EA005169B1

EA005169B1 - РЕКОМБИНАНТНОЕ АНТИТЕЛО, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩЕЕ С АНТИГЕННЫМ КОМПЛЕКСОМ IOR C2, Fv- ФРАГМЕНТ УКАЗАННОГО АНТИТЕЛА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

Info

Publication number: EA005169B1
Application number: EA200100782A
Authority: EA
Inventors: Кристина Мария Матео Де Акоста Дель Рио; Лоурдес Татьяна Роке Наварро; Алехо Моралес Моралес; Роландо Перес Родригес; Марта АЙЯЛА АВИЛА; Хорхе Виктор Гавилондо Ковлей; Марта Дуэньяс Порто; Анссель Белль Гарсия; Энрике Ренхифо Кальсадо; Нормандо Иснага Эскобар; Майра Рамос Сусарте
Original assignee: Сентро Де Инмунология Молекулар
Priority date: 1999-11-16
Filing date: 2000-11-16
Publication date: 2004-12-30
Also published as: JP2003514831A; US6891023B1; CU22921A1; CA2359577A1; AU783622B2; CN1230446C; CO5280154A1; KR20020008113A; EP1174441A2; KR100827627B1; EA200100782A1; AU1513001A; AR026463A1; WO2001036485A3; BR0007827A; MXPA01007261A; WO2001036485A2; CN1344276A; ZA200105803B; TWI233440B

Abstract

Изобретение относится к получению новых рекомбинантных антител, получаемых на основе мышиного антитела IOR С5, которые продуцирует гибридома, депонированная под номером ЕССС 97061101 в соответствии с Будапештским Договором. Указанные рекомбинантные антитела, получаемые с помощью техники рекомбинантных ДНК, характеризуются тем, что распознают антиген ior c2. Конкретно указанные рекомбинантные антитела представляют собой химерное антитело, гуманизированное антитело и одноцепочечный Fv фрагмент. Химерное антитело содержит вариабельные домены мышиного иммуноглобулина и константные участки человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело содержит константные участки человеческого иммуноглобулина и было специфически модифицировано в участках рамки считывания (FR) мышиной молекулы, причем в тех участках, которые могут отвечать за антигенный сайт для Т-клеток. Fv фрагмент содержит вариабельные домены мышиного иммуноглобулина. Изобретение относится также к использованию рекомбинантых антител, полученных из мышиного антитела IOR C5, для диагностики и лечения колоректальных опухолей, их метастазов и рецидивов.

Description

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, и в частности к новым рекомбинантным антителам, получаемым с использованием методов генной инженерии, и конкретно к химерному антителу, гуманизированному антителу и одноцепочечному фрагменту Ρν, получаемому на основе антитела мыши ЮК С5, которое распознает эпитопы, экспрессированные в антигене ίοτ С2, представляющем собой гликопротеиновый комплекс, экспрессируемый в нормальных и злокачественных колоректальных клетках.

Предпосылки создания изобретения

Были испытаны различные виды лечения колоректальной карциномы, но до настоящего времени единственным способом излечения остается хирургия. При этом хирургическое вмешательство позволяет достичь высокого процента выживаемости, в том случае, когда опухоль обнаруживается на ранней стадии, но, к сожалению, в большинстве случаев она диагностируется уже при наличии метастаз.

Применяемая в настоящее время стратегия по увеличению выживаемости включает комплекс методов диагностики, терапии и эпидемиологических мероприятий на тех стадиях, когда поражение еще не распространяется на внешние слои органов и опухоль все еще операбельна. И в этом случае знание и учет эпидемиологических факторов, а также разработка новых методов терапии позволят повысить уровень выживаемости.

В последние годы получило распространение использование моноклональных антител (Мав) или их фрагментов, меченных радиоактивными изотопами, для обнаружения рака иммуногаммаграфическими методами. Показано, что Мав могут применяться в качестве носителей радиоизотопов при нацеливании их на ассоциированные опухолевые антигены.

Некоторые радиоактивно меченные антитела использовались для обнаружения ассоциированных с опухолью карциноэмбриональных антигенов (КЭА). Антитела против КЭА, меченные ¹³¹1 или ¹²⁵1, использовались для обнаружения опухолей, продуцирующих КЭА или ассоциированных с указанным маркером (патенты США № 3 663 684, № 3 867 363 и № 3 927 193). Кроме того, Мав могут быть помечены Тс-99т для достижения нужных молекул при диагностике ίη νίνο.

Разработка техники гибридомных антител (КоЫет апб Μίϊδίοίη) совершила буквально революционный переворот в иммунохимии и предоставила полученное новое семейство реагентов, перспективных в плане их применения как с исследовательскими целями, так и для клинической диагностики заболеваний (КоЫет О., МЙ8!еш С., 1975, ЫаЫге, 256, 495-497). Однако указанные антитела не продемонстрировали высокой терапевтической эффективности, и, хотя получение мышиных моноклональных антител (тАЬз) стало рутинной процедурой, применяемой в области фундаментальных исследований и в клинической диагностике, использовать такую иммунотерапию ίη νίνο было затруднительно, поскольку она снижала время полужизни антитела у человека, приводила к слабому распознаванию эффекторных доменов мышиных антител иммунной системой человека, а также в связи с тем, что чужеродные иммуноглобулины могли вызывать антиглобулиновый ответ (ГАМК ответ), который мешал проведению терапии.

Развитие методов генной инженерии кардинально расширило возможности генетической манипуляции с генами, кодирующими антитела, что позволило продуцировать тАЬз, обладающие сниженной антигенностью или не обладающие антигенностью вовсе или усиленными желательными эффекторными функциями в ситуациях, когда эти антитела использовались при лечении или с целью диагностики различных патологических состояний. Указанные манипуляции представляют собой альтернативу в тех случаях, когда мышиные Мав могли быть превращены в преимущественно человеческую форму, обладающую такими же антигенсвязывающими свойствами (Μοττίβοη 8.Ь. е! а1., 1984, Ρ.Ν.Α.8. И8А, 81, 6851-6855).

Недавно был разработан ряд методов для гуманизации мышиных или крысиных антител, с тем чтобы снизить ксегенную реакцию в ответ на введение в организм человека чужеродных белков.

Один из числа основных методов, направленный на снижение антигенности, был получен через механизм образования химерных антител. В таких молекулах в рамку считывания человека вводили вариабельные домены, причем в этом случае можно добиться не только снижения иммуногенности, но и улучшения эффекторных свойств, поскольку молекулы в этом случае становятся человеческими и распознаются, таким образом, иммунной системой человека (Μοττίδοη 8.Ь. е! а1., 1984, Ρ.Ν.Α.8. И8А, 81, 6851-6855). Указанные химерные молекулы сохраняют способность распознавать исходный антиген, и его константный участок не является иммуногенным, хотя иммуногенность против мышиного вариабельного участка сохраняется.

