EA016342B1 - АНТИ-αβ-АНТИТЕЛА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ - Google Patents

АНТИ-αβ-АНТИТЕЛА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Download PDF

Info

Publication number
EA016342B1
EA016342B1 EA200800278A EA200800278A EA016342B1 EA 016342 B1 EA016342 B1 EA 016342B1 EA 200800278 A EA200800278 A EA 200800278A EA 200800278 A EA200800278 A EA 200800278A EA 016342 B1 EA016342 B1 EA 016342B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
cancer
antibodies
variable domain
label
Prior art date
Application number
EA200800278A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200800278A1 (ru
Inventor
Шейла Вайолетт
Луиз А. Купман
Кеннет Дж. Саймон
Пол Х. Вейнреб
Герман Ван Влеймен
Хосе Сальданха
Алексей А. Луговской
Original Assignee
Байоджен Айдек Ма Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Байоджен Айдек Ма Инк. filed Critical Байоджен Айдек Ма Инк.
Publication of EA200800278A1 publication Critical patent/EA200800278A1/ru
Publication of EA016342B1 publication Critical patent/EA016342B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57557—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of other specific parts of the body, e.g. brain
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/5759—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving compounds localised on the membrane of tumour or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70546—Integrin superfamily, e.g. VLAs, leuCAM, GPIIb/GPIIIa, LPAM
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
    • G01N2800/085—Liver diseases, e.g. portal hypertension, fibrosis, cirrhosis, bilirubin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/12—Pulmonary diseases
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/20—Dermatological disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/34—Genitourinary disorders
    • G01N2800/347—Renal failures; Glomerular diseases; Tubulointerstitial diseases, e.g. nephritic syndrome, glomerulonephritis; Renovascular diseases, e.g. renal artery occlusion, nephropathy
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/80—Antibody or fragment thereof whose amino acid sequence is disclosed in whole or in part
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/801—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving antibody or fragment thereof produced by recombinant dna technology

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Abstract

Данное изобретение относится к клеточной биологии, иммунологии и онкологии. Это изобретение обеспечивает гуманизированные антитела, которые узнают интегрины αβ, причем эти антитела содержат вариабельную область, происходящую из нечеловеческого антитела, и по меньшей мере часть иммуноглобулина, происходящую из антитела человека. Данное изобретение обеспечивает также способы получения таких антител, фармацевтические композиции, содержащие их, и способы лечения, диагностики и/или предупреждения различных заболеваний и нарушений путем введения гуманизированных анти-αβ-антител согласно изобретению. Это изобретение относится также к идентификации дифференциальной экспрессии интегрина αβна поверхностях опухолевых клеток и тканей, применению этой дифференциальной экспрессии в определении метастатического потенциала опухолевых клеток и способам диагностики и лечения/предотвращения метастазирования опухолей, а также элиминации оставшихся метастатических опухолевых клеток с использованием лигандов, в частности антител, которые связываются с интегрином αβ.

Description

(57) Данное изобретение относится к клеточной биологии, иммунологии и онкологии. Это изобретение обеспечивает гуманизированные антитела, которые узнают интегрины θνβ6, причем эти антитела содержат вариабельную область, происходящую из нечеловеческого антитела, и по меньшей мере часть иммуноглобулина, происходящую из антитела человека. Данное изобретение обеспечивает также способы получения таких антител, фармацевтические композиции, содержащие их, и способы лечения, диагностики и/или предупреждения различных заболеваний и нарушений путем введения гуманизированных анти-а.,[1,-антител согласно изобретению. Это изобретение относится также к идентификации дифференциальной экспрессии интегрина ανββ на поверхностях опухолевых клеток и тканей, применению этой дифференциальной экспрессии в определении метастатического потенциала опухолевых клеток и способам диагностики и лечения/предотвращения метастазирования опухолей, а также элиминации оставшихся метастатических опухолевых клеток с использованием лигандов, в частности антител, которые связываются с интегрином щфв016342
Уровень техники
Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к областям клеточной биологии, иммунологии и онкологии. Конкретно, данное изобретение относится к гуманизированным антителам, которые узнают интегрины ανβ6, которые содержат вариабельную область, происходящую не из человека, и по меньшей мере часть иммуноглобулина человека. Данное изобретение относится также к способам их получения, к фармацевтическим композициям, содержащим их, и к способам лечения различных заболеваний введением гуманизированных анти-о^в6-антител. Данное изобретение относится также к идентификации дифференциальной экспрессии интегрина ανβ6 на поверхностях опухолевых клеток и тканей, применению этой дифференциальной экспрессии в определении метастатического потенциала опухолевых клеток и способам диагностики и лечения/предупреждения опухолевого метастазирования и для элиминации остаточных метастатических опухолевых клеток с использованием лигандов, в частности антител, которые связываются с интегрином ανβ6.
Известный уровень техники
Интегрины являются гликопротеиновыми рецепторами клеточной поверхности, которые связывают белки внеклеточного матрикса и опосредуют межклеточные взаимодействия и взаимодействия клеткавнеклеточный матрикс (обычно называемые событиями клеточной адгезии) (Киок1ай!1, Е., 1. С1ш. ΙηνοδΙ. 87:1-5 (1991); Нупек, К.О., Се11 69:11-25 (1992)). Эти рецепторы состоят из нековалентно ассоциированных альфа (α) и бета (β) цепей, которые объединяются с образованием различных гетеродимерных белков с разными клеточными и адгезивными специфичностями (А1Ьеба, 8.М., ЬаЬ. 1тгек1. 68:4-14 (1993)). Недавние исследования указывали на участие определенных интегринов в регуляции различных клеточных процессов, в том числе адгезии, миграции, инвазии, дифференцировки, пролиферации, апоптоза клеток и экспрессии генов (А1Ьеба, 8.М., ЬаЬ. Шуей. 68:4-14 (1993); 1ийапо, К., Сапсег Ме!. Кеу. 13:25-30 (1994); Киок1ай!1, Е. апб Кееб, ЕС., Се11 77:477-478 (1994) апб Киок1ай!1, Е. апб О1апсо!!1, Е.О., Сапсег Се118 1:119-126 (1989); Р1о\\\ Наак е! а1., 2000; уаη бег ЕНет апб 8оппепЬегд 2001).
α,.β,-,-Рецептор является одним из членов семейства интегринов, которые экспрессируются в виде гетеродимерных белков клеточной поверхности (Викк, М. е! а1., 1. Бю1. Сйет. 267 (9): 5790-5796 (1992). Хотя субъединица αν может образовывать гетеродимер с различными субъединицами β (β1, β3, β5, β6 и β8), только субъединица β6 может быть экспрессирована с субъединицей αν в виде гетеродимера. Известно, что интегрин ανβ6 является рецептором клеточной поверхности, связывающим фибронектин, ассоциированный с латентностью пептид (ЬАР) и тенасцин С, взаимодействующим с внеклеточным матриксом через трипептидные ΚΟΌ-сайты, находящиеся на нем (Викк, М. е! а1., 1. Вю1. Сйет. 267:5790-5796 (1992); ХУешаскег, А. е! а1., 1. Вю1. Сйет. 269:6940-6948 (1994); Рпе!о, А.Ь. е! а1., Ргос. Ыа!1. Асаб. 8с1. И8А 90:10154-10158 (1993)). Хотя интегрин ανβ6 был впервые идентифицирован и секвенирован более 10 лет назад, биологическое значение ανβ6, в частности, в заболевании, все еще находится в стадии исследования. Экспрессия ανβ6 ограничена эпителиальными клетками, где он экспрессируется при относительно низких уровнях в здоровой ткани и значительно положительно регулируется во время развития, патологического изменения и заживления ран (Вгеикк, ЕМ. е! а1., 1. Н1к!осйет. Су!осйет. 41:1521-1527 (1993); Вгеикк, ЕМ. е! а1., 1. Се11. 8сЕ 108:2241-2251 (1995); Ко1у1к!о, Ь. е! а1., Се11. Абйек. Соттишс. 7:245-257 (1999); 2атЬгипо, О. е! а1., 1. Се11. Вю1. 129 (3):853-865 (1995); Наккшеп, Ь. е! а1., 1. Нк!осйет. Су!осйет. 48(6):985-998 (2000)). Увеличивающееся число недавних сообщений показывает, что ανβ6 положительно регулируется на раковых опухолях эпителиального происхождения, включающих в себя рак ободочной кишки (№и, 1. е! а1., 1п!. 1. Сапсег 92:40-48 (2001); Ва!ек, К.С. е! а1., 1. С1ш. Икек!. 115:339-347 (2005)), рак яичника (Айтеб, N. е! а1., 1. Се11. Вюсйет. 84:675-686 (2002); Айтеб, N. е! а1., 1. Н1к!осйет. Су!осйет. 50:1371-1379 (2002); Айтеб, N. е! а1., Сагсшодеп. 23:237-244 (2002)), плоскоклеточный рак (Ко1у1к!о, Ь. е! а1., Ехр. Се11. Кек. 255:10-17 (2000); Хие, Н. е! а1., Вюсйет. Вюрйук. Кек. Сотт. 288:610618 (2001); Тйотак, О.1. е! а1., 1. 1тгек1. Эегта1о1. 117:67-73 (2001); Тйотак, О.1. е! а1., 1п!. 1. Сапсег 92:641-650 (2001); Каток, О.М. е! а1., Ма!пх Вю1. 21:297-307 (2002); (Адге/, М. е! а1., Вг. 1. Сапсег 81:9097 (1999); Нат1б1, 8. е! а1., Вг. 1. Сапсег 82(8):1433-1440 (2000); Ка^акЫта, А. е! а1., Ра!йо1. Кек. Ргас!. 99(2):57-64 (2003) и рак молочной железы (АпЫго, К. е! а1., Вгеак! Сапсег 7:19-26 (2000)). Сообщалось также, что субъединица αν может участвовать в метастазировании опухолей и что блокирование этой субъединицы может в результате предотвращать метастазирование (в отношении обзора см. 1тйо1, В.А. е! а1., ш: А!!етр!к !о Ипбегк!апб Ме!ак!акк Еоттайоп I. и. Оип!йет! апб В1гсйте1ег, ебк., Ветйп: 8ртшдег-Уег1ад, рр. 195-203 (1996)).
Интегрин ανβ6 может иметь множественные регуляторные функции в клеточной биологии опухолей. Недавние исследования продемонстрировали, что внеклеточный и цитоплазматический домены субъединицы β6 опосредуют различные клеточные активности. Было показано, что внеклеточный и трансмембранный домены опосредуют активацию ТОЕ-β и адгезию (8йеррагб, Ό., Сапсег апб Ме!ак!акк Ке\'. 24:395-402 (2005); Мипдег, 1.8. е! а1., Се11. 96:319-328 (1999)). Цитоплазматический домен субъединицы β6 содержит уникальную 11-аминокислотную последовательность, которая является важной в опо
- 1 016342 средовании аУв6-регулируемой пролиферации клеток, образовании ММР, миграции и провыживании (Ы, X. е! а1., 1. ΒίοΙ. Сйет., 278 (43): 41646-41653 (2003); Тйотак, Ο.Ι. е! а1., I Шуей. Эепп. 117(1): 67-73 (2001); Тйотак, Ο.Ι. е! а1., Вг. I. Сапсег 87 (8): 859-867 (2002); 1апек, 8.М. апб Аай, Р.М., I. Се11. Βΐο1., 166(3):419-431 (2004))). Субъединица β6 была клонирована, экспрессирована и очищена (8йеррагб е! а1., И.8. Ра!еп! № 6787322 В2, описание которого включено здесь в качестве ссылки в его полном объеме), и были сообщены блокирующие функцию антитела, которые селективно связываются с интегрином ανβ6 (АешйуЬ е! а1., 1. Βίο1. Сйет. 279:17875-17877 (2004), описание этой статьи включено здесь в качестве ссылки в полном объеме). Антагонисты ανβ6 (в том числе определенные моноклональные антитела) были также предложены в качестве возможных средств лечения для определенных форм острого легочного повреждения и фиброза (см. патент США № 6692741 В2 и АО 99/07405, описания которых включены здесь в качестве ссылок в полном объеме).
ανβ6 может связываться с несколькими лигандами, включающими в себя фибронектин, тенасцин и ассоциированные с латентностью пептиды 1 и 3 (ЬАР1 и ЬАР3), Ν-концевые 278 аминокислот латентной формы-предшественника Τ0Ρ-β1, через прямое взаимодействие с мотивом аргинин-глицин-аспартат (ΚΟΌ) (Визк, М. е! а1., I Βίο1. Сйет. 267(9):5790-5796 (1992); Уококай, Υ. е! а1., I Βίο1. Сйет., 271 (39):24144-24150 (1996); Ниапд, Χ.Ζ. е! а1., I Се11. 8ск 111:2189-2195 (1998); Мипдег, 1.8. е! а1., Се11. 96:319-328 (1999)). Цитокин ΤΟΡ-β синтезируется в виде латентного комплекса, который имеет Νконцевой ЬАР, нековалентно ассоциированный со зрелым активным С-концевым цитокином ΤΟΡ-β. Этот латентный комплекс ΤΟΡ-β не может связываться с его родственным рецептором и, следовательно, не является биологически активным, пока он не превращается в активную форму (Βа^се11οк-Нοίί, М.Н., 1. Матт. О1апб Βίο1. 1(4):353-363 (1996); О1е1ге8, Р.Е. е! а1., 8!ет Се11з 15(3):190-197 (1997); Мипдег, 1.8. е! а1., К1б. Ιη!. 51:1376-1382 (1997); КйаШ, Ν., МкгоЬез 1п1ес!. 1(15):1255-1263 (1999)). Связывание ανβ6 с ЬАР1 или ЬАР3 приводит к активации латентной формы-предшественника ΤΟΡ-β1 и ΤΟΡ-β3 (Мипдег, 1.8. е! а1., Се11. 96:319-328 (1999)), предлагаемой в качестве результата конформационного изменения в этом латентном комплексе, позволяющей ΤΟΡ-β связываться с его рецептором. Таким образом, положительно регулируемая экспрессия ανβ6 может привести к локальной активации ΤΟΡ-β, которая, в свою очередь, может активировать каскад событий далее по ходу развертывания событий.
Цитокин ΤΟΡ-β1 является плейотропным фактором роста, который регулирует пролиферацию клеток, дифференцировку клеток и иммунные реакции (Аай1, 8.М., 1. Ехр. Меб. 180:1587-1590 (1994); Маккадие, 1., Аппи. Кеу. Β^οсйет. 67:753-791 (1998); Сйеп, А. апб Аай1, 8.М., ΤΟΡ-β: КесерШгк, 81дпа1шд Ра!йтаук апб АиЮиптипйу. Βη^1: Кагдег, рр. 62-91 (2002); Τйοтак, Э.А. апб Маккадие, 1., Сапсег Се11. 8:369-380 (2005)). Роль, которую играет ΤΟΡ-β в раке, является двусторонней. ΤΟΡ-β считают опухолевым супрессором и ингибирующей рост активностью, но все-таки многие опухоли развивают устойчивость к супрессирующим рост активностям ΤΟΡ-β 1 УшдНпд, 1.М. е! а1., №11иге Кеу. Эгид ΩΚον. 3(12):1011-1022 (2004); Акйигк!, К.1. е! а1., ^еМк Се11. Βίο1. 11 (11):844-851 (2001); Βα^ίώ, А апб Акйигк!, К.1., №11иге 428 (6980):271-272 (2004)). В развившихся опухолях экспрессия и активность ΤΟΡ-β1 участвовали в стимуляции выживания, прогрессирования и метастазирования опухолей (Акйигк!, К.1. е! а1., ^еМк Се11 Βίο1. 11(11):844-851 (2001); Мш^ка, К.8. е! а1., 1. Сйп. ^ек!. 109(12):1551 (2002); Υί^ ΥΑ. е! а1., 1. Сйп. Стек!. 109(12):1607-1615 (2002)). Постулируется, что это опосредовано как аутокринными, так и паракринными действиями в локальной опухоль-стромальной среде, в том числе действиями ΤΟΡ-β на иммунологический надзор, ангиогенез и увеличенное опухолевое интерстициальное давление. Несколько исследований в настоящее время показали противоопухолевое и антиметастатическое действия ΤΟΡ-β1 (Акйигк!, К.1. е! а1., 1. Сйп. Стек!. 109(12):1533-1536 (2002); Мш^ка, К.8. е! а1., 1. Сйп. Стек! 109(12):1551 (2002); Υ^ηд1^ηд, 1.М. е! а1., Νί!. Ку. Эгид ΌΚον. 3(12):1011-1022 (2004); Υί^, Υ.Ά. е! а1., 1. Сйп. Стек!. 109(12):1607-1615 (2002); На1бег, 8.К. е! а1., Nеοр1ак^а 7(5):509-521 (2005); 1уег, 8. е! а1., Сапсег Βίο1. ΤΧγ. 4(3):261-266 (2005)).
Увеличенная экспрессия ανβ6 на опухолях, в частности на границе опухоль-строма, может отражать уникальный механизм для локальной активации ΤΟΡ-β1 и способности стимулировать выживание, инвазию и метастазирование опухоли. Высокий уровень экспрессии в метастазах человека означает потенциальную роль ανβ6 в образовании метастазов, что согласуется с более ранними сообщениями о том, что ανβ6 может опосредовать переход из эпителия в мезенхиму, инвазию опухолевых клеток ш νίίΓο и экспрессию, коррелированную с метастазами в мышиной модели ШаКк, К.С. е! а1., 1. Сйп. Стек! 115 (2):339-347 (2005); ΤΈοωίδ, Ο.Ι. е! а1., Βγ. 1. Сапсег 87(8):859-867 (2002); Мο^даη, М.К. е! а1., 1. Βίο1. Сйет., 279 (25):26533-26539 (2004)).
Авторы изобретения описали ранее генерирование активных и селективных моноклональных антиα,.βζ-антител (тАЬ), которые связываются с формами ανβ6 как человека, так и мышей и блокируют связывание ανβ6 с его лигандами и (/„„.(^-опосредованную активацию ΤΟΡ-β1 (АешгеЬ, Р.Н. е! а1., 1. Βίο1. Сйет. 279 (17):17875-17887 (2004)). Как также описано в публикации РСТ АО 03/100033, включенной здесь в качестве ссылки, были раскрыты и охарактеризованы высокоаффинные антитела против /νβ6, в том числе идентификация и анализ ключевых аминокислотных остатков в определяющих комплемен
- 2 016342 тарность районах (СИЯ) таких антител. В частности, эти высокоаффинные антитела (а) специфически связываются с ανβ6; (Ь) ингибируют связывание ανβ6 с его лигандом, таким как ЬЛР, фибронектин, витронектин и тенасцин, с величиной 1С50, меньшей, чем величина 1С50 10Ό5 (публикация международной заявки на патент νθ 99/07405); (с) блокируют активацию Τ0Ρ-β; (ά) содержат определенные аминокислотные последовательности в СИЯ, которые обеспечивают специфичность связывания с ανβ6; (е) специфически связываются с субъединицей β6; и/или (Г) узнают ανβ6 в процедурах иммуноокрашивания, таких как иммуноокрашивание залитых в парафин тканей.
νθ 03/100033 описывает также обнаружение того, что антитела, которые связываются с ανβ6, могут быть сгруппированы в биофизически различные классы и подклассы. Один класс антител проявляет способность блокировать связывание лиганда (например, ЬЛР) с ανβ6 (блокаторы). Этот класс антител может быть дополнительно подразделен на субклассы катионзависимых блокаторов и катионнезависимых блокаторов. Некоторые из катионзависимых блокаторов содержат последовательность пептида аргинин-глицин-аспартат (Я0Э), тогда как катионнезависимые блокаторы не содержат последовательности Я0Э. Другой класс антител проявляет способность связываться с ανβ6, но все еще не блокирует связывание ανβ6 с лигандом (не блокаторы).
Кроме того, νθ 03/100033 описывает антитела, содержащие тяжелые цепи и легкие цепи, определяющие комплементарность, районы (СЭЯ) 1, 2 и 3 которых состоят из определенных аминокислотных последовательностей, которые обеспечивают специфичность связывания с ανβ6. νθ 03/100033 обеспечивает также антитела, которые специфически связываются с ανβ6, но не ингибируют связывание ανβ6 с ассоциированным с латентностью пептидом (ЬЛР), а также антитела, которые связываются с тем же самым эпитопом.
νθ 03/100033 дополнительно раскрывает клетки гибридом 6.1А8, 6.2В10, 6.309, 6.806, 6.2В1, 6.2А1, 6.2Е5, 7.1010, 7.705 и 7.1С5, причем выделенные нуклеиновые кислоты содержат кодирующие последовательности, а выделенные полипептиды содержат аминокислотные последовательности анти«ДБ-антител. В частности, νθ 03/100033 раскрывает анти-α,ДС-антитела. содержащие полипептидные последовательности тяжелой и легкой цепей в виде антител, продуцируемых гибридомами 6.1А8, 6.2В10, 6.309, 6.806, 6.2В1, 6.2А1, 6.2Е5, 7.1010, 7.705 или 7.1С5. Несколько из этих гибридом были депонированы в Американской Коллекции типовых культур (АТТС; Р.О. Вох 1549, Мапаккак, УА 20108, И8А), согласно Будапештскому договору. В частности, гибридомные клоны 6.309 и 6.806 были депонированы 16 августа 2001 г. и имеют номера доступа АТСС РТА-3649 и РТА-3645 соответственно. Мышиные антитела, продуцируемые гибридомами 6.309 и 6.806, исследуются дополнительно в данной заявке в отношении их потенциального развития в качестве гуманизированных антител.
Мышиное моноклональное антитело 309 является мышиным 1д01, κ-антителом, выделенным из β6интегрин -/- мыши (Ниапд е1 а1., 1. Се11 Вю1., 133:921-928 (1996)), иммунизированной растворимым ανβ6 человека. Антитело 309 специфически узнает эпитоп интегрина ανβ6, который экспрессируется при положительно регулируемых уровнях во время патологического изменения, фиброза и рака (см., например, Тйотак е! а1., 1. 1пуек!. Эетта!о1о§у 117:67-73 (2001); Вгип!оп е! а1., №ор1ак1а 3:215-226 (2001); Адгех е! а1., 1п!. 1. Сапсег 81:90-97 (1999); Вгеикк, 1. Се11 8с1епсе 108:2241-2251 (1995)). Оно не связывается с другими α.,-интегринами и перекрестно реагирует с молекулами как человека, так и мыши. Было описано, что мышиное моноклональное антитело 309 блокирует связывание ανβ6 с БАР, как определено по блокированию связывания лиганда либо с очищенным растворимым ανβ6 человека, либо с β6экспрессирующими клетками, ингибируя посредством этого профиброзную активность активации рецептора Τ0Ρ-β (см. νθ 03/100033). Было также показано, что оно ингибирует ανβ6-опосредованную активацию Τ0Ρ-β с величиной 1С50, более низкой, чем величина 1С50 известных ανβ6-антител, 10Ό5 (Ниапд е! а1., 1. Се11 δα. 111:2189-2195 (1998)).
Мышиное моноклональное антитело 806 является мышиным 1д01, κ-антителом, которое узнает также эпитоп интегрина ανβ6, как описано в νθ 03/100033. Это мышиное моноклональное антитело 806 является катионзависимым, высокоаффинным блокатором ανβ6, обнаруживающим способность ингибировать ανβ6-опосредованную активацию Τ0Ρ-β с величиной 1С50 более низкой, чем величина 1С50 10Ό5 (см. νθ 03/100033).
Мышиные антитела как 309, так и 806, были эффективны в предупреждении фиброза почки и легкого, как описано в νθ 03/100033. Кроме того, мышиное антитело 309 было способно эффективно ингибировать рост опухоли в модели ксенотрансплантата опухоли человека, что предполагает потенциальную роль ανβ6 в патологии рака и эффективность такой блокады с использованием антител, направленных на ανβ6.
Таким образом, существует потребность в развитии ανβ6-антител, которые являются менее антигенными в людях и которые могут быть применимы в лечении заболеваний, включающих в себя ανβ6путь. С появлением методологии рекомбинантных ДНК стало возможным структурное конструирование генов антител и получение модифицированных молекул антител со свойствами, не получаемыми технологией гибридом. В терапевтической области одной из задач этой методологии было уменьшение имму
- 3 016342 ногенности моноклональных антител грызунов в людях модификацией их первичной аминокислотной структуры. Уменьшение иммуногенности терапевтических антител является желательным, так как индукция иммунного ответа может вызывать спектр побочных (вредных) действий в пациенте, в диапазоне от усиленной элиминации этого терапевтического антитела, с последующей потерей эффективности, до фатальной анафилаксии в наиболее тяжелом случае.
Одной стратегией уменьшения иммуногенности чужеродных моноклональных антител была замена константных доменов легких и тяжелых цепей моноклонального антитела аналогичными доменами человеческого происхождения, с оставлением доменов вариабельной области чужеродного антитела интактными. Домены вариабельной области легкой и тяжелой цепей являются ответственными за взаимодействие между антителом и антигеном. Химерные молекулы антител, имеющие вариабельные домены мыши, присоединенные к константным доменам человека, обычно связывают антиген с той же самой константой аффинности, что и мышиное антитело, из которого получена эта химера. Такие химерные антитела являются менее иммуногенными в людях, чем их полные мышиные копии. Тем не менее, антитела, которые сохраняют целые мышиные вариабельные домены, склонны провоцировать иммунные реакции у существенной части пациентов.
То, что люди могут генерировать иммунную реакцию на целые мышиные вариабельные домены, было предсказуемым, и, следовательно, начались попытки получения вариабельных доменов с более человеческой природой, даже до того, как были сообщены клинические испытания таких стандартных химерных антител. Одна категория способов, часто называемых гуманизацией, направлена на превращение вариабельных доменов мышиных моноклональных антител в более человеческую форму рекомбинантным конструированием вариабельного домена антитела, имеющего как мышиную природу, так и природу домена человека. Стратегии гуманизации основываются на нескольких согласованных пониманиях данных по структуре антитела. Во-первых, вариабельные домены содержат смежные участки пептидной последовательности, которые являются консервативными в пределах вида, но которые различаются между эволюционно удаленными видами, такими как мыши и люди. Во-вторых, другие смежные участки не являются консервативными в пределах вида, но различаются даже между продуцирующими антитело клетками в одном и том же индивидууме. В-третьих, контакты между антителом и антигеном происходят в принципе посредством неконсервативных областей вариабельного домена. В-четвертых, молекулярная архитектура вариабельных доменов антитела является достаточно сходной во всех видах, чтобы соответствующие положения аминокислотных остатков между видами могли быть идентифицированы на основе только положения, без экспериментальных данных.
Стратегии гуманизации имеют общую предпосылку, что замена аминокислотных остатков, которые являются характерными для мышиных последовательностей, будет уменьшать иммуногенность в людях полученного антитела. Однако замена последовательностей между видами обычно приводит к уменьшению связывания антитела с его антигеном. Таким образом, этот тип гуманизации лежит в балансировании замены исходной мышиной последовательности для уменьшения иммуногенности с необходимостью сохранения гуманизированной молекулой достаточного связывания антигена, чтобы быть терапевтически применимой. Этот баланс был найден с использованием двух подходов.
В одном подходе, приведенном в качестве примера в патенте США № 5869619, остатки антитела человека обычно заменяют остатками мышиного вариабельного домена, которые, как определено или предсказано, (ί) не играют значимой химической роли во взаимодействии с антигенами и (п) расположены с боковыми цепями, выступающими в растворитель. Таким образом, наружные остатки, удаленные от сайта связывания антигена, являются гуманизированными, в то время как внутренние остатки, антигенсвязывающие остатки и остатки, образующие границу между вариабельными доменами, остаются мышиными. Одним недостатком этого подхода является то, что требуются довольно обширные экспериментальные данные для определения, играет ли остаток незначимую химическую роль в связывании антигена или будет расположен в растворителе в виде конкретной трехмерной структуры антитела.
В другом более общем подходе, приведенном в примере патента США № 5225539, смежные участки пептидной последовательности мышиного вариабельного домена, рассматриваемые как консервативные, заменяют соответствующими участками из антитела человека. В еще более общем подходе все остатки вариабельного домена гуманизируют, за исключением неконсервативных районов, участвующих в связывании антигена. Для определения подходящих смежных участков для замены патент США № 5225539 использовал классификацию последовательностей вариабельных доменов, которая была разработана ранее \¥и апб КаЬа!, 1. Ехр. Меб. 132 (2):211-250 (1970).
\Уи и КаЬа! первыми выполнили сопоставление пептидных последовательностей антител, и их вклад в этом отношении был многосторонним: во-первых, посредством исследования сходства последовательностей между вариабельными доменами они идентифицировали соответствующие остатки, которые были в большей или меньшей степени гомологичными во всех антителах во всех видах позвоночных, в том, что они принимали сходную трехмерную структуру, играли сходные функциональные роли, взаимодействовали сходным образом с соседними остатками и существовали в сходных химических окружениях. Во-вторых, они предложили систему нумерации пептидных последовательностей, в которой
- 4 016342 гомологичные остатки иммуноглобулинов были отнесены к одному и тому же номеру положения. Специалист с квалификацией в данной области может недвусмысленно применить эту нумерацию, которую теперь обычно называют нумерацией Кабата, к любой последовательности вариабельного домена, без ссылки на какие-либо экспериментальные данные, кроме самой этой последовательности. В-третьих, для каждого нумерованного по Кабату положения последовательности, Кабат и Ву рассчитали вариабельность, под которой они имеют в виду обнаружение нескольких или многих возможных аминокислот при сопоставлении последовательностей вариабельных доменов. Они идентифицировали три смежных района высокой вариабельности, заключенных в четырех менее вариабельных смежных районах. Другие исследователи ранее отмечали вариабельность приблизительно в этих районах (гипервариабельных районах) и постулировали, что эти высоковариабельные районы представляли аминокислотные остатки, используемые для связывания антигена. Кабат и Ву официально разграничили остатки, составляющие эти вариабельные участки, и назвали их определяющими комплементарность районами (СОВ), ссылаясь на химическую комплементарность между антителом и антигеном. Роль в трехмерной укладке вариабельного домена, но не в узнавании антигена была приписана остальным менее вариабельным районам, которые теперь называют каркасными районами. В-четвертых, Кабат и Ву создали публичную базу данных пептидных последовательностей антител и последовательностей нуклеиновых кислот антител, которая продолжает сохраняться и хорошо известна специалистам с квалификацией в данной области.
Способ гуманизации, описанный патентом США № 5225539 с использованием классификации Кабата, приводит к химерному антителу, содержащему СЭВ из одного антитела и каркасные районы из другого антитела, которое отличается по видовому происхождению, специфичности, подклассу или другим характеристикам. Однако каркасным районам не приписывают никаких конкретных последовательностей или свойств, действительно, патент США № 5225539 утверждает, что любой ряд каркасов мог бы быть объединен с любым набором из СЭВ. С тех пор каркасные последовательности были признаны как важные для придания трехмерной структуры вариабельной области антитела, необходимой для поддержания хорошего связывания антигена. Последующие развития в этой области были усовершенствованиями в объеме патента США № 52215539, связанными с устранением потери авидности в отношении антигена, наблюдаемой с некоторыми гуманизированными антителами, относительно авидности соответствующих мышиных антител.
Патент США № 5693761 описывает одно усовершенствование относительно патента США 5225539 в отношении гуманизации антител и основывается на предпосылке, которая приписывает потерю авидности проблемам в структурных мотивах в гуманизированном каркасе, которые вследствие стерической или другой химической несовместимости мешают фолдингу (укладке) СЭВ в способную к связыванию конформацию, обнаруживаемую в мышином антителе. Для решения этой проблемы патент США № 5693761 предлагает использование каркасных последовательностей человека, близко гомологичных в линейной пептидной последовательности, каркасным последовательностям мышиного антитела, которое подлежит гуманизации. Таким образом, способы патента США № 5693761 фокусируются на сравнении каркасных последовательностей между видами. Обычно, все доступные последовательности вариабельных доменов человека сравнивают с конкретной мышиной последовательностью и рассчитывают процентную идентичность между соответствующими каркасными остатками. Выбирают вариабельный домен человека с наивысшим процентом для обеспечения каркасных последовательностей для плана гуманизации. Патент США № 5693761 утверждает также, что важно сохранять в гуманизированном каркасе некоторые аминокислотные остатки из мышиного каркаса, критические для поддержания СЭВ в способной к связыванию конформации.
В других подходах решающую роль конкретных аминокислотных остатков каркаса определяют экспериментально, как только получают гуманизированную конструкцию низкой авидности, возвратом отдельных остатков мышиной последовательности и анализом связывания антигена, как описано В1еейтапп е1 а1., Пакте 332(6162):323-327 (1988). Другой примерный подход к идентификации решающей роли аминокислот в каркасных последовательностях описан в патенте США № 5821337 и патенте США № 5859205. Эти ссылки описывают конкретные положения остатков Кабата в каркасе, которые в гуманизированном антителе могут требовать замены соответствующей мышиной аминокислотой для сохранения авидности. Таким образом, полученные сконструированные каркасы, которые являются частично человеческими и частично мышиными, все еще часто проявляют иммуногенность в человеке или пониженную авидность связывания, требуя вследствие этого многочисленных повторений в конструировании каркаса для получения подходящего каркаса для терапевтических применений.
Таким образом, существует потребность в данной области в развитии α,.β,-,-антител. которые являются менее антигенными в людях. Данное изобретение обеспечивает генерирование гуманизированных антител, которые являются специфически реактивными с ανβ6. Данное изобретение обеспечивает также способы приготовления таких гуманизированных антител обеспечением гуманизированных антител, которые надежно идентифицируют подходящие каркасные последовательности человека для поддержания районов нечеловеческого СЭВ и, кроме того, для обеспечения гуманизированных антител, которые сохраняют высокое связывание антигена с низкой иммуногенностью в людях. Данное изобретение обеспе
- 5 016342 чивает также применения таких гуманизированных антител, реактивных с ανβ6, в лечении, диагностике и/или предотвращении различных заболеваний и нарушений.
Сущность изобретения
Данное изобретение основано, по меньшей мере частично, на раскрытии и характеристике высокоаффинных гуманизированных антител против ανβ6, в том числе идентификации и анализе ключевых аминокислотных остатков в определяющих комплементарность районах (СЭК.) таких антител, а также идентификации и анализе критических аминокислотных остатков в каркасных последовательностях.
В одном варианте осуществления данное изобретение относится к гуманизированным моноклональным антителам, имеющим специфичность связывания в отношении интегринов ανβ6, причем указанное антитело содержит вариабельные домены тяжелой и легкой цепей 8ЕЦ ΙΌ N0: 1 и 8ЕЦ ΙΌ N0: 2 соответственно. Такие гуманизированные антитела получают из гуманизации мышиного антитела 3С9. В некоторых вариантах осуществления эти гуманизированные антитела содержат тяжелую цепь, определяющие комплементарность районы (СЭК) 1, 2 и 3 которой определяются аминокислотными остатками 31-35, 50-65 и 98-109, соответственно, 8ЕЦ ΙΌ N0: 1. В некоторых вариантах осуществления эти гуманизированные антитела содержат легкую цепь, СЭК 1, 2 и 3 которой определяются аминокислотными остатками 24-35, 51-57 и 90-98, соответственно, 8ЕЦ ΙΌ N0: 2. В некоторых вариантах осуществления эти гуманизированные антитела содержат тяжелую цепь, каркасные районы (ЕВ) 1, 2, 3 и 4 которой определяются аминокислотными остатками 1-30, 36-49, 66-97 и 110-120, соответственно, 8ЕЦ ΙΌ N0: 1. В некоторых вариантах осуществления эти гуманизированные антитела содержат легкую цепь, каркасные районы (ЕК) 1, 2, 3 и 4 которой определяются аминокислотными остатками 1-23, 36-50, 58-89 и 99-108, соответственно, 8ЕЦ ΙΌ N0: 2.
В некоторых вариантах осуществления эти гуманизированные антитела содержат по меньшей мере одну из следующих аминокислотных замен в тяжелой цепи, состоящих из Ц3М и N748 8ЕЦ ΙΌ N0: 1. В некоторых вариантах осуществления эти гуманизированные антитела содержат по меньшей мере одну из следующих аминокислотных замен в легкой цепи, состоящих из Е1Ц. Ε47\ν. Ι58ν, Л60У и Υ87Ε 8ЕЦ ΙΌ N0: 2.
В некоторых вариантах осуществления это гуманизированное антитело содержит версию 1 тяжелой цепи (НУ1), в которой эта тяжелая цепь состоит из аминокислотных замен Ц3М и N748 8ЕЦ ΙΌ N0: 1. В некоторых вариантах осуществления это гуманизированное антитело содержит версию 2 тяжелой цепи (НУ2), в которой эта тяжелая цепь состоит из аминокислотной замены N748 8ЕЦ ΙΌ N0: 1. В некоторых вариантах осуществления это гуманизированное антитело содержит версию 3 тяжелой цепи (НУ3), в которой эта тяжелая цепь состоит из 8ЕЦ ΙΌ N0: 1.
В некоторых вариантах осуществления это гуманизированное антитело содержит версию 1 легкой цепи (ЬУ1), в которой эта легкая цепь состоит из аминокислотных замен Τ47ν, 158У, Л60У и Υ87Ε 8ЕЦ ΙΌ N0: 2. В некоторых вариантах осуществления это гуманизированное антитело содержит версию 2 легкой цепи (ЬУ2), в которой эта легкая цепь состоит из аминокислотных замен Τ47ν и 158У 8ЕЦ ΙΌ N0: 2. В некоторых вариантах осуществления это гуманизированное антитело содержит версию 3 легкой цепи (ЬУ3), в которой эта легкая цепь состоит из аминокислотной замены Τ47ν 8ЕЦ ΙΌ N0: 2. В некоторых вариантах осуществления это гуманизированное антитело содержит версию 4 легкой цепи (ЬУ4), в которой эта легкая цепь состоит из аминокислотных замен Е1Ц и Τ47ν 8ЕЦ ΙΌ N0: 2. В некоторых вариантах осуществления это гуманизированное антитело содержит версию 5 легкой цепи (ЬУ5), в которой эта легкая цепь состоит из 8ЕЦ ΙΌ N0: 2.
В некоторых вариантах осуществления это гуманизированное антитело содержит вариабельный домен тяжелой и легкой цепей, содержащий НУ3, где эта тяжелая цепь состоит из 8ЕЦ ΙΌ N0: 1, и ЬУ5, где эта легкая цепь состоит из 8ЕЦ ΙΌ N0: 2.
В некоторых вариантах осуществления эти гуманизированные антитела имеют СЭК, произведенные из мышиного антитела 6.3С9 (АТСС Асеевой № РТА-3649).
В родственных вариантах осуществления данное изобретение относится также к гуманизированным моноклональным антителам, имеющим специфичность связывания в отношении интегринов ανβ6, где эти антитела содержат вариабельные области тяжелой и легкой цепей 8ЕЦ ΙΌ N0: 3 и 8ЕЦ ΙΌ N0: 4. Такие гуманизированные антитела получены из гуманизации мышиного антитела 8С6. В некоторых вариантах осуществления эти гуманизированные антитела содержат тяжелую цепь, определяющие комплементарность районы (СЭК) 1, 2 и 3 которой определяются аминокислотными остатками (т.е. за исключением некоторых консервативных вариаций) 31-35, 50-66 и 99-115, соответственно, 8ЕЦ ΙΌ N0: 3. В некоторых вариантах осуществления эти гуманизированные антитела содержат легкую цепь, СЭК 1, 2 и 3 которой определяются аминокислотными остатками 24-48, 54-60 и 93-101, соответственно, 8ЕЦ ΙΌ N0: 4. В некоторых вариантах осуществления эти гуманизированные антитела содержат тяжелую цепь, каркасные районы (ЕК) 1, 2, 3 и 4 которой определяются аминокислотными остатками 1-30, 36-49, 67-98 и 116-126, соответственно, 8ЕЦ ΙΌ N0: 3. В некоторых вариантах осуществления эти гуманизированные антитела содержат легкую цепь, каркасные районы (ЕК) 1, 2, 3 и 4 которой определяются аминокислотными остатками 1-23, 39-53, 61-92 и 102-111, соответственно, 8ЕЦ ΙΌ N0: 4.
- 6 016342
В некоторых вариантах осуществления эти гуманизированные антитела содержат по меньшей мере одну из следующих аминокислотных замен в тяжелой цепи, состоящих из А2 4С, 0268, О39Е Μ48Ι, У68А, К72У и Т74К, 8Е0 ΙΌ N0: 3. В некоторых вариантах осуществления эти гуманизированные антитела содержат по меньшей мере одну из следующих аминокислотных замен в легкой цепи, состоящих из Ε1Ό, Ь46Е и Υ49Κ, 8ЕО ΙΌ N0: 4.
В некоторых вариантах осуществления это гуманизированное антитело содержит версию 1 тяжелой цепи (НУ1), в которой эта тяжелая цепь состоит из аминокислотных замен А240, 02 68, Р39Ь, Μ48Ι, У68А, К.72У и Т74К, 8Е0 ΙΌ N0: 3. В некоторых вариантах осуществления это гуманизированное антитело содержит версию 2 тяжелой цепи (НУ2), в которой эта тяжелая цепь состоит из аминокислотных замен Μ48Ι, У68А, К.72У и Т74К, 8Е0 ΙΌ N0: 3. В некоторых вариантах осуществления это гуманизированное антитело содержит версию 3 тяжелой цепи (НУ3), в которой эта тяжелая цепь состоит из аминокислотных замен У68А, К.72У и Т74К, 8Е0 ΙΌ N0: 3.
В некоторых вариантах осуществления это гуманизированное антитело содержит версию 1 легкой цепи (ЬУ1), в которой эта легкая цепь состоит из аминокислотных замен ЕЮ, Ь46Е и Υ49^ 8Е0 ΙΌ N0: 4. В некоторых вариантах осуществления это гуманизированное антитело содержит версию 2 легкой цепи (ЬУ2), в которой эта легкая цепь состоит из аминокислотных замен Ь46Е и Υ49^ 8Е0 ΙΌ N0: 4. В некоторых вариантах осуществления это гуманизированное антитело содержит версию 3 легкой цепи (ЬУ3), в которой эта легкая цепь состоит из аминокислотной замены У49К, 8Е0 ΙΌ N0: 4.
В некоторых вариантах осуществления эти гуманизированные антитела имеют ΟΌΒ, произведенные из мышиного антитела 6.806. В некоторых вариантах осуществления эти гуманизированные антитела могут конкурировать за связывание с ανβ6 с мышиным антителом 806.
Данное изобретение включает в себя также гуманизированные антитела, которые связываются с тем же самым эпитопом, что и вышеописанные антитела.
Данное изобретение включает в себя также гуманизированные антитела, продуцируемые рекомбинантным вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую указанные антитела. В некоторых вариантах осуществления этим рекомбинантным вектором может быть плазмида, выбранная из группы, состоящей из рК18195 (8Е(Э ΙΌ N0: 5), рК18189 (8Е0) ΙΌ N0: 6) и рК18196 (8ЕЕ) ΙΌ N0: 7).
Данное изобретение включает в себя также выделенные нуклеиновые кислоты, содержащие кодирующую последовательность для любой из 8Е0 ΙΌ N0: 1-7, и выделенные полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность любой из 8Е0 ΙΌ N0: 1-7.
Данное изобретение включает в себя также рекомбинантные векторы, содержащие нуклеиновые кислоты любого из вышеописанных гуманизированных антител.
Данное изобретение включает в себя также клетки-хозяева, содержащие рекомбинантные векторы, содержащие нуклеиновые кислоты любого из вышеописанных гуманизированных антител.
Данное изобретение включает в себя также композиции, содержащие одно или несколько гуманизированных антител этого изобретения и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых из этих композиций гуманизированные антитела конъюгированы с цитотоксическим агентом (т.е. агентом, который ухудшает жизнеспособность и/или функции клетки), таким как токсин или радионуклид. Эти композиции могут вводиться субъекту (например, млекопитающему, такому как человек), имеющему заболевание, опосредованное ανβ6, или находящемуся при риске возникновения заболевания, опосредованного ανβ6, для лечения (например, ослабления симптомов, смягчения, уменьшения, предупреждения, задержки возникновения) этого заболевания. Примеры таких заболеваний включают в себя, но не ограничиваются ими фиброз (например, склеродермию, образование рубцов, фиброз печени, фиброз легких и фиброз почки); псориаз; рак (как описано в другом месте здесь, например, эпителиальный рак, рак полости рта, кожи, рак шейки матки, яичников, фарингеальный рак, рак гортани, рак пищевода, легкого, молочной железы, почки, поджелудочной железы, предстательной железы или колоректальный рак) ; синдром Альпорта; острые и хронические патологические изменения легкого, печени, почки и других внутренних органов; и склероз легкого, печени, почки и других внутренних органов. Риск возникновения таких заболеваний могут происходить из генетического предрасположения; некоторых типов образа жизни, например, курения и алкоголизма; воздействия загрязнителей окружающей среды, таких как асбест; физиологических состояний, таких как диабет, инфекции вирусов гепатита (например, инфекция вируса гепатита С), аутоиммунные заболевания; и медицинских обработок, таких как лучевая терапия.
Данное изобретение включает в себя также способы получения любого из вышеописанных гуманизированных антител культивированием любой из вышеописанных клеток-хозяев в условиях, подходящих для экспрессии гуманизированного антитела, в которых экспрессируются цепи гуманизированного антитела и продуцируются гуманизированные антитела. В некоторых вариантах осуществления эти способы дополнительно предусматривают стадии выделения гуманизированных антител. В некоторых вариантах осуществления клеткой-хозяином является клетка СНО.
Гибридомные клоны 6.309 и 6.806 были депонированы 16 августа 2001 г. в Американской Коллекции типовых культур (АТСС; Р.0. Вох 1549, Мапаккак, УА 20108, И8А) согласно Будапештскому Договору и имеют номера доступа АТСС РТА-3649 и 3645 соответственно.
- 7 016342
Гуманизированным антителом этого изобретения называют полноразмерное антитело, например антитело, содержащее две тяжелые цепи и две легкие цепи, или антигенсвязывающий фрагмент полного антитела, такой как РаЬ-фрагмент, РаЬ'-фрагмент, Р(аЬ')2-фрагмент и Р(,)-фрагмент. Гуманизированное антитело данного изобретения может быть антителом любого изотипа и подтипа, например 1дА (например, 1дА1 и 1§А2), 1дС (например, Ι§01, Ι§02, Ι§03 и Ι§04), 1дЕ, Ι§Ό, 1дМ, где легкие цепи иммуноглобулина могут быть легкими цепями типа к или λ.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело данного изобретения может содержать мутацию (например, делецию, замену или добавление) в одном или нескольких (например, 2, 3, 4, 5 или 6) определенных положениях в тяжелой цепи, так что эффекторная функция этого антитела (например, способность этого антитела связываться с Рс-рецептором или фактором комплемента) изменяется без влияния на антигенсвязывающую активность антитела.
В других вариантах осуществления гуманизированное антитело данного изобретения может содержать мутацию в аминокислотном остатке, который является сайтом гликозилирования, так что этот сайт гликозилирования элиминируется. Такое гуманизированное антитело может иметь клинически благоприятные уменьшенные эффекторные функции или другие нежелательные функции при сохранении его антигенсвязывающей аффинности. Мутация сайта гликозилирования может быть также благоприятной для развития технологического процесса (например, экспрессии и очистки белка).
В некоторых вариантах осуществления данного изобретения гуманизированное антитело содержит дегликозилированную легкую цепь, СЭВ которой получены из мышиного антитела 309. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело 309 содержит вариабельный домен легкой цепи, где СЭВ1 содержит замену аспарагина (Ν) на серин (8) в аминокислотном остатке 26 8Е0 ΙΌ N0: 2. Мышиный район СЭВ1 309 содержит аспарагин в этом положении аминокислоты. Однако в гуманизированной версии антитела 309 все пять версий легкой цепи (БУ1, ЬУ2, БУ3, БУ4 и БУ5) содержат серин в районе СЭВ1 309 в этом положении. Было показано, что дегликозилирование этого сайта во всех версиях легкой цепи гуманизированного антитела 309 является благоприятным как для экспрессии, так и для очистки этих легких цепей. В некоторых других вариантах осуществления гуманизированное антитело 309 содержит мутацию в сайте гликозилирования, который обычно требуется для нормального связывания Рс-рецептора. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело 309 содержит аминокислотную замену аспарагина (Ν) на глутамин Ю). В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело 309 содержит аминокислотную замену N на О в версии 3 тяжелой цепи (НУ3), продуцируемой рекомбинантным вектором, содержащим плазмиду рКТ8196 (8Е0 ΙΌ N0:7). В некоторых вариантах осуществления аминокислотная замена N на О происходит в аминокислотном положении 319 8>Е0 ΙΌ N0: 7. Было показано, что дегликозилирование этого сайта в версии 3 тяжелой цепи (НУ3) гуманизированного антитела 309 удаляет сигнал гликозилирования, требуемый для нормального связывания Рс-рецептора без влияния на антигенсвязывающую активность гуманизированного антитела. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело 309 содержит версию 3 тяжелой цепи (НУ3), продуцируемую рекомбинантным вектором, содержащим плазмиду рК18189 (8Е0 ΙΌ N0: 6), и версию 5 легкой цепи (ЬУ5), продуцируемую рекомбинантным вектором, содержащим плазмиду рК18195 (8Е0 ΙΌ N0: 5). В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело 309 содержит дегликозилированную версию 3 тяжелой цепи (а-НУ3), продуцируемую рекомбинантным вектором, содержащим плазмиду рК18196 (8Е0 ΙΌ N0: 7), и версию 5 легкой цепи (ЬУ5), продуцируемую рекомбинантным вектором, содержащим плазмиду рК18195 (8Е0 ΙΌ N0: 5).
В других дополнительных вариантах осуществления эти тяжелые или легкие цепи могут содержать мутации, которые увеличивают аффинность или активность.
Гуманизированные антитела данного изобретения применимы для лечения любого клинически нежелательного состояния или заболевания (обсуждаемых здесь), которое опосредовано связыванием ανβ6 с его лигандом, таким как БАР и фибронектин. Эти гуманизированные антитела могут быть более эффективными через более высокую аффинность или авидность и зависимость или независимость от катиона связывания с лигандом, чем ранее известные αν [/-антитела. В отличие от мышиных моноклональных антител гуманизированные антитела этого изобретения не будут вызывать продуцирования антител против мышиного иммуноглобулина в субъекте, в частности в теле человека, и вместо этого обнаруживают пролонгированный полупериод существования в крови с уменьшенной частотой побочных (вредных) эффектов, так что можно ожидать, что они превосходят мышиные моноклональные антитела по эффективности в лечении заболеваний, опосредованных ανβ6.
В дополнительных аспектах данное изобретение относится к способам диагностики, лечения и предупреждения рака с использованием αν[/-связывающих лигандов, таких как α,„.[/-связывающие антитела. В одном варианте осуществления данное изобретение обеспечивает способы уменьшения или предупреждения вторичной локализации метастазов первичной опухоли у пациента, предусматривающие введение пациенту терапевтически эффективного количества одного или нескольких лигандов, которые связываются с одной или несколькими субъединицами интегрина ανβ6 на одной или нескольких клетках в первичной опухоли, где связывание этого лиганда с интегрином приводит к смерти, чувствительности к
- 8 016342 химиотерапии или увеличенной инвазивности опухолевой клетки. В родственных вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способы уменьшения или предотвращения прогрессирования преметастатической опухоли в метастатическую опухоль у пациента, предусматривающие введение пациенту терапевтически эффективного количества одного или нескольких лигандов, которые связываются с одной или несколькими субъединицами интегрина ανβ6 на одной или нескольких клетках в преметастатической опухоли, где связывание этого лиганда с интегрином приводит к уменьшению или предотвращению инвазии клеток преметастатической опухоли в зоны тканей, окружающие первичную опухоль. В некоторых подобных вариантах осуществления данного изобретения опухолевой клеткой является клетка карциномы, например аденокарциномы. В более конкретных вариантах осуществления этой карциномой является карцинома молочной железы, карцинома эндометрия, карцинома поджелудочной железы, колоректальная карцинома, карцинома легкого, карцинома печени, карцинома яичника, карцинома шейки матки, карцинома предстательной железы, карцинома печени, карцинома пищевода, карцинома головы и шеи, карцинома желудка или карцинома селезенки. Более конкретно, эта карцинома является раком молочной железы (в том числе, но не только, раком ίη κίΐιι молочной железы, таким как внутрипротоковый преинвазивный рак ίη κίΐιι (рак на месте) (ЭС18) или дольчатый рак ίη кйи (ЬС18)), раком эндометрия, панкреатическим раком, колоректальным раком, раком шейки матки или раком легкого.
Подходящие варианты осуществления по этому аспекту изобретения используют ανβ6связывающие лиганды, которые являются аф6-антителами или их (/„ДУ-эпитопсвязывающими фрагментами. Согласно некоторым таким вариантам осуществления этими антителами являются моноклональные антитела (которые могут быть химерными, приматизированными или гуманизированными), в том числе моноклональные антитела, описанные в публикации заявки на патент США № И8 2005/0255102 А1, описание которой включено здесь в качестве ссылки в полном виде. Такие подходящие антитела включают в себя, но не ограничиваются ими, а„[6-связывающие моноклональные антитела, названные 1А8, 369, 866, 2В1, 2В10, 2А1, 2Е5, 1610, 765, 1С5, 10Ό5 (депозит АТСС № НВ12382) и С8Р6, также как их фрагменты, химеры и гибридомы. Особенно подходящими для применения в таких вариантах осуществления данного изобретения являются моноклональные антитела 369 и 866. Особенно подходящими для применения в таких вариантах осуществления этого изобретения являются также гуманизированные моноклональные антитела, такие как гуманизированное антитело 369, названное йи369 (В600011), и гуманизированное антитело 866, названное йи866.
В некоторых таких терапевтических вариантах данного изобретения а„[6-связывающие лиганды (например, а„[6-связывающие антитела) конъюгированы или связаны с одним или несколькими цитотоксическими соединениями или агентами, которые приводят к смерти или вызывают смерть клетки или ткани после связывания конъюгата а„[6-связывающий лигандтоксическое соединение с одним или несколькими интегринами /νβ6 на этой клетке или ткани. В дополнительных терапевтических вариантах осуществления этого изобретения а„[6-связывающие лиганды (например, а„[6-связывающие антитела) вводят пациенту вместе с одним или несколькими цитотоксическими соединениями или агентами. Цитотоксические соединения или агенты, которые могут быть подходящим образом использованы в соответствии с этими аспектами данного изобретения, включают в себя, но не ограничиваются ими, цитотоксические агенты (например, цисплатин, карбоплатин, оксалиплатин, паклитаксел, мелфалан, доксорубицин, метотрексат, 5-фторурацил, этопозид, мехлоретамин, циклофосфамид, блеомицин, калихеамицин, майтансин, трихотен, СС1065, А-цепь дифтерийного токсина, А-цепь экзотоксина Ркеибошопак аетидшока, А-цепь рицина, А-цепь абрина, А-цепь модекцина, α-сарцин, белки А1еип1С8 ίοτάίί, белки диантина, белки Р11у1о1асса ашепсапа, ингибиторы Мошотбюа сйатапйа, курцин, кротин, ингибиторы 8аропапа οΓΓίοίпайк, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин, трикотецены, рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы), радиоактивные изотопы (такие как 211Αΐ, 131Ι,125Ι, 90Υ, 186Ре. 188Ре. 1538ш, 212В1, и радиоактивные изотопы Ьи) и активирующие пролекарство ферменты (такие как щелочная фосфатаза, арилсульфатаза, цитозиндезаминаза, протеазы, Ό-аланилкарбоксипептидазы, расщепляющие углеводы ферменты, Р-лактамаза и пенициллинамидаза). В некоторых вариантах осуществления один или несколько ανβ6интегринсвязывающие лиганды вводят пациенту в форме фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество одного или нескольких а„в6-интегринсвязывающих лигандов и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей или эксципиентов. Эти один или несколько ανβ6интегринсвязывающих лигандов и/или одна или несколько фармацевтических композиций, содержащих один или несколько а^-интегринсвязывающих лигандов, могут вводиться пациенту любым подходящим способом введения фармацевтических композиций, в том числе, но не только, оральным введением, парентеральным введением (в том числе, например, инъекцией с использованием внутримышечного, внутривенного, внутриартериального, внутрибрюшинного или подкожного способа), внутричерепным введением, чрескожным введением, внутрилегочным введением и интраназальным введением. В дополнительных вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способы диагностики или идентификации карциномы, такой как аденокарцинома, которая, более вероятно, будет прогрессировать в инвазивную карциному и/или которая, более вероятно, будет отвечать на лечение лигандом, который связывается с одной или несколькими субъединицами интегрина /νβ6. Такие подходящие способы могут
- 9 016342 предусматривать, например, (а) получение от пациента пробы раковой эпителиальной ткани, содержащей опухоль или ее часть, и пробы нераковой эпителиальной ткани; (Ь) контактирование этих проб ткани с одним или несколькими лигандами, которые связываются с одной или несколькими субъединицами интегрина ανβ6; и (с) определение уровня экспрессии интегрина ανβ6 в этих пробах ткани, причем увеличение уровня экспрессии интегрина ανβ6 в пробе раковой ткани относительно уровня экспрессии интегрина ανβ6 в пробе нераковой ткани указывает на наличие у пациента карциномы, которая (а) имеет увеличенную вероятность прогрессирования из ίη 5Йи или неинвазивной формы в инвазивную, метастатическую форму; и/или (Ь) должна, более вероятно, отвечать на лечение одним или несколькими из вышеуказанных способов лечения, которые основаны на связывании α,.β,-,-связывающего лиганда, в частности, α,,βί,-связывающего лиганда, который конъюгирован или который вводят вместе с одним или несколькими цитотоксическими соединениями или агентами, такими, как описанные выше. Такие способы пригодны для диагностики или идентификации различных карцином, в том числе, но не только, карцином, в которых участвуют эпителиальные ткани, как отмечалось выше. В некоторых подобных вариантах осуществления лигандом, который связывается с одной или несколькими субъединицами интегрина ανβ6, является α,,β,-,-интегринсвязывающее антитело (которое может быть моноклональным антителом, таким как моноклональные антитела, описанные выше) или его эпитоп а^6-связывающий-фрагмент. Особенно подходящими для применения в таких диагностических способах этого изобретения являются ανβ6связывающие лиганды (например, антитела), которые являются детектируемо меченными, т.е. которые содержат по меньшей мере одну детектируемую метку или конъюгированы или связаны по меньшей мере с одной детектируемой меткой, такой как хромогенная метка (например, диаминобензидин или 4гидроксиазобензол-2-карбоновая кислота), ферментная метка (например, малатдегидрогеназа, стафилококковая нуклеаза, дельта-5-стероидизомераза, дрожжевая алкогольдегидрогеназа, а-глицеролфосфатдегидрогеназа, триозофосфатизомераза, пероксидаза, щелочная фосфатаза, аспарагиназа, глюкозооксидаза, β-галактозидаза, рибонуклеаза, уреаза, каталаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, глюкоамилаза или ацетилхолинэстераза), радиоизотопная метка (например, Н, Ιη, I, I, Р, 8, С, Сг, То, Со, 59Ее, 758е, 152Еи, 90Υ, 67Си, 217С1, 211Αΐ, 212РЬ, 478с или 109Рб), нерадиоактивная метка (например, 157Сб, 55Μη, 162Эу, 52Тг, 56Ее, 99тТс или 112Ιη), флуоресцентная метка (например, метка 152Еи, флуоресцеиновая метка, изотиоцианатная метка, родаминовая метка, фикоэритриновая метка, фикоцианиновая метка, аллофикоцианиновая метка, Зеленый Флуоресцирующий Белок (СЕР), метка в виде о-фталевого альдегида или флуорескаминовая метка), токсическая метка (например, метка в виде дифтерийного токсина, рициновая метка или метка в виде холерного токсина), хемилюминесцентная метка (например, люминоловая метка, изолюминоловая метка, метка в виде акридинийзамещенного ароматического сложного эфира, имидазольная метка, метка соли акридиния, метка оксалатного эфира, люцифериновая метка, люциферазная метка или эквориновая метка), рентгенографическая метка (например, барий или цезий), спиновая метка (например, дейтерий) и метка в виде контрастного агента для ядерного магнитного резонанса (например, Сб, Μη и железо).
В дополнительных вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способы элиминации α,,βί,-положительных метастатических опухолевых клеток в пациенте, предусматривающие введение пациенту терапевтически эффективного количества одного или нескольких лигандов, которые связываются с одной или несколькими субъединицами интегрина ανβ6 на одной или нескольких ανβ6положительных метастатических опухолевых клетках, причем связывание этого лиганда с интегрином приводит к смерти, чувствительности к химиотерапии или пониженной инвазивности этой метастатической опухолевой клетки. Такие способы пригодны для элиминации различных метастатических опухоле вых клеток в пациенте, например, возникающих из метастатических карцином, в том числе, но не только, карцином, включающих в себя эпителиальные ткани, которые отмечались выше. Подходящие варианты в соответствии с этим аспектом данного изобретения используют а^6-интегринсвязывающие лиганды, которые являются α,,βί,-связывающими антителами или их α,,βί,-эпитопсвязывающими фрагментами, в частности моноклональными антителами или их вариантами или фрагментами, описанными выше. В некоторых подобных терапевтических вариантах осуществления данного изобретения α,,βί,-связывающие лиганды (например, а^6-связывающие антитела) конъюгированы или связаны с одним или несколькими цитотоксическими соединениями или агентами, которые приводят к смерти или вызывают смерть клетки или ткани после связывания конъюгата а^6-связывающий лиганд-токсическое соединение с одним или несколькими интегринами ανβ6 на этой клетке или ткани. В дополнительных терапевтических вариантах осуществления этого изобретения α,,βί,-связывающие лиганды (например, α,,βί,-связывающие антитела) вводят пациенту вместе с одним или несколькими цитотоксическими соединениями или агентами. Цитотоксические соединения или агенты, которые могут быть подходящим образом использованы в соответствии с этими аспектами данного изобретения, включают в себя, но не ограничиваются ими, цитотоксические агенты, радиоизотопы и активирующие пролекарство ферменты, описанные выше. В соответствии с этим аспектом данного изобретения α,.β,-,-интегринсвязывающий лиганд или фармацевтическая композиция, содержащая этот лиганд и один или несколько фармацевтических носителей или эксципи
- 10 016342 ентов, могут быть введены пациенту в соответствии с описанными выше способами введения.
В дополнительных вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способы элиминации оставшихся (/.ДТ-положительных опухолевых клеток из пациента после хирургического удаления опухоли из ткани или органа пациента, предусматривающие введение этому пациенту терапевтически эффективного количества одного или нескольких лигандов, которые связываются с одной или несколькими субъединицами интегрина ανβ6 на одной или нескольких оставшихся опухолевых клеток в ткани или органе, причем связывание этого лиганда с указанным интегрином приводит к смерти, чувствительности к химиотерапии или пониженной инвазивности раковой клетки. Такие способы являются подходящими для элиминации различных метастатических опухолевых клеток в различных тканях пациента, таких как ткани, возникающие из карцином, в том числе, но не только, карцином, включающих в себя эпителиальные ткани, которые отмечались выше.
Подходящие варианты в соответствии с этим аспектом данного изобретения используют ανβ6интегринсвязывающие лиганды, которые являются (/.ДД-связывающими антителами или их (/.ДТ-эпитопсвязывающими фрагментами, в частности моноклональными антителами или их вариантами или фрагментами, описанными выше. В некоторых подобных терапевтических вариантах осуществления данного изобретения (/.ДТ-связывающие лиганды (например, (/.ДТ-связывающие антитела) конъюгированы или связаны с одним или несколькими цитотоксическими соединениями или агентами, которые приводят к смерти или вызывают смерть клетки или ткани после связывания конъюгата /ДТ-связывающий лигандтоксическое соединение с одним или несколькими интегринами </.νβ6 на этой клетке или ткани. Цитотоксические соединения или агенты, которые могут быть подходящим образом использованы в соответствии с этим аспектом данного изобретения, включают в себя, но не ограничиваются ими, цитотоксические агенты, радиоизотопы и активирующие пролекарство ферменты, описанные выше.
Другие предпочтительные варианты осуществления данного изобретения будут очевидными для специалиста с квалификацией в данной области в свете следующего графического материала и описания изобретения и из формулы изобретения.
Краткое описание графического материала
Фиг. 1 является ЕЬ18А-анализом связывания очищенных химерных вариантов 309 с </.νβ6. Планшеты, покрытые растворимым /νβ6, инкубировали с очищенным полученным из гибридомы мышиным антителом 309 (ш3С9), очищенным химерным антителом 309 (с1309) или очищенным химерным антителом 309, содержащим замену N на 8 в Ν-связанном сайте гликозилирования в первом СЭР легкой цепи (с113098). После промывания промывным буфером эти планшеты инкубировали с конъюгированным с пероксидазой антителом против мышиного 1д0 (для полученного из гибридомы материала) или антителом против 1д0 человека (для химерных антител) с последующим промыванием промывным буфером. Эти планшеты проявляли ТМВ-раствором, реакции останавливали серной кислотой и анализировали с использованием планшет-ридера при А450. Не было детектируемого значимого различия между этими 2 формами химерного антитела 309.
Фиг. 2 изображает результаты, показывающие экспрессию гуманизированных вариантов 309 из трансфицированных клеток 293Е с использованием анализа Еаку Тйет (Р1егсе). Супернатанты из транзиторно-трансфицированных клеток 293Е анализировали на титр антител при помощи способа Еаку Тйет в соответствии с протоколом изготовителя (Р1егсе). Экспрессию различных вариантов гуманизированного антитела 309 анализировали. Варианты 309, содержащие версию 1 легкой цепи, слабо экспрессируются, тогда как варианты, содержащие версию 2 легкой цепи, экспрессируются при более высоких уровнях. С увеличением гуманизации наблюдается склонность к более высокой экспрессии.
Фиг. 3 показывает результаты анализа ЕАС8 связывания вариантов 1ш-309 антитела с экспрессирующими интегрин </.νβ6 клетками 8\У480. определенные анализом проточной цитометрии. Клетки 8ХУ480 собирали трипсинизацией, промывали и ресуспендировали в ЕАС8-буфере. Затем 2х105 клеток инкубировали на льду в течение 1 ч в ЕАС8-буфере, содержащем указанный супернатант трансфектанта, титры которого определяли при помощи способа Еаку Тйет в соответствии с протоколом изготовителя (Р1егсе). После инкубирования клетки промывали ЕАС8-буфером и ресуспендировали в ЕАС8-буфере, содержащем конъюгированное с фикоэритрином антитело против 1д0 человека (1аск§оп 1ттипоВекеагсй) и инкубировали на льду в течение 30 мин. Затем клетки промывали и ресуспендировали в 200 мкл ЕАС8-буфера. Связывание меченого вторичного антитела наблюдали при помощи проточной цитометрии. Все испытанные гуманизированные версии связывались с клетками 8^480, по меньшей мере, так же хорошо, как химерное антитело 309. Варианты, содержащие версию 2 легкой цепи, значительно превосходят активность химерного антитела 309. В качестве отрицательного контроля служило антитело против β-рецептора лимфотоксина Ни-ВНА10.
Фиг. 4 изображает анализ ЕАС8 связывания версий 2-5 антитела 1и-309 с клетками Ε^СР1-β6. Анализ ЕАС8 проводили, как описано для фиг. 3, за исключением того, что использовали клетки ΕΌΟΡ1-β6 вместо клеток 8ХУ480. Версия 5 полностью гуманизированного варианта (Н3/Б5) связывалась с клетками ΕΌΟΡ1-β6 лучше, чем все другие версии гуманизации.
Фиг. 5 изображает анализ ЕАС8 связывания очищенных версий 2-5 антитела 1ш-309 с клетками
- 11 016342
ΕΌΟΡ1-β6. Анализ ЕАС8 проводили, как описано для фиг. 4, с использованием очищенных вариантов гуманизации 309. Версия 5 (Н3/Ь5) полностью гуманизированного варианта связывалась с ΕΌί.'Ρ1-β6 значимо лучше, чем другие версии гуманизации.
Фиг. 6 является ЕЫ8А-анализом связывания очищенных версий 2-5 антитела йи-309 с ανβ6. Связывание ЕЬ18А проводили, как описано для фиг. 1. По-видимому, гуманизированная версия 5 (Н3/Ь5) 309 связывается с ανβ6 слегка лучше, чем другие производные этого антитела.
Фиг. 7 является блокирующим ЕЫ8А-анализом связывания очищенных версий 2-5 антитела йи-309 с ανβ6. Планшеты покрывали 0,3 мкг/мл ЬЛР или 2,5 мкг/мл слитого белка ЬЛР-Ес и инкубировали при 4°С в течение ночи. Раствор для нанесения покрытия удаляли и эти планшеты блокировали, промывали и инкубировали со смесью биотинилированного ανβ6 и производными 309, как указано в подписи к этой фигуре, в присутствии кальция и магния. Планшет опять промывали и инкубировали с конъюгатом экстравидин-пероксидаза хрена (81дша). Связанный белок детектировали с использованием субстрата ТВМ с последующим детектированием в планшет-ридере при А450. Гуманизированная версия 5 309 (Н3/Ь5), повидимому, блокирует связывание ανβ6 с ЬЛР слегка лучше, чем другие производные этого антитела.
Фиг. 8 изображает результаты из анализа клеточной адгезии очищенных версий 2-5 йи-309. Микротитрационные планшеты покрывали 50 мкл на лунку 0,5 мкг/мл ЬЛР при 4°С в течение ночи. Затем эти планшеты промывали и блокировали. Клетки ΕΌΟΡ1-β6 (5х106 клеток/мл) отделяли из культуральных колб, метили флуоресцентным красителем (Са1сеш-ЛМ, Мо1еси1аг РтоЬек, Еидепе, ОК) и ресуспендировали в буфере для анализа. Эти планшеты инкубировали с указанными выше очищенными антителами и мечеными клетками ЕОСР1-(36 в присутствии кальция и магния. Планшеты промывали и регистрировали флуоресценцию, вызванную захваченными на планшете клетками. Процентное связывание определяли сравнением флуоресценции всех клеток с флуоресценцией связанных клеток. Версия 5 (Н3/Ь5) гуманизированного антитела 309, по-видимому, блокирует связывание </.,,(36-экспрессирующих клеток с ЬЛР слегка лучше, чем другие производные этого антитела.
Фиг. 9 является схематическим представлением карты плазмиды рК18195 и последовательности легкой цепи версии 5 309. Эта плазмида содержит гены легкой цепи версии 5 (ЬУ5) 309 и устойчивости к неомицину. Эта экспрессионная кассета легкой цепи содержит немедленно ранний промотор СМУ человека и первый интрон (содержащий небольшую делецию), а также последовательность полиаденилирования гормона роста человека.
Фиг. 10 является схематическим представлением карты плазмиды рК18189 и последовательности тяжелой цепи версии 3309. Эта плазмида содержит гены тяжелой цепи версии 3 (НУ3) 309 и дигидрофолатредуктазы (бМг). Эта экспрессионная кассета тяжелой цепи содержит немедленно ранний промотор СМУ человека и первый интрон (содержащий небольшую делецию), а также последовательность полиаденилирования гормона роста человека. Экспрессионная кассета бМг содержит ранний промотор 8У40 и последовательность полиаденилирования 8У40.
Фиг. 11 является схематическим представлением карты плазмиды рК18196 и последовательности тяжелой цепи версии 3 дегликозилированного антитела, агликозил-309. Эта плазмида содержит гены тяжелой цепи версии 3 (НУ3) агликозил-309 (а-НУ3) и дигидрофолатредуктазы (бМг). Эта конструкция идентична рК18189, за исключением замены N3190. которая уничтожает Ν-связанный сайт гликозилирования в константной области тяжелой цепи.
Фиг. 12 изображает результаты сборки и экспрессии экспрессирующих векторов СНО йи-309, транзиторно трансфицированных в клетки СНО, с использованием анализа Еаку Тйет (Р1егсе). Анализ Еаку Тйет проводили, как описано для фиг. 2, в соответствии с протоколом изготовителя (Р1егсе). Векторы версии 5 дикого типа (Н3/Ь5) и дегликозилированного (а-Н3/Ь5) гуманизированного антитела 309 транзиторно трансфицировали в клетки СНО для демонстрации эффективной сборки и секреции гуманизированного антитела 309 из этих клеток. Обе формы антител 1ш-309 равным образом собирались и экспрессировались в клетках СНО.
Фиг. 13 является комбинацией микрофотографий, изображающих уровни экспрессии ανβ6 (темные зоны) в некоторых карциномах человека, которые метастазировали в лимфатический узел (фиг. 13А13Ό) или легкое (фиг. 13Е-13Е) из указанных местоположений первичных опухолей.
Фиг. 14 является комбинацией микрофотографий, изображающих уровни экспрессии ανβ6 (темные зоны) в некоторых карциномах человека, которые метастазировали из указанных сайтов первичных опухолей в указанные местоположения метастатических опухолей.
Фиг. 15 является комбинацией микрофотографий, изображающих уровни экспрессии ανβ6 (темные зоны), наблюдаемые в первичных опухолях карциномы эндометрия (фиг. 15А, 15С) и в соответствующих метастазах лимфатических узлов (фиг. 15В, 15Ό).
Фиг. 16 является комбинацией микрофотографий, изображающих уровни экспрессии ανβ6 (темные зоны), наблюдаемые в пробах опухоли молочной железы человека. Фиг. 16А: экспрессия в пробе первичной опухоли от пациента с внутрипротоковой преинвазивной карциномой ίη δίΐιι (ЭС18); фиг. 16В: экспрессия в пробе первичной опухоли от пациента с инвазивной карциномой молочной железы.
Фиг. 17 является комбинацией микрофотографий, изображающих уровни экспрессии ανβ6 (темные
- 12 016342 зоны), наблюдаемые в соответствующих пробах первичных и метастатических опухолей аденокарциномы протоков поджелудочной железы от трех разных пациентов. Фиг. 17А-17С: экспрессия в пробах первичных опухолей от трех разных пациентов; фиг. 17Ό-17Ρ: экспрессия в соответствующих метастазах лимфатических узлов тех же самых трех пациентов; фиг. 170-17Н: экспрессия в нормальной ткани поджелудочной железы двух из этих трех пациентов.
Фиг. 18 является комбинацией микрофотографий, изображающих уровни экспрессии ανβ6 (темные зоны) , наблюдаемые в соответствующих пробах первичных и метастатических опухолей внутрипротоковой аденокарциномы поджелудочной железы от пяти разных пациентов. Фиг. 18А-18Е: экспрессия в пробах первичных опухолей от пяти разных пациентов, трех с опухолями, характеризуемыми как аденосквамозные опухоли (фиг. 18А-18С), и двух с опухолями, характеризуемыми как слабо дифференцированные опухоли (фиг. 18Ό-18Ε); фиг. 18Е-181: экспрессия в соответствующих метастазах лимфатических узлов тех же самых пяти пациентов; фиг. 18К-18Б: экспрессия в нормальной панкреатической ткани, полученной от двух из этих пяти пациентов.
Фиг. 19 демонстрирует способность моноклонального анти-α,,[У-антитела (309) ингибировать рост опухоли в модели мыши ВхРС-3 с ксенотрансплантатом рака поджелудочной железы человека. Фиг. 19 А: микрофотография среза опухоли ксенотрансплантата, окрашенного с использованием иммуногистохимии с моноклональным анти-а,в6-антителом (309); фиг. 19В: кривые роста опухоли ксенотрансплантата ВхРС-3 во время обработки α,β,,-тАЬ 369 > растворимым слитым белком Т6ГЬШ1-Ес-1д (т) или носителем ЗФР ; фиг. 19С: диаграмма рассеивания (разброса) размеров отдельных опухолей в конце этого исследования (день 66).
Фиг. 20 является серией диаграмм в виде столбцов, демонстрирующих действия моноклонального анти-а,в6-антитела (309) и растворимого конъюгата ΤΘΕ-β-рецептор-фрагмент антитела (кТСЕ-рВП-Ее) на миграцию через матрикс, инвазию и продуцирование матриксной металлопротеиназы 9 (ММР9) клетками УВ6, экспрессирующими β6 (трансфицированными β6) и ложнотрансфицированными клетками. Фиг. 20А и 20В: миграция (фиг. 20 А) или инвазия (фиг. 20В) клеток через внеклеточный матрикс. Ии!: необработанные клетки; 309: клетки, обработанные 10 мкг/мл моноклонального анти-а,в6-антитела 309; кТОГЬВ-Ее: клетки, обработанные 10 мкг/мл растворимого конъюгата кТОЕ-рКИ-Ее. Незакрашенные столбцы: клетки, трансфицированные интегрином β6 и экспрессирующие интегрин β6 (УВ6клетки); закрашенные столбцы: ложнотрансфицированные клетки, не экспрессирующие интегрин β6 (С1клетки); фиг. 20С: продуцирование ММР9 (нг/мл) клетками С1 или УВ6, которые были необработанными (незакрашенные столбцы), были обработаны 10 мкг/мл 309 (заштрихованные столбцы) или были обработаны 10 мкг/мл конъюгата 8Т0Е-рК11-Ес (закрашенные столбцы).
Фиг. 21 является микрофотографией иммуногистохимического среза, демонстрирующей экспрессию ανβ6 (темные зоны) на опухолевых клетках, проникающих в строму в модели ксенотрансплантата ЫМ1863. Окрашивание антителами против кератина человека на последующих срезах (не показано) подтвердило, что эти клетки были эпителиальными (т.е. Б1М1863), происходящими из опухоли.
Фиг. 22А-22Е изображают действия а.ДА-тАЬ 309 и рекомбинантного растворимого слитого белка Т0ЕЬК-Ес-1д на рост опухоли и инфазию в строму в модели опухоли ксенотрансплантата ЫМ1863. Фиг. 22А: кривые роста опухоли ксенотрансплантата ЫМ1863 во время обработки α, β6-ιηΑό 369 > растворимым слитым белком Т6ГЬЯП-Ес-1д или носителем ЗФР ·; фиг. 22В: диаграмма рассеивания (разброса) размеров отдельных опухолей в конце этого исследования (день 52); фиг. 22С: количество ανβ6 положительных зон в срезах опухоли; фиг. 22Ό-22Ρ: микрофотографии, изображающие репрезентативное окрашивание ανβ6 в опухолях, собранных из каждой указанной группы обработки.
Фиг. 23 А-23Э являются гистограммами из анализа с использованием клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (ЕАС8) различных клеточных линий, обработанных мышиным 309-тАЬ или контрольным тАЬ, демонстрирующими уровень связывания т309 с ΝΗΡ а.ДА-экспрессирующих клеточных линий (А, Уето; В, ЕЬС-МК2; С, 12МВг6; Ό, 4МВг5).
Фиг. 24А-24В являются кривыми титрования, демонстрирующими уровень связывания мышиного 309 с ΝΗΡ а^-экспрессирующих клеточных линий (А, 12МВг6; В, 4МВг5).
Фиг. 25 является диаграммой в виде столбцов, демонстрирующей адгезию ΝΗΡ ανβ6экспрессирующих клеточных линий с БАР (А, 12МВг6; В, 4МВг5).
Фиг. 26А-26В являются кривыми титрования, демонстрирующими уровень ингибирования мышиным 309 адгезии ΝΗΡ а^-экспрессирующих клеточных линий с БАР (А, 12МВг6; В, 4МВг5).
Фиг. 27 является диаграммой в виде столбцов, демонстрирующей активацию латентного Τ0Ε-β а¥6-экспрессирующими клеточными линиями человека и примата.
Фиг. 28 является кривой титрования, демонстрирующей ингибирование активации Τ0Ε-β мышиным 309 на клеточных линиях 8\ν480β6 и 4МВг5.
Фиг. 29 является серией микрофотографий, демонстрирующих а^-иммуноокрашивание в заболевании почки человека. (А) Замороженные срезы почки человека, иммуноокрашенные а^-тАЬ (красный цвет) и тАЬ пан-цитокератина (зеленый цвет). (В) Залитые в парафин срезы почки человека, иммуноо
- 13 016342 крашенные с использованием α,,β6-ιηΛό.
Фиг. 30 демонстрирует (/.ДЦ-иммуноокрашивание в почках Со14А3 +/- и Со14А3 -/- мыши. Фиг. 30А: микрофотография замороженных срезов почки 7-недельных Со14А3 +/- мышей и Со14А3 -/- мышей, иммуноокрашенных аУв6-шАЬ (красный цвет) и шАЬ пан-цитокератина (зеленый цвет); фиг. 30В: залитые в парафин срезы почки 4- и 8-недельных Со14А3 +/- и Со14А3 -/- мышей, иммуноокрашенные ανβ6тАЬ; фиг. 30С: диаграмма в виде столбцов, демонстрирующая количество аДЦ-иммуноокрашивания в почках из 4-, 7- и 8-недельных Со14А3 +/- и Со14А3 -/- мышей (п=3).
Фиг. 31 демонстрирует специфичность связывания аДЦ-тЛЬ. Фиг. 31 А: проточный цитометрический анализ связывания (/.ДУтЛЬ (369, 866, 8В3), анти-(/.,,-тЛЬ (КМУ-7), тАЬ отрицательного контроля (1Е6 и МОРС21) и контроля на изотип (1д61 крысы) с клетками ΝΙΗ3Τ3 и клетками Ы1Н3Т3Ь6; фиг. 31В: иммуноокрашивание Со14А3 -/- и Со14А3 -/-; β6 -/- срезов почек с использованием анти-а^-тАЬ (химерного антитела 369 человек-мышь); фиг. 31С: иммуноокрашивание Со14А3 +/- и Со14А3 -/-; β6 -/срезов почек с использованием поликлонального анти-α,,-антитела.
Фиг. 32 демонстрирует 8МА-окрашивание в Со14А3 -/- почках с различными обработками. Фиг. 32А: иммуноокрашивание 8МА (красный цвет) и ламинином (зеленый цвет) в почках показано для Со14А3 -/- мышей, обработанных с 3-недельного до 8,5-недельного возраста, и для необработанных мышей Со14А3 +/- соответствующего возраста. Показано иммуноокрашивание (коркового вещества и мозгового вещества почки) репрезентативного среза для каждой группы обработки (п=8 на группу); фиг. 32В и 32С: количественное определение 8МА в почках необработанных Со14А3 +/- мышей и Со14А3 -/- мышей, обрабатыаемых разными агентами в возрасте от 3- до 7-недельного или от 3- до 8,5-недельного возраста. Показано процентное положительное иммуноокрашивание для коркового вещества (32В) и мозгового вещества почки (32С) относительно общего размера изображения. Ν-величина для каждой группы обработки обозначена в диаграмме рассеивания (*=р<0,001, **=р<0,05, ***=р<0,001 при сравнении групп обработки с обработанными тАЬ отрицательного контроля, 1Е6, мышами).
Фиг. 33А и 33В являются графиками разброса, представляющими анализ Такмана уровней мРНК коллагена 1α1 (фиг. 33А) и коллагена 1α2 (фиг. 33В). РНК выделяли из почек 7-недельных необработанных или обработанных Со14А3 -/- мышей и 7-недельных необработанных Со14А3 +/+ мышей.
Фиг. 34 является парой графиков разброса, демонстрирующих 8МА-иммуноокрашивание Со14А3 -/- почек с задержанной обработкой тАЬ. Необработанные 8,5-недельные Со14А3 +/-; необработанные 6недельные Со14А3 -/-; необработанные 8,5-недельные Со14А3 -/- и 8,5-недельные мыши, обработанные Со14А3 -/-, обработанные 1Е6 и 369, 6-8,5 недель. Ν-величины, обозначенные в графике разброса (*=р<0,0005, сравнение обработки с отрицательным контролем, 1Е6-обработанными Со14А3 -/- мышами, **=р<0,02, сравнение обработки с необработанными 6-недельными Со14А3 -/- мышами).
Фиг. 35 изображает картины распределения экспрессии и модуляции генов в почках 7-недельных Со14А3 -/- мышей. Показаны 395 наборов зондов чипа генов (6епеСЫр), отобранных на 2-кратное или большее изменение между группами дикого типа (^Т) и необработанными Альпорт-(иу)-группами при р<0,01. Столбцы карты (йеа! тар) изображают картины распределения относительных уровней экспрессии для отдельных экспериментальных групп. Каждый столбец представляет 395 нормализованных средних величин интенсивности сигнала набора зондов для единственной экспериментальной группы из 5 мышей. Изменения в экспрессии генов по всем экспериментальным условиям отражены изменением окраски, как показано на окрашенном столбце. Двухмерное иерархическое разбиение на кластеры выполняли для исследования родства (показанного дендрограммой) среди этих экспериментальных групп.
Фиг. 36Λ-36Ω являются диаграммами в виде столбцов, демонстрирующими функциональную аннотацию (/^-зависимых генов, ассоциированных с почечным заболеванием в Со14А3 -/- почках. 1пдепийу Ра1й\тау5 Апа1у515 (1РА) выполняли отдельно на перечне наборов зондов, соответствующих генам, сверхэкспрессируемым или недостаточно экспрессируемым в почках Альпорта в сравнении с диким типом. Перечнями, используемыми для 1РА, были наборы субпопуляций из 395 наборов зондов, первоначально отобранных на значимое (>2-кратного, р<0,01) изменение между группами мышей с синдромом Альпорта и группами мышей дикого типа. Показаны ранжированные перечни биологических функций (А, С) и канонические пути (В, Ό), ассоциированные с генами, сверхэкспрессированными (А, С) и отрицательно модулированными (С, Ό) в почках 7-недельных мышей с синдромом Альпорта.
Фиг. 37А-37С являются схематичными представлениями анализа. Субпопуляции и сети генов, дифференциально экспрессируемых в Со14А3 -/- почках и модулируемых обработкой блокирующими ανβ6 тАЬ. Фиг. 37А: диаграмма Венна перечня наборов зондов. Площади кругов Венна, их объединения и пересечения являются пропорциональными количествам наборов зондов в соответствующих перечнях; фиг. 37В, 37С: регуляторные сети наивысшей оценки, выведенные из перечней наборов зондов, на которые значимо (более чем 2-кратное изменение между обработанными и необработанными почками Альпорта, р<0,05) влияют α,,[/-блокирующие тАЬ 369 (фиг. 37В) и 866 (фиг. 37С). Острия этих сетей показывают направления взаимодействий среди генов, изображенных в виде узлов и расположенных в соответствии с их клеточной локализацией.
Фиг. 38 изображает иммуногистохимический анализ и анализ Такмана экспрессии Τ6Ε-β1. Фиг.
- 14 016342
38А: срезы почек из Со14А3 +/- и Со14А3 -/- мышей, обработанных указанными агентами, иммуноокрашенные на экспрессию ТСГ-β 1. Окрашивание показано для репрезентативного среза из каждой группы обработки; фиг. 38В: анализ Такмана уровней мРНК Τ0Ρ-β1 в группах обработки.
Фиг. 39 изображает окрашивание трехцветным красителем (трихромом) на экспрессию коллагена в почках. Окрашивание для 10-недельных Со14А3 +/+; β6 +/+; Со14А3 -/-; β6 +/+ и Со14А3 -/-; β6 -/- мышей. Репрезентативные срезы тканей показаны для областей коркового вещества почки (фиг. 39 А) и мозгового вещества почки (фиг. 39В).
