KR20020008113A

KR20020008113A - 항원 아이오알 시2를 인식하는 항체 및 에프브이 단편

Info

Publication number: KR20020008113A
Application number: KR1020017008965A
Authority: KR
Inventors: 크리스티나마리아 마테오데아코스타델리오; 루르데스타티아나 로쿠에나바로; 알레조 모랄레스모랄레스; 롤란도 페레즈로드리게즈; 마르타 아얄라아빌라; 요르게빅토르 가빌론도카울리; 마르타 두에냐스포르토; 한셀 벨가르시아; 엔리케 렌지포칼자도; 노르만도 이즈나가에스코바르; 마이라 라모스주자르테
Original assignee: 아구스틴 라제 다빌라; 센트로 데 인무노로지아 몰레큘라
Priority date: 1999-11-16
Filing date: 2000-11-16
Publication date: 2002-01-29
Anticipated expiration: 2020-11-16
Also published as: EA200100782A1; CU22921A1; EP1174441A2; MXPA01007261A; TWI233440B; AU783622B2; CA2359577A1; EA005169B1; US6891023B1; AR026463A1; CO5280154A1; CN1344276A; CN1230446C; KR100827627B1; WO2001036485A3; ZA200105803B; AU1513001A; JP2003514831A; BR0007827A; WO2001036485A2

Abstract

본 발명은 부다페스트 조약에 따라 수탁 번호 ECCC 97061101로 수탁된 하이브리도마에 의해 생성된 쥐과동물 항체 IOR C5로부터 신규한 재조합 항체를 수득하는 것에 관한 것이다. 상기 재조합 항체는 재조합 DNA 기술을 사용하여 수득하였고, 이들이 항원 IOR C2를 인식함을 특징으로 한다. 재조합 항체는 특히 키메라 항체, 인간화된 항체 및 단일 사슬 Fv 단편이다. 키메라 항체는 쥐과동물 면역글로불린의 가변 도메인과 인간 면역글로불린의 불변 영역을 함유한다. 인간화된 항체는 인간 면역글로불린의 불변 영역을 함유하며, 쥐과동물 골격 영역 (FR) 및 이 중에서 T 세포에 대한 항원 부위를 생성시킬 수 있는 영역에서 특히 변형되었다. Fv 단편은 쥐과동물 면역글로불린의 가변 도메인을 함유한다. 또한, 본 발명은 결장직장 종양, 이의 전이 및 재발을 진단하고 치료하기 위해 쥐과동물 IOR C5로부터 유도된 재조합 항체를 사용하는 것에 관한 것이다.

Description

항원 아이오알 시2를 인식하는 항체 및 에프브이 단편{ANTIBODIES AND FV FRAGMENT RECOGNIZING ANTIGEN IOR C2}

다양한 형태의 결장직장 암종 치료법이 시험되어 왔지만, 현재까지 수술이 유일한 치료 방법이었다. 종양이 초기 단계에서 검출된 경우 수술은 높은 생존율에 이를 수 있게 해주지만, 불운하게도 대부분의 환자의 종양은 전이되었을 때 진단된다.

현재, 생존율을 증가시키기 위한 방법으로는 질병이 장기의 외부 층으로 전파되지 않아서 종양이 여전히 외과수술에 의해 치료될 수 있는 단계에서의 진단, 치료 및 역학이 있다. 이와 관련하여, 역학적 요인에 대한 지식 뿐만 아니라 새로운 치료 방법의 개발은 생존율을 증가시키는 것을 도울 것이다.

면역감마그래피 방법을 통해 암을 검출하기 위해 방사성 동위원소로 표지된모노클로날 항체 (Mab) 또는 이들의 단편을 사용하는 것이 지난 수 년간 수행되어 왔다. Mab는 방사성 동위원소의 캐리어로서 사용될 가능성 및 관련된 종양 항원에 표적화될 가능성을 나타내었다.

몇몇 방사선표지된 항체는 암배아성 항원 (CEA)과 관련된 종양을 검출하는 데에 사용되어 왔다. I-131 또는 I-125로 표지된, CEA에 대한 항체는 CEA를 생성하는 종양 또는 이러한 마커와 관련된 종양을 검출하는 데에 사용된다 (미국 특허 제 3 663 684 호, 미국 특허 제 3 867 363 호 및 미국 특허 제 3 927 193 호). 또한, Mab는 "생체내 (in vivo)" 진단을 위한 분자를 생성시키기 위해 Tc-99m으로 표지될 수 있다.

쾰러(Koehler)와 밀슈타인(Milstein)에 의한 하이브리도마 항체 기법의 개발은 면역화학 부문을 대변혁시켰고, 질병의 연구 및 임상 진단에 적용될 수 있는 새로운 종류의 시약을 제공하였다 (Koehler G; Milstein C. (1975) Nature 256, 495-497). 이러한 항체는 강력한 치료 효능을 나타내지 않았고, 기초적 연구 및 임상 진단에 사용되는 마우스 모노클로날 항체 (mAb)를 생성시키는 것은 일상적인 작업이 되었지만, 이러한 항체를 "생체내" 면역치료를 위해 사용하는 것은 어려운데, 이는 이들의 인체내에서의 반감기가 짧고 인간 면역계에 의한 마우스 항체 이펙터 도메인의 인식이 불량하며, 또한 외래 면역글로불린이 치료를 간섭할 수 있는 항글로불린 반응 (HAMA 반응)을 일으킬 수 있기 때문이다.

유전공학의 발달은 항체 유전자를 유전학적으로 조작하여 항원성은 감소되거나 제거되고 원하는 이펙터 기능은 향상된 mAb를 생성시킬 수 있는 능력을 혁신시켰고, 이 경우, 이러한 항체는 몇몇 병리의 치료 또는 진단에 사용된다. 이러한 조작은 쥐과동물 mAb를 동일한 항원 결합 특성을 지닌 거의 인간 형태로 전환시킬 수 있는 대안을 제공하였다 (Morrison S. L; et al 1984, P.N.A.S. USA, 81,6851-6855).