Другие авторы пытались создать сайты связывания антигенов грызунов непосредственно на молекулах человеческих антител при трансплантации от мышиного антитела только антигенсвязывающего сайта, а не полностью вариабельного домена (ίοικδ Р.Т. е! а1., 1986, №щ.1ге. 321, 522-524, Уег1юеуеп М. е! а1., 1988, Заенее. 239, 1534-1536). Указанные авторы разработали несколько применений метода Рейчманна (К^е!сйтаηη Ь. е! а1., 1988, №!ите, 332, 323-327; Оиее С. е! а1., 1989, Ρ.ΝΑ.8. И8А, 86, 10029-10033), однако, ряд других авторов работали с измененными по форме антителами, включающими некоторые остатки мышиных молекул в человеческие рамки считывания (РК.) для целей восстановления аффинности к исходному антигену (Тетреб, Р.К., 1991, Вю1сс1шо1оду. 9, 266-272).

Матео с соавт. (Ма!ео е! а1., патент США № 5711210) описали процедуру снижения иммуногенности мышиных антител. В указанной процедуре вводимые модификации ограничиваются только вариабельными доменами и конкретно мышиными рамками считывания химерных антител. Более того, указанные модификации вводятся только в участки РК. имеющие амфипатическую спиральную структуру, что, таким образом, делает их возможными эпитопами, которые могут распознаваться Т клетками. Указанный метод предлагается для замены мышиных остатков внутри амфипатических участков аминокислотами, находящимися в тех же самых положениях в человеческих иммуноглобулинах, разумеется, аминокислоты, которые участвуют в образовании трехмерной структуры сайта связывания, т. е. зоны Вернье, канонической структуры гипервариабельного участка и аминокислоты межфазного участка, между легкой и тяжелой цепями исключаются.

Антитело, модифицированное методом, описанным Матео с соавт., сохраняют способность распознавать и связывать антиген, который распознавало исходное антитело, что приводит к меньшей иммуногенности, и в этой связи отмечается повышение терапевтической эффективности. При использованной указанной процедуре необходимо ввести лишь небольшое число мутаций для получения модифицированных антител, обладающих сниженной иммуногенностью по сравнению с химерными антителами.

Относящееся к изотипу 1дС1 моноклональное антитело мыши 1ОК С5 (заявка на патент XVО 97/33916), которое получают при иммунизации Ва1Ь/С клетками δ\ν 116 (клетки колоректальной аденокарциномы), распознает антиген, экспрессируемый преимущественно на поверхности и в цитоплазме злокачественных и нормальных колоректальных клеток. Указанное антитело не распознает ни КЭА, ни антигены Льюиса а, Льюиса Ь, асиалилированный антиген Льюиса, ни антигены на мембранах моноядерных клеток, ни красные глобулы (Уа/сще/ А.М. е! а1., НуЬпбота, 11, 245-256, 1992).

Исследования методом вестерн-блоттинга экстракта мембран клеток δ\ν 116 показали, что указанное антитело распознает гликопротеиновый комплекс, обозначенный как юг С2, и имеет две формы с разным молекулярным весом (145 и 190) (Уа/сщех А.М. е! а1., Уеаг 1ттипо1. Ва§е1, Кагдег, νοί. 7, 137-145, 1993).

Из уровня техники известно также, что генно-инженерными методами можно сконструировать рекомбинантные фрагменты на основе моноклональных антител. Имеется много отчетов, оценивающих потенциал использова ния фрагментов различных антител для целей диагностики ίη νίνο и лечения заболеваний.

Ира Пастан с соавт. (1га Рабап е! а1., ЕР 0796334 А1) описывает процедуру конструирования одноцепочечных Ρν фрагментов с использованием вариабельных участков антител, специфически распознающих углеводы, родственные тем, что имеются в антигене Льюиса Υ. На основе таких фрагментов ими был разработан метод обнаружения клеток, несущих этот антиген. Кроме того, были представлены доказательства ингибирующего действия указанных фрагментов на клетки, несущие антиген.

Описание изобретения

Настоящее изобретение относится к рекомбинантным антителам, получаемым с использованием методов генной инженерии, и конкретно к химерному антителу, гуманизированному антителу и одноцепочечному фрагменту Ρν, получаемому на основе антитела мыши 1ОК С5, которое продуцирует гибридома с одноименным названием, депонированная в соответствии с Будапештским Договором под номером ЕССС 97061101 в Европейской коллекции клеточных культур 11 июня 1997г. Указанное антитело распознает эпитопы, экспрессированные в антигене 1ог С2, представляющем собой гликопротеиновый комплекс, экспрессируемый в нормальных и злокачественных колоректальных клетках.

Подробное описание изобретения

Синтез кДНК и амплификация гена вариабельного участка С5 мыши

Проводят экстракцию цитоплазматической РНК из примерно 10⁶ гибридомных клеток, продуцирующих моноклональное антитело С5 (Уа/сще/ А.М. е! а1., Υеа^ 1ттипо1., Ва§е1, Кагдег, νο1. 7, 137-145, 1993). Указанный метод, используемый для экстракции РНК, описан Фалоро с соавт. (Ра1ого, 1., Тгектап, К., апб Кетеп, К., 1989, МеИобк ш Епхуто1оду, 65: 715-749). Реакционная среда для синтеза кДНК состоит из 5 мкг РНК, полученной с использованием 25 пкмолей сконструированных праймеров для гибридизации с началом константного участка мышиного 1дС 1 и с константным каппа участком легкой цепи мыши, 2,5 мМ каждого дезоксинуклеотида (дНТФ), 50 мМ Трис-НС1, рН 7,5, 75 мМ КС1, 10 мМ ДТТ, 8 мМ МдС1₂ и 15 мкг ингибитора рибонуклеазы (РНК диагб, РНагшас1а) в общем объеме 50 мкл. Образцы нагревают при температуре 70°С в течение 10 мин и затем медленно охлаждают до 37°С в течение 30 мин. Затем добавляют 100 единиц обратной транскриптазы и продолжают инкубацию при 42°С в течение 1 ч.