Фиг. 40А и 40В являются графиками разброса, изображающими 8МА-окрашивание с титрованием доз обработки 309. Количественный анализ иммуноокрашивания 8МА показан для гломерулярной (корковое вещество почки) (фиг. 40А) и интерстициальной (мозговое вещество) (фиг. 40В) областей почек после обработки указанными дозами ши3О9 или 10 мг/кг ти1Е6 (1д0-контроль), 3 раза в неделю, с 3-7недельного возраста. ΕΌ50 коркового вещества почки = 0,4 мг/кг; ΕΌ50 для мозгового вещества почки = 0,3 мг/кг. Горизонтальные линии представляют средние величины.
Фиг. 41 является серией микрофотографий, демонстрирующих иммуногистохимический анализ экспрессии ανβ6 в здоровой почке и почке после ИИО. Фиг. 41 А: здоровая неповрежденная почка; фиг. 41В: 7 дней после ИИО; фиг. 41С: 10 дней после ИИО; фиг. 41Ό: 14 дней после ИИО.
Фиг. 42 является серией микрофотографий, демонстрирующих, что положительная регуляция ανβ6 происходит при 18 неделях после облучения. Мышей С57ВЬ/6, облученных 14 Гр (джоули/кг массы тела), умерщвляли в указанных временных точках, и срезы легких окрашивали анти-в6-антителом.
Фиг. 43 является парой микрофотографий, демонстрирующих, что в зонах фиброза стойко сохраняется положительно регулируемая экспрессия ανβ6. Срезы легких окрашивали на экспрессию β6, как на фиг. 1. Срезы были из мышей, умерщвленных при 24 неделях (слева) или при 27 неделях (справа) после облучения 14 Гй. Оба среза обнаруживают фиброзные повреждения с многочисленными эпителиальными клетками, экспрессирующими высокие уровни ανβ6. В соседнем нефиброзном эпителии экспрессия ανβ6 остается высокой при 24 неделях, но является гораздо менее очевидной при 27 неделях.
Фиг. 44 является серией микрофотографий, демонстрирующих, что ИдЬ6-/- мыши защищены от индуцированного облучением фиброза легких. Мышей ИдЬ6+/+ и ИдЬ6-/- (фенотип С57ВЬ/6) подвергали торакальному облучению 14 Гр. После 27 недель мышей умерщвляли и левые легкие окрашивали трехцветным красителем (Трихромом) Массона. Показаны репрезентативные легкие: в общем и целом, 21 из 23 ИдЬ6+/+ мышей имела явный фиброз, тогда как ни одна из 17 ИдЬ6-/- мышей не имела фиброза.
Фиг. 45 является диаграммой в виде столбцов, демонстрирующей, что ИдЬ6-/- мыши защищены от индуцированного облучением фиброза легких, как измерено по гидроксипролину. Содержание коллагена ИдЬ6+/+ мышей является значимо более высоким, чем содержание коллагена необлученных ИдЬ6+/+ легких и облученных ИдЬ6-/- легких (р<0,03 против ИдЬ6+/+, N=5-6 для каждой группы).
Фиг. 46 является линейным графиком, демонстрирующим, что отсутствие интегрина ανβ6 не влияет на выживание после облучения легких. Группы ИдЬ6+/+ и ИдЬ6-/- мышей облучали 14 Гр. Кривые выживания для этих двух групп не отличаются значимо (^Т=ИдЬ6+/+, КО = ИдЬ6-/-).
Фиг. 47 является графиком разброса, изображающим измерения фиброза легких в мышах, получающих 309, растворимый Τ0Ε-βΚ или контрольное антитело (АЬ) ΙΡ, умерщвленных при 26 неделях после облучения. Фиброз легких предотвращается в мышах, получающих 1 мг/кг 309. Каждая точка представляет отдельную мышь, горизонтальные стержни представляют средние величины. Не было различий в фиброзе между группой 0,3 мг/кг и контрольной группой. Группа 1 мг/кг имела значимо меньший фиброз, чем контроли. Группы 10 мг/кг и группы с растворимым рецептором Τ0Ε-β имели меньший фиброз, но различия в сравнении с контролем не достигали значимости.
Фиг. 48 является графиком разброса, изображающим измерения фиброза легких у всех мышей (умерщвленных мышей, умирающих мышей и мышей, найденных мертвыми, от 20 до 26 недель после облучения), получающих 309, растворимый ΤΟΡ-βΡ или контрольное антитело (АЬ) ΙΡ. Данные представлены, как на фиг. 47. Не было различия в фиброзе между группой 0,3 мг/кг и контрольной группой. Группы 1 мг/кг, 10 мг/кг и растворимого рецептора ΤΟΡ-β имели значимо меньший фиброз, чем контроли.
Фиг. 49 является диаграммой в виде столбцов, изображающей определения лейкоцитарных формул по Шиллингу клеток БАЛ мышей, получающих 309, растворимый ΤΟΕ-βΚ или контрольное антитело (АЬ) ΙΡ, умерщвленных при 26 неделях после облучения.
Фиг. 50 является линейным графиком, демонстрирующим, что облученные 14 Гр мыши, получающие ΙΡ инъекции антитела 309, имели выживание, сходное с контролями. Анализ выживания выполняли на всех группах в виде комбинированного анализа (р=0,088, С=контроль, 0,3=0,3 мг/кг, 8о1К=растворимый рецептор Τ0Ρ-β, 10=10 мг/кг).
Фиг. 51 является диаграммой в виде столбцов, изображающей измерения фиброза легких в мышах, обработанных 309 (1, 3, 6 или 10 мг/кг) один раз в неделю 8С. Показаны отдельные результаты для всех мышей (мышей, обнаруженных мертвыми/умирающими и умерщвленных мышей), мышей, умерщвленных при 28 или 32 неделях, и мышей, обнаруженных мертвыми/умирающими. Значимо увеличенный
- 15 016342 фиброз присутствовал в контролях в сравнении со всеми группами с антителом (р<0,05 для всех доз в сравнении с контролями).
Фиг. 52 является диаграммой в виде столбцов, изображающей определения лейкоцитарных формул по Шиллингу клеток БАЛ мышей, получающих 309 или контрольное антитело (АЬ) 8С, умерщвленных при 28 или 32 неделях после облучения. Дозы 3093, 6 и 10 мг/кг приводят к значимо увеличенным процентам как нейтрофилов, так и лимфоцитов (р<0,05 для всех сравнений).
Фиг. 53 является серией микрофотографий, изображающих вид клеток БАЛ в контроле против обработанных 309 мышей. В контрольном цитоспине видны нормальные альвеолярные макрофаги. Клетки БАЛ из мышей, обработанных 1 мг/кг 309, похожи на контрольные клетки. При дозе 3 мг/кг становятся видны пенистые макрофаги (подобные макрофаги видны в ЙдЬ6-/- мышах). При более высоких дозах (6 мг/кг и показанных здесь 10 мг/кг) видны увеличенные количества нейтрофилов (острие стрелки) и лимфоцитов, а также некоторые остатки клеток.
Фиг. 54 является линейным графиком, изображающим кривые выживания Каплана-Мейера для когорты мышей, умерщвленных при 28 неделях после облучения.
Фиг. 55 является линейным графиком, изображающим кривые выживания Каплана-Мейера для когорты мышей, умерщвленных при 32 неделях после облучения.
Фиг. 56 является диаграммой в виде столбцов, демонстрирующей, что массовое отношение ЯУ/ЬУ увеличивается в мышах, которые умирали в диапазоне 29-32 недель после облучения, в сравнении с мышами, которые выживали до 32 недель после облучения. Сердца мышей фиксировали в формалине. Правый желудочек (ЯУ) отсекали от левого желудочка плюс межжелудочковая перегородка (ЬУ) и эти ткани взвешивали. Семь необлученных мышей той же самой расы использовали в качестве контролей. Столбцы представляют средние величины +/- 8Ό (стандартное отклонение). Данные для облученных мышей показаны для всех обработанных мышей (обработанных контрольным антителом 1Е6 или любой дозой 309), мышей, обработанных контрольным антителом 1Е6, и мышей, обработанных любой дозой 309. Количества мышей были следующими: необлученные мыши, N=7; 1Е6-обработанные мыши: выжили N=10, умерли N=5; 309-обработанные мыши: выжили N=8, умерли N=9. Отношение ЯУ/ЬУ не отличалось значимо от необлученных контролей в мышах, которые выживали. В противоположность этому, отношение ЯУ/ЬУ значимо увеличивалось у мышей, которые умирали (всех мышей и мышей субпопуляций 1Е6 и 309), по сравнению с необлученными мышами (Р<0,02). Отношение ЯУ/ЬУ было также значимо повышено у мышей (всех мышей и мышей субпопуляций 1Е6 и 309) в сравнении с эквивалентными группами мышей, которые выживали (Р<0,0007).
Фиг. 57 является парой микрофотографий, изображающих легкие из мышей, которые умирали, которые были обработаны контрольным антителом (1Е6), слева, или анти-аУв6-антителом (309, 1 мг/кг/неделя), справа. Обратите внимание на периферические зоны с отсутствием эритроцитов в альвеолярных стенках. Этот вид согласуется с потерей перфузии.
Фиг. 58 является серией микрофотографий, изображающих экспрессию ανβ6 в заболевании легкого человека, демонстрирующих, что экспрессия ανβ6 в сильной степени положительно регулируется в заболевании легкого человека. Срезы тканей в парафине легкого человека и мыши иммуноокрашивали ανβ6специфическим антителом для визуализации относительных уровней экспрессии в нормальном (фиг. 58А) и пораженном болезнью легком: идиопатический фиброз легкого (фиг. 58В), диффузное интерстициальное заболевание легкого (фиг. 58С) и диффузное интерстициальное заболевание легкого (фиг. 58Ό). Окрашивание является характеристикой уровня положительной регуляции, наблюдаемой в сорока одной пробе разных пациентов, представленных ниже в табл. 16-1 (пример 16).
Фиг. 59 является серией микрофотографий, изображающих экспрессию ανβ6 в модели индуцированного блеомицином фиброза легкого, демонстрирующих, что экспрессия ανβ6 в сильной степени положительно регулируется в мышиной модели индуцированного блеомицином фиброза легкого. Срезы тканей в парафине легкого мыши иммуноокрашивали а^6-специфическим антителом для визуализации относительных уровней экспрессии в легком, в которое инстиллировали блеомицин.
Фиг. 60 является серией диаграмм в виде столбцов, изображающих действие обработки ши309 на содержание гидроксипролина легкого в обработанных блеомицином мышах 8У129. Каждая из мышей получала 4 мг/кг ши309 (блокирующего а.Щ-тАЬ). 1Е6 (контрольный 1д01) в первых трех экспериментах, показанных для разных перечисленных периодов обработки. В четвертом варианте каждая из мышей получала ЗФР, 4 мг/кг ти309 (блокирующего а^6-тАЬ), 4В4 (неблокирующего а^6-тАЬ) или 806 (второго блокирующего а^6-тАЬ) три раза в неделю в течение дней 15-60 после обработки блеомицином. Стержни ошибок представляют собой стандартные ошибки. Средние величины для групп и стандартные отклонения приведены в приложении А примера 16.
Фиг. 61 является серией диаграмм в виде столбцов, изображающих действие обработки ти309 на содержание коллагена (гистоморфометрию) в обработанных блеомицином мышах С57В16. Мыши получали 3 дозы в неделю ти309 (блокирующего а^6-тАЬ), 806 (второго блокирующего а^6-тАЬ), 8В3 (неблокирующего а^6-тАЬ), 1Е6 (контрольного 1д01-тАЬ) или §Т0РЬЯ (растворимого Τ0Ρ-βрецептора-положительного контроля на ингибирование Τ0Ρ-β). В первых трех показанных эксперимен
- 16 016342 тах (фиг. 61А, 61 В и 61С) мышей обрабатывали, начиная со дня 1 перед введением блеомицина, и эвтанизировали в день 14. В первых двух экспериментах (фиг. 61А и 61В) дозы каждого агента были 4 мг/кг, тогда как в третьем эксперименте (фиг. 61 С) дозу ти369 варьировали, как указано. В конечном эксперименте (фиг. 61Ό) мышей обрабатывали, начиная с 14 дней перед введением блеомицина, и эвтанизировали в день 28. Гистологические срезы окрашивали красителем Трихром (дающим трехцветную окраску), визуализировали и площадь окрашенной в синий цвет (содержащей коллаген) ткани рассчитывали в виде процента общей площади ткани с использованием программы Ме1ашогр11. Стержни ошибок представляют собой стандартные ошибки. Средние величины для групп и стандартные отклонения приведены в приложении В примера 16 (* = значимо отличающиеся от ЗФР-обработанной группы согласно ΑΝΟνΑ).
Фиг. 62 является серией диаграмм в виде столбцов, изображающих ти369 в индуцированном блеомицином фиброзе легкого с использованием мышей с коллагеном в качестве репортера. Блеомицин инсталлировали интратрахеально в мышей с люциферазой-коллагеном в качестве репортера. Мышей обрабатывали, начиная со дня перед индукцией патологического изменения блеомицином, один раз в неделю в течение двух недель с использованием ЗФР, 5 мг/кг растворимого Τ6ΡβΕΙΙ-Ι§ или ти369 в дозах 0,1, 0,3, 1,0, 3 и 10 мг/кг. Включали также дополнительную группу мышей, получавших 3 раза в неделю 4 мг/кг 1Ш13С9 (3Х 4 мг/кг). Ложнообработанным мышам инсталлировали интратрахеально солевой раствор и обрабатывали их ЗФР. Содержание люциферазы легкого анализировали в день 14. Стержни ошибок представляют собой стандартные ошибки. Средние величины для групп и стандартные отклонения приведены в приложении С примера 16 (* = значимо отличающиеся от ЗФР-обработанной группы согласно ΑΝΟνΑ).
Фиг. 63 является серией линейных графиков, изображающих временной ход для оценки действия низких эффективных доз ти369 на основные популяции клеток БАЛ в индуцированных блеомицином мышах. Мышам вводили блеомицин в легкие в день 0. Мышей обрабатывали ЗФР, ти369 в дозах 0,3, 1,0 и 3,0 мг/кг или контрольным 1д61 (1Е6) в дозе 1,0 мг/кг в дни -1 и +6. Мышей умерщвляли в дни 2, 5, 8 и 11 и легкие собирали и оценивали на общее количество клеток БАЛ. Популяции макрофагов, нейтрофилов и лимфоцитов анализировали дифференциальным окрашиванием цитоспинов. Средние величины для групп и стандартные отклонения приведены в приложении С примера 16.
Фиг. 64 является серией диаграмм в виде столбцов, изображающих действие высоких доз ти369 на основные популяции клеток БАЛ в день 5 в получавших блеомицин мышах. Мышам вводили блеомицин инстилляцией в легкие в день 0. Мышей обрабатывали ЗФР, ти369 в дозах 4, 20 и 40 мг/кг или контрольным 1д61-шЛЬ (1Е6) в дозах 20 и 40 мг/кг в дни -1, +1 и +3. Мышей умерщвляли в день 5 и легкие собирали и оценивали на общее количество клеток БАЛ. Популяции макрофагов, нейтрофилов и лимфоцитов анализировали дифференциальным окрашиванием цитоспинов. Средние величины для групп и стандартные отклонения приведены в приложении Ό примера 16 (*=р<0,05 относительно получавших блеомицин контролей, обработанных ЗФР, но не относительно контролей, обработанных 1д61-тЛЬ 1Е6).
Фиг. 65 изображает отсутствие эффективности ти369 в модели с множественными дозами блеомицина в хомячках. Хомячкам вводили блеомицин (ВЬ) или солевой раствор (8Α) в легкие в дни 0, 7 и 14. Хомячков обрабатывали ЗФР, ти369 (ΑΜ) или контрольным 1§С (1Е6), начиная в день 0. Дополнительные группы обрабатывали ти369 в день 7 (ΑΒ2) или день 3 (ΑΒ3). Все антитела вводили три раза в неделю в дозе 5 мг/кг. Хомячков, которые выживали, умерщвляли в день 28 и легкие собирали и оценивали на содержание гидроксипролина (фиг. 65А) и перокисление липидов (фиг. 65В). Указанный разброс представляет собой стандартную ошибку. Выживаемость хомяков в процессе исследования множественных доз (фиг. 65С). Не наблюдали значимого различия в выживании хомячков, обработанных ти3С9. при сравнении с ЗФР- или 1д6-обработанными контрольными группами. Средние величины для групп и стандартные отклонения приведены в приложении С примера 16.
Фиг. 66 изображает профили нормализованных интенсивностей сигналов для генов, идентифицированных как гены, на которые значимо действуют экспериментальные обработки. Мышей обрабатывали 5 мг/кг §Т6ЕЬВ11-1д (§В) или ЗФР или ти369 в дозах, указанных между 0,3 и 30 мг/кг, в дни 1, 8, 15 и 22 и эвтанизировали их в день 29 (без периода восстановления) или в день 78 (7-недельный период восстановления). РНК получали из легких обработанных мышей и анализировали транскрипты.
Фиг. 67 изображает профили экспрессии для генов, показывающих тенденцию к повышению при 3 мг/кг 369 в этой группе обработки. Мышей обрабатывали 5 мг/кг §Т6ЕЬВ11-1д (§В) или ЗФР или ти369 в дозах, указанных между 0,3 и 30 мг/кг в дни 1, 8, 15 и 22, и эвтанизировали их в день 29 (без периода восстановления) или в день 78 (7-недельный период восстановления). РНК получали из легких обработанных мышей и анализировали транскрипты.
Фиг. 68 является парой графиков, изображающих ΙΡΑ-аннотацию генов, на которые значимо действует ти369.
Фиг. 69А и 69В являются картами-схемами, схематически изображающими регуляторные схемы, на которые действует ти369 в легком мыши.
Фиг. 70 является диаграммой в виде столбцов, изображающей зависимость реакции от дозы транскрипта ММР-12 на обработку ти369.
- 17 016342
Фиг. 71 является серией диаграмм рассеивания уровней белков в жидкости БАЛ в нормальных и облученных мышах.
Фиг. 72 является серией диаграмм рассеивания, изображающих белки, которые положительно регулируются индуцированным облучением фиброзом и которые отрицательно регулируются обработкой ти309 при 28 неделях.
Подробное описание изобретения
Если нет других указаний, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют значения, обычно понимаемые специалистом с обычной квалификацией в области, к которой принадлежит это изобретение. Хотя любые способы и материалы, сходные со способами и материалами, описанными здесь, или эквивалентные способам и материалам, описанным здесь, могут быть использованы в практике или испытании данного изобретения, далее описываются предпочтительные способы и материалы. Ниже описаны примерные способы и материалы, хотя способы и материалы, сходные со способами и материалами, описанными здесь, или эквивалентные способам и материалам, описанным здесь, могут быть также использованы в практике данного изобретения. Все публикации и другие ссылки, упоминаемые здесь, включены в качестве ссылки в их полном виде. В случае противоречия, контролем будет данное описание, включающее в себя определения. Материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения. Во всем описании слово содержат или вариации, такие как содержит или содержащий, будут предполагать включение указанного целого числа или группы целых чисел, но не исключение какого-либо другого целого числа или группы целых чисел.
Определения
Приблизительно (около). В данном контексте при ссылке на любую численную величину термин приблизительно означает величину ±10% указанной величины (например, приблизительно 50°С включает в себя диапазон температур от 45 до 55°С включительно; приблизительно 100 мМ включает в себя диапазон концентраций от 90 до 110 мМ включительно).
Антагонист. В данном контексте термин антагонист относится к соединению, молекуле, части молекулы или комплексу, которые уменьшают, существенно уменьшают или полностью ингибируют биологические и/или физиологические действия интегрина ανβ6 в клетке, ткани или организме. Антагонисты, которые могут быть лигандами для ανβ6, могут проводить такие действия различными путями, в том числе, но не только, конкуренцией с другим лигандом за связывание с ανβ6 на поверхности клетки; взаимодействием с ανβ6 таким образом, чтобы уменьшить, существенно уменьшить или ингибировать способность этого интегрина связывать другие лиганды; связыванием с ανβ6 и индукцией конформационного изменения ανβ6 в клеточной поверхности, так что этот интегрин принимает структуру, с которой уже не могут связываться другие лиганды (или могут связываться только с уменьшенной или существенно уменьшенной аффинностью и/или эффективностью); индукцией физиологического изменения (например, увеличения комплексов внутриклеточной передачи сигналов; увеличения ингибиторов транскрипции; уменьшения экспрессии ανβ6 в клеточной поверхности; и т.д.) в клетках, тканях или организмах, так что связывание других лигандов или физиологический сигнал, индуцированный такими лигандами после связывания с ανβ6, уменьшается, существенно уменьшается или полностью ингибируется; и другими механизмами, при помощи которых антагонисты могут проводить их активности, которые известны специалисту с обычной квалификацией в данной области. Как будет понятно квалифицированному в данной области специалисту, антагонист может иметь сходную структуру относительно другой ανβ6-связывающей части (например, ανβ6-связывающего лиганда), в отношении которой он действует антагонистически (например, этим антагонистом может быть вариант, фрагмент или производное агониста), или может иметь совершенно неродственную структуру.
Связанный. В данном контексте термин связанный относится к связыванию или присоединению, которое может быть ковалентным, например, посредством химического связывания, или нековалентным, например, посредством ионных взаимодействий, гидрофобных взаимодействий, водородных связей и т.д. Ковалентными связями могут быть, например, сложноэфирные связи, простые эфирные, сложные фосфоэфирные, сложные тиоэфирные, простые тиоэфирные, уретановые, амидные, аминные, пептидные, имидные, гидразоновые, гидразидные, углерод-серные связи, углерод-фосфорные связи и т.п. Термин связанные является более широким, чем соединенные сочетанием, конъюгированные и присоединенные.
Конъюгат/конъюгация. В данном контексте термин конъюгат относится к продукту ковалентного присоединения части молекулы, например химического соединения или радиоактивного изотопа, к лиганду, который связывается с ανβ6, например ανβ6-связывающему антителу или его фрагменту. Конъюгация обозначает образование конъюгата, определенного в предыдущем предложении. Любой способ, обычно используемый специалистами с квалификацией в области конъюгации химических соединений или радиоактивных изотопов к биологически активным веществам, таким как белки или полипептиды (в том числе антитела), может быть использован в данном изобретении.
Заболевание, нарушение, состояние. В данном контексте термин заболевание или нарушение
- 18 016342 относится к любому неблагоприятному состоянию человека или животного, включающему в себя опухоли, рак, аллергии, привыкание (к лекарствам, наркотикам и т.д.), аутоиммунную реакцию, инфекцию, отравление или ухудшение оптимальной умственной или соматической функции. Состояния в данном контексте включают в себя заболевания и нарушения, но обозначают также физиологические состояния. Например, фертильность является физиологическим состоянием, но не заболеванием или нарушением. Таким образом, композиции этого изобретения, подходящие для предотвращения беременности посредством уменьшения фертильности, могли бы быть описаны как лечение состояния (фертильности), но не лечение нарушения или заболевания. Другие состояния известны квалифицированным в данной области специалистам.
Эффективное количество. В данном контексте термин эффективное количество относится к количеству указанных соединения, конъюгата или композиции, которое является необходимым или достаточным для реализации желаемого биологического эффекта. Эффективным количеством указанных соединения, конъюгата или композиции в соответствии со способами данного изобретения было бы количество, которое дает этот выбранный результат, и такое количество может быть определено рутинным способом лицом с квалификацией в данной области с использованием анализов, которые известны в данной области и/или которые описаны здесь, без необходимости чрезмерного экспериментирования. Например, эффективным количеством для лечения или предупреждения метастазирования рака могло бы быть количество, необходимое для предотвращения миграции и инвазии опухолевой клетки через базальную мембрану или через эндотелиальный барьер ίη νίνο. Этот термин является также синонимом термина достаточное количество. Эффективное количество для любого конкретного применения может варьироваться в зависимости от таких факторов, как подлежащее лечению заболевание, нарушение или состояние, конкретная вводимая композиция, способ введения, размер субъекта и/или тяжесть заболевания или состояния. Специалист с обычной квалификацией в данной области может определить эмпирически эффективное количество конкретного соединения, конъюгата или композиции данного изобретения в соответствии с обеспеченным здесь руководством, без необходимости чрезмерного экспериментирования.
Термин один. Использование термина один в этом описании обозначает по меньшей мере один или один или несколько, если нет других указаний. Термины один или несколько и по меньшей мере один могут использоваться здесь взаимозаменяемо.
Пептид, полипептид, белок. В данном контексте термин полипептид включает в себя единственный полипептид, а также множественные полипептиды и относится к молекуле, состоящей из мономеров (аминокислот), линейно связанных амидными связями (также известными как пептидные связи). Термин полипептид относится к любой цепи или любым цепям двух или более аминокислот и не относится к какой-либо конкретной длине продукта. Таким образом, пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды, белок, цепь аминокислот или любой другой термин, используемый для ссылки на цепь или цепи двух или более аминокислот, может быть использован вместо любого из этих терминов или взаимозаменяемо с любым из этих терминов. Термин полипептид относится также к продуктам постэкспрессионных модификаций полипептида, включающих в себя гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, амидирование, дериватизацию известными защитными/блокирующими группами, протеолитическое расщепление или модификацию не встречающимися в природе аминокислотами. Полипептид может быть получен из природного биологического источника или продуцирован рекомбинантной технологией, но необязательно транслирован из указанной последовательности нуклеиновой кислоты. Он может быть генерирован любым образом, в том числе химическим синтезом. В соответствии с этим определением используемые в данном изобретении полипептиды могут иметь размер приблизительно 3 или более, 5 или более, 10 или более, 20 или более, 25 или более, 50 или более, 75 или более, 100 или более, 200 или более, 500 или более, 1000 или более или 2000 или более аминокислот. Полипептиды могут иметь определенную трехмерную структуру, хотя они необязательно имеют такую структуру. Полипептиды с определенной трехмерной структурой называют уложенными, а полипептиды, которые не имеют определенной трехмерной структуры, но могут принимать большое число различных конформаций, называют неуложенными. В данном контексте термин гликопротеин относится к белку, связанному по меньшей мере с одной углеводной группой, которая присоединена к этому белку через содержащую кислород или содержащую азот боковую цепь аминокислотного остатка, например остатка серина или остатка аспарагина. Предпочтительные полипептиды, используемые в соответствии с этим изобретением, включают в себя полипептиды, которые являются лигандами или которые связываются с интегрином ανβ6 на поверхности клетки, в том числе, но не только, антителами (в частности, моноклональными антителами), которые узнают один или несколько эпитопов на ανβ6 и связываются с одним или несколькими эпитопами на ανβ6.
Под выделенным полипептидом или его фрагментом, вариантом или производным имеют в виду полипептид, который не находится в его природном окружении. Не требуется какой-либо конкретный уровень очистки. Например, выделенный полипептид может быть удален из его природного окружения. Рекомбинантно полученные полипептиды и белки, экспрессируемые в клетках-хозяевах, считаются вы
- 19 016342 деленными для целей этого изобретения, так же как и нативные или рекомбинантные полипептиды, которые были отделены, фракционированы или частично или, по существу, очищены любым подходящим способом.
В качестве полипептидов данного изобретения включены также фрагменты, производные, аналоги или варианты предыдущих полипептидов и любые их комбинации. Термины фрагмент, вариант, производное и аналог при ссылке на анти-(/.//-антитела или полипептиды антител включают в себя любые полипептиды, которые сохраняют, по меньшей мере, некоторые из антигенсвязывающих свойств соответствующего нативного антитела или полипептида, т.е. те полипептиды, которые сохраняют способность связываться с одним или несколькими эпитопами на интегрине ανβ6. Фрагменты полипептидов данного изобретения включают в себя протеолитические фрагменты, а также делеционные фрагменты, наряду со специфическими фрагментами антител, обсуждаемыми здесь в другом месте. Варианты анти«.//-антител и полипептиды антител, используемые в соответствии с данным изобретением, включают в себя фрагменты, описанные выше, а также полипептиды с измененными аминокислотными последовательностями вследствие аминокислотных замен, делеций или инсерций. Варианты могут встречаться природно или не быть природно встречающимися. Не встречающиеся в природе варианты могут быть получены с использованием известных в данной области способов мутагенеза. Вариантные полипептиды могут содержать консервативные или неконсервативные аминокислотные замены, делеции или добавления. Производные анти-«//-антител и полипептидов антител, применимые в соответствии с данным изобретением, являются полипептидами, которые были изменены таким образом, что они проявляют дополнительные признаки, не обнаруживаемые в случае природного полипептида. Примеры включают в себя слитые белки. Вариантные полипептиды могут также называться здесь полипептидными аналогами. В данном контексте производное анти-«//-антитела или полипептида антитела обозначает рассматриваемый полипептид, имеющий один или несколько остатков, химически дериватизованных реакцией функциональной боковой группы. Включены также в качестве производных пептиды, которые содержат одно или несколько производных природно встречающихся аминокислот из двадцати стандартных аминокислот. Например, пролин может быть заменен 4-гидроксипролином; лизин может быть заменен гидроксилизином; гистидин может быть заменен 3-метилгистидином; серин может быть заменен гомосерином, и лизин может быть заменен орнитином.
По существу, существенный. В данном контексте говорят, что конъюгация белка по существу не мешает способности этого белка связываться с его рецептором (рецепторами), если степень и/или величина связывания конъюгированного белка с рецептором составляет не менее чем приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 65%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или приблизительно 100% или более, степени и/или величины связывания соответствующего цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона, которые не были конъюгированы.
Лечение. В данном контексте термины лечение, лечить, леченный или выполнение лечения относятся к профилактике и/или терапии, в частности, когда целью является предотвращение или замедление (ослабление) нежелательного физиологического изменения или нарушения, такого как, например, рассеянный склероз. Благоприятные или желаемые клинические результаты включают в себя, но не ограничиваются ими, уменьшение симптомов, уменьшение степени заболевания, стабилизированное (т.е. не ухудшающееся) состояние заболевания, задержка или замедление прогрессирования заболевания, уменьшение интенсивности симптомов или временное облегчение состояния заболевания и ремиссию (частичную или полную), независимо от того, являются ли они детектируемыми или недетектируемыми. Лечение может также означать пролонгирование выживания в сравнении с ожидаемым выживанием в случае неполучения лечения. Субъекты, нуждающиеся в лечении, включают в себя субъекты, уже имеющие это состояние или нарушение, а также субъекты, склонные иметь это состояние или нарушение, или субъекты, у которых это состояние или нарушение должно быть предотвращено. Под субъектом или индивидуумом, или животным, или пациентом или млекопитающим имеется в виду любой субъект, в частности субъект-млекопитающее, для которого являются желательными диагностика, прогноз или терапия. Субъекты-млекопитающие включают в себя других приматов, домашних животных, сельскохозяйственных животных и животных зоопарков, спортивных животных или животныхлюбимцев, таких как собаки, кошки, морские свинки, кролики, крысы, мыши, лошади, крупный рогатый скот и т.п.
Обзор
Данное изобретение описывает гуманизированные антитела, которые являются специфическими для интегрина ανβ6. Здесь описаны различные способы получения этих антител данного изобретения. Способы, которые известны в данной области, но не описаны конкретно здесь, также находятся в объеме этого изобретения.
Данное изобретение основывается также, по меньшей мере частично, на открытиях, что интегрин
- 20 016342 ανβ6 дифференциально экспрессируется на поверхностях опухолевых клеток, в том смысле, что он экспрессируется в увеличенных количествах на опухолевых клетках, которые являются метастатическими или имеют более высокий метастатический потенциал относительно уровней экспрессии, наблюдаемых на опухолевых клетках, которые являются неметастатическими или которые имеют более низкий метастатический потенциал. Для анализа этой дифференциальной экспрессии данное изобретение использует применение лигандов, в частности антител (и, более конкретно, гуманизированных антител, обеспеченных данным изобретением), которые связываются с интегрином ανβ6. В других вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает также способы, использующие идентификацию этой дифференциальной экспрессии в определении инвазивного и/или метастатического потенциала опухолевых клеток и в идентификации тех карцином, таких как некоторые аденокарциномы и преинвазивные ίη βίίυ карциномы (в том числе ЭСЧЗ и ЬСК), которые могут с большей вероятностью прогрессировать в инвазивные или метастатические карциномы. В настоящем изобретении представлены также способы идентификации таких опухолей, в которых клетки опухоли с большей вероятностью являются оказывающими на лечение одним или более лигандами, которые связываются с а^-интегринами. Данное изобретение обеспечивает также способы диагностики и лечения/предупреждения метастазирования опухолей и элиминации оставшихся клеток метастатических опухолей после хирургического удаления опухолей.
Гуманизированные антитела
В одном варианте осуществления антителами, обеспеченными данным изобретением, являются моноклональные антитела, которые в предпочтительном варианте осуществления являются гуманизированными версиями когнатных анти-а^-антител, полученных из другого вида. Гуманизированным антителом является антитело, продуцируемое технологией рекомбинантных ДНК, в котором некоторые или все аминокислоты легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина человека, которые не требуются для связывания антигена (например, константные области и каркасные области вариабельных доменов), используют для замены соответствующих аминокислот из легкой или тяжелой цепи когнатного нечеловеческого антитела. В качестве примера, гуманизированная версия мышиного антитела к конкретному антигену имеет как на его тяжелой, так и на его легкой цепи (1) константные области антитела человека; (2) каркасные районы из вариабельных доменов антитела человека и (3) СОВ из мышиного антитела. При необходимости, один или несколько остатков в каркасных районах человека могут быть изменены в остатки соответствующих положений в мышином антителе, чтобы сохранить аффинность связывания этого гуманизированного антитела с антигеном. Это изменение называют иногда обратной мутацией. Гуманизированные антитела обычно с меньшей вероятностью индуцируют иммунную реакцию в людях в сравнении с химерными антителами человека, так как первые содержат значительно меньше нечеловеских компонентов.
Подходящие способы получения гуманизированных антител данного изобретения описаны, например, в ОТ1п!ет ЕР 0239400; 1опев е! а1., №11иге 321:522-525 (1986); В1есйтапп е! а1., №11игс 332:323-327 (1988); Уегйоеуеп е! а1., 8с1епсе 239:1534-1536 (1988); Оиееп е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8с1. И8А 86:10029 (1989); и.8. Ра!еп! 6180370 и 0г1апб1 е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8с1. И8А 86:3833 (1989), описания которых включены здесь в качестве ссылки в полном виде. Обычно трансплантация мышиных (или других животных, не являющихся человеком) СОВ на антитело человека достигается следующим образом. кДНК, кодирующие вариабельные домены легкой и тяжелой цепей, выделяют из гибридомы. Последовательности ДНК вариабельных доменов, включающих в себя СОВ, определяют секвенированием. ДНК, кодирующие эти СОВ, переносят в соответствующие районы кодирующей последовательности вариабельных доменов тяжелой или легкой цепей сайт-направленным мутагенезом. Затем добавляют сегменты генов константной области человека желаемого изотипа (например, γ1 для СН и к для СД. Гуманизированные гены тяжелой и легкой цепей коэкспрессируют в клетках-хозяевах млекопитающего (например, клетках СНО или N80) для получения растворимого гуманизированного антитела. Для облегчения крупномасштабного получения антител часто желательно производить такие гуманизированные антитела в биореакторах, содержащих антитело-экспрессирующие клетки, или получать трансгенных млекопитающих (например, коз, коров или овец), которые экспрессируют указанное антитело в молоке (см., например, патент США 5827690).
Иногда прямой перенос СИВ в каркас человека приводит к потере антигенсвязывающей аффинности полученного антитела. Это происходит вследствие того, что в некоторых когнатных антителах определенные аминокислоты в этих каркасных областях взаимодействуют с СИВ и, следовательно, влияют на общую антигенсвязывающую аффинность этого антитела. В таких случаях, могло бы быть решающим введение обратных мутаций (выше) в каркасные области акцепторного антитела для сохранения антигенсвязывающей активности этого когнатного антитела.
Общий подход получения обратных мутаций известен в данной области. Например, Онееп е! а1. (выше), Со е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8сЕ И8А 88:2869-2873 (1991) и ОТ0 90/07861 (Рто!ет Эе^ди ЬаЬв Мс.) описывают подход, который включает в себя две ключевые стадии. Сначала вариабельные каркасные области человека выбирают компьютерным анализом на оптимальную гомологию белковой последовательности относительно каркаса вариабельной области когнатного мышиного антитела. Затем третичную
- 21 016342 структуру мышиной вариабельной области моделируют при помощи компьютера для визуализации аминокислотных остатков каркаса, которые имеют вероятность взаимодействия с мышиными СОК, и затем эти мышиные аминокислотные остатки накладывают на гомологичную каркасную область человека.
При этом двухстадийном подходе имеются несколько критериев для конструирования гуманизированных антител. Первым критерием является использование в качестве человеческого акцептора каркаса из конкретного иммуноглобулина человека, который обычно является гомологичным донорскому нечеловеческому иммуноглобулину, или использование консенсусного каркаса из многих антител человека. Вторым критерием является использование донорского аминокислотного остатка, а не акцепторного аминокислотного остатка, если акцепторный остаток каркаса человека является необычным, а донорский остаток является типичным для последовательностей человека в конкретном остатке этого каркаса. Третьим критерием является использование донорского аминокислотного остатка, а не акцепторного аминокислотного остатка в положениях, смежных с этими СОК.
Можно также использовать другой подход, описанный, например, Тетрек!, Вю!есйпо1оду 9:266-271 (1991). Согласно этому подходу каркасы вариабельной области, полученные из тяжелой и легкой цепей НЕ\УМ и КЕ1, соответственно, используют для СПК-трансплантации без радикального введения мышиных остатков. Преимуществом использования этого подхода является то, что трехмерные структуры вариабельных областей НЕ\УМ и КЕ1 известны из рентгеновской кристаллографии, и, следовательно, могут быть легко моделированы специфические взаимодействия между СПК и остатками каркаса вариабельной области.
Авторы данного изобретения получали кДНК вариабельной области тяжелой цепи и кДНК вариабельной области легкой цепи из мРНК, выделенных из гибридом 6.3С9 и 6.8О6, как описано в \УО 03/100033. Эти гибридомы продуцируют мышиные моноклональные антитела класса 1дО1, которые связываются с интегрином ανβ6. Экспрессирующие векторы химерных антител человека конструировали инсертированием этих кДНК в экспрессирующий вектор, содержащий кодирующие последовательности константной области тяжелой цепи антитела человека или константной области легкой цепи антитела человека. Затем такие векторы вводили в клетки животного для выполнения продуцирования химерных анти-а.ДЕ-антител человека. Было обнаружено, что среди этих полученных химерных антител химерные анти-а.ДЕ-антитела 3С9 и 8С6 взаимодействуют с интегрином ανβ6 и проявляют блокирующую активность.
С использованием вышеописанных подходов генерировали гуманизированные версии химерных антител 3О9 и 8С6. Для антитела 3С9 этот подход включал в себя клонирование вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, как описано в примерах здесь. Затем кДНК, кодирующие вариабельные области легкой и тяжелой цепей мышиного антитела 3О9, использовали для конструирования векторов для экспрессии химер мышь-человек, в которых вариабельные области мышиного 3С9 были связаны с константными областями 1дО1 человека (для тяжелой цепи) и κ человека (для легкой цепи), как описано в примерах здесь. Экспрессия экспрессирующих векторов легкой цепи и тяжелой цепи 3О9 после трансфекции в клетки 293-ЕВNА показала, что трансфицированные химерным 3С9 клетки синтезировали и эффективно собирали тяжелые и легкие цепи, и секретировали антитело (см. пример 2). Кроме того, была создана также дегликозилированная (агликозильная) мутантная форма химерного антитела 3С9. Было показано, что аминокислотная замена аспарагина (Ν) на серин (8) в Ν-связанном сайте гликозилирования в первом СПК легкой цепи 3С9 в значительной степени улучшала экспрессию и очистку белка без изменения связывающей аффинности (фиг. 1).
Для получения гуманизированных антител 3С9 акцепторные каркасные домены человека выбирали по соответствию гомологии с последовательностями зародышевой линии человека. Для легкой цепи было обнаружено, что акцепторные каркасы Ь6 человека были наиболее гомологичными, а для тяжелой цепи было обнаружено, что акцепторные каркасы 3-7 человека были наиболее гомологичными, как описано в примере 3. С использованием этих акцепторных каркасов человека конструировали вариабельные домены легкой и тяжелой цепей и генерировали, и экспрессировали ряд вариантов/версий каждого из них (пример 4).
Данное изобретение описывает гуманизированные антитела 3О9, содержащие вариабельный домен 8ЕО ΙΌ N0: 1 тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 2.
ЗЕО Ю ΝΟ.Ί
ЕУОЪУЕЗбССЬУОРебЗЬВЬЗСААЗСЕТГЗКУУМЗИУКОАРСКбЪЕ ИУАЗТЗЗССКМУУРОТУКбКГТХЗВРИАКЫЗЬУЬОМЫЗЬКАЕОТАУ УУСАКС31УОСУУУГРУЖ5ОЗТЬУТЗЗ
ЗЕО Ю N0;2
ЕГУЬТОЗРАТЬЗЬЗРСЕКАТЕЗСЗАЗЗЗУЗЗЗУЬУбУООКРСОАРЕЬШУ 8ТЗЫ1АЗС1РАКГЗС5СЗСТ0ЕТЬТ135ЬЕРЕ0ЕАУУУСН0ИЗТУРРТГ6
6СТКУЕ1К
- 22 016342
Различные варианты/версии тяжелой и легкой цепей 369 генерировали с различными степенями обратных мутаций для определения, какая комбинация продуцировала наилучшее гуманизированное антитело с превосходной связывающей аффинностью и блокирующей активностью в отношении ανβ6. Из генерированных пяти различных версий легких цепей и трех различных версий тяжелых цепей спаривание версии 3 (НУ3) тяжелой цепи 369 с версией 5 (ЬУ5) легкой цепи 369 генерировало наилучшее гуманизированное антитело (пример 4). Это гуманизированное антитело 369 версии 5 (Н3/Ь5) получают экспрессией рекомбинантного вектора для версии 3 (Н3) тяжелой цепи, содержащего плазмиду рК18189 (8ЕО ΙΌ N0: 6), в комбинации с рекомбинантным вектором для версии 5 легкой цепи (ЬУ5), содержащим плазмиду рК18195 (8Е0 ΙΌ N0: 5).
8Б<2ШКО:«
12 6Э 1 яте оде ттс ода МеЬ Лар РНе в±у сте аде тсс ста ттс егз ио сте сто ств ам осе «к дав тис дав отв сад сте отс дав дос ам дас
Ьеи 8»? Тгр уд1 Хао уц ни ΥΑ1 где Ьу» В1У V»! 61П Су« ЭД ν»1 эд Ьеи сьи вег эд эд
1347 ССС СТО стз сад ССС дас дас АЗС СТС ΛΒ3 СТО «X тес асе вес две еда тее асс ттс мс дас ТАС «те лта лес Т№ ста
Й1у Баи ν·1 эд ею ЭД в1У 8« Ьеи Аг? Ьеи Вег <^г> Ми А1а вде 01у РЬе ТЬг РЬе бег Агд Туг «8^ 8«г Тхр дез
Ш1 ссс сад вес ссс овс АЛ? отс сте вад тез ОТВ ЯСС яда лги лес лзс еда дас ссс яга тад тле ССС оде лда Ив ДАВ ВЕС
57 Аг? 91Я Л1а Рг» ЭД Ьув В1у Ьеи в!и Тхр V»! А1а ваг 11е Вех вег ЭД ЭД Аг? ыде Гу» Туг Рю Авр 7Ьг Та1 Ьу» б1у
1515 ссс ттс дес аде две евс дас МС вес АМ ме авс ств ЧАС СТО САО МО АМ АВС сто С6С вес ало вас лее вес отв тле
ев Ах? РЬе ТЬг 11« вех Аг? Авр Мп А1В Ьув Аде вег Ьеи Туг Ьеи ЭД МвГ Аде Вех Ьеи Агд «1а бХи Лор ты А!* Уа! Ту»
тис тзс ОСС свс ей; ЛВС АТС гас оде дас ТАС ТДС «те ТТС же ТАС твв дас сас дас ясс сто отв лее иге Две тсс вес
из тух Су» ада Агц 61у Вес 11« туг Лер эд туг Тут V»! РЬ» Его Туг Тгр 51у ЭД эд ТЬг ьеи У<1 ТЬг ν»ι ба» Зег Д1а
им аде аде ДАВ 65С ссс да ив ттс ссс ста дас ссс МС АСС лад лее АСС АСС «ОС ВОС АСС ССС ссс СТС ©ЕС ТОС его СТС
141 8ег ТЬг ьуз <Э1у Рго 9ыс УА1 гЬе ₽гс А1а ?го Вет бег Ьу» Вег ТЬг бег <Э1у 01/ ТЬг А1а Л1а Ьеи 61/ суе Ьде νη
37У7 А№ САС ТАС гтс ссс дад ссс СТв ЛСо его тсв тда дас ТСА вес вес ств лее лес вес «Τί СЯС АСС ТТС еда ест СТС ста
1» Буе Авр ту» РМ Рг» С1и Рго У»1 ТМ Уа! Ваг Тгр Аде Вег Иу Д1а Кеи ТА» Вег эд т Н1е рде ли ν*1 ьде
1591 сад тсс ТСА 0ОД сте ТАС 700 СТС дэт аде СТО вга дос отв ссс тда лес яда ттс дас асс дав аде тле яте тэт ляс вто
191 αΐη $«· ί·Α эд ьеи Тус ££ 1ап Ваг Вег V»! иаХ ТЬг Уа1 Рта ваг Вах Вех 1«и 01/ ТЬ» С1л ТЬг Туг Не су» Ава Уа1
ИЗБ мт сад ДАО сне ДОС ААС ДОС лад сте ВАС Л№ ААЛ СТТ оде ссс мл тст тст вад ям лот дас АСА ТЭС ода ССС ТСС СОА
225 Аде К1в ъуе Рго Век яде тьг ЬУ* ΥΒ3 Лер Ьуе ьув V»! эд Рго Ьув Вех Сух Аде Буе ТМ В1е ТЬ? су« ₽де рва СУв Рде
2519 ося ест дал СТС СТС дав вод сев тса етс ТТС СТС ТТС сес сел лм ссс дм ем АСС стс лте АТС ТСТ даб лес ССТ ОАО
153 А1в Рю Ьнц Хеи в1у ЭД Рео Вег ν·1 РЬе Ыи РЬе Рго Рго Ьуз ₽Т0 Ьув Агр ТЬг им МеЪ Не Вег Аг? ТЬг Ргь 61и
2305 ИС АСА ТЭТ Ив отв етс еле СТС лес САС ода дас ССТ дав стс дав ттс дас таз тао отв дас вес втв 6АВ вте С» МТ
Уа! ТЛг Суа Уа1 УЧ 7*1 Дар Уа! Ваг Я1е ЭД дар Рго эд У«1 Ьув РЬе Аде Ггр тух V»! Аар ЭД V·! Ши УЧ Κί· Аде
2107 вес мз дед М3 оса ОМ ОМ вВД САС ТАС МС АМ ЛОТ ТАС ССТ СТС СТО МС СТС СТС МС СТС сте слс СМ 6ДС ТО6 ств
309 А1* ЬуВ ТЬг Ьу* Рго Аги С1и С1и Б1«з Аде Вде тт»г Туг ДЮ V*! V»! Вег Уа! Беи ТЬг Уа1 Ьеи К1х С1л Двр «де Хаи
2511 ДАТ ОСС дад сад ТАС ААС ТСС лад сте тес дад апа аса СТС ССА ССС ССС АТС СМ МА лес лтс ТСС ДМ дас АДА дао сад
зет АВП С1у дуа эд Тус Буе Суе Ьуе Уа1 вас Аде Ьу* А1а [ей Рю А1е Рео Не эд Хуа ткс и» 8βΐ Ьув А1а ьув эд С1г>
2355 ссс еда вая сад сад СТО ТАС АСС сте ССС ССА ТСС еда СНГ ОДО СТО АСС ЛАО ЛАО еде сте аде ОГО ДОС тсс сте СТС лад
365 его дхд С1о Все 31П УЧ Туг ТЬг Ьеи Рго Рг» Ват ЛГО А«Р <51а Хеи таг !уз Аде 01л Уа! рее ьеи тйг Су» Хви Уа1 Ьу»
2439 вбе ттс ТАГ ССС аде дас дтс вес ото см тов дас Аве ляг «ос сад «с оде дас ААС ТИС АЯ6 ЯСС ЯСС ест ССС аге по
393 01у РЬе ТУК Тег Авр не А1» У«1 ЭД тгр Ши Вее Аде 61у «1п рхе ЭД Аса Ава Тух Ьу» ТЬг ТЫ Рко РХО V·! Ьеи
2513 ВАС ТСС дас еос тсс ттс ттс СТС ТАС аде ДАВ СТС аде сте оде лхе мс дет т&э сна сад соа Ш сте ттс ТСА «зс ТСТ
421 2607 445 Мр бег ИО АТв ν»! Μ&Ϊ Мр дат М1Е эд дав в!» бес ОСТ А13 РЬе РЬе сте сад ьве Н1е 1еп Туе мс сад дел к1а Звг ТАС туг Буе Хде АСС СТС ТЬт »г ¥4 дад мс Ъуг &ег Мр Ьу* Зег Тгр СТС ТСС СТС тст сое ьеи Бег ьеи Зег рю С1Л ЕСТ ЭД 61а СЬу Аде Υ81 РЬе вег Сув бет
8ΕΟΪϋΝΟ:5
1163 яте оде ттс сад сте сад агс ттс дос ттс СТО сте дгс аде сте лее етв атс кто аде ссс ссс вад АТС Сте ста аде сад
МЫ Авр Ηιβ Ολη V»! Не И* Ваг РЬе Ьаа Ьеи 11« В» УЛ 6« Уа1 11« НОВ 54? ВД ЭД ЭД Ые Уа1 Без ТЬг ЭД
13«? аде ссс осс аде сто лес сте аде ссс вес сад лез ссс аде сте дос тес две есе аде аде аде втв аде две аде «с ста
3« Рю А1а ТЪс Ь*и Дет Хаи Вег Рта 01у й1и Аг? Л1а ТЬг Ьеи бег су» Вег А1а бег вег Вег ¥й1 Зет бег Зег Туг Ьеи Ш1 тас гсс тле сад еде дад ссс изс ом ссс ссс лев «те ст© № тас аде лее аде лад сте ссс лее осе лтс ссс ссх дас δδ Ту» Тер Туг ЭД Ь/в Его С1у <31л А1Э ₽Г<з Дгр Ми Ьеи 11« Ту» вес ΤΗ» Βατ Мл ДДа, бет Шу Г1е Рг» Л1а Аг?
1515 ТТС АСС 6ВС ДОС <ЗбС МС ССС ЯСС ОАО ТТС АСС СТС АСС АТС АЭС МС СТС 5Д.6 ССС САО ОДС ТТС ССС СТО ТАС ТДС ТВС ОДС
Б>Ъ« Эсг 01у 5ег С1у ТЬх Лвр ТЬг Ми ТНг II· вот 9ег 1ли 01« ?го <51и Авр РЬй А1& Туг Туг Суа К1е
1909 сад ТСС АСС №С ТАС ССС ССС АСС ТТС СОС б<30 вве ЛК МС ИС над дтс МБ сот лее вге ОСТ ОСА ССА тст стс ттс АТС
110 ЭД Тер бе» ТЬг Тус ₽Хо РТС ТЫ РЬе ЭД ЭД ЭД ТЬг 1уа V»! ЭД ХМ Ьув Агд ТЬг VII Л1а АЪв Рю бег ¥! №е 11«
1бвз ттс ссс сса тст дат ело сад ттс ш тс* ввл лет осс тст ©Гт сте тес ста сто лат лас ттс та? ссс доа нас вес мл
111 Его ₽го Не дар 01и 61а Ьеи Ьу? $вг С1у ТЬг Л1а в»г ν«1 ν«1 Су» Ьм Ми лап Лея бп» Туг Рго яг? <31и Лв Ьу»
1?«? ста сад т® ам сте дат аас ах сте сад тсс оет яад тсс сад сад дет отс аса сас сад сад аде т вле лес аде тле
1Н сад Е1п Тур Ьуе ν*1 Авр Μη А1» Ьеи С1п 8в» ЭД Аде Век1 ЭД ЭД бег ¥а1 ТЬг 61Р ЭД Авр Вег Був Авр Зег ТЬг Туг
1951 АЙС СТС АСС аде АСС СТ5 АСО СТО АЗС ААА ОСА ОДС ТАС ОАО ААА САС ДАА СТС ТИС 5СС ГвС Ш. СТС АСС СМ* СМ С6С СТС
191 вад Ьеи вех вех ты 1ли 7Ы ьш 5« Ьув Л1в лер туе схи ьуа ни ьув уад ту? льз су* эд ν»1 ты НАа 31л ЭД ьеи изв лес тсе ссс его лсд лад ясс ттс аас Азе сод етс тот
2)6 Вег Рго V»! ТЬг Ьу» Вег РЬе Яде Аг? Е1У 61в Су»
Генерировали также другую версию гуманизированного антитела 369 версии 5 (Н3/Ь5), в которой тяжелую цепь мутировали для удаления сайта гликозилирования в константной области, который, как было показано, является необходимым для нормального связывания Ес-рецептора (пример 5). Эту дегликозилированную (агликозильную) форму гуманизированного антитела 369 (аН3/Ь5) получают заменой аминокислотного остатка аспарагина (Ν) глутамином (О) в константной области версии 3 тяжелой цепи (Н3). Дегликозилированное гуманизированное антитело 369 (а-Н3/Ь5) получают экспрессией рекомбинантного вектора для версии 3 агликозильной тяжелой цепи (а-Н3), содержащего плазмиду рК18196 (8Е0 ΙΌ N0: 7), в комбинации с рекомбинантным вектором для версии 5 легкой цепи (Ь5), содержащим плазмиду рК18195 (8Е0 ΙΌ N0: 5; см. выше).
- 23 016342
8ΕΡΠ)ΝΟ:7
иа 1 дю ОДС ттс МвБ МР РЙ« вес сто аде тев «к ттс сто ста отв ото сто ллс вас ста сад тос ед его ед ста отв сад лее вас сот
в1у Ми Мг тгр Υ91 «Н5 Ьеи ПП ьеи 741 Веи Ьув «1у Уа! βία СУ» Б1и ν>1 βΐπ Ьеи ν«1 01 и Зег 01у 61у
1341 ОТС СТС СТС САС ССС ОвС вес аде СТО АБС ста аде тве вес БСС АЭС вес 1ТС АСС ТТС АБС ССС ТАС ОТО АТС АБС ТС9 СТС
29 31у Ми Τβΐ σΐη Рго вху 01/ 5ег Ьеи Агд ми вех бу* ад* ли Зег О1у РЬе ТЬг РЬе 9ег Агд Тус ТД1 НеЬ вех Тгр ш
1431 СЭС СЫЗ ССС ссс вес лад вас ста вад тса ста аса аде дте лес аде еа вес ССС «а ТАС ТАС ССС оде АСС отс ААС вес
57 Агд 61Л ΛΖβ РГО С1У Ьув «У ьеи ахи Тгр ¥41 А18 54Γ Не бег 5ег е1у £1у лгд Иве Туг туг РГО Авр ТЬг тех ьуз $1у
1515 сос ттс лес АТС Две ССС еле ДАС вес лад аас Две СТС ТАС СТС САБ АТС ДАС МС ста овс ССС БАБ оде Асе вес ста ТАС
¢5 Агд РЬе ТЫ ГХ« 5ег лев Азр Азп ДМ Ьув Авп вег ьеи туг Ьеи СТп Иек Азп Зег Ьеи Агд А1а Б1и А*р ТЫ А1в Υ&1 туг
1699 тле тсс все СЕС вас АСС АТС тле САС вес ТАС ТАС СТС ТТС ССС ТАС тве вас сад ССС лее сто отв дес ста мс тсс все
113 Туг Су» Л16 Агд 01у вег На Туг Авр 61/ Туг Г?» 741 РЬе РЕВ п* тгр (31У δία вау ТЛЕ Ма νβΐ ты 7«Х зег вег АДв
1633 лес АСС ДАЙ БЭС ССС АБС ото ТТС ССС ста есс ССС аде АЙС А№ АВС АСС лес вес сес лее ОСС асе сто вас тсс СТС отв
141 бег ты ъув С1у 9га Зег ш РЬе РГО Ьеи А1в Рго вег вес ьуз Зя г ТЫ вех С1у Б1у ТЫ АХв А1» Ми 61у еуе Ъеи 7«1
176? ЯМ ОДС ТАС ТТС ССС 6ΑΛ сса втв АСС его тев твв лад ТСА аес ССС СТС АСС АБС ОСС СТС СЯС АСС ТТС оса ест СТС СТА
159 Ьу® Авр Туг РЬе Ото 01« РГО ш ТЫ УаХ вег Тгр Ава бег 61У ли ьеи ТДГ Зег еху УаХ М1з ТЬг РЬв РГО ЛДе Υαΐ ми
1851 сад тсс тел БОА СТС ТЛС тсс стс АСС аде отв ста АСС СТС есс тсс дес АСС гтс вас лае САС АСС ТАС АТС тве ДАС ста
197 914 вех зег 01у ми Туг 8ΘΧ Ьеи 8« Зег /а! ТЬг 7«1 Рги вег Зег 9ег Ми Б1у ТЬг ЭХп ТЫ Туг Х1е еув ЛЯП νβΐ
1935 ДАТ САС АЛБ ССС АБС ЛАС АСС ЙАБ ста <ЗАС дад «А етт ед ССС ААА тст тет БАС ДАБ лет САС ЛСД Т6С ССА сев тот ОСА
225 Ави ЯМ Ьув Рго Зег Лап ТЬг Ьув 7а1 Авр Ьув Ьув ты С1и Рго Ьуо вех Суо Аар 1уВ ты К1о ТЫ Суз Рго Рго Суз его
2019 ОСА СОТ ОЛА стс ста ввв вал саз гса отс ттс СТС ттс ССС ССА ААА до лад еде АСС СТС «ТО АТС ТСС сов АСС ССГ 6Л0
253 Л1» РГО 614 мп ми в1у аху рго ваг 7Ж1 9М 1ли еь« Тго Рго ьу» рте Ьув Авр ТЬг Ми №1 Не 9ег Дед ТЬг РГО Б1и
2103 СТС ДСА тсс СТО ОТС СТО САС СТО лес сад ОДА вад сот ед этс АДБ ТТС ЛАС ТСС ТЙС ста ед авс отв ед отв САТ ЛАТ
281 Ум! ТЬг Суе 7а1 7а1 7а1 Аар νοί Эах ш 01и Авр Рте 01« ν«ι Ьув РЬе Лап Тгр Туг 7в1 Авр 31у Уе1 ои 781 ИХ· АЗП
1187 есс дде аса ш сса сев вад ем САД тад сад лас АСС тле сет СТС СТС АСС 43ТС СТС АСС СТС СТС САС САС БАС тес ста
309 ли ьу* ты Ьув Р» Агд в!и 01(1 61П Туг вм вег ТЫ Туг Агд па у«1 8Ы Υ31 ьеи ТЫ Уа1 Ьеи и* 51п Азр Тгр Ьеи
2271 АЛТ 0ОТ ЛАС ед гад лад ТОО лад СТС ТСС мс мл есс СТС ССА ОСС ССС АТС ед А№ АСС АТС ТСС АЛА ОСС ДАЛ ББб СЙБ
337 Авп 01/ 1у° βία Тух Ьу* Сув Ьув 7а1 вех АвП Ьув ли Ми Рго АХа Рго Х1е 01 и Ьув ТЬг Не вех Ъуз А1& Ьув СТу вХп
1353 ССС ССА САА «л ем ото ТАС АСС ста ССС ССА тсс сев акт ед ста АСС ЛАв ДАС СМЕ СТС АЙС ста АСС тве СТС вгс МЛ
ЗС5 Рго Агд СДи рго (21п 7аХ туг тЫ Ьеи РрР Зег ЛКд Авр 61и ми ТЬг Ьуз Авп С1п V»! Сиг 1еи ТЬг Суз Ми Уз1 Ьув
2439 вое ТТС ТАГ есс аде вад АТС вес ага оад ТБв ед аде ДАТ вот сад сев ОД6 ААС ААС ТАС ΑΑΘ лес лее ССГ ССС ста ТТС
393 С1у ЕЬе Туг Его вег Авр 110 дхе ναΐ «1и Тгр 610 вег АЗП 01у СМ №0 618 АЗА АЗО туг Ьуз ТЫ ТЬг Рго Рго Υ31 Ьеи
2523 САС ТСС БАС бэс тсс ттс ттс СТС тле МС АА6 СТС лее БТС САС АДв АЭС ДОС τββ см сад 660 ДАС вге ттс тод тот ТСС
421 Дзр Звг Аер С1у Зег РЬе ЕПв ъео Тух Бег Ьув Ми ТЬг Υβΐ Авр Ъуз вег Агд Тгр ахп 31п 01у Леи УвХ РЬе Эаг Сув Зет
2687 ста яте саг оде зет ста САС ДАС САС ТАС ма СМ АЛв лее СТС ТСС ста тст ССС авт
449 Уа1 ИеЬ ни βίο ли ьеи Н18 АЗП НХ8 ТУГ ТЛЕ С1п Ьуз 5вг Ми Ввк Ми Саг 9X0 51у
Подобные подходы использовали в конструировании гуманизированного антитела 806 (пример 7). Конструировали три версии вариабельной легкой цепи и вариабельной тяжелой цепи 806, причем первая версия содержит наибольшую часть обратных мутаций, а третья версия содержит наименьшую часть обратных мутаций (т.е. является наиболее гуманизированной) (пример 5).
8ЕО ГО ΝΟ: 75 (легкая цепь версии 1 Ьи8<Э6)
О1УЬТ98РЬА1Е8Е8РОЕКАТЬЗСК.А505У5Т53У8¥МУУ/У00КРС0АР ΚΓΠΚΥΑ5ΝΕΕ8ΟΙΡΑΐυ?8Ο8Ο3αΤΟΡΤ±·Π33ΓΕΡΕΟΡΑνγΥΟ0ΗΝ\νΕ1 ρρτΓΟοατκνΕίκ
8ЕО И) ΝΟ: 76 (легкая цепь версии 2 Ьи8С6)
Е1УЕТ98РАП.8Ь8РОЕКАТЬ8СКА898У8Т88У8УМУ1УУ0(?КР6(гАР ΚΓΕΙΚΥΑ8ΝΕΕ8ΟΙΡΑΚΓ8Ο8080ΤΟΡΤΕΤΙ88ΕΕΡΕΟΕΑνΥΥ00ΗΝΐνΕΙ ΡΓΤΡΟΟΟΤΚνΕΙΚ
8ЕО И) ΝΟ: 77 (легкая цепь версии 3 НиЗСб)
ΕΙ\ΤΤΟ5ΡΑΤΕ8Ε8ΡΟΕΚΑΤΕ8ΟΚΑ8Ο8ν8Τ88Υ8ΥΜΥν/Υ00ΚΡα0ΑΡ КШКУА8МЕЕ8О[РАКЕ8О8а80ТОГТЕТ(88ЬЕРЕОЕАУУУС0НК\УЕ1 ρρτροοατκνΕίκ
8ЕО ГО ΝΟ; 78 (тяжелая цепь версии 1 Ни8<36)
0ν0Εν08ΟΑΕνΚΚΡθΑ8νκν8ΟΚΌ58ΥΓΡΤΟΥΑΜΗ\ννΚΕΑΡΟ0ΟΕΕ ΤΥΙΟνίΒΤΥΥΟΝΤΝΥΝΟΚΡ'ΚΟΚΑΤΜΤνϋΚδΙδΤΑΥΜΕΕδΚΕΚ.δΟΟΤΑν ΥΥΟΑΚΟΟΕΚΚΟΟΚΡ8ΕΚΥΑΜΠΥνϋΟΟΤΕντν83
8ЕО ГО ΝΟ: 79 (тяжелая цепь версии 2 Ни8С6)
0ν0Εν08ΟΑΕνΚΚΡΟΑ8νκν80ΚΑ8ΟΥΤΡΊΌΥΑΜΗννΚ0ΑΡΟ0ΟΕ Ε\νΐ0νΐ8ΤΥΥΟΝΤΝΥΝ0ΚΓΚΟΚΑΤΜΤνθΚ8Ι8ΤΑΥΜΕΕ8ΚΕΚ.8ΟΟΤΑ νΥΥΟΑΚΟΟΕΚΚαθΚΡ8ΕΚΥΑΜΟΥ1νθΟΟΤΕντν88
8ЕО ГО ΝΟ: 80 (тяжелая цепь версии 3 Ьи866)
0ν0Εν08ΟΑΕνΚΚΡΟΑ8νκν8ΟΚΑ8ΟΥΊΤΤΟΥΑΜΗ\ννΚ0ΑΡα0ΟΕ ΕΐνΜθνΐ8ΤΥΥΟΝΤΝΥΝ0ΚΡΚσΚΑ™τνθΚ8Ι8ΤΑΥΜΕΕ5ΚΕΚ8ΟΟΤΑ νΥΥΟΑΚΟΟΕΚΚΟΟΚΡ8ΕΚΥΑΜϋΥΐν60ΟΤΕντν88
Другие части молекул антител
Как описано более подробно ниже, гуманизированные моноклональные антитела этого изобретения могут дополнительно содержать другие части молекул для выполнения желаемых функций. Например, гуманизированные антитела могут включать в себя токсиновую часть (например, столбнячный токсоид или рицин) или радионуклид (например, ш1п или 90Υ) для убивания клеток, на которые нацелены эти антитела (см. патент США 6307026). Гуманизированные антитела могут содержать часть (например,
- 24 016342 биотин, флуоресцентные части, радиоактивные части, гистидиновую метку или другие пептидные метки) для легкости выделения или очистки. Гуманизированные антитела могут также содержать часть молекулы, которая может пролонгировать их полупериод существования в сыворотке, например полиэтиленгликоль (ПЭГ).
Различные химиотерапевтические агенты могут быть связаны с этим нацеливающим гуманизированным антителом. Предпочтительно наилучшим было бы гуманизированное антитело, которое интернализуется после связывания, однако, не исключается использование неинтернализующихся гуманизированных антител. Например, использование конъюгатов антитело-лекарственное средство, которые связываются с поверхностью опухолевой клетки, высвобождает это лекарственное средство в опухоли или вблизи опухолевых клеток, и диффузия или транспорт в эту клетку может осуществлять противоопухолевую активность в зависимости от используемого лекарственного средства. Перечень лекарственных средств, которые можно было бы использовать для получения конъюгатов, является обширным, и специалисту с квалификацией в данной области известно, как получать химические модификации в отношении желаемого соединения, чтобы сделать реакции этого соединения более удобными для целей получения конъюгатов данного изобретения. Например, лекарственное средство могло бы быть связано через высвобождаемые линкеры, которые являются дифференциально более стабильными в сыворотке, но высвобождают активное лекарственное средство внутри опухолевой клетки. Могут быть использованы несколько механизмов высвобождения в зависимости от конкретного лекарственного средства. Примеры этих механизмов высвобождения включают в себя использование чувствительных к кислотам гидразонов, чувствительных к окислению-восстановлению линкеров, например дисульфида, и протеолитически расщепляемых пептидных линкеров. Далее приведены некоторые репрезентативные лекарственные средства из нескольких различных классов:
(A) алкилирующие агенты. Некоторыми конкретными примерами этих лекарственных средств являются циклофосфамид, хлорамбуцил, бусульфан, мелфалан и нитрозомочевина;
(B) антиметаболиты и антипролиферативные агенты, такие как антрациклины, лекарственные средства, произведенные из Ушса (барвинка), митомицины, блеомицины, нуклеозиды, птеридины, эндиины. Примерами являются адриамицин, даунорубицин, доксорубицин, аминоптерин, метотрексат, митомицин С, актиномицин Ό, 5-фторурацил, 6-меркаптопурин, цитозина рабинозид, таксол, таксан, цитохалазин В, колхицин и пуромицина этопозид, мелфалан, винбластин, винкристин, калихеамицин, производные майтансинов и производные долистатина;
(C) гормоны и антагонисты гормонов, такие как кортикостероиды, прогестины и эстрогены.
Пролекарства определяются как лекарственные средства, которые существуют в менее активной химической форме при присоединении к антителу, но после интернализации отщепляются ферментативно с образованием более активной лекарственной формы. То же самое применение может быть получено с конъюгатами антител, которые не интернализуются, например ферментативное расщепление происходит на поверхности опухолевой клетки и лекарственное средство высвобождается в непосредственное окружение опухоли и ассимилируется опухолевой клеткой. Некоторыми примерами этого являются лекарственные средства, содержащие фосфаты, сульфаты и пептиды.
Присоединение биологически активных белковых токсинов, таких как А-цепь рицина, дифтерийный токсин, шигатоксин (из 8Ыде11а букеЗДепае), столбнячный токсин или токсичный фермент, является другой формой конъюгата антитела, рассматриваемой данным изобретением. Такие конъюгаты могут быть получены с использованием способов химической конъюгации или с использованием способов генетической инженерии, которые делают возможной прямую экспрессию конструкции антитело-токсин, которые хорошо известны специалисту с квалификацией в данной области.
Гуманизированные моноклональные антитела этого изобретения могут также содержать другие части, такие как радионуклиды. Для целей радиоиммунотерапии этим изобретением рассматривается применение гуманизированных а^6-антител для специфического нацеливания терапевтических радиоактивных изотопов для лечения рака. Перечень релевантных изотопов может включать в себя, но не ограничивается ими, 90Υ, 1251, 1311, 1231, 1П1п, 105ВЬ, 1538т, 67Си, 670а, 166Но, 177Ьи, 186Ке и 188Ке. Рассматриваются также изотопы-излучатели α-излучения, такие как 211А!, 212В1. Способы присоединения изотопов варьируются и зависят от конкретного используемого изотопа. Специалист с квалификацией в данной области сможет определить химический способ конъюгации для присоединения любого конкретного изотопа.
Для целей радиоиммунодиагностики гуманизированные «ДЕ-антитела могут предоставлять возможность визуализации и выполнения дозиметрии для рака-мишени и/или заболевшего органа/ткани любого конкретного заболевания. Это может быть применимо для подтверждения локализации относительно известных участков опухоли, а также оптимизированного предоставления доз терапевтического введения. В частности, позитронные радиоизотопы (например, 86Υ), наряду с чистым γ-изотопом 99МТс, могли бы предоставляться во время терапевтического введения.
Вышеописанные применения радиоиммунотерапии/радиоиммунодиагностики не ограничиваются применением неинтернализующихся антител. Имеются примеры эффективного использования интерна
- 25 016342 лизующихся антител для нацеливания радиоизотопов, в частности, с изотопами, которые сохраняются в клетке в виде хелата после катаболизма. Например, 9'°У-меченные антитела получали с использованием высокоаффинных хелаторов, таких как МХ-ЭТРА или СНХ-ЭТРА.
Любой из вышеописанных конъюгатов антител включает в себя также использование фрагментов ЕаЬ, Е(аЬ')2, ксЕу, минител, СН2-домен-делетированных конструкций антител и ЕсКп-мутантов. Эти фрагменты антител или происходящие из них модифицированные конструкции имеют фармакокинетику, проникновение в опухоль и свойства локализации в опухоли, отличающиеся от интактного Ιβ0, что может предоставлять преимущества в конкретных приложениях. Например, ЕаЬ с более быстрым клиренсом может быть применим для диагностических применений и для радиоиммунодиагностических применений. С другой стороны, для радиоиммунотерапии или нацеливания лекарственных средств может быть более эффективным выбор нацеливающего носителя с более продолжительным !1/2 в сыворотке.
Патологические состояния и модели животных
Гуманизированные антитела данного изобретения применимы в диагностике и лечении, в том числе предупреждении, а^6-опосредованных заболеваний. Например, эти гуманизированные антитела могут быть использованы для лечения фиброза (например, фиброза легкого, острого легочного патологического изменения, фиброза почки, фиброза печени, синдрома Альпорта и склеродермии) и других заболеваний и нарушений, описанных здесь в другом месте, блокированием активации Т0Е-() или блокированием связывания ανβ6 с любыми другими лигандами, такими как фибронектин, витронектин и тенасцин. В частности, гуманизированные антитела этого изобретения могут быть использованы для лечения заболеваний легких, ассоциированных с повреждением/фиброзом, таких как, но не только, идиопатический легочный фиброз, индуцированный радиацией фиброз, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), склеродермия, индуцированный блеомицином фиброз, хроническая астма, силикоз, индуцированный асбестом фиброз, острое повреждение легкого и острый респираторный дистресс-синдром (в том числе, индуцированный бактериальной пневмонией, индуцированный травмой, индуцированный вирусной пневмонией, индуцированный респиратором (аппаратом искусственной вентиляции легких), индуцированный нелегочным сепсисом и индуцированный аспирацией). Гуманизированные антитела этого изобретения могут быть также использованы для лечения хронических нефропатий, ассоциированных с повреждением/фиброзом, таких как, но не только, волчанка, диабет, склеродермия, гломерулярный нефрит, очаговый сегментарный гломерулярный склероз, ^А-нефропатия, гипертензия, аллотрансплантат и болезнь Альпорта.
Гуманизированные антитела могут быть также применимы для лечения фиброза кишечника, склеродермии, индуцированного радиацией фиброза. Гуманизированные антитела этого изобретения могут быть также использованы для лечения фиброза печени, например, но не только, индуцированного повреждением желчных протоков фиброза. Другие показания, для лечения которых могут быть использованы гуманизированные антитела этого изобретения, включают в себя также фиброз головы и шеи, индуцированный облучением фиброз, рубцевание роговицы, ЕА8ЕХ, трансплантат роговицы, трабекулэктомию, гипертрофическое рубцевание, индуцированный ожогом фиброз, хирургический фиброз, саркоидоз, псориаз и повреждение/фиброз спинного мозга.
Как описано подробно ниже, кроме фиброзных заболеваний и состояний гуманизированные антитела этого изобретения применимы в лечении рака или метастазирования рака (в том числе роста и инвазии опухоли), в частности эпителиальных типов рака. Подклассом эпителиальных типов рака является плоскоклеточный рак, например, головы и шеи (включающий в себя рак ротовой полости, рак гортани, рак глотки, рак пищевода), рак молочной железы, рак легкого, рак предстательной железы, рак шейки матки, рак ободочной кишки, рак поджелудочной железы, рак кожи (базальноклеточные карциномы) и рак яичников. Исследования авторов изобретения с использованием новых моноклональных ανβ6антител показали, что ανβ6 в высокой степени экспрессируется во многих эпителиальных типах рака, особенно на основном крае этих опухолей. Эти новые антитела могут быть также использованы для любых других заболеваний, опосредованных ανβ6, в том числе псориаза.
Эффективность антител данного изобретения может быть испытана в различных моделях животных, некоторые из которых описаны в неограничивающих примерах ниже. Модели фиброза легкого мыши включают в себя индуцированный блеомицином (РПТеТ е! а1., I. С1т. Ιηνβκΐ. 107(12):1537-1544 (2001) и Мипдег е! а1., выше) и индуцированный облучением фиброз легких (Егапко е! а1., Кай. Кек. 140:347-355 (1994)). В обработанных блеомицином мышах экспрессия ανβ6 увеличивается в эпителиальных альвеолярных клетках легких. Но мыши с нокаутом β6 защищены от индуцированного блеомицином патологического изменения и фиброза.
Модели мышей для фиброза почки включают в себя Со14А3 -/- мышей (см., например, Сокдготе е! а1., Атег. I. Ра1Ь. 157:1649-1659 (2000), мышей с индуцированным адриамицином повреждением (^апд е! а1., К1йпеу ЬИетаНопа! 58:1797-1804 (2000); Иетап е! а1., №рйго1 Όίη1 Тгапкр1ап1 16:147-150 (2001)), мышей ЙЬ/ЙЬ (21уайеЬ е! а1., РNА8 И8А 97:8015-8020 (2000)) и мышей с односторонней уретральной обструкцией (Еодо е! а1., ЬаЬ ЬчуекидаНоп 81:189А (2001); и Еодо е! а1., 1оигпа1 о£ 1Ье Атепсап 8оае1у о£ №рйго1оду 12:819А (2001)). Во всех этих моделях мыши развивали повреждение и фиброз почек, кото
- 26 016342 рые могли прогрессировать до почечной недостаточности. /νβ6 положительно регулируется в эпителиальной выстилке восходящих и нисходящих почечных канальцев Со14А3 -/- мышей, обработанных адриамицином мышей, и мышей, которые были подвергнуты односторонней уретральной обструкции. Вероятно, экспрессия /νβ6 также увеличивается в различных моделях повреждений почек.
Как описано также подробно ниже, моноклональные анти-о.^-антитела могут быть также испытаны на их способность ингибировать рост, прогрессирование и метастазирование опухолей в таких моделях животных в качестве стандартных ίη νίνο моделей роста и метастазирования опухолей. См., например, Йоск\\'е11 е1 а1., 1. Сапсег ΙπδΙ. 49:735 (1972); 0иу е! а1., Мо1. Се11 ΒίοΙ. 12:954 (1992); ХУускоГГ е!
а1., Сапсег Ке§. 60:2504 (2000) и Ой е! а1., Сигг. Вю1. 8:1243 (1998). Важные </.,„ β6-лиганды в случае рака могут включать в себя Τ0Ε-β, который участвует в метастазировании (в отношении обзора см. Акйигй е1 а1., Тгепбк ш Се11 Вю1о§у 11:844-851 (2001)), фибронектин и витронектин.
Эффективность лечения данного изобретения может быть измерена с использованием ряда доступных диагностических инструментов, включающих в себя физическое обследование, анализы крови, измерения протеинурии, уровней креатинина и клиренса креатинина, тесты легочной функции, уровни азота крови (ΒϋΝ) в плазме, наблюдение и оценка рубцевания или фиброзных повреждений, отложение внеклеточного матрикса, такого как коллаген, актин гладких мышц и фибронектин, тесты функции почек, ультразвук, магнитно-резонансную томографию (МШ) и сканирование при помощи компьютерной томографии (СТ).
Фармацевтические композиции
Данное изобретение обеспечивает также фармацевтические композиции, которые содержат одно или несколько гуманизированных антител данного изобретения или их фармацевтически приемлемых производных, необязательно с любым фармацевтически приемлемым носителем. Термин носитель в данном контексте включает в себя известные приемлемые адъюванты и носители.
В соответствии с этим изобретением эти фармацевтические композиции могут быть в форме стерильного инъекционного препарата, например стерильной инъекционной водной или масляной суспензии. Эта суспензия может быть приготовлена в соответствии со способами, известными в данной области, с применением подходящих диспергирующих, увлажняющих и суспендирующих агентов.
Фармацевтические композиции этого изобретения могут предоставляться местно, внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно, внутримышечно, интрамедуллярно, интраартикулярно, внутрисуставно, внутригрудинно, внутриоболочечно, внутрипеченочно или интракраниально, по мере необходимости, или просто локально в местах воспаления или в местах опухолевого роста. Фармацевтические композиции данного изобретения могут также вводиться ингаляцией с использованием, например, распылителя, ингалятора для сухого порошка или ингалятора с отмеренными дозами.
Доза и мощность дозы антител данного изобретения, эффективная для получения желаемых эффектов, будут зависеть от подлежащего лечению заболевания, размера субъекта, задачи лечения, конкретной используемой фармацевтической композиции и суждения лечащего врача. Применимы уровни доз приблизительно 0,001-100 мг/кг массы тела в день, например приблизительно 0,1-50 мг/кг массы тела в день активного соединения-ингредиента. Например, антитело этого изобретения будет вводиться в дозе в диапазоне приблизительно 0,01-20 мг/кг массы тела в день, например примерно от 0,1 до 10 мг/кг, при интервалах каждые один-четырнадцать дней. В другом варианте осуществления указанное антитело вводят в дозе приблизительно 0,3-1 мг/кг массы тела при внутрибрюшинном введении. Еще в одном варианте осуществления указанное антитело вводят в дозе приблизительно 5-12,5 мг/кг массы тела при внутривенном введении. В одном варианте осуществления композицию антител вводят в количестве, эффективном для обеспечения уровня антитела в плазме по меньшей мере 1 мг/мл.
Другие подходящие дозы и схемы введения и способы введения будут известны специалистам с обычной квалификацией в данной области; другие дозы описаны с дополнительными подробностями ниже.
Лиганды, связывающиеся с интегрином <χνβ6
В дополнительном варианте осуществления данное изобретение относится также к способам идентификации метастатических раковых клеток или предсказания метастатического потенциала клеток в опухоли (т. е. вероятности, что клетки в этой опухоли будут метастазировать из участка первичной опухоли во вторичный, или метастатический, участок щ νί\Ό) определением уровня экспрессии интегрина </.νβ6 этими клетками, причем увеличение экспрессии </.,.·β6 в поверхности клетки указывает на то, что эта раковая клетка с большей вероятностью должна быть метастатической. В родственных вариантах осуществления данное изобретение относится к способам элиминации оставшихся опухолевых клеток, которые экспрессируют σνβ6, в частности метастатических опухолевых клеток, после медицинского вмешательства для удаления опухоли (например, хирургического удаления этой опухоли или химиотерапевтического или радиотерапевтического уменьшения или удаления этой опухоли). В дополнительных родственных вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способы идентификации неинвазивных форм карциномы, в частности аденокарцином или карцином ш δίΐιι (таких как внутрипротоковая карцинома преинвазивная щ δίΐιι (Όί.’Ι8) или дольчатая карцинома ш δίΐιι (ЬС18) молочной железы), кото
- 27 016342 рые с большей вероятностью прогрессируют в инвазивную или метастатическую форму. Некоторые подобные варианты осуществления предусматривают определение уровня экспрессии интегрина ανβ6 в клетках этой карциномы или в миоэпителии, окружающем эту карциному, в срезах ткани, полученной от пациента, страдающего от такой карциномы, причем увеличенный уровень экспрессии интегрина ανβ6 относительно проб неопухолевой ткани (в идеале, из того же самого органа того же самого пациента) указывает на то, что эта карцинома с большей вероятностью будет прогрессировать в инвазивную или метастатическую форму рака через некоторое время в ближайшем будущем. В каждом таком варианте осуществления данное изобретение основывается на идентификации или эксплуатации увеличенной экспрессии ανβ6 в опухолевых клетках, причем эту идентификацию выполняют контактированием ткани, опухоли или опухолевых клеток с одним или несколькими лигандами, которые связываются с интегрином ανβ6 в этой ткани, опухоли или опухолевых клетках. В некоторых вариантах осуществления эти ткань, опухоль или опухолевые клетки являются тканями, опухолями или опухолевыми клетками карциномы, в том числе тканями, опухолями или опухолевыми клетками из таких карцином, как аденокарциномы. В более конкретных вариантах осуществления этой карциномой является карцинома молочной железы, эндометриальная карцинома, панкреатическая карцинома, колоректальная карцинома, карцинома легкого, карцинома яичника, карцинома шейки матки, карцинома предстательной железы, карцинома печени, карцинома пищевода, карцинома головы и шеи, карцинома желудка или карцинома селезенки. Более конкретно, этой карциномой является карцинома молочной железы (в том числе карцинома молочной железы ίη Щи, такая как внутрипроточная карцинома ίη кби (Όί.Ί8>) или дольчатая карцинома ίη κίΐιι (ЬС18), карцинома эндометрия, панкреатическая карцинома, колоректальная карцинома, карцинома шейки матки или карцинома легкого).
В некоторых вариантах осуществления данного изобретения лиганды, которые связываются с ανβ6, являются антагонистами ανβ6. Такие антагонисты включают в себя, но не ограничиваются ими, антитела, которые специфически связываются с ανβ6; антитела, которые специфически связываются с β6; антитела, которые специфически связываются с αν; антитела, которые специфически связываются с лигандами для ανβ6; лиганды для ανβ6; антисмысловые нуклеиновые кислоты и пептидные, непептидные и пептидомиметические аналоги таких лигандов.
В некоторых подобных вариантах данного изобретения лигандом, который связывается с интегрином ανβ6, является антитело, которое связывается с интегрином ανβ6, или его интегрин ανβ6связывающие фрагменты, варианты или производные. Такие антитела могут связываться с одной субъединицей этого интегрина (например, антитела, которые связываются с эпитопом, расположенным на ανсубъединице, или с эпитопом, который расположен на (^-субъединице) или с обеими субъединицами (например, антитела, которые связываются с эпитопом, который расположен в области гетеродимера интегрина, которая связывает в виде мостиковой связи как αν-, так и β6-субъединицы). Если нет специальной ссылки на полноразмерные антитела, такие как природно встречающиеся антитела, термин ανβ6антитела включает в себя полноразмерные антитела, а также а^6-связывающие фрагменты, варианты, аналоги или производные таких антител, например природно-встречающееся антитело или молекулы иммуноглобулина, или сконструированные молекулы или фрагменты антител, которые связывают антиген способом, сходным со связыванием молекулами антитела. Антитела могут быть синтетическими, моноклональными или поликлональными и могут быть получены способами, хорошо известными в данной области. Для терапевтических применений часто являются предпочтительными моноклональные антитела человека, имеющие константные и вариабельные области иммуноглобулина человека, например, для минимизации иммунной реакции пациента против этого антитела. Такие антитела могут быть получены иммунизацией трансгенных животных, которые содержат гены иммуноглобулина человека (см., например, .ТакоЬоубк е1 а1., Αηη. Ν.Υ. Асаб. 8с1. 764:525-535 (1995)). В связи с синтетическими и полусинтетическими антителами, такие термины включают в себя, но не ограничиваются ими, фрагменты антител, антитела с переключенным изотипом, гуманизированные антитела (например, мышьчеловек, человек-мышь и т.п.), гибриды, антитела, имеющие множественные специфичности, полностью синтетические антителоподобные молекулы и т.п.
Термины антитело и иммуноглобулин используются здесь взаимозаменяемо. Антитело или иммуноглобулин содержит, по меньшей мере, вариабельный домен тяжелой цепи и обычно содержит, по меньшей мере, вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи. Базовые структуры иммуноглобулина в системах позвоночных являются относительно хорошо исследованными. См., например, Наг1о\т е1 а1., Ли1|Ьоб1ек: А ЬаЬогаЮ1у Маииа1 (Со1б 8ρτίη§ НагЬог ЬаЬота1оту Ргекк, 2п6 еб. 1988). Как будет понятно специалистам с обычной квалификацией в данной области, термины антитело и иммуноглобулин включают в себя разные широкие классы полипептидов, которые могут различаться биохимически. Квалифицированным в данной области специалистам будет понятно, что тяжелые цепи классифицируются как γ, μ, α, δ или ε с некоторыми подклассами среди них (например, γ1-γ4). Природу этой цепи определяет класс антитела, например 1дС, 1дМ, 1дЛ, Ι§Ό или 1дЕ соответственно. Подклассы (изотипы) иммуноглобулинов, например 1дС1, 1дС2, 1дС3, 1дС4, 1дЛ1 и т.д., хорошо охарактеризованы и, как известно,
- 28 016342 придают функциональную специализацию. Модифицированные версии каждого из этих классов и изотипов легко распознаются квалифицированным в данной области специалистом с учетом данного описания и, соответственно, находятся в объеме данного изобретения.