최근에는, 쥐과동물 또는 래트 항체를 인간화시켜 이들이 인체내에서 사용되는 경우 외래 단백질에 대한 이종 반응을 감소시키기 위한 몇몇 방법이 개발되었다.

항원성을 감소시키려는 첫 번째 목적 중의 하나는 "키메라" 항체를 생성시킴으로써 달성되었다. 이러한 분자에 있어서, 가변 도메인이 인간 골격내로 삽입되었고, 이렇게 함으로써 면역원성이 감소될 뿐만 아니라 이펙터 기능도 개선될 수 있는데, 이는 이들이 인간화되어 면역계에 의해 인식되기 때문이다 (Morrison S. L et al (1984) P.N.A.S, USA 81, 6851-6855). 이러한 키메라 분자는 본래의 항원의 인식을 보유하며 이의 불변 영역은 면역원성이 아니지만, 쥐과동물 가변 영역에 대한 면역원성은 보유된다.

다른 연구자들은 쥐과동물 항체로부터의 전체 가변 도메인이 아닌 항원 결합 부위만을 이식시킴으로써 설치류 항원 결합 부위를 인간 항체내로 도입시키려고 하였다 (Jones P.T et al (1986) Nature 321, 522-524, Verhoeyen M et al (1988) Science 239, 1534-1536). 리트히만(Rietchmann)에 의해 이러한 방법의 몇몇 응용 방법이 개발되었지만 (Rietchmann L. et al (1988) Nature 332, 323-327; Quee C. et al (1989) P.N.A.S USA 86,10029-10033), 다른 연구자들은 본래의 항원에 대한친화력을 회복시키기 위해 인간 FR 내에 몇몇 쥐과동물 잔기를 포함시킨 재구성된 항체를 사용하여 실험하였다 (Tempest,P.R (1991) Biotechnology 9, 266-272).

마테오(Mateo) 등의 미국 특허 제 5712120 호에는 쥐과동물 항체의 면역원성을 감소시키기 위한 과정이 기재되어 있다. 이러한 과정에 있어서, 변형은 가변 도메인, 특히 키메라 항체의 쥐과동물 골격에 제한된다. 더욱이, 이러한 변형은 양쪽성(amphipatic) 나선 구조를 지닌 FR 영역에서만 수행되므로, 이러한 영역은 T 세포에 의해 인식되는 잠재적인 에피토프이다. 상기 방법은 양쪽성 영역 내부에 있는 쥐과동물 잔기를 인간 면역글로불린 내의 동일한 위치에 있는 아미노산 (물론, 결합 부위의 3차원 구조에 관여하는 아미노산, 즉, 버니어 구역 (Vernier's zone), CDR의 정준 구조 및 경쇄와 중쇄 사이의 계면에 있는 아미노산은 제외됨)으로 치환할 것을 제안한다.

마테오 등에 의해 기술된 방법에 의해 변형된 항체는 본래의 항체를 인식하였던 항원을 인식하고 이에 결합할 수 있는 능력을 보유하며, 이로 인해 덜 면역원성이 됨으로써, 치료 효능이 증가된다. 이러한 과정을 통해, 키메라 항체와 비교하여 감소된 면역원성을 나타내는 변형된 항체를 수득하는 데에는 약간의 돌연변이가 필요할 뿐이다.

IOR C5 쥐과동물 모노클로날 항체 (특허 출원 WO 97/33916)는 Balb/c를 SW1116 세포 (결장직장 선암종)로 면역시킴으로써 수득된 IgG1 이소타입으로서 악성 및 정상 결장직장 세포의 표면과 세포질에서 우선적으로 발현되는 항원을 인식한다. 이러한 항체는 CEA, 루이스(Lewis) a, 루이스 b, 아시알릴화된 루이스, 정상 단핵 세포 항원의 막 뿐만 아니라 적혈구도 인식하지 못한다 (Vazquez A. M. et al, Hybridoma 11, pag. 245-256, 1992).

SW1116 막 추출물을 사용하는 웨스턴 블로팅 실험은 이러한 항체가 IOR C2라 일컬어지는 2가지 분자량 형태 (145 및 190 Kda)의 당단백질 복합체를 인식한다는 것을 밝혀내었다 (Vazquez A. M. et al, Year Immunol. Basel, Karger, vol. 7, pag. 137-145, 1993).

또한, 유전공학 기법을 사용하여 재조합 단편으 모노클로날 항체로부터 작제할 수 있다는 것은 당 분야에 공지되어 있다. 질병의 "생체내" 진단 및 치료에 사용되는 다양한 항체 단편의 용도를 확인시켜주는 많은 보고서가 발표되어 있다.

이라 파스탄 (Ira Pastan) 등의 EP 0796334 A1 에는 루이스 Y 항원과 관련된 탄수화물을 특이적으로 인식하는 항체의 가변 영역을 사용하여 단일 사슬 Fv 단편을 작제하는 것이 기재되어 있다. 이러한 단편을 사용하여, 위 발명자는 상기 항원을 함유하는 세포를 검출하기 위한 방법을 개발하였다. 또한, 위 발명자는 상기 항원을 함유하는 세포에 대한 이러한 단편의 억제제 효과의 증거를 제시하고 있다.

본 발명은 생물공학 분야에 관한 것이며, 특히 유전공학 기술을 사용하여 수득한 신규한 재조합 항체, 상세하게는, 정상 및 악성 결장직장 세포에서 발현되는 당단백질 복합체로서 특징화된 IOR C2 항원에서 발현되는 에피토프를 인식하는, 쥐과동물 IOR C5 항체로부터 수득한 키메라 항체, 인간화된 항체 및 단일 사슬 Fv 단편에 관한 것이다.