Вариабельный участок легкой цепи (УК) и тяжелой цепи (УН) амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Вкратце: 5 мкл кДНК УН или УК смешивают с 25 пкмолями специфических праймеров, 2,5 мМ каждого дНТФ, 5 мкл буфера 10Х для рестриктазной ДНК-полимеразы и 1 единицей этой рестрикта зы. Образцы подвергают воздействию 25 термических циклов при 94°С 30 с, при 50°С - 30 с, при 72°С - 1 мин и последнюю инкубацию проводят в течение 5 мин при 72°С.

Клонирование и секвенирование амплифицированной кДНК

Очищенные УН и УК кДНК клонируют в ТА вектор (ТА С1ошпд кй, Рготеда, США). Клоны секвенируют дидезоксиметодом с использованием ДНК-полимеразы Т7 (Рйаттае1а, Швеция).

Конструирование химерных генов

Вариабельные участки легкой и тяжелой цепей получают при обработке рестрикционными ферментами из ТА векторов и затем клонируют в векторы экспресии (Со1ота е! а1., 1оигиа1 о£ 1ттиио1од1са1 Ме!йоб§, 152, 89-104, 1992).

Гены УН вырезают из ТА вектора расщеплением ЕсоИ5 и Ыйе1 и затем клонируют их в вектор экспрессии РАН 4604, в который включены человеческий константный 1дС1 и ген устойчивости к гистидинолу.

Полученная конструкция представляет собой С5УН-РАН4604. Гены УК вырезают из ТА вектора расщеплением ЕсоК5 и 8а11 и затем клонируют их в РАС4622. Указанный вектор содержит ген устойчивости к др! и использует каппа константный участок человека. Полученная конструкция представляет собой С5УК-РАС4622.

Экспрессия химерного антитела

Клетки N80 подвергают электропорации с использованием 10 мкг С5УН-РАН4604 и 10 мкг С5УК-РАС4622 и затем линеаризуют при расщеплении с использованием РуиТ Полученные ДНК смешивают друг с другом, осаждают этанолом и растворяют в 25 мкл воды. Выращивают до полуслияния примерно 10⁷ клеток N80, собирают их центрифугированием и ресуспендируют в 0,5 мл ΌΜΕΝ вместе с расщепленной ДНК в кювете для проведения электропорации. После 5-минутного выдерживания во льду клетки обрабатывают импульсным током (170 В и 960 мкФ) и оставляют во льду еще на 30 мин. Затем клетки помещают в 20 мл ΌΜΕΝ, содержащей 10% околоплодную сыворотку теленка, и оставляют для восстановления на 48 ч. К этому времени клетки разносят на 96-луночный планшет и добавляют селективную среду (ΌΜΕΝ, 10% околоплодная сыворотка теленка, 0,8 мкг/мл микофеноловая кислота и 250 мкг/мл ксантин). Трансфицированные клоны становятся видимыми невооруженным глазом через 10 дней.

Наличие человеческого антитела в среде ячеек, содержащей трансфицированные клоны, определяют методом ТИФА (ЕЫ8А). Микротитрационные ячейки покрывают козьим антителом, направленным против человека (специфичным к гамма-цепи). После промывания ФБСР (фосфатно-буферный солевой раствор, содержащий 0,02% Твина 20, рН 7,5) к каждой микротитрационной ячейке добавляют 100 мкл культуральной среды из ячеек, содержащих трансфектанты, на 1 ч при 37°С. Далее ячейки промывают ФБСР и добавляют конъюгированный козий каппа фрагмент, направленный против человека, специфичный к легкой цепи, и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем ячейки промывают ФБСР и добавляют субстратный буфер, содержащий диэтаноламин. Через 30 мин измеряют поглощение при длине волны 405 нм.

Конструирование гуманизированного Ι0Ρ С5й путем гуманизации Т эпитопов Предсказание Т эпитопов Последовательности вариабельных участков Ι0Κ С5 анализируют с помощью программы АМРН1, которая позволяет предсказывать сегменты последовательностей длиной от 7 до 11 аминокислот со структурой амфипатической спирали, которая связана с проявлением Тиммуногенности. Используют также программу 80ННА, которая дает возможность предсказывать гидрофобные участки спирали (ЕШо! е! а1.,

1. 1ттипо1. 138: 2949-2952, 1987). Указанные алгоритмы позволяют предсказывать фрагменты, связанные с презентацией Т эпитопов в легкой и тяжелой цепях вариабельных участков Ι0Ρ С5.

Анализ гомологии вариабельных участков

Вариабельные домены Ι0Ρ С5 сравнивают с соответствующими вариабельными доменами человека с целью определения наибольшей гомологии последовательности человеческой и мышиной молекул. Для этого используют информацию по последовательностям молекул человека, имеющейся в базах данных Сепе Вапк и ЕМВЬ, доступных через Интернет. Сравнение проводят в режиме автоматизированного метода при использовании компьютерной программы РС-008 Н1В10 РК0818 06-00, НйасЫ.

Анализ на снижение иммуногенности

Сущность указанного метода состоит в снижении иммуногенности путем гуманизации возможных эпитопов Т клеток с введением лишь незначительных мутаций в РС, и конкретно в амфипатическую спираль, за исключением положений, участвующих в образовании трехмерной структуры сайта связывания.

В рамках указанного метода проводят сравнение участков УН и УК мышиного иммуноглобулина с последовательностью человеческого иммуноглобулина с наибольшей гомологией для выявления различающихся остатков в последовательностях молекул человека и животных, причем только в пределах амфипатических участков внутри зоны РС (Кайа! Е. 1991, 8ес.|иепсе5 о£ рто!еш8 о£ 1ттипо1одюа1 1п(егек1, Ийй Ебйюи, №1Бопа1 1и8!йи!е о£ Неа1!й), поскольку только такие мышиные остатки будут подвергнуты мутации человеческой последовательностью в тех же положениях.

Те остатки в мышиной РС, которые определяют канонические структуры входящих в зону Вернье остатков, не подвергают мутациям, поскольку они могут оказать существенное влияние на третичную структуру и воздейство вать на сайт связывания. Дополнительная информация о возможных замещениях в третичной структуре может быть получена при создании трехмерной модели вариабельных участков. Клонирование и экспрессия гуманизированного ЮК. С5 антитела в N80 клетки

После осуществления перекрывания в рамках ПЦР для получения мутаций и гуманизации УН и УК полученную генетическую конструкцию, соответствующую, после гуманизации Т-клеточных эпитопов, Ι0Κ С5, клонируют в векторы экспрессии с применением процедур, аналогичных тем, которые были использованы для экспрессии химерного антитела, с получением следующих плазмид: С5Укйи-РАС4622 и С.’5У111ш-РАН4604. Трансфекцию указанных генов в N80 клетки проводят точно в тех же условиях, что приведены для случая химерного антитела.

