JPH11511973A

JPH11511973A - 大腸細胞および大腸癌細胞関連核酸分子、タンパク質およびペプチド

Info

Publication number: JPH11511973A
Application number: JP9510274A
Authority: JP
Inventors: オールド，ロイド，ジェイ; ウェルト，シドニー; リッター，ゲルト; シンプソン，リチャード，ジェイ; ナイス，エドワード; モリッツ，アール，エル; キャティメル，ブルーノ; ジ，フン; バージェス，アンソニー; ヒース，ジョーン; ホワイト，サラ; ジョンストン，キャメロン
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-02-02
Filing date: 1996-08-05
Publication date: 1999-10-19
Anticipated expiration: 2016-08-05
Also published as: JP4037451B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、大腸細胞の表面および大腸癌細胞の表面に見られる単離タンパク質およびペプチド、更に、前記タンパク質およびペプチドをコードする核酸分子に関する前記タンパク質およびペプチドは、ｍＡｂＡ３３等の腫瘍関連抗体に結合する。前記単量体タンパク質は、非還元条件下に於けるＳＤＳゲル電気泳動での測定で約４３ｋＤの分子量を有する。更に、本発明は、前記核酸分子、単離体又は多量体形態のタンパク質、更に、前記ペプチドに対する抗体の診断、スクリーニング、および治療方法における利用に関する。本発明は、更に単離体又は多量体形態の、前記タンパク質に対して特異的な抗体と、前記ペプチドに対する抗体とにも関する。

Description

【発明の詳細な説明】大腸細胞および大腸癌細胞関連核酸分子、タンパク質およびペプチド関連出願に関する相互参照本出願は、ここにその両方を参考文献として合体させる、大腸細胞および大腸癌細胞関連タンパク質およびペプチド、と称する１９９５年４月４日出願の米国特許出願第０８／５１１，８７６号の一部継続出願である１９９６年２月２日出願の第０８／５９７，４９５号の一部継続出願である。発明の分野本発明は、ヒト大腸細胞および大腸癌細胞関連抗原、核酸分子、タンパク質およびペプチドに関する。詳しくは、本発明の核酸分子によってコードされる本発明のタンパク質とペプチドとは、ヒト大腸細胞とヒト大腸癌細胞の表面及び細胞内の両方に見られ、大腸癌抗体に結合する。単離体形態としての前記タンパク質は、非還元条件下に於けるＳＤＳゲル電気泳動にかけた場合は約４０−４５ｋＤの分子量、そして還元条件下に於けるＳＤＳゲル電気泳動での測定で約４９−５５ｋＤの分子量を有する。このタンパク質、そのペプチドフラグメント、およびその多量体は、癌の診断と治療に有用な試薬と方法とを開発するのに使用することができる。発明の背景結直腸がんは、悪性腫瘍疾患である。西洋、特に米国に於いては結直腸がんの発生率が高い。この種の腫瘍は、しばしば、リンパ管および血管を介して転移する。結直腸がんの患者の多くが、この疾患によって最終的に死亡する。事実、６２，０００人の米国人と、８０００人のオーストラリア人が毎年結直腸がんで死亡していると推定されている。今日まで、結直腸がんの治療のために、組織治療法および化学療法が開発されている。しかしながら、転移性疾患を有する結直腸がんの患者の生存をある程度の信頼性をもって伸ばすための十分な抗腫瘍活性を示す治療方法はいまだ存在しない。その結果、いまだ、結直腸がんを有効に治療するための方法と製品との開発に対する必要が存在する。モノクローナル抗体Ａ３３は、広範囲な基礎医学分析と患者に於ける局在確認研究とが行われているマウス免疫グロブリンである。(Ｗelt et al.,Ｊ．Ｃlin ．Ｏncol., 8:1894-1906(1990),Ｗelt et al.,Ｊ.Ｃlin.Ｏncol.,12: 1561-1571( 1994),and Ｗelt et al.,Ｊ.Ｃlin.Ｏncol. 14: 1787-1797(1996)参照)。この抗体は、正常な大腸細胞と大腸癌細胞の細胞内及び表面上に見られる抗原に結合する。この抗原は、Ａ３３抗原として知られている。結腸粘膜に由来する腫瘍に於いて、Ａ３３抗原は、９５％以上の症例に於いて均質的に発現される。Ａ３３抗原は、研究された多くの他の正常組織には検出されていない。その制限された発現によって、このシステムは、実質的に「器官特異的」(大腸、小腸)であると定義される。免疫蛍光実験によって、ｍＡｂＡ３３は、イン・ヴィトロでＡ３３抗原−陽性細胞のマクロピノソームへとインターナリゼーションに内化されることが明らかとなった(Ｄaghighian et al.,Ｊ.Ｎuc.Ｍed.37:1052-1057(1996))。マウスモデルに於いて、ｍＡｂＡ３３は、かなりの量、ヒト大腸癌の異種移植片に局在化されることが判り、これは、投与後１時間以内に、移植された大腸癌細胞の細胞質内に同定することができる。迅速な腫瘍への局在化と、腫瘍による高いレベルの抗体とりこみとは、以下の事実に関連するものであると考えられる。(１)Ａ３３抗原は、分泌されず、従って、ｍＡｂＡ３３の腫瘍細胞に対する標的化は、腫瘍細胞から血管系へと拡散する離脱したＡ３３抗原によつて妨害されない、( ２)ｍＡｂＡ３３は、細胞膜上でＡ３３抗原に結合すると、迅速に細胞内にインターナリゼーションされ、これによって、細胞に結合した抗体の量が増加する、そして（３）いくつかの大腸癌細胞ラインが、多量のＡ３３抗原を発現し、細胞当たり８００，０００のｍＡｂＡ３３分子に結合する。これらの特徴に依り、Ａ３３抗原と、更に、類似の特徴を有する関連タンパク質とを単離、キャラクタライズ、配列決定する必要がある。多くの精製プロトコールは、通常、ＳＤＳゲル電気泳動に依る対象タンパク質を分析するために還元工程を利用する。これによって、タンパク質をより容易に同定、モニターすることが可能である。本出願の発明者等は、還元条件を利用することによっては、ウェスタンブロッティングによって標的Ａ３３タンパク質を同定することはできないという驚くべき事実を見出した。本発明のＡ３３抗原を、同定、モニター、およびキャラクタライズするために還元工程を完全に除去するためには、標準技術を変えなければならなかった。抗原が単離されると、その還元条件下に於ける振る舞いの研究を行うことができるであろう。Ａ３３抗原の精製は、アクチンを含む他のタンパク質が、一次元および二次元ゲル電気泳動に於いて、およそ同じ位置へともに永動されることによってさらに困難なものであった。更に、ｍＡｂＡ３３は、アクチンに非特異的に結合する。本出願の発明者等は、このアクチンに対する非特異的結合が前記抗体のＦｃ領域に依るものであることを突き止めた。Ｆｃ領域を除去することによって、本発明者等はアクチン結合を防ぐことができた。アクチンは、大腸癌細胞の細胞表面抗原ではなく、還元によって影響されやすいものではないので、本発明者等にとって、アクチンが、モノクローナル抗体Ａ３３の標的ではありえないことが明白であった。この抗原の同定、単離およびキャラクタリゼーションにおける困難性は、Ａ３３抗原の存在が知られてから１０年以上経つにも拘わらず、この抗原の精製、単離および配列決定は本発明によって始めて成功したという事実によって裏付けられる。ここに記載するように、本出願の発明者等は、Ａ３３抗原を同定、単離、キャラクタライズした。本発明者等は、更に、Ａ３３抗原をコードするｃＤＮＡも単離し、このｃＤＮＡのヌクレオチド配列を決定し、Ａ３３抗原のアミノ酸配列を推定した。ここにＡ３３タンパク質と称する、前記Ａ３３抗原は、癌およびその他の疾患、特に、結腸、直腸、胃および小腸粘膜癌のようなガンの予知、診断および治療に有用な臨床試薬および方法を開発するのに利用することができる。発明の要旨本発明は、正常なヒト大腸細胞およびヒト大腸癌細胞の内部および表面に見られる単離タンパク質、更に、該タンパク質のペプチドフラグメント、に関する。前記タンパク質およびペプチドは、Ａ３３大腸癌抗体又は、前記タンパク質配列の領域に対して作成したポリクローナル抗体によって結合される。ＳＤＳゲル電気泳動によって分析された時、本発明の単離糖タンパク質は、非還元条件が使用された場合には、約４０−４５ｋＤの分子量、そして、還元条件が使用された場合には、約４９−５５キロダルトンの分子量を有する。本発明は、更に、前記タンパク質をコードする核酸分子、そして、前記糖タンパク質、ペプチドおよび核酸分子の、癌の診断および治療に於ける利用方法とにも関する。図面の簡単な説明上記簡単な記載および本発明のその他の課題および特徴は、以下の本発明の好適な、但し例示的な、実施例に関する詳細記載を、添付の図面とともに参照することによってより完全に理解されるであろう。ここで、図１は、Ａ３３モノクローナル抗体を用いた、ＬＩＭ１２１５およびＨｅｐ− ２細胞の細胞蛍光分析を示している、図２は、還元条件を使用したＳＤＳゲル電気泳動後検出不能で、非還元条件を使用したＳＤＳゲル電気泳動後のウェスタンブロットによっては検出可能であるＡ３３抗原をしめしている。”−Ｂ−ＭＥ”は、非還元条件を使用した電気泳動を示し、”＋−ＢＭＥ”は還元条件を使用した電気移動を示す。図３は、ｍＡｂＡ３３を用いた、又はそれを用いない、細胞可溶化物の免疫沈降反応を示している、図４は、ツニカマイシとインキュベートした、又はそれを用いない、細胞可溶化の免疫沈降反応を示している。図５は、図５Ａと図５Ｂとから成り、ＬＩＭ１２１５細胞から抽出されたＡ３３抗原の非還元条件下でのウェスタンブロット分析を示している。図６は、アクチンと、Ａ３３ＩｇＧ又はＡ３３Ｆ(ａｂ)’₂フラグメント間の相互作用のバイオセンサー分析を示している。図７は、Ａ３３抗原の精製に使用したクロマトグラフィー精製プロトコールを示すフローチャートである。