도 1은 플라스미드 pPACIB.9+의 유전자 작제물을 나타내는 도면으로서, 이 플라스미드는 대장균의 세포질에서 융합 단백질을 발현하도록 변형된 플라스미드이다. 상기 플라스미드는 다음과 같은 기능을 수득하기 위한 조절 서열을 함유한다: 프로모터 서열 (트립토판), 단백질의 효율적인 발현을 달성하기 위해 IL-2h로부터 유도된 27aa 단편 및 이러한 단백질을 정제하는 도중에 사용되도록 성숙한 단백질의 C-말단에 조직화된 6개의 히스티딘의 도메인.

본 발명은 유전공학 기술을 사용하여 수득한 재조합 항체, 특히, 1997년 6월 11일에 유러피안 컬렉션 오브 셀 컬처스 (European Collection of Cell Cultures)에 수탁 번호 ECCC 97061101로 부다페스트 조약에 따라 수탁된 동일한 명칭의 하이브리도마에 의해 생성된, 쥐과동물 항체 IOR C5 항체로부터 수득한 키메라 항체, 인간화된 항체 및 단일 사슬 Fv 단편에 관한 것이다. 이러한 항체는 정상 및 악성결장직장 세포에서 발현된 당단백질 복합체인 IOR C2 항원에서 발현된 에피토프를 인식한다.

쥐과동물 C5의 가변 영역의 cDNA 합성 및 유전자 증폭

세포질 RNA를 모노클로날 항체 C5의 약 10⁶개 하이브리도마 세포로부터 추출하였다 (Vazquez A.M. et al. Year Immunol, Basel, Karger, vol 7, pag. 137-145, 1993). RNA를 추출하기 위해 사용한 방법은 팔로로(Faloro) 등의 문헌 [Faloro,J., Treisman,R., and Kemen,R. (1989). Methods in Enzymology 65:718-749]에 기술되어 있다. cDNA 합성 반응물은, 쥐과동물 IgG1의 불변 영역의 개시부 및 경쇄에 대한 쥐과동물 불변 카파 영역에서 하이브리드화하도록 설계된 프라이머 25pmol로 수득한 5ug RNA, 2.5mM의 각각의 데옥시누클레오티드 (dNTP), 50mM Tris-HCl pH 7.5, 75mM KCl, 10mM DTT, 8mM MgCl₂및 15u의 리보누클레아제 억제제 (RNA guard, Pharmacia)로 총 부피가 50ul가 되도록 구성되었다. 샘플을 70℃에서 10분간 가열하고, 30분에 걸쳐 37℃로 서서히 냉각시켰다. 그 후, 100 단위의 역전사효소를 첨가하고, 42℃에서 1시간 동안 계속 인큐베이션시켰다.

경쇄(VK) 및 중쇄(VH)의 가변 영역을 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 이용하여 증폭시켰다. 요약하면, VH 또는 VK의 5㎕ cDNA를 25pmol의 특이적 프라이머, 2.5mM의 각각의 dNTP, DNA 중합효소에 대한 5㎕ 완충액 10X 및 이러한 효소 1 단위와 혼합시켰다. 샘플을 94℃에서 30초; 50℃에서 30초; 72℃에서 1분; 및 72℃에서 5분간 최종 인큐베이션의 25회 열주기에 적용시켰다.

증폭된 cDNA의 클로닝 및 시퀀싱.

정제된 VH 및 VK cDNA를 TA 벡터내로 클로닝시켰다 (TA Cloning kit. Promega, USA). 클론을 T7 DNA Pol (Pharmacia, Sweden)을 사용하여 디데옥시 방법에 의해 시퀀싱하였다.

키메라 유전자의 작제.

경쇄 및 중쇄 가변 영역을 TA 벡터로부터 효소 제한에 의해 수득하고, 발현 벡터내로 클로닝시켰다 (Coloma M.J. et al., Journal of Immunological Methods, 152, 89-104, 1992).

VH 유전자를 EcoRV 및 NheI 분해에 의해 TA 벡터로부터 절단시키고, PAH 4604 발현 벡터내로 클로닝시키고, 인간 불변 IgG1을 포함시키고, 히스티디놀 내성 유전자를 포함시켰다.

생성된 작제물은 C5VH-PAH4604 이다. VK 유전자를 TA EcoRV 및 SalI 분해에 의해 절단시키고, PAG4622내로 클로닝시켰다. 이 벡터는 gpt에 대한 내성을 함유하며, 카파 인간 불변 영역을 사용하였다. 생성된 작제물은 C5VK-PAG4622 이다.

키메라 항체 발현.

NSO 세포를 10㎍의 C5VH-PAH4604 및 10ug의 C5VK-PAG4622로 일렉트로포레이션시키고, Pvul로 분해하여 선형화시켰다. DNA를 함께 혼합시키고, 에탄올 침전시키고, 25㎕의 물에 용해시켰다. 약 10⁷개의 NSO 세포를 세미컨플루언시(semiconfluency)까지 성장시키고, 원심분리에 의해 수거하고, 일렉트로포레이션 큐벳에서 분해된 DNA와 함께 0.5㎖ DMEN 중에 재현탁시켰다. 얼음상에 5분간 정치시킨 후, 세포에 170 볼트 및 960㎌의 펄스를 가하고, 얼음에서 30분 더 정치시켰다. 그 후, 세포를 20㎖ DMEN + 10% 우태아 혈청내에 넣고 48시간 동안 회복시켰다. 이 시점에서, 세포를 96-웰 플레이트내로 분산시키고, 선택 배지를 적용하였다 (DMEN, 10% 우태아 혈청, 0.8㎍/㎖ 미코페놀산, 250㎍/㎖ 크산틴). 트랜스펙션된 클론을 10일 후 육안으로 볼 수 있었다.