Получение одноцепочечного Εν фрагмента Конструирование и экспрессия κοΕν Стратегия включает первую амплификацию с использованием ПЦР, которая приводит к модификации последовательностей УН и УЪ, включая сайты рестрикции эндонуклеазами, для последующего клонирования в векторы экспрессии. В рамках проводимой амплификации используются соответствующие олигонуклеотиды для воссоздания точной последовательности. После амплификации вариабельные участки очищают и расщепляют соответствующими рестрикционными эндонуклеазами. Фрагменты ДНК очищают и лигируют в векторы экспрессии. Позже с использованием традиционных методов осуществляют экспрессию указанных генетических конструкций в Ε.οοίί.

В процессе экстракции белка из продуцирующих клеток проводят разрушение клеток ультразвуком и далее с использованием комбинации методик электрофореза в ДСН-полиакриламидном геле, методов переноса на нитроцеллюлозных мембранах и вестерн-блоттинга разделяют растворимую и нерастворимую фракции.

Частичную очистку белка проводят в ходе процесса, который включает (1) разделение растворимого и нерастворимого материала ультразвуковой обработкой с последующим центрифугированием, (2) промывание в низкомолярном растворе мочевины и солюбилизацию в высококонцентрированном растворе мочевины. Для очистки белка из солюбилизированного материала проводят аффинную хроматографию с применением атомов металла. Затем белок восстанавливают диализом против буфера.

Примеры

Пример 1. Получение химерного моноклонального антитела.

кДНК УН и УК получают из РНК, экстрагированной из гибридомы, продуцирующей моноклональное антитело Ι0Κ С5 с использованием обратной транскриптазы. Используют следующие специфические праймеры:

Для УН:

5' АССТСТАСАА(СТ)СТССАСАСАСАбС(АС) (АС)ССАСТССАТАСАСЗ' Для УК:

5' СССТСТАСААСТССАТССТСССААСАТСС3'

АДН в цепях УН и УК амплифицируют с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием Тас.| полимеразы и праймеров, специфичных для сайтов рестрикции ЕсоК.У/Мае1 для УН и ЕсоКУ/8а11 для УК, соответственно. Специфические праймеры представляют собой:

Для УН:

Олигонуклеотид 1:

5' ССССАТАТССАССАТСССТСТСТТСССССТССТСТТСТЗ'

Олигонуклеотид 2:

5'ТСССТССАС(АТ)САТСССС(СС)ТСТТСТССТАССТСАССАСАСЗ' Для УК:

Олигонуклеотид 1:

ССССАТАТССАССАТСАСС(СТ)СССС(АТ)(СА)СТСАС(СТ)Т(СТ)3' Олигонуклеотид 2:

5' АСССТССАСТТАССТТТ(ТС)АТТТССА(СА)СТТ(СТ)СТСССЗ'

ПЦР-продукты клонируют в ТА вектор (набор для клонирования ТА, Ιηνίΐгоден). Двенадцать независимых клонов секвенируют дидезокси-методом с использованием ДНК полимеразы Т7 (Фармация (РйагтаДа)). Последовательности УН и УК характеризуются высоким сродством с подгруппой 2 Кабата (КаЬа1).

Далее УН цепь расщепляют ЕсоК.У/Мае1 и УК цепь расщепляют ЕсоКУ/8а11, после чего клонируют, используя РАН4604 и РАС4622, для УН и УК, соответственно. Указанные векторы, которые используются для экспрессии иммуноглобулинов в клетках млекопитающих, были любезно предоставлены Шери Моррисон (81аепе Моггкоп, иСЬА, СаНГогта, США). Вектор РАН4604 включает константный участок человеческого 1дС1, и РАС4622 несет человеческий Ск (из группы новых векторов, применяемых для экспрессии молекул антител с использованием вариабельных участков, получаемых в результате полимеразной цепной реакции, М. 1окейпа Со1ота е) а1., 1оита1 оГ 1ттипо1одюа1 МеШобк, 152, 1992, 89-104). Полученные после клонирования Ι0Κ С5 участков конструкции представляют собой УНС5-РАН4604 и УКС5РАС4622.

Клетки N80 подвергают электропорации с использованием 10 мкг химерного вектора С5УН-РАН4604 и 10 мкг С5УК-РА64622 и затем линеаризуют расщеплением с использованием ΡνυΙ. Полученные ДНК смешивают друг с другом, осаждают этанолом и растворяют в 25 мкл воды. Выращивают до полуслияния примерно 10⁷ клеток N80, собирают их центрифугированием и ресуспендируют в 0,5 мл ЭМЕН вместе с расщепленной ДНК в кювете для проведения электропорации. После 5-минутного выдерживания во льду клетки обрабатывают импульсным током (170 В и 960 мкФ) и оставляют во льду еще на 30 мин. Затем клетки помещают в 20 мл ЭМЕИ содержащей 10% околоплодную сыворотку теленка, и оставляют для восстановления на 48 ч. К этому времени клетки разносят на 96-луночном планшете и добавляют селективную среду (ΌΜΕΝ, 10% околоплодная сыворотка теленка, 10 мМ). Трансфицированные клоны становятся видимыми невооруженным глазом через 10 дней.

Наличие химерного антитела в среде лунок, содержащей трансфицированные клоны, определяют методом ТИФА (ЕБ1БА). Микротитрационные ячейки покрывают козьим антителом, направленным против человека (специфичным к гамма-цепи). После промывания ФБСР (фосфатно-буферный солевой раствор, содержащий 0,02% Твина 20, рН 7,5) к каждой микротитрационной ячейке добавляют 20 мкл культуральной среды из ячеек, содержащих трансфектанты, на 1 ч инкубации при 37°С. Далее ячейки промывают ФБСР и добавляют конъюгированный с щелочной фосфатазой козий каппа фрагмент, направленный против человека, специфичный к легкой цепи, и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем ячейки промывают ФБСР и добавляют субстратный буфер, содержащий диэтаноламин. Через 30 мин измеряют поглощение при длине волны 405 нм.

Пример 2. Получение различных вариантов гуманизированного антитела.

ЮК С5 последовательности УН и УК сравнивают с базами данных последовательностей человека для получения последовательностей человека с наивысшей степенью гомологии, к 1ОК С5. Затем в участках УН и УК определяют амфипатические участки или возможные Т клеточные эпитопы.