図８は、図８Ａと図８Ｂとから成り、それぞれ、ＬＩＭ１２１５大腸細胞のＴｒｉｔｏｎＸ−１００抽出物とＴｒｉｔｏｎＸ−１１４抽出物とのウェスタンブロト分析を示している。図９は、Ａ３３抗原の陰イオン交換ＨＰＬＣを示している。図１０は、Ａ３３抗原のサイズ−排除ＨＰＬＣを示している。図１１は、図１１Ａと図１１Ｂとから成る。図１１Ａは、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２活性フラクションのミクロ分取ＲＰ−ＨＰＬＣ情報を示している。図１１Ｂは、前記ＨＰＬＣフラクション中のＡ３３抗原活性のバイオセンサー分析を示している。図１２は、Ａ３３抗原中のペプチドフラグメントのアミノ酸配列を示している。図１３は、Ａ３３抗原のアウィニティー精製に用いたプロトコールを示すフローチャートである。図１４は、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）に結合させた化学合成ペプチドＳＶＥＴＰＱＤＶＬＲＡＳＱＧＫＳＶＴＬＰ（配列番号１のアミノ酸２−２１）で免疫したマウスとウサギから得た血清のウエスタンブロト分析を示している。図１５は、Ａ３３抗原のＮ−末端に対して作成した抗−ペプチドＩｇＧを使用した、非還元（パネル１）および還元（パネル２）条件下でのＡ３３抗原のウェスタンブロット分析を示している。図１６は、図１６Ａと図１６Ｂとから成る。図１６Ａと、その連続である図１６Ｂとは、Ａ３３抗原をコードする２．６ｋｂのｃＤＮＡを示している。図１７は、ヒトおよびマウスＡ３３の推定アミノ酸配列の比較である。図１８は、パルミテートでの標識化後、ｍＡｂＡ３３が標識化Ａ３３抗原を沈降させるということを示している。図１９は、ヒドロキシルアミンを使用した時の染色の阻害を示している。発明の詳細説明例１表１にリストする複数の大腸癌培養細胞ラインを入手した。ＬＩＭ１２１５細胞ラインは、Ｌudwig Ｉnstitute for Ｃancer Ｒesearch,メルボルン、オーストラリアから得た。細胞ラインＳＫ−ＣＯ−１７，ＳＫ−ＣＯ−１９，ＳＫ−ＣＯ−１０，ＳＫ−ＣＯ−１１，ＳＫ−ＣＯ−１５は、Ｌudwig Ｉnstitute for Ｃancer Ｒesearch、ニューヨーク、及びＭemorial Ｓloan Ｋettering Ｉnstit ute、ニューヨークから得た。他のすべての細胞ラインは、Ａmerican Ｔype Ｃu lture Ｃollection,ロックビル、メリーランドから得た。Ｐｆｒｅｕｎｄｓｃｈｕｈｅｔａｌ.，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ. Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５：５１２２−５１２６（１９７８）に記載されているプロトコールを使用して、ブダペスト協定に基づき、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄに寄託され、ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ８７７９としてカタログ化された、ハイブリドーマ細胞ラインによって分泌された、モノクローナル抗体Ａ３３（ｍＡｂＡ３３）を使用してこれらの細胞ラインのそれぞれについて、ロゼット形成試験（rosetting assay）を行った。ｍＡｂＡ３３は、ＩｇＧ２ａのアイソタイプを有し、ここに記載するように、ヒト大腸癌の内部又は表面上に存在するＡ３３として示す抗原に結合する。前記大腸癌細胞ラインの内のいくつかは、ロゼット形成試験、イムノアッセイ、および免疫組織化学による判定で、Ａ３３−陽性であることが判った(次の表１を参照)。例２例１のロゼット形成試験で陽性であった、ＬＩＭ１２１５大腸細胞ラインを、１０％胎児ウシ血清を含有するＲＰＭＩ培地中で生育させた。集密(confluent) 細胞を（１０⁶／ｃｍ²）をＴｒｙｐｓｉｎ−Ｖｅｒｓｅｎｅ溶液を使用して分離させた。細胞を、１０％の胎児ウシ血清、１μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、０．０２５Ｕ／ｍｌのインスリンおよび１０．８２μｇ／ｍｌのα−チオグリセロールを添加した、２５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０を含む組織培養シャーレに１／１０で播種した。前記シャーレを、５日間、５％ＣＯ₂の雰囲気中で３７℃でインキュベートした。前記培地の除去後、細胞を、細胞スクレーパによって表面から除去する前に、ＰＢＳで洗浄した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、１０⁹細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。次に、前記ＬＩＭ１２１５大腸癌細胞ラインの表面上でのＡ３３抗原の発現を、標準技術に従いフローサイトメトリーによって分析した。Ｈｅｐ−２表皮ガン細胞ライン（Ｂｏｒｉｎｇｅｔａｌ.，ＣａｎｃｅｒＪ．Ｃｉｎ．Ｖｏｌ．４４，ｐｐ．７−２６(１９９４)）をネガティブコントロールとして使用した。前記細胞を、洗浄し、５ｍＭのＥＤＴＡと５％の胎児ウシ血清とを含有する５００μｌのＰＢＳ中に、５ｘ１０⁶細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。細胞を、５μｇのＡ３３ｍＡｂとともに、４℃で３０分間、インキュベートした。バッファーでの洗浄後、細胞／抗体複合体を、フルオレセイン−結合抗−マウスＩｇＧ（１／５０希釈）とともにインキュベートした。ネガティブコントロールを、細胞を、アイソタイプが一致する非関連抗体（５μｇ）での染色と、その後の、フルオレセイン−結合抗−マウスＩｇＧのみでの染色によって行った。フローサイトメトリーを、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ.）を使用して行った。図１は、Ａ３３モノクローナル抗体を用いたＬＩＭ１２１５およびＨｅｐ−２細胞の細胞けい光分析を示している。前記コントロール抗体で得られた蛍光（パネルＡ）と比較して、ＬＩＭ１２１５の全集団は、Ａ３３ｍＡｂとインキュベートした時、強い均一な蛍光（パネルＢ）を示した。Ｈｅｐ−２細胞（ＣおよびＤ）で得られたパネルに示されたプロファイルは、重複しており、これは、これらの細胞に結合するＡ３３ｍＡｂは検出されていないことを示している。Ｘ軸は、蛍光強度（対数単位）を示し、Ｙ軸は細胞数を示している。例３ロゼット形成試験でＡ３３陽性であった細胞ライン（表１）を、０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を使用して、ＰＢＳ，ｐＨ７．４中で溶解させた。当業者に知られているその他のデタージェントも、Ａ３３陽性細胞を溶解するために使用可能である。９つのＡ３３−陽性細胞ラインと、更に、５つのＡ３３−陰性細胞ライン（コントロール）の細胞可溶化物を、非還元条件を使用したウェスタンブロット分析によって、Ａ３３抗原の発現について調査した。約４３ｋＤの分子量を有する分子が、ロゼット形成試験でＡ３３陽性であった大腸癌細胞からの溶解物中に於いてｍＡｂＡ３３でのウェスタンブロットによって検出された。この分子は、ロゼット形成試験においてＡ３３について陰性であった細胞ラインから得られた溶解物中、又は、抗−アクチンｍＡｂを含むｍＡｂＡ３３以外の抗体によっては検出されなかった。Ａ３３抗原は、非還元条件を使用したＳＤＳゲル電気泳動後に於いてのみウェスタンブロット分析によって検出可能であった。Ａ３３抗原は、還元条件を使用した場合には検出不能であった。図２に示すウェスタンブロットは、ＳＷ１２２２細胞からのアフィニティー精製によって得られたＡ３３抗原を利用した。上側のバンド（図２）は、Ａ３３タンパク質の多量体形態を示している。例４Ａ３３抗原を、大腸癌細胞可溶化から免疫沈降させた。これを行うために、大腸癌細胞を、当業者に公知の標準技術を使用して、³Ｈ−ＧｌｃＮＡｃ又は³⁵Ｓで標識化した。ロゼット形成試験でＡ３３陽性であった細胞可溶化と、非還元条件下でのＳＤＳゲル電気泳動によって約４３ｋＤのバンドを示した細胞可溶化とを、モノクローナル抗体Ａ３３で免疫沈降させた。図３は、約４３ｋＤの分子量を有するＡ３３陽性溶解物から免疫沈降された分子を示している。このバンドは、ロゼット形成試験に於いてＡ３３陰性であった溶解物からは沈降しなかった。更に、このバンドは、ｍＡｂＡ３３以外の抗体によっては沈降しなかった(”ｎｏ．１°Ａｂ”は、ｍＡｂＡ３３が使用されなかったことを示す)。³Ｈ−ＧｌｃＮＡｃは、糖タンパク質のグリコシル化部位に導入される炭水化物であるので、これらの結果は、前記バンドに含まれるＡ３３抗原が、糖タンパク質であるということを示唆している。これを支持する更に別の証拠が、以下の所例に於いて提供される。例５ ³⁵Ｓで標識化されたＳＷ１２２２細胞を、５μｇ／ｍｌのツニカマイシンとともに１８時間インキュベートした。ツニカマイシンは、糖タンパク質のグリコシル化を阻止することが知られている。これらの細胞と、更に、ツニカマイシンとともにインキュベートされなかった細胞を溶解し、Ａ３３抗体、ＦＢ−５抗体（コントロール）と、又は抗体なし（コントロール）での免疫沈降を行った。図４は、これら免疫沈降の結果を示している。ツニカマイシンとともにインキュベートされなかった細胞では、Ａ３３抗体での免疫沈降は、約４３ｋＤのバンドを示した。アイソタイプコントロールである抗体ＦＢ−５、または、抗体なしでの免疫沈降は、そのような４３ｋＤバンドを示さなかった。ツニカマイシンとともにインキュベートされた細胞では、Ａ３３抗体での免疫沈降は、４３ｋＤのバンドと、更に、より低い分子量の３本の他のバンドとを示した。これらの低分子量バンドは、ツニカマイシンの存在に依り、グリコシル化程度の異なるＡ３３抗原の存在を示している。これは、Ａ３３抗原が、糖タンパク質であり、Ｎ結合型オリブ糖を含むこということの別の証拠を提供するものである。