Антитела, которые связываются с интегрином ανβ6, или их а^-связывающие фрагменты, варианты или производные, которые пригодны для применения в данном изобретении, включают в себя, но не ограничиваются ими, поликлональные, моноклональные, мультиспецифические антитела, антитела человека, гуманизированные, приматизированные или химерные антитела, одноцепочечные антитела, эпитоп-связывающие фрагменты, например ЕаЬ, ЕаЬ' и Е(аЬ')2, Еб, Εν, одноцепочечные Εν (δοΕν), одноцепочечные антитела, дисульфид-связанные Εν (§6Εν), фрагменты, содержащие Уъ- или Ун-домен, фрагменты, продуцируемые библиотекой экспрессии ЕаЬ, и антиидиотипические (апб-1б) антитела (в том числе, например, апб-1б-антитела к анти-а^-антителам, описанным здесь). Молекулы ксЕу известны в данной области и описаны, например, в патенте США 5892019. Молекулы иммуноглобулина или антител данного изобретения могут быть любого типа (например, 1д0, 1дЕ, 1дМ, 1дБ, 1дА или Ι§Υ), класса (например, 1д01, 1д02, 1д03, 1д04, 1дА1 и 1дА2) или подкласса молекулы иммуноглобулина.
Фрагменты антител, включающие в себя одноцепочечные антитела, могут содержать вариабельную область (вариабельные области) отдельно или в комбинации со всеми или частью из следующих компонентов: шарнирной области, доменов Сн1, Сн2 и Сн3. В данное изобретение включены также антигенсвязывающие фрагменты, также содержащие любую комбинацию вариабельной области (вариабельных областей) с шарнирной областью, доменами Сн1, СН2 и Сн3. Антитела или их иммуноспецифические фрагменты для применения в описанных здесь диагностических и терапевтических способах могут происходить из любого животного, в том числе птиц и млекопитающих. Предпочтительно эти антитела являются антителами человека, мышей, крысы, осла, кролика, козы, морской свинки, верблюда, ламы, лошади, коровы или курицы. Наиболее предпочтительно эти антитела являются антителами человека, гуманизированными или приматизированными антителами или химерными антителами, предпочтительно моноклональными антителами. В данном контексте антитела человека включают в себя антитела, имеющие аминокислотную последовательность иммуноглобулина человека, и включают в себя антитела, выделенные из библиотек иммуноглобулинов человека или из животных, трансгенных в отношении одного или нескольких иммуноглобулинов человека, которые не экспрессируют эндогенные иммуноглобулины, как описано 1пЕга и, например, в патенте США № 5939598, КисЬег1араб с1 а1. В этом контексте термин химерное антитело будет обозначать любое антитело, в котором иммунореактивная область или участок получены или произведены из первого вида, а константная область (которая может быть интактной, частичной или модифицированной в соответствии с данным изобретением) получена из второго вида. В предпочтительных вариантах осуществления мишень-связывающий район или сайт будет происходить из нечеловеческого источника (например, мыши или примата), а константная область является константной областью человека.
Особенно предпочтительные антитела для применения в соответствии с данным изобретением являются моноклональными анти-а^-антителами, такими как описанные в статье ХУетгеЬ е1 а1., I. Βίο1. С’Нет. 279(17):17875-17877 (2004) (описание которой включено здесь в качестве ссылки в полном виде), в том числе моноклональными антителами 6.806 (806) и 6.309 (309), описанными в этой статье. Дополнительные антитела, которые связываются с ανβ6 и которые, следовательно, пригодны для применения в соответствии с данным изобретением, включают в себя антитела (или их фрагменты, варианты или производные), которые связываются с субъединицей β6 интегрина ανβ6 (и которые, следовательно, считаются анти-β6-антителами), такие как антитела, описанные в статье Уешаскег е1 а1., I. Се11 Βίο1. 269:1-9 (1994), которая включена здесь в качестве ссылки в полном виде; и в патенте США № 6692741 В2, который включен здесь в качестве ссылки в его полном виде, в частности в столбцах 2-3 и 7-8 этого патента, в том числе антитела, названные 10Ό5 (депозит АТСС № НВ 12382, депонированный 6 августа 1997 г., Атепсап Туре СиЙиге Со11ес1юп, Р.О. Вох 1549, Мапаккак, УА 20108) (см. патент США № 6692741 в столбцах 3, строчках 7-13 и в столбцах 7-8) и С8β6 (см. патент США № 6692741 в столбцах 78). Подходящие варианты в соответствии с этим аспектом данного изобретения используют ανβ6интегрин-связывающие лиганды, которые являются а^-связывающими антителами или их а.ДТ-эпитопсвязывающими фрагментами. Дополнительные антитела, подходящие для применения в соответствии с этим аспектом данного изобретения, включают в себя, но не ограничиваются ими, а^-связывающие моноклональные антитела, описанные в публикации заявки на патент США № ϋδ 2005/0255102 А1, описание которой включено здесь в качестве ссылки в полном виде, в том числе антитела, названные в ней как 309, 806, 1А8, 2В1, 2В10, 2А1, 2Е5, 1010, 705, 1С5, а также их фрагменты, химеры и гибриды. Особенно предпочтительными антителами для применения в соответствии с данным изобретением являются моноклональные антитела 2В1, 309 и 806.
В некоторых вариантах осуществления эти антитела содержат те же самые полипептидные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи, что и антитело, продуцируемое гибридомой 6.1А8, 6.309, 6.806, 6.2В1, 6.2В10, 6.2А1, 6.2Е5, 7.1010, 7.705 или 7.1С5. Особенно подходящими антителами для применения в соответствии с данным изобретением являются моноклональные антитела, которые содер
- 29 016342 жат те же самые полипептидные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи, что и антитела 2В1, продуцируемые гибридомой 6.2В 1 (депозит АТСС № РТА-3646, депонированный 16 августа 2001 г., Атепсап Τуре СиЙиге Со11ес1юп. Р.О. Вох 1549, Мапаззаз, У А 20108), антитела 806, продуцируемые гибридомой 6.806 (депозит АТСС № РТА-3645, депонированный 16 августа 2001 г., Атепсап Τуре Си1!иге Со11ес11оп. Р.О. Вох 1549, Мапаззаз, УА 20108), и антитела 309, продуцируемые гибридомой 6.309 (депозит АТСС № РТА-3649, депонированный 16 августа 2001 г., Атепсап Τуре СиПиге Со11есиоп. Р.О. Вох 1549, Мапаззаз, УА 20108) (см. опубликованную заявку на патент США № И8 2005/0255102 А1, описание которой включено здесь в качестве ссылки в полном виде, в частности на стр. 1, в абзаце 0008; на стр. 2, в абзаце 0032 и 0036 и в примерах на стр. 6-14), и антитело, названное 10Ό5 (гибридома, секретирующая указанное антитело, была депонирована 6 августа 1997 г. в виде депозита № НВ 12382, Атепсап Τуре СиПиге Со11есиоп. Р.О. Вох 1549, Мапаззаз, УА 20108) (см. патент США № 6692741, описание которого включено здесь в качестве ссылки в полном виде, в частности, в столбце 3, строчках 7-13 и в столбцах 7-8).
В некоторых вариантах осуществления эти антитела содержат тяжелую цепь, определяющие комплементарность районы которой (СОК) 1, 2 и 3 состоят, по существу (т.е. за исключением некоторых консервативных вариаций), из последовательностей, показанных в табл. 1 ниже. В некоторых таких вариантах эти антитела содержат тяжелую цепь, 0ΌΡ1 которой состоит, по существу, из любой из 8Е0 ΙΌ NО: 101-105; 0ΌΡ2 которой состоит, по существу, из любой из 8Е0 ΙΌ NО: 106-111; 0ΌΡ3 которой состоит, по существу, из любой из 8ЕО Ш NО: 112-117; и/или легкой цепи, СОК 1, 2 и 3 которой состоят, по существу, из любой из последовательностей 8Е0 ΙΌ NО: 118-123, 124-127 и 128-133 соответственно.
Таблица 1
Антитело 1 Аминокислотная последовательность 3Εβ Ιϋ ΝΟ:
Последовательности СйК1 тяжелой цепи
866 ΞΥΤΓΤϋΥΑΜΗ 101
1А6 8ΥΤΓ.ΤϋΥΤΜΗ 102
2В1 6ΕΤΓ5Ρ.ΥνΜ5 103
369 бГТГЗВЭТМЗ 103
2А1 ΟΥΟΕΝΝϋΜΕ 104
262 ΟΥΑΓΤΝΥΙΙΕ 105
Последовательности СГОК2 тяжелой цепи
866 νΐΞΤΥΥ6ΝΤΝΥΝΏΚΕΚ6 106
1А8 νΐϋΤΥΥΘΚΤΝΥΝαΚΕΕΟ 107
2В1 3Ι336-63ΤΥΥΡ03νΚ6 108
369 3Ι333-3ΚΜΥΥΡ0ΤνΚ3 109
2А1 νΐΝΡ636ΚΤΝΥΝΕΚΡΚ6 110
262 νΐ3Ρ636ΙΙΝΥΝΕΚΓΚ6 111
Последовательности СОКЗ тяжелой цепи
866 СбЬВКСОКРЗЬКУАМОУ 112
1А8 СбЕККСОкРЗЬРУАМОЗ 113
2В1 ΟΑΙΥϋΟ-----ΥΥνΕΑΥ 114
369 εειγϋο-----γγνΕ₽γ 115
2Ά1 ΙΥΥ6ΡΗ-----3ΥΑΜϋΥ 116
262 Ю-У36-----ΡΥΑνβϋ 117
Последовательности СОК1 легкой цепи
866 ΗΑ305ν3Τ35-Υ5ΥΜΥ 118
1А8 ΚΑ303ν3Ι3Τ-Υ3ΥΙΗ 119
2В1 ЗАЗЗЗУЗЗЗ----Υ5Υ 120
369 3ΑΝ35ν8Ξ3----ΥΕΥ 121
2А1 ΚΑΞΣΟνΚΤΑνΑ 122
262 КАЗОАУИТАУА 123
Последовательности СЕН.2 леткой цепи
- 30 016342
866 ΥΑ5ΝΙ.Ε5 124
1А8 УАЗИЪЕЗ 124
2В1 ЭТЗКЬАЗ 125
3Θ9 ЗТЗИЬАЗ 125
2А1 8Α3ΥΡΥΤ 126
262 5Α5Υ0ΥΤ 127
Последовательности СЩХЗ легкой цепи
806 βΗΝΗΕΙΡΓΤ 128
1А8 СНЗИЕ1РУТ 129
2В1 Η0Η53ΥΡΡΤ 130
369 НОИЗТУРРТ 131
2А1 δβΗΥΕΙΡΗΤ 132
262 оннубурнт 133
В других родственных вариантах осуществления моноклональные антитела, используемые в соответствии с данным изобретением, являются химерными антителами, т.е. антителами, в которых когнатное антитело из одного вида (например, мыши, крысы или кролика) изменяют технологией рекомбинантных ДНК таким образом, что часть или все шарнирные и/или константные области тяжелой и/или легкой цепей заменены соответствующими компонентами антитела из другого вида (например, человека). Обычно, вариабельные домены сконструированного антитела остаются идентичными или, по существу, идентичными вариабельным доменам когнатного антитела. Такое сконструированное антитело называют химерным антителом, и оно является менее антигенным, чем когнатное антитело, при введении индивидууму вида, из которого происходят шарнирная и/или константная область (например, человека). Способы получения химерных антител хорошо известны в данной области.
В других родственных вариантах осуществления моноклональные антитела, используемые в соответствии с данным изобретением, являются полностью человеческими антителами. Способы получения таких полностью человеческих моноклональных антител хорошо известны в данной области (см., например, патент США 2005/0255102 А1 на стр. 4, абзацы 0069-0070, который включен здесь в качестве ссылки).
В других родственных вариантах осуществления моноклональные антитела, используемые в соответствии с данным изобретением, являются гуманизированными версиями когнатных анти-а^-антител, полученных из другого вида. Гуманизированное антитело является антителом, полученным технологией рекомбинантных ДНК, в котором некоторые или все аминокислоты легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина человека, которые не требуются для связывания антигена (например, константные области и каркасные области вариабельных доменов), используют для замены соответствующих аминокислот из легкой или тяжелой цепи когнатного нечеловеческого антитела. В качестве примера, гуманизированная версия мышиного антитела к конкретному антигену имеет как на его тяжелой, так и на его легкой цепи: (а) константные области антитела человека; (Ь) каркасные области из вариабельных доменов антитела человека и (с) СОК из мышиного антитела. При необходимости один или несколько остатков в каркасных областях человека могут быть изменены в остатки в соответствующих положениях в мышином антителе для сохранения связывающей аффинности этого гуманизированного антитела в отношении данного антигена. Это изменение иногда называют обратной мутацией. Гуманизированные антитела обычно с меньшей вероятностью индуцируют иммунную реакцию в людях в сравнении с химерными антителами человека, так как первые содержат значительно меньше нечеловеческих компонентов. Способы получения таких гуманизированных моноклональных антител хорошо известны в данной области (см., например, И8 2005/0255102 А1 стр. 4-5, абзацы 0072-0077, которые включены здесь в качестве ссылки).
В дополнительных подобных вариантах осуществления эти гуманизированные антитела содержат один или несколько СЭК в тяжелой и/или легкой цепях, которые произведены из соответствующих СЭК в тяжелой и/или легкой цепях другого антитела. Одним подходящим неограничивающим примером такого антитела является гуманизированное антитело 309, содержащее СЭКТ легкой цепи, который имеет последовательность СЭКТ легкой цепи, полученную из антитела 2В1 (8ΕΟ Ш ΝΟ: 120), вместо последовательности СЭКТ легкой цепи для депонированного антитела 309 (8Ε0 Ш ΝΟ: 121). Такое гуманизированное антитело 309, имеющее последовательность СЭКТ легкой цепи, представленную в 8Ε0 Ш ΝΟ: 120, называют здесь 1ш309 (или В000011). Другим подходящим неограничивающим примером такого антитела является гуманизированное антитело 806, содержащее СЭКТ легкой цепи, которое имеет последовательность СЭКТ легкой цепи, полученную из антитела 2В1 (8Ε0 Ш ΝΟ: 120), вместо последовательности СЭКТ легкой цепи для депонированного антитела 806 (8Ε0 Ш ΝΟ: 118). Такое гуманизированное антитело 806, имеющее последовательность СЭКТ легкой цепи, представленную в 8Ε0 Ш ΝΟ: 120, называют здесь 1ш809. Дополнительные примеры таких антител-производных, в которых один или
- 31 016342 несколько СОЯ тяжелой цепи и/или легкой цепи заменены одним или несколькими соответствующими СОЯ тяжелой цепи или легкой цепи из другого антитела и которые пригодны для применения в соответствии с данным изобретением, будут вполне очевидными квалифицированным в данной области специалистам с учетом последовательностей, изображенных в табл. 1, и обеспеченного здесь руководства. Подходящие способы получения таких гуманизированных антител, в том числе таких производных гуманизированных антител, известны квалифицированным в данной области специалистам и представлены, например, в опубликованной заявке США № 2005/0255102 А1, описание которой включено здесь в качестве ссылки.
Конъюгаты и другие модификации а^-связывающих лигандов
В некоторых вариантах осуществления лиганды, например антитела, которые связываются с ανβ6, могут быть использованы в неконъюгированной форме. В других вариантах осуществления эти лиганды, например антитела, которые связываются с ανβ6, могут быть конъюгированы, например, с детектируемой меткой, лекарственным средством, пролекарством или изотопом.
В некоторых способах данного изобретения, описанных более подробно ниже, таких как способы детектирования экспрессии «νβ6 в клетках или тканях в качестве критерия метастатического потенциала опухолевых клеток или в качестве способов идентификации карцином ίη δίΐιι (например, ЭС18 или ЬС18) в тканях, «^-связывающие лиганды (например, антитела) ,конъюгируют с одной или несколькими детектируемыми метками. Для таких применений «.//-связывающие лиганды, например ανβ6связывающие антитела, могут быть детектируемо помечены ковалентным или нековалентным присоединением хромогенного, ферментного, радиоизотопного, изотопного, флуоресцентного, токсичного, хемилюминесцентного агента, контрастного агента для ядерного магнитного резонанса или другой метки.
Примеры подходящих хромогенных меток включают в себя диаминобензидин и 4-гидроксиазобензол-2-карбоновую кислоту.
Примеры подходящих ферментных меток включают в себя малатдегидрогеназу, стафилококковую нуклеазу, δ-5-стероидизомеразу, дрожжевую алкогольдегидрогеназу, а-глицеролфосфатдегидрогеназу, триозофосфатизомеразу, пероксидазу, щелочную фосфатазу, аспарагиназу, глюкозооксидазу, βгалактозидазу, рибонуклеазу, уреазу, каталазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, глюкоамилазу и ацетил холинэстеразу.
о 111 1 ОС 1 ^1 'З.'У ос 1 Л ^1
Примеры подходящих радиоизотопных меток включают в себя Н, Ιη, I, I, Р, 8, С, Сг, 57Ре, 58Со, 59Ре, 75 8е, 152Еи, 90Υ, 67Си, 217А!, 211А!, 212РЬ, 478с и 109Рб и т.д. ш1п является предпочтительным изотопом при использовании визуализации ίη угуо, так как он позволяет избежать проблемы дегалогенирования 125Ι- или 1311-меченных «//-связывающих лигандов печенью. Кроме того, этот радионуклид имеет более предпочтительную энергию γ-излучения для визуализации (Регктк е! а1., Еиг. ί. Жс1. Меб. 10:296-301 (1985); Сага5С.|ш11о е! а1., 1. Жс1. Меб. 28:281-287 (1987)). Например, 1ΠΙη, связанный с моноклональными антителами с 1-(Р-изотиоцианатобензил)-ОРТА обнаружил низкое поглощение в неопухолевых тканях, в частности в печени, и, следовательно, увеличивает специфичность опухолевой локализации (Ек!еЬап е! а1., 1. Жс1. Меб. 28:861-870 (1987)).
Примеры подходящих нерадиоактивных изотопных меток включают в себя 1576б, 55Мп, 162Эу, 52Сг и 56Ре.
Примеры флуоресцентных меток включают в себя 152Еи-метку, флуоресцеиновую метку, изотиоцианатную метку, родаминовую метку, фикоэритриновую метку, фикоцианиновую метку, аллофикоцианиновую метку, зеленый флуоресцирующий белок (6ЕР), метку в виде о-фталевого альдегида или флуо рескаминовую метку.
Примеры подходящих токсиновых меток включают в себя дифтерийный токсин, рицин и холерный токсин.
Примеры хемилюминесцентных меток включают в себя люминоловую метку, изолюминоловую метку, метку в виде акридинийзамещенного ароматического сложного эфира, имидазольную метку, метку в виде соли акридиния, метку в виде оксалатного эфира, люцифериновую метку, люциферазную метку и эквориновую метку.
Примеры контрастирующих агентов ядерного магнитного резонанса включают в себя ядра металлов, таких как 6б, Мп и железо.
Типичные способы связывания вышеописанных меток с «.//-связывающими лигандами, например, с «.//-связывающими антителами, обеспечены Кеппебу е! а1., Сйп. СЫт. Ас!а 70:1-31 (1976) и 8с1шг5 е! а1., С1т. СЫт. Ас!а 81:1-40 (1977). Способы связывания, упомянутые в последней ссылке, представляют собой способ с использованием глутарового альдегида, периодатный способ, дималеимидный способ, способ с использованием м-малеимидобензил-Угидроксисукцинимидного эфира, все из которых вклю чены здесь в качестве ссылки.
Для применения в некоторых терапевтических подходах данного изобретения, таких как удаление оставшихся опухолевых клеток после хирургии или предупреждение метастазирования, «νβ6связывающие лиганды могут быть конъюгированы с одним или несколькими лекарственными средствами, пролекарствами или изотопами. Предпочтительные подобные конъюгаты содержат один или не
- 32 016342 сколько лигандов, например одно или несколько антител или их фрагментов, производных или вариантов, которые связываются с /νβ6, конъюгированных с одним или несколькими цитотоксическими агентами; такие конъюгаты применимы в способах лечения и предупреждения метастазирования опухолей, обеспеченных этим изобретением. В соответствии с некоторыми такими вариантами этого изобретения (/.,,βζ-связывающий лиганд, например антитело, конъюгируют с цитотоксическим агентом. Цитотоксические, например химиотерапевтические, агенты, применимые в генерировании конъюгатов /νβ6связывающий лиганд-цитотоксический агент, хорошо известны в данной области и включают в себя, но не ограничиваются ими, цисплатин, карбоплатин, оксалиплатин, паклитаксел, мелфалан, доксорубицин, метотрексат, 5-фторурацил, этопозид, мехлоретамин, циклофосфамид и блеомицин. Другие химиотерапевтические агенты, подходящие для применения в соответствии с этим аспектом данного изобретения, хорошо известны и будут известны специалисту с обычной квалификацией в данной области.
Применение конъюгатов одного или нескольких а^-связывающих лигандов, например одного или нескольких а^-связывающих антител, и одного или нескольких низкомолекулярных токсинов, таких как калихеамицин, майтансин (патент США № 5208020), трихотен и СС1065, также рассматривается здесь. В одном варианте осуществления этого изобретения а^-связывающий лиганд конъюгирован с одной или несколькими молекулами майтансина (например, приблизительно 1-10 молекул майтансина на а^-связывающий лиганд). Майтансин может быть, например, превращен в Мау-88-Ме, который может быть восстановлен до Мау-8Н3 и может взаимодействовать с модифицированными а^-связывающими лигандами (Сйап е! а1. Сапсег Кекеагсй 52:127-131 (1992)) с образованием конъюгата майтансиноид-а^связывающий лиганд.
Альтернативно, а^-связывающий лиганд может быть конъюгирован с одной или несколькими молекулами калихеамицина. Антибиотики семейства калихеамицина способны производить разрывы в двухцепочечной ДНК при субпикомолярных концентрациях. Структурные аналоги калихеамицина, которые могут быть использованы, включают в себя, но не ограничиваются ими, γ1 1, «Л а Л Ν-ацетил-у!1, Р8ΆΟ и Ф11 (Нштап е! а1. Сапсег Кекеагсй 53:3336-3342 (1993) и Йобе е! а1. Сапсег Кекеагсй 58:2925-2928 (1998)).
Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые могут быть использованы для получения конъюгатов с одним или несколькими а^-связывающими лигандами, например с одним или несколькими а^-связывающими антителами, включают в себя А-цепь дифтерийного токсина, несвязывающиеся активные фрагменты дифтерийного токсина, А-цепь экзотоксина (из Ркеибοтοηак аегидтока), А-цепь рицина, А-цепь абрина, А-цепь модекцина, а-сарцин, белки А1еий!ек Гогбп, белки диантина, белки РЬ.у1о1асса атейсапа (РАР1, РАР11 и РАР-8), ингибитор Мотогбюа сйагапйа, курцин, кротин, ингибитор 8аропапа оГйстайк, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин, трикотецены. См., например, АО 93/21232, опубликованный на английском языке 28 октября 1993 г., описание которого включено здесь в качестве ссылки в полном виде. Майтансиноиды могут быть также конъюгированы с одним или несколькими а^-связывающими лигандами, например с одним или несколькими (/.„(Р,связывающими антителами.
Данное изобретение дополнительно рассматривает а^-связывающие лиганды, конъюгированные с соединением с нуклеолитической активностью (например, рибонуклеазой или ДНК-эндонуклеазой, такой как дезоксирибонуклеаза; ДНКаза).
Различные радиоактивные изотопы также доступны для получения радиоконъюгированных а^связывающих лигандов для применения в терапевтических способах этого изобретения. Примеры включают в себя 211А!, 131Ι, 125Ι, 90Υ, 186Ке, 188Ке, 1538т, 212Βί, 32Р и радиоактивные изотопы Ьи.
Конъюгаты а^-связывающих лигандов и цитотоксических агентов могут быть получены с использованием бифункциональных белоксвязывающих агентов, таких как №сукцинимидил-3-(2пиридилдитиол)пропионат (8РЦР), сукцинимидил-4-(Ы-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат, иминотиолан (ΙΤ), бифункциональных производных имидоэфиров (таких как диметиладипимидат-НС1), активных сложных эфиров (таких как дисукцинимидилсуберат), альдегидов (таких как глутаровый альдегид), бис-азидосоединений (таких как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производных бис-диазония (таких как бис(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианатов (таких как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активных соединений фтора (таких как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицин может быть получен, как описано в Уйейа е! а1., 8с1епсе 238:1098 (1987). 14Углерод-меченная 1изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (МХ-О'ГРА) является примером хелатообразующего агента для конъюгации радионуклида с а^-связывающим лигандом. См. АО 94/11026. Этот линкер может быть расщепляемым линкером, облегчающим высвобождение цитотоксического лекарственного средства в клетке. Например, может быть использован кислотолабильный линкер, чувствительный к пептидазе линкер, диметилсодержащий линкер или дисульфидсодержащий линкер (Сйай е! а1., Сапсег Кекеагсй 52:127-131 (1992).
Альтернативно, слитый белок, содержащий а^-связывающий лиганд и цитотоксический агент, может быть получен, например, рекомбинантными способами или пептидным синтезом.
- 33 016342
Еще в одном варианте осуществления «.//-связывающий лиганд может быть конъюгирован с рецептором (таким как стрептавидин) для утилизации в предварительном нацеливании, причем конъюгат «//-связывающий лиганд-рецептор вводят пациенту с последующим удалением несвязанного конъюгата из кровотока с использованием агента клиренса и затем введением лиганда (например, авидина), который конъюгирован с цитотоксическим агентом (например, радионуклидом).
«.//-связывающие лиганды данного изобретения могут быть также конъюгированы с активирующим пролекарство ферментом, который превращает пролекарство (например, пептидильный химиотерапевтический агент, см. ν0 81/01145) в активное лекарственное средство. См., например, ν0 88/07378 и патент США № 4975278. Ферментный компонент таких конъюгатов включает в себя любой фермент, способный действовать на пролекарство таким образом, что оно превращается в более активную цитотоксическую форму.
Ферменты, которые применимы в этом способе данного изобретения, включают в себя, но не ограничиваются ими, щелочную фосфатазу, применимую для превращения фосфатсодержащих пролекарств в свободные лекарственные средства; арилсульфатазу, применимую для превращения сульфатсодержащих пролекарств в свободные лекарственные средства; цитозиндезаминазу, применимую для превращения нетоксичного 5-фторцитозина в противораковое лекарственное средство, 5-фторурацил; протеазы, такие как протеаза 8егга(1а, термолизин, субтилизин, карбоксипептидазы и катепсины (такие как катепсины В и Ь), которые применимы для превращения пептидсодержащих пролекарств в свободные пролекарства; Ό-аланилкарбоксипептидазы, применимые для превращения пролекарств, которые содержат Όаминокислотные заместители; углеводрасщепляющие ферменты, такие как 0-галактозидаза и нейраминидаза, применимые для превращения гликозилированных пролекарств в свободные лекарственные средства; Р-лактамазу, применимую для превращения лекарственных средств, дериватизованных Рлактамами, в свободные лекарственные средства; и пенициллинамидазы, такие как пенициллин Vамидаза или пенициллин С-амидаза, применимые для превращения лекарственных средств, дериватизованных на их аминных атомах азота феноксиацетильной или фенилацетильной группами, соответственно, в свободные лекарственные средства.
Ферменты могут быть ковалентно связаны с «.//-связывающим лигандом способами, хорошо известными в данной области, такими как использование гетеробифункциональных сшивающих агентов. Альтернативно, слитые белки, содержащие, по меньшей мере, антигенсвязывающую область «νβ6связывающего лиганда этого изобретения, связанную, по меньшей мере, с функционально активной частью фермента, могут быть сконструированы с использованием способов рекомбинантных ДНК, хорошо известных в данной области (см., например, №иЬегдег е1 а1., №Шге 312:604-608 (1984)).
Диагностика и прогнозирование заболеваний
Теперь было обнаружено, что клетки из некоторых опухолей, которые являются метастатическими, экспрессируют значимо увеличенные уровни интегрина «νβ6 при сравнении с клетками, которые являются менее метастатическими или неметастатическими. Кроме того, авторы этого изобретения обнаружили, что в некоторых формах преинвазивной, ίη кйи, карциномы, например внутрипротоковой карциномы ίη 511и (ΌΟΙ8) или дольчатой карциномы ίη /Ш (ΕΟΙ8) молочной железы, миоэпителий, окружающий опухоль, экспрессирует значимо увеличенные уровни интегрина «νβ6 относительно опухолевых клеток этой карциномы и относительно нормальной ткани молочной железы. Таким образом, это изобретение обеспечивает способ, применимый в диагностике метастатического потенциала опухолевой клетки, в том числе опухолей из карцином, таких как аденокарцинома. В более конкретных вариантах осуществления этой карциномой является карцинома молочной железы, карцинома эндометрия, панкреатическая карцинома, колоректальная карцинома, карцинома легкого, карцинома яичника, карцинома шейки матки, карцинома предстательной железы, карцинома печени, карцинома пищевода, карцинома головы и шеи, карцинома желудка или карцинома селезенки. Более конкретно, эта карцинома является раком молочной железы (в том числе, но не только, раком ίη /Щ молочной железы, таким как внутрипротоковый рак ίη /Ιίί (ΌΟΙ8) или дольчатая карцинома ίη /Щ (ΕΟΙ8)), раком эндометрия, панкреатическим раком, колоректальным раком, раком шейки матки или раком легкого.
Способы в соответствии с этим аспектом данного изобретения включают в себя анализ уровня экспрессии «νβ6 в опухолевых клетках или в миоэпителии в пробе ткани и сравнение этих уровней экспрессии со стандартным уровнем экспрессии «νβ6 (например, в нормальных клетках, неметастатических клетках или нормальной ткани, предпочтительно полученной от того же самого животного, например пациента-человека), где увеличение экспрессии «νβ6 в опухоли или в ее клетках указывает на более высокий инвазивный и/или метастатический потенциал этой опухоли или ее клеток, или где увеличение экспрессии «νβ6 в миоэпителии, окружающем опухоль, или кластер эпителиальных клеток в срезе ткани указывает на присутствие ίη /Щ карциномы, например ΌΟΙ8 или БОБ, которая с большей вероятностью станет инвазивной и потенциально будет образовывать метастазы.
Если диагноз рака уже был выполнен в соответствии с общепринятыми способами, данное изобретение применимо в качестве прогностического показателя, посредством которого будет предсказано, что опухолевые клетки, обнаруживающие увеличенные уровни экспрессии «νβ6, с большей вероятностью
- 34 016342 будут становиться инвазивными и метастазировать из первичного участка опухоли в дистальный метастатический участок. Подобным образом, если предполагаемый диагноз ίη δίΐιι карциномы был выполнен в соответствии с общепринятыми способами (например, маммаграфическим детектированием обызвествленных узелков в молочной железе), данное изобретение применимо в качестве подтверждающего показателя, посредством которого ткань биопсии из зоны обызвестления (кальциноза), проявляющая увеличенные уровни экспрессии ανβ6 в миоэпителии, свидетельствует о присутствии ίη δίΐιι карциномы, например ЭС18 или ЬС18, которая будет становиться инвазивной и может отвечать на лечение ο^-ιΑΚ На основании таких прогностических и диагностических результатов лечащий врач может затем корректировать программу лечения соответствующим образом, обеспечивая посредством этого более раннее обнаружение преметастатического или предракового состояния и, следовательно, более благоприятный клинический исход для пациента.
Под термином анализ уровней экспрессии ανβ6 имеют в виду качественное или количественное измерение или оценивание уровней ανβ6 в первой биологической пробе (например, пробе опухоли, биопсии ткани или аспирата и т.д.), или прямо (т.е. определением или оцениванием уровня экспрессии ανβ6 в этой пробе), или относительно (например, сравнением уровня экспрессии ανβ6 в первой биологической пробе относительно уровня экспрессии ανβ6 во второй биологической пробе). Предпочтительно уровень ανβ6 в первой биологической пробе измеряют или определяют и сравнивают с уровнем ανβ6 в стандарте, взятом из второй биологической пробы, полученной от индивидуума, не имеющего рака или предракового патологического изменения. Как будет понятно квалифицированному в данной области специалисту, после того как стандартный уровень экспрессии ανβ6 становится известным для конкретной нераковой ткани, его можно использовать повторно много раз в качестве стандарта для сравнения.
Биологическая проба обозначает любую биологическую пробу, полученную от индивидуума (например, пациента), из клеточной линии, культуры ткани или другого источника, который может содержать клетки или клеточные продукты, такие как внеклеточный матрикс. Такие биологические пробы включают в себя ткани и клетки тела млекопитающего, в том числе лейкоциты, ткани яичника, предстательной железы, сердца, плаценты, поджелудочной железы, печени, селезенки, легкого, молочной железы, головы и шеи (например, ткани полости рта, фарингеальные, язычные и ларингеальные ткани), ткани эндометрия, ободочной кишки (или колоректальные ткани), шейки матки, желудка и умбиликальные ткани, которые могут экспрессировать ανβ6. Способы получения биопсий тканей и жидкостей тела от млекопитающих хорошо известны в данной области. Предпочтительные млекопитающие включают в себя мартышек, обезьян, кошек, собак, свиней, лошадей, кроликов и людей. Особенно предпочтительными являются люди.
Определение уровней экспрессии ανβ6 в биологической пробе может проводиться с использованием любого известного в данной области способа. Предпочтительными для анализа уровней экспрессии ανβ6 в биологической пробе являются иммунологические способы. Например, экспрессия ανβ6 в тканях может исследоваться классическими иммуногистологическими способами. В них специфическое узнавание обеспечивается первичным лигандом, например антителом (поликлональным или моноклональным), который связывается с ανβ6. Этот первичный лиганд может быть меченным, например, флуоресцентной, хемилюминесцентной, фосфоресцентной, ферментной или радиоизотопной меткой. Альтернативно, эти способы данного изобретения могут использовать систему вторичного детектирования, в которой второй лиганд, который узнает а^6-связывающий лиганд и связывается с а^-связывающим лигандом, например, так называемое вторичное антитело, которое узнает первое а^6-связывающее антитело и связывается с первым α,,βί,-связывающим антителом, является детектируемо меченным, как описано выше. В результате получают иммуногистологическое окрашивание среза ткани для патологического обследования. Альтернативно, пробы тканей и клеток могут быть экстрагированы, например, мочевиной или нейтральным детергентом для высвобождения белка ανβ6 для Вестерн-блоттинга или дот-слот-анализа (1а1капеп, М., е1 а1., 1. Се11. Вю1. 101:976-985 (1985); 1а1капеп, М., е1 а1., 1. Се11. Вю1. 105:3087-3096 (1987)) для прямого количественного определения относительно стандартной пробы ткани или клеток, о которых известно, что они имеют более низкие уровни экспрессии ανβ6.
Как отмечалось выше, способы данного изобретения применимы для детектирования метастатических типов рака у млекопитающих, для определения метастатического потенциала опухолевой клетки (т.е. предсказания вероятности того, что рассматриваемая опухолевая клетка будет метастазировать из участка первичной опухоли в дистальный метастатический участок) и для определения вероятности того, что неинвазивная или т δίΐιι карцинома будет прогрессировать в инвазивную или метастатическую карциному. В частности, способы этого изобретения применимы в детектировании инвазивных и/или метастатических типов рака эпителиальных тканей (т.е. инвазивных и/или метастатических карцином), включающих в себя ткани молочной железы, яичника, предстательной железы, печени, легкого, поджелудочной железы, ободочной кишки (или колоректальные ткани), головы и шеи (например, ткани полости рта, фарингеальные, язычные и ларингеальные ткани), ткани эндометрия, шейки матки, желудка и селезенки. Особенно подходящими для детектирования способами данного изобретения, но не только, являются
- 35 016342 инвазивные и/или метастатические аденокарциномы, в том числе, но не только, карциномы молочной железы, панкреатические карциномы, колоректальные карциномы, карциномы шейки матки, карциномы легкого и ίη δίΐιι карциномы, такие как определенная внутрипротоковая карцинома ίη δίΐιι (ΌΟ8) или дольчатая карцинома ίη δίΐιι (ЬС18) молочной железы, которые имеют увеличенную вероятность прогрессирования в инвазивный и/или метастатический фенотип. Ранняя идентификация и раннее лечение таких карцином связаны с улучшенным долгосрочным прогнозированием для пациентов. Например, сообщалось, что без лечения значительная доля опухолей ОС.Ч8 становится инвазивной и может привести к метастатическим типам рака, которые имеют гораздо худший прогноз (см. ЗакогаТак, 0.Н., апб ΤδίοΙου, А.0.Н., Сапсег ТгеабпеШ Кеу. 26:103-125 (2000)).
Таким образом, данное изобретение рассматривает способы лечения или предупреждения метастатических типов рака идентификацией прединвазивных повреждений или карцином у пациентов и лечение пациента для элиминации прединвазивного патологического изменения, до того как оно имеет возможность развития в инвазивную форму. Такие способы предусматривают, например, (а) получение пробы ткани, в которой предполагается присутствие рака или прединвазивного патологического изменения и образец ткани, которая не содержит злокачественных или предзлокачественных изменений (предпочтительно из тех же самых ткани или органа, что и ткань или орган, в котором предполагают присутствие рака или прединвазивного патологического изменения); (Ь) контактирование проб ткани с одним или несколькими а^6-связывающими лигандами, такими как одно или несколько а,Д36-связывающих антител или их фрагментов, в условиях, способствующих связыванию этих одного или нескольких ανβ6связывающих лигандов с интегринами ανβ6 в этой ткани, где бы они ни присутствовали; и (с) детектирование уровня или картины связывании а,Д36-связывающего лиганда а,Д36-связывающих лигандов) с этой тканью, причем увеличение в локализованном связывании а,Д36-связывающего лиганда в миоэпителии, окружающем гиперплазию (например, опухоль), относительно связывания в самой гиперплазии (или ее клетках) или увеличение уровня связывания а,,(36-связывающего лиганда в пробе ткани, содержащей раковое или прединвазивное патологическое изменение, относительно связывания в пробе нераковой ткани (или ее клетках) указывает на наличие карциномы, которая с большей вероятностью будет становиться инвазивной и потенциально метастазировать. В других родственных вариантах осуществления это изобретение рассматривает способы уменьшения или предупреждения прогрессирования предметастатической или прединвазивной опухоли в метастатическую или инвазивную опухоль у пациента, предусматривающие введение этому пациенту терапевтически эффективного количества одного или нескольких лигандов, которые связываются с одной или несколькими субъединицами интегрина ανβ6 на одной или нескольких клетках в предметастатической или прединвазивной опухоли, причем связывание этого лиганда с интегрином приводит к уменьшению или предупреждению инвазии клеток предметастатического или прединвазивного рака в зоны тканей, окружающие первичную опухоль.
Подходящие ткани и органы, из которых могут быть получены пробы для применения в соответствии с этими способами данного изобретения, включают в себя, но не ограничиваются ими, эпителиальные ткани, описанные здесь в другом месте. Карциномы и опухоли, которые могут выгодным образом лечиться или предотвращаться в соответствии с этими способами данного изобретения, включают в себя, но не ограничиваются ими, карциномы, в частности аденокарциномы, в том числе карциномы и аденокарциномы, описанные подробно в другом месте здесь. После детектирования такой карциномы в соответствии со способами этого изобретения эта опухоль может быть удалена из пациента посредством хирургических, химиотерапевтических, радиологических или других способов противораковой терапии, которые хорошо известны в данной области и которые, следовательно, будут известны специалистам с обычной квалификацией в данной области. Альтернативно, такая карцинома может быть элиминирована с использованием способов лечения данного изобретения, введением пациенту или в органы, или ткани этого пациента одного или нескольких а,Д36-связывающих лигандов, таких как одно или несколько ανβ6связывающих антител или их фрагментов. В некоторых неограничивающих примерах таких вариантов один или несколько а,Д36-связывающих лигандов были конъюгированы с одним или несколькими цитотоксическими соединениями или агентами, как описано подробно выше. В дополнительных неограничивающих примерах таких вариантов один или несколько а,Д36-связывающих лигандов, таких как одно или несколько а,Д36-связывающих антител или их фрагментов, вводят субъекту, например пациенту, вместе с одним или несколькими цитотоксическими соединениями или агентами, как описано подробно выше.
В родственных вариантах осуществления данное изобретение рассматривает определение метастатического потенциала опухолевой или раковой клетки измерением экспрессии ανβ6 этой опухолевой или раковой клеткой. В таких вариантах осуществления пробы опухоли или клеток получают от пациента, как описано выше, и анализируют в соответствии с описанными здесь способами на уровень экспрессии ανβ6 на этой опухолевой или раковой клетке. Предпочтительные подобные способы включают в себя иммуногистохимию с использованием а,Д36-связывающих антител (или их фрагментов, вариантов или производных), таких как описанные здесь. В соответствии с этими способами данного изобретения имеется прямая корреляция между уровнем экспрессии ανβ6 опухолевой или раковой клеткой и метастатическим потенциалом этой опухолевой или раковой клетки: увеличение экспрессии ανβ6 опухолевой или
- 36 016342 раковой клеткой указывает на то, что эта опухолевая или раковая клетка с большей вероятностью метастазирует во второй очаг из первичного участка опухоли. Таким образом, уровень экспрессии ανβ6 опухолевой или раковой клеткой может быть использован в качестве прогностического показателя метастатического потенциала опухолевой или раковой клетки, который может помочь раковым пациентам и их лечащим врачам в принятии решений в отношении подходящего лечения на основе присутствующей или предсказанной будущей агрессивности или инвазивности этого рака.
Кроме анализа уровней экспрессии ανβ6 в биологической пробе, полученной от индивидуума, такой как проба ткани или клетки опухоли, уровень и картина распределения экспрессии ανβ6 могут быть также детектированы ш νί\Ό при помощи визуализации. В таких способах этого изобретения один или несколько а^-связывающих лигандов, например одно или несколько а^-связывающих антител, детектируемо метят одной или несколькими метками, подходящими для визуализации ш νί\Ό. Подходящие метки или маркеры для визуализации ш νί\Ό включают в себя метки или маркеры, детектируемые рентгенографией, ЯМР или электронно-спиновым резонансом (Е8В). Для рентгенографии подходящие метки включают в себя радиоизотопы, такие как барий и цезий, которые испускают детектируемое излучение, но не являются явно вредными для субъекта. Подходящие маркеры для ЯМР и Е8В включают в себя маркеры с детектируемым характерным спином, такие как дейтерий.
Связывание лиганда с ανβ6, например а^-связывающего антитела или фрагмента антитела, которые были помечены подходящей детектируемой визуализирующей частью молекулы, такой как радиоизотоп (например, 131Ι, 112Тп, 99тТс), непроницаемое для излучения вещество или материал, детектируемые ядерным магнитным резонансом, вводят (например, парентерально, подкожно или внутрибрюшинно) млекопитающему, подлежащему обследованию в отношении рака или карциномы ш в1!и. Специалистам с квалификацией в данной области будет понятно, что размер субъекта и система визуализации будут определять количество визуализирущей составляющей молекулы, необходимое для получения диагностических изображений. В случае радиоизотопной составляющей для субъекта-человека, количество инъецируемой радиоактивности будет обычно в диапазоне приблизительно 5-20 милликюри 99тТс. Затем меченый лиганд а^, например а^-связывающее антитело или фрагмент антитела, будет преимущественно накапливаться в местоположении клеток или тканей, которые содержат или экспрессируют интегрин а^б. Затем визуализацию опухоли ш νί\Ό выполняют, как описано в 8.ОТ. ВигсЫе1 е! а1., 'Гттипорйагтасокшебсв ок Вабю1аЬе11еб АпбЬоб1ев апб Ткей Ргадтеп!в (Скар!ег 13 т Титог кпащпд: Тке Вабюскетюа1 Ое!ес!юп ок Сапсег, 8.ОТ. ВигсЫе1 апб В.А. Вкобев, ебв., Маввоп РиЬквккщ Шс. (1982)).
Терапевтические применения а,ф6-евязывающих лигандов
В дополнительных вариантах осуществления этого изобретения а^-связывающие лиганды, например а^-связывающие антитела или их фрагменты, могут быть использованы в терапевтических программах для лечения млекопитающих, пораженных некоторыми заболеваниями, в частности некоторыми карциномами, такими как карциномы, описанные здесь в другом месте. Такие способы данного изобретения применимы в лечении рака и ассоциированных событий, включающих в себя рост, метастазирование и ангиогенез опухоли. Особенно поддающимися такому подходу являются болезни или карциномы, которые характеризуются увеличенными уровнями экспрессии а^ в тканях или клетках млекопитающего, страдающего от этого заболевания, и которые являются отвечающими на лечение, которое действует на ткани или клетки, экспрессирующие увеличенные уровни а^ и элиминирует эти ткани или клетки. Заболевания, которые особенно хорошо лечатся этими способами, включают в себя метастатические раковые опухоли эпителиальных тканей (т.е. метастатические карциномы и/или аденокарциномы), включающих в себя ткани молочной железы, яичника, предстательной железы, печени, легкого, поджелудочной железы, ободочной кишки, головы и шеи (например, ткани полости рта, фарингеальные, язычные и ларингеальные ткани), ткани эндометрия, шейки матки, желудка и селезенки. Особенно подходящими для лечения этими способами данного изобретения являются карциномы эндометрия, поджелудочной железы, ободочной кишки (например, колоректальные карциномы), карциномы шейки матки, легкого и молочной железы (в том числе внутрипротоковая карцинома ш в1!и (ΌΟΙ8) и дольчатая карцинома ш в1!и (ЪС.Ч8) молочной железы). Предпочтительные млекопитающие для лечения включают в себя мартышек, обезьян, кошек, собак, коров, свиней, лошадей, кроликов и людей. Особенно предпочтительными являются люди.
В некоторых подобных терапевтических схемах способы этого изобретения являются подходящими для элиминации оставшихся опухолевых клеток, например оставшихся метастатических клеток, после удаления, лечения или ликвидации опухоли другим подходом. Например, такие способы данного изобретения могут быть использованы для элиминации оставшихся опухолевых клеток или метастатических клеток, которые могут оставаться в пациенте после хирургического удаления опухоли или ликвидации опухоли такими способами, как облучение, химиотерапия и т.п. В таких схемах лечения способы данного изобретения могут предусматривать введение а^-связывающих лигандов, например, а^связывающих антител или их фрагментов, пациенту до, во время и/или после хирургического, радиологического и/или химиотерапевтического удаления опухоли.
В родственных вариантах осуществления, как описано выше, данное изобретение обеспечивает
- 37 016342 способы уменьшения или предупреждения прогрессирования преметастатической опухоли в метастатическую опухоль у пациента, предусматривающие введение пациенту терапевтически эффективного количества одного или нескольких лигандов, которые связываются с одной или несколькими субъединицами интегрина /νβ6 на одной или нескольких клетках в преметастатической опухоли, причем это связывание лиганда с интегрином приводит к уменьшению или предотвращению инвазии клеток преметастатического рака в зоны тканей, окружающие первичную опухоль.
В проведении этих терапевтических способов данного изобретения «.^-связывающие лиганды, такие как (/„,β,-,-связывающие антитела или фрагменты антител, могут быть введены пациентам в виде терапевтических готовых форм (которые называются здесь взаимозаменяемо и эквивалентно фармацевтическими композициями). Терапевтические готовые формы «^-связывающих лигандов, используемые в соответствии с данным изобретением, готовят для хранения смешиванием «^-связывающего лиганда, имеющего желаемую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Кетшдоп'к Рйагтасеийса1 8с1епсе§ 16'1' ебйюп, О§о1, А.Еб. (1980)), например, в форме лиофилизированных готовых форм или водных растворов. Кроме фармакологически активных соединений, таких как (/^-связывающие лиганды, композиции, используемые в терапевтических способах этого изобретения, могут содержать также один или несколько подходящих фармацевтически приемлемых носителей, содержащих эксципиенты и добавки, которые облегчают обработку этих активных соединений в препараты, которые могут быть использованы фармацевтически. Фармацевтические препараты данного изобретения готовят способом, который сам по себе известен, например, с использованием способов общепринятого смешивания, грануляции, приготовления драже, растворения или лиофилизации. Таким образом, фармацевтические препараты для орального применения могут быть получены объединением активных соединений с твердыми эксципиентами, необязательно измельчением полученной смеси и обработки этой смеси гранул, после добавления подходящих добавок, если желательно, с получением таблеток или сердцевин драже.
Подходящими эксципиентами являются, в частности, наполнители, такие как сахариды, например лактоза или сахароза, маннит или сорбит, препараты целлюлозы и/или кальцийфосфаты, например трикальцийфосфат или кальцийгидрофосфат, а также связывающие вещества, такие как крахмальная паста, использующая, например, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагакант, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, натрийкарбоксиметилцеллюлоза и/или поливинилпирролидон. Если желательно, могут быть добавлены дезинтегрирующие агенты, такие как вышеуказанные крахмалы, а также карбоксиметилкрахмал, сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота или ее соль, например альгинат натрия. Добавками являются, прежде всего, регулирующие текучесть агенты и смазывающие вещества, например диоксид кремния, тальк, стеариновая кислота или ее соли, такие как стеарат магния или стеарат кальция, и/или полиэтиленгликоль. Сердцевины драже обеспечивают подходящими покрытиями, которые, если желательно, являются устойчивыми к желудочному соку. Для этой цели могут быть использованы концентрированные растворы сахаридов, которые могут необязательно содержать гуммиарабик, тальк, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, растворы лаков и подходящие органические растворители или смеси растворителей. Для получения покрытий, устойчивых к желудочному соку, используют растворы подходящих препаратов целлюлозы, таких как фталат ацетилцеллюлозы или фталат гидроксипропилметилцеллюлозы. К таблеткам или покрытиям драже могут быть добавлены красители или пигменты, например, для идентификации или для характеристики комбинаций доз активных соединений.
Другие фармацевтические препараты, которые могут быть использованы орально, включают в себя пуш-фит-капсулы (с плотной посадкой половинок), изготовленные из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Пуш-фит-капсулы могут содержать активные соединения в форме гранул, которые могут быть смешаны с наполнителями, такими как лактоза, связывающими веществами, такими как крахмалы, и/или смазывающими веществами, такими как тальк или стеарат магния, и, необязательно, стабилизаторами. В мягких капсулах активные соединения предпочтительно растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как жирные масла или жидкий парафин. Кроме того, могут быть добавлены стабилизаторы.
Подходящие композиции для парентерального введения включают в себя водные растворы активных соединений в водорастворимой форме, например в виде водорастворимых солей или щелочных растворов. Щелочные соли могут включать в себя соли аммония, приготовленные, например, с Трисом, гидроксидом холина, бис-Трис-пропаном, Ν-метилглюкамином или аргинином. Кроме того, могут быть введены суспензии активных соединений в виде подходящих масляных инъекционных суспензий. Подходящие липофильные растворители или носители включают в себя жирные масла, например кунжутное масло, или синтетические эфиры жирных кислот, например этилолеат, или триглицериды, или полиэтиленгликоль-400 (эти соединения растворимы в ПЭГ-400). Водные инъекционные суспензии могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, например натрий-карбоксиметилцеллюлоза, сорбит и/или декстран. Не обязательно, эта суспензия может также содержать стабилизаторы.
- 38 016342
Соединения данного изобретения могут быть введены в глаз животных или людей в виде капель или внутрь в виде мазей, гелей, липосом или биосовместимых полимерных дисков, осадков или могут быть внесены в контактных линзах. Внутриглазная композиция может также содержать физиологически совместимый офтальмический носитель, который квалифицированные в данной области специалисты могут выбрать с использованием общепринятых способов. Эти носители могут быть выбраны из известных офтальмических носителей, которые включают в себя, но не ограничиваются ими, воду, простые полиэфиры, такие как полиэтиленгликоль 400, поливинилы, такие как поливиниловый спирт, повидон, производные целлюлозы, такие как карбоксиметилцеллюлоза, метилцеллюлоза и гидроксипропилметилцеллюлоза, производные нефти, такие как минеральное масло и белый вазелин, животные жиры, такие как ланолин, растительные жиры, такие как арахисовое масло, полимеры акриловой кислоты, такие как карбоксиполиметиленовый гель, полисахариды, такие как декстраны и гликозаминогликаны, такие как хлорид натрия и хлорид калия, хлорид цинка и буфер, например бикарбонат натрия или лактат натрия. Могут быть также использованы высокомолекулярные молекулы. Физиологически совместимые консерванты, которые не инактивируют соединения данного изобретения в этой композиции, включают в себя спирты, такие как хлорбутанол, бензалконийхлорид и ЭДТА, или любой подходящий консервант, известный специалистам с квалификацией в данной области.
Лиофилизированные готовые формы антител, приспособленные для подкожного введения, описаны в патенте США № 6267958, описание которого включено здесь в качестве ссылки в полном виде. Такие лиофилизированные готовые формы могут быть воссозданы с подходящим растворителем до высокой концентрации белка, и эта воссозданная готовая форма может вводиться подкожно пациенту, который должен лечиться в соответствии с данным изобретением.
аА6-связывающие лиганды могут быть также захвачены в микрокапсулах, изготовленных, например, способами коацервации или межфазной полимеризацией, например, с использованием гидроксиметилцеллюлозных или желатиновых микрокапсул и поли(метилметакрилатных) микрокапсул, соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственных средств (например, липосомах, альбуминовых микросферах, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах) или в макроэмульсиях. Такие способы описаны в Κет^ηдΐоη'к Р11агтасеиНса1 БЛеисек 164Ь ебШон, Око1, А. Еб. (1980).
Могут быть изготовлены препараты пролонгированного высвобождения а^6-связывающих лигандов. Подходящие примеры препаратов пролонгированного высвобождения включают в себя полупроницаемые матриксы твердых гидрофобных полимеров, содержащие а^6-связывающий лиганд, причем эти матриксы находятся в виде имеющих определенную форму изделий, например пленок или микрокапсул. Примеры матриксов пролонгированного высвобождения включают в себя сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поли(виниловый спирт)), полилактиды (патент США № 3773919), сополимеры Ь-глутаминовой кислоты и γ-этил-Ь-глутамата, недеградируемые сополимеры этилена и винилацетата, деградируемые сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как [.ΟΨΟΝ ЭЕРОТ™ (инъекционные микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и ацетата лейпролида, и поли-Э-(-)-3-гидроксимасляную кислоту.
Готовые формы, подлежащие применению для введения ίη у1уо, должны быть стерильными. Это легко выполняется фильтрованием через мембраны стерильного фильтрования.
α,,βί,-связывающий лиганд может вводиться субъекту или пациенту любым подходящим способом, в том числе парентеральным, внутрилегочным, внутричерепным, чрескожным и интраназальным. Парентеральные инфузии включают в себя внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Кроме того, аА6-связывающий лиганд может удобным образом вводиться импульсной инфузией, например, со снижающимися дозами α,,βί,-связывающего лиганда. Предпочтительно дозы вводят инъекциями, наиболее предпочтительно внутривенными или подкожными инъекциями, в зависимости, отчасти, от того, является ли это введение кратковременным или продолжительным.
В некоторых примерных вариантах осуществления этого изобретения α,,βί,-связывающие лиганды вводят пациенту (например, внутривенно) в дозе приблизительно 1-500 мг/м2. Например, ανβ6связывающий лиганд может быть введен в дозе приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395 или 400 мг/м2.
α,.β,-,-связывающий лиганд может вводиться в соответствии с большим разнообразием схем введения доз. Например, α,,β,-,-связывающий лиганд может вводиться один раз в день в течение заданного периода времени (например, четырех-восьми недель или более) или на недельной основе (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 раз/нед.) в течение предварительно определяемого количества времени (например, от 4 до 8 недель или более). Конкретным примером схемы введения один раз в неделю является введение ανβ6связывающего лиганда в дни 1, 8, 15 и 22 периода лечения. В альтернативных вариантах осуществления α,.β,-,-связывающий лиганд может вводиться периодически на протяжении периода месяцев. Например,
- 39 016342 а^6-связывающий лиганд может вводиться один раз в неделю в течение трех последовательных недель два раза в год (т.е. с повторением схемы введения доз один раз в неделю каждые шесть месяцев). Должно быть понятно, что такие схемы введения могут продолжаться в течение пролонгированных периодов (порядка лет) для поддержания полезных терапевтических эффектов, обеспеченных начальными этапами лечения. В других вариантах осуществления, такая поддерживающая терапия может выполняться после острой схемы введения доз, предназначенной для уменьшения немедленных симптомов ракового, метастатического состояния или состояния карциномы ш кйи.
Количество α,.β,-,-связывающего лиганда, вводимое каждый раз на протяжении периода лечения, может быть одним и тем же; альтернативно, количество, вводимое каждый раз на протяжении периода лечения, может варьироваться (например, количество, вводимое в данный момент, может быть большим или меньшим, чем количество, вводимое ранее). Например, дозы, вводимые во время поддерживающей терапии, могут быть более низкими, чем дозы, вводимые во время острой фазы лечения. Подходящие схемы введения доз в зависимости от конкретных обстоятельств будут очевидными лицам с обычной квалификацией в данной области.
В некоторых вариантах осуществления этого изобретения множественные типы или разновидности α,,βί,-связывающих лигандов объединяют друг с другом и вводят пациенту для лечения одного или нескольких раковых, метастатических состояний или состояния карциномы ш кйи. Например, данное изобретение рассматривает введение двух или более разных а^6-связывающих антител пациенту, таких как описанные здесь. При введении пациенту множественных а^6-связывающих лигандов, эти различные а.ДУ-связывающие лиганды могут вводиться вместе в единой фармацевтической композиции или более предпочтительно могут вводиться последовательно в отдельных дозах. Эффективное количество таких других агентов зависит от количества а^6-связывающего лиганда, присутствующего в этой композиции, типа заболевания или нарушения или лечения и других факторов.
Данное изобретение включает в себя также способы лечения раковых, метастатических состояний или состояний карциномы ш кйи (рака на месте), которые предусматривают введение пациенту первого агента вместе со вторым агентом, причем первый агент является а^6-связывающим лигандом, а второй агент является агентом, который применим для лечения одного или нескольких раковых, метастатических состояний или состояний карциномы ш кйи, но который необязательно является а^6-связывающим лигандом. Под введением первого агента вместе с вторым агентом имеется в виду, что этот первый агент может вводиться пациенту до, одновременно или после введения второго агента пациенту, так что оба агента вводят пациенту во время этой терапевтической программы. Например, согласно некоторым таким вариантам осуществления этого изобретения, а^6-связывающий лиганд вводят пациенту вместе (т.е. до, одновременно или после) с введением антагониста одного или нескольких рецепторов интегрина (например, α1β1, α4β1, ανβ8, ανβ5, α5βι и т.д.) пациенту, в том числе антитела, полипептидных антагонистов и/или низкомолекулярных антагонистов, специфических в отношении одного или нескольких рецепторов интегрина (например, α1β1, α4β1, ανβ8, ανβ5, α5βι и т.д.), которые известны в данной области.
В некоторых вариантах этого аспекта данного изобретения, вторым агентом, который вводят вместе с α,,βί,-связывающим лигандом, является, например, стероид, цитотоксическое соединение (в том числе описанные здесь цитотоксические соединения), радиоизотоп (в том числе описанные здесь), активирующий пролекарство фермент (в том числе описанные здесь активирующие пролекарство ферменты), колхицин, кислород, антиоксидант (например, №ацетилцистеин) и хелатор металла (например, тератиомолибдат), ΣΤΗ-β, ГЕИ-у, α-антитрипсин и т.п. Дополнительные вторые агенты или соединения, которые могут быть введены пациенту вместе с одним или несколькими первыми агентами, такими как ανβ6связывающие лиганды, для терапевтических целей в соответствии с этим аспектом данного изобретения, будут известны квалифицированному в данной области специалисту; таким образом, предполагается, что применение таких дополнительных вторых агентов или соединений включено в данное изобретение.
Специалисту с обычной квалификацией в релевантных областях будет вполне понятно, что другие подходящие модификации и адаптации в отношении описанных здесь способов и применений являются очевидными и могут быть произведены без отклонения от объема данного изобретения или любого его варианта осуществления. После подробного описания данного изобретения оно будет еще более понятным со ссылкой на следующие примеры, которые включены здесь только для целей иллюстрации, а не для ограничения этого изобретения.
Примеры
Пример 1. Клонирование вариабельных областей ти-309.
Тотальную клеточную РНК из мышиных гибридомных клеток 309 получали с использованием мининабора О|адеп К№аку в соответствии с рекомендуемым изготовителем протоколом. Комплементарную кДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой и легкой цепей, клонировали ОТ-ПЦР из тотальной клеточной РНК с использованием набора для синтеза первой цепи кДНК АтегкЬат РЬагтааа в соответствии с рекомендуемым изготовителем протоколом с использованием случайных гексамеров для праймирования.
Праймерами, используемыми для ПЦР-амплификации вариабельного домена тяжелой цепи имму
- 40 016342 ноглобулина 369, были
5' АССТСТАСААУСТССАСАСАСАСбКЙССАСТббАТАОАС 3' (8Е£> И
N0:8;
5' ССбСАТАТССАССАТОКАСТТССбСУТбАССТКССТТТТ 3' (5Е0 Ю
N0:9); (3=0/6, М-А/С, К=А/б, К=С/Т, И=А/Т и У=С/Т).
Эта реакция состояла из начального плавления при 95°С в течение 2,5 мин с последующими 10 циклами плавления при 94°С в течение 30 с, отжига при 60°С -1°С на цикл в течение 45 с и удлинения при 68°С в течение 1 мин с использованием ДНК-полимеразы Тад С1оп!ес1 Абуап!аде. Эту реакцию продолжали в течение дополнительных 10 циклов плавления при 94°С в течение 30 с, отжига при 55°С в течение 45 с, удлинения при 68°С в течение 1 мин и конечного удлинения при 68°С в течение 9 мин. Эти реакции очищали с использованием набора для очистки ПЦР 01адеп 01адшск в соответствии с протоколом изготовителя. Концы амплифицированной Абуап!аде Тад ДНК затупляли для генерирования тупых концов ДНК-полимеразой Т7 в присутствии избытка б№ГР. Очищенные и затупленные ПЦР-продукты гена вариабельной области тяжелой цепи 369 субклонировали в клонирующий вектор рСЯ4В1ип!-ТОРО ΙπνιΙΐΌ^π с использованием их набора для клонирования ТОРО в соответствии с рекомендуемым изготовителем протоколом. ОТ-ПЦР-субклоны тяжелой цепи были названы рК18062.
Ген вариабельного домена легкой цепи 369 амплифицировали с праймерами
5’ ССОТСТАОААСТООАТСОТОООАОАТООА 3' (5Е<2 10 N0:10);
5' бббСАТАТССАССАТССАТТТТСАССТССАОАТТТТСАб 3' (5Е0 Ю
N0:11)
Эта реакция состояла из начального плавления при 95°С в течение 2,5 мин с последующими 6 циклами плавления при 94°С в течение 30 с, отжига при 60°С -1°С на цикл в течение 45 с и удлинения при 68°С в течение 2 мин с использованием ДНК-полимеразы Тад С1оп!ес1 Абуаηίаде. Эту реакцию продолжали в течение дополнительных 24 циклов плавления при 94°С в течение 30 с, отжига при 54°С в течение 45 с, удлинения при 68°С в течение 1 мин и конечного удлинения при 68°С в течение 10 мин. Одну десятую этой реакции использовали в качестве матрицы для второго раунда амплификации с ДНКполимеразой Р£и (8!га!адепе). Эта реакция состояла из начального плавления при 95°С в течение 2,5 мин с последующими 20 циклами плавления при 94°С в течение 30 с, отжига при 55°С в течение 45 с и удлинения при 72°С в течение 1 мин. Эти продукты реакции очищали из геля с использованием набора для экстракции гелей О|адеп Э1адшск в соответствии с рекомендуемым изготовителем протоколом. Очищенные ПЦР-продукты гена вариабельной области легкой цепи 369 субклонировали в клонирующий вектор рСЯ4В1ип!-ТОРО Iηу^!^одеη с использованием их набора для клонирования ТОРО. ОТ-ПЦР-субклоны легкой цепи были названы рК18054.
Инсерты из множественных независимых субклонов как рК18054, так и рК18062 секвенировали. В обоих случаях последовательности инсертов этих множественных субклонов были идентичными. Анализы ВЬА8Т этих последовательностей вариабельных доменов подтвердили их иммуноглобулиновую идентичность. Вариабельный домен тяжелой цепи 369 является членом мышиной подгруппы ΙΙΙΌ. Вариабельный домен легкой цепи 369 является членом мышиной κ-подгруппы ГУ.
Пример 2. Конструирование и экспрессия с1369.
кДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей мышиного 369, использовали для конструирования векторов для экспрессии химер мышь-человек (с1 369), в которых вариабельные области ти369 были связаны с Ι§61 человека и константными областями к.
Для конструирования химеры тяжелой цепи ЕсоШ-фрагмент 508 п.н. из плазмиды рК18062 вариабельного домена тяжелой цепи 369 субклонировали в сайт ЕсоК! линеаризованного дефосфорилированного, полученного из рИС клонирующего вектора рNN09. Эта стадия добавляла фланкирующие сайты ЖН в полученную плазмиду, рК18093. Последовательность тяжелой цепи в плазмиде рК18093 подтверждали секвенированием ДНК. Донорный сайт сплайсинга, за которым следовал непосредственно сайт рестрикции НшбШ, добавляли к плазмиде рК18093 непосредственно справа от кодирующей последовательности вариабельной области сайт-направленным мутагенезом с мутагенными олигонуклеотидами
5' СТСТСТСТССАССТААССТТАСАСССССАТСТС 3' (ЗЕО 10 N0:12),
5' САОАТбОСОбТСТААбСТТАССТбСАСАСАСАС 3' (5Е0 Ю N0:13), с использованием набора для мутагенеза 81га1адепе ОшсксНапде в соответствии с рекомендуемым изготовителем протоколом. Эта стадия генерировала плазмиду рК18116. ^П-НшбШ-фрагмент 0,48 т.п.н. вариабельного домена тяжелой цепи из рК18116 и ^П-НшбШ-фрагмент 1,22 т.п.н. из плазмиды рЕА6964, содержащий константную область Ι§61 человека, субклонировали в сайт произведенной из экспрессирующего вектора ЕВУ рСЕР4 (Iηу^ί^одеη) плазмиды рСН2 69 с получением плазмиды рК18136.
Для конструирования химеры легкой цепи ЕсоШ-фрагмент 474 п.н. из плазмиды рК18054 вариабельного домена легкой цепи 369 субклонировали в сайт ЕсоК! линеаризованного дефосфорилированно
- 41 016342 го клонирующего вектора ρΝΝ09, добавляя фланкирующие сайты ΝοΐΙ в полученную плазмиду рК18112. Последовательность легкой цепи в плазмиде рК18112 подтверждали секвенированием ДНК. Сайт рестрикции ВдШ добавляли к плазмиде рК18112 непосредственно справа от кодирующей последовательности вариабельной области сайт-направленным мутагенезом с мутагенными олигонуклеотидами
5' ЗССАССААССТСОАОАТСТААСЗСССТСАТССТСС 3' (3Εζ) Ιϋ N0:14) , 5' 0САССАТСА5ССС0ТТАСАТСТССАЗСТТССТССС 3' (ЗЕС Ю N0:15), с использованием набора для мутагенеза 81та1адепе Цшсксйапде с генерированием плазмиды рК18132. ΝοΐΙ-ВдШ-фрагмент 453 п.н. вариабельного домена легкой цепи из рК18132 и ΝοΐΙ-ВдШ-фрагмент 678 п.н. из плазмиды рЕА0963, содержащий константную область легкой цепи к человека, субклонировали в сайт ΝοΐΙ произведенной из экспрессирующего вектора ЕВУ рСЕР4 Дпуйтодеп) плазмиды рСН269 с получением плазмиды рК18141. Во время клонирования ти309 было замечено, что первый СОК легкой цепи содержал последовательность сигнала гликозилирования (ΝΧΤ 8).
Единственный раунд сайт-направленного мутагенеза Цшсксйапде с олигонуклеотидами 5' 0СААСТТАСАСТТ0А0СТ66САСТ6САТ0ТСАА00 3' (3ΕΩ Ю N0:16),
5' ССТТСАСАТССАСТОССАССТСААСТСТААСТТСС 3' (5Е0 Ю N0:17), превращающий мотив Ν88 в 888 и создающий экспрессирующий вектор рК18157, удалял эту последовательность сигнала гликозилирования. Последовательность вариабельной области легкой цепи рК18157 подтверждали секвенированием последовательности ДНК.
Экспрессирующие векторы (рК18141 или рК18157 легкой цепи и рК18136 тяжелой цепи) котрансфицировали в клетки 293-ΕВNА и трансфицированные клетки испытывали на секрецию и специфичность антитела. Трансфицированные пустым вектором клетки и клетки, котрансфицированные экспрессирующими векторами ЕВУ для с1М92 (молекулярно клонированного СО 154-специфического тАЬ), служили в качестве контролей. Анализ титров антител с использованием набора Ρ^е^се Еаку Тйет в соответствии с рекомендуемым изготовителем протоколом и Вестерн-блот-анализ (развитый с антителами против тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина человека) из кондиционированной среды показал, что с1309-трансфицированные клетки синтезировали и эффективно собирали тяжелые и легкие цепи и секретировали антитело. ЕЫ8А-анализ против ανβ6 показал, что антитело с1309 связывалось с ανβ6 подобно ти309, тогда как антитело с1М92 не связывалось.
Как показано на фиг. 1, химерное антитело 309 (с1309; указанное трехугольным символом) и дегликозилированная мутантная форма химерного 309, содержащая замену Ν на 8 в Ν-связанном сайте гликозилирования в первом СОК легкой цепи (с13098; указанная квадратным символом), полученные из крупномасштабных транзиторных трансфекций, были очищены и продемонстрировали одинаковое связывание с ανβ6 в анализе ЕЫ8А. Было показано, что удаление сайта гликозилирования в СЭК1 вариабельного домена легкой цепи улучшало экспрессию и очистку белка без изменения связывающей аффинности или влияния на связывающую аффинность этого антитела.
Пример 3. Конструирование версий 1, 2 и 3 1и309.
Конструирование реконструированных вариабельных доменов для получения гуманизированного антитела 309 (1и-309) выполняли следующим образом. Вариабельный домен легкой цепи 309 соответствует цепи к 3 человека, а вариабельный домен тяжелой цепи соответствует подгруппе 3 тяжелой цепи человека. Выбор акцепторных каркасных областей человека выполняли по гомологии соответствия последовательностям зародышевой линии человека с использованием программы 1дВЬА8Т: Ь6 человека (с районом 1, происходящим из 1К4 человека) для легкой цепи и 3-7 человека (с районом 1, происходящим из 1Н4 человека) для тяжелой цепи. Конструировали три версии каждой из реконструированных вариабельных областей легкой и тяжелой цепей, как показано в табл. 1 (Мышиная тяжелая цепь = 8Е0 ΙΌ ΝΟ:81; 309НУ1 = 8ЕС) ΙΌ ΝΟ:82; 309НУ2 = 8ЕС) ΙΌ ΝΟ:83; 309НУ3 = 8ЕС) ΙΌ ΝΟ:84; УН3-7 = 8ЕС) ΙΌ ΝΟ:85; мышиная легкая цепь = 8ЕО ΙΌ ΝΟ:86; 309БУ1 = 8 ЕС) ΙΌ ΝΟ:87; 309БУ2 = 8ЕС) ΙΌ ΝΟ:88; 309БУ3 = 8ЕС) ΙΌ ΝΟ:89; 309БУ4 = 8ЕС) ΙΌ ΝΟ:90; 309БУ5 = 8ЕС) ΙΌ ΝΟ:91 и Ь6 = 8ЕС) ΙΌ ΝΟ:92). Первая версия содержит большинство обратных мутаций в отношении мышиных донорских последовательностей, тогда как третья версия содержит наименьшее их количество (т.е. является наиболее «гуманизированной»). Районы СОК вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей, как показано в табл. 1 ниже, определены общепринятой системой классификации в соответствии с нумерацией Кабата. Однако ниже представлена нумерация этих последовательностей, основанная на относительном линейном расположении этих разных последовательностей относительно друг друга.
- 42 016342
Таблица 1
Последовательности тяжелой и легкой цепи для 1ш3С9 Таблица 1а - последовательности тяжелой цепи
РЯ1 СРК1 РЯ2
Мышиная 11' ЕУми'нзассцукРОСЗькцзсААзсгтре яуумз иуяотрекяьенуа зсэн-.-ι 11 > ЕУ’мьУЕзасаь'.'Ораазьр.ьзсААЗОЕтг’З яуумз нур.оарскоеенуа
ЗОЭНУ2 (и ЕУОЦ'/Е5<ЗОСЦУОРОС5ЦР.Ь5СААЗОЕТЕ5 НУУМЗ НУЯОАРСКСЦЕИУА
ЗОЭНУЗ ί1I ЕУОЬУЕЗСООЕУОРССЗЬЯЬЗСААЗСГТГЗ ЯУУМЗ ИУР.ОАРОКОЬВНУА
УНЗ-7 (И ЕУ9Ь7Е5аааЬУ0₽О05ЬКЬ5СААЗаГТР8 .....НУЕОАРЗГОЦЕИУА срн2 газ
Мышиная '50' 5133 -ОакНУУРЕГГ/Ка нгг15нр$аян1Цуьомззея5еотаягусая ЗС9НУ1 <50’ ЗХЗЗ-ОСЯМУУРРТУКС КРТ15ЯРЗАКЦЗЬУЬаМ№ЬКАЕРТАУУУСАЯ ЗОЭНУ2 150' 3135-аОЯМУУРРТУКО ЯРТГЗЯРЗАКИЗЬУЬаММЗЬЯАЕРТАУУУСАЯ ЗаЭНУЗ <50) ЗТЗЗ-СЮЯМУУРРТУКа ЯЕТГЗЯРЫАКИЕЕУЬОМЧЗЬРАЕРТАУУУСАЯ
УНЗ-7 (30> ·· ............... РТТ13КРЫАКН5ЬУЪдИН5ЬЯАЕОТАУУУСАЯ
Мышиная зоги·’ ЗО9Ь'.:2 ЗСЙЬ'.З ЗСР1ЛЧ ЗС9ЦУ5 1Л
Таблица 1Ь - последовательности легкой цепи па
О1УЬТОЗРА П-15АЗ РС ЕКУТЬТС
ЕIУЦТОЗРАТЕЗЕЗРСЕНАТЕЗС
ЕIУЬТСЗРАТЕЗЬЗРСБЕАТ13С ЕГУЦТОЗРАТЬЗЬЗРСЕЯАТЕЗС ОГ УЦТОЗРАТЕЗЕЗ РСЕР-АТЬЗС
ЕIУЬТОЗ РАТ С 5 Е 5 РС ЕРАТЬЗ С
ΕΙУЕТОЗРАТЬЗЕЗРОЕЯАТЬЗС (11 < 1 ; (и (1> ' 1) (I;
(1)
СРК1
ЗАНЗЗ’ЛЗЗЗУЬ? ЗАЙЗЗУЗЗЗУЕУ ЗАЗЗЗУЗЗЗУЬУ ЗАЗЗЗУЗЗЗУЬУ ЕАЗЗЗУЗЗЗУЬУ ЗАЗЗЗУНЗЗУЪУ * — Я «*<нМ<*м*ж* ряг
НУООКЗСЗЗРКЕИГУ НУ 02ΚΡΟΟΛΡΡ.ΕΗΙ Ϊ НУООКРСОАРЕЕНГУ Н?00КРС0АРНЬН1? нуоокрсоаряцнгт иуоокрсоаряеьгу НУООКРЗОАРЙЬЫ?
Мышиная 30? и·': 51’ 1.5 и СРН2 ЗТЗНЬАЗ ЗТЗИАЗ
3093-/2 (51) 5Т5ШЗА5
309ЕЛ'3 (51 ) ЗТ5Н1АЗ
3091,74 (511 ЗТЗНЬАЗ
3<3?ЬУ5 (51) ЗТЗНЬАЗ
Еб ί 5 а).
?кз
С;/РУЙР5СЗСЗСТЗР5ЬТ153МЕАЕРАА8УРС
СУРУНРЗС5аЗСТРРТЪТ135ЕЕРЕРГА\-УРС
ОУеАЯГ5С503ОТРРТЬТ153ЬЕРЕРГАУУУС
ОI₽АН РЗСЗСЗСТО ГТЪТ133 ЬЕРЕРРАУУУС
О1РАКРЗС5<35СТРРТЬТ133ЬЕРЕРЕАУУУС
СГРАНРЗСЗОЗСТРРТЬТЗЗЗЬЕРЕРРАУУУС
С1 РАКРЗаЗаЗСТРРТЕТ 133ЦЕ реррауу ус
СРКЗ
ВДНЗТУРРТ
Η0Η5ΤΥΡΡΤ
НОНЗТУРРТ
ΗΟΗ3ΊΎΡΡΤ
НОЫЗТУРРТ нонет?ррт
Версии 1 и 2 тяжелой цепи и версии 1, 2 и 3 легкой цепи 1ш3С9 получали синтетически лигированием комбинации фосфорилированных олигонуклеотидов верхней цепи, удерживаемых в сопоставленном положении олигонуклеотидами короткой нижней цепи, ДНК-лигазой Тас.| (№ν Епд1апб В1о1аЬк). Эти реакции инкубировали на протяжении 15 циклов 1 мин при 94°С, 1 мин при 55°С -1°С на цикл и 65°С в течение 4 мин с получением одноцепочечных матричных ДНК, включающих в себя 5'-сайты рестрикции (N011 и ВатИ1), сигнальные последовательности, вариабельные области и удлинение до (легкая цепь) константных доменов или в константные домены (тяжелая цепь) до первого потенциального уникального сайта рестрикции (Вк1У1 для легкой цепи и Аде1 для тяжелой цепи). Праймеры для этих синтетических генов описаны ниже. Эти генные матрицы амплифицировали при помощи ПЦР ДНК-полимеразой Р£и (81га1адепе) с использованием олигонуклеотидов (олиго)
5' бСТСАСАОСООССОССОСАТССАС 3' (ЗЕ<2 Ю N0:18) и
5Г ОСТСАССЗТСАССОеТТССббО 3' (5Е<2 Ю N0:19) для тяжелой цепи и
5' ССТСАСАСССССССССС6АТССАС Зг (ЗЕО Ю N0:20), и
5' ССААСАТСААСАСАСТСССТОССО 3' (ЗЕО 10 N0:21) для легкой цепи с получением двухцепочечных ДНК. Эти реакции состояли из начального плавления при 95°С в течение 2,5 мин с последующими 16 циклами плавления при 94°С в течение 30 с, отжига при 64°С в течение 30 с и удлинения при 72°С в течение 1 мин. Продукты реакции очищали из геля с использованием набора для экстракции гелей О|адеп 01ас.|шск в соответствии с рекомендуемым изготовителем протоколом.
Версию 1 этой тяжелой цепи создавали синтетически из следующих 5'-фосфорилированных олигонуклеотидов верхней цепи
- 43 016342
5оегоАСАасос<хюссасАтсСАссАТоаАСТТСОЦСстсАостс<к;та'П'сст ООТОСТОСТССТОААОСОСОТОСЛОТОСОАСЮТОАТОСТООТООЛОАОССЗОСОО С 3’(5Е<} ИЗ N0: 22).
ЗОаССТСаТОСАОССССОСаОСАСССТСАООСТСАаСТОСОССОССАСССОСП САССГГСАСССОСТАСОТСАТСАОСТОСбЗТбСОССАООСССССООСААОООССТО ОАОтсаатоассла у ($Ер го мо: гз»,
З’САТСАОСАОСООАОСССОСАТОТАСТАССССОАСАССОТОААОООССОСТТСА ССАТСАаССОССАСЛОСаССААОААСАбССТ.аТАССТаСАСАТОААСАСССГСК.· ОСОСССАОСАС 3' (ЗЕр ГО КО: 24).
: АССОСССТСТАСТАСТССОСССОССаСАОС АТСТАСО АССОСГ АСТАСОТаТТС СГССТЛСТООСОССАОСОСАСССТССТаАСССТСЛССТССОССАОСАСС 3' (5ЕО 10 МО; 25).
5‘ЛАСС;С.ССССАС;СОТОТ['СССССГСО£'ССССА<.;САОСААаЛОСАССАС.СООСОО САССОССОССХПХЮаСГОССТСОТСААСЮАСТАСТГССССОААССООТОАСССТС ДОС У (ЗЕр ГО МО: 26).
Эти олигонуклеотиды удерживали в сопоставленном положении следующими нефосфорилированными олигонуклеотидами нижней цепи, которые перекрываются с олигонуклеотидами верхней цепи приблизительно 15 п.н. Олигонуклеотидами нижней цепи являются
ССТОСАССАССССаСССССССТСТСС 3“ (8Еф ΙΟ ΝΟ: 27).
5‘ СС6СГССТСАТОСТОСССАСССАС 3' ΙΟ ΝΟ: 28).
5’ осАатАСТАСАсеессегстсстссесссо з <5ео ю ко: з о»,
5' ОСТСССССССттоатсстессоо 3 (5Ε(Ϊ Ю N0: 30).
Версию 2 этой тяжелой цепи создавали синтетически из следующих 5'-фосфорилированных олигонуклеотидов верхней цепи
5'ОСТа.\САОСС>СССОСС(С.аАТССАССАТОТАСТТСООССГОЛССТООа1'ОП'СС|· аСТОСТСОГССТОА.АСбОСОТССАОТОСОАООТОСАОС'КЮТОСАОАОСТЗОСбО
С 3' (ЗЕр II) МО: 31) 5-ООССТСОТОСАОСССХЮСООСАСССТОАООСТОА<ЭСТСССССаССА<К:бОСТТ СТАгаТСАиССОСТ.иОТОАТОАОСТОСОГССбССАСОСССССС/ОСААООСгССТО αΑΟΤα001ΌΟ0€ΑΟ3·(5ΕρΐΗΝΟ:32). З'САГСАССАОСаСАаоССаСАТОТАСТАСССССАСАССОТОЛЛООаССОСГТСА
ССАТСлае«ЮОЛСАССОССААаААСАСССТОТАССТССАОАТаААСАС, сотое
ОССССОАООАС 3’ (8Е0 ГО N0; 33). 5АССаСССТОТАСГЛСТССЮССС6ССССАОСАТСТАССАСОС,СТАСТАСОТОТТС
СССТАСТССКЗОССАОСОСАСССТССТОАСССТаАОСТССОССАССАСС 3' (ЗЕр го
МО; 34).
5'ААСССССССАОССТСГГГСССССГОСССССаАОСАОСААОАОСАСХЛОСОО€06
САССОССОСССТОСССТОССТССТО.ААООАСТАСТТСССССААССООТОАССОта
АСС 3’(ЗЕр ГОМО; 35)
Эти олигонуклеотиды удерживали в сопоставленном положении следующими нефосфорилированными олигонуклеотидами нижней цепи, которые перекрываются с олигонуклеотидами верхней цепи приблизительно 15 п.н. Олигонуклеотидами нижней цепи являются
5' ОСТС5САССЛООСССССО(Х6СТСТСС Г (51'4 10 N0: 3«).
5’ ССССТСС ТОАТССТССССАСССАС 3” (ЗЕЧ ю N0: 37). 5'ХЗСАОТА<»ТАСАССОССОТСТССТСаССОСС 3” (5Е() 10 КО: 38). 3' ОСТОСОССССТГСетССТССССС 3” (8ЕЦ ω N0: 39).
Экспрессирующие векторы для версий 1 и 2 тяжелых цепей 1ш3С9 получали субклонированием ПоП-ЛдеБфрагментов 538 п.н. вариабельных доменов тяжелой цепи, включающих в себя первые 105 п.н. константной цепи 1дС 1 человека из синтетически генерированных гуманизированных вариантов, и фрагмента ΑдеI-ВатΗI 919 п.н. из плазмиды рК18160, содержащей остаток константной области 1дС1 человека, в расщепленную №(1-ВатН1 плазмиду рК18160 (идентичную произведенному из рСЕР4 (1пу1(годеп) экспрессирующему вектору ЕВV рСН269), с получением экспрессирующих векторов тяжелой цепи рК18166 (версия 1) и РК18167 (версия 2).
Версию 3 тяжелой цепи создавали выполнением единственного раунда ОшсксНапде сайтнаправленного мутагенеза на плазмиде рК18167 с олигонуклеотидами
5’ССАТСАСССССОАСААСОССААСААСАСССТе 3’ (5Е<} 10 КО: 40) И з’ сАШСТстгстгеосогтетсессестСАТСО з' (зеу ю
Полученная плазмида тяжелой цепи версии 3 была названа РК18168. кДНК-последовательности вариабельной области в полученных плазмидах подтверждали секвенированием ДНК.
- 44 016342
Версию 1 легкой цепи создавали синтетически из следующих 5'-фосфорилированных олигонуклеотидов верхней цепи
5’ОСТО.АСАиССЮССОСОСОАТССАС€АТ0ОАСТТССАС>ОТаСАСАТСТТСАОСТТ сстостсатсассстсассстсатсатсасссососсоасатсогостаассу (5Е0 ΪΒ МО: 42), усАОАСсссссссАСссталссстоАассссассаАаАооассАссстсАасто САССаССАССАОСАССаТОАОСАССАССГАССТОТАСТСаТЛССАССАаААССС СООССАСССС 3’ (8Е0 (О ΝΟ: 43),
З’СССАСОСТатОСАТСТАСАССАССАОСААССТСОССАОСООСатаСССаТССОС
ТТСАОСОаСАОСООСАОСООСАС:ССАСТТСАСССТСАССАТСАОСАОССГ<КЗ.АСС
СС0А6САС 3 (5Е0 ГО КО: 44), 5’ТГСССССТОТАСТТСТСССАССАОГОСАССАССТАСССССССЛССТТСОССООС СОСАССААООТООАаАТСААОСбТАСОбТООССССАСССАОТОТОГГСАТСГГГСС 3* (5Е(? ГО ΝΟ. 45).
Эти олигонуклеотиды удерживали в сопоставленном положении следующими нефосфорилированными олигонуклеотидами нижней цепи, которые перекрываются с олигонуклеотидами верхней цепи приблизительно 15 п.н. Олигонуклеотидами нижней цепи являются
5’ ССХХКЮСТСТООСЛ САОСАССгАТС (5Εζ> ГО N0: 4«),
5* ССАСАОССТОСОООССТСОССС 3 (5Е0 (В МО: 47), УОТАСАССОССААОТССТСбООСТС ?' (8Е0 ΙΒ КО; 43).
Версию 2 этой легкой цепи создавали синтетически из следующих 5'-фосфорилированных олигонуклеотидов верхней цепи
УОСТСАСЛОСОСССЮСОиСЛТССЛССАТООАСТТССАООТОСАСАТСТТСАОСТТ
ГСТОеТОАТСАСССТСАаСОтаАТСАТСАОССССОСССАСАТСОГССтаАСС У (ВЕС? ГО КО: 49). 5'САОАОСССиСССАСССТСАОССТСАОССССООСОАОАОСОССАСССГОАбСТС САаСОССАаСАбСАОСаТСАОСАОСАОСТАССТОТлСТОаТАССАССАОААССС;
СООССАСОСС У (ЗЕО 10 КО: 50).