В случае УН, мутации вводятся в положения 10 и 17 и аминокислоты Акр и Бег на С1у и ТЬг, соответственно, замещают. Указанные мутации получают путем ПЦР-перекрывания с использованием праймеров 1, 2, 3 и 4 в первой ПЦР и полученные в результате реакций продукты подвергают следующему перекрыванию во второй ПЦР с использованием праймеров 2 и 4, последовательности которых указаны ниже (Каттап, Μ., БаиГк, 1., БсЬеП, 1., СгопетЬогд, В. Βαριά шкеШоиа1 ти1адепек1к оГ ΌΝΑ Ьу ро1утегаке сйаш геас(юп (РСК) №.1с1ею Ас1йк КекеагсЬ 17: 5404, 1989).

Праймеры для мутаций в положениях 10 и 17 тяжелой цепи

Праймер 1:

5'САСТСАЗСАССТССССТССТСАААССТТСТСАСАСАСТТТСАСТСАСС3'

Праймер 2:

5'ТСССТССАС(АТ)САТСССС(СС)ТСТТСТССТАССТСААСАСАСЗ'

Праймер 3:

5' ССТСАСТСАААСТСТСТСАСААССТТТСАССАССССАССТССТСАСТСЗ'

Праймер 4:

5'ССССАТАТССАССАТСССТСТСТТСССССТССТСТТСТЗ'

После подтверждения секвенированием образования первой серии мутаций в такую мутированную ДНК вводят новые мутации в положения 43 и 44, где Бук и С1у заменяют на Акп и Бук, соответственно. Процедуру перекрывания проводят, как указано выше. Затем наличие мутаций вновь подтверждают секвенированием, и образованная новая конструкция получает название С5УНЬи. Праймеры, описанные для указанных мутаций, были следующими.

Праймеры для мутаций в положениях 43 и 44 тяжелой цепи

Праймер 1:

5' САСТТТССАССААААССАСТССААТССАТСЗ'

Праймер 2:

5'ТСССТССАС{АТ)САТСССС(СС)ТСТТСТССТАССТСААСАСАС 3'

Праймер 3:

5'САТССАТТССАСТССТТТТССТССАААСТС 3'

Праймер 4:

5'ССЗСАТАТССАССАТСССТСТСТТСССССТССТСТТСТЗ'

Для УК мутации проводят в положениях 15, 45 и 63, замещая Н1, Бук и ТЬг на Беи, Агд и Бег, соответственно.

Мутации вводят при перекрывании в ходе ПЦР, как описано ранее. Показаны последовательности используемых праймеров. Новая генетическая конструкция была обозначена С5УкЬи.

Праймеры для мутаций в положении 15 легкой цепи

Праймер 1:

5'ТТСТСССТТАСССТТССАСААССАСССЗ'

Праймер 2:

5'АСССТССАСТТАССТТТ(ТС)АТТТССА(СА)СТТ(СТ)СТСССЗ'

Праймер 3:

5'СССТССТТСТССААСССТААСССАСААЗ'

Праймер 4:

5'ССССАТАТССАССАТСАСС(СТ)СССС(АТ)(СА)СТСАС(СТ)Т(СТ)СТ(ТС)СТ

Праймеры для мутаций в положении 45 легкой цепи

Праймер 1:

5' ССССАСТСТССААССССССТААТСТАТЗ'

Праймер 2:

Праймер 3:

5'АТАЗАТТАССССССТТССАСАСТССССЗ'

Праймер 4:

ССССАТАТССАССАТСАСС(СТ)СССС(АТ)(СА)СТСАС(СТ)Т(СТ)СТ(ТС)СТ

Праймеры для мутаций в положении 63 легкой цепи

Праймер 1:

5'ССТСАСАСАТТСАЗТСССАСТССАТСАЗ'

Праймер 2:

Праймер 3:

5' ТСАТССАСТСССАСТСААТСТСТСАССЗ'

Праймер 4:

5'ССССАТАТССАССАТСАСС(СТ)СССС(АТ) (СА)СТСАС(СТ)Т(СТ)СТ(ТС)СТ

Все мутации подтверждаются секвенированием.

Гуманизированные УК и УН клонируют в векторы РАС4622 и РАН4604, получая в результате следующие конструкции: С5УкЬиРАС4622 и С5УНЬи-РАН4604.

Клетки №О подвергают электропорации с использованием 10 мкг гуманизированной С5УНЬиРАН4604 и 10 мкг С5УКЬи-РАС4622. Указанные векторы линеаризуют при расщеплении РуиБ

Процедуры электропорации и выявления клонов, экспрессирующих гуманизированное антитело 1ОК С5Ь, идентичны тем, что были описаны выше для химерного антитела.

Пример 3. Конструирование одноцепочечного Ρν фрагмента.

Конструирование 8сЕу фрагмента (УНлинкер-УЪ) на основе вариабельных доменов (УН и УЬ) в Мав 1ОКС5. Клонирование в вектор экспрессии для экспрессии в клетках Ε.αοϊί.

Процедура (а). Конструирование δοΕν.

Стратегия включает первый цикл амплификации с помощью ПЦР, модификацию секвенированных участков УН и УЬ, включая сайты рестрикционных эндонуклеаз, для клонирования в векторы экспрессии рРАС1В.7р1и8 и рРАС1В.9р1и§. В процессе амплификации используют олигонуклеотиды с конкретной последовательностью. Тяжелая цепь:

4066: ΕσοΚν-ΚΚΙ-νΗ

5' СССАТАТСТСАССТССАССТТСАССАСТСАССА. . 3 ’

4255: ЕсоАУ-ГК4-УН

5' САСЕАТАТСССАСАСАСАСТСАССАСАСТССС . . 3'

Легкая цепь:

2938: ЗаИ-ЕТЯ-УЪ

5' ССТССАССАТАТССАСАТСАС (АС) СА (СА) АСТ (АС) С . . 3' 2935: Ара1-ГК4-УЬ

5'АТССССССТТТ(ТС) А(ТС)(ТС)ТССАССТТССТ..3'

После амплификации участки очищают и расщепляют УН (ЕсоКУ) и УЬ (За11-Ара1). Фрагменты ДНК очищают и лигируют в векторы рРАС1В.9р1и§ и рРАС1В.7р1и8, предварительно расщепленные рестриктазами.