例６非還元条件下での二次元ゲル電気泳動を使用してＡ３３抗原を同定した。先ず、前記ＬＩＭ１２１５大腸細胞ラインを、１０％胎児ウシ血清を含有するＲＰＭＩ培地中で生育させた。集密(coufuant)細胞（１０⁶／ｃｍ²）を、Ｔｒｙｐｓｉｎ−Ｖｅｒｓｅｎe溶液を使用してプラスチックシャーレから分離させた。細胞を、前述したように、１０％の胎児ウシ血清、１μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、０．０２４Ｕ／ｍｌのインスリンおよび１０．８２μｇ／ｍｌのα−チオグリセロールを添加した、２５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０を含む組織培養シャーレ（１５０ｘ２０ｍｍ）に１／１０で播種した。前記シャーレを、５日間、５％ＣＯ₂の雰囲気中で３７℃でインキュベートした。前記培地の除去後、細胞を、細胞スクレーパによって除去する前に、ＰＢＳで洗浄した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、１０⁹ 細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。次に、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中で０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を使用して３ｘ１０⁸ＬＩＭ１２１５細胞からＡ３３抗原を抽出した。この抽出物を、３０％のグリセロールを含有する、アルギニン／リジン緩衝液，ｐＨ１０から成るサンプルバッファーで１：１に希釈し、非還元条件下で小（８ｘ８ｃｍ）Ｎｏｖｅｘ２次元ゲル電気泳動ゲルで電気泳動した。前記タンパク質を、第１次元目は、ｐＨ３．５−８．５での等電点泳動によって、第２次元目は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％アクリルアミドゲル）によって分離した。Ａ３３抗原は、ｍＡｂＡ３３を使用したイムノブロット分析（図５Ｂ）と共に、ＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｌｕｅＲ−２５０での染色によってゲル中で位置決定した。比較のために、抗−アクチンｍＡｂを使用して観察された染色パターン（図５Ａ）を示す。アクチンは、Ａ３３抗原に類似の泳動特性を有するために、比較用に使用した。例７前記ＬＩＭ１２１５細胞抽出物とクロマトグラフィーフラクションとについてバイオセンサー分析を行った。これら抽出物とフラクションとを、光学機器バイオセンサー（ＢＩＡｃｏｒｅ^TM，ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｓｅｎｓｏｒ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、Ａ３３ヒト化モノクローナル抗体のＦ(ａｂ)’₂フラグメントをバイオセンサー表面上に固定化して、モニターした。前記Ｆ(ａｂ)’₂フラグメントを調整するために、Ａ３３抗体を精製した(Ｋｉｎｇｅｔａｌ.；Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．７２，ｐｐ．１３６４ −１３７２(１９９５))．Ｆ(ａｂ)’₂フラグメントは、０．１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）中に於ける１０ｍｇのＡ３３ｍＡｂのペプシン（１％ｗ／ｗ）消化によって生成された。次に、これらを、０．１５ｍＭＮａＣｌ含有の５０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ７．４）で平衡させたＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ− ２００（２．８ｘ６０ｃｍ）カラム(Ｐharmacia Ｂiotech)でのサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。溶出は、０．５ｍｌ／分の流速で行った。Ｆ(ａｂ)’₂フラグメントに結合する抗原の検出は、金センサー表面で、又はその近傍での屈折率のわずかな変化を測定する技術である表面プラズモン共鳴の現象に基づく。このバイオセンサーアッセイの前に、細胞抽出物とクロマトグラフィーフラクションとを、ＢＩＡｃｏｒｅ^TM緩衝液(ＨＢＳ)；３．４ｍＭＥＤＴＡ，０．１５ｍＭＮａＣｌおよび０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する１０ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）中に、１００μｌの最終容量となるように希釈した。サンプル（３０μｌ）を、５μｌ／分の流速で、前記センサ表面上に注入した。注入相の完了後、同じ流速で３６０秒間、解離を、ＢＩＡｃｏｒｅ緩衝液中でモニターした。残留結合抗原を、溶出させ、表面を、４０μｌの１０ｍＭＮａＯＨを使用して、注入の間に再生させた。この処理によって、前記センサー表面に固定化されたタンパク質は変性しなかった。このことは、Ａ３３抗原を含有するサンプルの注入に於いて、同等のシグナルが得られることによって示される。図６は、アクチンと、完全Ａ３３抗体、又はＡ３３Ｆ(ａｂ)’₂フラグメントとの間の相互作用のバイオセンサー分析を示している。ウサギ筋肉アクチンの調製物（０．３μｇ）を、完全Ａ３３（上側トレース）又はＡ３３Ｆ(ａｂ)’₂ フラグメント（下側トレース）とのいずれかで固定化されたセンサー表面上に５ μｌ／分の流速で注入した。タンパク質／タンパク質相互作用を、表面プラズモン共鳴によってモニターした。注入相の最後に、Ａ３３ＩｇＧへのアクチンの結合に依って、２４７ＲＵのシグナルが観察されたのに対して、Ａ３３Ｆ(ａｂ)’₂ へのアクチン結合に対応するシグナルはわずか４ＲＵであった(矢印で示す)。例８Ａ３３抗原を、配列分析のためにＬＩＭ１２１５細胞から精製した。図７は、Ａ３３抗原の精製に使用したクロマトグラフィー精製プロトコールを示すフローチャートである。Ａ３３抗原を抽出するために、ＬＩＭ１２１５大腸細胞（２ｘ１０⁹細胞）を回収し、燐酸−緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、１ｍＭＰＭＳＦ，１ｍＭペプスタチン、０．１ｍＭロイペプチン、および０．０１Ｕ／ｍｌアプロチニンを含有する１５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中にて、０．３％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００又は１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４のいずれかで、４℃で３０分間、溶解（１０⁸細胞／ｍｌ）させた。その結果得られた抽出物を、１４，０００ｇで２０分間４℃で２回遠心分離した。Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００上清は、Ｇｒｅｅｎ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＥ−４ＢＤクロマトグラフィーのために直接に取り出した。ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４抽出上清は、上にリストしたプロテアーゼ阻害剤を含有する、０．０６％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４と、１５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中で、６％のスクロース上に層形成させた。前記ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４抽出物とスクロースとを含むチューブを、３７℃で３０分間インキュベートし、次に、２５℃ で、１５分間、５，０００ｇで遠心分離した。デタージェントを、クロマトグラフィー精製のために収集した。Ｇｒｅｅｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーを行うために、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００抽出物又はＴｒｉｔｏｎＸ−１１４デタージェント層を、０．１％Ｔｒｉｔｏｎの最終濃度となるように希釈し、高速タンパク質液体クロマトグラフィー(ＦＰＬＣ，ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ)に接続されたＧｒｅｅｎ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＥ−４ＢＤカラム（１００ｘ１０ｍｍＩＤ）に４℃にてロードした。前記カラムは、０．１％ＣＨＡＰＳ（ｗ／ｖ）を含有する１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で平衡化させた。アクチンを含む、結合したタンパク質を、１ＭＮａＣｌを用いて段階的に溶出した。そのブレークスルー（漏出）は、Ａ３３抗原を含有しており、これを、下記の、陰イオン−交換ＨＰＬＣのために収集した。例９Ａ３３抗原の存在を確認するために、精製過程において、ウェスタンブロット分析を行った。Ｐｈａｓｔｓｙｓｔｅｍ分離とコントロールユニット（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）を使用してプレキャストＰｈａｓｔｇｅｌｓで電気泳動とウェスタンブロット分析とを行った。細胞抽出物と、クロマトグラフィーフラクションとを、Ｒｅｉｄｅｔａｌ.