5'СССАООСТСТССАТСТЛСАаСАССАОСААССТО<Х:САОСОасСгеСССаССССС ТТСАОСООСАОСОССАОССОСАССвАСЛТСАСССТОЛССАТСАОСАОССТОалОС ССОАОСАС 3’ (ВЕЦ Ш КО: 51).
5-ттссссотстастастсссассаотосассасстасссссссассттссс;сосс ОССАССААООТООАСАТСААОСОТАССОТОСССОСаСССАСТОТСТТСаТСГТСС
У («Ер 10 КО: 52).
Эти олигонуклеотиды удерживали в сопоставленном положении следующими нефосфорилированными олигонуклеотидами нижней цепи, которые перекрываются с олигонуклеотидами верхней цепи приблизительно 15 п.н. Олигонуклеотидами нижней цепи являются
5* ССООСОСТСТООСТСАССАССАТС Г’ (5Είϊ Ш N0: 53).
5' ССАСАОССТОСОСОССТОСССО г (ί>Ε<? I» ΝΟ: 54),
5’ 0ТАСАССССОААОТССТСОООСТС 3 (КЕЦ ίί) КО: 55).
Версию 3 этой легкой цепи создавали синтетически из следующих 5'-фосфорилированных олигонуклеотидов верхней цепи
5'ССТС АС ЛССООССОСОООА ГССАССАТбОАСТТССАОС ГОСАСАТСТТСАОСТТ ССТОСТЦАТСАОСОГОАОСиТСАТСАТОАСССССССССАСАТСОТаСТСАСС 3' (5£0 ГО КО: 56).
ί ’С АОАОССССЧХ ν «.СС IОАОССГОАОССССОССОЛОАОООССАССС ГОЛОСТО САОСОССАСлАОСАСгСОТСЛСгСАОСАОСТАССТОТАСТбСТАССАССАСААОСС СССССАОССС 3’ (5ЕЦ ГО КО: 57).
5’СССЛОССТОТСОАТСТ.4СЛОСАССАОСААССТСОССАОССиСАТССССССССОС ТТСАСС ОССАОСООС АСХХЯЗС АСС'О АСТТС АСССТО А ССА Т С ДОС А ОС С1ООАОС ССОАСОАС 3 (5Е<? ГО МО: 58).
5-ТТСОССОТОТАСТДСТСССАССлаТООАОСАССТАСССССССАССТТСООСООС ООСАССААСОТООАОАТСААОСОТАСООТ<ЗОССОСАСССА010ТОГТСАГСТГСС ЩЕЦ ГО N0: 59).
Эти олигонуклеотиды удерживали в сопоставленном положении следующими нефосфорилированными олигонуклеотидами нижней цепи, которые перекрываются с олигонуклеотидами верхней цепи
- 45 016342 приблизительно 15 п.н. Олигонуклеотидами нижней цепи являются
5' ОсиОООСГС!ОСОТСАССАСОАТС 3 (5Ε(Ϊ ГО МО: 60). 5' ссАСласстсассассгоасса з~ ικεο ю мо: би. $ а гАСАССссалАОтссгсассстс .г го νο: м».
Экспрессирующие векторы для версий 1, 2 и 3 легких цепей йи3О9 получали субклонированием №!1-Вк1^1-фрагментов 400 п.н. вариабельных доменов легкой цепи из синтетически генерированных гуманизированных вариантов и фрагмента Вк1^1-ВатН1 324 п.н. из плазмиды рК18162, содержащей остаток константной области κ иммуноглобулина человека, в расщепленную №!1-ВатН1 плазмиду рК18160 (также идентичную произведенной из экспрессирующего вектора ЕВУ рСЕР4 (Iηу^ί^одеη) плазмиде рСН269). Полученные плазмиды были названы рК18172 (версия 1), рК18173 (версия 2) и рК18174 (версия 3).
Пример 4. Экспрессия версий 1, 2 и 3 йи3О9 и конструирование версий 4 и 5.
Все возможные комбинации экспрессирующих векторов гуманизированных и химерных тяжелых и легких цепей котрансфицировали в клетки 293-ЕВNА (16 комбинаций).
Трансфицированные клетки испытывали на секрецию и специфичность антител. Вестерн-блотанализ (детектирование с антителами против тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина человека) и анализ с использованием набора Еаку Тйег (Р1егсе) кондиционированной среды показал, что йи3О9трансфицированные клетки синтезировали и эффективно секретировали тяжелые и легкие цепи и что уровни экспрессии, по-видимому, увеличивались с увеличением гуманизации антител. Как показано на фиг. 2, варианты, содержащие версию 1 легкой цепи, экспрессировали слабо, тогда как варианты, содержащие версию 2 легкой цепи, экспрессируют при более высоких уровнях, что предполагает, что увеличение гуманизации склонно приводить к более высокой экспрессии.
ЕАС8-анализ α^-экспрессирующих клеток 8^480, окрашенных кондиционированной средой от трансфицированных клеток, показал, что гуманизация тяжелой цепи 309 не оказывала отрицательного действия на способность этого антитела связываться с α^-экспрессирующими клетками, причем версия 3 тяжелой цепи (версия с привитым СОК) имеет увеличение связывающей активности в сравнении с версиями 1 и 2 (фиг. 3). ЕАС8-анализ показал также, что варианты йи3О9-тАЬ, содержащие версию 3 легкой цепи, связывали слегка менее хорошо, чем варианты, содержащие версию 2 легкой цепи йи3О9, хотя обе версии, по-видимому, связываются так же хорошо, как и химерное антитело 309 (фиг. 3). Имеется различие только 2 аминокислот или 1 аминокислоты между версиями 2 и 3 легких цепей, соответственно, и СОК-привитым 309. Поскольку эти версии легкой цепи имели сходную связывающую активность в отношении ανβ6 в сравнении с химерным 309, были созданы две дополнительные версии для определения, могла бы связывающая активность быть улучшена или могла бы СОК-привитая версия быть функциональной.
Версия 4 позволяла исследовать эффекты замены глутамина на глутаминовую кислоту в положении 1 легкой цепи, а версия 5 является полностью СЭЕ-привитой легкой цепью 309 (табл. 1). Для исследования индивидуальных вкладов каждого из этих изменений конструировали новые экспрессирующие векторы легкой цепи. Плазмиду рК18186, вариант Е10 версии 3 легкой цепи, получали сайт-направленным мутагенезом плазмиды рК18174 с олигонуклеотидами
5‘ОТСЛОСАССАТСТССССССбССТСАТСАТС 3’ ГО МО: 63) И ; САТСАТСАОССаССОССАОАТСОТССТСАС 3‘ (5Е0 ГО МО: 64) с использованием набора для мутагенеза 8!га!адепе Ршсксйапде, и она была названа версией 4 легкой цепи. Плазмиду рК18188, СОК-привитую легкую цепь 309, получали сайт-направленным мутагенезом плазмиды рК18174 с олигонуклеотидами
5' СССАСССТ6СТСАТСТАСА6САСС 3' (ЗЕС ГО N0:65) и
5' ССТССТ6ТАСАТСАССАСССТССС 3' (ЗЕО ГО N0:66), и она была названа версией 5 легкой цепи. Эти версии подтверждали в отношении последовательностей легкой цепи и затем котрансфицировали в клетки 293-ЕВNА с версиями 2 или 3 тяжелой цепи. ЕАС8анализ показал, что версия 3 тяжелой цепи и версия 5 легкой цепи, полностью СОК-привитая пара, связывалась с α^-экспрессирующими клетками равным образом или лучшим образом, чем любая другая пара гуманизированных вариантов (фиг. 4). Спаривание рК18168 и рК18188 было названо версией 5 йи309 (Н3/Ь5).
Котрансфекции клеток 293-ЕВNА сй309 и версиями 2-5 йи309 увеличивали в масштабе и собирали кондиционированную среду. Антитело очищали на протеин А-сефарозе, и очищенные тАЬ анализировали на их активность. Связывание с ανβ6 определяли при помощи ЕАС8-анализа на клеточной линии Е^СР1-β6 (фиг. 5), ЕЫ8А (фиг. 6) и блокированием биотинилированного ανβ6 в отношении ЬАР (фиг. 7). Ранговое соотношение связывающей активности было версия 5 (Н3/Ь5) > версия 3 (Н3/Ь3) = сй309 = версия 2 (Н2/Ь2). Блокирование α^-опосредованной Е^СР1-β6-клеточной адгезии с ЬАР показано на фиг. 8. Ранговое соотношение связывающей активности было сй309 = версия 5 (Н3/Ь5) = версия 2
- 46 016342 (Н2/Б2) > версия 3 (Н3/Т ,3) Поскольку версия 5 была более гуманизированной, чем версия 2, она была выбрана для генерирования стабильной линии клеток СНО.
ДНК-последовательности и соответствующие белковые последовательности различных версий вариабельных доменов тяжелой цепи (версий 1, 2, 3 и 5) и легкой цепи (версий 1-5) 1ш309 показаны в табл. 2. Для вариабельных доменов тяжелой цепи эти последовательности содержат:
(a) РК1 человека, полученный из РК1 УН3-7;
(b) последовательность СЭР1 тяжелой цепи мышиного 309;
(c) РК2 человека, полученный из РК2 УН3-7;
(б) последовательность СЭР2 тяжелой цепи мышиного 309;
(е) РК3 человека, полученный из РК3 УН3-7;
(Г) последовательность СЭР3 тяжелой цепи мышиного 309 и (д) РК4 человека, полученный из консенсусной каркасной последовательности, присутствующей в большинстве антител человека, со следующей последовательностью: \У0О0ТБУТУ88 (8Е0 Ш N0: 151).
Для вариабельных доменов легкой цепи эти последовательности содержат:
(a) РК1 человека, полученный из РК1 Ь6;
(b) последовательность СЭР1 легкой цепи мышиного 309 с аминокислотной заменой аспарагина (Ν) на серии (8);
(c) РК2 человека, полученный из РК2 Ь6;
(б) последовательность СОРТ легкой цепи мышиного 309;
(е) РК3 человека, полученный из РК3 Ь6;
(Г) последовательность СЭР3 легкой цепи мышиного 309 и (д) РК4 человека, полученный из консенсусной каркасной последовательности, присутствующей в большинстве антител человека, со следующей последовательностью: Р000ТКУЕ1К (8Е0 ΙΌ N0: 152).
Таблица 2 Последовательности тяжелой и легкой цепи вариабельных доменов 1ш309
Легкая цепь версии 1 Ии369 (8Е0 Ю N0:67 и ЗЕО Ю N0:139) аАЕмсет(зстеАСссАбА0СССССССАСсстбАесстбАессссбес(ЗАбАеоесСАсс ЕТУЬТОЗеАТЬВЬЗРСЕКАТ
СТЗАС СТ0СА6С ОСС АССА6САСС СТСЛС САСС АС СТ АССТСТАСТСОТ АССАССАСААС ЪЗСЗАЗЗЗ’УЗЗВУЬУЯУООК
121 ССС6СССАСеСССССА36СТ0ТС6АТСТАСА0САССАССААССТС0ССА0СССС0Т0ССС РбОАРВЬИТУЗТЗЫЬАЗС^Р
181 стесссттсассеесАСссбСАссессАссЕАСТтсАссстсАссАТСАесАссстесАс νΚΡ8Η5630ΤΟΕΤΙ.ΤΙ53Χ)Ε
241 ССССА00АСТТСССС0Т0ТАСТТСТ6ССАССАСГС0А0САССТАСССССССАССТТСС0С ΡΕϋΡΑνΥΡΟΗ(3Κ3ΤΥΡΡΤΡ0
301 06ССССАССААССТССА6АТСААС εοτκνεικ
- 47 016342
Легкая цепь версии 2ήιι369 (БЕС) Ю N0:68 и БЕО10 N0:140) бАеАтсетссгсАсссАодоссссессАссстеАссстОАбссссЕсссАсаоесссАсс ЕХУЬТОЗРАТЬЗЬВРСЕКАТ
СТ0АССТССАеС0ССА0САЭСА0СеТ0А0СД0СА6СТАССТ0ТАСТС0ТАССА6СА0АА0 евсзазбзуззбуьуиуоок
121 СССбеССАеОСССССАС6СТСтеОАТСТАСА0САССАОСААССТ05ССА0С03С0ТОССС
Р0ОА.₽кь»1узт8иьазс7р
181 ОССС6СТТСА6СабСАбСС0СА<ЗС00САСС6АСТТСАСССТ0АССАТСА0СА0ССТ66А0
АКЕЗЗВСЗЗТОРТЬТТЗВРЕ
241 СССеАО0АСТТС6СС0Т0ТАСТЛСТ0ССАССАбТ30АОСАССТАСССССССАССТТС30С РЕОГАУУУСНОИЗТУРРТГО
301 66СОеСАССААЕетССА<ЗАТСАА0 οετκνΕίκ
Легкая цепь версии 3 ЬиЗбЭ (БЕО10 N0:69 и БЕО Ю N0:141)
СА6АТСбтеСТ6АСССА6АЗСССС6ССАСССТ6АЕССТ5АеСССС5еС0АбАСС0ССАСС Е1УЬТОЗРАТЬЗЬЗР6ЕКАТ
СТеАбСТбСАОССССАССАОСАвСОтеАбСАбСАЗСТАССТаТАСТЗОТАССАОСАбААе ЕЗСЗАЗЗЗУБЗЗУЕТИУООК
121 СССС0ССА60СССССА0ССТ6Т6САТСТАСАССАССАвСААССТ00СОАеСС0САТСССС
Ρ6ΟΑΡΚΕΝΙΥ3Τ3ΝΕΑ30ΙΡ
181 0СССССТТСА0С60СА0СС0СА0С06САСС0АСТТСАСССТ<дАССАТСАССА0ССТС0АО АНГ30Б65СТОЕТ1.Т13БЪЕ
241 СССНАбОАС'ГТСССССТОТАСТАСТОССАССАСГСеАеСАССТАСССССССАССТТССОС
ΡΕ0ΓΑνΥΥ0ΗΏΗ3ΤΪΡΡΤΓΘ
301 ССССССАССААССТССАЩИСААС ОСТКУВТК
Легкая цепь версии 4 ЬиЗСЭ (БЕО10 N0:70 и БЕО Ю N0:142)
СА0АТССТССТСАСССАСАСССССаССАСССТОА0ССТ0А0ССССО0С6А0А600ССАСС ОТУЬТдЗРАТЬЗЬЗРбЕНАТ
СТСАССТ0САСССССАССАССАаС0ТСАеСАССАССТАССТСТАСТесТАССА6САеАА6
ЬЗСЗАВБЗУЗЗЗУЪУВУООК
121 СССбСССАСССССССАСОСТСТбСАТСТАСАССАССАССААССТеВССАЕССССАТСССС
Ρ00ΑΡΕΕΒΙΥΒΊ3ΝΑΑ3ΘΙΡ
161 ССССОСТТСАСССССАССеесАвССеСАССеАСТТСАСССТбАССЛТСАЗСАОССТССАб
АКГ30565СТ0ГТЬТ153ЬЕ
241 СССеАО<ЗАСТТС0ССОТ6ТАСТАстеССАССА0ТО0А6САССТЛСССССССАССТТСвЗС
РЕОГАУУУСНОИЗТУРРТЕС
301 С0С0ОСАССАА0СТ00А0АТСААС 0ОТКУЕ1К
Легкая цепь версии 5 НиЗОЭ (БЕО Ю N0:71 и БЕО10 N0:143) зАОАтсат0ст0АсссА0Аасссс0ССАСсст0а0сстоА0ссссоес0АбАееассАса
В1УЬТО8РАТЬ8Ъ8Р0ВЙАТ
СТ0А6СТеСА6СеССА6САЗСА6СвТ0А0САССА6СТАССТ0ТАСТ00ТАССАОСА0ААС
ЬЗСЗА83Б733НУЬУ«УйаК
121 ССС00ССАО6СССССАбестеСТ6АТСТАСА0САССАеСААССТ66ССА0СЗ<ЭСАТСССС РбОАРНЬЬГУЗТЗМЬАЗСХ?
181 бССС6СТТСАеССССА6ССССАОССВСАССеАСТТСАСССТ0АССАТСАбСА0ССТ00А0 АКЕЗСЗСВЗТОГТЬТТВЗЬВ
241 ССС0АССАСТТС0СС0Т0ТАСТАСТ0ССАССА0-Г60А5САССТАСССССССАССТТС00С РЕОГАУУУСНОИБТУРРТГС
301 00С00САССАА0бТО0А0АТСАА0
ΟΘΤΚΥΕΙΚ
- 48 016342
Тяжелая цепь версии 1 ПиЗСЭ (5Е0 Ю N0:72 и 5Е<2Ι0 N0:144) сАеетеАтостеотослаАСсеоссесеесстазтесАессссосбоСАСсстеАесстс ЕУМЪУЕЗсееьУОРеЕйькь 61 АестсссссбссАссеосттсАссттсА0сссстасстсАтеАсст5б13тсссссАСссс ЗСААЗеЕ'ТЕ’ЗКХУМЗИУЕОА 121 ССС66СААОеСССТОСАСТ0СЕТ6СССА<ЗСАТСА6САеС60АееСС0САТЗТАСТАСССС РОКОЬЕНУАЗХЗЗаОКМУТР 181 ОАСАСС5ТСАА63ССС6СТТСАССАТСАССС0ССАСАССОССААСААСАСССТСТАССте СТУКОКГТХЗВОЗАКНЗЬГЬ
241 САСАТеААСАЕССТСС6СОССеАеОАСАСС6СС6Т0ТАСТАСТССССССССеССА6САТС 0МИЗЪВ.АЕОТАУУГСАКС31 301 ТАС6АС06СГАСТАС0ТСТТССССТАСТ6066ССА0ебСАСССТбетСАСС6Т6А6СТСС ΥΟεϊϊνΕΡΥΗΟβΕΤΣντνδΕ
Тяжелая цепь версии 2 Ιιιι368 (8Е0 10 N0:73 и 5Е010 N0:145) еАбетбСАестеете(аи5лсс®зсзбссбсст(зо5еСА0сссе<зсбосАссстсАесстб Е7<2ЬУЕ36СеЬУСРС ЗЗЬКГ.
АОСТССССССССАОСОООТТСАССТТСАСССОСТАССТОАТОАОСТСООТеССССАСесС
С А А 3 б Г Т 1’ Й К 2 V И 3 « V Р. й А
121 СССббСААСССССТбСАСТСбСТСОССАОСАТСАССАЕСВвАвЙССЕСДТВТАСТАСССС РСК0ЬЕИ7А31 ЗЗССКИУТР 181 бАСАССбТСААбСеССбСТТСАССАТСАОССбСЕАСАЕССССААЕААСАбССТОТАССТб ΟΤνΚΕΕ₽ΤΙ5ΗΟ3ΆΚΝ3Ι·ΐΙ.
241 САОАТЗдаСАбССТССССеСССАбОАСАСССССеТОТАСТАСТССОСССОСОбСАЗСАТС 0ΜΚ31ΒΑΕϋΤΑνϊϊ6ΑΚ63Ι 301 ТАСбАСЕбСТАСТАСБТеТТССССТАСТЕбОбССАЕЕбСАСССтеСТбАСССТСАвСТСС Υ О С Υ Υ V Г Ρ Υ И б 3 3 Т Ь V Г V 3 3
Тяжелая цепь версий 3 и 5 ПиЗЗЭ (5Е010 N0:74 и ЗЕО10 N0:146) бАебТбСАестестееАаАесббссбссЕсстбствсАссссеесббСАбсстеАебсте ЕУСЬУЕЗССОЬУОРббЗЬНЬ 61 АЕСтессссессАбсвосттсАСсттсАСссбстАсетбАТСАбстбаетесбссАебсс 3 С А А 3 е Г Т Г 3 Η Υ V М 3 И V к с А 121 СОССССААСОбССТОбАбТесеТ6(5ССАОСАТСА6САесе0АеаСС6САТ6ТАСТАСССС РСКЕЬВЙУАЗТЗЗССКМУУР 161 0АСАССЗТОАА0ббССвСТТСАССАТСА6ССбСбАСААСеССАА0ААСАеССТСТАССТ6 ОТУКЙЙЕТ13КОИАККЗЬУЬ 241 САеАТбААСАбССТОССССССбАеЕАСАССЙССеТСТАСТАСТСС&СССССббСАОСАТС йМНЗЬЯАЕОТАУУУСАКбЗТ 301 ТАСеАСЙССТАСТАСбТЗТТССССТАСТСбйеССАСеЗСАСССТеОТЗАССбТСАССТСС ϊοεγγνΕ'ΡΥίϊΰοατϊ.ντνΒΞ
Пример 5. Конструирование стабильных экспрессирующих векторов СНО для дикого типа и версии 5 дегликозилированного (ад1усозу1) 111.1309.
Векторы ЕВУ, описанные выше, содержат периферические 5'- и 3'-υΤΚ (нетранслируемые районы), которые являются нежелательными. Были созданы стабильные экспрессирующие векторы СНО для версии 3 тяжелой цепи и версии 5 легкой цепи 1ш309 (Н3/Ь5), вместе называемые версией 5, в которых эти периферические последовательности были удалены. Кроме того, был создан дегликозилированный вектор тяжелой цепи для удаления потенциальных взаимодействий между экспрессированным антителом 309 и γ-рецепторами Ес.
Стабильный экспрессирующий вектор СНО легкой цепи получали лигированием ВатШ-фрагмента 723 п.н. рК18188 в неосодержащий ВатШ-расщепленный векторный фрагмент 6188 п.н. рК18077 (РЭМ64-02-13) с получением плазмиды рКР5195, как показано на фиг. 9.
Стабильный экспрессирующий вектор СНО тяжелой цепи получали сначала лигированием ВатШфрагмента 1449 п.н. из рК18168 в неосодержащий ВатНЕрасщепленный векторный фрагмент 6051 п.н. рКР5078 (РЭМ-64-02-13) для удаления сайтов рестрикции Νθΐ1, фланкирующих кодирующую последовательность тяжелой цепи, и генерирования рК18171. Для генетического удаления С-концевого остатка лизина из тяжелой цепи, кодируемой рК18171, В8г01-ХЬа1-фрагмент 2190 п.н. рК18171 заменяли Взг01ХЬа1-фрагментом 2187 рК1878 (РЭМ-64-02-13) с получением рК18189. Плазмида рК18189 представляет бЫг-содержащий стабильный экспрессирующий вектор СНО дикого типа 1и309, как изображено на фиг. 10. Для генерирования дегликозилированной (ад1усозу1) формы тяжелой цепи Лде[-В5г01-фрагмент 587 п.н. рК18189 заменяли Аде1-В8г01-фрагментом 587 п.н. из рСК076 с получением рК18196. Этот вектор представляет бЫг-содержащий стабильный экспрессирующий вектор СНО негликозилированного 111.1309. содержащий замену N3190. которая удаляет сигнал гликозилирования, требуемый для нормального связывания Ес-рецептора, как изображено на фиг. 11.
ДНК-последовательности ВатШ-кДНК-инсертов в рК18189, рК18196 и рК18195 были подтверждены. Экспрессирующие векторы котрансфицировали в клетки СНО и трансфицированные клетки испытывали на секрецию антител. Анализ детектирования антитела человека Еа^-ПТет (Р1егсе) кондиционированной среды показал, что трансфицированные клетки синтезировали и эффективно секретировали тяжелые и легкие цепи из экспрессирующих векторов СНО, как изображено на фиг. 12.
Таким образом, имеются два потенциальных сайта гликозилирования, которые могут быть модифицированы в антителе 1ш309 без влияния на связывающую аффинность этого антитела: (1) в вариабельных доменах легкой цепи 1ш309 в районе СЭК1 при аминокислотном остатке 26 8Е0 ΙΌ NО: 2, где за
- 49 016342 мена аспарагина (Ν) на серии (З) удаляет сайт гликозилирования, что улучшает экспрессию белка и очистку (этот сайт модифицируют во всех пяти версиях последовательностей вариабельных доменов легких цепей); и (2) в константной области версии 3 тяжелой цепи 1111309, где замена аспарагина (Ν) на глутамин (О) удаляет сайт гликозилирования, требуемый для связывания Ес-рецептора.
Пример 6. Линии клеток СНО, экспрессирующие версию 5 1ш3С9.
Экспрессионные плазмиды рК1З189, рК1З196 и рК1З195 для версии 5 1ш3С9 трансфицировали в клетки СНО. Экспрессию версии 5 1ш3С9 (Н3/Б5) и дегликозилированной версии 5 1ш3С9 (а-Н3/Ь5) наблюдали из трансфицированных клеток, причем секреция антитела свидетельствовала о специфичности связывания в отношении ανβ6.
Пример 7. Схема гуманизации анти-а,Д36-антитела 806.
В конструировании гуманизированных антител определяющие комплементарность районы (СЭК) содержат остатки с наибольшей вероятностью связывания антигена, и они должны сохраняться в реконструированном антителе. СЭК определяются последовательностями в соответствии с КаЬа! е! а1., Зесщепсек оТ Рго!етк оТ 1ттипо1од1са1 1п!егек!. 5'1' Ебйюп, и.З. Эер1. НеаИй апб Нитап Зегуюек, и.З. 0оу!. Рппбпд ОТйсе (1991). СЭК подразделены на канонические классы (Сйо1Ыа е! а1., №!иге, 342:877-883 (1989)), где ключевые остатки определяют в значительной степени структурную конформацию петли СЭК. Эти остатки почти всегда сохраняются в реконструированном антителе. СЭК тяжелой и легкой цепей классифицированы в канонические (усредненные) классы следующим образом:
Легкая цепь: Тяжелая цепь:
Ь1: 15 остатков ί Класс 4 Н1: 5 остатков Класс 1
Г.2: 7 остатков Класс 1 Н2: 17 остатков Класс 2
ЪЗ: 9 остатков Класс 1 НЗ: 17 остатков Нет канонического
класса
Канонические остатки, важные для этих классов, указаны в табл. 3. Все канонические остатки являются остатками, описанными с использованием этих правил. Для петли Н3 нет канонических классов.
Таблица 3
Ы Класс 4 2(1) 25(Α) 29(ν) 33 (М) 71 (Г)
Ь2 Класс 1 48(1) 51(А) 52(3) 64 (О
ЬЗ Класс 1 90(Н) 95(Р)
Н1 Класс 1 24(С) 26(3) 27(Υ) 29 (Е) 34 (М) 94 (К)
Н2 Класс 2 52а(Т) 55(0 71(V)
НЗ Нет канонического класса
Вариабельные домены легкой и тяжелой цепей сравнивали с консенсусными последовательностями для подгрупп мыши и человека (КаЬа! е! а1., 1991) с использованием программы ЕАЗТА.
Вариабельная легкая цепь 806 является членом подгруппы к 3 мыши с 81,250% идентичностью в 112-аминокислотном перекрывании, и вариабельная тяжелая цепь 806 является членом подгруппы 2а с 71,318% идентичностью в 129-аминокислотном (аа) перекрывании. Вариабельная легкая цепь 806 соответствует подгруппе к 4 человека с 65,487% идентичностью в 113-аминокислотном перекрывании. Вариабельная тяжелая цепь 806 соответствует подгруппе 1 человека с 58,955% идентичностью в 134аминокислотном перекрывании. Остатки границы упаковки УН/УЪ являются консервативными, за исключением необычного Р в аминокислотном положении 50 в легкой цепи (ЗЕО ΙΌ N0: 4) и необычного Ь в аминокислотном положении 39 в тяжелой цепи (ЗЕО ΙΌ N0: 3).
Моделирование структуры вариабельных областей выполняли следующим образом. Легкую и тяжелую цепи сопоставляли с локальной копией наиболее недавней базы данных РЭВ для определения структурных шаблонов для использования в конструировании трехмерных моделей легкой и тяжелой цепей. С использованием ЕАЗТА было обнаружено, что легкая цепь 806 имеет 90,991% идентичность последовательности в 111-аминокислотном перекрывании с мышиным РаЬ N10 (1Ν8Ν; разрешение 2,9 А). Было обнаружено, что тяжелая цепь 806 имеет 80,952% идентичность последовательности в 126аминокислотом перекрывании с мышиным РаЬ !ЕЬ42 (2!ЕЬ; разрешение 2,5 А). Полный структурный шаблон получали объединением тяжелой цепи 21ЕБ и легкой цепи 1Ν8Ν. С использованием Мобе1ег 5.0 пакета молекулярного моделирования (Ассе1гук 1пс.) были построены трехмерные структуры легкой и тяжелой цепей с использованием этой шаблонной структуры. Были созданы десять моделей гомологии, и была выбрана наилучшая модель на основе энергии Мобе1ег. Подтверждающий анализ показал, что не было остатков в запрещенной области карты рЫ/ркг
В конструировании реконструированных вариабельных областей была предпринята попытка нахождения наиболее сходных экспрессируемых последовательностей антитела человека для применения в качестве каркасов антитела. Для нахождения самых близких экспрессируемых последовательностей выполняли поиск на наиболее гомологичные экспрессируемые каркасы человека в ΝΗ-базе данных NСВI,
- 50 016342 базе данных ТгЕМВЬ и базе данных Кабата. Для последовательностей тяжелой и легкой цепей выполняли два поиска (с маскированными и немаскированными СОВ). Выбор наиболее подходящей экспрессируемой последовательности включает в себя проверку на идентичность последовательности канонических остатков и остатков поверхности раздела, а также проверку на сходство в длинах СОВ-петель. Источник данного антитела также является определяющим фактором. Ранее гуманизированные антитела исключаются. Для поисков в базах данных NСВI NΚ и ТгЕМВЬ использовали ВЬА8Т, а для поиска в базе данных Кабата использовали РА8ТА.
Наиболее сходная экспрессируемая легкая цепь была найдена в базе данных Кабата (каЬа! 1б 026520 АС21В'СЬ; 0к1т е! а1., Мо1. Iттиηо1., 33:47-56 (1996)). Она является ПЦР-амплифицированным всР, из фагового дисплея, но она является на 100% идентичной зародышевой линии Ь6 в каркасных областях. Для тяжелой цепи был выбран каркас §11392715 человека из NВ-базы данных в NСВI. Он является на 100% идентичным зародышевой линии УН1-2 в каркасных областях. Обе последовательности были подвергнуты поиску против базы данных последовательностей зародышевой линии (й!(р://ет^ет.псЬ1.п1т.п1й.§о,/1§Ь1ав(/), и это привело к следующим отобранным зародышевым линиям: Ь6 для легкой цепи и 1-2 для тяжелой цепи.
Наиболее важной процедурой в гуманизации моноклональных антител является идентификация обратных мутаций из остатков каркасной области человека в остатки каркасной области мыши. Опыт работы показал, что особенно важно сохранять канонические остатки, образующие поверхность раздела остатки и необычные мышиные остатки, которые находятся вблизи сайта связывания. Кроме того, остатки, расположенные в пределах 6 А от любого из остатков СОВ, должны быть внимательно анализированы на потенциальные действия на конформацию этих СОВ.
Были сконструированы три версии вариабельной легкой реконструированной цепи 806 и три версии вариабельной тяжелой реконструированной цепи 806. Первая версия содержит наибольшее число обратных мутаций, а третья версия содержит наименьшее число обратных мутаций (т. е является наиболее гуманизированной). Табл. 4 изображает последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей для гуманизированных антител 806 (1и806) (мышиная тяжелая цепь = 8ЕЦ ΙΌ N0: 93; 806НУ1 = 81Ь) ΙΌ N0: 94; 806НУ2 = 81 Г) ΙΌ N0: 95; 806НУ3 = 81Ь) ΙΌ N0: 96; УН1-2 = 81Ь) ΙΌ N0: 97; мышиная легкая цепь = 81Ь) ΙΌ N0: 98; 806ЬУ1 = 8 ЕС) ΙΌ N0: 99; 806ЬУ2 = 8ЕС) ΙΌ N0: 100; 806ЬУ3 = 8ЕС) ΙΌ N0: 134 и Ь6 = 8ЕС) ΙΌ N0: 135).
Таблица 4
Последовательности тяжелой и легкой цепи для 1ш8С6
Таблица 4а - последовательности тяжелой цепи
Мышиная 111
636НУ1 ί 11
8С6Н72 ·. 1)
ЗСбНУЗ (1)
УН 1 2 ί 11
Мышиная 150*
ВС6НУ1 15 о :>
6С6НУ2 (501
есенуз (50)
УН 1 - 2 150'
УИ1
ОУОЬООЗСРЕЬУЯРОУЗУКГЗСКОЗЗУТРТ 0УСЬУ(?ЗСАЕУКК₽СА57КУЗСКС38УТРТ ΟνΟΙΛ'ΎΞΟΑΕνΚΓ,Ρΰ АЗУ КУЗС КАЗО Υ Т ГТ 1Л'О8(ЗАЕУ ККРС АЗ УКУЗСКАЗЗУТ ГТ 2УаЬ\'дЗСАЕУ'КК₽аА5УКУ8СКА50ТТГТ
СРЯ2 .· 18ΤΥΪ0ΗΤΝУПОКГКО νιετγγβΝΤΝΥΝΩΚΓκα VI5ΤΪ УО«ТКТЫ<ЭКГК0
VI5ΤΥΥΟΝΤΚΥΝΟΚГКО
СРК1
РУАЙН
ΡΥΑΜΗ
ЦУАНН ρυαμη
ГК2
НУКЬЗНАКЗЦЕНГС
ИУЙЦАРС0СЦЕН1С
Η7Ρ.9ΑΡ<32·3ϋΕΗΐα иур/ЭАРЗоа ценно н'.'р.од ραοα ценно
УВЗ
КАТЫТУО КЗ 3 3ΤΑΪ Η Е ЦАР. ЦТ5ЕР5 АУУ’ССАВ
ΚΑΤΜΤντ>Κ5Ι3ΤΑΥΜεί3ΡΧΡ,ΞΟΟΤΑνΥΥΟΑΕ ΡΑΤΗΤνΌΚΞίδΤΑΪΗΕίεΕΤΡΞΟΟΤΑ'.'ΪΪΤΑΛ ЯАТМТТОК515~ДУМЕЦЗКЦРЗОРТА'/УУСАР ЯУТНТКРТЗ!ЗГАТМЕЦЗКЦРЗРРТАУУУСАЧ
Таблица 4Ь - последовательности легкой цели
Мышиная
8051,71 ВС6ЦУ2 есбцуз Ьб
Мышиная
8С6ЦУ1 есбцуг ВЗбЬУЗ Ь6 (54/ (54) (54) (54) (50)
РК1
Р1УЦТ55РАЗЬАУЗЦ0СЯА1ГЗС РIУЬТОЗРАТЬЗ ЦЗ РСЕЯАТЦЗС ЕИЪТОЗРАТРЗЦЗРСЕРАТЕЗС ЕIУЬТОЗРАТЦЗЬЗ РСЕКАТЦЗС ЕХУЦТОЗРАТЦЗЬЗ РСЕР.АТТЗС СРЯ2
УАЗЫЬЕЗ УАЗЫЬЕЗ УАЗЫЬЕЗ УАЗЫЬЕЗ ерях
КАЗСЗУЗТЗЗУЗУМУ КАЗОЗУЗТЗЗУЗУМУ
ΕΑ505ν5Τ35ΥδΥΗΥ
ΕΑ3<?3νετ3εΥ3ΥΜΥ
УЯЗ
ОV РАЯ ГЗСЗСЗОТРРТЬНIНРУЕЕ ΕΟΤΑΤΥУС
СIРАКЕЗСЗазаТОРТЬТ153 ЦЕРЕРГАУУУС С1РАЕЕЗСЗЗЗЗТОРТЬТ133ЦЕРЕОГАУУУС
С1РАЯР36303СТРГТЦТ133ЦЕРЕРГАУУУС
С1РАЯР5СЗСЗ<ЗТРГТЦТ133ЦЕРЕРРАУТУС
ГК 2
Н'Г’ЗЗКРООЗРКГЫК нтозкрооАрр.рык НУООКРСОАРРРЫК НУООКРСОАРКЦЦТК ΗΥΟίκρσοΑΡΡ.Ηϋϊ СРКЗ ! ΟΗΝΗΕΙΡ : СН11ИЕ1Р : онкиЕГР ' ΟΗΝΗΕΙΡ
Белковые последовательности различных версий вариабельных доменов тяжелой (версии 1, 2 и 3) и легкой (версии 1, 2 и 3) цепей 1ш8С6 показаны в табл. 5. Для вариабельных доменов тяжелой цепи эти последовательности содержат:
(a) РВ1 человека, полученный из РВ1 УН1-2;
(b) последовательность СОВ1 тяжелой цепи мышиного 806;
- 51 016342 (с) ЕК2 человека, полученный из ЕК2 УН1-2;
(б) последовательность ί.ΌΡ2 тяжелой цепи мышиного 8С6;
(е) ЕК3 человека, полученный из ЕК3 УН1-2;
(ί) последовательность СЭК3 тяжелой цепи мышиного 8С6 и (д) ЕК4 человека, полученный из консенсусной каркасной последовательности, которая на 100% идентична каркасу §11392715 из ΝΚ-базы данных и присутствует в большинстве антител человека, со следующей последовательностью: \¥СОСТЕУТУ88 (8ЕЦ ΙΌ νΟ: 151).
Для вариабельных доменов легкой цепи эти последовательности содержат:
(a) ЕК1 человека, полученный из ЕК1 Ь6;
(b) последовательность СЭК1 легкой цепи мышиного 8С6;
(c) ЕК2 человека, полученный из ЕК2 Ь6;
(б) последовательность ί.ΌΡ2 легкой цепи мышиного 8С6;
(е) ЕК3 человека, полученный из ЕК3 Ь6;
(ί) последовательность СЭК3 легкой цепи мышиного 8С6 и (д) ЕК4 человека, полученный из консенсусной каркасной последовательности, присутствующей в большинстве антител человека, со следующей последовательностью: ЕСССТКУЕГК (8ЕЦ ΙΌ N0: 152).
Таблица 5 Последовательности тяжелой и легкой цепи вариабельных доменов 1ш8С6
Тяжелая цепь версии 1 Ьи866 (8Е0 Ю N0:78)
Τ¥Ι6νΐ8ΤΥΥ0ΝΤΝΥΝφΚΡΚ6ΚΑΤΜΤνϋΚ8Ι8ΤΑΎΜΕΕ8ΙΪΙ,Κ8ΟΟΤΑν У¥САК.66ЕКК<ЗОКР8ЬКУАМОУ\¥С0<ЗТЬУТУ88
Тяжелая цепь версии 2 КиЗСб (5Е010 N0:79)
С\'СЕУС8ОАЕУ1ЖРСА8УКУ8СКАЗаУТРТОУАМП\¥УК.рАРС<ЮЕ ΕΨΙθνΐ8ΤΥΥΟΝΤΝΥΝ0ΚΡΚ0ΚΑΤΜΤνθΚ5Ι8ΤΑΥΜΕΤ5ΚΕΚ8ΟΟΤΑ УУУСАКаСТККСО1<Р8ЕКУЛМОУУ/ар6ТЬУТУ88
Тяжелая цепь версии 3 Ки8О8 (ЗЕО Ю N0:80)
ОУСЕУрЗОАЕУККРОАЗУКУКСКАБСУТРТОУАМНкУкСЛРОраЕ Ελ¥Μ0νΐ8ΤΥΥΰΝΤΝΥΝ6)ΚΕΚ0ΚΑΤΜΤνυΚ8Ι3ΤΑΥΜΕ1.8ΚΕΚ8ΡϋΤΑ νΥΥσΑΚΟϋΕΕΚαυΐ<Ρ5ΕΚΥΑΜΟΥ\ναρθΤΊΛΓΤν58
Легкая цепь версии 1 Ьи866 (8Е<2 (О N0:75)
О1УЕТр8РЕАТЕ8Ь8РОЕКАТЕЗСЕА8<28У8Т88У8УМУ'У¥00КРбрАР КРиКУА8НЕЕ801РАКГ80805СТПЕТЬТ185ЬЕРЕОРАУУУСрНК\¥Е! РРТРО6ОТКУЕ1К
Легкая цель версии 2 Ни8С6 (ЗЕО10 N0:76)
Е1УЕТр8РАТЬ8Е8РСЕКАТг8СкА808У5Т88У8УМУ\¥У99КРОС)АР ЕРЫКУА8кЬЕ8С1РАЕЕ8О8С8СТОЕТЕТ188ЕЕРЕОЕЛУУУСРНК1¥Е1 РЕТРОССТКУЕЖ
Легкая цепь версии 3 ЬиЙСб (8Е0 Ю N0:77)
Е1УЬТ98РАТЕ8Ь8РСЕ1<АТЕ5С10А308У8Т88¥8¥МУ\¥УОрКР6ОАР ΚΙΧΙΚΥΑ8ΝΕΕ80ΙΡΑΚΡ5050δΟΤϋΡ'ΤΕΤ188ΕΕΡΕΟΡΑνΥΥΟΟΗΝ\νΕΙ ρρτροοατκνΕίκ
Далее описываются обратные мутации в реконструированной вариабельной легкой цепи.
Е1Л - было показано, что этот аминокислотный остаток влияет на конформацию СОК/связывание антигена (Ко1Ьшдег е1 а1., РгоТет Εη§., 8:971-980 (1993)). В этой модели он может взаимодействовать с каркасом или боковыми цепями 826, 027 и/или Е93 в СОК Ь1 и Ь3. Он удален в версиях 2 и 3, так как эта замена является консервативной.
Ь46Е - этот остаток является остатком поверхности раздела упаковки УН/Уь. Он, по-видимому, находится также непосредственно ниже остатка Е55 СЭК-Е2. Он удален в версии 3.
Υ49Κ - этот остаток находится рядом с СЭК-Е2 и, по-видимому, взаимодействует с остатком Е55 в этой модели. Эта обратная мутация, по-видимому, является очень важной обратной мутацией и, следовательно, не удаляется.
Далее описываются обратные мутации в реконструированной тяжелой цепи.
А24С - этот остаток является каноническим остатком для С0К-Н1. Консервативная мутация. Удален в версии 2.
С268 - этот остаток является каноническим остатком для С0К-Н1. Консервативная мутация. Удален в версии 2.
- 52 016342
О39Й - этот остаток является остатком поверхности раздела упаковки. Он имеет очень ограниченное взаимодействие с легкой цепью и, следовательно, удален в версии 2.
Μ48Ι - этот остаток является обычной обратной мутацией. В этой модели он может взаимодействовать с Υ59 и Е63 в СИК-Н2. Он удален в версии 3.
У68А - этот остаток расположен ниже СПК-Н2, возможно, взаимодействует с Υ59 и Е63.
К72У - этот остаток является каноническим остатком для СИК-Н2.
Т74К - этот остаток расположен ниже СПК-Н2, возможно, взаимодействует с Υ53 или контактирует непосредственно с антигеном.
Пример 8. Интернализация анти-аДУ-антитела.
Антитела, которые интернализованы клетками, предоставляют преимущество для определенных клинических показаний, таких как рак, так как эти антитела могут быть затем конъюгированы с токсинами, радиоактивными соединениями или другими противораковыми агентами для селективного нацеливания и ингибирования роста раковых клеток. Способность анти-аДУ-антител быть интернализованными была ранее описана в XV0 03/100033, включенном здесь в качестве ссылки в полном виде. В XV0 03/100033 описано, что интернализацию наблюдали для катион-зависимых моноклональных антител (К0И-содержащих миметиков лигандов), таких как 6.806 и 6.1 А8. Однако интернализацию не наблюдали для катион-независимых тАЬ, таких как 6.309, 7.1С5 и 6.4В1. Способность антитела быть интернализованными клетками, такими как 806, предоставляет преимущество связывания интернализующегося антитела с терапевтическими компонентами/агентами для создания возможности доставки этих компонентов/агента в клетку. Например, лекарственное средство или токсин могут быть конъюгированы с интернализующимся антителом 806. Однако то же самое применение может быть использовано для неинтернализующихся антител, таких как 309, причем химическая часть молекулы может быть конъюгирована с такими антителами для создания возможности доставки к клеточной поверхности мишени (например, поверхности опухолевой клетки).
Пример 9. ανβ6 является высокоэкспрессируемым в метастазах относительно первичных опухолей.
В этих экспериментах авторы пытались исследовать экспрессию ανβ6 в различных раках эпителиального происхождения и на метастатических патологических изменениях и определить, могут ли блокирующие функцию ανβ6 тАЬ ингибировать рост аДД-экспрессирующих опухолей ш νί\Ό. Авторы оценивали 1п \йго и 1п νί\Ό противоопухолевую активность полученных ими анти-аДУ-тЛЬ (против ανβ6 человека) на фарингеальной карциноме, Пе1гой62, и сравнивали ее с противоопухолевой активностью ТβКII:Ес 1п νί\Ό. Данные авторов подтверждают роль в раке человека в отношении ανβ6 и потенциал в отношении терапевтического вмешательства с использованием блокирующих функцию ανβ6 тАЬ.
A. Материалы и способы.
Для иммуногистохимии срезы тканей освобождали от парафина в ксилоле и этаноле, повторно гидратировали в дистиллированной воде и затем погружали в метанол, содержащий 0,45% Н2О. Ткани инкубировали с пепсином (00-3009, 2утей, 8ап Егапсйсо, СА) и блокировали авидином и биотином (8Р2001; Уес!ог ЬаЬогаФпек, Вигйпдате, СА). Первичное антитело разводили в забуференном фосфатом солевом растворе (ЗФР), содержащем 0,1% бычий сывороточный альбумин (БСА), и ткани инкубировали в течение ночи при 4°С. Для иммуноокрашивания β6 на ткани ксенотрансплантата мыши срезы инкубировали с химерной формой человек/мышь анти-а^6-тАЬ, 2А1 (^ешгеЬ, Р.Н. е! а1., I. Вю1. СНет. 279(17):17875-17887 (2004)), и биотинилированным вторичным антителом против Ι§0 человека (РК6103, УесЮг ЬаЬогаФпек, Виг1шдате, СА). Для иммуноокрашивания β6 на ткани человека срезы инкубировали с мышиным 2А1 и антимышиным-биотинилированным вторичным антителом (РК-6102, УесЮг ЬаЬогаФпек). Комплекс авидин-биотин-пероксидаза хрена (УесЮг Кй, РК-6102) наносили на срезы, инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре и готовили субстрат 3,3'-диаминобензидин (ИАВ), согласно рекомендациям (8К-4100, УесЮг ЬаЬогаФпек), и наносили на срезы и выдерживали в течение 5 мин при комнатной температуре. Срезы ткани окрашивали гематоксилином Майера в течение 1 мин и промывали в воде и ЗФР.
B. Результаты.
1. Экспрессия ανβ6 в метастазах.
Иммуноокрашивание ανβ6 оценивали на различных опухолевых метастазах. 78% метастазов (43/55) положительно окрашивались, обнаруживая интенсивное окрашивание на большинстве метастазов (фиг. 13А-Е; фиг. 14Λ-Ι). Было обнаружено, что этот результат является увеличением процента положительного иммуноокрашивания, поскольку было обнаружено, что только опухоли головы и шеи, шейки матки и поджелудочной железы имеют эквивалентный уровень экспрессии (табл. 1).
- 53 016342
Таблица 1
Экспрессия ανβ6 в опухолях человека (иммуногистохимия)
Ткань а,367обшее число %
Полости рта 4/4 100%
Шейки матки 79/98 81%
Поджелудочной железы 31/39 80%
Кожи 41/53 77%
Гортани и глотки 43/64 67%
Пищевода 35/56 63%
Эндометрия 17/32 53%
Легкого 28/70 40%
Молочной железы 41/101 41%
Колоректальная 18/488 37%
2. Экспрессия ανβ6 в эндометриальных опухолях и метастазах соответствующих пациентов.
Как отмечалось выше в табл. 1, иммуноокрашивание ανβ6 было положительным на 53% испытанных эндометриальных опухолей. За несколькими исключениями окрашивание было более явным в более инвазивных участках опухолей более высокозлокачественных опухолей. Три пробы первичной опухоли соответствовали метастазам лимфатических узлов. В двух из этих случаев иммуноокрашивание было значительно более высоким на метастазах лимфатических узлов относительно иммуноокрашивания соответствующей первичной опухоли (сравните фиг. 15А с 15В и 15С с 15Ό). В третьем случае иммуноокрашивание было высоким как на метастазах лимфатических узлов, так и на соответствующей первичной опухоли (данные не показаны). Процент окрашивания а^-положительного опухолевого эпителия в этих трех опухолях был равен 10, 20 и 90% соответственно, хотя процент а^-положительного опухолевого эпителия в соответствующих метастатических лимфатических узлах был равен 80, 100 и 100% соответственно. В здоровом эндометрии окрашивание ограничивалось случайными клетками на поверхностном слое, а также цистами.
3. Экспрессия а^ в пробах инвазивной опухоли молочной железы человека.
Более чем 100 проб рака молочной железы человека, оценивали на уровень экспрессии а^ с использованием иммуногистохимии в соответствии с процедурами, описанными выше в разделе материалы и способы. В некоторых случаях внутрипротоковой карциномы ίη δίΐιι (Όί'.Ί8) экспрессия а^ ограничивалась миоэпителием, окружающим опухоль, и не наблюдалась на самой опухоли (см., например, ВгСа19; фиг. 16А). Однако в некоторых случаях инвазивной карциномы молочной железы а^ экспрессировался также и на опухоли (см., например, ВгСа23, фиг. 16В).
Имеется доказательство, что экспрессия специфических генов в клетках ткани молочной железы (эпителиальных клеток, миоэпителиальных клеток и фибробластов) изменяется в сравнении с нормальной тканью молочной железы в ткань молочной железы, содержащей неинвазивную опухоль, такую как Ό6Ι8, в ткань молочной железы, содержащей инвазивную карциному молочной железы (А1шеп, М. е1 а1., Сапсег Се11 6:17-32 (2004); Вигйеш, Н.Е е! а1., Ν. Епд1. I. Меб. 350:1430-1441 (2004)). Многие из этих изменений экспрессии генов были детектированы в миоэпителиальных клетках. Возможно, что экспрессия интегрина а^ на миоэпителии (как в нормальной ткани, так и в ΌΕΙ8) заставляет микроокружение, возможно, через локализованную активацию Τ0Ε-β, поддерживать жизнеспособность опухоли и стимулировать прогрессирование инвазивной опухоли. Модель ίη νίνο ΌΟ8, которая может прогрессировать в инвазивную карциному, такую как МСЕЮИСК (М111ег, Е.К. е! а1., Е №И. Сапс. Ιηκΐ. 92:1185-1186 (2000)), могла бы обеспечить способ оценки экспрессии а^ в контексте прогрессирующей опухоли молочной железы. Можно оценивать экспрессию а¥6 в миоэпителии в ранней, неинвазивной стадии этой опухоли и экспрессию а¥6 по мере прогрессирования опухоли в инвазивный фенотип ίη νίνο. Эта модель могла бы также позволить тестировать роль а^ с использованием блокирующих а^ тАЬ, а также тестировать эффективность конъюгированных анти-а.ДЕ-тАЬ.
4. Экспрессия а^ в пробах панкреатической опухоли человека, метастазах соответствующего пациента и модели трансплантата мыши инвазивной панкреатической опухоли.
Как отмечалось выше в табл. 1, иммуноокрашивание а^ было положительным на 80% испытанных панкреатических опухолей. При исследовании проб из первичных панкреатических опухолей от восьми разных пациентов с использованием иммуногистохимии, окрашивание было явным в инвазивных областях высокозлокачественных опухолей (фиг. 17А-17С; 18А-18Е). Пробы первичных опухолей имели также соответствующие метастазы в лимфатических узлах (фиг. 17Ό-17Ρ; 18Е-181), которые также демонстрировали сильное окрашивание а^, что подтверждало представление, что а^-положительные клетки были диссеминированы из этого участка первичной опухоли. В нормальной поджелудочной же
- 54 016342 лезе (фиг. 176-17Н; 18К-18Б) окрашивание ограничивалось случайными клетками на поверхностном слое.
Для дополнительного испытания влияния экспрессии «νβ6 на инвазию опухолевых клеток авторы использовали трансплантат опухоли мыши ВхРС-3 в качестве модели инвазивной аденокарциномы поджелудочной железы человека. Животных имплантировали (день 0) подкожно на боку 5х106 клеток/мышь, суспендированных в стерильном солевом растворе, с использованием инъекции 0,1 мл/мышь. В день 30 мышей с образованными опухолями (~60-100 мм3) распределяли попарно в каждую из трех групп обработки (ЗФР; тАЬ 369; слитый белок, растворимый ТСВ-β рецептор ΙΙ-Ι§ (5о1Τ6ΡβЯII-Ρс) ) для всех исследований. Тест-агенты вводили мышам внутрибрюшинно с использованием схемы обработки 3 раза в неделю. Мышей инъецировали 369 при 10 мг/кг, 8о1Τ6ΡβЯII-Ρс при 2 мг/кг или ЗФР (отрицательный контроль). Рост опухолей измеряли дважды в неделю и объем опухоли определяли в соответствии с формулой: [(ширина)2 х длина]/2. Опухоли из групп обработки иссекали, фиксировали в 10% параформальдегиде, заливали в парафин и готовили срезы для иммуногистохимического анализа с использованием неблокирующего химерного у6-тАЬ 6.2А1.
Лечение анти-а^-тАЬ 369 оказывало прямое действие на рост опухолей (фиг. 19В, 19С), причем значимо уменьшенный рост опухоли наблюдали после приблизительно 48 дней лечения этим антителом. Уровень ингибирования роста, наблюдаемый с 8о1Τ6ΡβЯII-Ρс, был несколько более низким, чем уровень ингибирования роста, наблюдаемый для 369. Эти результаты указывают на то, что анти-а^-тАЬ 369 ингибирует рост опухолей в модели трансплантата панкреатического рака человека, и предполагают, что такие блокирующие антитела могли бы быть полезными в ингибировании роста опухолей и, посредством отсрочки инвазии опухолей, в первичных панкреатических аденокарциномах человека.
Пример 10. Блокирующие функцию «νβ6 тАЬ ингибируют миграцию, инвазию опухолевых клеток и продуцирование ММР «.//-экспрессирующих опухолевых клеток.
«.//-блокирующее моноклональное антитело (тАЬ) 369 (Уе1пгеЬ, Р.Н. е! а1., 1. Вю1. Сйет. 279 (17):17875-17887 (2004)) и растворимый рекомбинантый Τ6Ρ-βЯII-Iд (Со8д^оуе, Ό. е! а1., Ат. 1. Ра!йо1. 157 (5):1649-1659 (2000)) оценивали на их способность блокировать способность β6-трансфицированных клеток к инвазии, миграции и продуцированию матриксной металлопротеиназы 9 (ММР-9) ш уйто. Эти активности подвергали мониторингу, так как каждая из них была ассоциирована с инвазией и миграцией опухолевых клеток. Действия 369 и Τ6Ρ-βЯII-Iд оценивали с использованием нетрансфицированных исходных клеток (С1) и β6-трансфицированного производного клеток С1 (УВ6).
Анализ миграции и инвазии. Клетки С1 и УВ6 плоскоклеточной карциномы полости рта человека выращивали в среде К6М, описанной ранее (Тйотак, 6.1. е! а1., I. БкеН. Эепп. 117(1):67-73 (2001)). Для измерения миграции авторы использовали планшеты и вкладыши РЬиОЯОВЬОСК™ (ВО Вюкаепсек; Вебйэтб, МА) в соответствии с инструкциями изготовителя. Вкратце, пустые лунки наполняли средой К6М или бессывороточной К6М в качестве отрицательного контроля. Клетки собирали и предынкубировали в бессывороточной среде с антителом. 50000 клеток добавляли во вкладыш, который затем помещали внутрь лунок и инкубировали в течение 24 ч при 37°С в термостате для культуры ткани. После инкубирования клетки и среды удаляли из верхней части вкладыша. Клетки, которые мигрировали к нижней стороне фильтра, определяли количественно мечением 2 мкг/мл кальцеином (Ι пх'Игодеп Согрп. СаткЬаб, СА) в течение 1 ч и измерением флуоресценции в режиме считывания со дна. Процентное ингибирование рассчитывали в виде уменьшения количества клеток, мигрировавших в присутствии антитела, в сравнении с вариантом только со средой. Инвазию измеряли сходным образом с использованием покрытых Ма!пде1® вкладышей РЬиОЯОВЬОСК и инкубирования в течение 48 ч.
Количественное определение продуцирования ММР. Клетки в среде, содержащей 1% ФТС, культивировали в покрытых Ма!пде1® лунках (ВО Вюкшепсек) в течение указанного времени. Супернатанты собирали, центрифугировали для удаления остатков клеток и замораживали до анализа. Уровни ММР определяли количественно при помощи ЕЫ8А ( (Κ.&Ό 8у§!ет5, МтпеароШ. МЩ.
Результаты.
Как показано на фиг. 20А-20С, «.//-блокирующее тАЬ 369 значимо ингибировало миграцию, инвазию и продуцирование ММР-9 клеток УВ6 ш уйто. Блокирование активности ТСВ-β рекомбинантным растворимым Τ6Ρ-β-Κ1I-Ρс также ингибировало инвазию и продуцирование ММР-9 клетками УВ6 (фиг. 20В и 20С), но не влияло на их миграцию (фиг. 21А). Эти данные показывают индивидуальное функциональное различие при сравнении блокады функции «νβ6 с блокадой активности ТСВ-β. Этот вывод согласуется со способностью «νβ6 опосредовать как адгезию, так и миграцию клеток через связывание с фибронектином, а также активацию латентного предшественника ТСВ-β (8йеррагб, Ό., Сапсег Ме!ак!. Ксу. 24:395-402 (2005)).
Пример 11. «.//-шАй ингибирует стромальную инвазию в модели ксенотрансплантата колоректального рака человека (ЫМ1863).
1. Уровень техники.
Недавно была охарактеризована новая модель карциномы рака, ЫМ1863 (Ва!ек, Я.С. апб Метсипо,
- 55 016342
А.М., Мо1. Вю1. Се11 14:1790-1800 (2003); Ва1е§, Р.С. е! а1., 1. С1т. ^ей. 115(2):339-347 (2005)). Клетки Б1М1863 растут ш ,11го в суспензионной культуре в виде хорошо дифференцированных трехмерных сфероидов 3Ό (органоидов). Однако после воздействия Т0Р^ и ТОТ/ эта клеточная линия превращается в мигрирующий монослойный фенотип с морфологическими изменениями, характерными для эпителиально-мезенхимного перехода (ЕМТ), отличающегося потерей Е-кадхерина. Этот переход сопровождается значимым увеличением экспрессии </.νβ6. 1п νίνΌ, клетки Б1М1863 являются онкогенными при инъецировании подкожно в бок голых мышей (Ва1е§, Р.С. е! а1., 1. С1т. ΙιτνΌδΙ. 115 (2):339-347 (2005)). Как показано на фиг. 6, клетки ЫМ1863 проявляют поразительное распределение экспрессии /νβ6 (1б.). Конкретно, экспрессия /νβ6 является особенно значительной на клетках, которые, по-видимому, инвазировали из массы первичной опухоли в строму опухоли. Это открытие согласуется с обнаружением того, что эти клетки были подвергнуты эпителиально-мезенхимному переходу (ЕМТ), который был описан ранее (см. 1б.).
Таким образом, авторы выбрали применение клеток Б1М1863 в качестве модели трансплантата колоректального рака человека для испытания возможного участия /νβ6 в стромальной инвазии в этой модели.
2. Материалы и способы.
Клетки ЫМ1863 выращивали в виде органоидов в среде КРМ1-1640 (01ВС0; Итсйгодеп Согр., Ба Эо11а, СА), дополненной 5% фетальной телячьей сывороткой (ФТС). Органоиды ЫМ1863 (приблизительно 8х106 клеток) инокулировали подкожно в бока самок голых мышей. Все исследования на животных были одобрены 1п81йийопа1 Ашта1 Саге апб Ике СоттШее (1АСИС) Вюдеп 1бес. Мышей обрабатывали внутрибрюшинной инъекцией три раза в неделю 10 мг/кг анти-ανβ6-сπецифического мышиного моноклонального антитела 309 (^ешгеЬ, Р.Н. е! а1., 1. Вю1. С1ет. 279(17): 17875-17887 (2004)), 2 мг/кг рекомбинантного растворимого слитого белка Τ0Ρ-βΚII-Iд (Сο8д^ονе, Ό. е! а1., Ат. 1. Ра11ю1. 157 (5):16491659 (2000)) или носителем (ЗФР). Объемы опухолей измеряли в соответствующих временных точках с использованием штангенциркуля и объем опухоли рассчитывали с использованием формулы (Б(длина) х XV2 (ширина))/2.
Ксенотрансплантаты собирали спустя семь недель и фиксированные в формалине, залитые в парафин срезы использовали для иммуногистохимии, которую выполняли, как описано выше в примере 9 (фиг. 21).
Результаты.
Анти-ανβ6-тАЬ 309 и/или рекомбинантный растворимый Τ0Ρ-βΚII-Iд не оказывали прямого действия на рост опухолей (фиг. 22А, 22В). Однако эти лиганды значимо ингибировали стромальную инвазию клеток ЫМ1863 на приблизительно 80% (фиг. 22С), как было оценено количественным определением площадей (/^-положительных опухолевых клеток в строме (фиг. 22Ό-22Ρ), выполняемым патологом, которому была неизвестна схема обработки.
Пример 12. Аффинность и биоактивность мышиного антитела 6.309 (т309) в отношении интегрина (/νβ6, экспрессируемого на клетках приматов (не человека).
Резюме. Аффинность и биоактивность анти-ανβ6-блокирующего моноклонального антитела 6.309 (т309) на интегрине (/νβ6 примата (не человека) (ННР) определяли с использованием различных способов ш ,йго. С использованием сортинга клеток с активацией флуоресценции (РАС8) клеточные линии Ν^, экспрессирующие высокие уровни (/νβ6, идентифицировали из 2 разных видов (12МВг6 из африканской зеленой мартышки и 4МВг5 из макака резуса). Антитело т309 связывалось с (/νβ6, экспрессированным на 12МВг6 и 4МВг5, с величинами ЕО50 0,30 и 0,38 мкг/мл соответственно. Антитело т309 ингибировало также связывание 12МВг6 и 4МВг5 с пептидом ассоциированного с латентностью ТСРДО (БАР) с величинами 1С50 0,22 и 0,29 мкг/мл соответственно. Наконец, т309 блокировало способность клеточной линии 4МВг5 активировать латентный Τ0Ρ-β, как определено с использованием анализа сокультивирования с отвечающими на ТСР-β эпителиальными репортерными клетками норки, стабильно экспрессирующими стимулятор ингибитора 1 активатора плазминогена (ТМБС), с величиной 1С50 0,31 мкг/мл.
Введение. Целью этого исследования было определение аффинности и биологической активности моноклонального анти-ανβ6-антитела 6.309 (т309) в отношении интегрина (/νβ6, экспрессируемого на клетках нечеловеческого примата (ННР). т309 является мышиным предшественником гуманизированного моноклонального антитела 1ш3С9 (В000011). Это мышиное антитело является высокоаффинным, специфически нацеленным на /νβ6 реагентом1. т309 связывается с его мишенью, интегрином /νβ6, с высокой аффинностью (Кс=16 пМ), ингибирует связывание экспрессируемого клеткой /νβ6 с лигандами (пептидом, ассоциированным с латентностью ТСР-β (БАР), и фибронектином) и блокирует способность (/νβ6 активировать латентный Τ0Ρ-β1. Указанное антитело требует для связывания как субъединицы (/ν, так и субъединицы β6, и не наблюдали перекрестной реактивности с другими родственными интегринами ((/νβ3, </νβ3, </...·β5 и (/πβ6), что указывает на то, что т309 является высокоспецифическим в отношении °νβ6 .
- 56 016342
Мышиные и человеческие интегрины β6 имеют высокую степень сходства последовательностей (89,5 % идентичность)2, как и мышиные и человеческие интегрины αν (92,8% идентичность)3. Последовательность ανβ6 из N4^ не была определена, но можно было бы также ожидать, что она имеет высокий уровень идентичности последовательности.
Для определения аффинности т309 в отношении NНР ανβ6 связывание измеряли при помощи ЕАС8. Способность т309 блокировать адгезию клеток с ЬАР ТСЕ-β человека оценивали в анализе адгезии клеток. Наконец, способность т309 блокировать ИНР-а^-опосредованную активацию латентного ТСЕ-β определяли с использованием анализа сокультивирования клеток.
Материалы и способы.
Реагенты. Мышиные моноклональные антитела 6.309 (т309) и 6.4В4 генерировали и очищали, как описано в ссылке 1 и здесь выше. Рекомбинантный ЬАР человека (ЬАР) покупали из К&О 8ук!етк (номер по каталогу 246-ЕР). Трансфицированную β6 человека линию клеток 8\У480 (колоректальная аденокарцинома человека) (8ν480β6) получали от Эеап 8йеррагб (ИС8Е).
Клеточные линии NНР. Следующие клеточные линии получали из Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС):
Название Вид-источника Тип клеток Возраст источника
Уего Африканская зеленая мартышка почечные эпителиальные взрослый
12МВгё Африканская зеленая мартышка легочные эпителиальные 2-3-летний самец
ЬЬС-МК2 макак резус почечные эпителиальные взрослый
4МВт5 макак резус легочные эпителиальные 2-3-летний
Сортинг клеток с активацией флуоресценции (ЕАС8). Клетки собирали трипсинизацией, промывали один раз в забуференном фосфатом солевом растворе и затем ресуспендировали в ЕС-буфере (ЗФР, 2% ФТС, 0,1% NаNз, 1 мМ СаС12 и 1 мМ МдС12). Затем 1 х 106 клеток инкубировали с 10 мкг/мл т309 на льду в течение 0,5 ч в общем объеме 50 мкл ЕС-буфера. После инкубации клетки промывали два раза охлажденным на льду ЕАС8-буфером (ЗФР, 2% ФТС, 0,1 №N3) и ресуспендировали в 100 мкл ЕСбуфера, содержащего 1:200-разведение А1еха488-конъюгированных козьих антител против мышиного 1д0 (1асккоп 1ттипоКекеагсй), и инкубировали на льду в течение 30 мин. Затем клетки промывали два раза охлажденным на льду ЕС-буфером и ресуспендировали в 100 мкл ЕС-буфера и 50 мкл 4% параформальдегида. Связывание меченого вторичного антитела подвергали мониторингу проточной цитометрией (Вюдеп 1бес Кекеагсй соге Еасббу).
Анализ адгезии клеток. 96-Луночный микротитрационный планшет покрывали 50 мкл на лунку 0,5 мкг/мл ЬАР, разбавленным в 50 мМ растворе бикарбоната натрия, рН 9,2 при 4°С в течение ночи. Планшет промывали дважды ЗФР (100 мкл на лунку), блокировали 1% БСА (100 мкл на лунку) в течение 1 ч при 25°С и промывали дважды 100 мкл буфера для анализа (50 мМ Трис, рН 7,5, 150 мМ №С1, 1 мМ СаС12, 1 мМ МдС12). Клетки 12МВг6 или 4МВг5 (4-12х106 клеток/мл) инкубировали с 2 мкМ флуоресцентным красителем (ВСЕСЕ-АМ, Мо1еси1аг РгоЬек) в буфере для анализа с осторожным встряхиванием на водяной бане при 37°С в течение 15 мин, собирали центрифугированием и ресуспендировали в буфере для анализа до 4-12х106 клеток/мл. К отдельным лункам промытого планшета добавляли 25 мкл 2хконцентрированного т309 и 25 мкл меченых клеток и планшет инкубировали при 25°С в течение 0,5 ч. Планшет промывали 4-6 раз буфером для анализа (100 мкл на лунку) и флуоресцентный краситель, захваченный клетками на этом планшете, регистрировали на 96-луночном планшет-ридере для регистрации флуоресценции (Су!оЕ1иог 8епек 4000, Регкербуе В1окук!етк). Процентное связывание определяли сравнением флуоресценции перед конечной стадией промывания (т.е. со всеми добавленными клетками) с флуоресценцией после промывания (т.е. флуоресценцией связанных клеток).
Анализ сокультивирования. ТМЬС (клеточную линию эпителиальных клеток легкого норки (Му 1 Ьи), стабильно трансфицированную частью белка ингибитора 1 активатора плазминогена)4 выращивали в ЭМЕМ+10% фетальная телячья сыворотка с 2 мМ Ь-глутамином, пенициллином-стрептомицином и 200 мкг/мл 0418. Клетки собирали из колб с использованием ЗФР+5 мМ ЭДТА, промывали в ЗФР+0,1% БСА, считали при помощи гемоцитометра и высевали в 96-луночные планшеты. а.ДЕ-экспрессирующие клетки выдерживали на льду в течение 2 ч, в то время как ТМЬС высевали в 96-луночные планшеты при 104 клеток на лунку в ЭМЕМ+0,1% ФТС и давали им прикрепляться при 37°С, после чего связанные ТМЬС промывали один раз ЭМЕМ+0,1% БСА. Моноклональные антитела разводили в ЭМЕМ+0,1% БСА, добавляли к α^-экспрессирующим клеткам и предынкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем аДЕ-экспрессирующие клетки добавляли к ТМЬС при 4х104 клетках на лунку в ПМЕМ+0,1% БСА (100 мкл на лунку). Планшеты инкубировали в течение 20 ч при 37°С в увлажненном
- 57 016342
СО2-обогащенном термостате. Супернатант выбрасывали и заменяли 100 мкл ЗФР+1 мМ Са+2 и 1 мМ Мд+2. Клетки лизировали и люциферазу детектировали с использованием набора ЬисЬйе (Регкт Е1тег Ь1£е 8с1епсек, Вок!оп, МА) с использованием микропланшетного люминометра (Тгор1х ТК717 М1сгор1а1е 1иш1поте1ег, Регкт Е1тег Ь1£е 8с1епсек).
Результаты.
1. Связывающая аффинность и блокирование активности мышиного антитела 6.309 (т309) в отношении интегрина ανβ6 приматов.
Для исследования аффинности т309 в отношении интегрина ανβ6 нечеловеческого примата (ЯИР) из АТСС получали четыре линии клеток ХНР. Начальный скрининг (фиг. 23) показал, что экспрессия ανβ6 была наивысшей на клеточных линиях 12МВг6 и 4МВг5, так что эти две линии использовали для характеристики т309. Не блокирующее ανβ6 антитело, 6.4В4, также связывалось с 12МВг6 и 4МВг5 со сходной средней интенсивностью флуоресценции, в сравнении с интенсивностью флуоресценции, наблюдаемой для т309.
1.1. Связывание с экспрессируемым клетками интегрином (ЕАС8).
Связывание т309 с 12МВг6 и 4МВг5 измеряли с использованием сортинга клеток с возбуждением флуоресценции (ЕАС8), как описано в разделе материалы и способы. Полное титрование т309 выполняли на каждой клеточной линии и ЕИ50 (концентрацию антитела, дающую полумаксимальный сигнал) определяли с использованием нелинейной регрессии. Величины ЕИ50 для 12МВг6 и 4МВг5 были равны 0,30 мкг/мл (фиг. 24А) и 0,38 мкг/мл (фиг. 24В) соответственно.
1.2. Адгезия клеток с ЬАР.
Способности 12МВг6 и 4МВг5 связываться с ЬАР демонстрировали с использованием анализа адгезии клеток. Эта адгезия блокировалась т309, но не контрольным белком (БСА) или не блокирующим ανβ6 антителом (6.4В4) (фиг. 25). Активность т309 в блокировании этого взаимодействия оценивали измерением концентрационной зависимости ингибирования на каждой клеточной линии (фиг. 26). Из этих экспериментов определяли Ιί.'50 (концентрацию антитела, дающую полумаксимальное ингибирование). Величины ГС50 для 12МВг6 и 4МВг5 были равны 0,22 и 0,29 мкг/мл соответственно.
1.3. Активация ТСЕ-β (анализ сокультивирования).
Способности 12МВг6 и 4МВг5 активировать латентный ТСЕ-β определяли с использованием анализа сокультивирования, в котором клетки инкубировали с чувствительными к ТСЕ-β репортерными эпителиальными клетками легкого норки, стабильно экспрессирующими часть стимулятора ингибитора 1 активатора плазминогена (ТМЬС) (фиг. 27). Экспрессия ανβ6 не является достаточной для стимуляции активации ТСЕ-β, так как различия во внутриклеточной передаче сигнала и/или продуцировании латентного ТСЕ-β будут также влиять на активность в этом анализе. Из этих двух клеточных линий только 4МВг5 была эффективной в активации латентного ТСЕ-β, в то время как 12МВг6 не обнаруживала этого эффекта. Активацию наблюдали также с использованием клеточной линии положительного контроля 8ν480β6, β6-трансфицированной линией клеток карциномы ободочной кишки человека, стабильно экспрессирующей ανβ6. Нетрансфицированная контрольная исходная клеточная линия (8ν480), как и ожидалось, не обнаруживала активации.
Способность т309 блокировать активацию ТСЕ-β клетками 4МВг5 измеряли в том же самом эксперименте. Активация ТСЕ-β блокировалась добавлением т309 или при 1 мкг/мл, или при 10 мкг/мл, но не добавлением неблокирующего анти-аДУ-антитела 6.4В4. Ингибирующее действие т309 на клетки 4МВг5 при этих концентрациях было сходным с ингибирующим действием, наблюдаемым с использованием клеточной линии 8\ν480β6. В отдельном эксперименте определяли зависимость от дозы т309ингибирования 4МВг5-опосредованной активации ТСЕ-β (фиг. 28).
Величины ^50 для 4МВг5 и 8ν480β6 были равны 0,31 и 0,37 мкг/мл соответственно.
2. Сравнение аффинности т309 в разных видах.
Данные, полученные в отношении связывания и активности т309 на интегрине а^6 мыши, ХНР и человека, суммированы в следующей таблице. Первый столбец в этой таблице показывает ЕЭ50 связывания, определенные при помощи ЕАС8. В каждом случае измеренная ЕЭ50 была <0,38 мкг/мл (2,5 нМ). Второй столбец в этой таблице показывает Ιί.'50 для ингибирования адгезии клеток посредством т309. В каждом случае т309 блокировал адгезию клеток с ^50<0,29 мкг/мл (1,9 нМ). Третий столбец в этой таблице показывает Ιί’50 для ингибирования а,,[/--опосредованной активации ТСЕ-β, определенную с использованием анализа сокультивирования. Линия клеток МНР 4МВг5 обнаруживала сходную активность в сравнении с линией клеток человека 8ν480β6 (величины Ιί./0 0,40 и 0,24 мкг/мл соответственно).
- 58 016342
Сравнение активности т309 с использованием клеточных линий мыши, ИЯР и челов ека
Вид Линия клеток Связывание (ГАС8) ЕО5(|, мкг/мл Адгезия клеток 1С50, мкг/мл Сокультура 1С50| мкг/мл
Мышь ΝΙΗ3Τ3β6 0,30“ пл? и. ά.
ГОС-ΡΙβό 11.4 0,02“ пЛ.
МНР 4МВг5 0,30 0,22 0,31
12МВг6 0,38 0,29 пЛ.
Человек 8Ж480рб 0,051 0,03 0,37
ϋβΐτοΐί562 пЛ. 0,04 пЛ.
8СС-14 η.ά. 0,16 пА
а ссылка 1 Ь п.б., не определяли
3. Ссылки.
1. ЖешгеЬ, Р.Н. е! а1., I. Вю1. С1ет. 2004, 279, 17875-87.
2. Агепб, Ь.1., I. Ат. Зос. №рЬго1. 2000, 11, 2297-305.
3. Жаба, I. е! а1., I. Се11 Вю1., 1996, 132, 1161-76.
4. АЬе, М. е! а1., Апа1. ВюсЬет., 1994, 216, 276-84.
Пример 13. Действия мышиного анти-аДД-тЛЬ в мышах А1рог1 (Со14А3-/-).
Резюме. ανβ6 является Τ0Е-β-индуцируемым интегрином, который экспрессируется преимущественно в сайтах эпителиального реконструирования, и было показано, что он связывает и активирует латентный предшественник ТСЕ-β. Здесь авторы показывают, что ανβ6 сверхэкспрессируется в эпителии почек человека в случае мембранозного гломерулонефрита, сахарного диабета, 1дА-нефропатии, болезни Гудпасчера и в почечном эпителии в случае синдрома Альпорта. Для оценки потенциальной регуляторной роли ανβ6 в почечном заболевании авторы изобретения исследовали действия блокирования функции ανβ6 тАЬ и генетической элиминации субъединиц β6 на фиброзе почки в Со14А3 -/- мышах, мышиной модели синдрома Альпорта. Экспрессию ανβ6 в почках мышей Альпорта наблюдали, прежде всего, в корковых канальцевых эпителиальных клетках и коррелировали с прогрессированием фиброза. Лечение «^-блокирующими тАЬ ингибировало накапливание активированных фибробластов и отложение интерстициального коллагенового матрикса. Сходное ингибирование почечного фиброза наблюдали в β6недостаточных мышах Альпорта. Исследование профиля транскриптов тканей почки показало, что ανβ6блокирующие тАЬ значимо увеличивали связанные с заболеванием изменения экспрессии фиброзных и воспалительных медиаторов. Сходные картины модуляции транскриптов получали при лечении рекомбинантным растворимым ТСЕ-β К11, что предполагает общие регуляторные функции ανβ6 и ТСЕ-β. Эти открытия демонстрируют, что ανβ6 может способствовать регуляции почечного фиброза, и предполагают, что этот интегрин является потенциальной терапевтической мишенью.
Введение.
Прогрессирующий фиброз является общим процессом, приводящим к развитию почечного заболевания терминальной стадии и стимулируется ремоделированием эпителиальной ткани, активацией фибробластов, воспалением и реорганизацией клеточных взаимодействий с внеклеточным матриксом (ЕСМ). Молекулярные механизмы, способствующие этим событиям, являются сложными и включают в себя нарушение регуляции системы Т0Е-3, отклоняющееся от нормы ремоделирование ЕСМ и измененную экспрессию, и функцию рецепторов клеточной адгезии суперсемейства интегринов1-5. В настоящем исследовании выявлены важные регуляторные функции ряда интегринов и ассоциированных с ними молекул в клетках почечного эпителия и мезенхимы.
Среди интегринов, экспрессия которых сильно увеличивается в почечном заболевании, находится Τ0Е-β-индуцируемый интегрин ανβ6 5,9,10. Экспрессия ανβ6 обычно ограничивается эпителиальными клетками, где он экспрессируется при низких уровнях в нормальных развитых тканях и обнаруживает увеличенную экспрессию во время развития, повреждения и неоплазии9,11-13. Хотя ανβ6 экспрессируется при относительно низких уровнях в здоровой развитой почке, его экспрессия является значительной в развивающейся почке мыши, особенно в проксимальных канальцах, петле Генле и прямых почечных канальцах11,12,14. Недавно сообщалась увеличенная экспрессия ανβ6 для различных форм патологии почек человека10.
В соответствии с увеличенной экспрессией ανβ6 ш у1уо во время ремоделирования ткани, экспрессия интегрина ανβ6 в культивируемых эпителиальных клетках могла быть индуцирована цитокинами, которые регулируют эпителиальное ремоделирование, в том числе Е0Е и Т0Е-35-9. Кроме того, было
- 59 016342 показано, что сверхэкспрессия β6 в коже трансгенных мышей провоцирует образование спонтанных хронических ран15, что предполагает, что а^6 может играть важную роль в регуляции ремоделирования эпителиальной ткани.
Известные лиганды для «νβ6 включают в себя фибронектин, тенасцин и ассоциированные с латентностью пептиды 1 и 3 (БАЛ и Ε-ΛΡ3). Ν-концевые фрагменты форм латентных предшественников Т0Еβ1 и Τ0Ε-β316-19. В результате связывания с этими лигандами а^6 может опосредовать адгезию, распространение, миграцию клеток и активацию латентного Τ0Ε-β. Τ0Ε-β синтезируется в виде латентного белка, который отщепляется и секретируется с Ν-концевым БАГ, нековалентно ассоциированным со зрелым, активным С-концевым цитокином Τ0Ε-β. Этот латентный комплекс Τ0Ε-β не может связываться с его когнатным рецептором и, следовательно, остается биологически неактивным, пока он не превращается в его активную форму одним из нескольких альтернативных механизмов, которые включают в себя расщепление протеазами, воздействие низким рН или ионизирующей радиацией и конформационными 20-22 изменениями в латентном комплексе, позволяющими ему связываться с его когнатными рецепторами . Активирующее конформационное изменение может быть индуцировано а^6 посредством прямого связывания этого интегрина с К0О-мотивом, содержащимся в БАИ и БАЕ3. Это связывание превращает ТОЕ-β-предшественник в компетентное в отношении связывания рецептора состояние17,19. Эти открытия предполагают, что повышающая регуляция экспрессии «νβ6 на поверхности эпителиальных клеток может приводить к локальной активации Τ0Ε-β с последующей паракринной активацией ТОЕ-β-зависимых событий в опухолевых клетках с неканоническим антигенным фенотипом. Это могло бы включать в себя возможность непрямых действий далее по ходу процесса на активность Τ0Ε-β, которые могли бы быть опосредованы изменением воспаления и фиброза, прежде всего, в местах экспрессии а^.
Поскольку Τ0Ε-β предположительно считался центральным регулятором почечного фиброза, авторы изобретения высказали гипотезу, что его локальная активация интегрином а^ может быть важным процессом в возникновении и прогрессировании почечного заболевания, и блокада функции а^ могла бы подавлять развитие почечного фиброза. В описанных здесь исследованиях авторы изобретения показывают, что а^б в сильной степени положительно регулируется в мышиной модели фиброза почек и в пробах почек человека с фиброзной патологией. С использованием Сο14А3-/-мышей, модели прогрессирующего заболевания почек, сходного с заболеванием, наблюдаемым в синдроме Альпорта человека, авторы показывают, что тАЬ, блокирующие связывание лиганда и функции активации Τ0Ε-β интегрина а^23, а также генетическая элиминация β6, сильно ингибируют как гломерулярный, так и канальцевоинтерстициальный фиброз, и задерживают деструкцию архитектуры почечной ткани. Авторы показывают, что хотя интегрин а^ имеет экспрессию в почке, ограниченную канальцевыми эпителиальными клетками, он может обеспечивать защитные действия в дистальных участках в этой ткани. Эти открытия выдвигают возможность того, что антифиброзные действия могут также опосредоваться непосредственными внепочечными действиями, наряду с вызыванием действий блокирования а^ на канальцевых эпителиальных клетках. Исследования задержанного лечения указывают на то, что терапевтическая блокада а^б не только ингибирует прогрессирование фиброза почки, но и имеет потенциал создания возможности существующих фиброзных повреждений. Анализ авторов молекулярных ярлыков, которые ассоциированы с прогрессированием заболевания почек и на которые действует ингибирование а^, указывает на то, что терапевтическое действие а^-блокирующих антител является сходным с терапевтическим действием системной блокады Τ0Ε-β и является механистически родственным уменьшенной активности Τ0Ε-β. Эти данные предполагают, что а^6 участвует в регуляции почечного фиброза и мог бы быть новой молекулярной моделью для его терапевтической модуляции.
Материалы и способы.
1. Реагенты.
а^-тАЬ получали, как описано здесь и как описано ранее23. кДНК химерных антител человекмышь 2А1 и 309 получали из тотальных РНК соответствующих исходных гибридом с праймерами константной области СОБ-739 для тяжелой цепи и СЭБ-738 для легкой цепи с использованием набора для синтеза первой цепи кДНК (Ате^8Йат/Ρйа^тас^а, Ρ^8саΐа^ау, ΝΙ). Гены вариабельных областей тяжелой и легкой цепей амплифицировали полимеразной цепной реакцией с использованием 3'-праймеров, использованных для синтеза кДНК, и пулов вырожденных праймеров, специфических для сигнальных последовательностей большинства генов мышиных антител (последовательностей, доступных по запросу), и ДНК-полимеразы Ии (81га1:адепе, Ба 6ο11η, СА). Клонированные вариабельные области тяжелой и легкой цепей лигировали в экспрессирующие векторы млекопитающих с константными областями Ι§01 человека. Слитый белок рекомбинантный растворимый рецептор типа ΙΙ мышиного Τ0Ρ-β-Ι§ (гаТ0ЕβΡ.ΙΙ-Ι§) получали, как описано ранее, и покупали из К&Э 8у51ет5 (532-К2, М^ηηеаρο1^8, М№). Антитела покупали из указанных источников: НТС-конъюгированные пан-анти-цитокератин-тАЬ (С-11), 81дтаА1бпсй (Е3418, 8ΐ. Εουίδ, МО); анти-В1-цепь ламинина-тАЬ (БТ3), Οκιηχοπ (МАВ1928, Тетеси1а, СА); фикоэритрин(РЕ)-конъюгированные анти-ау-тАЬ (КМУ7), ΟκιηΚοπ (СВ^1346Ρ); кроличьи анти-ауантитела, Οκιηχοπ (АВ1930); Ι§01 РЕ-крысы, ВО Вюкаепсек (553925, 8ап Лке, СА) и антитела против
- 60 016342 актина гладких мышц (8МА)-Су3, 81дта-А1бпсй (С-6198). Авторы идентифицировали кроличье поликлональное анти-Τ6Р-β-антитело, 8ап!а Сгих В1о!есйпо1оду (кх-146, 8ап!а Сгих, СА) в качестве антитела, которое преимущественно связывает срезы ксенотрансплантата клеток 293, экспрессирующих конститутивно активную форму Т6Р-[, в сравнении со срезами ксенотрансплантатов клеток 293, экспрессирующих латентный ТСР-β2'1.
2. Животные.
Со14А3+/- мышей в фенотипе 12 98ν/1 получали от доктора Оо1шпк|ие Сокдгоуе (Воу'к То\уп №йопа1 Яекеагсй Нокрйа1, Отайа, ΝΞ) и спаривали с получением Со14А3-/- мышей для исследований с использованием инъекций. β6-/- мышей в фенотипе 1298У получали от доктора Эеап 8йеррагб (Ишуегкйу о£ СаШогша 8ап Ргапс1ксо, СА) и скрещивали с Со14А3+/- мышами. Всех животных содержали в Вшдеп Иес и все исследования с животными были санкционированы и проводились в соответствии с требованиями Iηк!^!иΐ^оηа1 Ашта1 Саге апб Ике СотпиНее.
3. Проточная цитометрия.
Мышиные стабильно трансфицированные β6 клетки МН3Т3 (NIΗ3Τ3β6) получали, как описано ранее23. Клетки собирали трипсинизацией, промывали в ЗФР и ресуспендировали в РС-буфере (1Х ЗФР, 2% ФТС, 0,1% №N3, 1 мМ СаС12 и 1 мМ МдС12). 0,2х105 клеток инкубировали на льду в течение 1 ч в РСбуфере, содержащем очищенные первичные антитела, в общем объеме 100 мкл. После инкубации клетки промывали два раза охлажденным на льду РС-буфером и ресуспендировали в 100 мкл РС-буфера, содержащего 5 мкг/мл РЕ-конъюгированного ослиного антитела против мышиного ΙβΟ Цасккоп IшшиπоЯекеагсй), и инкубировали на льду в течение 30 мин. Для мониторинга экспрессии «ν клетки инкубировали с РЕ-конъюгированным крысиным тАЬ против мышиного «ν (ЯМУ-7) и РЕ-конъюгированным крысиным Ι§61 в качестве контроля. Клетки промывали два раза охлажденным на льду РС-буфером и связывание меченого вторичного антитела подвергали мониторингу проточной цитометрией.