Плазмиду рРАС1В.7р1и§ модифицируют для переноса в периплазму гетерологичных белков, гены которых экспрессируются в Е.сой. Указанная плазмида содержит регуляторные последовательности для выполнения следующих функций: промоторную последовательность (триптофан), последовательность для сигнального пептида (ОМРА), последовательность для линкерного пептида (Сйаибйагу е! а1., 1990) и домен, состоящий из 6 гистидинов, модифицированный в С-концах зрелых белков, для облегчения очистки указанного белка (Сауйопбо, ЕУ. е! а1. Ртосеебтдз οί 1йе 1У Аппиа1 СопГегепсе οη АпбЬобу Епдтеегтд. 1ВС СопГегепсез 1пс. Согапабо, СА. ЭесетЬег 8-10, 1993).

Плазмиду рРАС1В9.р1и§ (фиг. 1) модифицируют для экспрессии в цитоплазме гетерологичных белков, гены которых экспрессируются в Е.сой. Указанная плазмида содержит регуляторные последовательности для выполнения следующих функций: промоторную последовательность (триптофан), 27аа фрагмент, полученный из 1Ь-2й, для достижения эффективной экспрессии белка и домен, состоящий из 6 гистидинов, модифицированный в С-концах зрелых белков, для облегчения последующей очистки указанного белка (Сауйопбо, ЕУ. е! а1. Ртосеебтдз οί 1йе 1У Аппиа1 СопГегепсе οη АпйЬобу Епдтееппд. 1ВС СопГегепсез 1пс. Согапабо, СА. ЭесетЬег 8-10, 1993).

Продукт ПЦР используют для трансформации компетентных клеток Е.сой (штамм МС1061), которые помещают в твердую селективную сре ду и выращивают при 37°С. Для отбора рекомбинантных векторов бактериальные колонии инокулируют в жидкую среду и экстрагируют плазмидную ДНК из культуры (Мо1еси1аг С1ошпд, А ЬаЬота!о1у Мастак зесопб ебНют 1989, ЗатЬгоок, Етйзсй апб Матабз). Плазмидную ДНК расщепляют ЕсоКУ, За11/Ара1, Хйо1/Ара1 в соответствии со стадией клонирования, разгоняют в агарозном геле и визуализируют в УФ свете, выбирая рекомбинантные клоны из клонов с двухполосным профилем расщепления, один из которых соответствует рРАС1В.7 и 9р1из (примерно 2,9 кбайт) и второй - ожидаемому домену (примерно 320 нп УН или УЬ и 720 нп для зсЕу). В случае УН домена вставку подтверждают секвенированием ДНК.

Процедура (б). Экспрессия зсЕу в Е.сой, достигаемая в случае генов вариабельных доменов Мав 1ОК С5.

Трансформируют четыре штамма Е.сой (ТО1, сойВ, ЭД3110 и ММ294) для изучения экспрессии клонированных генов с использованием двух рекомбинантных плазмид, выбранных в соответствии с п. (а). В основном, рекомбинантные бактерии выращивают в жидкой среде (ЬВ) с ампициллином в течение ночи при 37°С. Из указанных культур инокулируют свежие культуры, содержащие ампициллин, и инкубируют в течение 3 ч при 37°С. Затем индуцируют экспрессию добавлением к культуре бетаиндолакриловой кислоты (индуктор триптофанового промотора). Анализ образцов в 12% ДСНполиакриламидных гелях показывет, что в описываемых условиях в периплазматической фракции экспрессируется белок размером примерно 28 кДа, относящийся к конструкции РАСГВ.7р1и8, и полоса, соответствующая белку размером 30 кДа, который относится к рекомбинантному клону в рРАС1В.9р1и§, экспрессируемому в ТО1 на уровне 6-11% от общего количества бактериального белка. Методом вестерн-блот-анализа (Мо1еси1аг С1ошпд, А ЬаЬота!огу Мапиа1, зесопб ебНюю 1989, Ьу ЗатЬгоок, Етйзсй апб Машабз) с использованием антисыворотки кролика против ЕаЬ фрагмента ЮК. С5 после очистки его иммуноферментной техникой было показано, что указанный белок представляет собой зсЕу 1ОК С5.

Пример 4. Получение зсЕу из бактериальных культур, восстановление и определение способности распознавать антиген.

Процедура (а). Экстракция и восстановление зсЕу от 1ОК С5 из рекомбинантного клона в рРАС1В.9р1и8.

В процессе экстракции белка из клетокпродуцентов с использованием разрушения клеток ультразвуком достигается разделение растворимой и нерастворимой фракции, и далее при комбинировании методов гель-электрофореза в ДСН-полиакриламиде, переноса на нитроцеллюлозных мембранах и вестерн-блоттинга было доказано, что указанный белок остается в нерастворимой фракции бактериальных клеток.

В описываемых условиях белок подвергают частичной очистке в ходе процесса, включающего следующие стадии:

(1) разделение растворимого и нерастворимого материала ультразвуковой обработкой с последующим центрифугированием, (2) промывание в низкомолярном растворе мочевины (2М) и (3) солюбилизация в высокомолярном растворе мочевины (6М).

Из солюбилизированного материала белок очищают аффинной хроматографией с ионами металла и затем восстанавливают диализом против буферного раствора.

Процедура (б). Тест на связывание опухолевых клеток с 8сРу-1ОЯС5 фрагментом.

Используемые для исследования клетки получают из Центра молекулярной иммунологии (СеПго бе 1ттипо1од1а Мо1еси1аг). Клеточную линию аденокарциномы 8\У948 выращивают в среде Ь-15, дополнительно содержащей 10% околоплодную сыворотку теленка, при 37°С с 6% содержанием СО₂. В качестве отрицательных контролей используют клеточную линию Раджи (Ка_|1) (лимфома Буркитта человека) и Ни! 78 (Т-клеточная линия человека).

Указанные клеточные линии растят в среде КРМ1 1629, дополнительно содержащей 10% околоплодную сыворотку теленка, при 37°С.

Клеточные суспензии фиксируют в концентрации 10⁶ клеток/мл в ФБР, содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина. К каждой ячейке добавляют 10 мкл клеточной суспензии. Препараты высушивают на воздухе, не содержащем пыли, в течение 3 ч и фиксируют в растворе ацетон-метанол (1:1) в течение 5 мин, после чего в течение 10 мин проводят гидратацию в ТВ8. В конце процедуры проводят иммуноцитохимический анализ клеток.

Активность йсРу 1ОКС5 фрагмента определяют в рамках иммуноцитохимического анализа с использованием иммунопероксидного метода. Клетки инкубируют в течение 2 ч при 37°С с одноцепочечным Ρν 1ОКС5 и затем инкубируют с антисывороткой против РаЬ и с противомышиной конъюгированной пероксидазой (НКРО), каждый раз по 30 мин при комнатной температуре. Сайт локализации пероксидазы визуализируют с помощью раствора, содержащего 5 мг 3-3-диаминобенцидина, 5 мл ТВ8 и 5 мкл 30% Н₂О₂. В перерывах между инкубациями препараты промывают холодным ТВ8.