트랜스펙션된 클론을 함유하는 웰의 배지 중의 인간 항체의 존재는 ELISA에 의해 측정하였다. 미세역가 플레이트 웰을 염소 항-인간 (감마 사슬 특이적)으로 코팅시켰다. PBST (0.02% Tween 20을 함유하는 인산염 완충 식염수, pH 7.5)로 세척한 후, 트랜스펙턴트를 함유하는 웰로부터의 배양 배지 100㎕를 각각의 미세역가 웰에 37℃에서 1시간 동안 첨가하였다. 웰을 PBST로 세척하고, 컨쥬게이션된 염소 안티-사람 카파 (경쇄 특이적)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 웰을 PBST로 세척하고, 디에탄올아민을 함유하는 기질 완충액을 첨가하였다. 30분 후, 405nm에서의 흡광도를 측정하였다.

T 에피토프 인간화에 의한 인간화된 IOR C5h의 작제.

T 에피토프의 예측.

IOR C5의 가변 영역 서열을, T 면역원성과 관련된 양쪽성 나선을 지닌 7개 또는 11개 아미노산 길이의 서열의 분절을 예측하는 AMPHI 프로그램을 이용하여 분석하였다. 또한, 소수성 나선을 예측하는 SOHHA 프로그램을 사용하였다 (Elliot et al. J. Immunol. 138: 2949-2952, (1987)). 이러한 알고리듬은 IOR C5의 경쇄및 중쇄 가변 영역에서의 T 에피토프 제시와 관련된 단편을 예측해준다.

가변 영역의 상동성 분석.

IOR C5의 가변 도메인을 상응하는 인간 가변 도메인과 비교하여 쥐과동물 분자와 가장 상동인 인간 서열을 확인한다. 사용된 인간 서열 데이터베이스는 Gene Bank 및 EMBL에 공표되어 있으며, 둘 모두 인터넷으로 이용할 수 있다. 비교를 자동 컴퓨터처리법 (PC-DOS HIBIO PROSIS 06-00, Hitachi)에 의해 수행하였다.

면역원성 감소에 대한 분석.

이 방법의 본질은 FR, 특히 결합 부위의 3차원 구조에 관여하는 위치를 제외한 양쪽성 나선에서의 약간의 돌연변이만으로 가능한 T 세포 에피토프를 인간화시킴으로써 면역원성을 감소시키는 데에 있다.

이러한 방법에 있어서, 쥐과동물 면역글로불린의 VH 및 VK 영역을 가장 상동인 인간 면역글로불린 서열과 비교하여, FR 구역 (Kabat E.(1991) Sequences of proteins of immunological interest, Fifth Edition, National Institute of Health)내의 양쪽성 영역 내부에서만 쥐과동물과 인간 서열 간의 상이한 잔기를 확인할 수 있으며, 이러한 쥐과동물 잔기만이 인간 서열의 잔기에 의해 동일한 위치에서 돌연변이될 것이다.

정준 구조 또는 버니어 구역에 관여하는 구조를 초래하는 마우스 골격내의 잔기는 돌연변이될 수 없는데, 이는 이들 잔기가 3차 구조에 현저한 효과를 미쳐서 결합 부위에 영향을 줄 수 있기 때문이다. 3차 구조에서의 치환에 관한 추가 정보는 가변 영역의 3차원 분자 모델을 구성하여 수득할 수 있다.

NSO 세포내로의 인간화된 IOR C5 항체의 클로닝 및 발현.

돌연변이 및 인간화된 VH 및 VK를 수득하기 위해 PCR 오버랩핑을 수행한 후, T 세포 에피토프의 인간화에 의해 IOR C5에 상응하는 수득한 유전자 작제물을 키메라 항체를 발현시키기 위해 사용한 방법과 유사한 방법으로 발현 벡터내로 클로닝시켜 플라스미드 C5Vkhu-PAG4622 및 C5Vhhu-PAH4604를 생성시켰다. 키메라 항체에 대해 앞서 기술한 조건과 똑같은 조건으로 이러한 유전자를 NSO 세포내로 트랜스펙션시켰다.

단일 사슬 Fv 단편의 수득. scFv의 작제 및 발현.

이 과정은 발현 벡터내로의 클로닝을 위한 엔도누클레아제 제한 부위를 포함하는 VH 및 VL 서열을 변형시키는, PCR을 사용하는 제 1 증폭을 포함한다. 증폭 단계에서는 정확한 서열에 대한 설계된 올리고누클레오티드를 사용하였다.

증폭시킨 후, 가변 영역을 정제하고, 상응하는 제한 효소로 분해시킨다. DNA 단편을 정제하고, 발현 벡터에 연결시킨다. 그 후, 이러한 유전자 작제물을 통상적인 방법에 따라 대장균에서 발현시킨다.

생산 세포로부터 단백질을 추출하는 처리에 있어서, 초음파에 의한 파열 처리를 수행하고, SDS 폴리아크릴아미드 전기영동 겔, 니트로-셀룰로오스 전달 및 웨스턴 블롯을 조합하여 가용성 및 불용성 단편을 분리할 수 있다.

단백질의 부분 정제는, (1) 초음파 및 원심분리에 의해 가용성 및 불용성 물질을 분리하고, (2) 낮은 몰농도의 요소로 세척하고 고농도의 요소에 가용화시키는 것을 포함하는 처리에 의해 수행한다. 가용화된 물질로부터, 금속 이온에 대한 친화성 크로마토그래피에 의해 단백질을 정제시킨다. 그 후, 단백질을 완충액에 대해 복원시킨다.