Иммуногистохимия.
Среды ткани депарафинизировали в ксилоле и этаноле, повторно гидратировали в дистиллированной воде и затем погружали в метанол, содержащий 0,45% Н2О. Ткани инкубировали с пепсином (003009, 2утеб, 8ап Ргапаксо, СА) и блокировали авидином и биотином (8Р-2001; Уес!ог ЬаЬога!опек, Виг1шдате, СА). Первичное антитело разводили в ЗФР, содержащем 0,1% бычий сывороточный альбумин (БСА), и ткани инкубировали в течение ночи при 4°С. Для иммуноокрашивания β6 на ткани мыши срезы инкубировали с химерной формой человек/мышь анти-ανβ6-тАЬ, 2А123, и биотинилированным вторичным анти-человеческим антителом (РК-6103, Уес!ог ЬаЬога!опек, Вигйпдате, СА). Для иммуноокрашивания β6 на ткани человека срезы инкубировали с мышиным 2А123 и антимышиным-биотинилированным вторичным антителом (РК-6102, Уес!ог ЬаЬога!опек). Комплекс авидин-биотин-пероксидаза хрена (Уес!ог К1!, РК-6102) наносили на срезы, инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре и готовили субстрат 3,3'-диаминобензидин (ПАВ), согласно рекомендациям (8К-4100, Уес!ог ЬаЬога!опек), и наносили на срезы и выдерживали в течение 5 мин при комнатной температуре. Срезы ткани окрашивали гематоксилином Майера в течение 1 мин и промывали в воде и ЗФР.
Замороженные срезы тканей, залитые в О.С.Т.
Соединение (Са!.# 4583, 8акига Токуо, 1арап) фиксировали в ацетоне и блокировали 0,5% казеином/0,05% тимеросалом в ЗФР. Для иммуноокрашивания β6 на ткани человека срезы инкубировали с мышиным антителом 2А123 и А1еха йиог 594-конъюгированным вторичным антимышиным антителом (А-11032, Мо1еси1аг РгоЬек Еидеп, Огедоп). Для иммуноокрашивания β6 на ткани мыши срезы инкубировали с химерной формой человек/мышь 2А1 и А1еха йиог 594-конъюгированным вторичным антителом против иммуноглобулина человека (А-11014, Мо1еси1аг РгоЬек). Все другие антитела конъюгировали непосредственно, как указано ранее. Все изображения получали при увеличении 20Х, за исключением фиг. 2А, которую получали при 40Х. Все пробы ткани человека получали с санкционирования местного ведомства и согласия пациента.
5. Количественная оценка иммуногистохимии.
8МА-окрашивание оценивали количественно с использованием программы Ме!аМогрй у.5.0 (Ишуегка1 Инадтд Согрогабоп, 8иппууа1е, СА) и выражали в виде процента, положительного относительно общего размера изображения. Для каждого животного анализировали 20Х-изображения по меньшей мере из 5 срезов коркового вещества и 1-2 срезов мозгового вещества. Статистический анализ групп обработки проводили с использованием АNОУА.
6. Лечение Со14А3-/- мышей с использованием тАЬ и комплекса.
^кΤ6Р-βЯII-Iд. Со14А3+ -/- мышей в фенотипе 1298ν/1 спаривали для получения Со14А3-/- мышей. Мышей инъецировали внутрибрюшинно белками три раза в неделю с 3-недельного возраста до 7- или 8,5-недельного возраста, как указано. тАЬ инъецировали внутрибрюшинно при 4 мг/кг, а ^кΤ6Р-βЯII-Iд инъецировали при 2 мг/кг. Мышей эвтанизировали и почки собирали для выделения РНК и окрашивания. Все исследования на животных были санкционированы и проводились в соответствии с требованиями Iηк!^!иΐ^оηа1 Ашта1 Саге апб Ике СоттШее.
7. Очистка тотальной РНК и синтез кДНК.
- 61 016342
Почки гомогенизировали непосредственно в ТКIζο1 (155-96-018, ^йгодеп, Саг1кЬай, СА) и РНК экстрагировали в соответствии с протоколом изготовителя с дополнительной экстракцией 1 мл смеси подкисленного фенол:хлороформ:изоамиловый спирт 25:24:1 рН 6,6. Очищенную тотальную РНК ресуспендировали в диэтилпирокарбонате (ЭЕРК), обработанном водой (АтЫоп Шс, Аикйп, ТХ), и регистрировали при 260 и 280 нм (8рес!га тах Р1ик, Мо1еси1аг йсхек, 8иηηуνа1е, СА). Оставшуюся ДНК удаляли с использованием 5 единиц ДНКазы Ι категории амплификации (са!# 18068-015, ^Илодеи) при 20°С в течение 15 мин. кДНК генерировали с использованием высокопроизводительного архивного набора кДНК в соответствии с протоколом изготовления (са!# 4322171, АррИей Вюкук!етк Шс. Еок!ег Сйу, СА).
8. Конструирование праимеров, зондов и олигонуклеотидных стандартных матриц для Тацтап.
Олигонуклеотидные праймеры и зонды Тацтап М0В конструировали из консенсусных последовательностей АГГутейх с использованием Рптег Ехргекк гегкюп 2.0.0 (Аррйей Вюкук!етк Шс.). Зонды Тацтап М0В конструировали с 5'-ковалентносвязанным флуоресцентным репортерным красителем (ЕАМ) и связывающим агентом малой бороздки/нефлуоресцентным гасителем (М0ВКЕ), ковалентно связанным с 3'-концом. Олигонуклеотидные стандартные матрицы конструировали добавлением 10 п.н. ген-специфической последовательности к 5'- и 3'-концам этого ампликона. Очищенные обращеннофазовой ВЖХ праймеры и олигонуклеотидные стандартные матрицы покупали из Вюкеагсй !есНпо1од1ек Шс., Nονа!ο, СА.
ВЖХ-очищенные праймеры и зонд для мышиной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (0АРОН) синтезировали в Вюдеп Шее [САТ00ССТТСС0Т0ТТССТА, 0С00САС0ТСА0АТСС, 6ЕАМССССААТ0Т0ТСС0ТС] (обозначенные 8ЕС) ΙΌ N0: 147, 8ЕО ΙΌ N0: 148 и 8ЕО ΙΌ N0: 149 соответственно).
9. Термоциклирование Тацтап.
ПЦР-реакции в четырех повторностях для проб и стандартов проводили в термоциклере 7900НТ (Аррйей Вюкук!етк Шс.) при следующих условиях: 50°С в течение 2 мин (продукт расщепления N дегликозилазы), 95°С в течение 10 мин (активация термостабильной полимеразы Тас.|) и 40 циклов 95°С в течение 15 с и 60°С в течение 60 с. Испускание флуоресценции собирали каждые 7 с на протяжении продолжительности этого опыта для каждой реакционной лунки. Относительные количества транскрипта определяли для каждой пробы сравнением с кривой олигонуклеотидных стандартов с использованием программы детектирования последовательностей (Аррйей Вюкук!етк, Ечс.).
10. Мечение зондов, гибридизация и сканирование для анализа профиля транскриптов.
Мечение проб, гибридизацию и окрашивание проводили в соответствии с протоколом Еикагуойс Тагде! Ргерага!юп рго!осо1 ш !Не ЛГГутеι^^x Тес11шса1 Мапиа1 (701021 тех 1) для СепесЫр® Ехргеккюп Апа1ук1к (ЛΓΓутеι^^x. 8ап!а С1ага, СА). Вкратце, 5 мкг очищенной тотальной РНК использовали в 20 мкл реакции первой цепи с 200 Е 8ирегкспр! ΙΙ (са!# 18064-022, ^Шодей) и 0,5 мкг (йТ)-Т7 праймера [5'00ССА0Т0ААТТ0ТААТАС0АСТСАСТАТА000А00С00(Т24)] (8ЕО ΙΌ N0: 150) при 42°С в течение 1 ч. Синтез второй цепи проводили добавлением 40 Е ДНК-полимеразы Е.со11 (са!# 18010-025, Ιπνί!годеп), 2 Е РНКазы Н Е.со11 (са!# 18021-071, Iην^ΐ^οдеη) и 10 Е ДНК-лигазы Е.соН (са!# 18052-019, Ιπνί(годеп) с последующим инкубированием при 16°С в течение 2 ч. Продукт реакции синтеза второй цепи очищали с использованием 0епесЫр® 8атр1е С1еапир Мойи1е в соответствии с протоколом изготовителя (са!# 900371, Айутейзх, 8ап!а С1ага, СА). Очищенную кДНК амплифицировали с использованием набора ВюАггау для мечения транскрипции РНК с высоким выходом (са!# 42655-40, Епхо ЬгГе 8с1епсек, 1пс., Рагтшдйа1е, ΚΥ) в соответствии с протоколом изготовителя с получением 70-120 мкг меченной биотином кРНК (комплементарной РНК). Матрицы мышиных зондов Μдυ74Аν2, Μдυ74Вν2 и Мди74Су2 0епеСЫр® предварительно гибридизовали в 0епеСЫр® НуЬпй|/а1юп 0усп 640 (ЛΓΓутеι^^x. 8ап!а С1ага, СА) в соответствии с протоколом изготовителя. Фрагментированную меченую кРНК ресуспендировали в 300 мкл ΙΧ буфера для гибридизации, содержащего 100 мМ 2-морфолиноэтансульфоновую кислоту, 1М [№+], 20 мМ ЭДТА, 0,01% Твин 20, 0,5 мг/мл ацетилированного БСА, 0,1 мг/мл ДНК спермы сельди, контрольный олиго В2 и контрольные транскрипты ЬюВ 1,5 пМ, ЬюС 5 пМ, ЬюЭ 25 пМ и сге 100 пМ, и гибридизовали с матрицами зондов 0епесЫр® в соответствии с протоколом изготовителя (ЛΓΓутеι^^x. 8ап!а С1ага, СА). Гибридизованные матрицы зондов 0епеСЫр® промывали и окрашивали с использованием стрептавидина-фикоэритрина (са!# 8866, Мо1еси1аг РгоЬек, Еидепе, 0К) и амплифицировали с биотинилированным антистрептавидин-антителом (ВА-0500, Уес!ог ЬаЬога!ог1ек, Виг1шдате, СА) с использованием 0епеСЫр® Е1шйюк 81айоп 400 (ЛΓΓутеι^^x. 8ап!а С1ага, СА). Матрицы зондов 0епеСЫр® сканировали с использованием сканера матриц генов 0епеАггау 8саппег (НеМей Раскагй, СогуаШк, 0К).
11. Анализ данных профилей транскриптов.
Сканы этих матриц превращали в файлы ЛΓΓутеι^^x.СЕ^ и полученный набор данных (группу.СЕЬфайлов, представляющую весь эксперимент) нормализовали с использованием способа КоЬик! Мюгоаггау Аνе^аде (КМА). Статистический и кластерный анализы выполняли с использованием инструментов получения данных 0епе8ргшд (Адйеп!) и 8роШге (8ройле). Авторы изобретения использовали двухступенчатый АN0VА и фильтрацию кратности изменения (Го1й-сНапде) для идентификации наборов зондов, сигнал интенсивности которых изменялся экспериментальной обработкой в сравнении с необработанной
- 62 016342
Со14а3-/-группой при р<0,05 и по меньшей мере 2-кратно. Подобным образом, ассоциированные с заболеванием транскрипты отбирали на дифференциальную экспрессию между необработанной Со14а3-нульгруппой и необработанными группами дикого типа с использованием статистического предела р<0,01 и предела кратности изменения сигнала 2. Профили полученной группы генов и группирования экспериментальных условий анализировали и визуализировали иерархическим разбиением на группы. Виртуальный анализ пути выполняли с использованием базы данных 1пдепибу РаШхуау Апа1ук1к ба!аЬаке (1пдепибу 8ук!етк).
Результаты.
1. Экспрессия ανβ6 в пробах почки человека с фиброзной патологией.
Несколько различных типов заболевания почек человека, ассоциированных с воспалительной/фиброзной патологией, показали соответствующую увеличенную экспрессию ТСтР-β в ткани почек25-27. С использованием иммуногистохимического анализа авторы изобретения испытывали экспрессию ανβ6 в пробах биопсии почки человека, ассоциированных с хроническим воспалением и фиброзом в качестве потенциального механизма, приводящего к увеличенной активации ТСЕ-β (фиг. 29А и 29В). Пробы ткани из мембранозного гломерулонефрита, сахарного диабета, 1дА-нефропатии, болезни Гудпасчера, синдрома Альпорта и волчанки, - все обнаруживали значительное α^-окрашивание в эпителиальной выстилке расширенных и поврежденных канальцев. В противоположность этому, пробы морфологически здоровых почек (почечный рак и нормальная ткань) обнаруживали минимальное случайное иммуноокрашивание в канальцах. Гломерулярное окрашивание отсутствовало во всех анализированных пробах почек.
Это открытие согласуется с более ранними сообщениями, что ανβ6 экспрессируется при низких уровнях в здоровом развитом эпителии, но положительно регулируется во время повреждения и репарации ткани10,11,13,15,17.
2. Экспрессия ανβ6 в почках Со14А3-/- мышей коррелирует с прогрессированием фиброза почек.
Со14А3-/- мыши, мышиная модель заболевания Альпорта человека, развивают прогрессирующий гломерулонефрит, приводящий к накоплению ЕСМ как в гломерулярных, так и интерстициальных участках почки, сопровождающемуся увеличенной экспрессией ряда стандартных маркеров фиброза28-29. Ранее сообщалось, что лечение Со14А3-/-мышей с использованием ^кТОТ-βКII-Iд приводит к ингибированию фиброза почек7. Почки из Со14А3-/- мышей начинают обнаруживать гистологические признаки фиброза при приблизительно 5-6-недельном возрасте. Это заболевание прогрессирует быстро с возрастом, и мыши умирают от почечной недостаточности при приблизительно 11 неделях. Гетерозиготные Со14А3+/- мыши не развивают гломерулонефрит, и их почки являются гистологически неотличимыми от почек однопометных мышей дикого типа. Для испытания динамики экспрессии ανβ6 в почках Со14А3+/и Со14А3-/- (А1роб) мышей с увеличением возраста, авторы изобретения выполняли иммуногистохимический анализ экспрессии ανβ6 в почках, выделенных из 4-, 7- и 8-недельных мышей (фиг. 30А-С). При 4недельном возрасте была случайная экспрессия ανβ6 в почечных канальцах как мышей Со14А3+/-, так и мышей Со14А3-/-. При 7 неделях экспрессия ανβ6 заметно увеличивалась в канальцевых эпителиальных клетках почек Со14А3-/- мышей, но не Со14А3+/-мышей. Эта увеличенная экспрессия ανβ6 сохранялась в Со14А3-/-мышах более чем 8-недельного возраста. Авторы изобретения наблюдали также увеличение интенсивности окрашивания ανβ6 в эпителиальных клетках расширенных и поврежденных канальцев в Со14А3-/- (А1роб) мышах после 6-недельного возраста, что сопровождалось значительным увеличением площади почечной ткани, проявляющей сильную экспрессию ανβ6. Эта увеличенная экспрессия во время 7-8-недельного периода возраста совпадала с быстрым прогрессированием фиброза почек в Со14А3-/мышах. В противоположность этому, только минимальную экспрессию ανβ6 и слабо детектируемое, зависимое от возраста увеличение интенсивности его иммуноокрашивания детектировали в почках Со14А3+/- мышей на протяжении этого временного периода. Поскольку экспрессия ανβ6 в почках Со14А3-/- мышей коррелировала с прогрессированием фиброза, авторы изобретения хотели определить, могла бы блокада функции ανβ6 ингибировать инициацию и прогрессирование фиброзных повреждений.
3. Специфичность связывания тАЬ с ανβ6 в почках Со14А3-/-мышей.
Авторы изобретения ранее сообщали о генерировании сильных и селективных анти-а^-тАЬ, в том числе тАЬ, которые связываются с ανβ6 без влияния на его способность связывать лиганды (неблокирующих тАЬ), и тАЬ, которые блокируют как связывание лигандов, так и а.ДЬ-опосредованную активацию ТОР-β (блокирующих тАЬ). Для подтверждения, что а^-блокирующие тАЬ, использованные для исследований ш у1уо, были селективными в отношении связывания с интегрином ανβ6, авторы изобретения проводили ЕАС8-анализ (фиг. 31 А), сравнивающий связывание α,.β6-ιΐ'ΐΛό с нетрансфицированными исходными клетками МН3Т3 и с клетками МН3Т3, трансфицированными кДНК мышиного β6 (N1Н3Т3β6). В то время как контрольное анти-αν-тΛЬ, КМУ7, окрашивало как нетрансфицированные, так и α,,βί,-экспрессирующие клетки МН3Т3, анти-ανβ6-тΛЬ селективно связывали только клетки NIН3Т3β6. Для подтверждения специфичности связывания ανβ6 в почках авторы изобретения генерировали химерную форму человек-мышь одного из блокирующих ανβ6 тАЬ, 309, и сравнивали распределе
- 63 016342 ние иммуноокрашивания, получаемого с кроличьим поликлональным анти-«ν-антителом (фиг. 31В и 31С). Эта химерная форма и исходная мышиная форма 309 имели сравнимые аффинности связывания мишени, как определено при помощи РАС8 и ЕЫ8А (данные не показаны). Химерная форма 309 специфически иммуноокрашивала канальцевые эпителиальные клетки с почках Со14А3-/- мышей и не обнаруживала иммуноокрашивания срезов почки из Со14А3-/- мышей, скрещенных с β6-/- мышами (Со14А3-/-; β6-/-). Иммуноокрашивание почек анти-«ν-антителом не обнаруживало значимых различий между Со14А3-/- мышами или Со14А3-/-; β6-/- мышами.
4. Лечение Со14А3-/- (Альпорт) мышей анти-«νβ6-тАЬ ингибирует фиброз почек.
Для определения потенциального функционального участия (/νβ6 в регуляции фиброза почек авторы изобретения испытывали способность блокирующих /νβ6 тАЬ влиять на инициацию и прогрессирование запущенных фиброзных повреждений. Для оценивания превентивных действий «ДБ-блокады Со14А3-/- мышей обрабатывали с 3-недельного до 7-недельного возраста или с 3-недельного до 8,5недельного возраста двумя разными блокирующими (/νβ6 тАЬ, 309 или 806; неблокирующим /νβ6 тАЬ, 6.8В3, или тАЬ отрицательного контроля того же изотипа, 1Е6. Для фенотипического контроля и для мониторинга действий системного ингибирования ТСР-β эти исследования включали в себя также Со14А3-/- мышей, обработанных 1^0^(^11-18. Почки собирали для гистологического оценивания и для выделения РНК. Гистологические отличительные признаки фиброза, а также экспрессия 8МА разительно увеличивались в Со14А3-/- почках при 7 и 8,5 неделях в сравнении с почками Со14А3+/- мышей того же возраста. Почки из обработанных тАЬ отрицательного контроля Со14А3-/- мышей обнаруживали расширенный и фиброзный гломерулярный мезангий и серповидное образование в боуменовой капсуле (фиг. 32А, 1Е6). Эти почки обнаруживали также заметную активацию миофибробластов и интерстициальный фиброз, который был ассоциирован с канальцевым эпителиальным патологическим изменением и расширением. Лечение Со14А3-/- мышей блокирующими /νβ6 тАЬ, 6.309 или 6.806 заметно уменьшало гломерулярное и интерстициальное повреждение и фиброз, приводя к значительному макроскопическому сохранению архитектуры почек (фиг. 32А, 309 и 806). Эти действия блокирующих /νβ6 тАЬ сопровождались уменьшением экспрессии 8МА на >65% в клубочках и на >90% в интерстициальных участках (фиг. 32В и 32С). Действие блокирующих тАЬ на экспрессию 8МА в клубочках предполагает, что хотя экспрессия интегрина </νβ6 ограничена канальцевыми эпителиальными клетками, блокирование их функции может влиять на более дистальные участки в этой ткани, что могло бы быть опосредовано, по меньшей мере частично, непрямыми системными действиями блокирующих (/νβ6 тАЬ. Не наблюдали действия на прогрессирование фиброза в почках Со14А3-/- мышей, инъецированных не блокирующим </νβ6 тАЬ, 8В3. В соответствии с ранее сообщенным ингибированием фиброза почек посредством блокады ТСР-β7,30-33, лечение Со14А3-/- мышей ^8Τ0Ρ-βΚII-Iд вызывало ингибирование почечного фиброза, сходное с ингибированием, производимым блокирующими /νβ6 тАЬ, как можно судить по изменениям гистологического вида и содержания 8МА тканей почек. Действия /^-блокирующих тАЬ на экспрессию 8МА происходили параллельно уменьшению общих тканевых уровней мРНК коллагена-1(/1 и коллагена-1/2 (фиг. 33А и 33В). Лечение Со14А3-/- мышей 309, 806 или ^8Τ0Ρ-βΚII-Iд вызывало значимое уменьшение содержания мРНК коллагена-1/1 и коллагена-1/2, тогда как не блокирующее /νβ6 тАЬ и контрольное тАЬ того же изотипа не оказывали значимого действия на уровни этих транскриптов.
Для испытания действия /^-блокады на прогрессирующий фиброз почек авторы изобретения исследовали действия /^-блокирующих тАЬ на фиброз почек в шестинедельных Со14А3-/-мышах, когда патология почек проявляется измеримым повреждением и накоплением 8МА-положительных активированных фибробластов. Мышей обрабатывали /^-блокирующим тАЬ, 309, или контрольным тАЬ того же изотипа, 1Е6, в течение 2,5 недель и затем умерщвляли в 8,5-недельном возрасте. Количественное определение иммуноокрашивания 8МА обнаруживало уменьшение присутствия 8МА-положительных фибропластов в почках из Со14А3-/- мышей, обработанных 309, в сравнении с мышами, обработанными контрольным тАЬ того же изотипа (фиг. 34А). Важно также, что интенсивность и площадь иммуноокрашивания 8МА с задержанной обработкой уменьшались в сравнении с уровнем 8МА, наблюдаемым при начале обработки (6 неделях). Задержанная обработка Со14А3-/- мышей 309 индуцировала явное обращение патологии, в том числе значимое уменьшение поврежденных канальцев и фиброза в интерстиции в сравнении с почками, выделенными из Со14А3-/-мышей, обработанных 1Е6.
Эти результаты предполагают, что терапевтическая блокада /νβ6 не только ингибирует прогрессирование почечного фиброза, но и может сделать возможным рассасывание существующих фиброзных повреждений.
5. Регуляция экспрессии генов почек с использованием анти-«νβ6-тАЬ.
Для дополнительного проникновения в суть механизмов заболеваний, связанных с функцией /νβ6, авторы выполняли анализ экспрессии генов АГГуте1пх 0епеСЫр в тканях почек из мышей дикого типа и мышей с болезнью Альпорта. Идентифицировали группу генов с измененной экспрессией в Со14а3-/почках в виде 395 наборов зондов, обнаруживающих по меньшей мере 2-кратное среднее различие в нормализованной интенсивности сигнала между соответствующими 7-недельными Со14А3-/- почками
- 64 016342 дикого типа при р<0,01 (фиг. 35). Функциональное аннотирование дифференциально экспрессированных генов выполняли с использованием в качестве инструмента анализа 1пдепш1у Ра111\гау Апа1у818 (1РА), и оно показало преимущественную ассоциацию генов, сверхэкспрессируемых в Со14А3-/- почках, с воспалением и регуляцией функции лейкоцитов, в то время как гены, экспрессия которых уменьшалась, были ассоциированы прежде всего с метаболической регуляцией (фиг. 36).
Обработка этих животных «^-блокирующими тАЬ ослабляла дифференциальную экспрессию субпопуляции генов в Со14А3-/- почках. Авторы изобретения использовали дисперсионный анализ (Же1с1 АNОVА) для идентификации транскриптов, на которые экспериментальные обработки действовали при р<0,05, и полученные наборы зондов дополнительно фильтровали для отбора наборов зондов, обнаруживающих по меньшей мере 2-кратное различие в интенсивности сигнала в ответ на обработку. Эта процедура давала 56, 42 и 28 наборов зондов, на которые значимо влияли 309, 806 и Τ0ЕβКII-Ес, соответственно. Эти группы наборов зондов обнаруживали значительное перекрывание, и каждая из этих групп представляла полностью включенную субпопуляцию из 395 наборов зондов, соответствующих транскриптам, дифференциально экспрессируемым в Со14А3-/- почках (фиг. 37 А). Авторы наблюдали сходную модуляцию экспрессии генов «^-блокирующими тАЬ 309 и 806 (фиг. 35, 37А), которые, как было показано ранее, принадлежат к двум разным биохимическим классам23. Ни неблокирующее ανβ6 тАЬ 8В3, ни изотипически сходное контрольное тАЬ 1Е6 не оказывали значимого действия на экспрессию генов. Таким образом, действие «^6-тАЬ на экспрессию генов в почках было, вероятно, обусловлено блокадой функции ανβ6, а не активацией передачи сигнала интегрина или неспецифическими событиями. Авторы изобретения не обнаружили значимых действий «^-блокирующего тАЬ 309 на экспрессию генов в здоровой ткани почки дикого типа. Это наблюдение предполагало, что действия ανβ6блокирующих тАЬ в экспериментах авторов отражали, прежде всего, специфические в отношении заболевания регуляторные функции ανβ6.
Для исследования потенциальных взаимосвязей генов, модулируемых «^6-тАЬ, с основными регуляторными путями, авторы подвергали перечни соответствующих генов виртуальному анализу регуляторной сети с использованием программного обеспечения 1РА (фиг. 37). 1РА сравнивает перечни генов, обеспечиваемые в виде ввода хранимой базы данных известных физических и регуляторных взаимодействий между генами и белками. Этот анализ дает ранжированный перечень и индивидуальные конфигурации регуляторных путей, которые должны с наибольшей вероятностью отражать указанный перечень модулированных генов. Хотя перечни генов, модулируемых 309 и 806, не были полностью идентичными, 1РА выявил Τ0Е-β-зависимые сети в виде регуляторных сетей наивысшей оценки, на которые действует 309 (фиг. 37А), а также 806 (фиг. 37В). В соответствии с этим открытием, иерархическая кластеризация средних профилей экспрессии генов этой экспериментальной группы продемонстрировала сходство между распределениями модуляции генов посредством «^6-тАЬ и посредством ^8Τ0ЕβКII-Iд (фиг. 35).
6. Блокада ανβ6 уменьшает экспрессию Т0Е-3 в Со14А3 -/- почках.
Для определения, был ли уменьшенный фиброз почек, обнаруженный с лечением при помощи 309и 806-тАЬ, связан с уменьшенной экспрессией Т0Е-3, срезы почек иммуноокрашивали с использованием анти-Τ0Е-β1-тАЬ (фиг. 38А). тАЬ, которое использовали для иммуноокрашивания, был тАЬ, которое преимущественно связывается со срезами тканей, экспрессирующих конститутивно активный Т0Е-3 относительно латентного Т0Е-3 (данные не показаны)24. Обработка этих мышей 309 или 806 вызывала значимое уменьшение иммуноокрашивания Т0Е-31 как в интерстициальных, так и в клубочковых участках этих почек. Эти изменения в экспрессии Т0Е-3 сопровождались аналогичными изменениями в общих тканевых уровнях мРНК Т0Е-3 (фиг. 38В). Распределение иммуноокрашивания Т0Е-31 показало, что хотя экспрессия ανβ6 ограничена эпителиальной выстилкой почечных канальцев, ингибирование функции ανβ6 могло бы приводить к уменьшенной экспрессии Т0Е-3 в дистальных участках, таких как гломерулярные участки, которые не являются непосредственно смежными с зонами экспрессии ανβ6. Это может предполагать, что хотя ανβ6 мог бы служить в качестве начального триггера локальной активации ТСЕ-β, он мог бы также производить регуляторные эффекты дальнего действия на Т0Е-3. Один возможный механизм таких эффектов дальнего действия мог бы быть основан на способности Т0Е-3 активировать свою собственную экспрессию аутокринным или паракринным образом, приводя к экспансии Т0Еβ-экспрессирующих зон ткани. Это также включает в себя возможность того, что начальное локальное ингибирование активации Т0Е-3 блокадой ανβ6 мешает процессу воспаления и фиброзу, что могло бы затем непосредственно дополнительно понижающим образом модулировать активность Т0Е-3.
7. Генетическое удаление гена β6 в Со14А3-/- мышах.
Для валидизации открытий из экспериментов с тАЬ авторы изобретения генерировали мышей с двойным нокаутом Со14А3 и β6 (Со14А3-/-; β6-/-). Гистологическое исследование почек Со14А3-/-; β6+/- и Со14А3-/-; β6-/- мышей подтвердило результаты, полученные в исследованиях с «^-блокирующими тАЬ. Было значимое уменьшение иммуноокрашивания ЗМА в почках из 7-10-недельных Со14А3-/-; β6-/
- 65 016342 мышей в сравнении с Со14А3-/-; β6+/- мышами того же возраста (данные не показаны). Это сопровождалось разительным уменьшением фиброза в гломерулярных и интерстициальных участках почек (фиг. 39). Это продемонстрировано уменьшением экспрессии коллагена и хорошо сохраненной архитектурой почек, как наблюдали в окрашенных трехцветным красителем Трихром Массона почках из 10-недельных Со14А3-/-; β6-/- мышей в сравнении с почками из Со14А3-/-; β6+/- мышей. Эта согласованность антифиброзных действий, наблюдаемых с обработкой а^-блокирующими тАЬ в сравнении с генетическим удалением функции β6, указывает на то, что обработка тАЬ является эффективным подходом к блокированию функции а^ ш νίνο.
8. Зависимость доза-ответ 3Ο9-ингибирования фиброза почек в Со14А3-/- мышах.
Со14А3-/- мышей обрабатывали 3 раза в неделю увеличивающимися концентрациями 3Ο9. Мышей обрабатывали с 3-недельного возраста до 7-недельного возраста и затем умерщвляли. Иммуногистохимический анализ 8МА выполняли как в области коркового вещества почки, так и в области мозгового вещества почки. Титрование дозы показало, что 3Ο9 ингибировал экспрессию 8МА с ЕИ50 0,3-0,4 мг/кг в Со14А3-/- мышах (фиг. 40).
Обсуждение.
Прогрессирование почечного заболевания сопровождается интенсивным ремоделированием ткани, воспалением и образованием фиброзных повреждений, в конечном счете приводящим к потере почечной функции. Фиброз является центральным для этого процесса и включает в себя активацию и экспансию фибробластов, неоваскуляризацию патологической ткани и массивное отложение внеклеточного матрикса. Молекулярные механизмы, которые рассматриваются в качестве основной движущей силы этих событий, включают в себя нарушение регуляции ΤΟΡ-β-системы, сопровождающееся измененной экспрессией белков ЕСМ и их рецепторов в клетках, имеющих фиброзные повреждения34-36. Повышенная экспрессия ΤΟΡ-β является отличительным признаком фиброзных тканей человека25-27, и функциональная важность ΤΟΡ-β в стимуляции фиброза тканей была документирована ш νίίΓο и в моделях животных. Сверхэкспрессия ΤΟΡ-β является достаточной для индукции активации фмбробластов и ангиогенеза ш νίνο и для активации избыточного продуцирования ЕСМ в органотипических и клеточных культурах34,37,38. Напротив, генетическое или фармакологическое разрушение передачи сигнала ΤΟΡ-β обеспечивает эффективную защиту от фиброза в моделях легочного, кожного и почечного фиброза30,32,33,39-41.
Несколько исследований, направленных на системное ингибирование функции ΤΟΡ-β (блокирующие тАЬ, Γ8ΤΟΡ-βΚΙΙ-Ι§, киназные ингибиторы рецептора ΤΟΡ-β), показали, что все эти агенты ослабляют фиброз в моделях заболеваний животных. Однако все из этих подходов были нацелены на блокирование активированной формы ΤΟΡ-β, в то время как терапевтический потенциал агентов, которые могут блокировать активацию ΤΟΡ-β, оставался менее исследованным. ΤΟΡ-β экспрессируется в виде латентного предшественника и может быть превращен в биологически активный цитокин рядом механизмов, которые включают в себя молекулы активного кислорода, рН, тромбоспондин-1, внеклеточные протеазы и интегрины21,42-44. Особый интерес среди интегринов представляет а^, ΤΟΡ-β-индуцируемый интегрин, экспрессируемый в участках эпителиального ремоделирования, который, как показано, функционирует в качестве рецептора и активатора латентного ΤΟΡ-β11,17,45. Субъединица β6 положительно регулируется в нескольких формах почечного заболевания19, и было показано, что ее генетическое удаление обеспечивает заметную защиту от индуцированного повреждением почечного фиброза в мышиной модели односторонней уретральной закупорки (ИИО)46. Сходную защиту β,-недостаточных мышей от фиброза наблюдали в индуцированной блеомицином модели фиброза легкого, что позволяет предположить, что а^е может опосредовать фиброз в различных тканях17,47. Интересно, что ИИОиндуцированное фосфорилирование 8МАИ2, центрального медиатора передачи сигнала ΤΟΡ-β, заметно ослаблялось в β,-недостаточных почках, что свидетельствовало о том, что а^, действительно может функционировать ш νίνο в качестве части регуляторной цепи ΤΟΡ-β46.
Предыдущие исследования с мышами с нокаутом β6 обеспечили доказательства, что а^ может играть роль в инициировании фиброза, что предполагает, что этот интегрин является потенциальной новой терапевтической мишенью. Авторы изобретения пытались определить, может ли фармацевтическое ингибирование функции а^, блокирующими тАЬ уменьшить почечный фиброз в Со14А3-/- мышах, модели аутосомного рецессивного синдрома Альпорта животного28,29. Синдром Альпорта является наследственным заболеванием, вызываемым мутациями в генах Со14А3, Со14А4 или Со14А548. Дефекты в этих генах приводят к отклоняющейся от нормы сборке сетей коллагена ГУ и отклоняющегося от нормы образования гломерулярных и канальцевых базальных мембран. Пациенты с синдромом Альпорта развивают прогрессирующий гломерулонефрит, который приводит к терминальной стадии почечной недостаточности. Авторы наблюдали явную положительную регуляцию а^ в человеке с синдромом Альпорта, а также в мышиных Со14А3-/- тканях почек. В почке Со14А3-/- мыши увеличенная экспрессия а^ была особенно существенной в канальцевом эпителии, где она предшествовала широкой экспансии 8МАположительных клеток и отложению коллагена и сопровождала эти процессы. На основе этого распределения экспрессии авторы изобретения высказали гипотезу, что а^ становится положительно регули
- 66 016342 руемым рано в цикле эпителиальной реакции на повреждение и может быть важным медиатором как в инициировании, так и в поддержании фиброза в условиях стойкого эпителиального повреждения. Эти результаты исследований авторов показывают, что антитело-опосредованная блокада а^6 может ингибировать инициирование, а также раннее прогрессирование почечного фиброза и подавлять его поддержание. В соответствии с предыдущими открытиями с использованием модели υυΟ β6-недостаточной мыши46, эти антифиброзные эффекты а^-блокирующих тАЬ, наблюдаемые в экспериментах авторов, коррелировали с уменьшенной активностью и экспрессией Τ0Ε-β.
Интересно, что явное уменьшение экспрессии Τ0Ε-β и 8МА после лечения а^-тАЬ наблюдалось не только вблизи а^-положительных клеток, но было детектируемым также в относительно удаленных участках ткани. Хотя это открытие может предполагать, что а^6 может способствовать активации системы Τ0Ε-β как непосредственно, так и непрямым образом, например через паракринную аутоактивацию экспрессии Τ0Ε-β, это не исключает возможности того, что а^-блокада может обеспечивать защиту через внепочечные действия, в том числе изменением системной иммунной функции. Авторы оценивали сывороточные уровни ряда хемокинов и цитокинов и популяций периферической крови в мышах после четырех недель лечения с использованием а^-тАЬ и не обнаруживали значимых изменений. Кроме того, только минимальные изменения в количестве моноцитов в почках Сο14А3-/- мышей детектировали иммуногистохимией с обработкой а^-тАЬ или генетическим нокаутом гена β6. Дополнительные исследования, оценивающие функциональный статус иммунной системы с обработкой а^тАЬ, или исследования с трансплантацией могли бы более полно решить этот вопрос.
Нарушенная регуляция и гиперактивность пути Τ0Ε-β считались важным механизмом, участвующим в прогрессировании почечного заболевания в ί'.'ο14Λ-/- мышах6. Одним интересным признаком Т0Еβ-цепи, который мог бы помочь в объяснении несомненно доминантной роли этого цитокина в фиброзном заболевании, является способность Τ0Ε-β индуцировать его собственную экспрессию. Это выдвигает возможность того, что антифиброзные действия а.ДЕ-блокады могут быть опосредованы, по меньшей мере частично, непрямыми механизмами. Это могло бы включать в себя действия далее по ходу процесса на экспрессию Τ0Ε-β изменением воспаления и фиброза локально и созданием препятствия последующей увеличенной активности Τ0Ε-β. Поскольку а^6 может индуцироваться Τ0Ε-β и стимулировать активацию латентного Τ0Ε-β, авторы исследовали функциональную взаимосвязь между Τ0Ε-β и а^6 в опосредовании патологии Сο14А3-/- почек. Авторы изобретения сравнивали воздействия а^-тАЬ и Γ5Τ0Ε-βΕΙΙ-Ι§ на экспрессию ассоциированных с заболеванием транскриптов в почках Сο14А3-/- мышей. Это сравнение выявило определенную функциональную ассоциацию а^-зависимых генов с Τ0Ε-β, а также близкое сходство картин модуляции генов посредством а^-тАЬ и Γ5Τ0Ε-βΕΙΙ-Ι§. Кроме того, лечение Сο14А3-/- мышей а^-блокирующими тАЬ ингибировало почечную экспрессию Τ0Ε-β. Эти открытия показывают, что модифицирующие заболевание действия ингибирующих а^ тАЬ могли бы происходить из ингибирования функции Τ0Ε-β, возможно, через супрессию а.ДЕ-опосредованной активации латентного Τ0Ε-β в патологической ткани. Одним интригующим аспектом приведенных выше данных является ингибирование экспрессии провоспалительного гена посредством блокады а^6 или Τ0Ε-β. Τ0Ε-β имеет хорошо установленные противовоспалительные и иммуносупрессивные функции, однако, распределения модуляции генов посредством Γ5Τ0Ε-βΕΙΙ-Ι§ и посредством анти-а^-тАЬ в экспериментах авторов изобретения свидетельствовали о провоспалительной функции Τ0Ε-β в модели заболевания Альпорта. Хотя действительный механизм этого очевидного провоспалительного действия требует дополнительного исследования, он мог бы быть основан на известной способности Τ0Ε-β индуцировать остановку роста и смерть эпителиальных клеток31,49-51. Поскольку эпителиальное повреждение обеспечивает важный механизм для активации ранних природных иммунных реакций на повреждение ткани, очевидная провоспалительная функция Τ0Ε-β, предполагаемая данными авторов данного изобретения, могла бы быть непрямой и опосредованной ТОЕ-β-стимулируемым повреждением эпителия почек. Согласно этой модели, а^6 может функционировать в качестве важного компонента Τ0Ε-βзависимого механизма эпителиального ремоделирования, и нарушение его функции в заболевании могло бы дополнительно стимулировать ассоциированные с заболеванием повреждение и воспаление ткани.
Эти результаты исследования авторов изобретения демонстрируют, что οβ является высоко положительно регулируемым в заболевании почек человека и нацеливание на а^ блокирующих функцию антител может обеспечивать эффективный новый подход к терапевтической модуляции почечного фиброза. Поскольку экспрессия а^ в значительной степени ограничивается эпителиальными клетками в патологической ткани, этот подход делает возможной селективную локальную супрессию Τ0Ε-βфункции. Поскольку Τ0Ε-β экспрессируется в различных типах клеток и тканей и играет важную роль в регуляции ряда различных гомеостатических процессов, блокирование функции а^ предоставляет потенциально более безопасную альтернативу системному ингибированию Τ0Ε-β в заболеваниях, в которых положительно регулируется интегрин а^.
- 67 016342
Выводы.
ανβ6 сверхэкспрессируется в заболевании почек человека, ассоциированных с воспалительной и фиброзной патологией.
α,,β,-,-блокирующие тАЬ ингибируют фиброз в Со14А3-/- модели (Альпорт) фиброза почек.
Исследования отдаленного эффекта лечения указывают на то, что терапевтическая блокада ανβ6 не только ингибирует прогрессирование фиброза почек, но может сделать возможной элиминацию существующих фиброзных повреждений.
Генетический нокаут β6 приводит к защите в Со14А3-/-мышах.
Анализ профиля транскриптов тканей почек показал, что а^6-блокирующие тАЬ значимо ингибировали ассоциированные с заболеванием изменения экспрессии фиброзных и воспалительных медиаторов.
Сходные распределения модуляции транскриптов получали с лечением рекомбинантым растворимым ТСЕ-β КП, что предполагает общие регуляторные функции ανβ6 и ТСЕ-β.
Ссылки.
1. Окаба Н, Ка11шг К. Се11и1аг апб то1еси1аг ра!й^аук Ла! 1еаб [о ргодгекк1ои апб гедгеккюп оГ гепа1 ΓίЪгодеие818. Сигг Мо1. Меб. 2005, 5:467-474.
2. 8Неррзгб Ό. Еипс!юпк оГ ри1тоиагу ерййе11а1 т!едгтк: Ггот беуе1ортеШ [о бгееаке. РНукю1. Кеу. 2003, 83:673-686.
3. №гтап1Т.. Ете Ь.С. Ргодгеккб'е гепа1 б1кеаке: ПЬгоЬ1ак(к, ехйасе11и1аг тайх, апб т!едгтк. Ехр. №рНго1. 1999, 7:167-177.
4. Вогбег О., №Ь1е ΝΑ Iη!е^асί^оηк оГ !гзикГогт1пд дго\\Л Гзс[ог-Ье1з апб апдю!епкт ΙΙ ίη гепа1 ΓίЬгок1к. Нурейепкюп 1998, 31:181-188.
5. Аапд V, Кока У, бап 4.Υ. ТгзикГогт1пд дго\\Л Гзс[ог-Ье1з апб 8таб к1дпз111пд ίη к1бпеу бйеакек. №рбго1оду 2005, 10:48-56.
6. 8атркоп Ν.8., Куан 8.Т., Еπке И.А., ί.οκ§ΐΌ\Ό Ό, Ко!е11апкку У, Со[\\'а1к Р. С1оЬа1 Сепе Ехргеккюп Апз1ук1к К^еаИ а Во1е Гог Ле а1рНа Ι Л!едгт ίη Кепа1 РаЛодепекге. ί. Вю1. СНет. 2001, 276:34182-34188.
7. Сокд^оνе Ό., Кобдегк К., МееНап Ό, Мб1ег С., Воузг6 К., Сбгоу А., Сагбпег Н., Ко!ебзикк1 У., Со[\уа1к Р., Ата!!исс1 А., Ка11шг К. Ыедгш α1β1 зиб [гзикГогттд дго\у[Н ГасЮфИ р1ау 61к11пс( го1ек ίη а1рог[ д1отеги1аг ра!йодепек1к зиб кегее ак биа1 1агде1к Гог тебаЬоНс Легару. Атег ί оГ РаЛо1. 2000, 157:1649-1859.
8. Натегкк1 И.А., 8ап!ого 8.А. Л!едгтк зиб Ле к1бпеу: Ью1оду зиб раЛоЬю1оду. Сигг Орт. №рбго1. Нурейепз 1999, 8:9-14.
9. ΖзтЬ^иио С., МагсЫкю Р.С., Магсот А., УаксЫеп С., Ме1сЫоп А., С1аппеЛ А., Эе Ьиса М. ТгапкГогттд дго^Л ГзсЮг-β 1 тоби1з1ек β1 зиб β5 ш!едгш гесерЮгк зиб тбисек Ле бе поуо ехргеккюп оГ Ле ανβ6 НеЮгобппег ίη иогтз1 Нитзи кега!шосу!ек: 1трбсабопк Гог \уоипб НезНид. ί. Се11. Вю1. 1995, 129:853-865.
10. Т^еν^11^аη Р., Раи1 Н., Мб1аг Е., НЛЬегб А., Адге/ М.У. а1рНа('г)Ье[а(6) Л!едгт ехргеккюп ίη б1кеакеб апб !гзикр1зи!еб к1бпеук. К1бпеу Ιηΐ. 2004, 60:1423-1433.
11. Вгеикк ЕМ., Са11о 1., ИеЫккег Н.М., Кбтапккауа ГУ., Ео1кеккоп Н.С., Рй!е! ЕЕ., МкЫтига 8., А1баре К., бапбегк И.У., Сзгреп!ег V., Сб1е11 Ν., 8Неррзгб Ό., Маййау М.А., А1Ье1ба 8.М., Кгатег К.Н., Ру!е11а К. Ехргеккюп оГ Ле β6 киЬипй ίη беуе1оρтеηΐ, пеор1ак1а зиб Иккие герай киддек!к а го1е ίη ерййебз1 гетобебпд. 1 Се11 8ск 1995, 108:2241-2251.
12. Вгеикк ЕМ., Сб1ей Ν., Ьи Ь., 8беррагб Ό., Ру!е11а К. Кек[пс[еб б1к!пЬи!юп оГ ш!едгш β6 тИКА ίη рпта[е ербйеба1 бккиек. ί. Н1к1осНет зиб СуЮсНет 1993, 41:1521-1527.
13. Накк1пеп б., НббеЬгапб Н.С., Вегиб! А., Коктеб1 Н., бафта Н. [ттипоксаПхабоп оГ !епакс1п-С, а9 т!едпп киЬипй, зиб ανβ6 ш!едгш бигшд тоипб йеабпд ίη Нитап ога1 тисока. ί. оГ НгеЮсНет зиб СуЮсНет 2000, 48:985-998.
14. Агепб Ь.Е, 8тзг[ А.М., Впддк ЕР. Мойке β6 ш!едгш кециепсе, рабет оГ еxρ^екк^ои. зиб го1е ίη к1бпеу беуе1оρтеηΐ. ί. Атег. 8ос. №рНго1. 2000, 11:2297-2305.
15. Накктеп б., КотбЮ Ь., Сагбпег Н., 8аапаШо-Кеге и., Сагго11 ЕМ., Ьакко М., Езпуз1з Н., бзз1о М., Нето Е, бафта Н. Лсгеакеб ехргеккюп оГ β6-^η!ед^^η ίη ккт 1еабк [о кроШапеоик беуе1оρтеηΐ оГ сНгошс теоипбк. Ат 1. РаЛо1. 2004, 164:229-242.
16. Ниапд Χ.Ζ., IV., 8ропд 8., 8Неррзгб Ό. ТНе т!едгш ανβ6 1к сгВ1са1 Гог кега!шосу!е т1дга!1оп оп ЬоЛ 11к кпотп 11^^0, Г1Ьгопес11п, зиб оп νίΙΐΌίκΛη. ί. Се11. 8сН 1998, 111:2189-2195.
17. Мипдег 18., Ниапд X., Кзтзкз1ки Н., Сг1ГГ1(Нк МГО., ИаЙоп 8.6., νυ ί., Р1Ие1 ЕЕ., Кзтткк1 Ν., Сага! С., Маййау М.А., КИ^<1и И.В., 8Неррзгб Ό. ТНе т!едгш ανβ6 Ьшбк зиб асί^уа!ек 1а!еп! ТСЕ(1: а тесНзшкт Гог геди1а!шд ри1щопзгу 1пГ1атта!юп зп6 ДЬгокге. Се11 1999, 96:319-328.
18. Υококзк^ Υ., Мошк Н., СНеп А., 8Неррзгб Ό. П1ГГегеп11з1 еГГес!к оГ [Не ш!едгшк з1рНз9Ье!з1, з1ρНзνЬе[з3. зп6 з1ρНзνЬе[з6 оп се11 ρ^о1^Γе^з1^νе гекропкек !о [епакст. Ко1ек оГ [Не Ье1з киЬипй ех1гзсе11и1зг аиб су!ор1актю боташк. I. Вю1. СНет. 1996, 271:24144-24150.
19. Аииек ЕР, Кйкт И.В, Мипдег ί.8. ТНе ш!едгш ανβ6 Ьшбк зиб ас[б'а[ек 1а!еп! ТСЕ(3. ЕЕВ8 1ей 2002, 511:65-68.
20. Мипдег 68., Нзгре1 ЕС., С1е1/ек Р.Е., Мз//1ег1 К., Мтек Ι., К1Гкт Р.В. ба!еп! ЦзикГогттд дго\\1Н
- 68 016342 йасТо^-β:зТ^исТи^а1 ГеаТиге апб тесНатзтз оГ асбуабоп. К1б Ιώ 1997, 51:1376-1382.
21. КНа111 Ν.: ТСЕ-ЬеТа: Ггот 1аТепТ То асбте. М1сгоЬез ШГесТ 1999, 1:1255-1263.
22. Вагсе11оз-НоГГ М.Н. ЬаТепсу апб асТ^νаТ^оп ш (Не сопТго1 оГ Τ0Ρ-β. I. Матт 01апб Вю1. 1996, 1:353-363.
23. ХУеткЬ Р.Н., 81топ Кб., КауНот Р., Уапд \У.к, Ьеопе Ό.Κ, Эо1тзк| В.М., Реагзе В.К., УокоТа Υ., Ка^акаТзи Н., АТакШТ А., 8Неррагб Ό., Ую1ейе 8.М. Еипсбоп-ЫоскШд тТедгт а1р11а\'Ье1а6 топос1опа1 апбЬобкз. I. Вю1. СНет. 2004, 279:17875-17887.
24. Вагсе11оз-НоГГ М.Н., ЕНгНагТ Е.к, Кака М, Лгбе К., Е1апбегз К.С., Τзапд МЬ-8. IттипоН^зТоскет^са1 беТесбоп оГ асТке ТгапзГотппд дго^ТН ГасТог-β ΐπ зйи изшд епдшеегеб бззие. Атег I. оГ РаТНо1. 1995, 147:1228-1237.
25. ΥататоТо Τ., Nакати^а Τ., №Ь1е ΝΑ., Киоз1аНб Е., Вогбег ^.А. Ехргеззюп оГ ТгапзГоптпд дго\\ТН ГасТог ЬеТа 18 е1е\гаТеб Ш Нитап апб ехрептепТа1 б1аЬебс перНгораТНу. Ргос №Т1. Асаб. 8с1, и8А 1993, 90:1814-1818.
26. ΥататоТо Τ., №Ь1е ΝΑ, СоНеп А.Н., №181 С.С, ШзЫба А., Ι. 0.Ь, Вогбег ^.А. Ехргеззюп о Г ТгапзГоптпд дго\\ТН ГасТог-ЬеТа 1зо£огтз ш Нитап д1отеги1аг б1зеазез. К1бпеу ШТ 1996, 49:461-469.
27. 8Н1НаЬ Е.8., ΥататоТо Τ., №азТ С.С. Н. СА, №Ь1е ΝΑ., 0о1б Ь.к, Вогбег ^.А.
дго\\ТН ГасТог-ЬеТа апб таТпх ргоТеШ ехргеззюп 1п асиТе апб сНгошс ге.)есбоп оГ Нитап гепа1 а11одгаТТз. I. Ат 8ос. №рНго1. 1995, 6:286-294.
28. Создго¥е Ό., МееНап Ό., 0гипкетеуег кА., Когпак кМ., 8ауегз К., НипТег \У.к, 8атие1зоп 0.С. Со11адеп СОЬ4А3 кпоскоиТ: а тоизе тобе1 Гог аиТозота1 А1рогТ зупбготе. 0епез Эет. 1996, 10:2981-2992.
29. МШег кН., 8апез кК. Мо1еси1аг апб ГипсТюпа1 беГесТз ш к1бпеуз оГ тке 1аск1пд со11адеп о3(ГУ): трбсабопз Гог а1рогТ зупбготе. I. Се11. Вю1. 1996, 135:1403-1413.
30. 8Нагта К. Лп Υ., 0ио I., 21уабеН Ρ.Ν. №иТгак7аТюп оГ ТСЕ-ЬеТа Ьу ап апб-ТСЕ-ЬеТа апкЬобу аТТепиаТез к1бпеу НурегТгорНу апб ТНе епНапсеб ехТгасе11и1аг таТпх депе ехргезззюп ш 8ΤΖ-^пбисеб б1аЬекс тке. О1аЬеТез 1996, 45:522-530.
31. М1уарта А. СНеп I. Ьа^гепсе С., ЬебЬекег 8., 8оз1о\г К.А., 8Тет I., Ша 8. Р1даТо I. Ьетег М.Ь., Рорраз Э.Р., ОаггасоТТ УаидНап 1г. Е. Ее1зоп Ό. АпбЬобу То ТгапзГогттд дго\\ТН ГасТог-β атекогаТез ТиЬи1аг арорТоз1з 1п иш1аТега1 игеТега1 оЬзТгисбоп. К1б ШТ 2000, 58:2310-2313.
32. Ζ^уабек Ρ.Ν., НоГГтап В.В., Нап О.С., ^кзТаз-бе 1а ί’πιζ М.С., Нопд 8.^., копо М., СНеп 8., МсСо\\'ап ТА., 8Нагта К. Ьопд-Тегт рге¥епТ1оп оГ гепа1 ШзиГйскпсу, ехсезз таТпх депе ехргеззюп, апб д1отеги1аг тезапд1а1 таТпх ехрапзюп Ьу ТгеаТтепТ \\йН топос1опа1 апШгапзГогттд дго\\ТН ГасТог-β апбЬобу Ш бЬ/бЬ б1аЬеТк тке. Ргос. №Т1. Асаб. 8т, и8А 2000, 97:8015-8020.
33. Казида Н., Ио Υ., 8акатоТо 8., КатасЫ Н., 8НтХи Е., Υηζη^η Υ., 8. М: ЕГГесТз оГ апТ^-ΤΟЕ-β Туре ΙΙ гесерТог апбЬобу оп ехрейтепТа1 д1отеги1оперНпбз. К1б ШТ. 2001, 60:1745-1755.
34. КоЬегТз А.В., 8рогп М.В. Кеди1абоп оГ епбоТНейа1 се11 дго^ТН, агсНйесТиге, апб таТпх зупТНез1з Ьу ТСЕ-ЬеТа. Ат Кет Кезр1г Э1з 1989, 140:1126-1128.
35. Екке1Ьегд О., КоН1ег Е., КекНепЬегдег Е., ВегТзсНШ 8., ^ообТк Τ., Ете Р., РеггисНоиб А.Р., КоТН М. ЕхТгасе11и1аг таШх берозйюп Ьу рйтагу Нитап 1ипд йЬгоЫазТз ш гезропзе То ТСЕ-ЬеТа1 апб ТСЕ-ЬеТа3. Ат I. РНузю1. 1999, 276:Ь814-Ь824.
36. Уагда I., КозепЬ1оот I., Ιίηκικζ 8.А.: дго^ТН ГасТог ЬеТа (ТСЕ ЬеТа) саизез а регзкТепТ
Шсгеазе ш зТеабу-зТаТе атоипТз оГ Туре Ι апб Туре ΙΙΙ со11адеп апб ГЬюпесТШ т^Аз ш погта1 Нитап бегта1 ЙЬгоЫазТз. ВюсНет. I. 1987, 247:597-604.
37. Кошд А. В^искпе^-Τибе^тап Ь. дго\\ТН ГасТог-ЬеТа рготоТез берозйюп оГ со11адеп Уй
Ш а тобгбеб огдапоТурк зкт тобе1. ЬаЬ Втез! 1994, 70:203-209.
38. 81те Р.к, ХШд Ζ., 0гаНат Е.Ь., Сзаку К.0., 0аи1бк I. Абепо¥есТог-теб1аТеб депе ТгапзГег оГ асТке ТгапзГоптпд дго\\ТН ГасТог-β 1 тбисез рго1опдеб зе\'еге йЬгоз1з Ш гаТ 1ипд. I. С1т ккез! 1997, 100:768-776.
39. Ьартд Ν.6. АЙК ШЫЬйюп Ш гепа1 б1зеазе. Сигг. ОрШ. РНагтасо1. 2003. 3:204-208.
40. Воптаиб Р. Ко1Ь М., 0ай Τ., КоЬегТзоп I. КоЬЬтз С., 8Татрй1 М., кагегу С., МагдеТТз Р.к, КоЬегТз А.В., 0аи1бк I: 8таб3 пи11 тке бе\ге1ор акзрасе еп1агдетепТ апб аге гез1зТапТ То ТСЕ-ЬеТа-теб1аТеб ри1топагу йЬгоз1з. I. Iттипо1. 2004, 173:2099-2108.
41. Ι^ζιΠ К., Капатаги Υ., Корта Υ., 8иеуозН1 Ν., Окитига К., Капеко К., УатазНйо Υ., Ода^а Н., Nакао А. 8таб3 бейскпсу аТТепиаТез гепа1 йЬгоз1з, шйаттаТюп, апб арорТоз1з акТег иш1аТега1 игеТега1 оЬзТгископ. К1бпеу ШТ 2004, 66:597-604.
42. МигрНу-икгкН кЕ., ΡосζаТек М. АсТ^νаТ^оη оГ 1аТепТ ТСЕ-ЬеТа Ьу ТНготЬозропбт-1 тесНатзтз апб рНузю1оду. СуТокте Сго\\ТН ЕасТог Ке¥ 2000, 11:59-69.
43. Аппез кР., Мипдег 1.8., КГкт Э.В. Мактд зепзе о Г 1аТепТ ΤΟЕβ асТ^аТют I. Се11. 8ск 2003, 116:217-224.
44. 8Неррагб Ό. ШТедпп-теб1аТеб асТ^аТ^ оГ 1аТепТ ТгапзГогттд дгоМН ГасТог ЬеТа. Сапсег МеТазТаз1з Ке-ν 2005, 24:395-402.
45. 8Неррагб Ό. ШТедпп-Меб1аТеб АсТ^νаТ^оп оГ Τ^апзйо^т^пд Сго\\ТН ЕасТог-{ЬеТа}1 Ш Ри1топагу Е1Ьгоз1з, сНезТ 2001, 120:495-53.
- 69 016342
46. Ма Ь.Т, Υаηд Н., Сакрей А., Саг1екко 6., Вайу М.М., Эау|бкоп ТМ., 8йеррагб Ό., Родо А.В. ТгапкГотипд дго\\Й1 Гас!о^-β-береηбеη! апб тберепбеп! раЛгаук ой тбис!юп ой !иЬи1от!егк!й1а1 йЬгок1к ш β6-/- тюе. Ат ί Ра!йо1. 2003, 163:1261-1273.
47. Кат1шкк1 Ν., А11агб ΤΌ., Р1!!е! ГР., Репдгопд Ζ., 6пГй!йк МТЭ, Мотк Ό, X. Н, 8йеррагб Ό., Не11ег
Я.А. 61оЬа1 апа1ук1к ой депе ехргеккюп ш ри1топагу йЬгоык геуеа1к б1к!тс! ргодгатк геди1а!шд 1ипд тйаттайоп апб йЬгокУ Ргос. Асаб. 8с1, И8А 2000, 97:1778-1783.
48. Тогга Я., Тахоп-Уеда В., Агк Е., Ва11апп ί. Со11адеп !уре ΙΥ ({а1рйа}3-{а1рйа}4) перйгораЛу: Ггот 1ко1а!еб йаета!ипа !о гепа1 Гайиге. №рйго1. Э1а1. Тгапкр1ап!. 2004, 19:2429-2432.
49. Войтдег Е.Р., Вйхег М. Т6Р-Ье!а мдпаПпд шгепа1 б1кеаке. ί Ат 8ос. №рйго1. 2002, 13:2000-2610.
50. 6оитепок Ό.8., Ткатапбак А.С., Е1 №1йак А.М., Тйотак 6., Ткакак 8., 8о!кюи Р., Вошкок Ό.8., У1асйо_)аптк 1.С.: Арор!ок1к апб туойЬгоЫак! ехргеккюп ш йитап д1отеги1аг б1кеаке: а рокк1Ь1е 1тк \νίΛ йапкГотипд дгоМй Гас!ог-Ье!а-1. №рйгоп. 2002, 92:287-296.
51. Эа1 С., Υаηд ί., Яш Υ. ТгапкГотипд дгоМй Гас!ог-Ье!а1 ро!епйа!ек гепа1 !иЬи1аг ерййе11а1 се11 беа!й Ьу а тесйаткт тберепбеп! ой 8таб ыдпайпд. ί. Вю1. Сйет. 2003, 278:12537-12545.
Пример 14. Эффективность мышиного 369 (ти369) в мышиной модели индуцируемого односторонней уретральной обструкцией фиброза почек.
Резюме.
Односторонняя уретральная обструкция (ИИО) является хорошо установленной моделью почечного повреждения животного, приводящего к ускоренному почечному интерстициальному фиброзу. Обструкция мочевых путей вызывает увеличенное внутрипросветное давление в мочеточнике и почечных канальцах, которое вызывает паренхимное почечное повреждение. ИИО характеризуется гидронефрозом, канальцевым расширением, апоптозом почечных канальцев, прогрессивной почечной атрофией, интерстициальной клеточной инфильтрацией, увеличением почечного ТСР-β и почечным интерстициальным фиброзом1. Функция интегрина «νβ6 может участвовать как в активации Т6Р-[, так и в процессе превращения эпителия в мезенхиму. Поскольку эти процессы способствуют прогрессированию заболевания, модель ИИО использовали для оценивания эффективности моноклонального анти-ανβ6-антитела ти369 и рекомбинантного белка растворимый рецептор ТСР-β типа ΙΙ мышийд (^кΤ6Р-βЯII-Iд) против быстро прогрессирующего почечного фиброза. Среднее процентное ингибирование окрашивания актина гладких мышц ти369 при 4 мг/кг, при введении дозы 1.р. три раза в неделю в течение 10-дневного эксперимента, было равно 32%.
Введение.
Прогрессирующий фиброз является общим процессом, приводящим к развитию почечного заболевания терминальной стадии и стимулируется ремоделированием эпителиальной ткани, активацией фибробластов, воспалением и реорганизацией клеточных взаимодействий с внеклеточным матриксом (ЕСМ). Молекулярные механизмы, способствующие этим событиям, являются сложными и включают в себя нарушение регуляции системы Т6Р-[, отклоняющееся от нормы ремоделирование ЕСМ и измененную экспрессию и функцию рецепторов клеточной адгезии суперсемейства интегринов2-9. Недавние исследования выявили важные регуляторные функции нескольких интегринов и ассоциированных молекул в почечных эпителиальных и мезенхимных клетках8,10-13.
Среди интегринов, экспрессия которых сильно увеличивается в почечном заболевании, находится Τ6Р-β-индуцируемый интегрин «νβ6 3,14,15. Экспрессия «νβ6 обычно ограничивается эпителиальными клетками, где он экспрессируется при низких уровнях в нормальных развитых тканях и обнаруживает увеличенную экспрессию во время развития, повреждения и неоплазии14,16-18. Хотя «νβ6 экспрессируется при относительно низких уровнях в здоровой развитой почке, его экспрессия является значительной в развивающейся почке мыши, особенно в проксимальных канальцах, петле Генле и прямых почечных канальцах16,17,19. Недавно сообщалась увеличенная экспрессия «νβ6 для различных форм патологии почек человека15.
В соответствии с увеличенной экспрессией «νβ6 ш у1уо во время ремоделирования ткани, экспрессия интегрина «νβ6 в культивируемых эпителиальных клетках могла быть индуцирована цитокинами, которые регулируют эпителиальное ремоделирование, в том числе Е6Р и Т6Р-[3,14. Кроме того, было показано, что сверхэкспрессия β6 в коже трансгенных мышей провоцирует образование спонтанных хронических ран, что предполагает, что «νβ6 может играть важную роль в регуляции ремоделирования эпителиальной ткани.
Известные лиганды для «νβ6 включают в себя фибронектин, тенасцин и ассоциированные с латентностью пептиды 1 и 3 (ТАР1 и ТАР3), Ν-концевые фрагменты форм латентных предшественников Т6Рβ1 и Т6Р-[321-25. В результате связывания с этими лигандами, «νβ6 может опосредовать адгезию, распространение, миграцию клеток и активацию латентного ТСР-β. ТСР-β синтезируется в виде латентного белка, который отщепляется и секретируется с Ν-концевым ТАР, нековалентно ассоциированным со зрелым, активным С-концевым цитокином ТСР-β. Этот латентный комплекс ТСР-β не может связываться с его когнатным рецептором и, следовательно, остается биологически неактивным, пока он не превраща
- 70 016342 ется в его активную форму одним из нескольких альтернативных механизмов, которые включают в себя расщепление протеазами, воздействие низким рН или ионизирующей радиацией и конформационными изменениями в латентном комплексе, позволяющими ему связываться с его когнатными рецепторами26-29. Активирующее конформационное изменение может быть индуцировано ανβ6 посредством прямого связывания этого интегрина с К0О-мотивом, содержащимся в ЕАР1 и ЬАР3. Это связывание превращает ТОЕ-β-предшественник в компетентное в отношении связывания рецептора состояние22,25. Эти открытия предполагают, что повышающая регуляция экспрессии ανβ6 на поверхности эпителиальных клеток может приводить к локальной активации ТСЕ-β с последующей паракринной активацией ТОЕ-β-зависимых событий в опухолевых клетках с неканоническим антигенным фенотипом.
Поскольку ТСЕ-β предположительно считался центральным регулятором почечного фиброза, авторы изобретения высказали гипотезу, что его локальная активация интегрином ανβ6 может быть важным процессом в возникновении и прогрессировании почечного заболевания, и блокада функции ανβ6 могла бы подавлять развитие почечного фиброза. В описанных здесь исследованиях авторы изобретения показывают, что ανβ6 в сильной степени положительно регулируется в мышиной модели индуцированного односторонней уретральной обструкцией фиброза почек. Авторы изобретения показывают, что тАЬ, блокирующие связывание лиганда и функции активации ТСЕ-β интегрина ανβ6 30, ингибируют фиброз в этой модели.
Материалы и способы.
1. Животные. В этих исследованиях использовали самцов 8-12-недельных не содержащих вирусного антигена С57ВЬ мышей с массой 25,5±0,2 г (1асккоп ЬаЬога!опек, Ваг НагЬог, МЕ). Животных содержали в не содержащем вирусов лабораторном оборудовании для животных Вюдеп 1бес на стеллажах с вентилируемыми изолированными клетками и давали им приспособиться к обстановке ш у1уо нескольких дней перед началом этого исследования. Мыши имели доступ аб 11Ь1!ит к облученному стандартному корму для мышей (ЬаЬП1е! Рго1аЬ® 5Р75 1корго® КМН 3000) и стерильной воде на протяжении всего периода аккомодации и эксперимента. Массу тела измеряли с интервалами в качестве части мониторинга здоровья животных.
2. Антитела и реагенты.
а^-тАЬ получали, как описано здесь и как описано ранее39. кДНК химерных человек-мышь антител 2А1 и 309 получали из соответствующих тотальных РНК исходных гибридом с праймерами константной области СОЬ-739 для тяжелой цепи и СЭЬ-738 для легкой цепи с использованием набора для синтеза кДНК первой цепи (Атегкйат/Рйагташа Р1кса!^ау, N1). Гены вариабельных областей тяжелой и легкой цепей амплифицировали полимеразной цепной реакцией с использованием тех же самых 3'праймеров, используемых для синтеза кДНК, и пулов вырожденных праймеров, специфических для сигнальных последовательностей большинства генов мышиных антител (последовательностей, доступных по запросу), и ДНК-полимеразы Р£и (8ба!адепе, Ьа 1о11а, СА). Клонированные вариабельные области тяжелой и легкой цепей лигировали в экспрессирующие векторы млекопитающих с константными областями 1д01 человека. Слитый белок рекомбинантный растворимый рецептор типа II мышиного Т0Е^-1д (гкТСЕ-β 11-1д) получали, как описано ранее, и покупали из Е&Э 8ук!етк (532-К2, Мшпеаройк, М№).
3. Иммуногистохимия.
Среды ткани депарафинизировали в ксилоле и этаноле, повторно гидратировали в дистиллированной воде и затем погружали в метанол, содержащий 0,45% Н2О. Ткани инкубировали с пепсином (003009, 2утеб, 8ап Егапаксо, СА) и блокировали авидином и биотином (8Р-2001; Уес!ог ЬаЬога!ог1ек, Вигйпдате, СА). Первичное антитело разводили в ЗФР, содержащем 0,1% бычий сывороточный альбумин (БСА), и ткани инкубировали в течение ночи при 4°С. Для иммуноокрашивания β6 на ткани мыши срезы инкубировали с химерной формой человек/мышь анти-ανβ6-тΛЬ, 2А130, и биотинилированным вторичным антителом против 1д0 мыши (РК-6103, Уес!ог ЬаЬога!ог1ек, Вигйпдате, СА). Для иммуноокрашивания β6 на ткани человека срезы инкубировали с мышиным 2А130 и антимышиным-биотинилированным вторичным антителом (РК-6102, Уес!ог ЬаЬога!опек). Комплекс авидин-биотин-пероксидаза хрена (Уес!ог Κι!, РК-6102) наносили на срезы, инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре и готовили субстрат 3,3'-диаминобензидин (ОАВ), согласно рекомендациям (8Κ-4100, Уес!ог ЬаЬога!ог1ек), и наносили на срезы и выдерживали в течение 5 мин при комнатной температуре. Срезы ткани окрашивали гематоксилином Майера в течение 1 мин и промывали в воде и ЗФР.
4. Индукция односторонней уретральной обструкцией фиброза почек.
Хирургию для этих исследований выполняли на протяжении двухдневного периода и схемы введения доз хронометрировали относительно перевязки (лигирования) мочеточника. Левый мочеточник асептически выделяли посредством лапаротомии слева от срединной линии под анестезией с использованием кетамина/ксилазина (1000:10 мг/кг к.с). Две плотные окклюзивные лигатуры хирургическим шелком 6-0 накладывали на мочеточник на уровне нижнего полюса почки и этот мочеточник разрезали между этими лигатурами. Стенку брюшной полости закрывали шовным материалом Викрилом 4-0 и кожу закрывали нейлоном 4-0. Животным давали восстановиться на грелке-подушке и вводили 0,05 мг/кг к.с. бупренорфин два раза в день в дни 0 и 1. Животным вводили дозы три раза в неделю ти309 или два раза
- 71 016342 в неделю 500^-(^11-18, начиная в день перед хирургией. Эта процедура была заимствована из описанного ранее сообщения31.
5. Сбор проб ткани и гистологический анализ на индикаторы заболевания.
Животных эвтанизировали диоксидом углерода в день 10 после лигирования. Обе почки (левую лигированную, правую нелигированную) извлекали и разрезали пополам поперек через центр почечной лоханки. Одну половину каждой почки помещали в 10% нейтрально забуференный формалин для окрашивания фиксированной ткани. Другую половину каждой почки помещали в 15% сахарозу, затем в 30% сахарозу для иммуногистохимического окрашивания актина гладкой мышцы.
Фиксированные формалином срезы почек окрашивали на содержание коллагена трехцветным носителем Трихромом Массона и на структурную анатомию Н & Е. Окрашенные Трихромом срезы определяли количественно морфометрически в изображениях, улавливаемых микроскопией с освещением методом светлого поля, с использованием системы анализа изображений Ьеюа Ο\νίιι. Изображения улавливали с использованием стандартизованных условий освещения и установок экспозиций цифровой камеры, корректировали на фон и калибровали относительно дистанционных стандартов.
Были установлены пороги для детектирования темно-синего цвета для окрашивания коллагена в окрашенных Трихромом Массона предметных стеклах. Площадь коллагена анализировали в изображениях при увеличении 200Х. Изображения смежных полей, покрывающих весь левый срез почки, брали для каждого животного для количественного определения.
6. Статистический анализ.
Содержание коллагена в каждом измеренном поле выражали в виде процента общей площади ткани в поле 200Х (за исключением любого белого пространства), т.е. % синей площади. Для каждой почки измеряли 16-35 отдельных полей. Они включали в себя всю корковую ткань и медуллярную ткань из среза и исключали почечные сосочки. Процент средней синей площади, взятой из всех полей в левой лигированной почке, рассчитывали для каждого животного и принимали в качестве оценки фиброза этого животного для статистического анализа. Статистическую значимость связанных с лечением различий в проценте синей площади среди нескольких групп обработки определяли однофакторным дисперсионным анализом с последующей процедурой Стьюдента-Ньюмана-Кеулса для парных множественных сравнений. Различия считались статистически значимыми при р<0,05.
Результаты.
1. Экспрессия /νβ6 в почках после ИИО.
Экспрессию интегрина /νβ6 в почках после односторонней уретральной обструкции (ИИО) исследовали при помощи иммуногистохимического анализа. Минимальную экспрессию /νβ6 детектировали в неповрежденных (здоровых) почках, тогда как значимую положительно регулируемую экспрессию наблюдали при 7, 10 и 14 днях после ИИО (фиг. 41). Детектируемую экспрессию измеряли так рано, как через 3 дня после ИИО.
2. Ингибирование иммуноокрашивания актина гладкой мышцы в ИИО-почках посредством ти309.
Степень фиброза в мышиной модели ИИО измеряли гистоморфометрическим анализом иммуногистохимического окрашивания /-актина гладкой мышцы (коричневая окраска) или окрашивания трехцветным красителем Массона коллагенового матрикса (синяя окраска). В каждом исследовании долю площади ткани, занимаемую фиброзом, определяли в ИИО-мышах, получающих носитель или изотипически сходное контрольное тАЬ (группы отрицательного контроля), в группах, получающих испытуемую терапевтическую обработку, и в нелигированных здоровых мышах. Терапевтические действия выражали в виде процентного ингибирования окрашивания коллагенового матрикса Трихромом Массона (синего) или окрашивания актина гладкой мышцы (коричневого) расчетом отношения различия окрашенной площади между отрицательными контрольными и испытуемыми терапевтическими в сравнении с различием между отрицательными контрольными или нелигированными мышами.
С целью соотнесения результатов на протяжении множественных исследований, терапевтические действия выражали в виде процентного ингибирования окрашивания /-актина гладкой мышцы. Среднее процентное ингибирование окрашивания актина гладкой мышцы при 4 мг/кг ти309, вводимого 1.р. три раза в неделю в течение курса десяти дней эксперимента, было равно 32,8%, тогда как г5ТСБ-(К11-18 обнаруживал среднее %-ное ингибирование 13,2 при 2 мг/кг (табл. 14.1).
- 72 016342
Таблица 14.1 Среднее процентное ингибирование окрашивания а-актина гладких мышц для ти3Ο9 и ^ΤΟΡ^^Ι-^, объединяющее данные множественных исследований
Молекула Доза, мг/кг Среднее %-ное ингибирование Стандартное отклонение (8.ϋ.) п Номер исследования иио
ЗС9 0,02 14,5 3,8 8 2
309 0,2 6,7 3,2 8 2
ЗС9 1 14,7 9,4 7 2
309 2 12,9 4,8 14 4,9
309 4 32,8 5,0 30 4,6,7,14
309 10 17,7 2,4 7 4
гзТОР-рШМё 2 13,2 5,7 31 4,6,8,9
Внутрибрюшинное введение доз 3 раза в неделю, в течение 10 дней. См. табл. 14.8 в отношении отдельных мышей при каждой дозе.
Таблица 14.2 ииО-4 среднее процентное ингибирование окрашивания актина гладких мышц Коричневая площадь ϋυθ-4 А8МА в % от всей ткани
Носитель 309(1) 309(2) 309(4) 309(10) Г5ТОГ₽К(2) Здоровые
54 45 51 52 43 48 2
55 36 47 47 45 45 3
41 54 56 42 42 55 2
59 63 46 22 41 70 2
50 33 46 53 45 53 2
46 43 43 42 36 55 1
48 29 38 41 41 52 2
50,4 43,3 46,7 42,7 41,9 54,0 2,0
2,3 4,5 2,2 3,9 и 3,0 0,2
7 7 7 7 7 7 7
Контроль. 50,4
Сигнал: 48,4
% ингибирования 11,2 -1,2 -3,2 15,3 5,0
29,8 7,1 7,1 11,2 11,2
-7,4 -11,5 17,4 17,4 -9,4
-26,0 9,1 58,7 19,5 -40,4
36,0 9,1 -5,3 11,2 -5,3
15,3 15,3 17,4 29,8 -9,4
44,2 25,7 19,5 19,5 -3,2
Среднее: 14,7 7,7 15,9 17,7 -7,4
Среднеквадратичная ошибка среднего 9,4 4,5 8,1 2,4 6,2
- 73 016342
Таблица 14.3
ИИО-6 среднее процентное ингибирование окрашивания актина гладких мышц
Коричневая площадь ииО-6 Л8МЛ в % от всей ткани
Носитель 309(4) 806(4) 4В4(4) Г8ТОГ0К(2) Здоровые
38 66 33 45 40 1
34 32 31 51 51 2
30 29 42 48 52
49 40 31 37 55
57 42 48 44 45
46 45 28 43 44
60 26 57 39 41
51 28 40 36 47
45,6 38,5 38,8 42,9 46,9 1,5
3,8 4,7 3,5 1,9 1,9 0,5
8 8 8 8 8 2
Контроль: 45,6
Сигнал: 44,1
% ингибирования: -46,2 28,6 1,4 12,7
30,9 33,1 -12,2 -12,2
37,7 8,2 -5,4 -14,4
12,7 33,1 19,5 -21,2
8,2 -5,4 3,7 1,4
1,4 39,9 5,9 3,7
44,5 -25,8 15,0 10,5
39,9 12,7 21,8 -3,1
Среднее: 16,1 15,6 6,2 -2,8
Среднеквадратичная ошибка среднего 10,5 8,0 4,2 4,3
- 74 016342
Таблица 14.4А υυΟ-7 среднее процентное ингибирование окрашивания актина гладких мышц
Коричневая площадь υυΟ-7 А8МА в % от всей ткани
Носитель ЬАР1§(1) ЬАР1§(5} ЬАР1ё(10) 369(4) Здоровые
31 30 33 26 18 1
39 35 35 45 21 I
49 45 33 20 13 1
45 46 14 20 24 1
39 43 17 23 18 1
40 58 56 33 13
41 55 40 23 16
52 33 35 23 21
42,0 43,1 32,9 26,6 18,0 1,0
2,3 3,6 4,6 3,0 1,4 0,0
8 8 8 8 8 5
Контроль: 42,0
Сигнал: 41,0
% ингибирования 29,3 22,0 39,0 58,5
17Д 17,1 -7,3 51,2
7,3 22,0 53,7 70,7
-9,8 68,3 53,7 43,9
-2,4 61,0 46,3 58,5
-39,0 -34,1 22,0 70,7
-31,7 4,9 46,3 63,4
22,0 17,1 46,3 51,2
Среднее: 2,7 22,3 37,5 58,5
Среднеквадратичная ошибка среднего 8,7 и,з 7,3 3,4
Таблица 14.4В υυΟ-7 среднее процентное ингибирование окрашивания Трихромом Массона
Синяя площадь 660-7 в % от всей ткани
ЗФР ЬАР1£ 1 ЬАР1$5 ЬАР!^ 10 369 4 Здоровые
5,6 5,9 4,2 4,9 4,0 3,5
7,8 5,1 6,6 4,2 7,0 2,4
6,8 5,1 12,6 4,1 4,6 2,1
6,5 5,4 3,8 5,1 4,8 2,7
4,8 5,5 4,9 4,5 5,4 2,3
8,2 4,7 4,7 5,7 4,0
5,1 9,2 5,1 3,9 4,3
10,9 5,8 6,5 6,3 6,2
7,0 5,8 6,1 4,8 5,0 2,6
0,7 0,5 1,0 0,3 0,4 0,2
8 8 8 8 8 5
Контроль: 7,0
Сигнал: 4, 4
% ингибирования % ингибирования 24,4 63,3 47,3 67,9
42,7 8,3 63,3 -0,9
42,7 -129,2 65,6 54,2
35,8 72,5 42,7 49,6
33,5 47,3 56,4 35,8
51,9 51,9 28,9 67,9
-51,3 42,7 70,2 61,0
26,6 10,6 15,2 17,5
Среднее: Среднее: 25,8 20,9 48,7 44,1
Среднеквадратичная ошибка среднего Среднеквадратичная ошибка среднего 11,5 22,9 6,8 8,8
Таблица 14.5
- 75 016342 υυθ-8 среднее процентное ингибирование окрашивания актина гладких мышц
Коричневая площадь υυθ-8 А5МА в % от всей ткани
Носитель зТаРЬК(О,5) еТОРЬК(2) гзТСРрК (5) Здоровые
38 42 13 29 2
35 42 10 31 2
36 35 32 35 1
42 23 51 39 2
47 30 30 39 1
28 35 29 27
51 31 27 32
48 30 42 41
40,6 33,5 29,3 34,1 1,6
2,8 2,3 4,8 1,8 0,2
8 8 8 8 5
Контроль: 40,6
Сигнал: 39,0
% ингибирования -3,5 70,8 29,8
-3,5 78,5 24,7
14,4 22,1 14,4
45,2 -26,6 4,2
27,2 27,2 4,2
14,4 29,8 34,9
24,7 34,9 22,1
27,2 -3,5 -1,0
Среднее 18,3 29,1 16,7
Среднеквадратичная ошибка среднего 5,8 | 12,3 4,7
Таблица 14.6 υυΟ-9 среднее процентное ингибирование окрашивания актина гладких мышц
Коричневая площадь ииО-9 А8МА в % от всей ткани
Носитель 309(0,02) 369(0,2) 369(2) 8ВЗ(4) теТСГрЩ) Здоровые
65,0 56,0 68,0 65,0 60,0 37,0 1,0
69,0 59,0 63,0 60,0 64,0 56,0 2,0
80,0 63,0 57,0 24,0 63,0 34,0 1,0
76,0 58,0 63,0 64,0 61,0 42,0 1,0
62,0 51,0 54,0 52,0 57,0 52,0 2,0
58,0 44,0 62,0 64,0 53,0 56,0
61,0 62,0 60,0 56,0 71,0 56,0
64,0 66,0 73,0 67,0 38,0
66,9 57,4 62,5 55,0 62,0 46,4 1,4
2,7 2,5 2,1 5,5 2,0 3,4 0,2
8 8 8 7 8 8 5
Контроль: 66,9
Сигнал: 65,5
% ингибирования: 16,6 -1,7 2,9 10,5 45,6
12,0 5,9 10,5 4,4 16,6
5,9 15,1 65,5 5,9 50,2
13,6 5,9 4,4 9,0 38,0
24,2 19,7 22,7 15,1 22,7
34,9 7,4 4,4 21,2 16,6
- 76 016342
7,4 10,5 16,6 -6,3 16,6
1,3 -9,4 -0,2 44,1
Среднее: 14,5 6,7 18,1 7,4 31,3
Среднеквадратичная ошибка среднего 3,8 3,2 8,4 3,0 5,2
Таблица 14.7 ииО-14 среднее процентное ингибирование окрашивания актина гладких мышц
Коричневая площадь 1ДЮ-14 А8МА в % от всей ткани
Носитель ^43(3901(4) МЗС9С2а(4) а§1уЗС9О2а(4) Здоровые
54 34 18 33 3
62 24 32 23 4
63 19 42 21 1
51 40 35 24 3
61 42 28 20 1
58 45 26 35
47 43 18
56,5714286 35,2857143 30,1666667 24,8571429 2,4 среднее
6,07884701 10,1277554 8,20771994 6,56832225 1,34164079 стандарт. отклонение
Контроль: 56,6
Сигнал: 54,2
% ингибирования 41,7
60,1
69,4
30,6
26,9
21,4
25,1
Среднее % ингибирования 39,3
Стандарт, отклонение 18,6900534
Таблица 14.8
Процентное ингибирование иммуноокрашивания актина гладких мышц в отдельных животных посредством обработки ти309 или ^кΤ0Е-βКII-Iд
ти3<39 0,02 мг/кг % ингибирования тиЗО9 0,2 мг/кг % ингибирования шиЗО9 1 мг/кг % ингибирования
иио-9 16,6 иио-9 -1,7 иио-4
иио-9 12,0 иио-9 5,9 иио-4 29,8
иио-9 5,9 иио-9 15,1 иио-4 -7,4
иио-9 13,6 иио-9 5,9 иио-4 -26
иио-9 24,2 иио-9 19,7 иио-4 36
иио-9 34,9 иио-9 7,4 иио-4 15,3
иио-9 7,4 иио-9 10,5 1Д1О4 44,2
иио-9 1,3 иио-9 -9,4
Среднее: 14,5 среднее 6,7 среднее 14,7
Станд. отклонен. 3,8 станд. отклон. 3,2 станд. отклон. 9,4
η 8,0 η 8,0 η 7
- 77 016342
тиЗОЭ 2 мг/кг ши ЗС9 % ингибирования тиЗОЭ 4 мг/кг ти369 % ингибирования тиЗО9 10 мг/кг тиЗО9 % ингибирования
иио-4 -1,2 иио-4 -32 иио-4 15,3
иио-4 7,1 иио-4 7,1 иио-4 112
иио-4 -11,5 иио-4 17,4 иио-4 17,4
иио-4 9,1 иио-4 58,7 иио-4 19,5
иио-4 9,1 иио-4 -5,3 иио-4 11,2
иио-4 15,3 иио-4 17,4 иио-4 29,8
иио-4 25,7 иио-4 19,5 иио-4 19,5
иио-9 2,9 иио-б -46,2
ШО-9 10,5 иио-б 30,9
иио-9 65,5 иио-б 37,7
иио-9 4,4 иио-б 12,7
иио-9 22,7 иио-б 8,2
иио-9 4,4 иио-б 1,4
иио-9 16,6 иио-б 44,5
иио-б 39,9
иио-7 58,5
иио-7 51,2
иио-7 70,7
иио-7 43,9
иио-7 58,5
иио-7 70,7
иио-7 63,4
иио-7 51,2
иио-14 41,7
иио-14 60,1
иио-14 69,4
иио-14 30,6
иио-14 26,9
иио-14 21,4
иио-14 25,1
Среднее 12,9 среднее 32,8 среднее 17,7
Станд. отклов 4,8 Станд, откион. 5,0 Станд. отклон. 2,4
и 14 # 30 и 7
- 78 016342
Γ5ΤΟΡβΚΠ4§ % ингибирования
υυο-ϊ 70,8
78,5
22,1
-26,6
27,2
29,8
34,9
-3,5
υυο-9 45,6
16,6
50,2
38,0
22,7
16,6
16,6
44,1
υυο-6 12,7
-12,2
-14,4
-21,2
1,4
3,7
10,5
-3,1
υυο-4 5,0 .
И,2
-9,4
-40,4
-5,3
-9,4
-3,2
Среднее 13,2
Стандартное отклонение 5,678
# 31
- 79 016342
Ссылки.