，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｖｏｌ．１６，ｐｐ．１１２０−１１３０(１９９５) ，に記載されているように非還元条件下で、８−２５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥＰｈａｓｔｇｅｌ又は８−２５％ネイティブＰｈａｓｔｇｅｌｓで電気泳動し、ＰＶＤＦメンブレン上にトランスファーし、Ａ３３モノクローナル抗体とインキュベートした。ＲＰ−ＨＰＬＣで精製したＡ３３抗原も、非還元条件下と、還元条件下でポリクローナル抗−Ｎ末端ペプチド抗体（ここに記載）を使用し、ウェスタンブロットによって分析した。ＩｇＧ結合を、セイヨウワサビペルオキシダーゼ −標識化ヤギ抗−マウスＩｇＧ、ヤギ抗−ヒトＩｇＧ又はヤギ抗−ウサギＩｇＧによって調べ、ｅｎｈａｎｃｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＣＬ）によって検出した。図８は、ＬＩＭ１２１５大腸細胞のＴｒｉｔｏｎＸ−１００およびＴｒｉｔｏｎＸ−１１４抽出物のウェスタンブロット分析を示している。パネルＡは、以下のことを示している。レーン１：０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中で可溶化されたＬＩＭ１２１５細胞。レーン２：４３ＫＡ３３抗原を含有するＧｒｅｅｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅブレークスルー。レーン３：４１ｋＤ分子量バンドを含む１ＭＮａＣｌで溶出されたＧｒｅｅｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ結合タンパク質。レーン４：ウサギ筋肉アクチン(１μｇ)。パネルＢは以下のことを示している。レーン１：１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４中で可溶化されたＬＩＭ１２１５細胞。レーン２：ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４水相。レーン３：ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４デタージェント相。レーン４：Ｇｒｅｅｎ −Ｓｅｐｈａｒｏｓｅブレークスルー。レーン４：１ＭＮａＣｌで溶出されたＧｒｅｅｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ結合タンパク質。例１０Ｇｒｅｅｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー（上述）の後、陰イオン −交換ＨＰＬＣを行った。前記Ｇｒｅｅｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅブレークスルーを、０．１％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳを含有する１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中で予め平衡化させておいたＭｏｎｏＱＨＲ１０／１０カラム上に４℃で注入した。タンパク質を、１ｍｌ／分の流速で９０分間に渡って生成させたリニア０−１ＭＮａＣｌグラジェントを使用して前記カラムから溶出させた。フラクション（１ｍｌ）を、フラクションコレクター（ＦＲＡＣ１００，ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）を使用して自動的に収集した。タンパク質を、２８０ｎｍでの吸光度で検出した。Ａ３３抗原を、非還元条件でのウェスタンブロッティングと、バイオセンサー分析との両方によって検出した。図９は、Ａ３３抗原の陰イオン−交換ＨＰＬＣを示している。前記Ｇｒｅｅｎ −Ｓｅｐｈａｒｏｓｅブレークスルー画分に含まれていた前記タンパク質を、ＭｏｎｏＱＨＲ１０／１０陰イオン−交換カラムにロードし、０−１ＭＮａＣｌで示したリニアグラジェントで、１ｍｌ／分の流速で溶出させた。リニアンのアリコント（２０μｌ）をバイオアッセイ用に採取した。ここに記載したように非還元条件化でのウエスタンブロット分析（図９挿入）により、番号をつけたフラクション中において約４３ｋＤの抗原が検出された。例１１次に、サイズ排除ＨＰＬＣを行った。前記ＭｏｎｏＱカラム（１０ｍｌ）から溶出された活性のあるフラクションを、ＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮器（ＳａｖａｎｔＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＩｎｃ.，ＮＹ，Ｕ．Ｓ．Ａ.）を使用して１０倍に濃縮し、０．０５％ＣＨＡＰＳ（ｗ／ｖ）を含有するＰＢＳに対して透析し、４℃でＳｕｐｅｒｏｓｅ１２ＨＲ１０／３０カラム上にロードした。タンパク質を０．０５％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳを含むＰＢＳで、流速５００μｌ／分で溶出させた。フラクション（０．５ｍｌ）が収集された。タンパク質を、２８０ｎｍで検出し、Ａ３３抗原を、上述したウェスタンブロッティングとバイオセンサー分析との両方を使用してモニターした。図１０は、Ａ３３抗原のサイズ排除ＨＰＬＣを示している。タンパク質較正標準（ＢＳＡ二量体、ＢＳＡおよびトリプシンインヒビタ）の溶出位置を、クロマトグラフィトレースの上方に示す。Ａ３３抗原も、図中に示したフラクションに於いて非還元条件下でのウェスタンブロット分析によって検出された(挿入Ａ)。８−２５％ネイティブゲルを使用したＳｕｐｅｒｏｓｅ１２の活性の画分（フラクション２ −５）のイムノブロット分析は、Ａ３３抗原は、ネイティブ条件下（ＳＰＳなし）では１８０ｋＤの相対的分子量で泳動されることを示した（挿入Ｂ，図１０）。例１２次に、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーを行った。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２活性フラクション（２．５ｍｌ）を、１ｍｌ／分の流速で、複数回の各１ｍｌの注入によって、ＢｒｏｗｎｌｅｅＡｑｕａｐｏｒｅＲＰ３００ミクロ分取ＲＰ− ＨＰＬＣカラム（３０ｘ２．１っｍＩＤ）上にロードした。カラムは、水中の０．１５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）からなる開始溶液で、平衡化させておいた。タンパク質を、１００μｌ／分の流速で、６０％水性ｎ−プロパノール／０．１２５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡまでの６０分間のリニアグラジェントで溶出させた。カラム温度は４５℃であった。タンパク質検出を、２１５ｎｍで行った。Ａ３３抗原を、ウェスタンブロッティングとバイオセンサー分析との両方を使用して検出した。Ａ３３抗原を含むピークを、再精製し、上述したグラジェント条件で、５０μｌ／分の流速で、Ｎ−末端配列分析の前に、ＢｒｏｗｎｌｅｅＡｑｕａｐｏｒｅＲＰ３００ミクロ分取ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（１００ｘ１ｍｍＩＤ）を使用して更に濃縮した。溶出フラクションを、手作業によって回収した。図１１は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２活性フラクションのミクロ分取ＲＰ−ＨＰＬＣ精製を示している。パネルＡ、大きい枠は、２１５ｎｍでの吸光度、及びバイオセンサーによって分析されたミクロ分取ＲＰ−ＨＰＬＣからのフラクションの溶出プロファイルを示している。パネルＡ，挿入Ａ、は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８ −２５％ゲル、銀染色）によって分析された各フラクションのアリコット（２μ ｌ）を示し、パネルＡ，挿入Ｂは、非還元条件下に於けるウェスタンブロットを示している。パネルＢは、ミクロ分取ＲＰ−ＨＰＬＣからの個々のフラクションのバイオセンサー分析を示している。各フラクションのアリコット（２０μｌ）を、ＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮装置を使用して濃縮し、１００μｌのＢＩＡｃｏｒｅ^TM緩衝液中に再溶解させた。３０μｌのアリコットを、バイオセンサーを使用して分析した。４６分と４８分との間に溶出したフラクションに活性が見られた。例１３上述したように、Ａ３３抗原含有逆相ＨＰＬＣフラクションを、アミノ酸配列分析の為にプールした。精製Ａ３３抗原／タンパク質のＮ末端アミノ酸配列分析を、Ｈｅｗｌｅｔｔ−ＰａｃｋａｒｄモデルＧ１００５Ａタンパク質センサーを、Ｒｅｉｄｅｔａｌ.，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｖｏｌ．１６，ｐｐ．１１２０−１１３０（１９９５）に記載されているルーチン３．０シーケンサープログラムによって運転して行った。下記の３０アミノ酸のＮ末端配列が得られた（配列番号１）ＸＳＶＥＴＰＱＤＶＬＲＡＳＱＧＫＳＶＴＬＰＸＴＹＨＴＳＸＸＸＲＥＧＬＩＱＷＤすべての入手可能なタンパク質、ＤＮＡおよびｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇデータベースのサーチによっても、このＡ３３Ｎ末端は公知のタンパク質と有意なアミノ酸配列アイデンティティーは示されなかった。更に、Ａ３３抗原含有逆相ＨＰＬＣフラクションに対して、Ｓｉｍｐｓｏｎｅｔａｌ.，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ.，Ｖｏｌ．１８３ｐｐ．