실시예 1. 키메라 모노클로날 항체의 수득.

VH 및 VK cDNA를 역전사효소를 사용하여 모노클로날 항체 IOR C5를 생성시키는 하이브리도마로부터 추출한 RNA로부터 수득하였다. 특이적 프라이머는 다음과 같았다:

VH의 경우:

5' AGGTCTAGAA(CT)CTCCACACACAGG(AG)(AG)CCAGTGGATAGAC 3'

VK의 경우:

5' GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG 3'

사슬 VH 및 VK의 cDNA를 Taq 중합효소를 사용하는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 이용하여 증폭시켰고, VH의 경우 특이적 프라이머 ECORV/NHEI 제한 부위를 사용하고 VK의 경우 ECORV/SALI를 사용하였다. 사용된 특이적 프라이머는 다음과 같았다:

VH의 경우:

올리고누클레오티드 1:

5' GGGGATATCCACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT 3'

올리고누클레오티드 2:

5' TGGGTCGAC(AT)GATGGGG(GC)TGTTGTGCTAGCTGAGGAGAC 3'

VK의 경우:

올리고누클레오티드 1:

5' GGGGATATCCACCATGAGG(GT)CCCC(AT)(GA)CTCAG(CT)T(CT) 3'

올리고누클레오티드 2:

5' AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC 3'

PCR 생성물을 TA 벡터내로 클로닝시켰다 (TA cloning kit, Invitrogen). 12개의 독립적 클론을 T7 DNA Pol (Pharmacia)을 사용하여 디데옥시 방법에 의해 시퀀싱하였다. VH 및 VK 서열은 카바트(Kabat)의 서브-그룹 2와 높은 연관성을 지닌다.

그 다음, VH 사슬을 ECORV/NHEI로 및 VK에 대해서는 ECORV/SALI로 분해시키고, VH 및 VK에 대해 각각 PAH4604 및 PAG4622내로 클로닝시켰다. 이러한 벡터는 쉐리에 모리슨(Sherie Morrison) (UCLA, California, USA)이 기증하였고, 이들은 포유동물 세포에서 면역글로불린을 발현시키기 위해 사용된다. PAH 4604 벡터는 인간 불변 영역 IgG1를 포함하였고, PAG 4622는 인간 Ck를 지닌다 (중합효소 사슬 반응에 의해 생성된 가변 영역을 사용하여 항체 분자를 발현시키기 위한 신규한 벡터; M. Josefina Coloma et al, Journal of Immunological Methods, 152 (1992), 89-104). IOR C5 영역을 클로닝시킨 후 생성된 작제물은 VHC5-PAH4604 및 VKC5-PAG4622 이었다.

NSO 세포를 10ug의 키메라 벡터 C5VH-PAH4604 및 10ug의 C5VK-PAG4622로 일렉트로포레이션시키고, PvuI로 분해하여 선형화시켰다. DNA를 함께 혼합시키고,에탄올 침전시키고, 25ul 물에 용해시켰다. 약 10⁷개 NSO 세포를 세미-컨플루언스까지 성장시키고, 원심분리에 의해 수거하고, 일렉트로포레이션 큐벳에서 분해된 DNA와 함께 0.5㎖ DMEN 중에 재현탁시켰다. 얼음상에 5분 정치시킨 후, 세포에 170 볼트 및 960 uF의 펄스를 가하고, 얼음에 30분 더 정치시켰다. 그 후, 세포를 20㎖ DMEN + 10% 우태아 혈청내에 넣고, 48시간 동안 회복시켰다. 이 시점에서, 세포를 96-웰 플레이트내로 분포시키고, 선택 배지를 적용하였다 (DMEN, 10% 우태아 혈청, 10mM 히스티디놀). 트랜스펙션된 클론을 10일 후 육안으로 볼 수 있었다.

트랜스펙션된 클론을 함유하는 웰의 배지 중의 키메라 항체의 존재는 ELISA에 의해 측정하였다. 미세역가 플레이트 웰을 염소 안티-인간 (감마 사슬 특이적, Sara lab)으로 코팅시켰다. PBST (0.02% Tween 20을 함유하는 인산염 완충 식염수, pH 7.5)로 세척한 후, 트랜스펙턴트를 함유하는 웰로부터의 배양 배지 20ul를 각각의 미세역가 웰에 37℃에서 1시간 동안 첨가하였다. 웰을 PBST로 세척하고, 알칼리 포스파타제 컨쥬게이션된 염소 안티-사람 카파 (경쇄 특이적)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 웰을 PBST로 세척하고, 디에탄올아민을 함유하는 기질 완충액을 첨가하였다. 30분 후, 405nm에서의 흡광도를 측정하였다.

실시예 2. 인간화된 항체의 다양한 변형체의 수득.

VH 및 VK IOR C5 서열을 인간 서열 데이터베이스와 비교하여 IOR C5와 관련된 가장 인간 상동인 서열을 수득하였다.

그 후, 양쪽성 영역 또는 가능한 T 세포 에피토프를 VH 및 VK 영역에서 결정하였다.

VH의 경우, 돌연변이를 위치 10 및 17에 도입시켰으며, 아미노산 ASP 및 SER을 각각 GLY 및 THR로 치환시켰다. 이러한 돌연변이를 제 1 PCR에서 프라이머 1 및 2, 3 및 4를 사용하여 PCR 오버랩핑에 의해 수행하였고, 이러한 PCR의 결과는 다음과 같은 서열을 지닌 2 및 4 프라이머를 사용하는 제 2 PCR에서 오버랩되었다: (Kamman, M., Laufs, J., Schell, J., Gronemborg, B. Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR). Nucleic Acids Research 17:5404, 1989).