1. М1уа.)1та А., Сйеп 1., Ьа^гепсе С., ЬебЬейег 8., 8ок1о\г К.А., 8!егпт 1., 1йа 8., Р1да!о 1., Ьетег М.Ь., Роррак Э.Р., ЭаггасоЦ Уаидйап 1г. Е., Ее1коп Ό. АпйЬобу !о !гапкГогтшд дгоМй ГасЮг-β ате1юга!ек !иЬи1аг арор!ок1к ш иш1а!ега1 иге!ега1 оЬк!гис!юп. К1б 1п! 2000, 58:2310-2313.
2. Окаба Н., Ка11ип К. Се11и1аг апб то1еси1аг раГйгаук !йа! 1еаб !о ргодгеккюп апб гедгеккюп оГ гепа1 ДЬгодепек1к. Сигг Мо1. Меб. 200.5, 5:467-474.
3. V., Кока У., Ьап Н.У. ТгапкГогттд дгоМй ГасЮг-β апб 8таб ыдпаШпд ш к1бпеу б1кеакек. №рйго1оду 2005, 10:48-56.
4. Ьеакк А., АЬгайат Ό.Ι. ТСЕ-β ыдпайпд апб Гйе ДЬгобс гекропке. ЕА8ЕВ 1. 2004, 18:816-827.
5. Сйартап Н.А. Э|когбегк оГ 1ипд та!пх гетобе1шд. 1. С1ш. 1пуек!. 2004, 113:148-157.
6. 8йеррагб Ό. Еипсйопк оГ ри1топагу ерййейа1 ш!едгшк: Ггот беуе1ортеп! !о б1кеаке. Рйукю1. Кеу. 2003, 83:673-686.
7. Пт Н. Ра!йодепек1к оГ ДЬгокй: го1е оГ ТСЕ-β апб СТ0Е. Сигг. Орт. Кйеита!о1. 2002, 14:681-685.
8. Шгтап 1.Т., Еше Ь.0. Ргодгекыуе гепа1 б1кеаке: ДЬгоЬ1ак!к, ех!гасе11и1аг тайгх, апб ш!едгшк. Ехр. ШрйгоЕ 1999, 7:167-177.
9. Вогбег νΆ, ШЬ1е КА. 1п!егас!юпк оГ !гапкГогтшд дго^Гй Гпс!ог-( апб апдю!епкш II ш гепа1 ДЬгок1к. Нурейепкюп 1998, 31:181-188.
10. 8атркоп N.8., Куап 8.Т., Епке О.А., Сокдгоуе Ό, Ко!ейапкку У., 0о!^а1к Р. 01оЬа1 0епе Ехргеккюп Апа1ук1к Кеуеа1к а Ко1е Гог !йе а1рйа 1 йИедгт ш Кепа1 Ра!йодепек1к. 1 Вю1. Сйет. 2001, 276:3418234188.
11. Сокдгоуе Ό., Кобдегк Κ., Меейап Ό., МШег С., Воуагб Κ., 011гоу А., 0агбпег Н., Ко!ейапкк1 У., Со1\га1к Р., Ата!!исс1 А., Ка11ип К. йИедпп α1β1 апб йапкГогтшд дго^Гй ГасЮг-β 1 р1ау бййпс! го1ек ш а1рог( д1отеги1аг раГйодепекй апб кегуе ак биа1 !агде!к Гог теГаЬойс !йегару. Атег 1. оГ РаГйо1. 2000, 157:16491659.
12. Рго1к Е., Найпег А., 8сйоск1тапп Н.О., 81егхе1 К.В. Мекапд1а1 се11к апб !йе1г абйеыуе ргорегйек. Ехр. Шр^оЕ 1999, 7:137-146.
13. Натегкк1 О.А., 8ап!ого 8.А. йИедгшк апб !йе к1бпеу: Ью1оду апб ра!йоЬ1о1оду. Сигг Орт. №рйго1. Нурейепк 1999, 8:9-14.
14. 2атЬгипо 0., МагсЫкю Р.С., Магсош А., УаксЫеп С., Ме1сйюп А., 01аппе!й А., Эе Ьиса М. ТгапкГогттд дго^Гй ГасЮг-β 1 тоби1а!ек β1 апб β5 ш!едпп гесер!огк апб шбисек !йе бе поуо ехргеккюп оГ Гйе ανβ6 йе1егоб1тег т погта1 йитап кегайпосу!ек: 1тр1юа!юпк Гог теоипб йеайпд. 1 Се11 Вю1. 1995, 129:853-805.
15. Тгеу1Шап Р., Раи1 Н., М111аг Е., Н1ЬЬегб А., Адгех М.У. а1рйа(у)Ье!а(6) йиедгш ехргеккюп ш б1кеакеб апб !гапкр1ап!еб Ибпеук. К1бпеу Ш 2004, 06:1423-1433.
16. Вгеикк 1.М., 0а11о 1., ОеЫккег Н.М., КИтапккауа РУ., Ео1кеккоп Н.0., Рй!е1 ЕЕ., МкЫтига 8., А1баре Κ., Ьапбегк Э.У., Сагреп!ег V., 0111е!! К, 8йеррагб Ό., Маййау М.А., А1Ье1ба 8.М., Кгатег К.Н., Ру!е11а К. Ехргеккюп оГ !йе β6 киЬиш! ш беуе1ортеп!, пеор1ак1а апб йккие герай киддек!к а го1е ш ерййейа1 гетобейпд. 1. Се11 8сЕ 1995, 108:2241-2251.
17. Вгеикк 1.М., 0111е!! К, Ьи Ь., 8йеррагб Ό., Ру!е11а К. Кек!пс!еб б1кйгЬи!юп оГ ш!едпп β6 тКNА ш рпта!е ерййейа1 йккиек. 1. Н1к!осйет апб Су!осйет 1993, 41, 1521-1527.
18. Накктеп Ь., НйбеЬгапб Н.С., Вегпб! А., Коктей1 Н., Ьадауа Н. Iттиηо1оса1^ζайоη оГ !епаксш-С, а9 ш!едпп киЬиш!, апб ανβ6 ш!едгш бигшд теоипб йеайпд ш йитап ога1 гоисока. 1. оГ Н1к!осйет апб Су!осйет 2000, 48:985-998.
19. Агепб Ь.1., 8тай А.М., Впддк 1.Р. Мойке β6 ш!едгш кецпепсе, райегп оГ ехргеккюп, апб го1е ш к1бпеу беуе1ортеп!. 1. Атег. 8ос. №рйго1. 2000, 11:2297-2305.
20. Накктеп Ь., Ко1У1к!о Ь., 0агбпег Н., 8аапа1йо-Кеге и., Сагго11 1.М., Ьакко М., Каиуа1а Н., Ьаа!о М., Нешо 1., Ьадауа Н. Шсгеакеб ехргеккюп оГ β6-^η!ед^^η ш ккш 1еабк !о кропГапеоик беуе1ортеп! оГ сйгошс \\'оипбк. Ат. 1. Ра!йо1. 2004, 164:229-242.
21. Ниапд Χ.Ζ., IV, 8ропд 8., 8йеррагб Ό. Тйе ш!едпп ανβ6 1к сгШса1 Гог кега!шосу!е т1дга!юп оп Ьо!й йк кпо\\г1 йдапб, ДЬгопесйп, апб оп уйгопесйп. 1. Се11 8с1. 1998, 111:2189-2195.
22. Мипдег 1.8., Ниапд X., Ка^ака!ки Н., 0йГГййк МЕО., Эа11оп 8.Ь., VII 1., Р1йе! ЕЕ., Катшкк1 К, 0ага! С., Маййау М.А., Кйкш О.В., 8йеррагб Ό. Тйе ш!едгш ανβ6 Ьшбк апб асйуа!ек 1а!еп! Т0Е(: а тесйашкт Гог геди1а!шд ри1топагу шЕ1атта!юп апб ДЬгокй. Се11 1999, 90:319-328.
23. Викк М., Ру!е11а К., 8йеррагб Ό. СйагасЮпхаиоп оГ !йе ш!едгш а1рйа у Ье!а 6 ак а ДЬгопесйпЬшбшд рго!еш. 1. Вю1. Сйет. 1992, 267:5790-5796.
24. Уококак1 Υ., Мошк Н., Сйеп А., 8йеррагб Ό. О1ЕГегепйа1 еГГес!к оГ Гйе ш!едгшк а1рйа9Ье!а1, а1рйауЬеГа3, апб а1рйауЬе!а6 оп се11 ргойЕегайуе гекропкек !о !епаксш. Ко1ек оГ !йе ЬеГа киЬит! ехйасе11и1аг апб су!ор1актк боташк. 1. Вю1. Сйет. 1996. 271:24144-24150.
25. Аппек 1.Р., Кйкш О.В., Мипдег 1.8. Тйе ш!едпп ανβ6 Ьшбк апб асйуа!ек 1а!еп! Т0Е(3. ЕЕВ8 1ей 2002, 511:65-68.
26. Мипдег 1.8., Нагре1 1.0., С1е1/ек Р.Е., Мах/1еп К., Шпек I., Кйкш О.В. Ьа!еп! йапкГогтшд дго^Гй
- 80 016342
ГасЮг-β: кйис!ига1 Геа!иге апб тесйашктк оГ асйуайоп. К1б Ш! 1997, 51:1376-1382.
27. Ο1е^ζек Р.Е., Мипдег 18., Шпек Ι., Нагре1 Ю., Мах/1еп К., Шдиега Ι., Кйкш Ό.Β. ΤΟΡ-β 1а!епсу: Ь1о1од1са1 ыдшйсапсе апб тесйашктк оГ асйуайоп. 8!ет Се11к 1997, 15:190-197.
28. Кйа111 Ν. ΤΟΡ-β: Ггот 1а!еп! !о асйуе. М1сгоЬек ШГес! 1999, 1:1255-1263.
29. Βαι^^^ο^ М.Н. Ьа!епсу апб асйуайоп т 1йе соп!го1 оГ ΤΟΡ-β. 1. Матт. Ο1ηπ6. Βίο1. 1996, 1:353-363.
30. АешгеЬ Р.Н., 81топ К.Ь, Кауйогп Р., Уапд А.!, Ьеопе Ό.Κ., По1шкк1 Β.Μ, Реагке Β.Κ., Уоко1а Υ., Ка^ака!ки Н., А!акШ! А., 8йеррагб Ό., Ую1е!!е 8.М. ЕипсНоп-Ыосктд ш!едйп а1рйауЬе!а6 топос1опа1 апйЬоб1ек. к Βίο1. Сйет. 2004, 279:17875-17887.
31. Ма I., МсЫтша Н., Ροдο А., Коп У., ΙπαβΗΐηί Τ., кЫката Ι. Ассе1ега!еб йЬгокй апб со11адеп берокйюп бе„е1ор т !йе гепа1 т!егкй!шт оГ апдю!епкш !уре 2 гесер!ог пи11 ти!ап! писе бийпд иге!ега1 оЬк1гпсйоп. К1б Ш! 1998, 53:937-944.
Пример 15. Применение ингибирующего анти-а^, в мышиной модели индуцированного излучением фиброза легких.
Введение.
Фиброз легких встречается при ремоделировании нарушенного матрикса после легочного повреждения (Сйартап 2004). Среди многих факторов передачи сигнала, которые нарушаются в фиброзе легких, цитокин ΤΟΡ-β играет особенно важную роль. В моделях животных ингибирование передачи сигнала ΤΟΡ-β предотвращает фиброз в легком, почке, печени и коже.
После внутриклеточного процессинга ΤΟΡ-β и его продомен секретируются в виде нековалентно ассоциированного комплекса (Аппек, Мипдег е! а1., 2003). ΤΟΡ-β, связанный с его продоменом, является латентным, т.е. он не может связываться с рецепторами ΤΟΡ-β, таким образом, продомен называют ассоциированным с латентностью пептидом (ЬАР). Кроме действия в качестве ингибитора ΤΟΡ-β, ЬАР взаимодействует через образование дисульфидной связи с белками семейства Латентных ΤΟΡ-βсвязывающих белков (ΕΤΒί). ΕΤΒί являются белками матрикса и якорем латентного ΤΟΡ-β в ЕСМ. Высвобождение ΤΟΡ-β из ЬАР, процесс, называемый активацией латентного ΤΟΡ-β, является необходимой стадией в пути передачи сигнала ΤΟΡ-β. Стадия активации является потенциальной мишенью для стратегий уменьшения передачи сигнала ΤΟΡ-β.
Интегрины α,β6 и α„β8 активируют латентный ΤΟΡ-β 1 и ΤΟΡ-β3 взаимодействием с аминокислотной последовательностью ΚΟΌ, расположенной вблизи С-концов соответствующих ЬАР (Мипдег, Ниапд е! а1., 1999; Аппек, Кйкш е! а1., 2002; Ми, СашЫег е! а1., 2002). (ΤΟΡ-β2, конечная изоформа ΤΟΡ-β, не имеет последовательности ΚΟΌ и не может активироваться этими интегринами). В легком активация ΤΟΡ-β интегрином α„β6 играет неизлишнюю роль в гомеостазе и реакции на повреждение. α„β6 экспрессируется в небольших количествах в эпителии здорового легкого, но быстро регулируется повышающим образом после повреждения. Мыши, лишенные гена β6 (ЛдЬ6-/-), развивают воспаление и эмфизему легких как результат уменьшенной передачи сигнала ΤΟΡ-β. Воздействие блеомицином на легкие мыши вызывает острое легочное повреждение, сопровождаемое большим увеличением экспрессии ανβ6, с последующим ΤΟΡ-β-зависимым фиброзом легких; ЛдЬ6-/- мыши не развивают фиброза легких после обработки блеомицином.
Ионизирующее излучение вызывает фиброз легких (Егапко апб 8йагр1ш 1994; Моукак, КаГйп е! а1., 1997; Магйп, ЬеГа1х е! а1., 2000; АЬгай, Могдап е! а1., 2004). В отличие от модели индуцированного блеомицином фиброза легких, в которой фиброз начинается в пределах нескольких дней после повреждения легких, индуцированный излучением фиброз легких (ШЬЕ) начинается спустя месяцы после повреждения. Мышиный ШЬЕ является зависимым от штамма; штамм С57Β^/6, используемый в этих экспериментах, является чувствительным. В этой мышиной модели Шй-й имеется также существенная поздняя смертность, происходящая приблизительно при времени развития фиброза; эта смертность, вероятно, обусловлена потерей перфузии легких (Ргапсо, Nдиуеη е! а1., 1996; Нак!оп, Ζΐιοιι е! а1., 2002). Было получено ингибирующее анти-а^-тАЬ (3Ο9) (Ае1пгеЬ, 81топ е! а1. 2004). Задачами этих исследований были: (1) установление α,,βζ-зависимости ΚΙΕΡ в чувствительном штамме мыши сравнением реакций ЛдЬ6+/+ и ЛдЬ6-/- мышей на торакальное облучение, (2) подтверждение ΤΟΡ-β-зависимости мышиной модели ШЬТ обработкой облученных мышей антагонистом ΤΟΡ-β (растворимым рецептором ΤΟΡ-β) и (3) оценивание действий различных доз 3Ο9, предоставляемых облученным мышам.
Материалы и способы.
1. Животные.
Все использованные мыши были самками. ЛдЬ6-/- мыши были подарком от Эеап 8йеррагб, υΤ8Ρ, и разводились в оборудовании авторов изобретения на фенотипе ί.'57ΒΕ/6. Мышами дикого типа были Ε57ΒΕ/6, покупаемые из Ьасккоп ЬаЬога!огу (Βηγ НагЬог, МЕ), 7-9-недельного возраста при прибытии, и им давали акклиматизироваться одну неделю в оборудовании авторов изобретения перед облучением. Все процедуры обращения с животными и эксперименты были одобрены комитетом по уходу за лабораторными животными №\ν Υογ1< Ишуегсйу 8сйоо1 оГ Мебюше и соответствовали руководствам Нацио
- 81 016342 нального Института здравоохранения США (ШН) в отношении содержания и применения лабораторных животных. Клетки содержали максимально 5 мышей на клетку согласно протоколу для аппаратуры наблюдения за животными. Мышей подвергали мониторингу один раз в день на заболеваемость и смертность. Умирающих мышей умерщвляли.
2. Антитела.
Два антитела получали из Вюдеп 1бес (СашЬпбде, МА) и готовили, как описано здесь в другом месте.
Первичное тестируемое антитело, 309, является анти-ανβ6-тАЬ, которое блокирует </.,„ β6опосредованную активацию ТСЕ-β. Оно имеет подтип 1д01 и связывает (/.,„ β6 катионнезависимым образом. Контрольное АЬ (1Е6) было мышиным моноклональным АЬ против ЬРА-3-1д01 человека, которое не взаимодействует с ЬРА-3 мыши. Дозы этого контрольного антитела до 200 мг/кг в неделю в течение 4 недель в здоровых мышах не обнаруживали токсичности (данные из Вюдеп 1бес). Аликвоты антител готовили в виде разведений в стерильном ЗФР с получением доз 0,3, 1, 3, 6 и 10 мг/кг в общем объеме 200 мкл. Подкожные инъекции в правый бок или внутрибрюшинные инъекции, в зависимости от эксперимента, начинали при неделе 15 после облучения.
3. Протокол облучения.
Мышей облучали в возрасте 8-10 недель. Перед облучением анестезия достигалась с использованием Авертина (2,2,2-трибромэтанола; Асгок Огдашск, N1) с 15 мкл/г 2,5% раствора, доставляемого внутрибрюшинно. Затем мышей супинировали липкой лентой на поверхности из плексигласа. Соответствующий свинцовый экран ограничивал облучение грудной клетки. Поле от уровня верхушки легкого до мечевидного отростка грудины составляло 1,8 см. Для доставки излучения 14 Грей (Гр, джоуль на кг массы тела) использовали 60Со-источник. Расстояние от источника до кожи было равно 65 см. Время экспонирования с этим источником было равно ~11 мин. После воздействия излучением мышей возвращали в их клетки и помещали в положение супинации и подвергали мониторингу во время восстановления.
4. Сбор проб из умерщвленных мышей.
Мышей, которые выживали до заданных временных точек после облучения (26, 28 недель или 32 недели для исследований антител), умерщвляли и обрабатывали следующим образом. После получения глубокой анестезии с использованием Авертина на кожу грудной клетки и брюшной полости наносили в виде спрея 70% этанол. Торакальную полость раскрывали через диафрагму. 400-500 мкл крови аспирировали непосредственно из желудочков. Трахею обнажали и канюлировали ангиокатетером калибра 22. Проводили лаваж легких два раза аликвотами 700 мкл ЗФР. Правый стебель главного бронха лигировали при воротах и каждую долю извлекали и помещали в отдельную пробирку, быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С. Левое легкое наполняли 400 мкл 10% формалина, помещали в 10% формалин на ночь и заливали в парафин. Жидкость бронхо-альвеолярного лаважа (ВАЬ), полученную в момент умерщвления, делили на две аликвоты: 200 мкл и остаток. Обе пробирки центрифугировали при 2000 об/мин в течение 3 мин. Супернатант из обеих пробирок объединяли, замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С. Осадок клеток из большей пробирки быстро замораживали и хранили таким же образом. Аликвоту 200 мкл осадка клеток ресуспендировали 200 мкл лизисного буфера РВС и осторожно перемешивали. 50 мкл использовали для счета клеток в гемоцитометре. Остальные 150 мкл использовали для препаратов цитоспинов. Кровь, полученную сердечной пункцией, использовали для получения сыворотки или плазмы следующим образом. После начального смешивания в пробирках Саруес! или гепаринизированных микроцентрифужных пробирках на 1,5 мл пробы центрифугировали при 14000 об/мин в течение 20 мин. Супернатанты удаляли и немедленно замораживали до -80°С.
5. Сбор проб из мышей, обнаруженных мертвыми или умирающими.
Мышей, которые были обнаружены мертвыми или умирающими до достижения даты умерщвления, вскрывали для получения проб легких. Умирающих мышей эвтанизировали авертином перед вскрыванием. Торакальную полость раскрывали через диафрагму. Вскрытие до трахеи выполняли с полным обнажением трахеи. Трахею канюлировали ангиокатетером с калибром 22. Легкие наполняли 800-1000 мкл 10% формалина. Содержимое торакальной полости удаляли еп Ь1ос и помещали в 10% формалин по меньшей мере при 24 ч перед отделением легких и заливкой парафином.
6. Определение лейкоцитарных формул.
Препараты цитоспина окрашивали по способу О1й0шск (15-секундные погружения последовательно в фиксатор, 1% Эозин-Υ, 1% Ахиге А и деионизованную воду). Затем предметные стекла дегидратировали и заделывали. Количества нейтрофилов, лимфоцитов и макрофагов считали вручную в двух отдельных полях зрения микроскопа под большим увеличением (400х).
7. Иммуногистохимия.
Некоторые фиксированные формалином пробы использовали для иммуногистохимического детектирования β6. Эндогенную пероксидазную активность гасили 3% пероксидом водорода в метаноле в течение 15 мин и восстановление антигена выполняли нанесением П1дей-А11 3 Рерып (Бушеб, 8ои111 8ап Ргапсйсо) в течение 5-7 мин. Блокирующий раствор комплекса Авидин/Биотин (УесЮг БаЬогаЮпК Виг1шдате, СА) использовали в соответствии с инструкциями изготовителя. Блокирование выполняли 0,5% раствором казеина в течение 15 мин. Моноклональное анти-β6-антитело с12А1 (Вюдеп 1бее), которое
- 82 016342 состоит из вариабельной области мышиного анти-β6-тΛЬ, клонированной в Ι§0 человека, использовали при разведении 1:500 в 0,1% БСА в течение 1 ч при комнатной температуре. Детектирование выполняли с использованием набора Уес!а8!ат АВС (УесФг ^аЬο^а!ο^^еκ) с вторичным антителом против антител человека в соответствии с указаниями изготовителя. Генерирование хромогена выполняли с использованием набора ЭАВ (81дта, 8!. Βουίδ, МО), с последующим контрастным окрашиванием гематоксилином. Специфичность этой процедуры подтверждали исключением первичного антитела в срезах, обрабатываемых параллельно, что производилось рутинным образом, и предварительными тестами на срезах легких из Ιΐ§β6-/- мышей, которые давали отрицательные результаты.
8. Срезы легких, окрашивание Трихромом и процентное определение фиброза.
Фиксированные формалином, залитые в парафин легкие использовали для приготовления срезов поперечно до толщины 5 мкм. Срезы легкого получали при воротах или вблизи ворот согласно визуальной оценке. Предметные стекла депарафинировали до деионизованной воды (баня с ксилолом х2 в течение 3 мин каждая, 100% этанолом х2 в течение 3 мин каждая, 95% этанолом х2 в течение 3 мин каждая, 70% этанолом х3 в течение 3 мин каждая, деионизованной водой х3 в течение 3 мин каждая). Срезы окрашивали трехцветным красителем Массона (раствор Боуина в течение ночи до протравного красителя, железо-гематоксилин Вейгерта в течение 5 мин, 8саг1е1-Ас1б ЕискЫп Бибриха в течение 5 мин, раствор фосфорновольфрамовой/фосфорномолибденовой кислоты в течение 5 мин, раствор анилинового синего в течение 5 мин, с промываниями деионизованной кислотой между ними, и 1% уксусная кислота в течение 2 мин). Затем предметные стекла дегидратировали (70% этанол, 95% этанол, 100% этанол и ксилол) и заливали с использованием Пермаунта.
Использовали способ определения процента фиброза, описанный НакФп е! а1. (Сапсег Кек 2002, 62:372-8). Изображения низкого увеличения (2-3Х) окрашенных трехцветным красителем срезов легких получали и хранили в цифровом формате. Мануальное обследование при высоком увеличении (100200Х) срезов легких выполняли с использованием световой микроскопии для идентификации участков фиброза (определяемых по увеличенным отложениям коллагена и потере архитектуры). Поперечные площади фиброза вместе с общей поперечной площадью среза легкого очерчивали на цифровом изображении с использованием программы МН Ийаде 1.62. Сумму площадей фиброза делили на общую площадь легкого для определения процентного фиброза. Было показано, что один случайный поперечный срез легкого отражает процентный фиброз во всем легком при сравнении с 10 случайными срезами (НакФп, Апток е! а1., 1996).
9. Анализ гидроксипролина.
Измерение содержания гидроксипролина было приспособлено из способа Кеббу апб Етгететка. Правое легкое извлекали и взвешивали. Ткань легкого (приблизительно 20 мг сырой массы) инкубировали в 400 мкл 2Н раствора NаΟΗ в течение 12 ч (при комнатной температуре), затем гомогенизировали. Эти гомогенаты и стандартные растворы гидроксипролина гидролизовали нагреванием до 120°С в течение 30 мин. Раствор хлорамина-Т (0,056 М, 450 мкл) добавляли к 50 мкл гидролизата и окислению давали проходить в течение 25 мин. Добавляли реагент Эрлиха (1 М, 500 мкл) и окраске давали развиваться в течение 20 мин при 65°С. Затем измеряли оптическую плотность при 550 нм. Конечную концентрацию выражали в виде мкг гидроксипролина/мг сырой массы ткани легкого.
10. Измерения отношения масс КУ/ЬУ.
Мыши, используемые для этого эксперимента, находились в когорте, которую умерщвляли при 32 неделях после облучения; семь дополнительных необлученных мышей С57ВБ/6 использовали в качестве контролей. Сердца облученных мышей были сердцами мышей, которые умирали между 28 и 32 неделями, или мышей, которые выживали до умерщвления при 32 неделях. Сердца фиксировали в формалине. Под препаровальной лупой удаляли предсердия и свободную стенку правого желудочка (КУ) отсекали полностью от левого желудочка и перегородки (ЬУ) . Каждый кусочек желудочковой ткани взвешивали и рассчитывали отношение масс. Семь необлученных мышей С57ВБ/6 использовали в качестве контролей.
11. Статистика.
Статистическую значимость процентных различий фиброза между группами выполняли с использованием критерия Манна-Уитни для непараметрических данных. Данные смерти регистрировали и использовали для построения кривых Каплана-Мейера. Сравнения отдельных групп, а также общие сравнения кривых Каплана-Мейера выполняли с использованием Фд-рангового критерия (Мантеля-Кокса). Средние величины измерений приводятся с соответствующей стандартной ошибкой среднего или стандартным отклонением. Для сравнения измерений отношения масс КУ/ЬУ использовали !-критерий Стьюдента (непарный, двухсторонний). Точный критерий Фишера использовали для сравнения присутствия или отсутствия фиброза среди Γ(^β6-/- и Ι^β6+/+ мышей. Статистическая значимость была определена как р<0,05.
- 83 016342
Результаты.
1. Мышиный Я1ЬЕ требует экспрессии а^: сравнение ЙдЬ6-/-и ЙдЬ6+/+ мышей после торакального облучения.
Этот эксперимент был спланирован для сравнения экспрессии «νβ6 фона и после облучения и для сравнения, предотвращает ли отсутствие а^ фиброз. Авторы изобретения облучали ЙдЬ6-/- и ЙдЬ6+/+ мышей и умерщвляли их в разных временных точках до 28 недель и при 28 неделях.
(a) β6 положительно регулируется при 18-20 неделях после облучения. Мыши, умерщвленные до 18 недель после умерщвления, имеют нормальную, низкую экспрессию а^, как измерено иммуногистохимией. Однако при 18 неделях наблюдается диффузно увеличенная экспрессия β6 по альвеолярному эпителию (фиг. 42).
(b) Высокая экспрессия а^ сохраняется в фиброзных областях.
Авторы изобретения постоянно наблюдали высокие уровни экспрессии «νβ6 в эпителиальных клетках в фиброзных повреждениях, независимо от времени после облучения (фиг. 43). Однако эта диффузная увеличенная экспрессия а^, отмеченная при 18 неделях, часто является менее заметной в поздних временных точках (фиг. 43, ср. 24 недели и 27 недель).
(c) Мыши, лишенные а^, не развивают Я1ЬЕ.
В контрольных мышах самая ранняя временная точка, при которой можно было различить зоны фиброза, была 20-22 недели после облучения (не показано). Фиброзные зоны обычно хорошо разграничены и являются подплевральными. Авторы изобретения не обнаруживали каких-либо зон фиброза в срезах легких из ЙдЬ6-/- мышей, умерщвленных спустя 27 недель после облучения (N=17). В противоположность этому, авторы обнаруживали фиброзные зоны в срезах из 21/23 ЙдЬ6+/+ мышей, различие, которое является статистически значимым (р<0,001, двухсторонний точный критерий Фишера) (фиг. 44). Средняя %-ная площадь фиброза срезов из ЙдЬ6+/+ мышей (27 недель после облучения) была равна 17±3%. Авторы изобретения подтвердили эти гистологические открытия измерением содержания гидроксипролина легких из ЙдЬ6+/+ и ЙдЬ6-/- мышей спустя 27 недель после облучения (фиг. 45).
(б) Отсутствие «νβ6 не влияет на выживание после облучения легких.
После торакального облучения 14 Гр смертность была незначительной, пока не достигались 18 недель после облучения, и достигала 50% при приблизительно 25 неделях после облучения. Не было значимого различия между кривыми выживания ЙдЬ6-/- и ЙдЬ6+/+ мышей (фиг. 46).
2. Действие 309 (0,3, 1 и 10 мг/кг доз ΙΡ) и растворимого ТСЕ-βΒ в модели мышиного Я1ЬЕ.
Предыдущие результаты указывают на то, что Я1ЬЕ зависит от экспрессии интегрина а^ и что отсутствие а^б не ухудшает смертность после облучения. Необходимость а^ согласуется с его известной функцией в качестве активатора латентного ТОЕ-βΓ Эти результаты предполагают также возможность ингибирования а^ в качестве противофиброзной стратегии. Для испытания этой идеи и для подтверждения, что мышиная модель Я1ЬЕ является ΤΟΕ-β-зависимой, авторы изобретения обрабатывали облученных мышей либо контрольным АЬ, растворимым рецептором Т0Е^, либо одной из трех доз 309 (N=27 на группу). Меньшее количество мышей (N=15) обрабатывали инъекциями одного ЗФР (200 мкл). 309 использовали в дозах 0,3, 1 и 10 мг/кг, контрольное АЬ использовали при 10 мг/кг и растворимый рецептор ТСЕ-β использовали при 5 мг/кг. Обработки начинали при 15 неделях после облучения (приблизительно трех неделях перед положительной регуляцией а^) и продолжали непрерывно один раз в неделю, пока их не умерщвляли при 26 неделях после облучения (см. способы в отношении подробностей).
(a) 309 и растворимый рецептор ТСЕ-β уменьшают фиброз.
Всех выживших мышей умерщвляли при 26 неделях после облучения. В то время как группа 0,3 мг/кг не обнаруживала уменьшения в % фиброзе в сравнении с контролями, группа 1 мг/кг имела значимое уменьшение фиброза. Хотя группы растворимого рецептора ТСЕ-β и 10 мг/кг также обнаруживали меньше фиброза, чем контроли, этот результат не достигал статистической значимости в анализе только умерщвленных мышей (фиг. 47). Возможно, что мыши, умершие перед запланированной временной точкой умерщвления, биологически отличались от выживающих мышей. Таким образом, авторы изобретения выполняли сходный анализ на всех мышах, которые умирали или которых умерщвляли во время периода исследования. При рассмотрении всех мышей (умерщвленных мышей и мышей, умерших до умерщвления) значимо меньший фиброз присутствовал в группах 1 мг/кг, 10 мг/кг и группах с растворимым рецептором ТбЕ-β в сравнении с контролями. Группа 0,3 мг/кг опять не имела значимого различия в сравнении с контролями (фиг. 48).
(b) 309 при дозе 10 мг/кг вызывает нейтрофильный и лимфоцитарный альвеолит.
Бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ), выполненный на всех умерщвленных мышах, выявил увеличенные проценты нейтрофилов и лимфоцитов в группе 10 мг/кг в сравнении с контролями (фиг. 49). Другие группы не показали сходных изменений.
(c) Блокада а^ посредством антител в низких дозах не влияет на выживание после облучения легких.
- 84 016342
Не наблюдали значимого различия в выживании при сравнении всех групп (р=0,008; сравнение всех групп с использованием 1од-рангового критерия Мантеля-Кокса). Однако была очевидной тенденция в направлении увеличенной смертности (фиг. 50). При сравнении только группы 10 мг/кг в неделю и контрольной группы (т.е. без поправки на множественные сравнения) различие между кривыми выживания является статистически значимым.
3. Действие 369 (1, 3, 6 и 10 мг/кг в неделю доз 8С) в мышиной модели ИЬР.
Предыдущие результаты указывают на то, что ЯЛР в мышиной модели является ТСР-βопосредованным и значимо уменьшается 369 в дозе 1 и 10 мг/кг. Однако увеличенное альвеолярное воспаление и тенденция в направлении увеличенной смертности присутствует при дозе 10 мг/кг. В этом эксперименте авторы изобретения оценивали фиброз в более поздних временных точках (до 32 недель после облучения) для испытания возможности того, что обработка 369 просто задерживает появление ШЬР на несколько недель, а не предотвращает его. Кроме того, для лучшего определения различий в альвеолярном воспалении и, возможно, выживании между дозами 1 и 10 мг/кг авторы испытывали дозы между 1 и 10 мг/кг. Авторы облучали 270 мышей и делили их на равные группы для получения одной из четырех доз 369 (1, 3, 6 и 10 мг/кг) или контрольного антитела (АЬ) (10 мг/кг). Обработки начинали при 15 неделях после облучения и продолжали один раз в неделю до более поздней даты умерщвления. Этот эксперимент выполняли с 2 группами мышей, облученных с интервалом в один месяц. В одной группе мышей, начинающих лечение, умерщвляли, если они выживали до 28 недель после облучения (группа 1), а в другой группе, если они доживали до 32 недель (группа 2). Антитела вводили подкожно (не ΙΓ, как в предыдущем эксперименте).
(a) 369 в дозах 1, 3, 6 и 10 мг/кг уменьшает фиброз.
Значимо уменьшенные уровни фиброза наблюдали во всех группах, получающих 369, в сравнении с контролями (р<0,01). Эти различия были значимыми для мышей, обнаруженных мертвыми или умирающими, мышей, умерщвленных в конечных временных точках, и всех объединенных мышей (фиг. 51).
(b) 369 в более высоких дозах вызывает нейтрофильный и лимфоцитарный альвеолит.
Бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ), выполненный на всех умерщвленных мышах (Ν=101), выявил более высокие проценты нейтрофилов и лимфоцитов (фиг. 52) в группах 3 мг/кг, 6 мг/кг и 10 мг/кг в сравнении с контролями (р<0,02). Значимо более высокие проценты присутствовали также в группе 10 мг/кг в сравнении с группой 1 мг/кг (р<0,001). Количественно, увеличенные количества пенистых макрофагов (идентичных пенистым макрофагам, наблюдаемым в ЙдЬ6-/- мышах) и продуктов распада клеток наблюдали при более высоких дозах (фиг. 53).
(c) 369 в дозе 6 мг/кг ассоциируется с уменьшенным выживанием.
Не было различия в смертности между контрольной группой в сравнении с группами 1 мг/кг и 3 мг/кг (фиг. 54 и 55). Однако была значимо более высокая смертность в группе 6 мг/кг в сравнении с контролями (р<0,05). Группа 10 мг/кг не имела уменьшения в выживании в сравнении с контрольными мышами. Группа 6 мг/кг в неделю 369 имела худшее выживание как в когорте при умерщвлении при 28 неделях (группа 1), так и в когорте при умерщвлении при 32 неделях (группа 2), хотя различие было более значительным в группе, умерщвляемой при 28 неделях (фиг. 54 и 55).
(б) Действие облучения легких на отношение масс ЯУ/ЬУ и перфузию легких.
Предыдущие исследования предполагали, что смерти во время фазы фиброза после облучения легких обусловлены респираторным дистрессом, происходящим из комбинации блокады доступа воздуха (в основном вследствие фиброза) и потери альвеолярной перфузии (8йагр1ш апб Ргапсо 1989). Потеря перфузии должна приводить к легочной артериальной гипертензии и гипертрофии правого желудочка, и увеличенная масса ЯУ сообщалась в этой модели. Авторы изобретения измеряли отношение масс ЯУ/ЬУ мышей, которые выживали до 32 недель, и мышей в той же самой когорте, которые умирали между неделями 28 и 32. Мыши, которые умирали, имели значимо увеличенное отношение ЯУ/ЬУ в сравнении с мышами, которые выживали, и в сравнении с необлученными мышами (фиг. 56). Кроме того, в некоторых мышах, которые умирали, отмечали отдельные зоны с полным отсутствием эритроцитов в альвеолярных стенках, факт, который является показателем полной потери альвеолярной перфузии (фиг. 57).
Обсуждение.
Известно, что ТСР-β является профиброзным медиатором. Предыдущая работа показала, что интегрин «νβ6 активирует латентный Т6Р-[1 и Т6Р-[3 и что ЙдЬ6-/- мыши защищены от индуцируемого блеомицином фиброза легких. Представленные здесь результаты указывают на то, что ЙдЬ6-/- мыши также защищены от индуцируемого облучением фиброза легких. Эти результаты обеспечивают обоснование для антифиброзной терапии, нацеленной на интегрин «νβ6.
В этих исследованиях авторы изобретения обнаружили, что антитело 369, вводимое в дозах 1 мг/кг в неделю, более стойко и эффективно уменьшало ЯИР. Более высокие дозы, в частности дозы 6-10 мг/кг в неделю, ассоциировались с увеличенными процентами нейтрофилов и лимфоцитов в жидкости БАЛ. Эти изменения согласуются с фенотипом ЙдЬ6-/- мышей и предполагают, что эти дозы 369 ингибируют «νβ6опосредуемую активацию ТСР-β до такой степени, что эти животные являются фенокопией нокаутов.
Кроме того, более высокие дозы 369 ассоциируются, вариабельно, с уменьшенным выживанием в
- 85 016342 мышиной модели В1ЬР. В первом испытании наблюдали сильную тенденцию к увеличенной смертности с дозой 10 мг/кг в неделю, но не в мышах, обработанных 1 или 0,3 мг/кг в неделю. Во втором испытании была увеличенная смертность в группе с 6 мг/кг в неделю, но не в других группах (в том числе 10 мг/кг в неделю). Хотя причины этих противоречий в зависимости доза/ответ не выяснены, общим результатом является склонность к уменьшенному выживанию при самых высоких испытанных дозах.
Случаи смерти, которые имеют место в этой модели В1ЬР, по-видимому, обусловлены респираторным дистрессом. Смертность зависит от штамма и от пола (На81оп, Ζ1ιο\ν е( а1. 2002). Причины дисфункции легких и смертности в мышиной модели В1ЬЕ интенсивно исследовались (БЬагрйп апб Ргапсо 1989). Авторы этого исследования сделали вывод, что перфузия легких уменьшается после облучения, и этот дефицит, по-видимому, способствует смертности. Мыши, которые являются устойчивыми к индуцируемому облучением фиброзу легких, также уменьшали выживание в индуцированной облучением модели фиброза легких. Было обнаружено, что уменьшенная перфузия легких в этих мышах является основным фактором, способствующим их смерти в этой модели. Распределение дефицита перфузии зависит от штамма (линии). В склонных к фиброзу мышах полная потеря перфузии (оцениваемой по присутствию или отсутствию коллоидального угля, инъецированного внутривенно за 30 с перед умерщвлением) ограничивается зонами фиброза и случайными небольшими зонами, смежными с фиброзными повреждениями. Кроме того, была большая вариабельность от участка к участку в количестве угля в перфузированных зонах в облученных мышах, чем в необлученных контролях, что предполагает, что были существенные зоны с уменьшенной, но не с отсутствующей перфузией. Другим доказательством потери перфузии легких, наблюдаемым во множественных линиях мыши, было уменьшенное количество малых кровеносных сосудов в свободном от повреждений легком и гипертрофия ВV, оцениваемая по отношению толщины Κ.ν/ίν. Количества эритроцитов в альвеолярных стенках (другой способ оценивания перфузии) были также уменьшенными в облученных мышах (линия Α/ί). Большинство мышей С57ВБ/6 не имели плевральных выпотов. За исключением линии С57ВЬ/101, повреждение миокарда не встречалось как результат облучения.
Наблюдения авторов изобретения в отношении смертности согласуются с более обширными наблюдениями §1агр1ш апб Ргапсо. В контрольных мышах количество фиброза является более высоким в мышах, которые умерли, чем в мышах, которые выживают до умерщвления (фиг. 51), что предполагает, что более сильная дисфункция легких ассоциирована со смертью. Мыши, которые умирают, имеют гипертрофию правого желудочка (определяемую как увеличение индекса масс ВV/^V), в то время как мыши, выживающие до умерщвления, не имеют гипертрофии правого желудочка (фиг. 56), наблюдение, которое предполагает, что потеря перфузии легких ассоциирована со смертью. В некоторых мышах, которые были обнаружены мертвыми, зоны легкого, не имеющие эритроцитов в альвеолярных стенках, были очевидными на гистологических срезах (фиг. 57) в соответствии с полной потерей перфузии в этих зонах и в соответствии с более ранними описаниями (§1агр1ш апб Ргапсо 1989). Авторы данного изобретения не отмечали доказательства эзофагеальной дисфункции (образования рубцов, перфорации), которые могли бы быть ответственными за смерть, и не отмечали некроза миокарда. Таким образом, доказательство авторов данного изобретения, интерпретируемое в свете предыдущих исследований, предполагает, что потеря перфузии легких встречается в мышах С57ВЬ/6, даже когда фиброз предотвращен, и что потеря перфузии легких, а не фиброз, является ответственной за смерть. Авторы отмечали также, что мыши с большей вероятностью должны были умирать в течение 2 дней после инъекций (либо контрольным ΑΚ либо 309), что предполагает, что стресс манипулирования и, возможно, избыточный объем жидкости вследствие инъекции ускорял смерть в случае мышей с критическим состоянием.
Хотя потеря ανβ6 посредством уничтожения гена не влияет на смертность в этой модели, высокие дозы 309 (6-10 мг/кг/неделя) были ассоциированы с более ранней смертью в сравнении с мышами, обработанными более низкой дозой 309, или контрольным ΑΒ Наиболее очевидной интерпретацией является то, что более высокая доза 309 ухудшает смертность. Однако авторы не могут исключить возможность того, что контрольное ΑЬ и более низкие дозы 309 действительно улучшают выживание. Сравнение времени до 50% выживания для этих трех экспериментов, по-видимому, выявляет две группы. Мыши дикого типа и ЙдЬ6-/- мыши (фиг. 46), ЗФР-обработанные и 10 мг/кг/неделя 309-обработанные мыши в ΙΡ-эксперименте (фиг. 50) и 6 мг/кг/неделя 369-обработанные мыши в §С-эксперименте (фиг. 54) имели медианы времени выживания ~22,5-25 недель, в то время как все другие группы обработки имели медианы времени выживания 24,5-30 недель (фиг. 50 и 54). Окончательные выводы в данный момент не являются возможными, так как экспериментальные условия варьировались и, возможно, другие условия изменялись между этими экспериментами, вызывая изменения в базовой смертности (фоне). В мышах, обработанных 309 при 6-10 мг/кг в неделю, авторы данного изобретения не отмечали новых отклонений от нормы (других, чем воспаление легких), что можно было бы также отнести на счет изменений в выживании согласно макроскопическому обследованию этих мышей при вскрытии или согласно гистологии легких. Причины различий в выживании между более низкими и более высокими дозами 309 в модели В1ЬР являются неясными.
Эти исследования подтверждают вывод, что более низкие дозы 309, которые предположительно не
- 86 016342 уменьшают максимально «ДУ-опосредуемую активацию Т0Е-[, безопасно предотвращают фиброз легких в мышиной модели ШЬЕ.
Ссылки.
АЬга!!, К.Р., Могдап, 0.ν. е! а1. (2004). Ри1топагу сотрйсайопк оГ гай1айоп !йегару. С1ш. СНек!. Мей. 25(1):167-77.
Аппек, I. Р., Мипдег, 1.8. е! а1. (2003). Макшд кепке оГ 1а!еп! Т0Е[ асйуайоп. I. Се11. 8с1. 116(Р! 2):217-24.
Аппек, 1.Р., Кйкт, О.В. е! а1. (2002). ТНе т!едгш ανβ6 Ьтйк апй асЕШек 1а!еп! Т0Е[3. ЕЕВ8 Ьей 511(1-3):65-8.
СНартап, Н.А. (2004). Ойогйегк оГ 1ипд тайзх гетойейпд. I. С1т. йгхек! 113(2):148-57.
Егапко, А.Т, Nдиуеη, 0.К. е! а1. (1996). А сотрапкоп оГ (Не ийгак!гис!иге оГ реГикюп-йейаеп! апй Гипс1юпа1 1ипд рагепсйута т СВА писе йиппд !Не 1а!е рНаке айег 1ггай1айоп. Кай1а! Кек 146(5):586-9.
Егапко, А.Т апй 8йагр1ш I. (1994). Оеуе1ортеп1 оГ ПЬгокй айег 1ипд 1ггай1а!юп т ге1айоп !о шйаттаНоп апй 1ипд Гипсйоп ш а тоике к!гат ргопе !о йЬгок1к. Кай1а! Кек 140(3):347-55.
Нак!оп, С.К., Аток, СТ. е! а1. (1996) 'ЧпНегйапсе оГ киксерйЬййу !о Ыеотуст-шйисей ри1топагу йЬгокй 1п !Не 1ипд. Сапсег Кек 56(11):2596-601.
Нак!оп, С.К., 2йои, X. е! а1. (2002). ип1уегка1 апй гай1а!юп-кресШс 1ос1 1пГ1иепсе тигше киксерйЬййу !о гай1а1юп-шйисей ри1топагу йЬгок1к. Сапсег Кек 62(13): 3782-8.
Магйп, М., ЬеГа1х, I. е! а1. (2000). ТСЕ^ апй гай1а!юп йЬгок1к: а так!ег к^йсй апй а кресШс !йегареийс !агде!. Ш!. I. Кай1а! 0псо1. Вю1. РНук. 47(2):277-90.
Моукак, В., КаГйп. Т.А. е! а1. (1997). Ри1топагу гай1айоп тщгу. СНек! 111(4):1061-76.
Ми, Ό., СатЫег, 8. е! а1. (2002). ТНе ш!едгш а^8 тей1а!ек ерййейа1 Нотеок!ак1к ЙгоидН МТ1-ММРйерепйеп! асйуайоп оГ Т0Е-Ье!а1. I. Се11. Вю1. 157 (3) :493-507.
Мипдег, I. 8., X. Ниапд, е! а1. (1999). ТНе ш!едгт аур6 Ьтйк апй ас!гуа!ек 1а!еп! Т0Е[1: а тесНашкт Гог геди1айпд ри1топагу шйатта!юп апй йЬгок1к. Се11. 96(3):319-28.
8йагр11п, I. апй Егапко А.Т (1989). А дцап!йа!гуе Ык!о1одка1 к!ийу оГ кйат-йерепйеп! йШегепсек т !Не еГГес1к оГитай1айоп оп тоике 1ипд йийпд !Не ш!егтей1а!е апй 1а!е рНакек. Кай1а! Кек 119 (1):15-31.
Vе^π^еЬ. Р.Н., 81топ, К.1. е! а1. (2004). Еипс!юп-Ь1оскшд ш!едгш а^ топос1опа1 апйЬоФек: йййпс! 11дапй-т1тейс апй попйдапй-ттейс с1аккек. I. Вю1. СНет. 279(17):17875-87.
Пример 16. Эффективность моноклонального анти-а^-интегрин-антитела в индуцированной блеомицином модели фиброза легких.
Резюме.
Существующие способы лечения для фиброза легких являются в значительной степени неэффективными, и имеется огромная потребность в развитии новых терапевтических веществ. Агенты, которые блокируют путь Т0Е-[, представляют особый интерес вследствие центральной роли Т0Е-[ в запуске многих патологических процессов, которые характеризуют фиброз легких, в том числе активации и пролиферации фибробластов, и экспрессии молекул внеклеточного матрикса. Кроме его профиброзных активностей, Т0Е-[ является важным противовоспалительным цитокином, и, следовательно, терапевтическое ингибирование Т0Е-[ должно идеально блокировать фиброз без стимуляции избыточного воспаления. Предыдущие исследования показали, что интегрин а^ является ключевым медиатором активации Т0Е-[ 1п у1уо, в частности, в легком. а^ непосредственно связывается с латентными Т0Е-[комплексами во внеклеточном пространстве, и это связывание во многих случаях является необходимым для высвобождения активной формы. Мыши, дефектные в отношении а^, имеют легкое воспаление легких вследствие нарушенной передачи сигнала Т0Е-[ в легком и являются устойчивыми к индуцируемому блеомицином фиброзу легких. Авторы данного изобретения развили моноклональные антитела, которые блокируют связывание а^ с латентным Т0Е-[ и ингибируют активацию Т0Е-[ и последующую передачу сигнала. Здесь авторы демонстрируют, что эти антитела являются эффективными в уменьшении индуцированного блеомицином фиброза в мышах. Авторы дополнительно показывают, что почти максимальная эффективность в уменьшении экспрессии коллагена в легких может быть достигнута при дозах, которые не производят дополнительного воспаления, как измерено количествами воспалительных клеток в бронхоальвеолярном лаваже. Хотя более высокие дозы этого антитела, которые также уменьшают фиброз, могут индуцировать воспаление в соответствии с воспалением, наблюдаемым в аДУ-недостаточных мышах. Эти открытия демонстрируют, что эти провоспалительные и антифиброзные действия блокирования аДУопосредованного Т0Е-[ являются разделимыми в этой модели и что ингибирование фиброза происходит при более низких дозах, чем провоспалительные действия.
Введение.
Цитокин Т0Е-[1 является центральным как в инициации, так и в поддержании фиброза, патологического процесса, отличающегося заменой патологической ткани избытком внеклеточного матрикса (ЕСМ) и в конечном счете приводящего к рубцеванию и повреждению органа. Т0Е-[1 стимулирует пролиферацию фибробластов и активацию миофибробластов, которые являются ответственными за секре
- 87 016342 цию ЕСМ и поддержание прогрессирования фиброзного процесса [1-6]. Т0Е-31 играет хорошо регулируемую роль в событиях ремоделирования ткани, которое имеют место во время заживления ран, однако, во многих заболеваниях этот процесс ремоделирования ткани становится отклоняющимся от нормы и характеризуется пролонгированной положительно регулируемой передачей сигнала, избыточным накапливанием фибробластов, отложением ЕСМ и рубцеванием. Важность Т0Е-31 в прогрессировании фиброза 1п у1уо была показана как в исследованиях увеличения функции, так и посредством блокады [1, 712]. Аденовирусная и трансгенная сверхэкспрессия различных цитокинов в легком показала, что Т0Е-31 является уникальным в его способности стимулировать фиброз в отсутствие существенного воспаления. Другие цитокины, которые стимулируют фиброз, часто выполняют это повышающей регуляцией экспрессии ТСЕ-β 1 в ткани. Кроме того, исследования показали, что мыши с нокаутом, дефектные в отношении ЗМАЭЛ, медиатора передачи сигнала Т0Е-3, являются устойчивыми к развитию фиброза легких [13]. Многочисленные исследования с анти-Τ0Е-β-агентами показывают сильную защиту от фиброза в моделях заболеваний [8, 9, 11, 14-17]. Поэтому, Т0Е-31 был идентифицирован как потенциальная терапевтическая мишень для лечения заболеваний, ассоциированных с патологией фиброза.
Интегрин «νβ6 был идентифицирован как критический регулятор активации Т0Е-3 1. Т0Е-3 1 синтезируется в виде латентного белка, который отщепляется и секретируется с Ν-концевым ЬАР, нековалентно ассоциированным со зрелым, активным С-концевым цитокином Т0Е-3. Этот латентный комплекс ТСЕ-β 1 не может связываться с его когнатным рецептором и, следовательно, остается биологически неактивным, пока он не превращается в его активную форму одним из нескольких альтернативных механизмов, которые включают в себя расщепление протеазами, воздействие низким рН или ионизирующей радиацией и конформационные изменения в латентном комплексе, позволяющие ему связываться с его когнатными рецепторами [18-21]. Интегрин «νβ6 связывается с К0Э-мотивом в латентном ТСЕ-βкомплексе и превращает его в активную форму [18, 22-25]. Хотя были идентифицированы несколько других механизмов активации Т0Е-3, исследования на β6-интегрин-недостаточных мышах ф6-нульмышах) предполагают, что «^-опосредованная активация Т0Е-3 является необходимой для развития фиброза в легком и почке [18, 26]. «νβ6 экспрессируется при низких или недетектируемых уровнях в нормальных развитых тканях, но сильно положительно регулируется в воспалительном/фиброзном заболевании и обычно ограничен эпителиальными клетками [27-30]. Таким образом, положительно регулируемая экспрессия «νβ6 в эпителиальных клетках во время повреждения ткани обеспечивает механизм для увеличенной локальной активации Т0Е-3 и последующих Τ0Е-β-зависимых событий в опухолевых клетках с неканоническим антигенным фенотипом. Блокирование связывания лиганда «νβ6 [31] обеспечивает способ локализованного ингибирования активации Т0Е-3 специфически в тканях, в которых положительно регулируется экспрессия «νβ6. Этот подход предоставляет потенциал для уменьшения клинических рисков безопасности, ассоциированных с глобальным ингибированием пути Т0Е-3.
В описанных здесь исследованиях авторы изобретения показывают, что «νβ6 является значимо положительно регулируемым в заболеваниях легких человека, ассоциированных с воспалительной и фиброзной патологией, в том числе идиопатическом фиброзе легких (1РЕ). Предыдущие исследования продемонстрировали, что 36-нуль-мыши, которые лишены функции «νβ6, защищены от индуцируемого блеомицином фиброза [18]. Здесь авторы изобретения показывают, что моноклональные антитела, которые блокируют связывание лиганда и функции активации Т0Е-3 «νβ6, в сильной степени ингибируют индуцированный блеомицином фиброз в большом разнообразии штаммов (линий) мышей и по целому ряду показателей фиброза. Далее авторы изобретения демонстрируют, что популяции альвеолярных клеток не изменяются при низких эффективных дозах в поврежденном блеомицином легком, и, следовательно, этот механизм антифиброзного действия, как и ожидалось, не опосредован ингибированием воспаления. Только при введении высоких, частых доз наблюдается дополнительное воспаление в этой модели в соответствии с открытием дополнительного воспаления в β6-нуль-мышах.
Материалы и способы.
1. Реагенты.
«^6-тАЬ получали, как описано здесь в другом месте и как описано ранее [31]. кДНК химерных антител человек-мышь 2А1 и 309 получали из соответствующих РНК исходных гибридом с праймерами константной области СЭЬ-739 для тяжелой цепи и СЭЬ-738 для легкой цепи с использованием набора для синтеза первой цепи кДНК (Атегкйат/Рйагтааа, Р1кса1а^ау, N1). Гены вариабельных областей тяжелой и легкой цепей амплифицировали полимеразной цепной реакцией с использованием 3'-праймеров, использованных для синтеза кДНК, и пулов вырожденных праймеров, специфических для сигнальных последовательностей большинства генов мышиных антител (последовательностей, доступных по запросу), и ДНК-полимеразы РТи (З1га1адепе, Ьа 1о11а, СА). Клонированные вариабельные области тяжелой и легкой цепей лигировали в экспрессирующие векторы млекопитающих с константными областями 1д01 человека. Слитый белок рекомбинантный растворимый рецептор типа II мышиного Τ0Е-β-Iд (кТ0ЕβΕΙΙ-Ιβ) получали, как описано ранее [32]. ти309, 1Е6 и кΤ0Е-βКII-Iд (очищенный белок в забуференном фосфатом солевом растворе) использовали во всех экспериментах.
- 88 016342
2. Животные.
Мыши. Мышей 8ν129 использовали для экспериментов с гидроксипролином легких в качестве конечного результата (8йеррагй ЬаЬогаИгу, ИС8Е). Мышей С57ВБ/6 использовали для экспериментов с гистоморфометрией или сбором и анализом БАЛ в качестве конечных результатов (Вюдеп Иес). Для количественного анализа экспрессии гена коллагена в качестве конечного результата использовали трансгенных репортерных мышей Шоден Иес). Трансгенные мыши, несущие репортерный ген люциферазы под контролем района 17 т.п.н. промотора гена соП«2, были описаны ранее [33]. Этих мышей сохраняли скрещиванием трансгенных самцов с гибридными самками Е1 С57ЭБ/6 X ИВА/2 (йаскюп ЬаЬога(опе5). Потомство, положительное в отношении этого трансгена (как определено по экспрессии люциферазы из хвостов светляка), отбирали для описанных ниже экспериментов с введением блеомицина.
Хомячки (Сш ЬаЬогаИгу). Самцов золотистых сирийских хомячков с массой 90-110 г покупали из 81топ5еп5, Нс. (Сйгоу, СА). Хомячков содержали в виде групп из четырех животных в установках с фильтруемым воздухом и постоянными температурой и влажностью. Весь уход был в соответствии с руководством Национальных Институтов здравоохранения в отношении закона об условиях содержания животных. Хомячкам давали акклиматизироваться в установках в течение 1 недели перед любыми обработками. Поддерживали цикл 12 ч свет/темнота.
3. Иммуногистохимия.
Легкие мышей собирали в 10% забуференном формалине и обрабатывали для гистологии в парафине в соответствии с обычной практикой. Парафиновые срезы ткани из легких пациентов с заболеванием легких с фиброзной патологией получали от С. Иаущ (И. Vе^тоηΐ), К. БаГуа(15 (Войоп ИшуегШу), АгйаЦ Согр. (ЪехтдЮш МА) и АЦегапй Нс. (Иейой, ΜΙ). Срезы ткани депарафинировали в ксилоле и этаноле, повторно гидратировали в дистиллированной воде и затем погружали в метанол, содержащий 0,45% Н2О. Ткани инкубировали с пепсином (00-3009, 2утей, 8ап Егапсщсо, СА) и блокировали авидином и биотином (8Р-2001; Vесΐо^ ЬаЬогаИпек, Виг/пдате, СА). Первичное антитело разводили в забуференном фосфатом солевом растворе (ЗФР), содержащем 0,1% бычий сывороточный альбумин (БСА), и ткани инкубировали в течение ночи при 4°С. Срезы инкубировали с химерной формой человек/мышь анти«^6-тАЬ, 2А1 [31] и биотинилированным вторичным антителом против ЦС человека (РК-6103, Vесΐо^ ЬаЬогаИпек, Виг/пдате, СА) для тканей мыши.
Срезы инкубировали с мышиным 2А1 [31] и антимышиным-биотинилированным вторичным антителом (РК-6102, Vесΐо^ ЬаЬогаИпек) для тканей человека. Комплекс авидин-биотин-пероксидаза хрена ^есИг Κίΐ, РК-6102) наносили на срезы, инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре и готовили субстрат 3,3'-диаминобензидин (ИАВ), согласно рекомендациям (8К-4100, Vесΐо^ ЬаЬогаИпек), и наносили на срезы и выдерживали в течение 5 мин при комнатной температуре. Срезы ткани окрашивали гематоксилином Майера в течение 1 мин и промывали в воде и ЗФР. Все пробы тканей человека получали с согласия местного институционального контроля и согласия пациента.
3.1. Введение блеомицина в мышей.
Штамм (линия) 8ν129 (И. 8йеррагй, ИС8Е). Мышам вводили блеомицин или солевой раствор в трахею, как описано ранее [18]. Вкратце, 8-12-недельных мышей линии 129/ίδΓ8νΈΜ8 одного возраста и пола содержали в среде, не содержащей конкретных патогенов. Блеомицин (Меай Ийпкоп, Рг1псе1оп, N1) растворяли в стерильном солевом растворе (0,03 или 0,05 ед. в 60 мл). Блеомицин или солевой раствор вводили через трахею при анестезии метоксифлураном прямым оперативным доступом.
Мыши штамма С57ВБ/6 и коллагеновые репортерные мыши (Вюдеп ЮЕС). Мышей анестезировали инъекцией ГР 100 мг/кг кетамина и 10 мг/кг ксилазина. Срединный разрез 0,5-1,0 см выполняли в области шеи с использованием стерильного скальпеля № 15 для обнажения трахеи для визуализации. Блеомицин вводили с использованием микрораспыляющего устройства Репп СепНгу после обнажения трахеи и помещения наконечника распылителя в трахею через полость рта. В контрольных животных вводили солевой раствор. После введения операционный участок закрывали стерильными раневыми зажимами. Подкожно вводили 0,05 мг/кг бупренорфина для снижения послеоперационной боли.
Использовали множественные протоколы обработки для оценки этого тест-изделия в исследованиях с блеомицином на мышах, и они будут, следовательно, описаны в разделе результатов.
3.2. Введение блеомицина в хомячка.
Под анестезией пентобарбиталом хомячкам вводили ΙΤ солевой раствор (8А; 4 мл/кг) или блеомицин (ВЬ; 6,5 Е/4 мл/кг) в дни 0, 7 и 14. Животных случайным образом делили на шесть экспериментальных групп: инсталлированные 8А, обработанные ЗФР (РВ8) (8А+ЗФР); инсталлированные ВЬ, обработанные ЗФР (ВЬ+ЗФР); инсталлированные ВЬ, обработанные ти3С9 со дня 0 (ВЬ+АЬ1); инсталлированные ВЬ, обработанные ти3С9 со дня 7 (ВЬ+АЬ2); инсталлированные ВЬ, обработанные ти3С9 со дня 14 (ВЬ+АЬ3); и инсталлированные ВЬ, обработанные 1Е6 при дне 0 (ВБ+1Е6). Животных умерщвляли в день 28 и их легкие извлекали и обрабатывали для анализа на гидроксипролин и пероксиление липидов.
4. Анализ с использованием гидроксипролина для определения содержания коллагена.
Легкие гомогенизировали в 1 мл йН20 в стеклянных пробирках (ЕЦйег #14961). К гомогенату до
- 89 016342 бавляли 125 мкл 50% трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и инкубировали на льду в течение 20 мин. Пробы центрифугировали при 1000 об/мин 5 мин и 4°С. Супернатант выбрасывали и к осадку в стеклянной пробирке добавляли 1 мл 12Н НС1. Затем пробы выдерживали при 110°С в течение 24 ч (в стеклянном химическом стакане).
Высушенный осадок восстанавливали 2 мл бН2О. Готовили шесть стандартов гидроксипролина (81дта-Н6002), начиная от 0,25 мг/мл. В пробирку Эппендорфа на 1,5 мл, содержащую 500 мкл хлорамина Т (1,4% хлорамин Т в 0,5М ацетате натрия и 10% изопропаноле), добавляли 200 мкл пробы и инкубировали 20 мин при комнатной температуре. Затем добавляли 500 мкл реагент Эрлиха/рОМВА (1М рБМВА (п-диметиламинобензальдегид) в 70% изопропаноле и 30% перхлорной кислоте) и инкубировали при 65°С в течение 15 мин. 100 мкл конечного реакционного раствора переносили в 96-луночный планшет, выполняли измерение в трех повторностях для каждой пробы и пробы считывали при 550 нм спустя 2 ч.
5. Гистологический индекс.
Для экспериментов с гистоморфометрией в качестве конечного результата в момент умерщвления все легкое каждой мыши оценивали гистологически. Делали поперечные срезы и окрашивали трехцветным красителем Массона рутинным образом. Поперечные срезы выбирали таким образом, что они включали в себя множественные доли легких из каждой мыши. Поля зрения микроскопа под большим увеличением (100Х) фотографировали для включения всего окрашенного трехцветным красителем среза (в среднем приблизительно тридцать на одну мышь). Каждую фотографию оценивали на содержание коллагена (который имеет синюю окраску в окрашенных трехцветным красителем срезах) при помощи программы Ме1атогр11 6.0.5. Синие зоны отбирали по порогу окраски и выражали в виде процента от общей площади ткани.
6. Анализ люциферазы.
Легкие собирали и гомогенизировали в 1 мл лизисного буфера (0,1М КН2РО4, рН 7,8 и 1 мМ ББдитиотреитол). Затем пробы помещали на лед на 10 мин, центрифугировали при 12000 об/мин при 4°С в течение 10 мин и затем 100 мкл каждой пробы переносили в \Уа11ас 1§ор1айег. Пробы опять помещали на лед на 15 мин перед добавлением 100 мкл субстрата Бис1йе (Регкш Е1тег #601911). Затем люциферазную активность считывали на люминометре.
7. Сбор бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) и дифференциальное окрашивание клеток БАЛ.
Мышей эвтанизировали чрезмерной дозой 1пасйп (81дта) внутрибрюшинной инъекцией (1Р). Трахею обнажали с использованием в большинстве случаев рассечения тупоконечным инструментом. Затем трахею раскрывали ножницами между двумя хрящевыми кольцами и в трахею вставляли тупоконечную иглу 23-го калибра. Эту иглу удерживали на месте легким фиксированием временным зажимом Шварца (РоЬох). БАЛ выполняли инъекцией 0,8 мл забуференного фосфатом солевого раствора без Са2+ или Мд2+ (ЗФР) в легкие. Затем жидкость оттягивали в шприц без применения большого давления и переносили в полипропиленовую пробирку Ба1соп на 15 мл на льду. Затем эту процедуру повторяли, жидкость БАЛ отсасывали обратно в шприц без создания избыточного отрицательного давления. Пробы хранили на льду и обрабатывали для счета клеток, лейкоцитарных формул, и как осадок, так и жидкость БАЛ собирали и хранили при -80°С.
1. Затем БАЛ центрифугировали при 180хд, 1000 об/мин (Весктап 0РР) в течение 10 мин на настольной центрифуге при 4°С. Затем супернатант (жидкость БАЛ) удаляли и замораживали при -80°С. 1,0 мл буфера для лизиса РВС (эритроцитов) добавляли к осадку и смешивали на вортексе в течение 20 с. Затем выполняли счет клеток и получали цитоспины.
2. Пробы хранили на льду и считали с использованием гемоцитометра, выдерживая клетки в течение 1 мин после внесения клеток в гемоцитометр и до считывания, что позволяет клеткам осесть.
3. 100 мкл суспензии клеток центрифугировали на цитоцентрифуге (Тйегто8йапбоп) при 500 об/мин в течение 5 мин при комнатной температуре. Препараты цитоспинов готовили помещением раствора клеток в прибор для получения цитоспинов и центрифугировали при 500 об/мин в течение 5 мин. Концентрации клеток проверяли, чтобы быть уверенными в том, что эти концентрации не были слишком высокими на предметном стекле. Предметным стеклам давали высыхать в течение ночи и затем их окрашивали с использованием БОГОтк (Бййег). Окрашивание выполняли в соответствии с протоколом изготовителя (ΌίΠΟιιίΙ/). После высыхания предметных стекол и покрытия пермаунтом (Бййег) клетки разделяли на категории по их типу, считая 100 случайным образом отобранных клеток при помощи лабораторного счетчика клеток (Бййег).
8. Статистический анализ. Статистические сравнения выполняли между контролем-носителем и/или контролем на изотип и тест-изделием с использованием дисперсионного анализа (АNОVА). При установлении статистически значимых различий при вероятности р<0,05 с использованием АNОVА, значимые различия между группами оценивали с использованием критерия множественных сравнений Дуннета.
Результаты.
1. Экспрессия (/νβ6 в заболевании легких человека и в модели с блеомицином.
- 90 016342
Положительно регулируемые Τ0Ε-β экспрессия и передача сигнала были описаны в различных заболеваниях легких человека, включающих в себя фиброзную и воспалительную патологию [20, 34]. Однако экспрессия а^ была описана только в небольшой пробе фибровоспалительного заболевания легких [28]. Авторы изобретения оценивали экспрессию а^ в сорока одной пробе тканей легких от пациентов с заболеванием легких, характеризующимся наличием фиброзных и/или воспалительных изменений (табл. 16-1). Кроме того, авторы окрашивали множество тканей легких из явно здоровых участков биопсий легких от раковых пациентов (бпдепех). Экспрессия а^ в здоровом легком была почти недетектируемой при помощи иммуногистохимии. Некоторые срезы тканей на этом множестве здоровых тканей легких обнаруживали положительное а^-окрашивание, но каждый из этих срезов имел также близкую к воспалительной патологию. Во всех из 41 пробы легких участки легкого с фиброзом и/или воспалительными изменениями обнаруживали сильную положительную регуляцию экспрессии а^ (фиг. 58). а^ был локализован в эпителиальных клетках, покрывающих участки явного фиброза, или в участках, смежных с воспалительными инфильтратами. Присутствие положительно регулируемого а^ наблюдали по всему спектру фибровоспалительных заболеваний, включающих в себя идиопатический фиброз легких, склеродермальное заболевание легких и хроническую обструктивную болезнь легких.
Для лучшей корреляции экспрессии со специфическими патологическими изменениями, авторы посылали окрашенные пробы тканей внешнему квалифицированному патологу. Хотя он не смог подтвердить патологический диагноз многих коммерчески полученных проб (АгбаЬ апб Айепапб), он последовательно отмечал, что гораздо более высокая интенсивность окрашивания оу[6 наблюдалась с обычным интерстициальным пневмонитом, патологией, ассоциированной с фиброзом и прогрессирующим заболеванием, в сравнении с неспецифическим интерстициальным пневмонитом (Ν8ΙΡ), патологией, ассоциированной с меньшим фиброзом и лучшим прогнозом. Во всех биопсиях из пациентов с υΙΡ интенсивное окрашивание наблюдается в выстилке пневмоцитов альвеолярных протоков и альвеол как типа ΙΙ, так и типа Ι, тогда как крупные дыхательные пути являются в значительной степени отрицательными и интраальвеолярные макрофаги являются отрицательными. В целом, окрашивание высокого уровня было ассоциировано с фиброзными зонами и υΙΡ, и сходные картины менее интенсивного окрашивания наблюдались в других случаях фиброза, в том числе Ν8ΙΡ. Поскольку υΙΡ является доминантной патологией в пациентах с идиопатическим фиброзом легких (ΙΡΕ), интенсивная сверхэкспрессия а^, активатора профиброзного цитокина Τ0Ε-β, у пациентов с этой патологией предполагает, что он может играть функциональную роль в запуске прогрессирования фиброза.
2. Экспрессия а^ в модели с блеомицином мыши.
Для подтверждения, что а^ также положительно регулировался в модели индуцированного блеомицином фиброза легких мыши, авторы изобретения иммуноокрашивали на присутствие белка а^ на срезах тканей, взятых в дни 1, 5 и 15 после введения блеомицина. В день 5 экспрессия а^ положительно регулируется на альвеолярном эпителии во всех участках легкого, поврежденных введением блеомицина (фиг. 59). В день 15, когда участки значительного фиброза являются очевидными, а^ является более сильно положительно регулируемым в альвеолярном эпителии в этих фиброзных зонах.
3. Оценка фиброза по гидроксипролину в мышах 8У129.
Мыши, генетически недостаточные в отношении а^ ([6-нуль-мыши), продемонстрировали ранее защиту от индуцированного блеомицином фиброза легких в штамме мыши 8У129 [18]. Авторы пытались оценить эффективность моноклонального анти-а^-антитела, ти309, в уменьшении индуцированного блеомицином фиброза в том же самом штамме. Серию из четырех экспериментов проводили в лабораториях сотрудника авторов, Эеап 8йерратб, в υС8Ε (табл. 16-2). Мышам 8У129 вводили блеомицин в трахею в день 0 и ти309 инъецировали ΙΡ при 4 мг/кг, три раза в неделю со дня 0, 15 или 30 после введения блеомицина. Контрольных мышей инъецировали ЗФР или антителом отрицательного контроля 1Е6. 1Е6 является мышиным IдО1-антителом против ЬЕА-3 человека, и оно не связывается ни с одним антигеном мыши. Мышей умерщвляли в день 30 или 60 и фиброз оценивали по содержанию гидроксипролина, меры общего коллагена ткани. В трех из этих четырех экспериментов имело место статистически значимое уменьшение гидроксипролина в ти309-обработанных мышах, что указывало на эффективность в уменьшении индуцированного блеомицином фиброза (фиг. 60). Только при задержке обработки до 30 дней после введения блеомицина (фиг. 60С) содержание гидроксипролина в легких ти309-обработанных мышей не уменьшалось значимо в сравнении с ЗФР-обработанными или обработанными контролем на изотип мышами.
4. Оценка выживания в мышах с введенным блеомицином, обработанных 46 дней.
Антифиброзная эффективность в модели с блеомицином обычно не коррелирует с улучшенным выживанием, и, следовательно, авторы не ожидали улучшения выживания в ти309-обработанных мышах. Однако поскольку эти мыши, обработанные ти309 при 4 мг/кг 3 раза в неделю со дня 15 до дня 60 (фиг. 60Ό), представляли самый продолжительный период обработки (46 дней), испытанный авторами, авторы анализировали, было ли какое-либо различие в выживании в испытанных группах в этом эксперименте. Не было значимого различия в общем выживании при сравнении мышей, обработанных ти309,
- 91 016342 с мышами, обработанными ЗФР и контрольным неблокирующим антителом 4В4 (табл. 16-2).
5. Гистоморфометрический анализ фиброза в мышах С57ВЬ/6.
Для валидизации антифиброзной эффективности ти369 в другом штамме мыши и в другой лаборатории ти369 оценивали в серии экспериментов в Вюдеп Иес с использованием штамма мыши С57ВЬ/6. Этот штамм часто используют в модели с блеомицином, и он дает быстрый фиброз, который может быть измерен, спустя 14 дней после введения. В первых трех экспериментах мышам вводили блеомицин в трахею в день 0, обрабатывали ти369 три раза в неделю, начиная со дня 1 перед введением блеомицина (день -1), и эвтанизировали в день 14 для сбора легких. В четвертом эксперименте обработку задерживали до дня 14 и легкие собирали в день 28. В каждом из этих экспериментов (фиг. 61) ти369 стойко уменьшал процент фиброзной ткани легкого относительно ЗФР-обработанных контролей, измеренной гистоморфометрически в виде окрашивающихся в синий цвет участков в окрашенных трехцветным красителем Массона срезах тканей. В одном из двух вариантов, в которых в качестве отрицательного ЛСконтроля использовали 1Е6-тАЬ, это 1Е6-тАЬ также значимо уменьшало процент фиброзной ткани (фиг. 61 А). Это действие 1Е6-тАЬ не наблюдали ни в более ранних экспериментах с использованием гидроксипролина в качестве конечного результата (фиг. 60), ни в эксперименте с задержанной обработкой (дни 14-28) (фиг. 61Ό). В целом, множественные эксперименты показали эффективность ти369тАЬ в уменьшении процента фиброзной ткани, индуцированной блеомицином в мышах С57В1/6. Однако вследствие трудоемкого характера определения гистоморфометрического конечного результата, авторы пытались найти более быстрый и количественный способ для измерения фиброза.
6. Применение репортерного трансгена коллагена-люциферазы в качестве количественного конечного результата.
Трансгенных мышей, несущих трансген, в котором репортерный ген люциферазы экспрессируется под контролем промотора гена коллагена Ι«2, использовали ранее для обеспечения количественного считывания экспрессии коллагена в моделях фиброза [33]; [35]. При 14 днях увеличение уровней люциферазы легких в мышах с введенным блеомицином относительно солевых растворов в качестве контролей было приблизительно 10-кратным, что делает этот способ гораздо более чувствительным конечным результатом, чем измерение гидроксипролина. С использованием этой системы авторы выполняли титрование дозы антитела 369 с использованием введения доз один раз в неделю, но с включением группы мышей, которых обрабатывали с использованием схемы введения доз 4 мг/кг - 3 раза в неделю, используемой в экспериментах с гидроксипролином и гистоморфометрии с трехцветным красителем в качестве конечного результата. Это титрование доз оценивали в трех экспериментах, в которых каждый эксперимент имел ЗФР-обработанную контрольную группу (п=6, 5 и 6, так что общее число п=17). Для коррекции на вариацию от эксперимента к эксперименту в измерениях люциферазы, величины люциферазы для всех групп в каждом эксперименте нормализовали относительно средней величины ЗФР-контролей. Обработка ти369 репортерных мышей с введенным блеомицином давала зависимое от дозы уменьшение коллаген-люциферазного репортера (фиг. 62), причем наблюдали значимую эффективность при еженедельной дозе 0,3 мг/кг и максимальную эффективность наблюдали при еженедельной дозе 1-3 мг/кг.
7. Анализ состава клеток бронхоальвеолярного лаважа.
Авторы анализировали клеточные популяции бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) в дни 2, 5, 8 и 11 модели с блеомицином для определения, обусловлено ли ингибирование фиброза уменьшением воспаления или изменениями основных субпопуляций воспалительных клеток в легком. Как и ожидалось, имелись увеличения в счете клеток БАЛ вследствие внутритрахеального введения блеомицина в сравнении с мышами, которым вводили солевой раствор. Однако во всем временном периоде не наблюдали значимого различия в общем количестве клеток БАЛ, в количествах или процентах макрофагов, нейтрофилов или лимфоцитов мышей, обработанных в эффективных дозах 0,3, 1,0 и 3 мг/кг антитела 369 по сравнению с мышами, обработанными изотипически сходным контрольным антителом 1Е6. Затем авторы испытывали гораздо более высокие дозы с использованием обработки 3 раза в неделю, которую первоначально использовали для демонстрации эффективности с гидроксипролином и гистоморфометрией в качестве конечных результатов. Мышам вводили три дозы 4, 20 и 40 мг/кг т369 в дни -1, +1 и +3 относительно введения блеомицина. Мышей эвтанизировали в день 5 и анализировали содержание клеток БАЛ. При дозе 4 мг/кг (обшей дозе 12 мг/кг) опять не было значимого изменения в общем количестве клеток БАЛ, в количествах или процентах макрофагов, нейтрофилов или лимфоцитов. При дозе 20 и 40 мг/кг (общей дозе 60 и 120 мг/кг) было значимое увеличение количества макрофагов относительно ЗФРконтролей, но не относительно ^61 -контроля (фиг. 62). При дозе 40 мг/кг было значимое увеличение процента нейтрофилов в БАЛ в сравнении как с ЗФР-, так и Iд6-контролями, хотя изменения общих количеств нейтрофилов не достигало значимости. Это увеличение нейтрофилов, которое имеет место при очень высокой дозе (120 мг/кг в целом), похоже на увеличение, наблюдаемое при высокой дозе, долгосрочной обработке (обработке 6 и 10 мг/кг в течение 3-4 месяцев) в модели индуцированного облучением фиброза (см. пример 15). Таким образом, анти-ανβ6-антитела способны уменьшать индуцированную блеомицином экспрессию коллагена при таких низких еженедельных дозах, как 0,3 мг/кг, в то время как дозы до 12 мг/кг в целом не производят значимых изменений в клеточных популяциях БАЛ в этой моде
- 92 016342 ли. Более высокие дозы могут производить увеличения в общем количестве макрофагов и в процентах нейтрофилов.
8. Оценка в модели хомячка со множественными дозами блеомицина.
Авторы изобретения испытывали эффективность ти309 в модели фиброза легких хомячка, в которой три последовательные дозы блеомицина предоставляли внутритрахеально в дни 0, 7 и 14. Три группы хомячков обрабатывали ти309 при 5 мг/кг три раза в неделю (всего 15 мг/кг в неделю), начиная с дней 0, 7 или 14. Животных умерщвляли и оценивали в отношении фиброза в день 28 посредством анализов гидроксипролина (фиг. 65А) и пероксиления липидов (фиг. 65В) (выполняемых в и. СаШогшаПа,1в, Оштв, СА). Неожиданно, эффективность не обнаруживали в уменьшении фиброза в этой модели. В одной из групп хомячков, обработанных ти309, начиная с дня 7 и 14, мыши обнаруживали статистически значимое увеличение в гидроксипролине легких относительно как ЗФР-, так и ЦС-контрольных групп. Величины перокисления липидов не увеличивались значимо в сравнении с IдΟ-контрольной группой. Авторы анализировали кривые выживания этих разных групп обработки, чтобы определить, оказывало ли это очевидное обострение действие на выживание хомячков. Мыши, обработанные ти309 со дня 0 (группа ВЬ+АЬ1 на фиг. 65С), начинали умирать несколько раньше, чем ЗФР- и IдΟ-контроли; однако, при сравнении кривой выживания ВЬ+АЬ1, отдельно с ЗФР- и IдΟ-контролями это различие не было значимым (1од-ранговый критерий: р=0,15 против ЗФР и р=0,25 против IдΟ-контрольного тАЬ). Неизвестно, реагирует ли моноклональное антитело ти309 перекрестно с хомячком, и возможно, что хомячки генерировали реакцию антител против мышиных антител, используемых в этой модели. Вследствие трудностей в интерпретации результатов в этой модели, оценивание различных доз на эффективность не проводили, так как постоянную эффективность наблюдали в двух различных мышиных моделях фиброза легких (индуцированного блеомицином и облучением).
Таблицы
Таблица 16-1
Пробы заболевания легких человека, иммуноокрашенные на экспрессию «νβ6
Патология/Диагноз (где доступны) Число случаев Источник
Диффузное интерстициальное заболевание легких 1 Ог. ОегаМ ОаУ18 ишуегзйу оГУеггпоп!
Воспаленная масса I
Саркоидоз 1
Хроническое воспаление и фиброз (ΙΡΡ) 1
Очаговое воспаление 2
Респираторный бронхиолит, интерстициальное заболевание легких 1
Бронхоэктаз 1
Эмфизема, очаговая пневмония 1
Диффузный интерстициальный фиброз с эмфиземой 1
Лучевой фиброз 3 Агбак Согр.
Фиброз 4
Муковисцидоз 1
Хроническая обструктивная болезнь легких 1
Хронический бронхит 2
Бронхоэктаз 1
Пневмония, интерстициальная, неспецифическая, фиброзная (Ν5ΙΡ-Ρ) 1
Фиброз 2 Ак1егап<11пс.
Пневмония 2
Легочное заболевание со склеродермией 14 Ог. КоЬег( Т ,а(уаш, ВозЮп ишуегзйу
Общее число проб 41
Таблица 16-2
Выживание мышей с введенным блеомицином, обрабатываемых в течение 46 дней ти309
ЗФР 4В4 309 806
Количество умерших мышей/количество обработанных мышей 4/11 3/13 2/13 5/13
Процент выживания 64% 77% 79% 62%
- 93 016342
Выводы.
Антитело ти309 является сильным ингибитором тяжести заболевания в модели индуцированного блеомицином фиброза. Эта серия экспериментов продемонстрировала следующее.
(a) Экспрессия а^ положительно регулируется на эпителиальных клетках в большом спектре заболеваний легких человека с фиброзной и/или воспалительной патологией. Она также положительно регулируется в мышиной модели индуцированного блеомицином фиброза.
(b) Антитело ти309 значимо уменьшало индуцированный блеомицином фиброз во множественных экспериментах при использовании множественных конечных результатов для анализа. Эффективность наблюдали во всех штаммах испытанных мышей, 8У129, С57ВЙ/6, и гибридах С57ВЙ/6 X ЭВА. Эффективность в подавлении экспрессии коллагена наблюдали при таких низких дозах, как 0,3 мг/кг в неделю.
(c) Механизм действия ти309 включает в себя ингибирование Т0Е^, пробиотического цитокина с противовоспалительными свойствами. Как и ожидалось, ингибирование фиброза происходит без ослабления воспаления. Высокие частые дозы ти309 (20 и 40 мг/кг, предоставляемые каждый второй день) могут индуцировать умеренные увеличения относительно ЗФР-, но не 1д0-контролей, в общих количествах клеток БАЛ, макрофагов и нейтрофилов в бронхоальвеолярном лаваже мышей с введенным блеомицином в день 5.
(б) Антитело ти309 не было эффективным в модели с блеомицином с множественными дозами в хомячке. Неясно, было ли очевидное обострение фиброза в одной ти309-обработанной группе связано с испытуемым антителом.
(е) Обработка ти309 в дозе 4 мг/кг 3 раза в неделю в течение 4 6 дней не влияла на выживание в модели с блеомицином.
Ссылки.
1. ЯоЬейк, А.В., е! а1., ТгапкГогттд дго\\Л Гас!ог 1уре β: Яар1б тбисйоп оГ йЬгок1к апб апдюдепекк т νίνο апб кЛтбаРоп оГ со11адеп ГогтаРоп ш уйго. Ргос. №111. Асаб. 8е1, И8А, 1986, 83: рр. 4167-4171.
2. ЯоЬейк, А.В. апб 8рот, М.В. Яеди1айоп оГ епбоЛейа1 се11 дго^Л агсЬйесЛге, апб та!пх купЛекк Ьу Т0Е-Ье!а. Ат. Яеν. Яекр1г. Όίκ., 1989. 140: рр. 1126-1128.
3. Уагда, I., ЯокепЬ1оот, ί. апб йтепе/, 8.А. ТгапкГогттд дго\\Л ГасЮг Ье!а (Т0Е Ье!а) саикек а регк1к!еп( тсгеаке ίπ к(еабу-к(а(е атоипк оГ 1уре 1 апб 1уре III со11адеп апб йЬгопесйп тЯЫАк ίπ погта1 йитап бегта1 йЬгоЫакК Вюсйет. I., 1987. 247(3): рр. 597-604.
4. 0гапбе, ΙΡ., Ме1бег, Э.С. апб 2шкте1ккг, А.Я. Моби1аРоп оГ со11адеп депе ехргеккюп Ьу су!октек: кйтиШогу еГГес! оГ йапкГогтЛд дго\\Л Гас!ог-Ье!аЕ \νίΛ бйегдеп! еГГес!к оГ ер1бегта1 дго\\Л ГасЮг апб (итог песгокк Гас!ог-а1р11а оп со11адеп !уре I апб со11адеп !уре 1У. ί. ЬаЬ. С1ш. Меб., 1997. 130(5): рр. 476486.
5. Уа1кег, 0.А., е! а1., Уа1уи1аг туойЬгоЬ1ак1к асРсаРоп Ьу !гапкГогттд дго\у!11 Гас!ог-Ье!а: пирНсаРопк Гог ра!йо1од1са1 ех1гасе11ы1аг та!пх гетобейпд т Неаг! уа1уе бйеаке. Спс. Яек., 2004. 95(3): рр. 253-260.
6. Екке1Ьегд, О., е! а1., Ех!гасе11и1аг та!пх берокйюп Ьу рптагу йитап 1ипд Г1ЬгоЬ1ак1к ш гекропке !о Т0Е-Ье!а1 апб Т0Е-Ье!а3. Ат. I. РЬуяоЦ 1999. 276(5): рр. Й814-Й824.
7. 81те, Р.Ь, е! а1., Абепоуес!ог-теб!а!еб депе (гапкГег оГ асруе !гапкГогттд дго\у!11 ГасЮг-β! шбисек рго1опдеб ксуеге ПЬгокй ш га! 1ипд. ί. С1т. ЛуекЕ, 1997. 100: рр. 768-776.
8. Воптаиб, Р., е! а1., Ргодгеккйе Т0Е-(Ье1а)1-тбисеб 1ипд йЬгок1к 1к Ь1оскеб Ьу ап ога11у асруе АЬК5 ктаке шЫЬйог. Ат. I. Яекрп. СЛ. Саге Меб., 2004. 171: рр. 889-898.
9. Ьаршд, N.1., АЬК5 !п1иЫРоп т гепа1 б1кеаке. Сигг. Орт. Рйагтасо1., 2003. 3(2): рр. 204-208.