７１５− ７２２（１９８９）によって記載されているように、トリプシン消化を行った。ペプチドフラグメントＴ１とＴ２とが得られた。これらのペプチドフラグメントのアミノ酸配列を図１２に示す。例１４Ａ３３抗原含有フラクションを、図１３に示すプロトコールを使用してＳＷ１２２２細胞から得た。アフィニティークロマトグラフィーを行うために、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒｅｔａｌ.，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２５７，ｐｐ．１０７６６−１０７６９（１９８２）に記載されたプロトコールに従って、Ａ３３アフィニティーカラムを調製した。Ａ３３モノクローナル抗体を、０．１Ｍボレート、ｐＨ８．２中で１ｍｇ／ｍｌに希釈し、１．５ｍｌプロテインＡ −Ｓｅｐｈａｒｏｓｅと４℃で一晩インキュベートした。０．１Ｍボレート（ｐＨ９．２）での洗浄後、前記プロテイン−Ａ−モノクローナル抗体複合体を、０．１Ｍボレート，ｐＨ９．２中で２０ｍＭのジメチルピメリミデートと室温で１時間インキュベートした。非−共有結合抗体を、５０ｍＭグリシン、ｐＨ２．５で除去した。残りの活性ジメチルピメリミデート基を、洗浄によって不活性化し、ビーズを０．１ＭエタノールアミンｐＨ８．０とインキュベートした。逆相ＨＰＬＣフラクションを、アミノ酸配列分析のためにプールした。配列分析は、例１３に記載したように行った。下記のＡ３３Ｎ末端配列が得られた（配列番号４）ＩＳＶＥＴＰＱＤＶＬＲＡＳＱＧＫＳＶＴＬＰＸＴＹＨＴＳＴＳＳＲＥＧＬＩＱＷＤＫＬ配列検索を行ったが、公知のタンパク質との有意のＩアミノ酸配列アイデンティティーは全くなかった。このＮ末端配列を、Ａ３３抗原をコードするｃＤＮＡ配列（下記）を得るのに利用した。更に、Ａ３３抗原含有逆相ＨＰＬＣフラクションに対して、Ｓｉｍｓｏｎｅｔａｌ.，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ.，Ｖｏｌ．１８３，ｐｐ．７１５−７２２（１９８９）に記載されているＡｓｐ−Ｎエンドプロテイナーゼ消化を行った。ペプチドフラグメントＤ１、Ｄ２、Ｄ３及びＤ４が得られた。これらのペプチドを、ミクロ分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。これらのペプチドフラグメントのアミノ酸配列を、図１２に示す。ペプチドＤ４のエドマン分解のサイクル３において一つのアミノ酸が不明であると判定された。Ａｓｐ１１２の側方には、位置１１４のＴｈｒが存在する。これは典型的Ｎグリコシル化モチーフであるので、Ａ３３タンパク質がＮグリコシル化されたものであるという証拠が提供された。フラクションに対して、Ｓａｒｋａｒｅｔａｌ.，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ.，Ｖｏｌ．８８，ｐｐ２３４−２３８（１９９１）に記載されているように、ペプシン消化をも行った。ペプチドフラグメントＰ１が得られた。ペプチドフラグメントＰ１のアミノ酸配列を図１２に示す。ＲＰ−ＨＰＬＣフラグメントに対して、サーモリシン(Thermolysin)／ペプシン／Ａｓｐ−Ｎ消化を行った。サーモリシン消化は、Ｓａｒｋａｒ前出によって記載されているように行った。ペプチドフラグメントＰｃ１とＰｃ２が得られた。ペプチドフラグメントＰｃ１とＰｃ２とのアミノ酸配列を図１２に示す。例１５Ａ３３抗原のＮ末端のアミノ酸配列由来の免疫原を利用して免疫化研究を行った。化学合成されたペプチドである、ＳＶＥＴＰＱＤＶＬＲＡＳＱＧＫＳＶＴＬＰ（配列番号１のアミノ酸２−２１）を、ＫＬＨに結合させ、アジュバントと共に、２匹のウサギと２匹のラビットとに注射した。ウサギは、３週間間隔で４回免疫化した。１回目の免疫化に於いて、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を使用した。続くウサギの免疫化に於いては、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を使用した。マウスは標準的アジュバントを用いて２週間間隔で４回免疫化した。これらのウサギとマウスから血清を得た。これらの血清に対してウェスタンブロット分析を行った。ウサギとマウスとの両方が、前記ペプチドと、又、細胞ラインＳＷ１２２１を使用した時における４３ｋＤバンド（同じ４３ｋＤバンドがｍＡｂＡ３３によって認識された）と反応するＩｇＧ抗体を生成させたことが判った(図１４)。ＩｇＧを、プロテイン−Ａアフィニチィクロマトグラフィーによってウサギ免疫血清から精製した。精製ＩｇＧを、ＬＩＭ１２１５細胞可溶化と精製Ａ３３抗原との反応性に関して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析によってキャラクタライズした。前記ＩｇＧは、上述した２０アミノ酸ペプチド及び、非還元条件下に於いてｍＡｂＡ３３によって認識される前記約４３ｋＤのタンパク質と、強く反応することが判った。更に、ウサギＩｇＧ抗−血清は、還元形態の完全Ａ３３抗原と強く反応した(図１５)。ＬＩＭ１２１５からのＨＰＬＣ精製Ａ３３抗原（０．１μｇ）を、非還元条件下（図１５、レーン１）と、還元条件下（図１５、レーン２）とに於いて、８−２５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥＰｈａｓｔｇｅｌで電気泳動にかけ、上述した、配列番号１の残基２−２１に対して作成した抗−ペプチドＩｇＧを使用したウェスタンブロットによって分析した。Ａ３３抗原Ｎ末端配列と、そのフラグメントとは、Ａ３３抗原−特異的抗体の開発に利用することができる。これらの抗体は、還元形態又は非還元形態に於いて、Ａ３３抗原、又はそのフラグメントを認識し、これに結合する。例１６Ａ３３タンパク質のＡ３３Ｎ末端のアミノ酸配列を使用して、Ａ３３タンパク質のｃＤＮＡをクローニングした。ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ（８０μｇ）を、標準手順を使用してオリゴ（ｄＴ）セルロースのカラムでの２ラウンドのニング濃縮によって集密ＬＩＭ１２１５細胞の内部から調製した。ＬＩＭ１２１５ｃＤＮＡライブラリーを、このｍＲＮＡを使用して、ファーストストランドＤＮＡ合成（標準手順）を開始するためにオリゴ（ｄＴ）とランダムヘキサマープライマーとを使用してＣｌｏｎｔｅｃｈ（ＰａｌｏＡｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ．Ｓ．Ａ.）によるλＺＡＰＩＩ発現ベクター中で特別(custum)合成した。前記ライブラリーの良好なスクリーニングが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して前記ＬＩＭ１２１５ｃＤＮＡライブラリーから作成したＤＮＡプローブによって達成された。それぞれが８通りのみの縮重を有する６つの１７マーアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｒ９−Ｒ１４）を前記Ａ３３抗原Ｎ末端配列のアミノ酸残基３４−３９（ＬＩＱＷＤＫ(配列番号４のアミノ酸３４ −３９)）に対応させるようにデザインした。これらを、λＺＡＰＩＩベクタのバックボーンに存在する配列とハイブリダイズするようにデザインされたセンスプライマと対合にし、Ａ３３抗原テンプレートのソースとしての増幅ＬＩＭ１２１５ｃＤＮＡライブラリーでのＰＣＲ反応に使用した。良好な反応が、下記のプライマを使用した時に起こった。ＰＣＲ反応のために、使用したテンプレートは、増幅したλＺＡＰＩＩベクター中のＬＩＭ１２１５ｃＤＮＡライブラリーであった。使用したプライマーは、下記の通りであった。ＫＳプライマー５’ＣＧＡＧＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＴＣＧ（配列番号１８）(１７マー)（λＺＡＰＩＩベクターのマルチクローニングサイト中の配列とハイブリダイズする）そして、Ｒ１０プライマー(上記)。反応条件は下記の通りであった。 cDNA ライブラリー（10" pfu/ml） 1 μl 10 x T′aq^TM バッファー 5 μl 2.5 mM NTPs 4 μl 15 mM MgCl₂ 5 μl KS（50 pmoles/μl） 1 μl R10（50 pmoles/μl） 1 μl 水 32.5 μl Taq ポリメラーゼ 0.5 μl（HotStartの最後に添加） 50.0 μl ＰＣＲに使用したタッチダウンプログラムは以下の通りであった。 1 95°C x 5 分 2 95℃ x 1 分 3 60℃ x 1 分引き続くサイクルにおいては−２℃ 4 72℃ x ２分 5 （２）に戻り１１回繰り返し 6 95℃ x 1 分 7 37℃ x 2 分 8 72℃ x 2 分 9 95℃ x 1 分 10 45℃ x 2 分 11 72℃ x 2 分 12 (９)に戻り１３回繰り返し 13 72℃ x 5 分 14 ４℃維持三つの産物が生成され、これらは、１．４ｋｂ，０．５ｋｂおよび０．３ｋｂ長であった。前記１．４ｋｂ産物（Ｒ１０／１とする）と、前記０．５ｋｂ産物（Ｒ１０／２とする）とを３％アガロースゲルで分離し、Ｂｒｅｓａ−ｃｌｅａｎ^TM核酸精製キット（Ｂｒｅｓａｔｅｃ，Ａｄｅｌａｉｄｅ，Ｓ．オーストラリア）を使用して静止した。より多量の産物を生成するために、これらの精製産物を、更なるＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。ＰＣＲ反応は、１μｌの前記ＬＩＭ１２１５ｃＤＮＡライブラリーの代わりに、１μｌの精製ＰＣＲ産物(Ｒ１０／１又はＲ１０／２)をＤＮＡテンプレートとして使用したことを除いて、全く前述したのと同じ要領で行った。前記Ｒ１０／１ＰＣＲ反応によって二つのバンドが生成された。上側バンドサイズ１．