중쇄의 돌연변이 10 및 17을 위한 프라이머.

프라이머 1:

5' GAGTCAGGACCTGGCCTGGTGAAACCTTCTCAGACACTTTCACTCACC 3'

프라이머 2:

5' TGGGTCGAC(AT)GATGGGG(GC)TGTTGTGCTAGCTGAAGAGAC 3'

프라이머 3:

5' GGTGAGTGAAAGTGTCTGAGAAGGTTTCACCAGGCCAGGTCCTGACTC 3'

프라이머 4:

5' GGGGATATCCACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT 3'

이전 돌연변이를 시퀀싱에 의해 확인한 후, 새로운 돌연변이를 이러한 돌연변이된 DNA에 도입시켰으며, 위치 43 및 44에 도입된 새로운 돌연변이는 LYS와 GLY으로 각각 ASN 및 LYS를 치환하는 것이었다. 오버랩핑 과정을 전술한 오버랩핑과 같이 수행하였다. 돌연변이를 시퀀싱에 의해 확인하였고, 이러한 새로운 작제물을 C5VHhu라 명명하였다.

이러한 돌연변이를 위한 프라이머는 다음과 같았다:

중쇄의 돌연변이 43 및 44를 위한 프라이머.

프라이머 1:

5' CAGTTTCCAGGAAAAGGACTGGAATGGATG 3'

프라이머 2:

5' TGGGTCGAC(AT)GATGGGG(GC)TGTTGTGCTAGCTGAAGAGAC 3'

프라이머 3:

5' CATCCATTCCAGTCCTTTTCCTGGAAACTG 3'

프라이머 4:

5' GGGGATATCCACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT 3'

VK의 경우, 돌연변이를 위치 15, 45 및 63에서 ILE, LYS 및 THR을 각각 LEU, ARG 및 SER으로 치환시킴으로써 수행하였다.

돌연변이를 앞서 기술한 바와 같이 오버랩핑 PCR에 의해 도입시켰다. 사용된 프라이머의 서열은 다음과 같다. 새로운 유전자 작제물을 C5Vkhu로 명명하였다.

경쇄의 돌연변이 15를 위한 프라이머

프라이머 1:

5' TTGTCGGTTACCCTTGGACAACCAGCC 3'

프라이머 2:

5' AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC 3'

프라이머 3:

5' GGCTGGTTGTCCAAGGGTAACCGACAA 3'

프라이머 4:

5' GGGGATATCCACCATGAGG(GT)CCCC(AT)(GA)CTCAG(CT)T(CT)CT(TG)GT

경쇄의 돌연변이 45를 위한 프라이머.

프라이머 1:

5' GGCCAGTCTCCAAGGCGCCTAATCTAT 3'

프라이머 2:

5' AGCGTCGACTTAGCTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC 3'

프라이머 3:

5' ATAGATTAGGCGCCTTGGAGACTGGCC 3'

프라이머 4:

5' GGGGATATCCACCATGAGG(GT)CCCC(AT)(GA)CTCAG(CT)T(CT)CT(TG)GT

경쇄의 돌연변이 63을 위한 프라이머.

프라이머 1:

5' CCTGACAGATTCAGTGGCAGTGGATCA 3'

프라이머 2:

5' AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC 3'

프라이머 3:

5' TGATCCACTGCCACTGAATCTGTCAGG 3'

프라이머 4:

5' GGGGATATCCACCATGAGG(GT)CCCC(AT)(GA)CTCAG(CT)T(CT)CT(TG)GT

모든 돌연변이를 시퀀싱에 의해 확인하였다.

인간화된 VK 및 VH를 벡터 PAG4622 및 PAH4604내로 클로닝하여, 작제물 C5Vkhu-PAG4622 및 C5VHhu-PAH4604를 수득하였다.

NSO 세포를 10㎍의 인간화된 C5VHu-PAH4604 및 10㎍의 C5VKhu-PAG4622로 일렉트로포레이션시켰다. 이러한 벡터를 PVUI 분해하여 선형화시켰다.

일렉트로포레이션 및 인간화된 항체 IOR C5h를 발현하는 클론의 검출 방법은 키메라 항체에 대해 앞서 설명된 방법과 동일하였다.

실시예 3. 단일 사슬 Fv 단편의 작제

IOR C5 mAb의 가변 도메인 (VH 및 VL)으로부터의 scFv 단편 (VH-링커-VL)의 작제. 대장균에서의 발현을 위한 발현 벡터내로의 클로닝.

과정 (a). scFv의 작제.

이 과정은 PCR에 의한 증폭의 제 1 라운드를 포함하여, 발현 벡터 pPACIB.7+ 및 pPACIB.9+ 내로의 클로닝에 대한 제한 엔도누클레아제 부위를 포함하는 시퀀싱된 VH 및 VL 영역을 변형시킨다. 증폭반응에 있어서, 정확한 서열에 따라 설계된올리고누클레오티드를 사용한다.

중쇄:

4066: EcoRV-FR1-VH

5'.GGGATATCTGAGGTGCAGCTTCAGGAGTCAGGA..3'

4255: EcoRV-FR4-VH

5'..CAGGATATCGCAGAGACAGTGACCAGAGTCCC..3'

경쇄:

2938: SalI-FR1-VL

5'.CGTCGACGATATCCAGATGAC(AC)CA(GA)ACT(AC)C..3'

2935: ApaI-FR4-VL

5'.ATGGGCCCTTT(TC)A(TG)(TC)TCCAGCTTGGT..3'

영역을 증폭시킨 후, 정제하고, VH (EcoRV) 및 VL (SalI-ApaI)로 분해하였다. DNA 단편을 정제하고, 제한 효소로 미리 분해시킨 pPACIB.9+ 및 pPACIB.7+ 벡터에 연결시켰다.