10. М1уарта, А., е! а1., АпйЬобу !о йапкГогтЛд дго\у!11 ГасЮг-β ате1юга!ек !иЬи1аг арор!ок1к т ит1а!ега1 иге!ега1 оЬкйисйоп. К1б. Λΐ., 2000. 58: рр. 2310-2313.
11. 8йагта. К. е! а1., ХеШгаНхаРоп оГ Т0Е-Ье!а Ьу ап апШТ0Е-Ье1а апрЬобу а!!епиа!ек йбпеу йурег!гор11у апб Ле епйапсеб ех!гасе11и1аг та!пх депе ехргекккюп ш 8Т2-шбисеб б1аЬеРс тюе. П1аЬекк, 1996. 45(4): рр. 522-530.
12. Уапд, О. е! а1., Яебисйоп оГ Ыеотуст шбисеб 1ипд йЬгок1к Ьу !гапкГогттд дго\у!11 Гас!ог β ко1иЬ1е гесер!ог ш йатккгк. Тйогах, 1999. 54: рр. 805-812.
13. Воптаиб, Р., е! а1., 8таб3 пи11 тке беуе1ор айкрасе еп1агдетеп! апб аге гек1к!ап! !о Т0Е-Ье1атеб1а!еб ри1топагу ПЬгокй. I. Iттипο1., 2004. 173(3): рр. 2099-2108.
14. 0еогде, I., е! а1., Л угуо тЫЫРоп оГ га! к!е11а!е се11 асРуаРоп Ьу ко1иЬ1е !гапкГогттд дго^Л Гас!ог !уре II гесер!ог: А ро!еп!1а1 пе\у Легару Гог йерайс ПЬгокЬ. Ргос. №1!1. Асаб. δα, И8А. 1999. 96(22): рр. 12719-12724.
15. 2йепд, н., е! а1., ЯесотЫпап! ко1иЬ1е !гапкГогттд дго^Л Гас!ог β !уре II гесер!ог ате1юга!ек габ1аРоп еп!егора!11у ш писе. 0акйоепкго1оду, 2000. 119: рр. 1286-1296.
16. Какида, н., е! а1., ЕГГес!к оГ апР-ТСЕ-β !уре II гесер!ог апрЬобу оп ехрептеп!а1 д1отеги1оперЬпйк. К1б. Λΐ., 2001. 60: рр. 1745-1755.
17. 21уабеЬ, Е^, е! а1., Бопд-!егт ргеуепРоп оГ гепа1 ткиЕйтепсу, ехсекк та!пх депе ехргеккюп, апб д1отеги1аг текапд1а1 та!пх ехрапкюп Ьу !геа!теп! \νίΛ топос1опа1 апЛгапкГогттд дго^Л ГасЮг-β апрЬобу 1п бЬ/бЬ б1аЬеРс тке. Ргос. N311. Асаб. δα, И8А, 2000. 97(14): рр. 8015-8020.
- 94 016342
18. Мипдег, 18., е( а1. ТНе 1п1едг1п ανβ6 Ьшбз апб асйуакз 1а(еп( Τ0Ρβ1: а тесНашзт йог геди1айпд ри1топагу шйаттайоп апб йЬгоз1з. Се11, 1999. 96: рр. 319-328.
19. 01е1/ез, Р.Е, е( а1. Т0Р-Ье(а 1а1епсу: Ь1о1од1са1 з1дпгйсапсе апб тесНашзтз ой асйуайоп. 8кт Се11з, 1997. 15(3): рр. 190-197.
20. КНай1, Ν., Т0Р-Ье(а: йгот 1а(еп( (о асРте. МкгоЬез 1пйес(., 1999. 1(15): рр. 1255-1263.
21. Вагсе11о8-Но1£, М.Н. Ьа1епсу апб асйуайоп ш (Не соп(го1 ой ТСР-β. ί. Матт. 01апб Вю1., 1996. 1(4): рр. 353-363.
22. Ниапд, Χ.Ζ., е( а1. ТНе 1п1едг1п ανβ6 1з сг1(1са1 йог кегайпосу1е т1дгайоп оп Ьо(Н Из кпо\уп Ндапб, йЬгопесйп, апб оп уйгопесйп. ί. Се11 8с1, 1998. 111: рр. 2189-2195.
23. Визк, М., Ру1е11а, В. апб 8Неррагб, Ό. СНагас(епха(кп ой (Не т(едпп а1рНа ν Ье(а 6 аз а йЬгопесйпЬтбтд ргокт ί. Вю1. СНет, 1992. 267(9): рр. 5790-5796.
24. Уокозакк Υ., е( а1. О1ййегепйа1 еййес(з ой (Не ткдппз а1рНа9Ье!а1, а1рНауЬек3, апб а1рНауЬе!а6 оп се11 ргоййегайуе гезропзез (о кпазст. Во1ез ой (Не Ье(а зиЬипй ехйасе11и1аг апб су1ор1азт1с ботатз. ί. Вю1. СНет, 1996. 271(39): рр. 24144-24150.
25. Αηηез, ΙΡ., Вйкт, Э.В. апб Мипдег, 18. ТНе ткдип ανβ6 Ьтбз апб асйуакз 1а(еп( Τ0Рβ3. РЕВ8 1ей., 2002. 511: рр. 65-68.
26. Ма, Ь.к, е( а1. Тгапзйогттд дго\у(Н йасΐο^-β-береηбеηΐ апб тберепбеп! ра(Н\уауз ой тбисйоп ой (иЬи1о1п1егзййа1 йЬгоз1з ш β6-/- тке. Αιη. ί. Ра(Но1., 2003. 163: рр. 1261-1273.
27. Вгеизз, !М., е( а1. Везйккб б1з!г1Ьийоп ой ткдпп β6 ιΡΝΑ т рпта(е ерйНеНа1 Нззиез. ί. Н|з(осНет. апб Су1осНет., 1993. 41(10): рр. 1521-1527.
28. Вгеизз, ГМ., е( а1. Ехргеззюп ой (Не β6 зиЬипй ш беуе1ортеп(, пеор1аз1а апб йззие герай зиддез(з а го1е ш ерйНе11а1 гетобейпд. ί. Се11 8а, 1995. 108: рр. 2241-2251.
29. ΖатЬ^иηο, 0., е( а1. Тгапзйогттд дго\у(Н йас(ог-р| тоби1а(ез β1 апб β5 Нпедпп гесер(огз апб тбисез (Не бе поуо ехргеззюп ой Не ανβ6 Некгобтег т погта1 Нитап кегайпосу1ез: ппр1ка(кпз йог \уоипб НеаНпд. ί. Се11 Вк1, 1995. 129(3): рр. 853-865.
30. Накктеп, Ь., е( а1. 1псгеазеб ехргеззюп ой (^6-1п(едг1п ш зкт 1еабз (о зроп(апеоиз беуе1ортеп( ой сНгошс \уоипбз. Αιη. ί. Ра(Но1., 2004. 164: рр. 229-242.
31. ХУетгеН, Р.Н., е1 а1. Рипсйоп-Ыосктд ткдпп а1рНатЬе(а6 топос1опа1 апйЬоб1ез. ί. Вю1. СНет., 2004. 279(17): рр. 17875-17887.
32. Создгоуе, Ό., е( а1. 1п(едпп α1β1 апб йапзйогттд дго\у(Н йас!ог-р1 р1ау б1з(1пс( го1ез т а1рой д1отеги1аг ра(Нодепез1з апб зегуе аз биа1 (агде(з йог те(аЬоНс (Негару. Αιικτ ί. ой Ра1Но1., 2000. 157(5): рр. 16491659.
33. 1падак1, Υ., е( а1. Лс(^νа(^οη ой Ргоа1рНа2(1) со11адеп ргото(ег бшапд Нерайс йЬгодепез1з т (гапздешс тке. ВксНет ВюрНуз Вез Соттип, 1998. 250(3): рр. 606-11.
34. Вгоеке1тапп, Т.П е( а1. Тгапзйогттд дго\у(Н йас(ог β1 1з ргезеп( а! зйез ой ех(гасе11и1аг та(пх депе ехргеззюп т Нитап ри1топагу йЬгоз1з. Ргос. Пай. Αсаб. 8α, υ8Α, 1991. 88: рр. 6642-6646.
35. Эеп(оп, С.Р., е( а1. Лс(^νа(^οη ой а йЬгоЬ1аз1-зресгйс епНапсег ой Не ргоа1рНа2(1) со11адеп депе т
НдН(-зкт тке. ВНеит, 2001. 44(3): рр. 712-22.
- 95 016342
Глоссарий.
1Е6
ΑΝΟνΑ ββ-нуль
БАЛ (ВАЛ)
ВАЛЕ
1д
ΙΡ тАЬ ти369 или
369 зТбБ-ЬК или зТСЕЬК11-1д ТСЕ-β
Мышиное 1д61-моноклональное антитело против
ЬЕА-3 человека. Не связывается с антигеном мыши. Его используют в качестве 1д61контрольного тАЬ.
Дисперсионный анализ
Мыши, дефектные в отношении субъединицы интегрина β6. Эти мыши являются недостаточными только в отношении интегрина θνβ$.
Бронхоальвеолярный лаваж
Жидкость бронхоальвеолярного лаважа
Иммуноглобулин
Внутрибрюшинный
Моноклональное антитело
Мышиное 1д61-моноклональное антитело против интегрина ανβ5- Оно является исходной формой ВйОООН, перед гуманизацией.
Растворимый рецептор Типа I ТСГ-β, слитый 1ддоменом.
Трансформирующий фактор роста бета
Приложение А. Изменение дозы ти309 (гидроксипролин).__________________
Дни 1-30 1Е6 309
Блеомицин Среднее 142,49 107,86
Стандартное отклонение 21,31 8,24
и (число животных) 7 3
Солевой раствор Среднее 95,01 92,64
Стандартное отклонение 14,66 10,78
η (число животных) 6 6
Дни 15-30 1Е6 309
Блеомицин Среднее 118,33 100,2
Стандартное отклонение 15,05 8,42
η (число животных) 6 7
Солевой раствор Среднее 96,70 111,19
Стандартное отклонение 16,82 7,26
η (число животных) 6 6
Дни 30-60 1Е6 309
Блеомицин Среднее 200,7 193,68
Стандартное отклонение 33,14 39,38
η (число животных) 6 7
Солевой раствор Среднее 120,49 118,58
Стандартное отклонение 13,57 6,26
η (число животных) 6 6
Дни 15-60 ЗФР 4В4 369 866
Блеомицин Среднее 208,45 178,17 160,3 134,49
Стандартное отклонение 19,36 22,4 15,25 6,29
и (число животных) 7 10 11 8
Солевой раствор Среднее 104,54 115,98 111,98 110,9
Стандартное отклонение 15,13 7,26 9,5 12,44
η (число животных) 5 5 5 5
- 96 016342
Приложение В. Изменение дозы ти3Ο9 (гистоморфометрия).
Фиг.61А ЗФР 369 866 8ВЗ 1Е6 Без блеомицина
Среднее 8,09 5,84 5,26 6,66 5,89 4,41
Стандартное отклонение 1,80 0,83 0,98 0,73 0,87 0,90
η {число животных) 12 7 7 9 7 8
Фиг.61В ЗФР 369 „ТбГЬК Без блеомицина
Среднее 6,32 4,01 4,69 4,56
Стандартное отклонение 0,53 0,64 0,77 0,35
η (число животных) 9 9 9 8
ФИГ.61С ЗФР 0,4 мг/кг 1 мг/кг 2 мг/кг 4 мг/кг Без блеомицина
Среднее 13,19 11,67 12,14 11,07 9,56 9,76
Стандартное отклонение 3,67 2,56 2,45 3,28 1,82 0,99
η (число животных) 13 12 11 9 13 11
Фиг.бГО ЗФР 4 мг/кг 20 мг/кг зТОГЬК 1Е6-4 мг/кг Без блеомицина
Среднее 10,92 9,18 9,13 9,63 10,78 8,10
Стандартное отклонение 1,88 1,41 1,85 0,66 1,45 0,80
η (число животных) 9 8 8 8 9 15
Приложение С. Изменение дозы ти3Ο9 (мыши с коллагеном в качестве репортера).
ЗФР 0,1 мг/кг 0,3 мг/кг 1 мг/кг 3 мг/кг 10 мг/кг 3X4 мг/кг зтсгыиме Ложноопер.
Среднее 3617 2887 2021 1121 837 1274 1927 768 331
Станд отклонен. 1768 1819 723 1023 500 872 1459 286 166
η (число животных) 17 11 12 15 6 5 5 5 3
Приложение Ό. Состав БАЛ в экспериментах с блеомицином: введение доз один раз в неделю.
1Е6 Без блеомкнвна ЗФР 0,3 мг/кг 1 мг/кг 3 мг/кг 1Е6
Средн. Стана. I η откп. (число 1 живот.1 Среди. Станд откл. (число живот.) Средн. (число жмъот.) Средн. (число Средн. Ά' (число живот.) Средн. л (число живот.)
ОбщийБАЛ День 2 1,40 0,45 5 2,80 0,75 10 4,83 1,32 10 3,78 1,67 10 4,18 1,61 10 4,25 0,63 10
День 5 2,51 0,87 5 8,80 6,17 10 7,35 4,97 10 10,03 5,35 10 9,43 4,56 10 9,66 5,76 10
День 8 2,70 0,69 5 10,83 6,59 8 7,39 2,21 9 7,95 5,69 9 12,95 9,14 9 6,68 2,60 10
День 11 2,26 0,55 5 12,17 2,13 9 7,73 2,33 8 7,67 2,62 6 9,63 3,48 4 8,44 2,42 7
Макрофаги День 2 1,33 0,39 3 2,33 0,54 9 4,22 1,20 9 2,99 1,00 10 3,24 1,09 10 3,54 1,09 10
День 5 2,51 0,87 5 6,65 4,26 10 5,34 3,98 10 7,60 4,52 10 6,86 3,14 9 5,33 3,14 10
День 8 1,85 0,49 5 9,86 5,57 10 8,23 4,22 9 8,94 4,34 10 5,90 3,63 10 10,74 3,63 4
День 11 2,26 0,55 5 8,50 2,15 8 2,83 2,40 7 5,06 2,39 6 3,78 1,93 4 3,95 1,93 7
Лимфоциты День 2 0 0 3 0 0 9 0 0 9 0 0 10 0 0 10 0 0 10
День 5 0 0 0 0 10 0 0 10 0 0 10 0 0 9 0 0 10
День 8 0 0 5 0,78 0,98 10 0,16 0,19 9 0,47 0,27 10 0,63 0,56 10 0,22 0,30 4
День 11 0 0 5 0,27 0,23 8 0,05 0,07 7 0,06 0,08 6 0,15 0,21 4 0,02 0,04 7
Нейтрофилы День 2 0,003 0,008 3 0,42 0,47 9 0,92 0,56 9 0,79 0,75 10 0,71 0,74 10 0,94 0,74 10
День 5 0 0 5 2,15 3,43 10 2,01 1,77 10 2,43 1,91 10 4,33 1,96 10 3.27 1,96 10
День 8 0 0 5 1,33 1,21 10 3,13 2,12 9 2,92 2,58 10 7,29 6,44 10 6,42 6,44 4
День 11 0 0 4 3,31 2,44 8 3,22 2.50 6 2,55 2,60 6 5,70 3,83 4 1,70 3,83 7
- 97 016342
Приложение Е. Состав клеток БАЛ: введение доз три раза в неделю.
Без блеомицина ЗФР тиЗС9 1Е6
4 мг/кг 20 мг/кг 40 мг/кг 20 мг/кг 40 мг/кг
Общий БАЛ Среднее 3,38 15,37 20,26 22,36 24,03 8,69 18,10
Стадд. отклонение 1,68 9,27 12,17 7,10 17,06 5,42 9,12
η(число животных) 12 10 15 16 7 6 5
Макрофаги Среднее 3,24 9,10 12,70 14,69 10,76 6,26 12,25
Станд. отклонение 1,56 4,43 6,93 5,10 6,16 3,54 3,35
η (число животных) 12 10 15 16 7 6 5
Лимфоциты Среднее 0,12 1,17 1,89 1,95 0,95 0,59 0,77
Ставд. отклонение 0,14 1,05 1,93 1,25 0,89 0,67 0,77
η (число животных) 12 10 15 16 7 6 5
Нейтрофилы Среднее 0,01 5,10 5,67 5,73 12,32 1,84 5,08
Станд. отклонение 0,02 6,74 7,00 4,72 11,64 2,51 6,35
η (число животных) 12 10 15 16 7 6 5
Пример 17. Молекулярный анализ действий моноклонального анти-ανβ6-интегрин-антитела в легком здоровой и имеющей заболевание мыши.
Резюме.
Модели животных для фиброза легких являются эффективными в моделировании некоторых аспектов фиброзной патологии идиопатического фиброза легких (РР); однако, ни одна модель животного не имитирует точно абсолютно точную патологию РР. Кроме того, поскольку механизмы появления и прогрессирования в РР являются не вполне понятными, важно тестировать потенциальные терапевтические агенты во множественных моделях заболеваний для оценки их эффективности не только в отношении уменьшения этой фиброзной патологии, но также и в отношении проникновения в молекулярные пути, которые считаются релевантными в заболевании человека. Путь Т6Р-[ считается ключевым путем в РР. Глобальный анализ транскриптов легкого человека с ΙΓΓ показал, что доминантным отличительным признаком в этом заболевании является признак активированного Т6Р-[-пути, что согласуется с известной ролью Т6Р-[ в запуске многих патологических процессов, которые характеризуют фиброз легких, в том числе активации и пролиферации фибробластов и экспрессии молекул внеклеточного матрикса. Кроме его профиброзных активностей, Т6Р-[ является важным противовоспалительным цитокином, и, следовательно, терапевтическое ингибирование Т6Р-[ в идеале должно блокировать фиброз без стимуляции избыточного воспаления. Интегрин «νβ6 непосредственно связывается с латентными комплексами Т6Р-[ и является необходимым для превращения Т6Р-[ в активное состояние. Однако поскольку «.//опосредованная активация Т6Р-[ является критической только в некоторых тканях, мыши, полностью дефектные в отношении функции «νβ6, обнаруживают патологию только в легком, в то время как Т6Р-[недостаточные мыши обнаруживают воспаление во множественных системах органов. Таким образом, очерченная здесь терапевтическая стратегия заключается в блокировании функции «νβ6 во избежание глобального ингибирования Т6Р-[-пути и для демонстрации, что эффективность в блокировании фиброзной патологии, ассоциированной с увеличенной передачей сигнала Т6Р-[, может быть достигнута при дозах, которые не индуцируют воспаления, ассоциированного с полной потерей Т6Р-[. Здесь авторы изобретения характеризуют молекулярные изменения на уровне мРНК и белка, ассоциированные с фиброзной и воспалительной патологией. Авторы демонстрируют, что высокие дозы моноклонального анти«.//-антитела ти369, исходного мышиного клинического кандидата В600011, производят изменения мРНК и белка в воспалительных маркерах в легком, которые согласуются с «.//-дефектными мышами. Кроме того, авторы демонстрируют, что низкие дозы ти369, которые являются эффективными в ослаблении фиброза, не производят эти воспалительные изменения в мышах.
- 98 016342
Введение.
Цитокин ТСЕ-β 1 является профиброзным цитокином, о котором известно, что он стимулирует фибробласты к продуцированию избытка внеклеточного матрикса (ЕСМ), приводя, в конечном счете, к рубцеванию и декомпенсации органов (КоЬейк 1986). Аденовирусная и трансгенная сверхэкспрессия различных цитокинов в легком показала, что Т0Е-31 является уникальным в его способности стимулировать фиброз в отсутствие значимого воспаления. Модели мышей с нокаутом генов в Т0Е-3-пути (Воишаиб 2044, Мипдег 1999) и многочисленные исследования с анти-Τ0Е-β-агентами продемонстрировали эффективность ингибирования ТСЕ-β в качестве средства ослабления фиброза (0еогде, I. 1999; Зйагта, К. 1996; Воптбаиб, Р. 2004; ΖΗ^, Н. 2000; Какида, Н. 2001; Ζ^уабеЬ, Γ.Ν. 2000; Ьартд, Ν.Ι. 2003). Интегрин «νβ6, состоящий из двух субъединиц: «ν- и β6-интегринов, является решающим регулятором активации Т0Е-31, в частности в легком. Он положительно регулируется на эпителиальных клетках во время повреждения, воспаления и фиброза и связывается с латентным комплексом Т0Е-31, превращая его в активную форму. [Ниапд 1998; Мипдег 1999; Викк 1992; Уокоакк 1996; Аппек 2002]. Блокирование связывания «νβ6 с латентным Т0Е-3 1 обеспечивает способ локализованного ингибирования активации Т0Еβ в участках положительно регулируемой экспрессии «νβ6, что позволяет избежать потенциальных рисков клинической безопасности глобального ингибирования Т0Е-3-пути во всех тканях.
В приведенных выше примерах авторы характеризовали эффективность мышиного моноклонального анти-«^6-антитела, ти309, в двух моделях фиброза легких: индуцированного блеомицином фиброза (пример 16), индуцированного облучением фиброза (пример 15). Кроме того, действия обработки ти309 в здоровых мышах подробно описаны в отчетах по токсикологии. В этом примере авторы характеризуют действия обработки ти309 в здоровых мышах и в моделях фиброза легких животных на уровнях мРНК и белка в легком.
Анализ профиля транскриптов ткани легких демонстрирует, что блокада «νβ6 ослабляет или изменяет гены-мишени Т0Е-3, которые ассоциированы с индуцированным блеомицином фиброзом легких. Эти данные предполагают, что «νβ6 участвует в регуляции фиброза легких и мог бы быть новой молекулярной мишенью для его терапевтической модуляции.
Материалы и способы.
1. Реагенты.
«^6-тАЬ получали, как описано здесь в другом месте и как описано ранее (29). кДНК химерных человек-мышь антител 2А1 и 309 получали из тотальных РНК соответствующих исходных гибридом с праймерами константной области СЭЬ-739 для тяжелой цепи и СЭЕ-738 для легкой цепи с использованием набора для синтеза первой цепи кДНК (Атегкйат/Рйагтааа, Р1кса1а^ау, N1). Гены вариабельных областей тяжелой и легкой цепей амплифицировали полимеразной цепной реакцией с использованием 3'праймеров, использованных для синтеза кДНК, и пулов вырожденных праймеров, специфических для сигнальных последовательностей большинства генов мышиных антител (последовательностей, доступных по запросу), и ДНК-полимеразы РТи (З!га!адепе, Ьа 1о11а, СА). Клонированные вариабельные области тяжелой и легкой цепей лигировали в экспрессирующие векторы млекопитающих с константными областями 1д01 человека. Слитый белок рекомбинантный растворимый рецептор типа II мышиного Т0Е-31д (кΤ0Е-βКII-Iд) получали, как описано ранее (10). Антитела ти309, 1Е6 и кΤ0Е-βКII-Iд категории, предназначенной для исследований (очищенный белок в забуференном фосфатом солевом растворе), использовали во всех экспериментах.
2. Животные.
(a) Обработка ти309 в здоровых мышах для анализа РНК. Здоровых мышей С57ВЬ/6 обрабатывали один раз в неделю в течение 4 недель (в дни 1, 8, 15 и 22) 5 мг/кг растворимого Τ0ЕβКII-Iд, ЗФР или следующими дозами ти309: 0,3, 1, 3, 10 и 30 мг/кг. Одну когорту обработанных мышей собирали в день 29 (одна неделя после введения последней дозы = без восстановления), тогда как другую когорту собирали в день 78 (8 недель после введения последней дозы = 7-недельное восстановление). Эти эксперименты выполняли независимо от исследования, описанного в отчетах по токсикологии ти309 для мышей, в которых испытывали штамм мышей СЭ-1 и использовали 8-недельное восстановление.
(b) Обработка ти309 в здоровых мышах для анализа множественных анализов белков БАЛ. Здоровых мышей С57ВЬ/6 обрабатывали один раз в неделю в течение 4 недель (в дни 1, 8, 15 и 22) ЗФР или следующими дозами ти309: 0,1, 0,3, 1, 3 и 10 мг/кг. Мышей собирали в день 29 (спустя одну неделю после введения последней дозы) для сбора бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ). Эти эксперименты опять выполняли независимо от исследования, описанного в отчетах по токсикологии ти309 для мышей, в которых испытывали штамм мышей СЭ-Е (c) Обработка ти309 в индуцированной облучением модели фиброза. Подробности групп обработки и конечных результатов, использованных в оценивании эффективности ослабления индуцированного облучением фиброза, содержатся в отчете ВИВ Керой #Ккс1-2006-007. Вкратце, проводили три исследования в лаборатории Ло11п Мипдег а! Νο\ν Уогк Зс1оо1 оТ МебШпе, в которых мыши получали торакальное облучение, и их обрабатывали разными дозами ти309 между 0,3 и 10 мг/кг в неделю, начиная с 15
- 99 016342 недель после облучения. Легкие мышей собирали для измерений гистологии/фиброза, если их находили мертвыми во время этого исследования. Выживших мышей собирали при неделях 26, 28 и 32 после облучения. Жидкость БАЛ собирали из одной доли легкого и отсылали в Вюдеп ШЕС, тогда как другие доли обрабатывали для измерения гистологии/фиброза. Анализ белков жидкости БАЛ включен в этот отчет для возможности сравнений с анализом жидкости БАЛ из здоровых мышей, обработанных ти309, в Вюдеп ЮЕС.
3. Сбор бронхоальвеолярного лаважа.
Мышей эвтанизировали чрезмерной дозой Шасбп (81дта) внутрибрюшинной инъекцией (ΙΡ). Трахею обнажали с использованием в большинстве случаев рассечения тупоконечным инструментом. Затем трахею раскрывали ножницами между двумя хрящевыми кольцами и в трахею вставляли тупоконечную иглу 23-го калибра. Эту иглу удерживали на месте легким фиксированием временным зажимом Шварца (КοЬοζ). БАЛ выполняли инъекцией 0,8 мл забуференного фосфатом солевого раствора без Са2+ или Мд2+ (ЗФР) в легкие. Затем жидкость оттягивали в шприц без применения большого давления и переносили в полипропиленовую пробирку ΡηΦοπ на 15 мл на льду. Затем эту процедуру повторяют, жидкость БАЛ отсасывают обратно в шприц без создания избыточного отрицательного давления. Пробы хранят на льду и обрабатывают для счета клеток лейкоцитарных формул и как осадок, так и жидкость БАЛ собирают и хранят при -80°С.
1. Затем БАЛ центрифугируют при 180хд (1000 об/мин) (Весктап 0ΡΕ) в течение 10 минут на настольной центрифуге при 4°С. Затем супернатант (жидкость БАЛ) удаляют и замораживают при -80°С. 1,0 мл буфера для лизиса КВС (эритроцитов) (81дта) добавляют к осадку и смешивают на вортексе в течение 20 с. Затем выполняют счет клеток и получают цитоспины.
2. Пробы хранят на льду и считают с использованием гемоцитометра, выдерживая клетки в течение 1 мин после внесения клеток в гемоцитометр и до считывания, что позволяет клеткам осесть.
3. 100 мкл суспензии клеток центрифугируют на цитоцентрифуге (Τйе^шο8йаηбοη) при 500 об/мин в течение 5 мин при комнатной температуре. Препараты цитоспинов готовят помещением раствора клеток в прибор для получения цитоспинов и центрифугируют при 500 об/мин в течение 5 мин. Концентрации клеток проверяют, чтобы быть уверенными в том, что эти концентрации не являются слишком высокими на предметном стекле. Предметным стеклам дают высыхать в течение ночи и затем их окрашивают с использованием ОШЦшк (Икйег). Окрашивание выполняют в соответствии с протоколом изготовителя (ΌίίΤΡιιίΙ;). После высыхания предметных стекол и покрытия пермаунтом (Икйег) клетки разделяют на категории по их типу, считая 100 случайным образом отобранных клеток при помощи лабораторного счетчика клеток (Икйег).
4. Сбор легких для РНК. Мышей эвтанизировали чрезмерной дозой Шасбп (81дта) внутрибрюшинной инъекцией (ΙΡ). Животное опрыскивают 70% ЕЮН, с использованием пары стерильных ножниц срезают кожу в направлении от грудины к голове. Как только кожа была срезана, грудину и ребра отрезают для обнажения сердца и легких. Легкие удаляют и помещают в стерильный кусок марли для удаления каких-либо продуктов крови и быстро помещают в полипропиленовую круглодонную пробирку на 14 мл 17х10 мм (Нкйег). Жидкий азот добавляют в эту полипропиленовую пробирку, содержащую легкие, и помещают на сухой лед. Затем легкие хранят при -80°С.
5. Получение РНК. Тотальную РНК очищали из быстро замороженных проб тканей легких с использованием реагента Οίηζο1 (01адеп) в соответствии с протоколом изготовителя. Качество РНК проверяли капиллярным электрофорезом на Биоанализаторе 2000 (Адйеп!).
6. Мечение зондов, гибридизация и сканирование на состав транскриптов. Мечение пробы, гибри- дизацию и окрашивание проводили в соответствии с протоколом Приготовления эукариотической мишени в АТу-теШх Тес11шса1 Мапиа1 (701021 геу 1) для 0епесЫр® Ехргеккюп Апа1у818 (АЛ^те^х, 8ап!а С1ага, СА). Вкратце, 5 мкг очищенной тотальной РНК использовали в реакции первой цепи 20 мкл с 200 Е 8ирегксг1р! ΙΙ (са! # 18064-022, Iην^ΐ^οдеη) и 0,5 мкг (бТ)-Т7 праймера [5'ООССΛОΤОΛΛΤΤОΤΛΛΤΛСОΛСΤСΛСΤΛΤΛОООΛООСОО(Τ)24] при 42°С в течение 1 ч. Синтез второй цепи проводили добавлением 40 Е ДНК-полимеразы Е.той (са! # 18010-025, Iην^!^οдеη), 2 Е РНКазы Н Е.отй (са! # 18021-071, Iην^ΐ^οдеη) и 10 Е ДНК-лигазы Е.той (са!. # 18052-019, Iην^!^οдеη) с последующим инкубированием при 16°С в течение 2 ч. Реакционную смесь синтеза второй цепи очищали с использованием Модуля 0епесЫр® 8атр1е С1еапир Мοби1е в соответствии с протоколом изготовителя (са!. # 900371, АТТушейх, 8ап!а С1ага, СА). Очищенную кДНК амплифицировали с использованием набора для мечения ВюАггау Ыдй у1е1б КNΛ 1гапкспр1юп (са!. # 42655-40, Εηζο ЬТе 8с1епсек, Шс., Ρа^т^ηдба1е, ΝΥ) в соответствии с протоколом изготовителя с получением 70-120 мкг меченной биотином кРНК (комплементарной РНК). Матрицы (массивы) зондов 0епесЫр® с Мдυ74Λν2, МдШ4Ву2 и МдШ 4Су2 предварительно гибридизовали в 0епесЫр® ΗуЬ^^б^ζа!^οη Ονеη 640 (АЛ^те^х, 8ап!а С1ага, СА) в соответствии с протоколом изготовителя. Фрагментированные меченые кРНК ресуспендировали в 300 мкл ΙΧ гибридизационного буфера, содержащего 100 мМ 2-морфолиноэтансульфоновую кислоту, 1М [№+], 20 мМ ЭДТА, 0,01% Твин 20, 0,5 мг/мл ацетилированного БСА, 0,1 мг/мл ДНК спермы сельди, контрольный олиго В2 и контрольные транскрипты ВюВ 1,5 пМ, ЬюС 5 пМ и ЬюЭ 25 пМ и сге 100 пМ, и
- 100 016342 гибридизовали с матрицами (массивами) зондов 0епесЫр® в соответствии с протоколом изготовителя (ЛГГутеТ^^x. 8апТа С1ага, СА). Матрицы гибридизованных зондов 0епесЫр® промывали и окрашивали с использованием стрептавидина-фикоэритрина (саТ # 8866, Мо1еси1аг РгоЬез, Еидепе, ОК) и амплифицировали с битинилированным антистрептавидином (ВА-0500, УесТог ЬаЬогаТогкз, Вигкпдаше, СА) с использованием 0епеСЫр® Е1шбк 8ТаТюп 400 (ЛГГутеТ^^x. 8апТа С1ага, СА). Матрицы зондов 0епеСЫр® сканировали с использованием сканера 0епеАггау (НеМеТТ Раскагб, Сог^'аНз, ОК).
7. Анализ результатов определения профиля транскриптов. Сканы массивов превращали в СЕЬфайлы ЛГГутеТ^^x и полученный набор данных (группу СЕЬ-файлов, представляющую полный эксперимент) нормализовали с использованием способа КоЬизТ Мкгоаггау А¥егаде (КМА). Статистический анализ и анализ разбиения на кластеры выполняли с использованием ВКВ Аггау Ио1з ν. 3.4.0 - ВеТа 2 (ΝΟ), 0епе8ргшд (АдкепТ) и 8роТйге (8роТйге) баТа Ш1шпд Тоо1з. Анализ значимости микроматриц (8АМ) использовали для идентификации наборов зондов, интенсивности сигналов которых изменяется любой из экспериментальных обработок в сравнении с ЗФР-обработанной группой с порогом Еа1зе П1зсо¥егу КаТе (ЕОК), установленным таким образом, что он не превышает 0,01 при доверительном пределе (СЬ) 0,95. Дополнительную фильтрацию выполняли, при необходимости, отбором наборов зондов, испытывающих значимое воздействие (Е0К<0,01, СЬ 0,95), обнаруживающих по меньшей мере 2-кратное изменение интенсивности сигнала. Профили полученной группы генов и группировку экспериментальных условий анализировали и визуализировали иерархическим разбиением на кластеры. Виртуальный анализ пути выполняли с использованием базы данных Шдепийу РаТНтау Апа1уз1з (Шдепийу 8узТетз).
8. Мультиплексный анализ уровней белков жидкости БАЛ. Аликвоты 200 мкл брали непосредственно из жидкости БАЛ, собранной, как описано выше. Эти аликвоты отсылали в Ки1ез Вазеб Мебкше, Шс. (Аизкп, ΤΧ), где их анализировали на стандартную панель белков мыши с использованием технологии на основе Ьишшех.
9. Статистический анализ. Статистический анализ для анализа профиля транскриптов описан выше. Статистические сравнения в анализе уровней белков в жидкости БАЛ выполняли между контролемносителем и/или контролем на изотип и различными дозами тест-изделия с использованием дисперсионного анализа (АNОУА). При установлении статистически значимых различий при вероятности р<0,05 с использованием АNОУА, значимые различия между группами оценивали с использованием критерия множественных сравнений Дуннета.
Результаты.
2. Действия обработки здоровых мышей ти309: анализ транскриптов легких. Результаты исследований токсикологии в мышах СО-1 идентифицировали легкое как орган-мишень токсичности для ти309. Как подробно описано в этих исследованиях, воспаление легких, согласующееся с открытиями в интегрин β6-нуль-мышах (которые являются дефектными в отношении интегрина ανβ6), наблюдали в мышах, обработанных ти309. Это воспаление, оцениваемое по гистопатологии, наблюдается нечасто при дозах 1 мг/кг, но постоянно при дозах 10 мг/кг в неделю. Для оценки этого воспаления в штамме С57ВЙ/6 (штамме, использованном в исследованиях эффективности, описанных выше в примерах 15 и 16) мышей обрабатывали ти309 в дозах 0,3-30 мг/кг в неделю и легкие обрабатывали для анализа РНК и анализа с использованием микроматриц.
Анализ значимости микроматриц (8АМ) с порогом ЕОК 0,01 и СЬ 0,95 использовали для поиска на дифференциально экспрессируемые гены в серии парных сравнений между ЗФР-обработанной контрольной группой и каждой из групп экспериментальной обработки, в том числе групп, обработанных 309 и зΤΟЕβКII-Ес. Такие парные 8АМ-анализы выполняли по отдельности для групп обработки и восстановления с использованием их соответствующих ЗФР-контролей. Полученные перечни генов подвергали дополнительной стадии фильтрации для идентификации тех значимо подвергавшихся воздействию наборов зондов, интенсивности сигналов которых варьировались между ЗФР-контролем и любой из групп обработки более чем в 2 раза. Эти результаты суммированы в табл. 17-1 - 17-6. Значимые изменения в экспрессии генов, удовлетворяющие выше выбранным критериям, наблюдали в подгруппах 10 мг/кг и 30 мг/кг этой группы обработок (табл. 17-1 и 17-2). Профили экспрессии генов для выбранных наборов зондов показали сильные двунаправленные смещения в уровнях экспрессии соответствующих генов в группах обработки 10 мг/кг и 30 мг/кг 309 (фиг. 66).
Не было статистически значимых изменений в экспрессии генов в любой другой подгруппе обработки или в группе восстановления (табл. 17-1 и 17-2). Однако ММР12 и 25 других генов, отобранных на большую, чем 0,95 корреляцию Пирсона их профилей экспрессии с профилем экспрессии ММР12, показали детектируемую направленную вверх тенденцию в группе 3 мг/кг 309 (фиг. 67; табл. 17-7).
Функциональную аннотацию генов, на которые значимо влияет 309, выполняли с использованием базы данных Шдепийу РаТНтау Апа1уз1з (ГРА), и была показана сильная ассоциация этих генов с иммунной реакцией и передачей сигнала иммунорегуляторного цитокина (фиг. 68). Подобным образом, виртуальный анализ регуляторного пути предполагал ассоциацию 309-индуцированных изменений в экспрессии гена с изменениями в передаче сигнала хемокина, ΤΟЕ-β, и интерферона. Эти ассоциации следуют из конфигураций этих двух сетей наивысших оценок (фиг. 69А, 69В).
- 101 016342
2. Количественный ПЦР-анализ транскриптов ММР-12. ММР-12 обнаруживает наивысшую кратную положительную регуляцию в легких из ти3С9-обработанных мышей (табл. 17-3). ММР-12 сообщался ранее как наиболее высоко положительно регулируемый транскрипт в легких из β6-нуль-мышей. Для дополнительного выяснения взаимосвязи между экспрессией ММР-12 и обработкой ти3С9 авторы анализировали относительные уровни транскрипта ММР-12 количественной ПЦР с использованием РНК, полученной из легких β6-нуль-мышей. Обработка ти3С9 производила зависимое от дозы увеличение транскрипта ММР-12, которое было значимым при 10 и 30 мг/кг. Это кратное изменение в экспрессии ММР-12 было сравнимо при этих дозах с изменением в β,-,-нуль-мышах. Подобно вышеописанным результатам для анализа микроматриц, уровни ММР-12 согласно кПЦР, имели тенденцию повышения при дозе 3 мг/кг, но были неизмененными при дозах 0,3 и 1 мг/кг.
3. Анализ белков БАЛ из легких здоровых мышей, обработанных ти3С9. Для дополнительной характеристики молекулярных изменений в легком, которые могут быть приписаны обработке ти3С9, авторы изобретения анализировали уровни 60 белков (табл. 17-8) в жидкости БАЛ из другой когорты мышей, обработанных в течение 4 недель дозами ти3С9 между 0,1 и 10 мг/кг. Анализ белков проводили с использованием 1ит1пех-анализа (мультиплексного анализа белков) в Ки1ек Вакеб Мебюте, Шс. (Аик!ш, ТХ). В соответствии с открытиями на уровне транскриптов, множественные белки, ассоциированные с воспалением легких, были повышенными в жидкости БАЛ мышей, обработанных дозой 10 мг/кг (табл. 17-9). Кроме того, некоторые из этих изменений были значимыми согласно АКОУА также при дозе 3 мг/кг; однако никакие белки на этой панели не имели повышенного содержания при дозе 1 мг/кг.
4. Анализ белков жидкости БАЛ из индуцированной облучением модели фиброза. Эффективность ти3С9 в уменьшении индуцированного облучением фиброза легких описана выше в примере 15. Пробы жидкости БАЛ (ВАЬЕ), собранные в этих исследованиях, анализировали мультианалитным белковым анализом с использованием той же самой панели мыши, которую использовали в ВАЬЕ из здоровых мышей, обработанных ти3С9. Анализ жидкости БАЛ (ВАЬЕ) временных точек недели 28 (13 недель обработки) и недели 32 (17 недель обработки) представлен здесь. Белки, которые были значимо изменены согласно дисперсионному анализу (АКОУА), суммированы в табл. 17-11. Как и в случае анализа транскриптов и белков в здоровых мышах, большинство белков, которые изменяются в модели индуцированного облучением фиброза, достигают значимости только при дозе 10 мг/кг, хотя некоторые из них являются значимыми и все обнаруживают эти тенденции при 3 мг/кг. Большинство из этих белков являются цитокинами или хемокинами, о которых известно, что они ассоциированы с фиброзом легких. Четырнадцать из этих 20 белков, положительно регулируемых в 2 раза или более в здоровых мышах, обработанных 10 мг/кг ти3С9 (табл. 17-10), также постоянно положительно регулируются в этой индуцированной облучением модели. Несмотря на различия в периоде обработки ти3С9 и в состоянии повреждения/воспаления, соответствие между полученными результатами в здоровых и облученных мышах является поразительным. Многие из белков обнаруживают умеренно в более высокое число раз повышенную регуляцию, согласующуюся с более продолжительным периодом обработки в модели с облучением (табл. 17-12), но в целом эти полученные результаты согласуются в этих двух очень разных постановках эксперимента. Кроме того, несмотря на разные уровни фона в здоровых и облученных мышах (повреждение от облучения положительно регулирует большинство из этих белков), диапазон доз, на протяжении которого эти маркеры воспаления положительно регулируются, является одинаковым в здоровых и облученных мышах. Конкретно, они положительно регулируются при дозах 3 и 10 мг/кг, но не при 1 мг/кг как в здоровых, так и в заболевших мышах (что иллюстрируется четырьмя наиболее высокоположительно регулируемыми белками при неделе 28 на фиг. 70). Таким образом, несмотря на гораздо более высокую экспрессию мишени лекарственного средства в модели облучения (см. пример 15 выше), дозы, которые производят изменения белков БАЛ, специфические для обработки ти3С9, являются одинаковыми в обеих постановках эксперимента. Важно отметить, как полагают авторы, что не все из этих белков, индуцированных ти3С9, имеют провоспалительные и/или пролиферативные действия. Например, хемокин СХСЬ ГР-10/СХСЫ0 обнаружил сильную антифиброзную эффективность в мышиных моделях, и мыши, дефектные в отношении ГР-10 или его рецептора СХСК3, обнаруживают очень повышенную фиброзную реакцию на блеомицин. Однако соответствующие изменения не наблюдаются в этом или других цитокинах при почти максимальной эффективной дозе 1 мг/кг, следовательно, мало вероятно, что любое из этих изменений в среде цитокинов легкого является необходимым для эффективности лечения ти3С9.
Среди белков, которые положительно регулировались в здоровых мышах, но не в модели облучения, были АроА1, фибриноген и ТIΜР-1. Уровни этих белков и четвертого белка, гаптоглобина, увеличивались в жидкости БАЛ облученных мышей в сравнении с нормальными мышами, но уменьшались обработкой ти3С9 (фиг. 71). Таким образом, нормализация уровней этих белков при эффективных дозах предполагает, что они могут действовать в качестве суррогатных маркеров эффективности при временной точке 28 недель (фиг. 72). Единственными белками на этой панели, которые значимо изменялись при более низких дозах, были белки, которые уменьшались обработкой: Т[МР-1 и гаптоглобин. Т[МР-1 является известной мишенью ТСЕ-β и часто является повышенным в фиброзном заболевании. Его отрица
- 102 016342 тельная (понижающая) модуляция согласуется с механизмом действия ти309, т.е. ингибированием а^опосредованной активации Т0Р-[.
Таблица 17-1
Анализ изменений транскриптов легких в ответ на увеличение доз ти309 ш νίΐΌ. Количество наборов зондов, на которые значимо (РОВ< 0,01, СЬ 0,95) влияли экспериментальные обработки.________
309, мг/кг
гзТОГЪК Гс 0,3 1 3 10 30
Обработка 0 0 0 0 226 91
Восстановление 0 0 0 0 0 0
Таблица 17-2 Анализ транскриптов легких с большим, чем 2-кратное, изменением. Количество наборов зондов, обнаруживающих значимые изменения, большие, чем двухкратные, в интенсивности сигнала в ответ на экспериментальные обработки.
309, мг/кг
гяТОГЬК Рс 0,3 1 3 10 30
1 Обработка 0 0 0 0 69 43
| Восстановление 0 0 0 0 0 0
Таблица 17-3
Перечень транскриптов
8 X □ “о Й 1 ζ !£в : о в Ф>Х δ?* II 6^8 5Ф« о£2 и ас 5 © £ II Набор мадов Символ гена
1 1826 8 37.7 48.45 6 1449153 Э( Μϋπρ12
5 2 1750 3 158.3 11.05 7 1460826 а а« ЗааЗ
1 7 1500 277.5 5.405 1438211 в а1 ОЬр
4 5169 980.2 5.273 1427747 а а( 1 сп2
3 е 736.9 145-9 5.051 1425890 а1 ί.ν6ί
2 379.4 75.7 5.012 1425951 а а( С1ес4п
6 706.3 150.6 4.69 1419725 а! 31с26а4
2 3 1В1.6 38.8 4.68 1419209 а! Схс11
9 911.9 200.8 4.541 1418174 а! ОЬр
1 9 234.^ 52.9 4.435 1420380 а1 Сс12
3 603.5 183.4 4.361 1446898 а( Сс19 '
7 727.7 175.6 4.144 1446303 э1 1 ЗрптЬ
1 1 5 2018, 4 538.6 3.747 1449025 Я1 6(3
а 5 126.4 34.5 3.664 1419282 а1 Сс!12
в 2667. 2 736.8 3.62 1417936 а( Сй9
1 3 86.5 26.9 3.216 1419561 а! Сс!3
7 3 586-9 186.8 3.142 1450291 ® а( Мз4а4с
7 0 88.6 28.9 3.066 1419598 а» ЛзДабб
9 2 105.8 34.9 3.032 1421228 а1 Сс17
1 3 193.4 63.9 3.027 1436313 а1 С 6200(4
4 1999. 8 669 2.989 1420394 5 а( Ср4еа///им>4
8 1653 7 566.8 2.907 1420249 8 Щ Мб
2 996.2 347.3 2.86В 1419627 з С)ес4п
2 В 342.5 123.2 2.78 1424727 а1 Ссг5
6 1Ир;/АУ1Уи'.псЫ.п1ип.П1Н.ко\'сп1гсг/аиегу.С(.'
0 942.2 355.0 2.6511436530 а! г1?ст0=5еагс11&.(1Ь*щепе&(епт1=
- 103 016342
7 9 72.5 27.4 2.646 1449984 а) Схс12
5 0 139.3 52.5 ¢2.633 1442082 а( Ю3аг1
4 2 444.6 170.7 2.605 1449227 а( 0(1255
1 2 6 285.5 109.5 2.598 1419599 8 а! Мэ4а11
1 0 1185 1 454.1 2.554 1450662 а1 Сйк
4 7 841.8 343.7 2.449 1418486 а1 Ινηηΐ
1 1 ί 4 1 : 289.4 118.4 2.436 1420464 8 а1 1 1 Рйа1 Ш Р|<-а2 И! Р;гаЗ Ш Риа4 ТО Рггаб ТО 1_|1гЬЗ
ТО 1.00546027
3 $ 663.4 276.7 2.406 1426464 а( ΝΓ161
1 £ 5 1 555.3 236 2.353 1451941 а а! Рсаг2Ь
191.9 82.4 2.329 1427221 31 МС1:2143217
8 6 384 168.9 2.274 1437939 8 аГ С18С
1 1 2 305.2 134.7 2.266 1450403 а1 31а12
1 5 4853. 1 2214. 3 2.192 1417266 а1 Сйб
3 2 256.1 122.7 2.169 1425151 а а! Кохо!
2 0 904 417 2.168 1449164 а! 0668
1 г 3 232 107.6 2.156 1419482 а1 СЗаг'
2 5 425.2 200.1 2,125 1458176 а1 РегЗ
9 6 35 8 17.1 2.094 1420768 а а1 □111ло2е
2 1 184.8 88.8 2.061 1427313 а1 ΡΙαίΓ
3 4 83.2 40.6 2.049 1416959 а! ΝΓ102
4 6 430.5 210.9 2.041 1422978 а! СуЬо
е 9 25.3 12.4 2.04 1417256 а( Мггю13
3 9 95.1 47.3 2.011 1419754 а! Мур5а
5 7 219.4 109.6 2.002 1419483 31 С3аг1
- 104 016342
2 2 133 2 59.1 2 1418809 а! Р1га1
2 6 269.6 137.4 1.962 1450184 ί а1 |Те7
1 2 4 313 159.7 1.96 1421578 а! Г |ссИ
1 0 6 243.8 125,8 1.938 1446834 а! |С1зс
1 г 5 1335 В 707 1 1.891 1426774 а1 1Рагр12
1 199.1 106 7 1.866 1441445 Э1 |регЗ
1 1 130.6 70.3 1.861 1422191 а! (0620014
3 0 366.9 198 3 1.85 1418797 а( Ί ' Ьй$4а&а ί
2 7 207.1| 112 5Ϊ1.84111442243 31 РегЗ '
3 6 1654.! 9: 898 9 -------------------1-- 1.84111416950 а! |Мг162 '
1 0 4 6572. 7 3665. а 1.793 1451537 а! ί 1 (сюзп
1 0 3 3162 —I 177.9 1.777 1420998 а! 1 |Ε1ν5
7 7 86.2 48,6 1774 1418248 а! |с1а
8 а 118 66.7 1.769 1421977 а1 ί |Мтр19
1 2 0 384.5 217.6 1.767 1450241 а 31 £хйа
$ в 1162. 4 063.8 1 751 1448276 а1 |Тзрап4
3 7 393,3 225.3 1.746 1422875 а( 10084
в 9 265.8 152.7 1.741 1444176 81 ΙΑ1ρ6νΜ2
8 3 1063. 7 611 1.741 1418025 81 1в№Ь2
2 9 164.1 94.7 1.733 1416986 а а! Р1ОП51
7 Ιι1ιθ:·ν^3ΐ·«'.η^ΐ.ηΙπι.ηίΙι.ΗονίβηΐΓ8Ζ/αοεΓν.(ο
6 304 178.3 1 705 1437729 Э1 к1?сп10=5еагс11&йЬ=йС(1С&1егт=
1 0 а 1652. 4 971.4 1.701 1448883 31 |кртя
а 1 38.3 22.7 1.687 1419729 81 Тех11
1 2 1 35.1 20.9 1.679 1447564 х а1 [9230101 НОЗРОк
9 7 371.6 222.8 1.669 1435263 а! 10610000110Н|к
- 105 016342
3 3 103.8 62.411.663 1460662 а1 РегЗ
1 1 0 138.5 83 6,1.657 1419676 а( Г“ 1мх2
4 3 236.3 143.4 1.648 145236 7 31 кйогоЭа
6 4 4218 б 2564 1 1.645 1448732 а! [с«1>
2 4 392.8 238.9 1.644 1417492 а! ρΐ8ί>
6 ΙιΐωιΛννινιν.ηοΒί.πΙηι.ηίΗ.Ηον/βηίΓεζ/αυβτν.ίο
7 54.1 33.3 1.625 1420250 а! ϋ ί ?с πιά =зеагсН&<1Ь=еепе& 1егш=
4 а 126.7 78.1 1.622 1433864 а1 1 и>12
7 9 275.8 170.1 1.621 1425407 8 31 С1ес4а21/1 С1ес4Ь
6 ΐ 395.4 244.1 1.62 1424356 а а! Меггл!
9 3 1066 657.Э 1 62 1435477 8 а! Рсог20
9 0 59.1 36.8 1.606 1425863 а 31 РЮго
1 1 а 1111р:.'ля1м'.11сЬ>.п1т.п1Ь.('О\7еп1гег/аиегу.Гс
542.2 336(1.60411419975 а! з ϊ ?ст с1=5еагс Ь цепе& ίεπτι -
7 5 387.1 241.8 —]----- 1.60111441855 х а) Схс11
а 0 280.7 175.6 1 599Ϊ1427429 а1 С512
6 1 434.2 272.2 1.595 1425444 а а1 ТчГЬг2
3 7 2066. 2 1298. 3 1.591 1424175 31 Те(
5 9 5030, 6 3168. 8 1.588 1448591 а! С188
1 4 3 197.5 125' 1.58 1430332 а з1 СивЬ
7 2 425.2 269.4 1.578' 1423308 а! Тоо)п1
7 а 135.9, 86.2 1.577 1450454 а( ТогЗа
4 0 3920. 1 2466. 7 1.576 1421813 а 81 Рвар
5 4 960.5 609.8 1.575 1450355 а а1 Своя
3 9 153.2 98.1 1.562 1421792 а Э1 Тгет2
4 5 413.1 267.1 1.547 1455332 х а! Рсог20
6 3 327.1 212 1.543 1419883 5 а! АЙбУ1Ь2
6 5 2946. 6 1910. 8 1,542 1417868 а а( СЙ2
8 2 10В 70.3 1.536 1436482 а а! 8йсЗ
5 441 1 287.5 1.534 1448534 а1 Р1опз1
- 106 016342
8 р
3 4 168.9 110.2 1.533 1422341 3 а! ЬусИаЗ
9 5 71.2 46.8 1.521 1436397 а1 ВС027057
7 1 79.2 52.2 1.517 1425227 а а! ΑίρθνΟΒΐ
8 1 542.4 226.2 1.514 1448749 а1 Р!ек
ί 0 9 213.6 141.4 1.512 1424083 31 Кос11
5 1951 7 1295. 4 1 507 1417870 х а1 С15Х
1 0 5 159ΐ 106.2 1 497 1431382 а а! Й5Л12
1 9 1 ! 672.6; 586 6 1.488 1435476 а а! 1 Рсаг2Ь |
5 5 65.3 43.9 1.467 1421В51 а! Ϊ М1ао1Ь
7 4 990.6 675.5 1.466 1450027 а! ЗОсЗ
9 β 62.5 42,7 1.464 1421789 5 а! АЙЗ
4 4 12,1 1.463 1439703 а! Сс1200г1
1 1 1 — 131.1 — 89.6 1.463 1425461 а( Γ6χνν11
5 6 148 2 101.4 1,462 1456043 Э1 Узр22
9 9 407.7 282.2 1.445 1417088 а! Ζ10346
1 9 2 268.4 185.7 1.445 1425834 а а1 Срат
1 0 0 117.8 81.6 1.444 1460650 а( А1рбу0а1
1 1 4 105.7 73.4 1.44 1422966 а а1 Т1гс
1 1 6 197.5 139,4 1,417 1421167 а! А1р11а
5 ί 80.3 57,3 1,401 1429562 а! 5031415С07Н1К
1 2 2 587.5 429.3 1.369 1437317 а! υοβίι
1 0 1 5469. 4 4011. 4 1 363 1415687 а а! Рзар
1 0 7 253.8 193.1 1.314 1456620 81 МОС79224
- 107 016342
1 1 7 49.5 38 1.313 АЕРХТгапзРесМиг/Х Пгс
57349 3 а1
1 9 1 ί 1557 4 1944 4 0.801 1424398 з а! иь<лп1
1 В 6 489.3 626.4 0 781 1440817 ?< а’ С63О024СО7К1к
1 9 4 385.9 496.6 0.777 1420493 а а) ΡΟΥ12
2 1 2 600 7 776.1 0.774 1452921 Э1 РсЬ02
1 9 5 135.3 176.2 0.768 1443380 а! гыьзэ
2 О 5 630.8 821.7 0.768 1419640 8Ϊ РигЬ
2 1 4 128 9 163.5 0 765 1443104 а! 4933431 И12Р|к
1 6 7 1368 1602; 4 0,759 1455289 а( Β1Μ1 I
2 1 7 263.2 348.3 0.756 1419359 а! Нех>т1
1 8 4 609 1075. 7 0.752 1448685 а! 2900010М23Як
2 0 0 321.8 428.3 0.751 1435874 а) РгкаЬ2
2 2 4 84 112.5 0.747 1458404 э1 Ц0и(Ь8
1 9 8 2304. 4 3103. 5 0.743 1416183 а 31 и<й>2
1 9 9 кио-.//ч'и'\х.псЬ1.п1т.п111.ЕОУ/еп1ге4/оиег¥.Гс
164 9 222.8 0.74 1451634 а» и! ?стй=зеагсй&с1Ь=1’епе&1епр=
2 г о 420 3 669.4 0.738 1420631 а а( В!сар
г 0 7 283.8 386.1 0.735 1433968 а! ВС024659
2 1 5 360 489.8 0.735 1451381 а( 1810020017ЙИ
1 7 7 126.6 173.3 0.731 1438422 а! ί-ΓπώΟ
1 5 811.3 1113.1 а 0.729 1452020 а а! МС1:1353506
- 108 016342
1 7 0 58.4 77.8 0.725 1432431 5 а! 11100331-15Ик
1 9 9 1524 2111. 1 0.722 1448237 χ а! ЮЬ2
2 2 6 899.3 1250. 5 0.719 1426690 а а! 8геЬ(1
1 4 8 285.6 397.6 0.718 1452411 а! 1 ггс1
2 0 4 545.9 761.5 0.717 1424455 а( Оргазр1
V β 2 152.2 213.4 0.713 1430375 а а( Сс127
1 7 4 Ιιΐΐο . псЫ. ηί ιη. ηϊΗ .£о ν/ епйгег'аиег ν. Гс
255.6 360.2 0.71 1456399 а! £Л?сгпс5 =5еагск&£1Ь=Ейпе&1епт^
2 1 6 кар:/7да\у\у.псЬкп1т.т11.йОУ/ел1гег/оиегу.(<;
647 4 911.6 0.71 1424746 а1 ш?стб =зеагс!1 &0Ъ= аепе&Юпт=
1 8 8 421.9 594.7 0.709 1429115 а1 2010003002Р.1к
1 8 9 522.2 741.7 0.704 1447585 5 а( Мграб 1
1 8 7 ЫЮ://'л'Улс.псЬ1.п1т.п1Ь.еоо/еп1ге7./С|иегх.Гс
129.8 185.3 0.7 1438916 х а1 εϊ ?стб =8еагсЬ&бЬ=а епе&1епп=
1 9 7 177.1 253.9 0.598 1441880 х а1 М6С30332
2 0 1 251.6 360.5 0.698 1435339 а! КсМ15
2 0 9 729 106 0.688 1447739 х а! К№0с4
ί 5 3 1Нр://м'И'1¥.псЫ.п11п.п1Ь.еоь7еп1гег.'оиегу.Гс
116.8 170.5 0.685 1456904 а1 £1?ст4=зеагс11&бЬ=еепе&1епп=
2 0 2 44.4 65 0.663 1454877 а! 5ейа<14
1 6 3 116.4 170.9 0.681 1438915 а! 6720401613№
1 5 4 99.5 146.4 0.68 1455293 ίβθ1
2 1 1 223 327.6 0.68 1418469 а1 Νπρί
- 109 016342
1 э 8 232.Й 344.ί 0.67С 1429197 3 а1 КзЬаао11
1 4 0 29&.Й 439 0.674 1424970 а! Рига
1 5 8 180.7 268.3 0.673 1440971 χ а! 6630024С07йк
1 β 3 725.2 1077 0 673 1424313 а @1 Νΰυίε7
1 8 0 206.6 307.6 0.672 1417220 # ЕаР
1 7 ί 399.2 602.2 0.663 1456603 а1 1500005К14Я1к
1 5 9 79.3 120 0.661 1452295 а! Ттеоэ!
1 5 2 200.7 317.7 0.657 1422561 а( А6ат1з5
1 4 9 295.2 449.9 0.656 1418172 Э1 НеЬр1
1 6 2 56.9 90.3 0.652 1457021 х а! Ат1»г2
1 9 3 36+6 56.7 0.646 1433855 а! Айа1
2 0 0 62.7 97.3 0.644 1438515 а1 Ζ(ο2Ο7
1 5 6 151 235.2 0.642 1427410 31 СМеи?
2 1 8 226.1 357.8 0.632 1417430 31 С0г2
1 6 5 470.0 748.4 0.629 1430612 а1 1810033В17гак
1 6 6 40.5 64.4 0.629 1435939 & а1 9,1987662
1 е ί 63.5 133 0.628 1456980 а1 9830134С10Я1к
1 $ 0 107.3 171.2 0.627 1417355 εΐ РеяЗ
ΐ 8 8 196.1 316.3 0.62 1428749 а1 Этх12
2 2 3 54.6 88 0.62 1440227 Ώ1 ВР642829
- 110 016342
1] 4 2 14С 226.4 0.618 1439777 31 В230218003
1 В Η 78.9 127.6 0.618 1457740 31 АгаВ
2 1 0 147.4 230.4 0.616 1418534 31
2 1 ΐ 126.1 205 0.615 1456722 31 СЬг<111
1 Β 9 54.8 89.3 0.614 1424945 31 СЕпхЯ1
1 7 2 304.3 504.4 0.603 1448269 3 31 ΚΙΝ13
1 7 5 450.9 747.6 0.603 1429214 3ί А6атЫ2
1 3 5 542.3 900.3 0.602 1434245 а а( СтЬавсЗ
1 5 ί 249.7 428.4 0.583 1435484 31 ВР642829
1 7 9 470,3 808.4 0.582 1416687 31 Р1ос12
2 0 3 204.1 357.8 0.57 1422953 а! -рг-гз2
2 2 5 42.0 76.0 0.557 1445032 а1 Оарк1
1 4 7 118.3 213.1 0.555 1436528 а) Кага161
1 7 β 110.0 201 0.551 1422155 31 Н1312ИЗс2
2 0 8 95.4 173.3 0.55 1438069 а а( ЧЬлп5
1 6 4 636.8 1161. 2 0.548 1420855 а1 Ξίπ
1 4 3 374 689 0.543 1429764 31 1500005К14Р|к
1 6 0 39.2 72.3 0.542 1441353 а1 11(р://даичу.псЬ1.п1п1.пй1.йО\7еп1ге2/аиег¥.Гс
21?ст0=5саге|1&4Ъ=еспе&1етп=
1 9 2 127.1 250.1 0.508 1455299 а1 1700110ΝΐΒΚίΚ
1 3 « 210.1 415 0.506 1422705 а1 Ттеоэ!
- 111 016342
т 7 8 91.2 180.4 0.506 1418932 Э1 Ν(ιΙ3
1 3 7 162.6 362.8 0.503 1433924 а! РедЗ
1 4 ΙΚΐϋΐ/'^νΛ'.ηοίϊί.ιιΙίπ.ηίΙι коусп1гс?'аиету.1с
1 129.5 264.2 0.49 1446471 а( κι ?сгпб=5еагсЬ&<! Ь=кепе&легт=
г 2 г 133.7 273.6 0.489 1459984 Щ МгаЗ
1 в 5 163.5 336.4 0.486 1419692 а а! Е(с4з
2 1 9 1664 9 3504. 9 0.481 1449846 а! Еаг2
1 7 3 270.4 501.1 0.465 1417388 41 8ех2
1 4 5 93.1 203.4 0 453 1438862 а( А630005104Р5к
1 3 9 63.3 139.3 0.454 1450808 а! Ррг1
2 2 1 56.4 125.9 0 448 1449498 а! Матео
1 5 7 192.6 440.6 0.437 1423566 8 81 НЗр!10
1 3 4 л На:Н ν,-ν, -л-. пс1л. ηί ιη. п Ж. до ν'епίτοζ/α иегз. Ге
152.9 363.5 0.421 1460061 а( й1?С1нб=5еагс11&бЬ=депе&1егт=
1 4 6 745.2 1784. в 0.418 1425993 а а! Нэр110
1 3 3 51.8 138.1 0.375 1424975 81
1 4 4 169.7 467.5 0.371 1417860 а 31 5роп2
1 3 9 69,5 196.3 0.354 1421037 81 Мраз2
1 3 1 1223 376.8 0.323 1425099 а а1 АгпИ
1 3 2 31.3 109.2 0.287 1417556 а! РаЬр1
1 3 9 18.5 71 4 0.259 1448764 а а! РаЬр1
1 2 е 80.2 355.3 0.226 1427352 э! В С031593
1 2 Э 34 194.7 0.175 1 1424451 а1 1 МОС29978
1 1 18 6 282.8 0.066 1421802 а! !Ра'1 .
- 112 016342
Таблица 17-4
Гены, на которые значимо влияет доза 30 мг/кг 309 в этой группе обработки
Гео метрическое среднее | интенсивностей в классе 1: 389 30 Т Геометрическое среднее интенсивностей в классе 2: ЗФР Кратное различие геометрического среднего а а ί о. £ £ Описание Символ гена
1 1546. 4 37.7 41. 019 1449153 31 Мтр12
2 1737 4 568.6 3.0 55 1420249 5 а( Сс16
3 2719. 8 736.8 3.6 91 1417936 31 Сс19
4 4556. 8 980.2 4.6 49 1427747 а а! Юп2
5 662.7 183.4 4.7 04 1448898 Э1 Сс19
6 1335. 4 464.1 2.8 77 1450652 а! С1зк
7 869.6 175.6 5.0 66 1448303 а! СрптЬ
б 346.7 75.7 4.5 8 1425951 а э1 С1ес4п
9 5373. 9 2214, 3 2.4 27 1417266 а( СсЮ
10 979.1 347,3 2.8 19 1419627 а а! С1ес4п
11 1998. 2 669 2.9 87 1420394 а а1 Ор49а III !ЛтЬ4
12 691.5 150,6 4.5 92 1419725 а1 31с26а4
13 66 33.3 1.9 82 1420250 61 1По:/ЛтаЖпсЬ1.п1т.тК еоу/епйегбзиегу. Г
СК1?стб=5еагсИ&<1Ь=еепе&1еп»=
14 134.1 70.3 1.9 08 1422191 а1 Сб200г1
15 1006. 1 417 2.4 14 1449164 а1 С 06 8
1« 185.6 68.6 2.0 92 1427313 а! Р1оя
- 113 016342
17 71 43.9 ТЗ 17 1421851 а! 1м1ао1Ь
18 53.1 38 1.3 97 АГЕХТгапзВесМиг/ Х57349 3 а1 Иге
19 4004 198.3 2.С 19 1418797 а! Мз4а8а
20 640.8 200.8 3.1 91 1418174 а! ЭЬр
21 291.8 122.7 2.3 78 1425151 а а! Νσχοί
22 1064 8 277.5 3.8 37 1438211 ί а! ОЬр
23 419 2 170Ύ 2 А 56 1449227 01 С02511
24 166.5 63 9 2.6 06 1435313 81 С0200Г4
25 77.3 26.9 2.8 74 1419561 а1 саз
26 459 269.4 1.7 04 1423308 а1 Тоо1я1
27 144 4 66.7 2 1 65 1421977 а1 Мто19
28 1093 4 3.0 76 Кио :/Λνινιν дкЫ η 1т. οί Ιι. ао у/егигегЛшеп'. Г
355.5 1436530 а1 сй1?ст<1=звагск&<1Ь=еепе&.1епп=
29 5060 1 3168. 8 1.5 99 1448591 а! Сйз
30 267.3 193 1 1.3 84 1456620 Э1 МОС79224
31 80.8 40.6 1.9 9 1416959 31 №102
32 118.4 38.8 3.0 52 1419209 а! СхсП
33 172.5 100.4 1.7 18 1417263 а) ΡίαδΖ
34 332.91 152.7 2.1 8 1444176 а! Α1ρ6νθά2
35 454 225.3 2.0 15 1422875 а| С084
36 390.7 168.9 2.3 13 1437939 5 а1 С15С
37 122β. ί 158.3 7.7 58 1450826 а а! ЗааЗ
38 17.7 12.1 1.4 63 1439703 а( Сб200г1
39 461.9 210.9 2.1 9 1422978 а( СИЛ
40 136 78.1 1.7 41 1433864 а! 1 пз12
41 133.3 59.1 1.9 29 1418809 31 Р1га1
42 390.9 244.1 1.6 01 1424356 Э а( Ме1т1
43 573.3 145.9 3.9 25 1425890 31 Ιϊδ!
44 260.5 170.1 1.5 78 1425407 5 а1 С1ес4а2 III С!ес4Ь
- 114 016342
45 328.6 198.9 ’-З 521418310 а1 Йп(128
46 1000 5 609.8 41(1450355 а а! Сам;
47 195.6 82.4 2.3 74 1427221 а! МО1:2143217
46 374.3 226.2 1.6 55 1448749 а! Р!ек
49 585-1 338 1.7 31 1419975 а( ϊιΙίρ.’/ΑννΛν. псЬ! .и I ηι. ηί Ь. ко ν/е пГгст/а негу £
се! ?стб =зеагс}1&(1Ь=иепе&1егт=
50 209.7 132.8 1.5 79 1449949 а а( СхаОг
51 168.9 110.2 1.5 33 1422341 з а1 1 ур1аЗ
52 176.5 98.1 1.8 2 1421792 з а! Тгетй
53 396.6 230.9 1.6 6 1417492 Э1 С(зо
$4 157 1 52.9 2.9 7 1420380 а! Сс12
55 124.6 95.6 1.3 03 1452461 а а1 М5С79224
56 218.4 109.6 1.9 93 1419483 а1 С3аг1
57 109.3 73.4 1.4 89 1422966 а э1 Т(гс
58 141.6 90.6 1.5 63 1442019 а1 1Нр:/Лу*и-.псЬ1.п1т.п1Ь.аоу7еп(гсгЛн1егу.Г
сш ? ст<1=5еагсй&дЪ -ее пе&1е пп=
59 283.6 175.6 1.6 15 1427429 Э1 Сз12
60 6424. 8 3665. 8 1.7 53] 1451537 а( сызи
61 147.2 94.7 1.5 54 1416986 а а! РЙ5П51
62 206.7 143.4 1.4 41 1452367 а! Сого2а
и 135.9 5Ζ9 2.5 69 1442082 а1 С3аг1
64 202.5 150.4 1.3 46 1418623 а1 АаЬ2
65 97.0 47.3 2.0 60 1419754 а! Муоба
66 432.4 259.4 1.6 67 1419321 а1 Р7
67 325.6 241.0 1.3 47 1416827 а! ТЬхаз1
66 74.8 355.3 0.2 11 1427352 а! ВС031593
69 44.3 194.7 0.2 28 1424451 э1 МСС29978
70 21.2 71.4 0.2 97 1448764 а а( РаЬр1
71 34.9 109.2 0.3 2 1417556 а) РаЬр1
72 33.2 282.8 0.1 17 1421802 31 2аг1
73 546.6 .. 900.3 0.6 07 1434245 а а! СуЬавсЗ
- 115 016342
1 74 178.8 378.8 0.4Ι 731425099 а а! ΑτπΙΙ
75 707 139.3 0.5 08 1450808 а! Рсг1
75 87.6 133 0.6 59 1456980 а< 983О134С1ОК1к
77 226.9 415 0.5 52 1422705 а! Тпоеоа:
78 172.9 363.5 0.4 76 1460061 а( Ηί(θ уЛеччг.псЫ .ηΐηι. ηΐίι. κον/εηΐ гсг-’оиег ν. Г
сц1? с тб=веагсй&бЬ=гепе&ле гт=
79 172.8 440.6 0.3 92 1423566 а а( Н5Р110
80 762.6 1784. 8 0/ 27 1425993 а а1 Н5Р110
81 266.2 400 0.6 65 1435247 а! 1Л>е16с1
82 464.7 689 0^ 74 1429764 ан 1500005К14Ик
83 632.4 821.7 07 7 1419640 а1 РигЬ
84 388.1 577.7 0.6 72 1453313 а1 ЗевпЗ
85 489.7 626.4 0.7 82 1440817 х а1 О639024С07Кгк
86 539 7417 07 27 1447585 8 э! 4гоз6
87 152.2 233.5 0.6 52 1442051 а! Н<512ЬЗс1
88 990.3 1438. 3 0.6 89 1438058 5 а! ΡΙον1
89 ай 127,6 0.6 27 1457740 Э1 Ат1!
90 270.4 423.4 0.6 31 1435484 а1 ВР642829
91 193.2 268.3 0.7 2 1440971 х а( б630024С07Ик
Таблица 17-5
Гены, на которые значимо влияет доза 10 мг/кг 369 и которые обнаруживают большее, чем 2-кратное изменение в соответствующей интенсивности сигнала набора зондов в этой группе обработки
Ряд гемов (Двойной щелчок) • Набор зондов Описание Символ тема
1720 1417388 аП экспрессируемый головным мозгом, Х-связанный 2 Вех2
1888 1417556 аП связывающий жирную кислоту белок 1, печень ЕаЬр1
1417860 а а
2192 е спондин 2, белок внеклеточного матрикса 8роп2
1419692 а а
4024 Г лейкотриен-С4-синтаза ЬЪс4з
5344 1421037 аС белок 2 РАЗ-домена нейрона Ыраз2
6109 1421802 аС эозинофил-ассоциированный член 1 семейства Еаг1
рибонуклеазы А
1423566 а а
7873 Ь белок теплового шока 110 ΗερΙΙΟ
8758 1424451 аС 3-кетоацил-СоА-тиолаза В МОС29978
9282 1424975 аЬ связывающий сиаловые кислоты 1д-подобный лектин 5 51д1ес5
1425099 а а
9406 £ подобный ядерному транслокатору арилуглеводородный АГПС1
рецептор
1425993 а а
- 116 016342
10300 Ъ белок теплового шока 110 НзрИО
11659 1427352 аг кДНК-последовательность ВС031593 ВС031593
23169 1438862 аг ΒΙΚΕΝ кДНК гена А630005104 А630005104Й1к
30778 1446471 аг
1448764 а а
33065 к связывающий жирную кислоту белок 1/ печень ГаЬр1
33799 1449498 аг рецептор макрофага с коллагеновой структурой Магсо
34142 1449846 аг эозинофил-ассоциированный член 2 семейства Еаг2
рибонуклеазы А
35104 1450808 аг рецептор 1 формилпептида Грг1
44278 1459984 аг ингибирующая меланому активность 3 МхаЗ
44355 1460061 аг кДНК обонятельного нерва головного мозга взрослого
самца/ ΚΙΚΕΝ полноразмерная обогащенная библиотека
1291 1416959 ак подсемейство ядерных рецепторов 1, группа о, член 2 ИгЫ2
1588 1417256 ас матриксная металлопептидаза 13 Мгар13
1598 1417266 ак лиганд 6 хемокина (мотив С-С) Сс16
2268 1417936 ак лиганд 9 хемокина (мотив С-С) Сс19
2506 1418174 ак белок, связывающий ϋ-сайт промотора альбумина ОЬр
2818 1418486 ак ванин 1 νηηΐ
3541 1419209 ак лиганд 1 хемокина (мотив С-Х-С) Схс11
3614 1419282 ак лиганд 12 хемокина (мотив С-С) Сс112
3814 1419482 ак рецептор 1 компонента комплемента За С3аг1
3815 1419483 ак рецептор 1 компонента комплемента За С3аг1
3893 1419561 ак лиганд 3 хемокина (мотив С-С) Сс13
3930 1419598 ак член 6ϋ подсемейства А с 4 простирающимися через Мз4а6сЗ
мембраны доменами
1419599 з а
3931 к член 11 подсемейства А с 4 простирающимися через Мз4а11
мембраны доменами
1419627 а а
3959 к член η семейства 4 доменов лектина С-типа С1ес4п
4057 1419725 ак член 4 семейства 26 'растворимых носителей 51с26а4
4086 1419754 ак миозин Уа Муо5а
1420249 з а
4569 ί лиганд 6 хемокина (мотив С-С) Сс16
4687 1420380 ак лиганд 2 хемокина (мотив С-С) Сс12
1420394 з а гликопротеин 4 9А///иммуноглобулин-подобныи рецептор
лейкоцитов, семейство В, член 4
4701 к 6р49а///Ы1гЬ4
1420464 з а ₽1га1///Р1га2///Р1га
3///Р1га4///Р1габ///
Ы1гЬЗ///ЬОС546О27
4771 6
1420768 а а
- 117 016342
507 5 ΐ ДНК-сегмент, Сил 11, ЬокЬаг НепптдЪаизеп 2, Ц11Ьдр2е
5535 1421228 аг экспрессированный лиганд 7 хемокина (мотив С-С) Сс17
7285 1422978 аг бета-лолипептид цитохрома Ь-245 СуЬЬ
9034 14247-27 аг рецептор 5 хемокина (мотив С-С) Ссг5
1425151 а а
9458 Ъ ΝΑΟΡΗ-оксидаза, организатор 1 Ыохо1
10197 1425890 аг локус 1 комплекс антигена б лимфоцитов ЬуС1
1425951 а а
10258 ί член η семейства 4 доменов лектина С-типа С1ес4п
10771 1426464 аг подсемейство ядерных рецепторов 1, группа ϋ, член 1 Ыг161
11528 1427221 аг ген Х-транспортерного белка 3 ахшИаг 1 МС1:2143217
11620 1427313 аг рецептор простагландина I (ΙΡ) РЬдаг
1427747 а а
12054 ί. липокалин 2 Ьсп2
19620 1435313 аг Сс1200 рецептор 4 С<3200г4
20837 1436530 аг кДНК-клон МСС:107б80 1МАСЕ:6766535
1437939 5 а
22246 1; Катепсин С (СТ5С), мРНК ССзс
1438211 з а
22518 ΐ: белок, связывающий 0-сайт промотора альбумина ОЬр
26389 1442082 аг рецептор 1 компонента комплемента За С3аг1
32604 1448303 аг трансмембранный гликопротеин птЬ СрптЬ
33199 1448898 аг лиганд 9 хемокина (мотив С-С) Сс19
33326 1449025 аг индуцированный интерфероном белок с Ι£ίί3
тетратрикопептидными повторами 3
33454 1449153 аг матриксная металлопептидаза 12 Мтр12
33465 1449164 аг антиген СО68 Сс168
33528 1449227 аг холестерол-25-гидроксилаэа СЬ25й
34280 1449984 аг лиганд 2 хемокина (мотив С-Х-С) Схс12
1450291 : 5 а
34587 Ь член 4с подсемейства А с 4 простирающимися через Мз4а4с
мембраны доменами
34699 1450403 аг Трансдуктор сигнала и активатор транскрипции 2 зъа-ег
34948 1450652 аг катепсин К СЁзк
1450826 . а а
35122 С сывороточный амилоид АЗ ЗааЗ
1451941 а а
36237 С Гс-рецептор, 1дС, 11Ъ низкой аффинности Гсдг2Ь
42472 1458176 аг мРНК РегЗ (Гомолог Рег1ос1 3 (ЭгозорНИа) ) РегЗ
- 118 016342
Таблица 17-6 Транскрипты, измененные более чем в 2 раза, в группе 30 мг/кг. Гены, на которые значимо влияла доза 30 мг/кг 309 и которые обнаруживали более чем 2-кратное изменение соответствующей интенсивности сигнала набора зондов в этой группе обработки.
Ряд генов (Двойной тцелЧОк) Набор Бондов Описание Символ гена
1888 1417556 а! связывающий жирную кислоту белок 1, печень ЕаЬр1
6109 1421802 аб эозинофил-ассоциированный член 1 семейства рибонуклеазы А Еаг1
7873 1423566 а аЪ белок теплового шока 110 НзрИО
8758 1424451 аЪ 3-кетоацил-СоА-тиолаза В МСС29978
9406 1425099 а а£ подобный ядерному транслокатору арилуглеводородный рецептор Агп-Ы
10300 1425993 а аИ белок теплового шока 110 НзрИО
11659 1427352 аТ кДНК-последовательность ВС031593 ВС031593
33065 1448764 а аТ связывающий жирную кислоту белок 1, печень РаЬр1
44355 1460061 ат кДНК обонятельного нерва головного мозга взрослого самца, Ε.ΙΚΕΝ полноразмерная обогащенная библиотека
1598 1417266 а£ лиганд 6 хемокина (.мотив С-С) Сс16
2268 1417936 аЪ лиганд 9 хемокина (мотив С-С) Сс19
2506 1418174 аЪ белок, связывающий О-сайт промотора альбумина бЬр
3129 1418797 аТ член 8А подсемейства А с 4 простирающимися через мембраны доменами Мз4а8а
3541 1419209 ат лиганд 1 хемокина (мотив (С-Х-С) СхС11
3893 1419561 аЬ лиганд 3 хемокина (мотив С-С) Сс13
3959 1419627 з а! член η семейства 4 доменов лектина С-типа С1ес4п
4057 1419725 а1 член 4 семейства 26 растворимых носителей 31с26а4
4086 1419754 аО миозин Уа Муо5а
4569 1420249 д ак лиганд 6 хемокина (мотив С-С) Сс16
4687 1420380 аб лиганд 2 хемокина (мотив С-С) Сс12
4701 1420394 з аИ гликопротеин 4 9А///иммуиоглобулин-подобный рецептор лейкоцитов, подсемейство В, член 4 (Зр4 9а///Ъ1гЬ4
6284 1421977 аЪ матриксная металлопептидаза 19 №пр19
7182 1422875 аТ антиген СО84 Сб.84
7285 1422978 аТ бета-полипептид цитохрома Ь-245 СуЬЬ
9458 1425151 а аП ΝΑΟΡΗ-оксидаза, организатор 1 Νοχοί
10197 1425890 аТ локус 1 комплекса антигена 6 лимфоцитов 1>у61
10258 1425951 а аЪ член η семейства 4 доменов лектина С-типа С1ес4п
11528 1427221 а!: ген Х-транспортерного белка 3 зхгаИаг 1 МС1:2143217
11620 1427313 аС рецептор простагландина I (ТР) РГдгг
12054 1427747 а а£ липокалин 2 Ьсп2
19620 1435313 аТ СС1200 рецептор 4 С0200г4
20837 1436530 а£ МСС:107680 1МАСЕ:6766535
22246 1437939 8 а£ катепсин С (СТЗС), мРНК СЪзс
22518 1438211 з аТ белок, связывающий 0-сайт промотора альбумина ПЬр
26389 1442082 а£ рецептор 1 компонента комплемента За С3аг1
28483 1444176 аГ АТФ-аза, Н+-транспортирующая, субъединица Ώ У0, изоформа 2 Αΐ:ρ6ν0ά2
32604 1448303 аЪ трансмембранный гликопротеин птпЪ СршпЬ
33199 1448898 аЪ лиганд 9 хемокина (мотив С-С) Сс19
33454 1449153 матриксная металлопептидаза 12 Μπιρ12
33465 1449164 аТ антиген СО68 Сс168
33528 1449227 аТ холестерол-25-гидроксилаза О125Ъ
34948 1450652 ан катепсин К С-Ьзк
35122 1450826 а аН сывороточный амилоид А 3 ЗааЗ
- 119 016342
Таблица 17-7 Транскрипты, обнаруживающие направленную вверх тенденцию в группе 3 мг/кг
Набор зондов 10 Название гена Символ гена
1417266_ар лиганд 6 хемокина (мотив ОС} Сс16
1417936_аР лиганд 9 хемокина (мотив С-С) Сс19
1418486_аЬ ванин 1 νπηΐ
1419209_аЬ лиганд 1 хемокина (мотив С-Х-С) Схс11
1419598_аГ член 60 подсемейства Ά с 4 простирающимися через мембраны доменами Мз4а6с1
1419599_з_аР член 11 подсемейства А с 4 простирающимися через мембраны доменами Мз4а11
1419627_з_аГ член η семейства 4 доменов лектина Стипа С1ес4п
1420394_з_аГ гликопротеин 4 9А///иммуноглобулинподобный рецептор лейкоцитов, подсемейство В, член 4 Ср49а///Ы1гЬ4
И21228_аГ лиганд 7 хемокина (мотив С-С) Сс17
1422191_аЪ С0200 рецептор 1 С<1200г1
1424727_аП рецептор 5 хемокина (мотив С-С) Ссг5
1425407_з_а5 член а2///член Ь семейства 4 доменов лектина С-типа С1ес4а2///С1ес4Ь
1425890_а1: локус 1 комплекса антигена 6 лимфоцитов Ьу61
1427747_а_аД липокалин 2 Ьсп2
143М77_еас Гс-рецептор, 1д(3, ПЬ низкой аффинности Гсдг2Ь
1436530_аГ кДНК-клон МСС:107680 1МАСЕ:6766535 —
1437939_з_аГ катепсин С СЬзс
1448303_аЬ гликопротеин (трансмембранный) шпЬ СргтаЬ
1448591_аЬ катепсин 3 СЬза
1448898_аР лиганд 9 хемокина (мотив С-С) Сс19
1449153_аГ матриксная металлопептидаза 12 Мтр12
1449984_аС лиганд 2 хемокина (мотив С-Х-С) Схс12
1450652_аР катепсин К СРзк
1450826_а_а1 сывороточный амилоид А 3 ЗааЗ
1451941_а_ар Гс-рецептор, 1дС, ПЬ низкой аффинности Гсдг2Ь
1455332_х_аР Ес-рецептор, 1дСг ПЬ низкой аффинности Есдг2Ь
Таблица 17-8
Все белки, анализированные мультианалитным анализом белков
Аро А1 (Аполипопротеин А1) 1Ь-12р70(интерлейкин 12р70) М-С5Е (колониестимулирующий фактор макрофагов)
СО4 0 11,-17 (интерлейкин-17) МОС (полученный из макрофагов хемокин/ССЬ22)
Лиганд С040 ΙΙ1-Ι8 (интерлейкин-18) М1Р-1сс (воспалительный белок Ια/ССЬЗ макрофагов)
- 120 016342
СКР (С реактивный белок) 1Ь-1альфа (интерлейкин- Хальфа) ΜΙΡ-1β (воспалительный белок 1р/ССЬ4 макрофагов)
ЕБГ (эпидермальный фактор роста) 1Ь-1бета (интерлейкин-1бета) ΜΙΡ-1γ (воспалительный белок- Ιγ/ССЪЗ макрофагов)
Эндотелин-1 1Ь-2 (интерлейкин-2) ΜΙΡ-2 (воспалительный белок 2/СХСЬ-2 макрофагов)
Эотаксин (ССЫ1) 1Ь-3 (интерлейкин-3) ΜΙΡ-3β (воспалительный белок- ЗР/ССЫ9 макрофагов)
Фактор VII 1Ь-4 (интерлейкин-4) ММР-9 (матриксная металлопротеиназа 9)
ЕСЕ-9 (фактор-9 роста фибробластов) 1Ь-5 (интерлейкин-5) Миоглобин
ЕСР-основный (основный фактор роста фибробластов) 1Ь-б (интерлейкин-6) ОЗМ (Онкостатин М)
Фибриноген 1Ь-7 (интерлейкин-7) ΚΑΝΤΕ3 (ССЬ5)
ССР-2 (хемотаксический белок- 2/СХСЬ6) гранулоцитов инсулин ВСЕ (фактор стволовых клеток
СМ-СЗГ (колониестимулирующий фактор гранулоцитовмакрофагов ) ΙΡ-10 (индуцируемый белок- 10/СХСЫО) 300Т (сывороточная трансаминаза глутаминовой-щавелевоуксусной кислоты)
Гормон роста КС/СКОа (СХСЫ) ΤΙΜΡ-1 (тканевый ингибитор металлопротеиназы Типа-1)
СЗТ-альфа (глутатион-3трансфераза альфа) лептин тканевой фактор
Гаптоглобин Ш (ингибирующий лейкоз фактор) ΤΝΓ-альфа (фактор-альфа некроза опухолей)
ΙΓΝ-гамма (интерферон-гамма) лимфотактин ТРО (тромбопоэтин)
ТдА (иммуноглобулин Ά) МСР-1 (хемоаттрактантный белок-1/ССЬ2 моноцитов) νθΑΜ-1 (молекула-1 адгезии васкулярных клеток)
1Ь-10 (интерлейкин-10) МСР-3 (хемоаттрактантный белок-3/ССЬ7 моноцитов) νΕ3Ρ (фактор роста васкулярных эндотелиальных клеток)
1Ь-11 (интерлейкин-11) МСР-5 (хемоаттрактантный белок-5/ССЬ12 моноцитов) νΜΡ (фактор фон Виллебранда)
Таблица 17-9
Белки, измененные при различных дозах обработки ти309
Количество белков ВАЬР, значимо измененных обработкой Количество белков ВАЬР с изменением, большим, чем 2кратное изменение
ЗФР уз 1Е6- 1 мг/кг 1 0
ЗФР уз 0,1 мг/кг 1 0
ЗФР уз 0,3 мг/кг 2 0
ЗФР уз 1 мг/кг 4 0
ЗФР уз 3 мг/кг 15 11
ЗФР уз 10 мг/кг 27 20
- 121 016342
Таблица 17-10 Белки ВАЬР с изменением, большим чем 2-кратное, в здоровых мышах
3 мг/кг 10 мг/кг
Аро А1 Аро ΑΙ
СО40 С 1)40
Фактор VII Фактор УП
Фибриноген Фибриноген
ССР-2 ССР-2
МПС СМ-СЗР
ΜΙΡ-1 гамма ΙΕ-18
ΜΙΡ-2 ΙΡ-10
Тканевой фактор МСР-1
УСАМ-1 МСР-3
УЕСЕ МСР-5
МПС
ΜΙΡ-1 гамма
ΜΙΡ-2
МИР-9
ΤΙΜΡ-1
Тканевой фактор
ТРО
УСАМ-1
УЕСР
Таблица 17-11
Белки жидкости БАЛ, значимо измененные в модели облучения
Неделя 28 модели облучения Неделя 32 модели облучения
1 мг/кг 3 мг/кг 10 мг/кг 1 н 3 мг/кг 5 мг/кг 10 мг/кг
ΤΙΜΡ-Ι Гаптоглобин Гаптоглобин Отсутствует ССР-2 1Ь-1в
ГС-10 НМбета 6М-СЗР М1Р-Збета
Л-7 Л-5 Л-10 ММР-9
- 122 016342
р<0,05 М1Р-Збета р<0,05 ΙΡ-10 УСАМ
Миоглобин МЕР-[альфа
ΊΤΜΡ-1 ЗСР
ΤΝΡ-альфа ΤΝΓ-альфа
νΐίΤ
р<0,01 Гаптоглобин ΑροΑΙ СО40 р<0,01 Отсутствует МСР-1 СЕ)40
ЕСР ССР-2 МСР-3 сср-2
1Ь-1альфа ОМ-СЯР МЕР-1 бета ОМ-С8Р
МЕР-1 альфа ΙΡ-10 ММР-9 1§А
О8М МСР-1 Онкостатин М 1Ы0
УЕ6Г МСР-3 УБОР ΙΡ-10
МСР-5 МСР-1
М-СЯР МСР-3
ΜΙΡ-Ι альфа МСР-5
М!Р-1бета М-СЯР
МЕР-2 ΜΙΡ- 1 альфа
ММР-9 М1Р-1бета
Миоглобин ΜΙΡ- 1гамма
Онкостатин М МЕР-2
8СР Миоглобин
ΤΝΡ-альфа Онкостатин М
ТРО 8СР
УБОР ΤΝΡ-альфа
уОТ ТРО
УЕОР
Таблица 17-12 Сравнения кратного изменения в белках БАЛ в здоровых и облученных мышах
Кратное изменение при 10 мг/кг/неделя
Нормальные мыши 4 недели обработки Облученные мыши 3-4 месяца обработки
МСР-1 39 46-85
МСЗ-З 11 25-50
МСР-5 2,4 18-32
ОМ-С8Г 2,9 16
СО40 3 6-10
ММР-9 3 5-6
М1Р-1бета 1,3 6
УЕОГ 3 5-7
М1Р-2 7,6 5-6
ΜΙΡ-1 гамма 65 2-4
СС'Р-2 3,6 4
1£А 6,7 5,5
М-С8Р 4,5 2,5-3
- 123 016342
Выводы.