４ｋｂ（微弱）下側バンドサイズ０．３ｋｂ（強）１０／１３００ｂｐと称する、前記Ｒ１０／２ＰＣＲ反応によって二つのバンドが生成された。上側バンドサイズ０．５ｋｂ（強）下側バンドサイズ０．３ｋｂ（強）１０／２と称する。前記０．３ｋｂフラグメント（１０／１３００ｂｐおよび１０／２）を上述のようにゲルで精製した。両方のフラグメントのヌクレオチド配列決定を行ったところ、各配列の逆相補鎖が、Ａ３３Ｎ末端タンパク質配列の一部分をコードすることがわかった。次に、ＬＩＭ１２１５ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用する正確な１８９ｂｐＰＣＲ産物を増幅するために、Ａ３３抗原ｃＤＮＡ配列に対する下記の正確なプライマーを合成した。プライマー＃１７４７（Ａ３３センスプライマー１）５’ＣＣＴＧＴＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＣＣＡＧＴ（２０マー）(配列番号１９) プライマー＃１７４８（Ａ３３アンチセンスプライマー１）５’ＡＧＧＴＧＣＡＧＧＧＣＡＧＧＧＴＧＡＣＡ（２０マー）(配列番号２０)。上記プライマーを、下記の標準式ＰＣＲ反応に使用し、予想されたサイズ（１８９ｂｐ）の産物を生成させた。標準ＰＣＲ反応条件１０／１−３００ｂｐ産物１μｌ１０ｘＴ’ａｑバッファー２μｌ２．５mＭＮＴＰｓ１．６μｌ１５mＭＭｇＣｌ₂ ２μｌプライマー＃１７４７（５０ｐｍｏｌｅｓ／μｌ）１μｌプライマー＃１７４８（５０ｐｍｏｌｅｓ／μｌ）１μｌ水１１μｌＴａｑポリメラーゼ０．４μｌ（最後に添加）２０．０μｌ下記の標準ＰＣＲプログラム１９５℃ｘ５分間２９５℃ｘ１分間３５５℃ｘ１分間４７２℃ｘ１分間５（２）に戻り３０回繰り返し６７２℃ｘ５分間７４℃維持前記１８９ｂｐ産物を、３％アガロースゲルで分離し、Ｂｒｅｓａ−Ｃｌｅａｎ^TMキットを使用して精製した。次に、それを、周知のランダムプライマー反応とＫｌｅｎｏｗポリメラーゼ手順を使用して＞１０⁷ｄｐｍ／μｇＤＮＡの比放射能にまで、[α³²Ｐ]ＡＴＰと［α³²Ｐ］ＣＴＰとで放射性標識化し、前記ＬＩＭ１２１５ｃＤＮＡライブラリーの８００，０００クローンをスクリーニングするのに使用した(標準式手順)。３ラウンドのスクリーニング後、１３の精製Ａ３３抗原ｃＤＮＡクローンが得られ、そのうちの最も長いものは、約２．８ｋｂであった。以下参照。前記標識化ＰＣＲプローブを、ノザン分析にも使用し、ＬＩＭ１２１５細胞からのトータルＲＮＡとポリ（Ａ）⁺濃縮ＲＮＡ中に、約２．８ｋｂのサイズのｍＲＮＡの単一種との強いハイブリダイズシグナルが生成され、これは、前記２．８ｋｂクローンが、全長に近いものであることを示唆した。複数のクローンを配列決定したところ、すべてがＡ３３抗原Ｎ末端タンパク質配列をコードすることが判った。２．６ｋｂクローン（クローン１１）の完全なヌクレオチド配列を図１６に示す。一つの２．６ｋｂｃＤＮＡを上述したように放射能標識化し（即ち、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼでのランダムプライマー反応で［α³²Ｐ］ＡＴＰと［α³²Ｐ］ＣＴＰとを使用して）ノザン分析に使用したとき、Ａ３３抗原陽性細胞ライン（ＬＩＭ１２１５，ＬＩＭ１８９９およびＬＩＭ１８６３）と、正常ヒト結腸上皮組織とから調製されたトータルＲＮＡについて、約２．８ｋｂのサイズの強いシグナルが得られたが、Ａ３３抗原陰性細胞ライン（ＬＩＭ２０９９，ＬＩＭ２４０５，ＬＩＭ２５３７）については得られなかった。３１９アミノ酸翻訳タンパク質生成物（Ａ３３抗原）を、複数の２．６ｋｂクローンのヌクレオチド配列から推定した。タンパク質翻訳は、ｃＤＮＡ配列の５ ’末端から２番目のＡＴＧに於いて開始させるものと予測された。これは、翻訳開始に関するＫｏｚａｋコンセンサス配列（ＧＣＣＣ（Ｒ）ＣＣＡＴＧＧ(配列番号２１)）を参照して推定された。推定全長翻訳タンパク質産生物は、３１９のアミノ酸からなり、次のアミノ酸配列（配列番号２２）を有している。このタンパク質は、切断されて配列番号２２のアミノ酸２２−３１９に対応する既知のＮ末端を備えた２９８アミノ酸の成熟タンパク質を産生する２１アミノ酸の疎水性リーダ配列を含有するものであると提案される。即ち、最初のイン・フレーム停止コドンの位置により、３３２７６のＭｒを有するポリペプチド鎖が予想される。前記アミノ酸配列から構築された親水性プロットに基づくと、前記分子は、三つの部分を有しているようである。即ち、２１３アミノ酸の細胞外領域(その保存残基の配列アラインメントによって、二つの免疫グロブリン様ドメインを有するものと考えられる)、２４−２７アミノ酸の高度に疎水性の膜貫通ドメイン、そして、極性の高い細胞内Ｃ末端尾。この一般構造は、前記分子がシグナルトランスダクションに関与していることを示唆している。クローン１１の５’末端から数えて塩基対１１３で始まり、クローン１１の塩基対１０７０まででおわる、前記２９８アミノ酸タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、以下の通り（配列番号２３）である。入手可能なＤＮＡおよびタンパク質データベースとの比較は、上述したアミノ酸（配列番号２２）から成るタンパク質が新規であることを明らかにした。しかしながら、入手可能なｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇ（ＥＳＴ）データベースの分析は、ヒトＡ３３抗原cＤＮＡの一部（ヌクレオチド２８６ −５２９）と、ネズミ胎生期ガン細胞ラインＦ９（ＥＭＢＬ承認番号ＭＭ８８Ａ０９；ＤＤＢＪ承認番号Ｄ２８６５７）由来の２４９塩基対ＥＳＴとの間の７４％の配列類似度を明らかにした。このＥＳＴは、ヒトＡ３３抗原ｃＤＮＡのマウスホモローグの一部に対応している可能性があったので、センスおよびアンチセンスＰＣＲプライマー（１７マー）を、前記ＥＳＴクローンの末端部にハイブリダイズするように以下のようにデザインした。これらのプライマーを、上述したタッチダウンＰＣＲプログラムに使用して、正常な成体マウス結腸陰窩ｃＤＮＡライブラリーからの２１８ｂｐ産物を増幅した。使用した前記マウスｃＤＮＡライブラリーの詳細については、例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２７２１４−２７２２５（１９９３）を参照。簡単に説明すると、ｃＤＮＡを、成体マウス結腸陰窩上皮から精製されたポリ（Ａ）⁺ 濃縮ＲＮＡから逆転写し、次に、これを、λｇｔ−１１発現ベクタにクローニングした。この産物を、ゲル精製し、ＤＮＡ配列決定したところ、この産物が、前記Ｆ９ＥＳＴと密接に対応しているものであることが示された。前記マウス大腸ＰＣＲ産物の翻訳は、Ａ３３抗原の配列の一部分（切断された分子の残基６４−１０４、配列番号２２の残基８５−１２５）とのかなりのホモロジーを明らかにした。予想ヒトおよびマウスタンパク質配列間のアラインメントを下に示す前記Ｆ９ＰＣＲ産物を、放射性標識化（前と同じく［α³²Ｐ］ＡＴＰと［α³² Ｐ］ＣＴＰ）して、複数のマウス組織ＲＮＡ（結腸陰窩、小腸陰窩、腎臓、肝臓、脳、脾臓、胸腺、肺、膵臓、精巣、心臓および大腿部筋から）のノザン分析に於けるプローブとして使用した。約２．６ｋｂのサイズの強いバンドは、結腸陰窩と小腸陰窩とから調製されたＲＮＡを含むレーンに於いてのみ見られ、精巣および膵臓ＲＮＡが使用された場合には、非常に弱いシグナルが見られた。このヒトＡ３３抗原ｍＲＮＡのサイズとの近い対応性と、更に、前に示したアラインメントと、制限された組織発現とは、共に、前記Ｆ９クローンが、Ａ３３抗原のマウスホモローグをコードするものであることを強く示唆している。更に、これらのデータは、前記Ｆ９ＥＳＴが、エラーを含んでいることと、真正の配列は、ここに記載する前記ＰＣＲ産物の配列によってより良好に記載される、ということを示唆している。次に、前記Ｆ９ＰＣＲ産物を使用して、全長マウスＡ３３ｃＤＮＡクローンを得るために、前述したマウス結腸陰窩ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。標準方法を使用し、２０のクローンが同定され、これらの大半は、約２．２ｋｂのＡ３３ｃＤＮＡインサートを有していたが、２つは、より長い４．２ｋｂのインサートを有していた。標準方法を使用して、これらの二つの長いクローンと、前記２．２ｋｂのクローンの内の二つに対してＤＮＡ配列決定を行った。４．２ｋｂクローンの３’配列は、Ａ３３抗原ｃＤＮＡと対応せず、ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡアルゴリズムを利用した公共利用可能なライブラリーの配列類似性検索は、前記３’末端が、胃、非筋肉Ｃａ²⁺ＡＴＰ−ａｓｅのｃＤＮＡに対応するものであることを明らかにした。４つのクローンの全ての５’末端は、Ａ３３抗原ヌクレオチド配列として認識可能であった。従って、前記４．２ｋｂクローンは、その５’末端にＡ３３ｃＤＮＡを、その３’末端に胃非筋肉Ｃａ²⁺ＡＴＰ−ａｓｅｃＤＮＡを有している。該４．２ｋｂクローンの配列決定は、Ａ３３ｃＤＮＡの２２０２塩基対を示した。前記短いクローンは、前記抗原の２１２２塩基対のｃＤＮＡを含有していた。最も長いＯＲＦの翻訳は、−ＮＨ₂末端が不完全な３１８アミノ酸タンパク質を予測させる。これは、前記ヒト抗原と同じ基本構造を示し、これは、それに対して高度に相同である。２０アミノ酸の疎水性リーダ配列（開始メチオニンを欠く）がみられ（ヒトの２１との比較で)、一つのＶ−セット、一つのＣ２セットの免疫グロブリン様ドメイン、一つの２４アミノ酸疎水性膜貫通ドメイン、そして、６１アミノ酸細胞内ドメインとが提示されている。更に、前記Ｎ末端領域は、ヒト切断部位：ＡＤＡ↑ＩＳＶＥＴ（配列番号３０）に類似のコンセンサスペプチド切断部位：ＡＤＡ↑ＬＴＶＥＴ（配列番号２９）を有し、これらはそれぞれ、２９８アミノ酸の成熟タンパク質を産生する。