플라스미드 pPACIB.7+는 대장균에서 발현되는 유전자를 지닌 이종 단백질을 원형질막으로 내보내도록 변형된다. 이러한 플라스미드는 다음과 같은 기능을 수득하기 위한 조절 서열을 함유한다: 프로모터 서열 (트립토판), 신호 펩티드를 위한 서열 (OMPA), 링커 펩티드를 위한 서열 (Chaudhary et al., 1990) 및 이러한 단백질의 정제를 보조하기 위해 성숙한 단백질의 C-말단에 조직화된 6개의 히스티딘으로 구성된 도메인 (Gavilondo, J.V. et al. Proceedings of the IV AnnualConference on Antibody Engineering. IBC Conferences Inc. Coronado, CA. December 8-10, 1993).

플라스미드 pPACIB.9+ (도 1)는 대장균에서 발현되는 유전자를 지닌 이종 단백질을 세포질에서 발현시키도록 변형된다. 이러한 플라스미드는 다음과 같은 기능을 수득하기 위한 조절 서열을 함유한다: 프로모터 서열 (트립토판), 단백질의 효율적인 발현을 달성하기 위해 IL-2h로부터 유도된 27aa 단편, 및 이러한 단백질의 후속 정제를 보조하기 위해 성숙한 단백질의 C-말단에 조직화된 6개의 히스티딘의 도메인 (Gavilondo, J.V. et al. Proceedings of the IV Annual Conference on Antibody Engineering. IBC Conferences Inc. Coronado, CA. December 8-10, 1993).

PCR 반응의 생성물을 사용하여 수용능력이 있는 대장균 세포 (균주 MC1061)를 형질전환시키고, 이를 고형 선택 배지에 플레이팅하고 37℃에서 성장시켰다. 재조합 벡터를 선택하기 위해, 박테리아 콜로니를 액체 배지에 접종시키고, 이러한 배양물로부터 플라스미드 DNA를 추출하였다 (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition, 1989, Sambrook, Fritsch and Maniatis). 플라스미드 DNA를 클로닝 단계에 따라 EcoRV, SalI/ApaI, XhoI/ApaI에 의해 분해하고, 아가로오스 겔에 적용시키고 UV 광으로 가시화시킨 후, 재조합 클론을 2개의 띠의 분해 패턴를 지닌 클론 사이에서 선택하였으며, 이 중 하나는 pPACIB.7 및 9+ 에 상응하고 (약 2.9kb), 나머지 하나는 예상된 도메인에 상응한다 (약 320pb VH 또는 VL 및 scFv의 경우 720pb). VH 도메인의 경우, 삽입 배향은 DNA 시퀀싱에 의해 검사하였다.

과정 (b). IOR C5 Mab의 가변 도메인 유전자로부터 수득한 scFv의 대장균에서의 발현.

4가지 균주의 대장균을 과정 (a)에서 선택된 2개의 재조합 플라스미드를 사용하여 형질전환시켜 (TG1, coliB, W3110 및 MM294) 클로닝된 유전자 발현을 실험하였다. 기본적으로, 재조합 세균을 암피실린 첨가된 액체 배지 (LB)에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 이러한 배양물에 암피실린을 함유하는 신선한 배양물을 접종시키고, 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 배양물에 베타-인돌아크릴산 (트립토판 프로모터의 유도물질)을 첨가함으로써 단백질의 발현을 유도시켰다. 12%의 SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 샘플을 분석한 결과 약 28kDa의 단백질이 이러한 조건하에서 pPACIB.7+의 작제를 위한 원형질막 분획에서 발현되고, pPACIB.9+ 중의 재조합 클론에 대한 30kDa 띠가 전체 세균 단백질의 6 내지 11%로 TG1에서 발현되는 것으로 나타났다. 이것은 IOR C5 Mab의 Fab 단편에 대해 토끼에서 수득한 항혈청을 사용하는 웨스턴 블롯 (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition de 1989, by Sambrook, Fritsch and Maniatis)을 통해 입증되었고, 이러한 단백질이 IOR C5의 scFv에 상응하는 것으로 면역정제되었다.

실시예 4. 세균 배양물로부터의 scFv의 수득, 복원 및 항원에 대한 인식 검정.

과정 (a). pPACIB.9+ 중의 재조합 클론으로부터의 IOR C5의 scFv의 추출 및 복원.

가용성 및 불용성 분획을 분리시켜줄 수 있는, 파열 초음파 처리를 사용하여 생산 세포로부터 단백질을 추출하는 처리에 있어서, 니트로-셀룰로오스로 전달되는 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동 겔 및 웨스턴 블롯을 조합시킨 결과, 단백질이 불용성 세균 분획에 남아있는 것으로 입증되었다.

이러하므로, 단백질을,

(1) 초음파 및 원심분리에 의해 가용성 및 불용성 물질을 분리하는 단계,

(2) 낮은 몰농도의 요소 (2M)로 세척하는 단계 및

(3) 높은 몰농도의 요소 (6M)에 가용화시키는 단계를 포함하는 처리로 부분 정제시켰다.

가용화된 물질로부터, 단백질을 금속 이온에 대한 친화성 크로마토그래피로 정제하고, 완충 용액에 대해 복원시킨다.

과정 (b). scFv-IOR C5 단편의 종양 세포에 대한 결합 검정.

세포주:

세포를 센트로 데 인무놀로지아 몰레큘라 (Centro de Inmunologia Molecular)로부터 입수하였다. SW948 선암종 세포주를 37℃에서 6% CO₂하에서 10% 우태아 혈청이 보충된 L-15 배지 중에서 성장시켰다. Raji 세포주 (Burkitt human limphome) 및 Hut 78 (T 사람 세포주)를 네거티브 대조표준으로서 사용하였다.