После внесения в воду препараты окрашивают контрастным красителем гематоксилином Майера (Нета!охШше οί Мауег) и добавляют канадский бальзам. Каждый эксперимент включает положительный и отрицательный контроль.

Иммуноцитохимические исследования показывают, что рассматриваемый фрагмент является позитивным лишь по отношению к клеточ ной линии 8\У948. что демонстрирует умеренный характер мечения в сравнении с полным Мав, указывая на специфическую картину распознавания 8сΡν ΙΟΚ С5 указанной клеточной линии. Метка связывается с мембранным и цитоплазматическим компартментом в злокачественных клетках ободочной кишки.

Краткое описание рисунков

На фигуре показано генетическое конструирование плазмиды рРАС1В.9р1и8, которая представляет собой плазмиду, модифицированную для экспрессии химерных белков в цитоплазме Е.со11. Указанная плазмида содержит регуляторные последовательности для выполнения следующих функций: промоторная последовательность (триптофан), 27аа фрагмент, полученный из 1Б-211 для достижения эффективной экспрессии белка, и домен, состоящий из 6 гистидинов, модифицированный в С-концах зрелых белков, для облегчения очистки указанного белка.

Список последовательностей <110> Центр молекулярной иммунологии (Сепрго 1ттипо1од1а то1еси1аг)

Матео де Акоста дель Рио, Мария Кристина (Ма!ео бе Асое1а бе1 Кю, Мала Спебпа) (Заявитель только для Соединенных Штатов Америки)

Року Наварро, Лурдес Татьяна (Кодие Nаνа^^ο, Бомбее Табапа) (Заявитель только для Соединенных Штатов Америки)

Моралес Моралес, Алехо (Мога1ее Мога1ее, А1е.)о) (Заявитель только для Соединенных Штатов Америки)

Перес Родригес, Роландо (Регех Робидие/, Ко1апбо) (Заявитель только для Соединенных Штатов Америки)

Айяла Авила, Марта (Ауа1а ΑνΗπ, Майа) (Заявитель только для Соединенных Штатов Америки)

Гавилондо Каули, Джордже Виктор (Са\з1опбо СоМеу, 1огде Ую!ог) (Заявитель только для Соединенных Штатов Америки)

Дуенас Порто, Марта (Ииепае Ройо, Майа) (Заявитель только для Соединенных Штатов Америки)

Белл Гарсия, Ханссел (Ве11 Сагаа, Напеее1) (Заявитель только для Соединенных Штатов Америки)

Ренгифо Кальсадо, Энрике (Кепдбо Сакабо, Еппдие) (Заявитель только для Соединенных Штатов Америки)

Изнага Эскобар, Нормандо (Ι/пада ЕесоЬаг, Ыогтапбо) (Заявитель только для Соединенных Штатов Америки)

Рамос Сусарте, Майра (Каток Ди/аПе, Мапа) (Заявитель только для Соединенных Штатов Америки) <120>АНТИТЕЛА И Εν ФРАГМЕНТЫ, РАСПОЗНАЮЩИЕ АНТИГЕН ΙΟΒ С2 <130> С1М <140> рст/си00/00004 <141> 20С0-11-16 <160> 14 <170> Патентен, версия 2.0 (РаЕепЫп, Уег.2.0) <210> 1 <211> 6 <212> РЕТ <213> млекопитающие <220>

<221> Домен <222> (1)...(6) <223> СОК1 тяжелой цепи рекомбинантного антитела и 5θΓν фрагмента <400> 1

Зег А1а Туг Азп Тгр ΗΪ5

5 <210> 2 <211> 16 <212> РКТ <213> млекопитающие <220>

<221> Домен <222> (1)...(16)

<223> С0К2	тяжелой цепи	рекомбинантного антитела	И 5θΕν
фрагмента
<400> 2
Туг 11е Зег	Туг Азп С1у ТЬг	ТЬг Зег Туг Азп Рго Зег Ьеи	Ьуз Зег
1	5	10	15

<210> 3 <211> 9 <212> РЕТ <213> млекопитающие <220>

<221> Домен <222> (1)...(9) <223> СЬКЗ тяжелой цепи рекомбинантного антитела и 3θΕν фрагмента <4С0> 3

Азп Азр С1и Агд А1а Тгр РЬе А1а Туг

5 <210> 4 <211> 16 <212> РКТ <213> млекопитающие <220 <221> Домен <222> (1)..,(16) <223> СДК1 легкой цепи рекомбинантного антитела и зсГу фрагмента <400 4

Ьуз Зег Зег С1п Зег Ьеи Ьеи Азр Зег Азр С1у Ьуз ТЬг Туг Ьеи Азп

5 10 15 <210 5 <211> 7 <212> РКТ <213> млекопитающие <220>

<221> Домен <222> (1)...(7) <223> СБК2 легкой цепи рекомбинантного антитела и зсГу фрагмента <400> 5

Ьеи Уа1 Зег Ьуз Ьеи Азр Зег

5 <210> 6 <211> 9 <212> РКТ <213> млекопитающие <220>

<221> Домен <222> (1)...(9) <223> СЬКЗ легкой цепи рекомбинантного антитела и зсГу фрагмента <400> б

Тгр С1п б1у ТЬг ΗΪ5 РЬе Рго ΗΪ3 ТЬг

5 <210 7 <211> 30 <212> РКТ <213> млекопитающие <220>

<221> Домен <222> (1)...(30) <223> ГК1 тяжелой цепи химерного антитела и зсЕу фрагмента

<4 0 С	)> 7
Азр	Уа1	С1п	Ьеи	С1п	С1и	Зег С1у	Рго	С1у	Ьеи Уа1	Ьуз	Рго Зег С1г.
1				5				10			15
ТЬг	Ьеи	Зег	Ьеи	ТЬг	Суз	ТЬг Уа1	ТЬг	С1у	Туг Зег	Не	ТЬг
			20				25				30

<210> 8 <211> 14 <212> РКТ <213> млекопитающие <220>

<221> Домен <222> (1)...(14) <223> ГК2 тяжелой цепи химерного антитела и зсГу фрагмента <400> 8

Тгр Не Агд С1п РЬе Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр МеЬ С1у

10 <210> 9 <211> 32 <212> РКТ <213> млекопитающие <220>

<221> Домен <222> {1).,.(32) <223> ЕЕЗ тяжелой цепи химерного антитела и зсГу фрагмента