全体の分析は、細胞外ドメインに於けるマウスとヒトの配列間の７１％の類似、膜貫通ドメインに於ける６７％の類似度、そして、細胞内ドメインに於ける５４％の類似度を示している。前記マウスタンパク質は、９１、１７９、および２０２に於いて三つの潜在部位を有するヒト配列と比較して、位置７８、９１、１７９および２０２に４つの潜在Ｎ結合型グリコシル化部位を示している。前記マウスクローンのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を、配列番号３１と３２として示す。ヒトとマウスの配列の前記推定アミノ酸配列のアラインメントを図１７に示す。例１７上述したプロトコルを使用してさらなる実験を行い、同じくＡ３３をコードする最長のＡ３３抗原ｃＤＮＡクローン（クローン１８）が見つかった。このクローンのヌクレオチド配列を、配列番号３３に示す。クローン１８は約２．８キロベース長であるのに対してクローン１１は、既にしめしたように、２．６キロベース長である点で、このクローンは、上述したクローン１１よりもわずかに長い。配列番号２９に於いて、ヌクレオチド３４５−１３０２は、配列番号３３に示した前記アミノ酸配列をコードするものであると考えられる。例１８上述したように、Ａ３３分子は、Ｎ−結合型グリコシル化を有する糖タンパク質であると考えられる。抗原に対する翻訳後の修飾に関する更なる研究が行われた。上述の文献に報告されているように、細胞ラインＳＷ1222,ＬＩＭ 1215,ＣＯＬＯ 205は全てＡ３３に関して陽性であったが、ＳＷ６２０、ＭＦ-ＳＨはＡ３３に関して陰性であった。これら全ての細胞ラインは、³Ｈパルミテートにより５００μＣi/m lとなるように代謝的に標識化され、その後デタージェントにより溶解され、上述されるように、溶解物はＡ３３とＦＢ５により沈降させた。ここで再び、ＦＢ５はネガティブコントロールとして機能する。沈降物はその後ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析と、オートラジオフルオログラフィーにより分析された。結果は図１８と１９に示される。図１８では、期待通り還元条件下と非還元条件下での分子量において³ＨパルミテートがＡ３３抗原を標識している事がわかる。標識された沈降物は３つの全ての陽性細胞において見つけられたが、陰性細胞においては見つけられなかった。全てのテストにおいてＦＢ５は陰性であった。ＳＤＳゲルが、オートラジオフルオログラフィーの前に１Ｍヒドロキシルアミン（ｐＨ7.5）により処理された場合、図 19 に示される通り、染色がなくなった。これはパルミテート基（アシル）はチオエステルにより連結されていることを示す。（Ｃys）₄ドメインが分子中に存在し、パルミテートはこれに連結されていると思われる。単離され、キャラクタライズされ、配列決定されたＡ３３抗原は、ガン、特にＡ３３抗原の発現により特徴づけられる大腸癌の診断に利用できる。例えば、大腸癌細胞を含んでいると考えられるサンプルをＡ３３抗原あるいはそのフラグメントに特異的な抗体に接触させると、Ａ３３蛋白質/抗体複合体が形成される。もしこのような複合体が存在すれば、大腸ガン診断において、陽性であることが示される。更に、Ａ３３抗原は、これに連結するリガンド（結合パートナー）を同定するのに利用できる。Ａ３３抗原は、単離され、組換え体として発現されることができ、さらに、組織培養培地、組織抽出物、及び細胞可溶化物を含む生物源を、結合パートナーの存在についてスクリーニングするのに利用できる。結合パートナーが見つかると、単離され、精製され、配列決定される。これはバイオセンサーとアフィニティーや他のクロマトグラフィー技術とを併用して行うことができる。さらに、Ａ３３抗原をタグし、抗原をバイオセンサー表面やアフィニティの担体に対する特定の方向に固定化することに役立てることができる。当業者に知られている技術を使って結合パートナーを同定する事ができる。例えば、Ｓtitt e t al.,Ｃell,Ｖol.80,pp.661-670(1995),Ｎice et al.,Ｊ.Ｃhromatography Ａ. ,Ｖol.660,pp.169-185(1994) and Ｂartley et al.,Ｎature,Ｖol.368,p.558(1994); Ｌachmann et al.,Ｐroc .Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ93: 2523-2527(1993)等を参照。更に、Ａ３３抗原をコードするｃＤＮＡについてここに記載される。5'末端や 3'末端の端部における非翻訳部分を含め、このｃＤＮＡはＡ３３抗原を発現している組織や細胞ラインよりのＡ３３抗原の二本鎖ｃＤＮＡ分子の生産や、ゲノムＤＮＡよりのＡ３３抗原のゲノムクローンの生産を容易にすることが可能である。これを行うために、Ａ３３のｃＤＮＡが、ｍＲＮＡテンプレートから二本鎖ｃＤＮＡ分子を生産する一般的な行程であるＲＴ-ＰＣＲ（反転写酵素―ＰＣＲ）の技術に利用される相補的プライマーをデザインすることに利用される。更に、Ａ３３のｃＤＮＡは、ゲノムＤＮＡテンプレートよりＡ３３抗原遺伝子の部分を増幅させるための標準ＰＣＲ反応に利用される相補的プライマーをデザインすることに利用可能である。Ａ３３抗原が関連蛋白質の新規なファミリーに属する可能性がある。ここに記載されるＡ３３のｃＤＮＡ配列は、Ａ３３抗原に関連する蛋白質をコードするｃＤＮＡとゲノムＤＮＡ分子の部分を増幅するための低ストリンジェント条件下でのＰＣＲ反応に利用される特異的な、ディジェネレートオリゴヌクレオチドのプライマーをデザインすることに利用することが可能である。更に、低ストリンジェント条件下でのゲノムＤＮＡのサザン分析によりＡ３３抗原遺伝子ファミリーのメンバーを同定するための、特異的なディジェネレトオリゴヌクレオチドプローブをデザインするのにＡ３３ｃＤＮＡは利用可能である。Ａ３３のｃＤＮＡを利用するこれらの行程は、分子生物学における当業者に知られる標準的な行程である。例えば、Ｍolecular Ｃloning:ＡＬaboratory man ual，2_ndedition，1989(Ｓambrook Ｊ,Ｆritsch ＥＦ＆Ｍaniatis Ｔ編集)Ｃo ld Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐress,Ｕ.Ｓ.Ａ.やＣurrent Ｐrotocols in Ｍolecular Ｂiology Ｖolumes Ｉ＆II,1989(Ａusubel,ＦＭ編集)Ｇrrne Ｐub lishing Ａssociates and Ｗiley-Ｉnterscience，Ｕ.Ｓ.Ａ.を参照。本発明は好適実施形態を参照して説明されたが、これらの実施形態はあくまで本発明の数々の特徴を説明するためのものであって、本発明の思想や範囲内で、これらの実施形態に対していろいろな変更等を加えることが可能である。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年８月１９日【補正内容】請求の範囲：１．単離タンパク質含有分子であって、そのタンパク質部分が、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定において、４０−４５ｋＤの分子量を有し、前記分子がモノクローナル抗体Ａ３３に結合する単離タンパク質含有分子。２．前記分子が組み換え体である請求項１の単離タンパク質含有分子。３．配列番号２２に示すアミノ酸配列、又は配列番号２２のアミノ酸２２−３１９からなる単離タンパク質含有分子。４．ｃｙｓ４３とｃｙｓ１１７がジスルフィド結合によって結合している請求項３の単離タンパク質含有分子。５．配列番号２２のアミノ酸配列の中の抗原性フラグメントからなる単離ペプチド分子であって、前記ペプチドがモノクローナル抗体Ａ３３に結合する単離ペプチド分子。６．前記ペプチドが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及び１１からなるグループから選択されるアミノ酸配列からなる、請求項５の単離ペプチド。７．前記ペプチドが組み換え体である請求項５の単離ペプチド。８．請求項１のタンパク質含有分子のタンパク質部分をコードする単離核酸分子。９．前記分子が配列番号２３に示すヌクレオチド配列を有する請求項８の単離核酸分子。１０．前記Ａ３３タンパク質が、配列番号２２に示すアミノ酸配列、又は配列番号２２のアミノ酸２２−３１９からなるアミノ酸配列を有する請求項８の単離核酸分子。１１．プロモーターに操作可能にリンクした請求項８の単離核酸分子を有する発現ベクター。１２．請求項８の核酸分子でトランスフォーメーション又はトランスフェクションされた宿主細胞。１３．請求項１１の発現ベクターでトランスフォーメーション又はトランスフェクションされた宿主細胞。１４．(ａ)配列番号２２のアミノ酸の線状配列に対応するアミノ酸配列を含む分子を単離、又は発現させる工程と、（ｂ）前記分子を用いて生物源をスクリーニングする工程と、（ｃ）前記生物源から前記分子に結合するリガンドを単離する工程、とを有するＡ３３抗原に結合するリガンドを得る方法。１５．前記分子が配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１及び２２からなるグループから選択されるアミノ酸配列を有する請求項１４の方法。１６．(ａ)配列番号２９に示すヌクレオチド配列の部分に相補的なプライマー対を開発する工程と、（ｂ）前記プライマー対を利用して逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を行って、Ａ３３抗原を発現する生物源からＡ３３抗原二本鎖ｃＤＮＡを得る工程とを有する、Ａ３３抗原をコードする核酸分子を得る方法。１７．(ａ)配列番号２９に示すヌクレオチド配列の部分に相補的なプライマー対を開発する工程と、（ｂ）前記プライマー対を利用してポリメラーゼ連鎖反応を行って、Ａ３３抗原ゲノムＤＮＡテンプレートからＡ３３抗原遺伝子フラグメントを増幅させる工程と、を有するＡ３３抗原遺伝子フラグメントを得る方法。