이러한 세포주를 37℃에서 10% 우태아 혈청이 보충된 RPMI 1629에서 성장시켰다.

세포 현탁액을 1% 우혈청 알부민을 함유하는 PBS 중에서 1㎖ 당 10⁶개 세포로 고정시켰다. 10ul의 세포 현탁액을 각각의 웰에 첨가하였다. 슬라이드를 먼지 없는 공기 중에서 3시간 동안 건조시키고, 아세톤-메탄올 (1:1) 용액 중에서 5분간 고정시키고, TBS 중에서 10분간 수화시켰다. 최종적으로, 세포를 면역세포화학 검정을 이용하여 처리하였다.

scFv IOR C5 단편의 활성을 면역과산화효소 기법을 통해 면역세포화학 검정을 이용하여 결정하였다. 세포를 37℃에서 2시간 동안 단일 사슬 Fv IOR C5와 인큐베이션시킨 후, 실온에서 30분간 각각 항 Fab 혈청 및 항-마우스 과산화효소 컨쥬게이티드 (HRPO)와 인큐베이션시켰다. 과산화효소의 국재화 부위를 5㎎의 3,3 디아미노벤지딘, 5㎖의 TBS 및 5㎕의 30% H₂O₂를 함유하는 용액으로 가시화시켰다. 인큐베이션 사이에, 슬라이드를 차가운 TBS로 세척하였다.

물에 도입시킨 후, 슬라이드를 메이어(Mayer)의 헤마톡실린(Hematoxilline)으로 대비시키고, 카나디안 발삼 (Canadian Balsam)을 첨가하였다. 각각의 실험은 포지티브 및 네거티브 대조표준을 포함하였다.

면역세포화학 실험은 이러한 단편이 온전한 Mab와 비교하여 보통의 표지화를 나타내었던 SW948 세포주에 대해서만 포지티브임을 나타내었고, 이는 이러한 세포주에 대한 scFv IOR C5의 특이적 인식을 입증해 주었다. 표지는 악성 결장 세포에서 막 및 세포질 구획에 결합되었다.

Claims

수탁 번호 ECCC 97061101로 수탁된 하이브리도마에 의해 생성된 쥐과동물 모노클로날 항체 IOR C5로부터 유도된 재조합 항체 및 단일 사슬 Fv 단편으로서, 상기 재조합 항체가 경쇄 및 중쇄에 대해 항체 IOR C5의 상보성 결정 영역 (CDR) 및 인간 불변 영역을 지니는 재조합 항체 및 단일 사슬 Fv 단편.
제 1항에 있어서, 경쇄 및 중쇄의 CDR 서열이 다음과 같음을 특징으로 하는 재조합 항체:
제 1항 및 제 2항에 있어서, 경쇄 및 중쇄에 대해 항체 IOR C5의 CDR과 골격 영역 (FR) 및 인간 불변 영역을 함유하는, 쥐과동물 모노클로날 항체 IOR C5로부터 유도된 키메라 항체이며, 중쇄 및 경쇄의 골격 아미노산 서열이 다음과 같음을 특징으로 하는 재조합 항체:
제 1항 및 제 2항에 있어서, 면역원성을 감소시키기 위해 중쇄 및 경쇄의 골격 영역에 점 돌연변이를 함유하는, 쥐과동물 모노클로날 항체 IOR C5로부터 유도된 인간화된 항체임을 특징으로 하는 재조합 항체.
제 4항에 있어서, 중쇄 및 경쇄의 골격 영역에 다음의 점 돌연변이 중의 어느 하나를 지님을 특징으로 하는 인간화된 항체:

중쇄:

위치 10 ASP → GLY

위치 17 SER → THR

위치 43 ASN → LYS

위치 44 LYS → GLY

경쇄:

위치 15 ILE → LEU

위치 45 LYS → ARG

위치 63 THR → SER
제 1항에 있어서, 경쇄 및 중쇄의 가변 영역에 대해 다음의 골격 및 CDR 서열을 포함함을 특징으로 하는 단일 사슬 Fv 단편:
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 재조합 항체를 발현시키는 세포주.
제 1항 및 제 6항의 단일 사슬 Fv 단편을 발현시키는 숙주 세포.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 재조합 항체와 적합한 부형제를 포함하는, 직장 및 결장 악성 종양, 이의 전이 및 재발을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
제 1항 및 제 6항의 단일 사슬 Fv 단편과 적합한 부형제를 포함하는, 직장 및 결장 악성 종양, 이의 전이 및 재발을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 재조합 항체를 포함하는, 직장 및 결장 악성 종양, 이의 전이 및 재발을 생체내에서 위치결정하고 확인하기 위한 약제학적 조성물.
제 1항 및 제 6항의 단일 사슬 Fv 단편을 포함하는, 직장 및 결장 악성 종양, 이의 전이 및 재발을 생체내에서 위치결정하고 확인하기 위한 약제학적 조성물.
제 9항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가능한 수용액을 형성하도록 혼합되는, 이러한 항체 또는 단편을 방사선표지시키기 위한 화합물을 추가로포함함을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 13항에 있어서, 방사선표지물질로서 테크네튬 99, 레니오(rhenio) 186, 레니오 188 또는 유사체를 포함함을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
Tc-99m 또는 임의의 유사체로 미리 표지시킨 제 1항 내지 제 5항에 따른 항체 또는 제 1항 및 제 6항에 따른 단편 중 어느 하나를 함유하는 생리학적으로 허용되는 조성물을 투여하고, 이러한 조성물의 생체분포를 면역감마그래피 방법에 의해 모니터링하는 것을 포함하여, 직장 및 결장 악성 종양, 이의 전이 및 재발을 생체내에서 확인하기 위한 진단 방법.