<400 9

Агд

Не Зег

11е

ТЬг

Агд

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз Азп

СЬп РЬе

РЬе

Ьеи

СЬп

1

5

10

15

Ьеи

Азп Зег

УаЬ

ТЬг

СЬи

Азр

ТЬг

АЬа ТЬг

Туг Туг

Суз

АЬа

Агд

20

25

30

<210 10 <211> 11 <212> РЕТ <213> млекопитающие <220>

<221> Домен <222> (1).,.(11} <223> ГЕ4 тяжелой цепи химерного антитела и зсГу фрагмента <400 10

Тгр С1у СЬп С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг УаЬ Зет АЬа

5 10 <210 11 <211> 23 <212> РЕТ <213> млекопитающие <220 <221> Домен <222> (1)...(23) <223> ЕК1 легкой цепи химерного антитела и зсГу фрагмента <400> 11

Азр Тгр Тгр Мег ТЬг С1п ТЬг Рго Ьеи ТЬг Ьеи Зег УаЬ ТЬг Ьеи СЬу 15 10 15

СЬп Рго АЬа 5ег Не Зег Суз <210> 12 <211> 15 <212> РЕТ <213> млекопитающие <220 <221> Домен <222> (1)...(15) <223> ГЕ2 легкой цепи химерного антитела и зсЕу фрагмента <400> 12

Тгр Ьеи Ьеи СЬп Агд Рго СЬу СЬ.п Зег Рго Агд Агд Ьеи Не Туг 15 10 15 <210 13 <211> 32 <212> РЕТ <213> млекопитающие <22 0>

<221> Домен <222> (1),..(32) <223> ГЕЗ легкой цепи химерного антитела и 3θΡν фрагмента <400> 13

С1у Уа1 Рго Азр Агд РЬе Зег СЬу Зег С1у Зег С1у ТЬг Аар РЬе А1а 15 10 15

Ьеи Ьуз Не Агд Агд УаЬ СЬи АЬа СЬи Азр Ьеи СЬу УаЬ Туг Туг Суз

25 30 <210> 14 <211> 11 <212> РЕТ <213> млекопитающие <220 <221> Домен <222> (1)...(17} <223> ГЕ4 легкой цепи химерного антитела и зсГу фрагмента <400> 14

РЬе СЬу СЬу С1у ТЬг Ьуз Ьеи СЬи Не Ьуз Агд Ьуз Зег ТЬг Ьеи ТЬг

5 10 15

С1у

Claims

1. Рекомбинантное антитело, взаимодействующее с антигенным комплексом юг С

2, полученное из мышиного моноклонального антитела Ι0Κ С5, продуцируемое гибридомой, депонированной под номером ЕССС 97061101, при том, что последовательности участков, определяющих комплементарность связывания с антигеном (СОК), легкой и тяжелой цепей представляют собой

Тяжелая цепь: СЦК.1: 3 0 Υ N И н СЦВ.2 : Υ I 3 Υ N с т т 3 Υ N Р 3 ь к 3 СЭКЗ : N Ц Е К А И Е А Υ Легкая ΐ цепь: СЦН1: К 3 3 Ώ 3 ь Ь Ц 3 Ц 0 к Т Υ ь N СЦК2 : ЬУЗ К Ь ц 3 СЭРЗ: и о с т Н г Р Н т 2. Рекомбинантное антитело по п.1, отли-

чающееся тем, что содержит участки СОК и каркасные области (ЕЕ) антитела Ι0Κ С5 и константные области легкой и тяжелой цепей антитела человека, при том, что аминокислотные последовательности указанных каркасных областей тяжелой и легкой цепей представляют собой

Тяжелая цепь:

ЕН1: СУОЬСЕЗСРСЪУКРЕОТЬЗЬТСТУТСУ

3 I т

ГЕ2 : ИЬЕОГРСКСЬЕИМС

ГАЗ: ΚΙ3ΙΤΚϋΤ5ΚΝ0ΕΓΕΰΕΝ8νΤΤΕΟΤΑΤ

Υ ¥ С А Е

ЕВ4 : ЙСОСТЬУТУЗА

Легкая цепь

ГА1: ОУУМТСТРЬТЬЗУТЬСОРАЗЬЗС

ЕН2: КЬЬ0КРССЗРКНЬ1¥

ГАЗ; СУРЬКЕЗСЗСЗСЗТПГАЬКЬККУЕАЕО!

С V Υ Ύ С

ГН4: ЕСССТКЬЕХКККЗТЬТС

3. Рекомбинантное антитело по п.1, отличающееся тем, что дополнительно содержит точечные мутации в каркасных областях тяжелой и легкой цепей для снижения его иммуногенности.

4. Рекомбинантное антитело по п.3, отличающееся тем, что содержит в каркасных областях тяжелой и легкой цепей любую из следующих точечных мутаций:

Тяжелая цепь:

Положение 10: замена Азр на С1у Положение 17 : замена Зег на ТЬг Положение 43: замена Азп на Ьуз Положение 44 : замена Ьуз на СЬу

Легкая цепь

Положение 15: замена Не на Ьеи Положение 45: замена Ьуз на Агд Положение 63: замена ТЬг на Зег

5. Линия клеток, экспрессирующих рекомбинантное антитело по любому из пп.1-4.

6. Фармацевтическая композиция для лечения злокачественных опухолей прямой и ободочной кишки, их метастазов и рецидивов, включающая рекомбинантное антитело по любому из пп.1-4 и приемлемый носитель.

7. Диагностическая композиция для локализации и идентификации т у1уо злокачествен19 ных опухолей прямой и ободочной кишки, их метастазов и рецидивов, включающая рекомбинантное антитело по любому из пп.1-4.

8. Диагностическая композиция по п.7, дополнительно включающая соединения для радиоактивного мечения антитела, выбранные из группы, состоящей из технеция 99, рения 186 и рения 188.

9. Диагностический способ идентификации ΐη νΐνο злокачественных опухолей прямой и ободочной кишки, их метастазов и рецидивов, включающий введение пациенту физиологически приемлемой композиции, которая содержит антитело по любому из пп.1-4, предварительно меченную Тс-99 или любым другим радиоактивным аналогом, и мониторинг биораспределения указанной композиции иммуногаммаграфическими методами.

10. Одноцепочечный фрагмент Γν рекомбинантного антитела, полученный из мышиного моноклонального антитела ЮК С5, продуцируемое гибридомой, депонированной под номером ЕССС 97061101, при том, что последовательности ΟΌΚ и каркасных областей (ГК) указанного фрагмента представляют собой