１８．(ａ)配列番号２９に示すヌクレオチド配列の部分に相補的な特異的ディジェネレートオリゴヌクレオチドプライマーを開発する工程と、（ｂ）前記プライマーを利用して低いストリンジェンシーのポリメラーゼ連鎖反応を行って、Ａ３３抗原に関連するタンパク質をコードするｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡの部分を増幅させる工程と、を有するＡ３３抗原に関連するタンパク質をコードする核酸分子を同定する方法。１９．(ａ)配列番号２９に示すヌクレオチド配列の部分に相補的な特異的ディジェネレートオリゴヌクレオチドプライマーを開発する工程と、（ｂ）前記プライマーを利用して低いストリンジェンシーの条件下でゲノムＤＮＡのサザン分析を行って、Ａ３３抗原に関連するタンパク質をコードする前記核酸分子を得る工程と、を有するＡ３３抗原に関連するタンパク質をコードする核酸分子を同定する方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｅ // Ａ６１Ｋ 31/00 ６３５Ｔ 39/395 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ 5/00 Ａ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (71)出願人リッター，ゲルトアメリカ合衆国ニューヨーク 10105 ニューヨークアベニュー・オブ・ジ・アメリカズ 1345 (71)出願人シンプソン，リチャード，ジェイオーストラリア国ヴィクトリア 3050 メルボルン（無番地）ピー・オー・ロイヤル・メルボルン・ホスピタル (71)出願人ナイス，エドワードオーストラリア国ヴィクトリア 3050 メルボルン（無番地）ピー・オー・ロイヤル・メルボルン・ホスピタル (71)出願人モリッツ，アール，エルオーストラリア国ヴィクトリア 3050 メルボルン（無番地）ピー・オー・ロイヤル・メルボルン・ホスピタル (71)出願人キャティメル，ブルーノオーストラリア国ヴィクトリア 3050 メルボルン（無番地）ピー・オー・ロイヤル・メルボルン・ホスピタル (71)出願人ジ，フンオーストラリア国ヴィクトリア 3050 メルボルン（無番地）ピー・オー・ロイヤル・メルボルン・ホスピタル (71)出願人バージェス，アンソニーオーストラリア国ヴィクトリア 3050 メルボルン（無番地）ピー・オー・ロイヤル・メルボルン・ホスピタル (71)出願人ヒース，ジョーンオーストラリア国ヴィクトリア 3050 メルボルン（無番地）ピー・オー・ロイヤル・メルボルン・ホスピタル (71)出願人ホワイト，サラオーストラリア国ヴィクトリア 3050 メルボルン（無番地）ピー・オー・ロイヤル・メルボルン・ホスピタル (71)出願人ジョンストン，キャメロンオーストラリア国ヴィクトリア 3050 メルボルン（無番地）ピー・オー・ロイヤル・メルボルン・ホスピタル (72)発明者オールド，ロイド，ジェイアメリカ合衆国ニューヨーク 10105 ニューヨークアベニュー・オブ・ジ・アメリカズ 1345 (72)発明者ウェルト，シドニーアメリカ合衆国ニューヨーク 10105 ニューヨークアベニュー・オブ・ジ・アメリカズ 1345 (72)発明者リッター，ゲルトアメリカ合衆国ニューヨーク 10105 ニューヨークアベニュー・オブ・ジ・アメリカズ 1345 (72)発明者シンプソン，リチャード，ジェイオーストラリア国ヴィクトリア 3050 メルボルン（無番地）ピー・オー・ロイヤル・メルボルン・ホスピタル (72)発明者ナイス，エドワードオーストラリア国ヴィクトリア 3050 メルボルン（無番地）ピー・オー・ロイヤル・メルボルン・ホスピタル (72)発明者モリッツ，アール，エルオーストラリア国ヴィクトリア 3050 メルボルン（無番地）ピー・オー・ロイヤル・メルボルン・ホスピタル (72)発明者キャティメル，ブルーノオーストラリア国ヴィクトリア 3050 メルボルン（無番地）ピー・オー・ロイヤル・メルボルン・ホスピタル (72)発明者ジ，フンオーストラリア国ヴィクトリア 3050 メルボルン（無番地）ピー・オー・ロイヤル・メルボルン・ホスピタル (72)発明者バージェス，アンソニーオーストラリア国ヴィクトリア 3050 メルボルン（無番地）ピー・オー・ロイヤル・メルボルン・ホスピタル (72)発明者ヒース，ジョーンオーストラリア国ヴィクトリア 3050 メルボルン（無番地）ピー・オー・ロイヤル・メルボルン・ホスピタル (72)発明者ホワイト，サラオーストラリア国ヴィクトリア 3050 メルボルン（無番地）ピー・オー・ロイヤル・メルボルン・ホスピタル (72)発明者ジョンストン，キャメロンオーストラリア国ヴィクトリア 3050 メルボルン（無番地）ピー・オー・ロイヤル・メルボルン・ホスピタル

Claims

【特許請求の範囲】１．大腸細胞と大腸ガン細胞の内部及び表面上に見られる単離タンパク質含有分子であって、前記単離タンパク質含有分子は、非還元条件下のＳＤＳゲル電気泳動での測定において、約４０−４５ｋＤの分子量、及び還元条件下のＳＤＳゲル電気泳動での測定において約４９−５０ｋＤの分子量を有する単離タンパク質含有分子。２．請求項１の単離グリコシル化含有分子であって、前記分子がモノクローナル抗体Ａ３３に結合する単離グリコシル化含有分子。３．前記分子が組み換え体である請求項１の単離タンパク質含有分子。４．配列番号２２のアミノ酸配列からなるタンパク質と配列番号２２のアミノ酸２２−３１９からなるタンパク質とからなるグループから選択される単離タンパク質。５．配列番号２２のｃｙｓ４３とｃｙｓ１１７とがジスルフィド結合によって結合している請求項４の単離タンパク質含有分子。６．モノクローナル抗体Ａ３３に結合し、配列番号２２のアミノ酸の線状配列からなる単離ペプチド。７．配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及び１１からなるグループから選択されるアミノ酸配列を有するペプチドである請求項６の単離ペプチド。８．Ａ３３タンパク質をコードする単離核酸分子。９．前記分子が配列番号２３に示すヌクレオチド配列を有する請求項８の単離核酸分子。１０．前記Ａ３３タンパク質が、配列番号２２に示すアミノ酸配列、又は配列番号２２のアミノ酸２２−３１４からなるアミノ酸配列を有する請求項８の単離核酸分子。１１．プロモーターに操作可能にリンクした請求項８の単離核酸分子を有する発現ベクター。１２．請求項８の核酸分子でトランスフォーメーション又はトランスフェクションされた宿主細胞。１３．請求項１１の発現ベクターでトランスフォーメーション又はトランスフェクションされた宿主細胞。１４．大腸細胞と大腸ガン細胞の内部及び表面上に見られるタンパク質含有分子に対して特異的な抗体であって、前記抗体がＡ３３ではなく、又、前記分子が非還元条件下でのＳＤＳゲル電気泳動での測定において約４０−４５ｋＤの分子量、及び還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥでの測定において約４９−５５ｋＤの分子量を有する、大腸細胞と大腸ガン細胞の内部及び表面上に見られるタンパク質含有分子に対して特異的な抗体。１５．大腸ガン細胞の内部及び表面上におけるＡ３３抗原の存在によって特徴づけられる大腸ガンの診断方法であって、（ａ）タンパク質／抗体複合体が形成されるように、前記大腸ガン細胞を含有すると考えられるサンプルと、請求項１のタンパク質含有分子、又はそれに由来するペプチドフラグメントに対して特異的な抗体とを接触させる工程と、（ｂ）前記複合体の存在が大腸ガン陽性であるという診断を示す、前記複合体が存在するか否かを判定する工程とを有する大腸ガンの診断方法。１６．(ａ)配列番号２２のアミノ酸の線状配列に対応するアミノ酸配列を含む分子を単離、又は発現させる工程と、（ｂ）前記分子を用いて生物源をスクリーニングする工程と、（ｃ）前記生物源から前記分子に結合するリガンドを単離する工程、とを有するＡ３３抗原に結合するリガンドを得る方法。１７．前記分子が配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１及び２２からなるグループから選択されるアミノ酸配列を有する請求項１６の方法。１８．(ａ)配列番号２９に示す配列に対して相補的なプライマーを開発する工程と、（ｂ）前記プライマーを利用して逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を行って、Ａ３３抗原を発現する生物源からＡ３３抗原二本鎖ｃＤＮＡを得る工程とを有する、Ａ３３抗原をコードする核酸分子を得る方法。１９．Ａ３３抗原遺伝子フラグメントを得る方法であって、（ａ）配列番号２９に示す配列に対して相補的なプライマーを開発する工程と、（ｂ）前記プライマーを利用してポリメラーゼ連鎖反応を行って、Ａ３３抗原ゲノムＤＮＡテンプレートからＡ３３抗原遺伝子フラグメントを増幅させる工程と、を有するＡ３３抗原遺伝子フラグメントを得る方法。２０．(ａ)配列番号２９に示す配列に対して相補的な特異的ディジェネレートオリゴヌクレオチドプライマーを開発する工程と、（ｂ）前記プライマーを利用して低いストリンジェンシーのポリメラーゼ連鎖反応を行って、Ａ３３抗原に関連するタンパク質をコードするｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡの部分を増幅させる工程と、を有するＡ３３抗原に関連するタンパク質を同定する方法。２１．(ａ)配列番号２９に示す配列に対して相補的な特異的ディジェネレートオリゴヌクレオチドプライマーを開発する工程と、（ｂ）前記プライマーを利用して低いストリンジェンシーの条件下でゲノムＤＮＡのサザン分析を行って、Ａ３３抗原に関連するタンパク質を得る工程と、を有するＡ３３抗原に関連するタンパク質を同定する方法。