Действия ти309-обработки были охарактеризованы в здоровых мышах анализом профиля транскриптов и мультианалитным анализом профиля белков.
(a) Анализ профиля транскриптов легких из обработанных высокой дозой ти309 мышей демонстрирует значимые изменения в ряде транскриптов, ассоциированных с легочным воспалением. Эти изменения согласуются с результатами анализа профиля транскриптов из интегрин^-нуль-мышей (ανβ6недостаточных). Конкретные мишени, которые неправильно регулируются, согласуются с уменьшенной передачей сигнала ΤΟЕ-β в легком вследствие механизма действия ти309.
(b) Результаты анализа профиля белков также демонстрируют согласующиеся увеличения в некоторых цитокинах и хемокинах, ассоциированных с механизмом действия ти309.
(c) Изменения в транскриптах достигают значимости только при дозе 10 мг/кг, хотя ряд транскриптов имеют тенденцию к повышению при дозе 3 мг/кг. Изменения некоторых белков являются значимыми при дозе 3 мг/кг, но большинство белков достигают значимости при дозе 10 мг/кг. При дозе 1 мг/кг не наблюдали значимых изменений в белках или транскриптах.
Действия ти309-обработки были охарактеризованы в модели лучевого фиброза с использованием мультианалитного анализа профиля белков.
(a) Многие из тех же самых цитокинов и хемокинов, индуцированных высокой дозой ти309 в здоровых мышах, повышались также высокой дозой ти309 в модели лучевого фиброза.
(b) Несмотря на гораздо более высокую экспрессию мишени ти309, интегрина ανβ6, увеличения в этих воспалительных маркерах наблюдали при одних и тех же дозах в модели лучевого фиброза и в нормальных мышах, т.е. увеличение при 3 и 10 мг/кг, но не при 1 мг/кг, которая является близкой к максимальной эффективной дозе в этой модели (см. пример 15).
(c) Некоторые белки, ассоциированные с фиброзом, в частности 11МР-1 и гаптоглобин, нормализовались ти309-обработкой при эффективных дозах во временной точке 28 недель.
Ссылки.
Аппез !Р, КйкШ И.В., Мипдег 1.8. Τке шТедпп ανβ6 Ьтбз апб асТтаТез 1аТепТ Τ0Еβ3. ЕЕВ8 ЬеТТ 2002; 511:65-68.
Вопшаиб Р., Ко1Ь М., 0а1Т Τ., КоЬегТзоп 1., КоЬЫпз С., 8ТатрШ М., Ьа¥егу С., МагдеТТз Р.1., КоЬегТз А.В., 0аи1б1е 1. 8таб3 пи11 тюе бе\ге1ор апзрасе еп1агдетепТ апб аге гез1зТапТ То ТСЕ-ЬеТа-теб1аТеб ри1топагу йЬгоз1з. 1 Iттипо1. 2004; 173(3):2099-108.
Вопшаиб Р., МагдеТТз Р.1., 8сНгоебег 1.А., Кароип А.М., Иатт Ό., МигрНу А., Скак^аνа^Ту 8., Иидаг 8., ШддШз Ь., РгоТТег А.А. апб оТНегз. Ρ^од^езз^νе ТСЕ-(ЬеТа)1-Шбисеб 1ипд йЬгоз1з 1з Ь1оскеб Ьу ап ога11у асТке АЬК5 кШазе 1пН1Ьйог. Ат. 1. Кезрк СпТ Саге Меб. 2004.
Вгеизз 1.М., 0а11о 1., ИеЫззег Н.М., Кктапзкауа ГУ., Ео1кеззоп Н.0., РйТеТ 1.Е., МзЫтига 8., А1баре К., Ьапбегз И.У., СагрепТег ^. еТ а1. Ехргеззюп ой ТНе β6 зиЬишТ ш бе¥е1ортепТ, пеор1аз1а апб Йззие герак зиддезТз а го1е Ш ер1ТНеИа1 гетобекпд. 1. Се11. 8ск 1995; 108:2241-2251.
СНем-Шег К.Ь., 0оуа1 8., К1т А., Ьапбаи Ό., ЬеКойН Ό. Кепа1 ТиЬи1отТегзТ1Т1а1 1И)игу йот игеТега1 оЬзТтасТюп ш ТНе пеопаТа1 гаТ 1з аТТепиаТеб Ьу ЮЕ-1. К1бпеу ШТ 2000; 57:882-890.
Со11агб Н.К., Куи 1.Н., Иоид1аз ЭД'.ЭД'., 8сН\\'а^ М.к, Си^^аη-Ενе^еТТ Ό., Кшд ТЕ., Вго\\'п К.К. СотЬШеб СогТ1созТего1б апб Сус1орНозрНат1бе Τке^ару боез поТ а1Тег зи^ν^νа1 Ш ШюраТЫс Ри1топагу Е1Ьгоз1з. СНезТ 2004; 125:2169-2174.
Сои1Таз И.В., Ζиш^а1Т К.Е., В1аск А.С., 8оЬопуа К.Е. Τке Ер1бешю1оду ой ШТегзШТа1 Ьипд Э|зеазе. Ат 1. Кезрк СпТ Саге Меб. 1994; 150:967-972.
Создго¥е Ό., Меб1ап Ό., 0тпкетеуег 1.А., Котак 1.М., 8ауегз К., НипТег А.1., 8атие1зоп 0.С. Со11адеп СОЙ4А3 кпоскоиТ: а тоизе тобе1 йог аиТозота1 А1рогТ зупбготе. 0епез Ое\' 1996; 10:2981-2992.
Иоид1аз ^.^., Куи кН., 8\\'епзеп 8. 1., Ойогб К.Р., 8сНгоебег И.К., Сагоп 0.М., Кетее К.А. Со1сН1сШе ¥егзиз Ргебшзопе Ш ТНе ^аТтек ой ШюраТЫс Ри1топагу Е1Ьгоз1з: а гапбопХеб ргозресТпе зТибу. Ат 1. Кезрк. СпТ. Саге Меб. 1998; 158:220-225.
Еюке1Ьегд О., КоН1ег Е., КеюНепЬегдег Е., ВегТзсНш 8., АообТк Τ., Егпе Р., РеггисНоиб А.Р., КоТН М. ЕхТгасе11и1аг таТпх берозйюп Ьу рйтагу Нитап 1ипд ЙЬгоЫазТз Ш гезропзе То ТСЕ-ЬеТа1 апб ТСЕ-ЬеТа3. Ат 1. РНузю1 1999 276 (5):Ь814-Ь824.
Е1аНегТу К.К., Τоез\ν 0.В., ЬупсН 1.Р., Каζе^ооп^ Е.А., 0гозз В.Н., 8Тга^бегтап К.Ь., НапНагап К., Е1ШТ А., Ма^Т^пеζ Е.к 8Тего1бз ш ШюраТЫс Ри1топагу Е1Ьгоз1з: А ргозресТпе аззеззтепТ ой аб\гегзе геасТюпз, гезропзе То ТНегару, апб зи^ν^νа1. Ат 1. Меб. 2001; 110:278-282.
0еогде 1., Кои1оТ Ό., КоТекапзку У.Е., В1ззе11 И.М. Ш у1уо шЫЬйюп ой гаТ зТе11аТе се11 псТТупТТоп Ьу зо1иЬ1е Тгапзйогтшд дгоМН йасТог Туре ΙΙ гесерТог: А роТепТ1а1 пе\\' ТНегару йог Нерайс йЬгоз1з. Ргос №й1. Асаб. 8с1, и8А 1999; 96(22):12719-12724.
Ο1е^ζез Р.Е., Мипдег 1.8., Шпез Ι., Нагре1 1.0., Маζζ^е^^ К., №диега Ι., Кйкш И.В. ТСЕ-ЬеТа 1аТепсу: Ью1одюа1 з1дшйсапсе апб тесНашзтз ой асб\гаТюп. 8Тет Се11з 1997; 15:190-197.
НаккШеп Ь., НббеЬгапб Н.С., ВегпбТ А., КозтеН1 Н., ^а^^ауа Н. Iттипо1осакζаТ^оп ой ТепазсШ-С, а1рНа9 ШТедпп зиЬишТ, апб а1ркауЬеТа6 шТедпп биппд теоипб Неабпд Ш Нитап ога1 тисоза. 1. ШзТосНет Су
- 124 016342 !оскет. 2000 48 (7):985-98.
Наккшеп Ь., КоМв!о Ь., 0агбпег Н., 8аапа1ко-Кге и., Сагго11 кМ., Ьакво М., Ваи,а1а Н., Ьаа!о М., Нешо I., Баг|а,а Н. йюгеавеб ехргеввкп ок Ье!а6-т!едпп ш вкт 1еабв !о вроп!апеоив бе,е1ортеп1 ок скгопк уоипбв. Ат к Ра!ко1. 2004 164(1):229-42.
Ниапд Χ.Ζ., ОТи кР., Савв Ό., Ег1е Ό.Ι, Соггу Ό., Уоипд 8.0., Рагеве В.У. 1г., 8керрагб Ό. ШасЮТакоп ок 1ке т!едппв т геди1а!тд шйаттайоп ш!ке 1ипд апб вкт. к Се11. Вю1. 1996 Мау; 133(4):921-8.
Ниапд X., ОТи к, 8ропд 8., 8керрагб Ό. Тке т!едпп а1рка,Ье1а6 1в сгккса1 ког кега!тосу!е т1дгакоп оп Ьо1к 1!в кпо\уп кдапб, йЬгопескп, апб оп „кгопескп. к Се11. 8ск 1998; 111:2189-95.
Каттвк1 К, Ве1репо кА., Вй!егтап Р.В., Скеп Ь., Скепвие 8.ОТ., апб о!кегв. Нкра^ис Ри1топагу Р1Ьгов1в. Ргосеебтдв ок !ке 1в! Аппиа1 Рй!вЬигдк Iη!етаΐ^оηа1 Ьипд Сопкегепсе. 0с!оЬег 2002. Ат к Веврк Се11. Мо1. Вю1. 2003 8ер; 29(3 8ирр1): 81-105.
Кавида Н., Йо Υ., 8акато!о 8., КауасЫ Н., 8ккп1/и Р., Уиха\\'а Υ., 8.М. Еккес!в ок апк-Т0Р-р 1уре ΙΙ гесер!ог апБЬобу оп ехрептеп!а1 д1отеги1оперкл!1в. К1б Ш! 2001, 60:1745-1755.
Ьартд N.1. АЬК5 Iηк^Ь^ΐ^оη шгепа1 б1веаве. Сигг 0рш Ркагтасо1. 2003; 3(2):204-208.
Ма Ь.к, Уапд Н., 0аврей А., Саг1евво 0., Ваку М.М., Эа,|бвоп кМ., 8керрагб Ό., Родо А.В. Тгапвкогттд дгоу!к каскг-к-берепбеп! апб тберепбеп! ра!куаув ок тбископ ок !иЬи1от!егв!кка1 йЬгов1в ш β6-/тке. Ат к Ра!ко1. 2003; 163:1261-1273.
Мшег кН., 8апев кВ. Мо1еси1аг апб кипскопа1 бекес!в ш к1бпеув ок тке 1асктд со11адеп а3(ГУ): 1трксайопв ког а1рой вупбготе. к Се11 Вю1. 1996, 135:1403-1413.
М|уарта А., Скеп к, Ьаугепсе С. ЬебЬе!!ег 8., 8ов1о\у В.А., 8!ет к, Чка 8., Р1да!о к, Ьетег М.Й., Роррав Э.Р., Уаидкап Е.Э., Ре1веп Ό. АпйЬобу !о йапвкогттд дго\\1к кас!ог-Ье1а атекога!ев !иЬи1аг арор!ов1в ш иш1а!ега1 иге!ега1 оЬвйисйоп. К1бпеу Ш! 2000. 58(6):2301-13.
Мотв Ό.0., Ниапд X., Каттвк1 К, ОТапд Υ., 8карко 8.Ό., Эо1дапо, 0., 0иск А., 8керрагб Ό. Ьовв ок т!едпп а1рка(у)Ье1а6-теб1а1еб Т0Р-Ье1а асР,аРоп саивев Мтр12-берепбеп! етркувета. Книге 2003 Маг 13: 422(6928):130-1.
Мипдег к8., Нагре1 4.0., 01е17ев Р.Е., Маххкп В., Шпев Ι., Вккт Э.В. Ьа!еп! 1гапвкогт1пд дгоу!к кас!ог-Ье!а вйис!ига1 кеа!игев апб тескашвтв ок ас!ка!кп. К1бпеу Ш! 1997: 51:1376-1382.
Мипдег к8., Ниапд X., Кауака!ви Н., 0пкй!кв МЮ., Эакоп 8.Й., ОТи к, Р1ке! кР., Каттвк1 К, 0ага! С., Майкау М.А. апб о!кегв. Тке ш!едпп а^6 Ьшбв апб асР,а1ев 1а!еп! Т0Р-[1: а тескашвт ког геди1а!тд ри1топагу шйаттайоп апб йЬгов1в. Се11 1999, 96:319-328.
Р1йе! 1.Р., 0пййкв М.к, 0е1вег Т., КаттвИ К, ЭаИоп 8.Й., Ниапд X., Вгоуп Й.А., 0о!уа1в РЭ, Ко!екапвку У.Е., Майкау М.А. апб о!кегв. Т0Р-Ье!а 1в а сй!ка1 теб1а!ог ок аси!е 1ипд 1п)игу. I Скп йкев! 2001; 107(12):1537-1544.
ВоЬейв А.В., 8рот М.В. Веди1айоп ок епбо!кейа1 се11 дгоу!к, агскйес!иге, апб тайгх вуп!кев1в Ьу Т0Р-Ье1а. Ат Ве, Веврй Э|в 1989; 140:1126-1128.
ВоЬейв А.В., 8рот М.В., Авво1ап В.К., 8тйк кМ., Воске N.8., ОТакекйеб Й.М., Неше υ.Ι., Ыойа Й.А., Ра1апда У., Кекг1 кН. апб о!кегв. Тгапвкогттд дгоу!к кас!ог !уре β. Вар1б шбисйоп ок йЬгов1в апб апдкдепев1в ш νί\Ό апб вйти1айоп ок со11адеп когтайоп ш„кго. Ргос №Н1 Асаб 8а, и8А 1986; 83:4167-4171.
8е1тап М. ^краШк ри1топагу йЬгов1в ска11епдев ког !ке ки!иге. Скев! 2001; 120(1):8-10.
81еукег-8. В1еотуст-тбисеб рпеитошйв. Скев! 2001; 120(2):617-24.
8кагта К., йп Υ., 0ио к, Ζιιγ^Ιι Р.К №и!га11/айоп ок Т0Р-[ апйЬобу а!!епиа!ев к1бпеу курейгорку апб !ке епкапсеб ех!гасе11и1аг та!пх депе ехргевввкп ш 8ТΖ-^ηбисеб б1аЬейс тке. П1аЬе!ев 1996; 45:522530.
81те Р.к, X^ηд Ζ., 0гакат Р.Й., Сваку К.0., 0аи1бк I. Абепо,ес1ог-теб1а1еб депе !гапвкег ок аск,е йапвкогттд дгоу!к ГасЮг-β 1 тбисев рго1опдеб ве,еге йЬгов1в ш га! 1ипд. I. Скп. йкев! 1997; 100:768-776.
Титег-ОТагукк М., Виггоув В. Чокпвоп А. Сгур!одешс йЬгов1п а1,ео1П1в: гевропве !о сойков!его1б йеа!теп! апб йв еккес! оп виттак Ткогах 1980; 35:593-599.
Уагда I., ВовепЬ1оот I., йтепех 8.А. Тгапвкогттд дгоу!к кас!ог Ье!а (Т0Р Ье!а) саивев а регв1в!еп! шсгеаве ш в!еабу-в!а!е атоип!в ок !уре Ι апб 1уре ΙΙΙ со11адеп апб йЬгопесйп т^Ав ш погта1 китап бегта1 йЬгоЬ1ав!в. Вкскет. I. 1987; 247 (3):597-604.
ОТапд О., Нубе Э.М., 0о!уа1в Р.к, 0ίη 8.К Еккес!в ок бе1ауеб йеа!теп! уйк во1иЬ1е !гапвкогттд дгоу!к кас!ог-Ье!а гесер!ог ш а !кгее-бове Ыеотуст тобе1 ок 1ипд йЬгов1в т катв!егв. Ехр. Ьипд. Вев. 2002; 28 (6):405-17.
ОТетгеЬ Р.Н., 81топ К.к, Ваукот Р., ОТ.к, Ьеопе О.В., По1твк1 В.М., Реагве В.В., Υоко!а Υ.,
Кауака!ви Н., А1акШ! А. апб о!кегв. Рипс!кп-Ь1осктд т!едпп а^ топос1опа1 апйЬобкв. I. Вю1. Скет. 2004; 279 (17):17875-17887.
Ζкеηд Н., ОТапд I., Ко1еНапвку У., I. 0Р, Наиег-кпвеп М. ВесотЬтап! во1иЬ1е !гапвкогттд дгоу!к кас!ог β !уре ΙΙ гесер!ог атекога!ев габ1а!кп еп!егоркау ш тке. 0ав1гоеп!его1оду 2000; 119:1286-1296.
Ζ^втаη О.А., Ьупск кР., Тоеув 0.В., Кахегоош Е.А., Ркп! А., Майте/ Р.1. Сус1орковркат1бе ш !ке Тгеа!теп! ок ИкраШс Ри1топагу йЬгов1в. Скев! 2000; 117:1619-1626.
Ζ^уабек Р.К, Нокктап В.В., Нап О.С., ^квхав-бе 1а Ουζ М.С., Нопд 8.ОТ., копо М., Скеп 8.,
- 125 016342
МсОο^аη Т.А., 8Наппа К. Βοπ§-Φπη ргеуеп!юп οΤ гепа1 ткиТйшепсу, ехсекк та1пх депе еxρ^екк^οη. апб дктегЫаг 1пекапд1а1 та1пх ехрапкюп Ьу ЦеаИпеп! \νί!1ι шοηοс1οηа1 дго\\П1 ТасЮг-β ак^бу ш бЬ/бЬ б1аЬебс пасе. Ρι^ №111 Асаб 8с1 Ь8А 2000; 97(14):8015-8020.
Теперь, после полного описания данного изобретения в некоторых деталях в качестве иллюстрации и примеров для более ясного понимания, специалисту с обычной квалификацией в данной области будет очевидно, что то же самое может быть выполнено модификацией или изменением этого изобретения в широком и эквивалентном диапазоне условий, композиций и других параметров без влияния на объем этого изобретения или на любой его конкретный вариант осуществления, и что предполагается, что такие модификации или изменения включены в объем прилагаемой формулы изобретения.
Все публикации, патенты и заявки на патент, упоминаемые в этом описании, являются показателями уровня квалификации специалистов, квалифицированных в области, к которой относится данное изобретение, и включены здесь в качестве ссылки в такой же степени, как если бы каждая отдельная публикация, каждый патент или каждая заявка на патент были конкретно и отдельно указаны как включенные в качестве ссылки.
Перечень последовательностей <110> У!о1еббе, ЗЬе11а М.
Коортап, Лои!за А.
Ξίττιοη, Кеппе РН 1.
ИеьпгеЬ, Раи1 Н.
хал УИ^теп, Негтап И.Т.
ЗаШапНа, Зоне N.
Ьидотекоу, А1ехеу А.
<120> Анти-альфаУбета6-антитела и ик применения <130 = 2159.0840002 <140> ий 11/483,190 <141> 2006-07-10 <150> из 60/773,310 <151 = 2005-07-08 <150 = из 60/697,442 <151> 2005-07-08 <160 = 152 <17 0= РабепИп версии 3.3 <210> 1 ' <211> 120 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Тяжелая цепь гуманизированного ЗС9 <400> 1
С1и 1 Уа1 С1п Ьеи Уа1 *21и Зег 01у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго <31у С1у
5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Агд Туг
20 25 30
- 126 016342
Уа1 Мер Зег Тгр 35 Уа1 Агд С1п А1а 40 Рго 51у Ьуз С1у Ьеи 45 С1и Тгр Уа1
А1а Зег Не Зег Зег 61у С1у Агд МеЬ туг Туг Рго Азр ТЬг Уа1 Ьуз
50 55 60
С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз АЗП Зег ьеи Туг Ьеи
65 70 75 80
С1п Мер Азп Зег Ьеи Агд А1а О1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз А1а
85 90 95
Агд <31у Зег Не Туг Азр С1у Туг Туг Уа1 РЬе Рго Туг Тгр С1у С1п
100 105 110
С1у ТЬг Ьеи. Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120 <210> 2 <211> 108 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Легкая цепь гуманизированного 309 <400> 2
<31и Не Уа1 Ьеи ТЬг αΐη зег Рго А1а ТЬг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у
1 5 10 15
<31и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Зег А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Зег Зег
20 25 30
Туг Ьеи Туг Тгр Туг <31п (31п Ьуз Рго С1у О1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи
35 40 45
Не Туг Зег ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег С1у Не Рго А1а Агд РЬе Зег
50 55 60
<31у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1и
70 75 80
- 127 016342
Рго С1и Азр РЬе А1а Та1 Туг туг Суз Нд.з 61п Тгр Зег ТНг Туг Рго
9095
Рго ТЬг РЬе С1у <31у 01у ТЬг Ьуз Уа! <Э1и Не Ьуз
100105 <210?3 <211? 126 <212? Белок <213? Искусственная последовательность <220?
<223> Тяжелая цепь гуманизированного ЗС6 <400? 3
<31п 1 Уа1 61п Ьеи 7а1 5 <31п Зег (31у
Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег Суз Ьуз А1а
20
А1а МеЬ Н13 Тгр Уа1 Агд (31п А1а
35 40
С1у Уа1 Не Зег ТЬг Туг Туг е1у
50 55
Ьуз С1у Агд Уа1 ТЬг Ме£ ТЬг Агд
65 70
Мед 01ч Ьеи Зег Агд Ьеи Агд Зег
85
А1а Агд С1у С1у Ьеи Агд Агд Н1у
100
МеЬ Азр Туг тгр □1у С1п С1у ТЬг
115 120
<210? 4
<211? 111
<212> : Белок
А1а <31и Уа1 10 Ьуэ Ьуз Рго <31у 15 А1а
Зег <31у туг ТЬг РЬе ТЬг Азр Туг
25 30
Рго 01у С1п (31у Ьеи 31и Тгр мес
45
АЗП ТЬг Азп Туг АЗП <31п Ьуз РЬе
60
АЗр ТЬг Зег Не Зег ТЬг АЬа Туг
75 80
Азр Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
90 95
АВр Агд Рго Зег Ьеи Агд Туг А1а
105 но
Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
125
- 128 016342 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Легкая цепь гуманизированного 806 <40О>4
С1и 1 Не Уа1 Ьеи ТЬг 5 <31п Бег Рго А1а ТЬг Ьеи 10 Зег Ьеи Зег Рго 15 С1у
С1и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суд Агд А1а Зег С1п Зег 7а1 Зег ТЬг Бег
20 25 30
Зег Туг Зег Туг МеЬ Туг Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго 61у θΐη А1а Рго
35 40 45
Агд Ьеи Ьеи Не Туг Туг А1а Бег АЗП Ьеи С1и Зег 61у Не Рго А1а
50 55 60
Агд РЬе Зег С1у зег С1у Зег 61у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег
65 70 75 80
Зег Ьеи С1и Рго 31и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз С1п ΗΪΞ Азп Тгр
85 90 95
<31и 11е Рго РЬе ТЬг РЬе О1у О1у <Э1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз
100 105 110
<210>5 <211>711 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Вектор рК38195 - Легкая цепь версии 5 309 <220>
<221> СПЗ <222> (1}..(711) е400> 5 аЬд дас ЬЪс сад дед сад аЬс ЬЬс аде ЬЬс сЬд сЬд аЪс аде ддд аде
- 129 016342
МеЬ 1 Азр РЬе (31п 7а1 С1п 5 11е РЬе Бег РИе Ьеи Ьеи Не 10 Бег Уа1 15 Зег
дЕд асе асд аде еде ддс дад асе дед сед асе сад аде еес дес асе 96
Уа1 11е МеС Зег Агд <31у □1и Не Уа1 Ьеи ТЬг <31п Зег Рго А1а ТЬг
20 25 30
сед аде сСд аде ссс ддс дад адд дес асе сСд аде Сде аде дес аде 144
Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у С1и Ахд А1а ТЬг Ьеи Зег Сув Зег А1а Зег
35 40 45
аде аде дСд аде аде аде Сае сСд Сае Сдд Сае сад сад аад ссс ддс 192
Зег Зег Уа1 Зег Зег Зег Туг Ьеи Туг Тгр Туг О1П 01п Ьув Рго С1у
50 55 60
сад дес ссс адд сСд сед аСс Сае аде асе аде аас сСд дес аде ддс 240
С1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи Не Туг Зег ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег С1у
65 70 75 80
аПс ссс дес еде ССс аде ддс аде ддс аде ддс асе дас еес асе сед 288
Не Рго А1а Агд РЬе Зег <Э1у Зег С1у Бег- С1у ТЬг Авр РЬе ТЬг Ьеи
85 90 95
асе асе аде аде сед дад ссс дад дас еес дес дЕд Сае Пас Еде сас 336
ТНг 11е Зег Зег Ьеи С1и Рго <31и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз Н1в
100 105 но
сад Сдд аде асе Сас ссс ссс асе еес ддс ддс ддс асе аад дед дад 384
31п Тгр Зег ТЬг Туг Рго РГО ТЬг рЬе <31у С1у С1у ТЬг Ьув Уа1 С1и
115 12 0 125
а!с аад еде аад дед дес дса сса СсС дСс еес аСс еес сед сса Псе 432
11е Ьуз Агд ТЬг νβΐ А1а А1а Рго Зег Уа1 РЬе 11е РЬе Рго Рго Зег
130 135 140
дас дад сад ее3 ааа псе дда асе дес С сП дес дьд Сде сед сед аае 480
Азр С1и <31п Ьеи Ьуз Зег С31у ТЬг А1а Зег Уа1 Уа1 Суз Ьеи Ьеи Азп
14 5 150 155 160
аас ССс СаС асе ада дад дес ааа дСа сад ьдд аад дСд дае аас дес 528
Азп РЬе Туг Рго Агд С1и А1а Ьуз Уа1 01п Тгр Ьув Уа1 Авр Азп А1а
165 170 175
- 130 016342
сСс Ьеи саа <31П Сед Зег дде С1у 180 аас Аеп есс Зег сад дад ад С Бег 185 дес Уа1 аса дад сад дас аде аад 576
С1п С1и тЬг О1и С1п Азр Зег 190 Ьуз
дас аде асе сас аде сСс аде аде асе сСд асд сСд аде ааа дса дас 624
Азр Бег ТЬг туг Бег Ьеи Бег Зег ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Бег Ьуз А1а Азр
195 200 205
Сас дад ааа сас ааа дЬс Сас дес Сдс даа дСс асе еаС сад ддс сСд 672
Туг 01и Ьув ΗΪ5 Ьуз Уа1 Туг А1а Суз 01и Уа1 ТЬг Ηίδ ΘΧη <31у Ьеи
210 215 220
аде Сед ссс дес аса аад аде ССС аас адд дда дад СдС 711
Зег Зег Рго Уа1 ТИг Ьуз Зег рье Азп Агд О1у 01и Суз
225 230 235
с210> 6 е211> 1404 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Вектор рКД3189 - Тяжелая цепь версии 3 ЗС9 <220>
<221> СОЗ <222> (1}..(1404) <400> 6
аСд МеС 1 дас Азр ССс РЬе ддс 31у сСд аде ьеи Зег 5 Сдд дСд Тгр Уа1 ссс РЬе сед Ьеи 10 зед Уа1 сед дед Ьеи Уа1 сед аад ддс 48
Ьеи Ьуз 15 (31у
дед сад Сдс Зад дед сад сед дед дад аде ддс ддс ддс сед дед сад 96
Уа1 С1п Суз О1и Уа1 С1п Ьеи νθΐ О1и Бег <31у С1у 01у Ьеи Уа1 С1П
20 25 30
ссс ддс ддс ад<= сСд адд сСд аде Сдс дес дес аде ддс ССС асе ССс 144
Рго е1у С1у Бег Ьеи Агд Ьеи Бег Суе А1а А1а Зег 31у РЬе ТЬг РЬе
35 40 45
аде сдс Сас дед аЬд аде С99 дед сдс сад дес с ее ддс аад ддс сСд 192
131 016342
Зег Агд 50 Туг Уа1 Мер Зег Тгр 55 Уа1 Агд <31X1 А1а Рго <31у 60 Ьуз 01у Ьеи
дад Ъдд д*^д дсе аде акс аде аде дда ддс еде акд Ьас Ьас ссс дас 240
Тгр Уа1 А1а Зег Не Зег Зег е1у С1у Агд Мек Туг Туг Рго Азр
65 70 75 80
асе дЕд аад ддс еде Ькс асе акс аде еде дас аас дсе аад аас аде 283
ТЬг Уа1 ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз АЗП Зег
85 90 95
скд Ьас скд сад акд аас аде скд еде дес дад дас асе дес дкд Ьас 336
Ьеи Туг Ьеи 61п Мек Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а νβΐ Туг
100 105 110
Ьас кде дсе еде ддс аде акс Ьас дас ддс Ьас кас дЕд ЬЬс ссс Ьас 384
Туг Су в А1а Агд С1у Зег Не Туг Азр <31у Туг Туг Уа1 РЬе Рго Туг
115 120 125
кдд ддс сад ддс асе скд дкд асе дЕд аде ксс дес аде асе аад ддс 432
Тгр <31у О1п <31у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег А1а Зег тЬг Ьуз 61у
130 135 140
ссс аде дкд ккс ссс скд дес есс аде аде аад аде асе аде ддс ддс 480
Рго Зег Уа1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго 8ег Зег Ьуэ Зег Т11Г Зег С1у <Э1у
14 5 150 155 160
асе дес дес скд ддс кде скд дед аад дас кас ккс ссс даа сед дЕд 528
ТЬг А1а А1а Ьеи С1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго 01и Рго Уа1
165 170 175
асд дЕд кед кдд аас кеа ддс дес скд асе аде ддс дЕд сас асе ЬЬс 576
ТЬг Уа1 Зег Тгр Азп Зег 61у А1а Ьеи ТЬг Зег <31у Уа1 Н15 ТЬг РЬе
180 185 190
сед дек дЬс ска сад ксс кеа дда скс Ьас ксс скс аде аде дкд дЬд 624
Рго А1а Уа1 Ьеи Θΐη Зег 8ег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег ν&ι ν»1
195 200 205
асе дЕд ссс ксс аде аде ккд ддс асе сад асе Ьас акс кде аас дед 672
ТЬг Уа1 Рго Зег 8ег Зег Ьеи С1у ТЬг О1п ТЬг Туг 11е Суз Азп Уа1
210 215 220
- 132 016342
ааЕ АЗП 225 сас Н1в аад Ьуз ссс Рго аде Бег аас Азп 230 асс ТЬг аад Ьув дЕд Уа1 дас Азр аад Ьуз 235 ааа ьув дЕЕ Уа1 дад О1и ССС Рго ааа Ьуз 240 720
Ес С ЕдЕ дас аад асЕ сас аса Еде сса ссд Еде сса дса ссЕ даа сЕс 768
Бег Суз АВр Ьуз ТЬг Ηίε ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи
245 250 255
сЕд ддд дда ссд Еса дЕс ЕЕс СЕС ЕЕС ССС сса ааа ссс аад дас асс 816
Ьеи (31у С1у Рго Бег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Авр ТЬг
260 265 270
сЕс аЕд аЕс Есс едд асс ССЕ дад дЕс аса Еде дЕд дЕд дЕд дас дьд 864
Ьеи МеЕ 11е Зег Агд ТЬг Рго <31и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Авр Уа1
275 280 285
аде сас даа дас ССЕ дад дЕс аад ЕЕс аас Едд Еас дЕд дас ддс дЕд 912
Зег ΗΪ3 С1и Азр Рго 61и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр 01у Уа1
290 295 300
дад дЕд саЕ ааЕ дсс аад аса аад ссд едд дад дад сад Еас аас аде 960
С1и Уа1 н!з АЗП А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и <31и <31П Туг Азп Зег
305 310 315 320
асд Еас сдЕ дЕд дЕс аде дЕс сЕс асс дЕс сЕд сас сад дас Едд СЕд 1008
ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Н1в С1п Азр Тгр Ьеи
325 330 335
ааЕ ддс аад дад Еас аад Еде аад дЕс ЕСС аас ааа дсс СЕС сса дсс 1056
Ав η 51у Ьуз <э1и Туг ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а
340 345 350
ссс аЕе дад ааа асс айс Есс ааа дсс ааа ддд сад ссс еда даа сса 1104
Рго Не <31и Ьуз ТЬг Не Зег ьуз А1а Ьуз <31у О1п Рго Агд (31и Рго
355 360 365
сад дЕд Еас асс сЕд ОСС сса Есс едд даЕ дад сЕд асс аад аас сад 1152
С1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр <31и Ьеи ТЬг Ьуз Авп С1п
370 375 380
дЕс аде сЕд асс Еде сЕд дЕс ааа ддс ЕЕС ЕаЕ ссс аде дас аЕс дсс 1200
Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе Туг Рго Бег Азр 11е А1а
385 390 395 400
- 133 016342
9Ьд Уа1 дад С1и Сдд Тгр дад О1и аде Зег 405 аас Азп ддд <31у сад <Э1п ссд Рго дад 31и 410 аас Азп. аас Азп Рас Туг аад Ьуз асе ТЬг 415 асд ТЬг 1248
ССР ссс дЬд РСд дас Ссс дас ддс Ссс ССс СЬс сЬс Сас аде аад ссс 1296
Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи
420 425 430
асе дьд да с аад аде адд ьдд сад сад ддд аас дСс ЬСс Сса Сдс Ссс 1344
ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд тгр αΐη С1п □1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег
435 440 445
дрд аЬд саС дад дсь сЬд сас аас сас рас асд сад аад аде сЬс Ссс 1392
Уа1 МеС Н1з 51и А1а Ьеи Н1з Азп Шз туг ТЬг <31п Ьуз Зег Ьеи Зег
450 455 460
сСд ЬсС ССС ддь 1404
Ьеи Зег Рго С1у
465
<210=· 7 <211> 1404 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220=· <223> Вектор рКЛ5196 - Тяжелая цепь версии 3 агликозил-ЗС9 <220>
<221> СЬ5 <222> (1> .. (1404) <400> 7
аЬд МеС 1 дас Азр ссс ддс сед аде Сдд тгр дСд ССс сСд дСд сСд дСд сСд аад ддс 48
РЬе (Э1у Ьеи 5 зег Уа1 РЬе Ьеи 10 Уа1 Ьеи Уа1 Ьеи Ьуз 15 С1у
д^д сад Сдс дад дьд сад сСд дСд дад аде ддс ддс дде сСд дСд сад 96
Уа1 С1п Суз <31и Уа1 О1п Ьеи Уа1 <31и Зег 01у 51у С1у Ьеи Уа1 (Э1п
20 25 30
ссс ддс ддс аде ссд адд сСд аде сде дсс дсс аде ддс СЬс асе ЬСс 144
- 134 016342
Рго С1у С1у 35 Бег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Бег СЯу РЬе ТЬг РЬе
40 45
аде сде Сае д<=д аСд аде Сдд дед сдс сад дсс ссс ддс аад ддс сед 192
Бег Агд Туг Уа1 Мее Бег Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз 01у Ьеи
50 55 60
дад £дд д*д дсс аде аЬс аде аде дда ддс сдс аед еас еас ССС дас 240
<31и Тгр Уа1 А1а Бег Не Бег Бег С1у С1у Агд Мее Туг Туг Рго Азр
65 70 75 80
асе д^д аад ддс еде еес асе аес аде сдс дас аас дсс аад аас аде 288
ТЬг Уа1 Ьуз е1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег
85 90 95
сед Сас сед сад аед аас аде сед сдс дсс дад дас асе дсс дед еас 336
Ьеи Туг Ьеи С1п МеС Азп Бег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг
100 105 110
бас Сде дсс еде ддс аде аЬс Сас дас ддс Ьас Сас д^д еес ссс еас 384
Туг Суз А1а Агд <з1у Бег 11е Туг Азр 01у Туг Туг Уа1 РЬе Рго Туг
115 12 0 125
ьдд ддс сад ддс асе сед дЬд асе дЬд аде есс дсс аде асе аад ддс 432
ТГр С1у С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Бег Бег А1а Зег ТЬг Ьуз 01у
130 135 140
ссе аде дед еес ссс сед дсс ссс аде аде аад аде асе аде ддс ддс 480
Рго Бег Уа1 РЬе Рго ьеи А1а Рго Зег Зег Ьуз Зег ТЬг Зег С1у О1у
145 150 155 160
асе дсс дсс сед ддс Сде сед дед аад дас Ьас еес ссс даа есд дед 528
ТЬг А1а А1а Ьеи 01у Суз Ьеи νβΐ Ьуз Азр Туг РЬе Рго С1и Рго Уа1
155 170 175
асд дед Сед ьдд аас еса ддс дсс сед асе аде ддс дед сас асе еес 576
ТЬг Уа1 Бег Тгр Азп Бег С1у А1а Ьеи ТЬг Бег 01у Уа1 ΗΪ5 ТЬг РЬе
180 185 190
сед дес дес сСа сад Ссс Сса дда сес еас есс сес аде аде дед д^д 624
Рго А1а Уа1 Ьеи О1п Бег Бег <Э1у ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1
195 200 205
- 135 016342
асе ТЬг дед Т7а1 210 ссс Рго Ссс Зег аде Зеп- аде Зег еед ддс асе ТЬг сад 31п асе ТЬг Сас Туг 220 аСс Не Сдс Суз аас Азп дед Уа1 672
ьеи 215 С1у
аас сас аад ссс еде аас асе аад дед дас аад ааа дСС дад ссс ааа 720
Азп Нхэ Ьуз Рго Зег Азп ТЫ Ьуз Уа1 Азр Ьуз Ьуз Уа1 С1и Рго Ьуз
225 230 235 240
СсС СдС дас аад асС сас аса Сдс сса ссд Сдс сса дса ССС даа сСс 768
зег Суз Азр Ьуз ТЬг Н13 ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго <31 и Ьеи
245 250 255
сСд ддд дда сед Сса дес ССс ССс ССс ССС сса ааа ссс аад дас асе 816
Ьеи <31у <Э1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго ьуз Авр ТЫ
260 265 270
сСс аСд асе Ссс едд асе ссС дад дСс аса Сдс дед дСд дед дас дед 864
Ьеи МеС 11е Зег Агд ТЬг Рго 31и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1
275 280 285
аде сас даа дас ссС дад дСс аад ССс аас едд Сас дед дас ддс дед 912
Зег Н13 01и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1
290 295 300
дад дед сас ааС дес аад аса аад ссд едд дад дад сад сас сад аде Э60
<31и Уа1 ΗΪ3 АЗП А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд 51и <31и 01п Туг С1п Зег
305 310 315 320
асд Сас сдС дед дСс аде дСс сСс асе дСс ссд сас сад дас едд ссд 1008
ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Н1з <31п Азр Тгр Ьеи
325 330 335
аас ддс аад дад сас аад Сдс аад дСс Ссс аас ааа дсс сСс сса дсс 1056
Азп С1у Ьуз <31и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а
340 345 350
ссс асе дад ааа асе аСс Ссс ааа дес ааа ддд сад ссс еда даа сса 1104
Рго Не (31и Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз 51у е1п Рго Агд 31и Рго
355 360 365
сад дед Сас асе сСд ссс сса Ссс едд дас дад сСд асе аад аас сад 1152
αΐη Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр <31и Ьеи ТЬг Ьуз Азп <31п
370 375 380
- 136 016342
дес Уа1 385 аде Зег сед ьеи асе ТЬг еде Суз ебд дес Ьеи Уа1 390 ааа Ьуз ддс С1у еес РЬе еае Туг 395 ссс аде дас Азр асе Не дес А1а 400 1200
Рго Зег
дед дад едд дад аде аае ддд сад ссд дад аас аас еас аад асе асд 1248
Уа1 С1и Тгр О1и Зег Азп С1у С1п Рго 61и Азп Азп Туг Ьуз ТЫ ТЬг
405 410 415
ссе ссс дед еед дас есс дас ддс есс еес еес сес еас аде аад сес 1296
Рго Рго νβΐ Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи
420 425 430
асе дьд дас аад аде адд едд сад сад ддд аас дес еес еса еде есс 1344
ТЫ Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр 61п С1п С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег
435 440 445
дед аед сае дад дсе сед сас аас сас еас асд сад аад аде сес есс 1392
Уа1 Меб Нтв <31и А1а Ьеи Ηίθ Азп Н1з Туг ТЬг □1п Ьуз Зег Ьеи Зег
450 455 450
сед есе ссс дде 1404
Ьеи Зег Рго С1у
465
<210? 8 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223> ПЦР-праймер для вариабельного домена тяжелой цепи мышиного 309
<400? 8
аддесЬадаа усессасаса саддггссад еддападас 39
<210? 9
<211? 39
<212? ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ПЦР-праймер для вариабельного домена тяжелой цепи мышиного 339
- 137 016342 <400>9 ддддаОаОсс ассаЪдгасЪ ЬсдддуЪдад сОкддОЦШ;39 <210> 10 <211>29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер для вариабельного домена легкой цепи мышиного ЗС9 <400>10 дсдЬсЪадаа сЪддаЕддЬд ддадаЕдда29 <210> 11 <211>39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер для вариабельного домена легкой цепи мышиного ЗС9 <400>11 ддддаЪаСсс ассаЪддабЪ ЪЪсаддЪдса даШ^Ъсад3 9 <210> 12 <211>33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер для конструирования тяжелой цепи химерного 309 <400>12 сЦдксСсСдс аддЪаадсСХ асасссссаЬ сЪд33 <210>13 <211>33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 138 016342 <223> ПЦР-праймер для конструирования тяжелой цепи химерного 309 <400>13 садабддддд ВдДаадсДЬа ссГдсадада сад33 <210>14 <211>35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер для конструирования легкой цопи химерного за э
<400> 14
ддсассаадс ЬддадаЬсба асдддсЬдаб дсЬдс 35
<210> 15
<211> 35
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ПЦР-праймер для конструирования легкой цепи химерного 369
<400> 15
дсадсаВсад сссдССадаС сЬссадсЬЬд дЕдсс 35
<210> 16
<211> 35
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ПЦР-праймер для конструирования легкой цепи химерного 369
<400>16 ддаасНДаса сСВдадсСдд сасЪдсаДдС саадд35 <210=·17 <211>35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 139 016342 <220 =
<223> ПЦР-праймер для конструирования легкой цепи химерного ЗС9
<400? 17
ссьедасаЪд садЪдссадс ЬсаадкдЬаа дЬЬсс 35
<210? 18
<211 = 24
<212 = днк
<213> Искусственная последовательность
<220 =
<223> ПЦР-прайьаер для конструирования версий 1 и 2 тяжелой цепи ЬцЗСЭ
<400> 18
дсЬдасадсд дссдсдддаЬ ссас 24
<210 = 19
<211= 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220 =
<223> ПЦР-праймер для конструирования версий 1 и 2 тяжелой цепи ЪиЗС9
<400 = 19
дсьсасддрс ассддЬСсдд дд 22
<210 = 20
<211 = 24
<212> днк
<213> Искусственная последовательность
<220?
<223> ПЦР-праймер для конструирования версий 1, 2 и 3 легкой цепи ЬиЗСЭ
<400 = 20
дсЬдасадсд дссдсдддаЪ ссас 24
<210 = 21
<211 = 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
- 140 016342 <220?
<223> ПЦР-прайыер для конструирования версий 1, 2 и 3 легкой цепи РыЗС9 <400?31 ддаадаДдаа сасасСдддС дсдд24 <2Ю>22 <211?109 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223? 5'-фосфорилированный олигонуклеотид верхней нити для тяжелой цепи ЗС9 <400?22 дсДдасадсд дссдсдддаС ссассаСдда ссРсддссСд адсЬдддСдС СссРддСдсС 50 ддСдсСдаад ддсдСдсадР дсдаддСдаС дсСддСддад адсддсддс109 <210?23 <211> 122 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223? 51-фосфорилированный олигонуклеотид верхней нити Для тяжелой цели 3(39 <400?23 ддссСддЬдс адсссддсдд садссСдадд сСдадсСдсд ссдссадсдд сССсассЪСс50 адссдсЪасд РдаЬдадсЦд ддрдсдссад дсссссддса адддссСдда дСдддСддсс120 ад122 <210?24 <211? 118 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223? 5'-фосфорилированный олигонуклеотид верхней нити для тяжелой цепи 369
- 141 016342 <400?24 сарсадсадс ддаддссдса ЁдЬасРассс сдасассдЬд аадддссдс! ДсассаЬсад60 ссдсдасадс дссаадааса дссЬдЪассР дсадаЬдаас адссЪдсдсд ссдаддас118 <210?25 <211? 102 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223? 5'-фосфорилированный олигонуклеотид верхней нити для тяжелой цепи 329 <400? 25 ассдссдрдь асЬасЬдсдс ссдсддсадс аЬсбасдасд дсбасЪасд! дЬСссссРас 50
Ьддддссадд дсасссСддР дассдрдадс Рссдссадса сс 102 <210? 26 <211? 111 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223? 5'-фосфорилированный олигонуклеотид верхней нити для тяжелой цепи ЗС9 <400?26 аадддсссса дсдЬдЬРссс ссДддссссс адсадсаада дсассадсдд сддсассдсс50 дсссРдддсС дссСддРдаа ддасРасСВс сссдаассдд РдассдЪдад с111 <210?27 <211? 26 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Олигонуклеотид нижней нити для тяжелой цели 309 <400? 27 дсВдсассад дссдссдссд сДсЬсс 25 <210? 28
- 142 016342 <21Ι> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 = <223> Олигонуклеотид нижней нити для тяжелой цепи 309 <400 =28 ссдсЬдсЬда СдсСддссас ссас24 <210 =29 <211>30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 = <22 3> Олигонуклеотид нижней нити для тяжелой цепи ЗС9 <4С0>
дсадСадЬас асддсддСдС ссСсддсдсд <210 = 30 <211= 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 = <223> Олигонуклеотид нижней нити для тяжелой цепи 3(39 <400 =30 дсЬддддссс ЬСддВдсбдд сдд23 <210=31 <211=109 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 = <223= 5'-фосфорилированный олигонуклеотид верхней нити для тяжелой цепи ЗС9 <400 = дсСдасадсд дссдсдддаД ссассаСдда сДЬсддсссд адсЬдддедК нссЬддДдсв
- 143 016342
ддсдс&даад ддсдьдсадс дсдаддДдса дсСддДддад адсддсддс 109
<210? 32
<211? 122
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220 =
<223 = 5'-фосфорилированный олигонуклеотид ; верхней нити для тяжелой цели 3(39
<400? 32
ддссЬддСдс адсссддсдд садссСдадд сЬдадскдсд ссдссадсдд СДДсассЫО 60
адссдсЬасд СдаЬдадсЬд ддсдсдссад дсссссддса адддссЪдда дЬдддЬддсс 120
ад 122
<210? 33
<211? 118
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220?
<223? 5'-фосфорилированный олигонуклеотид 1 верхней ниту [ для тяжелой цепи ЗС9
<400? 33
саСсадсадс ддаддссдса ДдСасЬассс сдасассдЬд аадддссдсЬ Ё.сасса1зсад 60
ссдсдасадс дссаадааса дссЬдСассС дсадаСдаас адссЪдсдсд седаддас 118
<210? 34
<211 = 102
<212> днк
<213> Искусственная последовательность
<220 =
<223 = 5'-фосфорилированный олигонуклеотид 1 верхней нитк [ для тяжелой цепи ЗС9
<400? 34
ассдссдьдд асбасЬдсдс ссдсддсадс аЬсСасдасд дс£ас±асд1: дЪ-ессссЪас 60
Ьддддссадд дсасссЬддД дассдЪдадс Сссдссадса сс 102
- 144 016342 <210? 35 <211> 111 <212? ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223:· 5' -фосфорилированный олигонуклеотид верхней нити для тяжелой цепи ЗС9 <400?35 аадддсссса дсдЬдЬ^ссс ссЕддссссс адсадсаада дсассадсдд сддсассдсс60 дсссДдддсЬ дссЬддСдаа ддасЕасЬЬс сссдаассдд ЬдассдСдад с111 <210:=36 <211? 26 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Олигонуклеотид нижней нити для тяжелой цепи 309 <400?36 дсЬдсассад дссдссдссд сЬсЬсс26 <210?37 <211?24 <212> ДНК <213? Искусственная последовательность <220?
<223> Олигонуклеотид нижней нити для тяжелой цепи 309 <400?37 ссдсЕдсЕда ЬдсСддссас ссас24 <210?38 <211?30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Олигонуклеотид нижней нити для тяжелой цепи 309
- 145 016342 <400>38 дсадСадСас асддсддСде ссЪсддсдсд30 <210>39 <2.1.=23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид нижней нити для тяжелой цепи 309 <400>39 дсДддддссс СЪддСдсДдд едд23 <210>40 <211>32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер для тяжелой цепи 369 <400>40 ссаСсадссд сдасаасдсс аадаасадсс Сд32 <210>41 <211>32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер для тяжелой цепи 309 <400>41 саддсФддЬс сЪддсд'ЬЬдС сдсддссдаЬ дд32 <210>42 <211> 106 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223> 5'-фосфорилированный олигонуклеотид верхней нити для легкой цепи ЗС9
- 146 016342 <400?42 дсЬдасадсд дссдсдддаЬ ссассаЪдда сЬЬссаддСд садаСсЬСса дсЬЬссЬдсД60 даСсадсдСд адсдЬдаСса Ъдадссдсдд сдадаСсдСд сСдасс106
<210? 43
<211? 117
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220?
<223? 5'-фосфорилированный олигонуклеотид верхней нити для легкой цепи ЗС9
<400? 43
сададссссд ссасссСдад ссСдадсссс ддсдададдд ссасссСдад сЬдсадсдсс60 адсадсадсд Ддадсадсад сДассрдрас ЬддЬассадс адаадсссдд ссаддсс117
<210? 44
<211? 117
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220?
<223? 5'-фосфорилированный олигонуклеотид верхней нити для легкой цепи 3<39
<400? 44
сссаддсьдС ддассЬасад сассадсаас сСддссадсд дсдЬдсссдС дсдсССсадс60 ддсадсддса дсддсассда сЬСсасссСд ассаСсадса дссЬддадсс сдаддас117
<210? 45
<211? 109
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220?
<223? 5'-фосфорилированный олигонуклеотид верхней нити для легкой цепи ЗС9
<400? 45
ЬРсдссдДдР асДЬсДдсса ссадСддадс ассСассссс ссаасСЬсдд сддсддсасс 60
- 147 016342 ааддрддада РсаадсдЬас ддрддссдса сссадРдЬдЕ РсаЬсРЬсс109 <210?46 <211?24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид нижней нити для легкой цепи 3(39 <400?46 дсддддсЬсЬ дддрсадсас даЬс24 <210?47 <211? 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Олигонуклеотид нижней нити для легкой цепи 309 <4 0 0 >4 7 ссасадссЬд ддддссЬддс сд22 <210?48 <211?24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Олигонуклеотид нижней нити для легкой цепи 3<39 <400?48 драсасддсд аадДссДсдд дсЬс24 <210?49 <211? 106 <212? ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223? 5'-фосфорилированный олигонуклеотид верхней нити для легкой цепи ЗС9
- 148 016342 <400>49 дсФдасадсд дссдсдддаъ ссассабдда сЬСссаддСд садаСсЬСса дсССссСдсС50 дабсадсдЪд адсдЪдаДса Ъдадссдсдд сдадаСсдЬд срдасс105 <210>50 <211?117 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 5'-фосфорилированный олигонуклеотид верхней нити для легкой цепи 369 <400?50 сададссссд ссасссЪдад ссЪдадсссс ддсдададдд ссасссДдад сЬдсадсдсс60 адсадсадсд Ддадсадсад сДассьдеас иддьассадс адаадсссдд ссаддсс117 <210?51 <211?117 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223? 5'-фосфорилированный олигонуклеотид верхней нити для легкой цепи 369 <400?51 сссаддсРдР ддаЬсЬасад сассадсаас сРддссадсд дсдЪдсссдс ссдсЬЬсадс60 ддсадсддса дсддсассда сСЬсасссрд ассаЬсадса дссЪддадсс сдаддас117 <210?52 <211?109 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223? 5'-фосфорилированный олигонуклеотид верхней нити для легкой цепи 369 <400? 52
ЬЕсдссдрдс асСасРдсса ссадЪддадс ассФассссс ссассДДсдд сддсддсасс 60 ааддЬддада СсаадсдЪас ддСддссдса сссадСдСдУ РсарсЬРсс 109
- 149 016342 <210? 53 <211? 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<22 3> Олигонуклеотид нижней нити для легкой цепи ЗС9 <400?53 дсддддсСсС дддЬсадсас дабе24 <210?54 <211? 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Олигонуклеотид нижней нити для легкой цепи 369 <400?54 ссасадссбд ддддссбддс сд22 <210?55 <211>24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Олигонуклеотид нижней нити для легкой цепи ЗС9 <400?55 дбасасддсд аадДссЬсдд дсСс24 <210?56 <211? 106 <212> ДНК <2.13> Искусственная последовательность <220?
<223? 5'-фосфорилированный олигонуклеотид верхней нити для легкой цепи 309 <400? 56
- 150 016342 дсЬдасадсд дссдсдддаЬ ссассаВдда сЁЬссаддЬд садаЁсЬЁса дсЁЁссЁдсЁ60 даЁсадсдЁд адсдЁдаЁса Ёдадссдсдд сдадаЁсдЁд сЁдасс106 <210=57 <211=117 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 = <223= 5'-фосфорилированный олигонуклеотид верхней нити для легкой цепи 369 <400>57 сададссссд ссасссЁдад ссЁдадсссс ддсдададдд ссасссЁдад СЁдсадсдсс60 адсадсадсд Ёдадсадсад сЁассЁдЁас ЁддЁассадс адаадсссдд ссаддсс117 <210>58 <211=117 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220= ' <223= 5'-фосфорилированный олигонуклеотид верхней нити для легкой цепи 369 <400>58 сссаддсЁдЁ ддаЁСЁасад сассадсаас сЁддссадсд дсаЁссссдс ссдсЁЁсадс60 ддсадсддса дсддсассда сЁЁсасссЁд ассаСсадса дссЁддадсс сдаддас117 <210>59 <211=109 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 = <223> 5'-фосфорилированный олигонуклеотид верхней нити для легкой цепи 369 <400=59
ЁЁсдссдЁдЁ асЁасЁдсса ссадЁддадс ассЁассссс ссассЁЁсдд сддсддсасс60 ааддЁддада ЁсаадсдЁас ддЁддссдса сссадЁдЁдЁ ёсэёсёёсс109
- 151 016342 <210> 60 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид нижней нити для легкой цепи ЗС9 <400> 60 дсддддсПс-Ь дддесадсас даре 24 <210> 61 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид нижней нити для легкой цепи ЗС9 <400>
ссасадссСд ддддссПддс сд <210> 62 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид нижней нити для легкой цепи ЗС9 <400>62 дПасасддсд аадДссПсдд дспс24 <210>63 <211>30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер для генерирования легкой цели ЗС9 <400;» дбсадсасда ЕсЬддссдсд дсПсаПдаПс
- 152 016342
<210? 64
<211? 30
<212? Дик
<213> Искусственная последовательность
<220?
<223> ПЦР-праймер для генерирования легкой цепи 3Θ9
<400? 64
даЬсаЬдадс сдсддссада СсдрдсЬдас 30
<210? 65
<211? 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220?
<223> ПЦР-праймер для генерирования легкой цепи 329
<4С0> 65
сссаддсСдс СдаДсЬасад сасс 24
<210? 66
<211? 24
<212? ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220?
<223? ПЦР-праймер для генерирования легкой цепи ЗС9
<400? 66
ддрдсЬдСад аЬсадсадсс Еддд 24
<210? 67
<211? 324
<212? Днк
<213> Искусственная последовательность
<220?
<223> Легкая цепь версии 1 ЬиЗбЭ
<220?
- 153 016342 <221? СПБ <222? (1} . . (324) <400?67
дад <Э1и 1 апс Пе дрд сРд асе ТЬг Б сад аде ССС Рго дсс А1а асе ТЬг 10 сРд Ьеи аде Зег сРд Ьеи аде Зег есс Рго 15 ддс 01у 48
Уа1 Ьеи (31п Зег
дад адд дсс асе сРд аде Рдс аде дсс аде аде аде дрд аде аде аде 96
С1и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Зег А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Бег Зег
20 25 30
Рас срд Рас сдд Рас сад сад аад ССС ддс сад дсс есс адд сРд Рдд 14 4
Туг Ьеи Туг Тгр Туг С1п Θΐη Ьуз Рго (Э1у С51п А1а Рго Агд Ьеи Тгр
35 40 45
аРс Рас аде асе аде аас сРд дсс аде ддс дрд ССС дрд еде РРс аде 192
Не Туг Зег ТЬг Зег Аеп Ьеи А1а Зег С1у Уа1 РГО Уа1 Агд РЬе Зег
50 55 60
ддс аде ддс аде ддс асе дас РРс асе сРд асе аре аде аде ерд дад 240
<31у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1и
65 70 75 80
ССС дад дас РРс дсс дрд Рас РРс Рдс сас сад Рдд аде асе Рас ССС 288
Рго <31и Азр РЬе А1а Уа1 Туг РЬе Суз Η1Ξ С1п Тгр Зег ТЬг Туг Рго
85 90 95
ССС асе РРс ддс ддс ддс асе аад дьд дад аРс аад 324
Рго ТЬг РНе С1у <31у С1у ТЬг Ьуз Уа1 01и 11е Ьуз
100 105 <210?58 <211?324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Легкая цепь версии 2 НиЗОД <220?
<221? СПЗ <222? (1)..(324)
- 154 016342 <400? 68
дад аЕс дЕд сЕд асе ТЫ 5 сад <31п аде Зег ссс Рго дсс А1а асе ТЫ 10 сЕд аде сЕд аде ссс ддс 48
<31и 1 Не ν&1 Ьеи Ьеи Бег Зег Рго 15 С1у
дад адд дсс асе сЕд аде Еде аде дсс аде аде аде дьд аде аде аде 96
<31и Агд А1а ТЫ Ьеи Бег Суз Бег А1а Зег Бег Бег Уа1 Зег Зег Зег
20 25 30
Рас ссд Сас ьдд Рас сад сад аад ссс ддс сад дсс ссс адд сЕд Едд 144
Туг Ьеи Туг Тгр Туг 61п С1п Ьуз Рго е1у 61п А1а Рго Агд Ьеи Тгр
35 40 45
аЕс Рас аде асе аде аас сЕд дсс аде ддс дЕд ссс дсс еде ЕЕс аде 192
Не Туг Зег ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Бег <31у Уа1 Рго А1а Агд РЬе Бег
50 55 60
ддс аде ддс аде ддс асе дас ЕЕС асе сЕд асе аЕс аде аде сЕд дад 240
01у Зег С1у Зег 61у ТЫ Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЫ Не Зег Бег Ьеи <Э1и
65 70 75 80
ссс дад дас ЕЕс дсс дрд Еас Еас Еде сас сад ьдд аде асе Еас ССС 288
Рго С1и АЗр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суе Н1е <31п Тгр Зег ТЬг Туг Рго
85 90 95
ссс асе еес ддс ддс ддс асе аад дЕд дад аЕс аад 324
Рго ТЬг РЬе (31у <Э1у С1у ТЬг Ьуз Уа1 <з1и Не Ьуз
100 105 <210> 69 <211> 324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Легкая цепь версии 3 ЬиЗбЭ <220>
<221? СПЗ
<222> (1) . . . (324)
<400> 69
дад аЕс дЕд сЕд асе сад аде ссс дсс асе сЕд аде сЕд аде ссс ддс 48
- 155 016342
С1и 1 Не Уа1 Ьеи ТЬг 5 С1п Зег Рго А1а ТЬг 10 ьеи Зег Ьеи Зег Рго О1у 15
дад адд дсс асе сРд аде Рде аде дсс аде аде аде дьд аде аде аде 96
<31и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Зег А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Бег Зег
20 25 30
Сас сед Рас рдд Рас сад сад аад ссс дде сад дсс ссс адд орд рдд 144
Туг Ьеи Туг Тгр Туг 01П (Пп Ьуз Рго С1у □1п А1а Рго Агд Ьеи Тгр
35 40 45
асе Сас аде асе аде аас сРд дсс аде ддс аРс ссс дсс еде РРс аде 192
Не Туг Зег ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег 01у Не РГО А1а Агд РЬе Зег
50 55 60
ддс аде ддс аде ддс асе дас РРс асе ерд асе аРс аде аде сРд дад 240
С1у Зег В1у Зег 01у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи <31и
65 70 75 80
ссс дад дас РРс дсс дрд Рас Рас Рде сас сад ьдд аде асе Рас ссс 28В
Рго С1и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз Ηίε С1п Тгр Зег ТЬг Туг Рго
85 90 95
ссс асе РРс ддс ддс ддс асе аад дрд дад аРс аад 324
Рго ТЬг РЬе С1у 01у С1у ТНг Ьуз νβΐ С1и 11е Ьуз
100 105 <210> 70 <2Η> 324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Легкая цепь версии 4 ИиЗСЗ <220>
<221> СЕЗ <222> (1) . . (324) <400> 70
сад аРе дрд сид асе сад аде ссс дсс асе сРд аде сид аде ссс ддс 48
αΐπ Не Уа1 Ьеи ТЬг С1п Зег Рго А1а ТЬг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 31у
1 5 10 15
- 156 016342
дад С1и адд Агд дес А1а асе ТЬг 20 сед Ьеи аде Зег Сдс Суе аде дес аде аде Зег аде Зег д^д ν&1 аде Зег 30 аде Зег аде Зег 96
Зег А1а 25 Зег
Сас сСд Сас Ддд Сас сад сад аад ссс ддс сад дес ссс адд сСд Сдд 144
Туг Ьеи Туг Тгр Туг σΐη <Э1п Ьуз Рго С1у С1п А1а Рго Агд Ьеи Тгр
35 40 45
аСс Рас аде асе аде аас сед дес аде ддс асе ссс дес сдс еес аде 192
Не Туг Зег ТЬг Зег Авп Ьеи А1а Зег С1у Не Рго А1а Агд РЬе Зег
50 55 60
ддс аде ддс аде ддс асе дас ССс асе сСд асе аСс аде аде сед дад 240
(31у Зег <31у Зег <31у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи 01и
65 70 75 80
ссс дад дас ССс дес дЛд Сас Сае Сдс сас сад едд аде асе Сас ссс 288
Рго Э1и Авр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз Нхз (Э1п Тгр Зег ТЬг Туг Рго
85 90 95
ССС асе СЬс ддс ддс ддс асе аад дед дад аСс аад 324
Рго ТЬг РЬе <31у <Э1у В1у ТЬг Ъуе Уа1 01и Не Ьуз
100 105 <210> 71 <211> 324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Легкая цепь версии 5 ЬиЗС9 <220>
<221> СОЗ
-:222=. (1) . . (324) <400=. 71
дад С1и 1 аСс дСд Не Уа1 сед Ьеи асе ТЬг 5 сад С1п аде Зег ссс дес асе Рго А1а ТИг 10 сед Ьеи аде Зег егд Ъеи аде Зег ссс Рго 15 ддс С1у 48
дад адд дес асе сСд аде Сдс аде дес аде аде аде дьд аде аде аде 96
- 157 016342
С1и Агд А1а тЬг Ьеи Зег Суз Бег А1а 25 Зег Зег Зег Уа1 Зег Зег 30 Бег
20
Ьас сед Ьас едд Ьас сад сад аад ССС ддс сад дсс ссс адд сед сед 144
Туг Ьеи Туг Тгр Туг 01X1 С1п Ьуз Рго 01у 01п А1а РГО Агд Ьеи Ьеи
35 40 45
аес Ьас аде асе аде аас сед дсс аде ддс аес ссс дсс сдс еес аде 192
Не Туг Бег ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег С1у Не РГО А1а Агд РЬе Зег
50 55 60
ддс аде ддс аде ддс асе дас еес асе сед асе аЬс аде аде сед дад 240
01у Зег 01у Бег 01у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Бег Бег Ьеи С1и
65 70 75 80
ссс дад дас еес дсс дед еас еас Сдс сас сад едд аде асе еас ссс 288
РгО 01и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз Нхз 01П Тгр Зег ТЬг Туг Рго
65 90 95
ссс асе ее с ддс ддс ддс асе аад дед дад аЬс аад 324
Рго ТЬг РЬе О1у 01у С1у ТЬг Ьуз Уа1 01и Не Ьуз
100 105 <210> 72 <211> 360 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Тяжелая цепь версии 1 Ьи369 <220>
<221= ССБ <222= (1)..(360) <400 = 72
дад дед апд сед дед дад аде ддс ддс ддс сед дед сад ссс ддс ддс 48
С1и Уа1 мег Ьеи Уа1 Е1и Зег 01у 01у 01у Ьеи Уа1 θΐη Рго С1у 01у
1 5 10 15
аде сед адд сед аде еде дсс дсс аде ддс еес асе аде сдс еас 96
5ег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег 01у РЬе ТЬг РЬе 5ег Агд Туг
25 30
- 158 016342
ДЕд Уа1 аЕд МеЬ аде Зег 35 Едд дкд сдс сад О1п дес А1а 40 ссс Рго ддс аад ддс сЬд дад Ьдд дЬд 144
тгр Уа1 Агд 01у Ьуз 01у Ьеи 45 С1и Тгр Уа1
дес аде акс аде аде дда ддс еде акд Ьас Ьас ссс дас асе дЕд аад 192
А1а Зег Не Зег Зег □1у С1у Агд Мек Туг Туг Рго Авр ТЬг Уа1 Ьуз
50 55 60
ддс сдс ккс асе акс аде еде дас аде дес аад аас аде сЬд Ьас сЬд 240
С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Авр Зег А1а Ьуз Авп Зег Ьеи Туг ьеи
65 70 75 80
сад акд аас аде скд еде дес дад дас асе дес дЕд Еас Ьас Ьде дес 288
С1п МеЬ Аэп Зег Ьеи Агд А1а С1и Авр ТЫ А1а Уа1 Туг Туг Суд А1а
85 90 95
сдс ддс аде акс кас дас ддс Ьас кас дЕд ььс ссс Ьас Едд ддс сад 336
Агд С1у Зег Не Туг Азр С1у Туг Туг Уа1 РЬе Рго Туг Тгр С1у С1п
100 105 но
ддс асе скд дЕд асе дЕд аде ксс 360
С1у ТЬг Ьеи уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120 <210> 73 <211? 360 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Тяжелая цепь версии 2 НиЗСЭ <220?
<221? СОЗ <222? (1)..(360) <400? 73
дад дкд сад 01п СЬд Ьеи дЕд Уа1 5 дад О1и аде Зег ддс 01у ддс С1у ддс О1у 10 сьд Ьеи дЬд сад ссс ддс ддс е1у 48
С1и 1 Уа1 νβΐ 61п Рго С1у 15
аде скд адд сЬд аде Еде дес дес аде ддс ььс асе ЬЬс аде еде Ьас 96
- 159 016342
Зег Ьеи Агд ьеи 20 Зег Суз А1а А1а Зег 25 С1у РЬе ТЬг РЬе Зег 30 Агд Туг
дед аЕд аде едд дед сдс сад дсс ссс ддс аад ддс сЕд дад едд дед 144
Уа1 меЕ Зег Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз <31у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
дсс аде аЕе аде аде дда ддс сдс аЕд Еас Еас ссс дас асс дед аад 192
А1а Зег Не Зег Зег С1у С1у Агд МеЕ Туг Туг Рго Азр ТЬг Уа1 Ьуз
50 55 60
ддс сдс ЕЕс асс аЕс аде сдс дас аде дсс аад аас аде сЕд Еас сЕд 240
<31у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Зег А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг Ьеи
65 70 75 80
сад аЕд аас аде сЕд сдс дсс дад дас асс дсс дед Еас Еас Еде дсс 288
□1п МеЕ Азп Зег ьеи Агд А1а б!и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз А1а
85 90 95
сдс ддс аде аЕс Еас дас ддс Еас Еас дЕд ЕЕс ССС Еас едд ддс сад 336
Агд С1у Зег Не Туг АЗр О1у Туг Туг Уа1 РЬе Рго Туг Тгр 61у 61п
100 105 но
ддс асс сЕд дЕд асс дед аде Есс 360
<Э1у ТЬг Ьеи. Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120 <210> 74 <211> 360 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Тяжелая цепь версий 3 и 5 ЬиЗС9 <220>
<221> СЬЗ <222> (1)..(360) <400> 74
дад дед сад с£д дед дад аде ддс ддс ддс сЕд дед сад ссс ддс ддс 48
С1и Уа1 С1л Ьеи Уа1 С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у е1у
1 5 10 15
- 160 016342
аде Бег сьд адд сед Ьеи 20 аде Зег Ддс дсс дсс А1а аде Зег 25 ддс 01у ССс РЬе асе ТЬг ССс аде сдс Агд сас Туг 96
Ьеи Агд Суз А1а РЬе Зег 30
ддд агд аде ьдд дьд сдс сад дсс ссе ддс аад ддс сСд дад Сдд дьд 144
Уа1 Мер Зег Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго б1у Ьуз 61у Ьеи б1и Тгр Уа1
35 40 45
дсс аде аСс аде аде дда ддс сдс аСд Сас Сас ссс дас асе дСд аад 192
А1а Бег Не Зег Зег е1у С1у Агд мер Туг Туг Рго Азр ТЬг ναΐ Ьуз
50 55 εο
ддс сдс ССс асе аре аде сдс дас аас дсс аад аас аде сСд Сас сСд 240
<Э1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг Ьеи
65 70 75 80
сад аСд аас аде сид сдс дсс дад дас асе дсс дЬд Сас Сас Сдс дсс 288
01п МеС Азп Зег Ьеи Агд А1а <31и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз А1а
85 90 95
сдс ддс аде аСс Сас дас ддс Сас Сас дьд ссе ССС Сас ьдд ддс сад 336
Агд С1у Зег 11е Туг Азр а1у туг Туг Уа1 РЬе РГО Туг Тгр С1у С1п
100 105 но
ддс асе оЬд дЬд асе дьд аде Ссс 360
<Э1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120 <210= 75 <211= 111 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Легкая цепь версии 1 ЬиЗБб <400= 75
Аер 11е Уа1 Ьеи ТЬг С1п Зег Рго А1а ТЬг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у
1 5 10 15
01и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег <31п Зег Уа1 Зег ТЬг Зег
20 25 30
- 161 016342
Бег Туг Зег 35 Туг МеЬ Туг Тгр Туг <31п 01п Ьуе Рго С1у <31п А1а Рго
40 45
Агд РЬе Ьеи 11е Ьуз Туг А1а Зег Азп Ьеи С1и Зег 01у 11е Рго А1а
50 55 60
Агд РЬе Зег С1у Зег <31у Зег О1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег
65 70 75 80
Зег Ьеи <31и Рго С1и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Сув 01п Н1з Азп Тгр
85 90 95
01и Не РГО РЬе ТЫ РЬе <31у 01у 61у ТЬг Ьуз Уа1 (31и Не Ьуз
100 105 но
<210? 76 <211? 111 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Легкая цепь версии 2 Ьи8Сб <400? 76
<31и 1 11е Уа1 Ьеи ТЬг 5 01п Зег Рго А1а ТЬг 10 Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 15 01у
С1и Агд А1а ТЬг Ьеи 5ег Суз Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег ТЬг Зег
20 25 30
Зег Туг Зег Туг Мес Туг Тгр Туг 61п 61п Ьуз Рго О1у С1п А1а Рго
35 40 45
Агд РЬе Ьеи Не Ьуз Туг А1а Зег Азп Ьеи О1и Зег С1у Не Рго А1а
50 5 5 60
Агд РЬе Зег <31у Зег С1у Зег <31у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег
65 70 75 80
Зег Ьеи 01и Рго С1и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз С1п Ηί3 Азп Тгр
85 90 95
- 162 016342
С1и Не Рго РЬе ТЬг РЬе С1у С1у 61у ТЬг Ьуа Уа1 61и Не Ьуз
100 105 110 <210? 77 <211? 111 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Легкая цепь версии 3 ЪиЙЕб <400? 77
0111 1 Не Уа1 ьеи ТЬг 5 С1п Зег Рго А1а ТЬг Ьеи 10 Зег Ьеи Зег Рго 15 С1у
(31и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суа Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег ТЬг Зег
20 25 30
Зег Туг Зег Туг ИеЬ Туг Тгр Туг С1п О1п Ьув Рго 01у О1п А1а Рго
35 40 45
Агд Ьеи Ьеи 11е ьуз Туг А1а Зег Азп Ьеи С1и Зег 61у Не Рго А1а
50 55 60
Агд РЬе Зег <31у Зег <31у зег (31у ТЫ Азр РЬе ТЫ Ьеи ТЬг Не Зег
65 70 75 80
Зег ьеи Н1и Рго <31и Азр ₽Ье А1а Уа1 туг Туг Суз С1п ΗΪ5 Азп Тгр
В5 90 95
С1и Не Рго РЬе ТЬг РЬе (31у С1у е1у ТЫ Ьуз Уа1 (Э1и Не Ьуз
100 105 110
<210? 78 <211? 126 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Тяжелая цепь версии 1 ЬиЗСб <400? 73
- 163 016342
01η Уа1 1 (31п Ьеи Уа1 5 С1п Зег (31у А1а <31и 10 Уа1 Ьуз Ьуз Рго С1у А1а 15
Зег Уа1 Ьуе Уа1 Зег Суз Ьуз 61у Зег Зег Туг ТЬг РЬе ТЬг Абр Туг
20 25 30
А1а МеС ΗΪ3 Тгр Уа1 Агд Ьеи А1а Рго С1у С1п С1у Ьеи <Э1и Тгр 11е
35 40 45
С1у Уа1 11е Зег ТЬг Туг Туг С1у Азп ТЬг Азп Туг Азп С1П Ьуз РЬе
50 55 60
Ьуз С1у Агд А1а ТЬг МеЬ ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Не Зег ТЬг А1а Туг
65 70 75 30
МеЕ <31и Ьеи Зег Агд Ьеи Агд Зег Азр Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд 61у <Э1у Ьеи Агд Агд О1у Азр Агд Рго Зег Ьеи Агд Туг А1а
100 105 110
МеЬ Азр Туг Тгр <31у <31 η (31у ТЬг Ьеи νβΐ ТЬг Уа1 Зег Зег
115 12 0 125
<210> ’ 79
<211> : 126
<212> Белок
<213> Искусственная [ последовательность
<220>
<223> Тяжелая цепь ΐ версии 2 Ьи8С6
<400 1? 79
<31п Уа1 Θ1Π Ьеи νβΐ (31П Зег <31у А1а 01и Уа1 Ьуз Ьуз Рго 31у А1а
1 5 10 15
Зег \7а1 Ьуз 7а1 Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг ТЫ РЬе ТЬг Азр Туг
20 25 30
А1а МеЬ ΗΪ3 Тгр Уа1 Агд Θ1Π А1а Рго С1у С1п О1у Ьеи С1и ТГр Не
35 40 45
- 164 016342
01у Уа1 Не Зег ТЬг Туг Туг С1у Азп ТЬг Авп Туг Азп С1п Ьуз РЬе
50 55 60
Буе <31у Агд А1а ТЬг МеС ТЬг Уа1 Азр Ьуз Бег Не Бег ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
МеС С1и Ьеи Зег Агд Ьеи Агд Зег Авр Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд О1у 61у Ьеи Агд Агд С1у Азр Агд Рго Зег Ьеи Агд Туг А1а
100 105 110
МеС Азр Туг Тгр 61у С1п С1у ТЬг ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Бег Зег
115 120 125
<210> ВО
<211> 126
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Тяжелая цепь версии 3 йи8С6
<400> ВО
□1п Уа1 <31п Ьеи Уа1 О1п Зег <31у А1а С1и Уа1 Ьув Ьув Рго С1у А1а
1 5 10 15
Бег Уа1 Ьув Уа1 Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг ТЬг РЬе ТЫ Азр Туг
20 25 30
А1а МеС Н1в Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у <31п С1у Ьеи С1и Тгр МеС
35 40 45
С1у Уа1 Не Зег ТЬг Туг Туг С1у Азп ТЬг Азп Туг Азп 61п Ьуз РЬе
50 55 60
Ьуз (31у Агд А1а ТЬг МеЬ ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Не Зег ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
МеС 0111 ьеи Зег Агд Ьеи Агд Зег Азр Авр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Су в
85 90 95
- 165 016342
А1а Агд (31у 61у Ьеи Агд Агд С1у Авр Агд Рго Зег Ьеи Агд Туг А1а
100 105110
Меб Азр Туг Тгр <31у С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120125 <210> 81 <211>97 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Мышиная последовательность тяжелой цепи для ЕиЗС9 <400= 81
<31и Уа1 1 Мед Ьеи Уа1 5 С1и Зег О1у <31у С1у 10 Ьеи Уа1 Ьуз Рго С1у 15 С1у
Зег Ьеи Ьуз Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬд РЬе Зег Агд Туг
20 25 30
Уа1 МеЁ Зег тгр Уа1 Агд 01п ТЬг Рго С1и Ьуз Агд Ьеи <31и Тгр Уа1
35 40 45
А1а Зег Не Зег Зег С1у □1у Агд МеЬ Туг Туг Рго Азр ТЬг Уа1 Ьуз
50 55 60
(31у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Зег А1а Агд Азп 11е Ьеи Туг Ьеи
65 70 75 80
<31п МеЬ Зег Зег Ьеи Агд Зег <Э1и Азр ТЬг А1а МеЬ Туг Туг Суз А1а
85 90 95
Агд <210> 82 <211= 97 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
- 166 016342 <223? Последовательность тяжелой цепи 369НУ1 для НиЗСЭ <400? 82
О1и Уа1 1 МеС Ьеи Уа1 5 Ши Зег Шу Шу Шу 10 Ьеи Уа1 Шп Рго Шу 15 Шу
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег Шу РЬе ТЬг РЬе Бег Агд Туг
20 25 30
Уа1 Ме! Зег Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьув С1у Ьеи Ши Тгр Уа1
35 40 45
А1а Зег Не Бег Зег Шу С1у Агд МеС Туг Туг Рго Азр ТЬг Уа1 Ьуз
50 55 60
С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Зег А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг Ьеи
65 70 75 80
Шп Мес Азп Зег Ьеи Агд А1а Ши Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз А1а
85 90 95
Агд <210? 83 <211? 97 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Последовательность тяжелой цепи ЗС9НУ2 для ЬиЗСЭ <400? 83
О1и Уа1 1 Е1п Ьеи Уа1 5 С1и Зег Шу Шу С1у Ьеи 10 Уа1 Шп Рго Шу 15 Шу
зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег Шу РЬе ТЬг РЬе Зег Агд Туг
20 25 30
Уа1 МеЬ Зег Тгр Уа1 Агд Шп А1а Рго Шу Ьуз (31у Ьеи Ши Тгр Уа1
35 40 45
- 167 016342
А1а Зег Не Зег Зег С1у С1у Агд Мее Туг Туг Рго Азр ТЬг Уа1 Ьуз
50 55 80
С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Зег А1а Ьуз Авп Зег Ьеи Туг Ьеи
65 70 75 80
01п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Авр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз А1а
85 90 95
Агд <210= 84 <211> 97 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220 = <223> Последовательность тяжелой цепи ЗСЭНУЗ для ЬиЗСЭ <40 0 > 84
(31и ν&1 1 С1п Ьеи Уа1 5 (31и Зег 01у (Пу С1у Ьеи 7а1 е1п 10 Рго 01у 15 01у
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Агд Туг
20 25 30
Уа1 Мее Зег Тгр Уа1 Агд <31п А1а РГО 01у Ьуз С1у Ьеи 01и тгр Уа1
35 40 45
А1а Зег Не Зег Зег 01у С1у Агд Мее Туг Туг Рго Азр ТЬг Уа1 Ьуз
50 55 60
<31у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз АЗП Зег Ьеи Туг Ьеи
65 70 75 80
σΐη Мее АЗП Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз А1а
85 90 95
Агд
- 168 016342 <210=· 85 <211? 76 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Последовательность тяжелой цепи УНЗ-7 для ЬиЗО9 <400? 85
<31и Уа1 1 31п Ьеи Уа1 5 31и Зег С1у <з1у О1у ьеи 10 ча1 <31п Рго <31у 15 С1у
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег <31у РЬе ТЬг РЬе Зег Тгр Уа1
20 25 30
Агд С1п А1а Рго <31у Ьуз С1у Ьеи (31и Тгр Уа1 А1а Агд РЬе ТЬг 11е
35 40 45
Зег Агд Аер Азп А1а ьуз Азп Зег Ьеи Туг Ьеи <31п меь Азп Зег Ьеи
50 55 60
Агд А1а С-1и Азр ТЬг А1а ”а1 Туг Туг Суз А1а Агд
65 70 75
<210? 86
<211? 98
<212> : Белок
<213> : Искусственная последовательность
<220?
<223> 1 Чышиная последовательность легкой цепи для ЬиЗС9
<400? : 86
31п 11е Уа1 Ьеи ТНг αΐη Зег Рго А1а 11е МеР Зег А1а Зег РГО О1у
1 5 10 15
С1и Ьуз Уа1 ТЬг Ьеи ТЬг Суз Зег А1а Азп Зег Зег Уа1 Зег Зег Зег
20 25 30
Туг Ьеи Туг Тгр Туг С1п 31п Ьуз Зег 31у Зег Зег Рго Ьуз Ьеи Тгр
40 45
- 169 016342
11е Туг Зег ТЬг Зег Азп Ьеи А1а 55 Бег С1у Уа1 Рго \7а1 Агд 60 РЬе Бег
50
01у Зег С1у Зег С1у ТЬг Бег РЬе Бег Ьеи ТНг Не Зег Бег Мер 01и
65 70 75 80
А1а 01и Азр А1а А1а Зег Туг РЬе Суз Шз 01п Тгр Бег ТЬг Туг Рго
90 95
Рго ТЫ <210> 87 <211> 98 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность легкой цепи ЗС9ЬУ1 для ЬиЗбЭ <400> 87
01и 1 11е Уа1 Ьеи ТЬг 01η 5 Бег Рго А1а ТНг ьеи 10 Зег Ьеи Зег Рго 15 31у
01и Агд А1а ТЬг Ьеи Бег Суз Бег А1а Бег Бег Бег Уа1 Зег Бег Бег
20 25 30
Туг Ьеи Тут Тгр Туг С1п О1П Ьуз Рго С1у С1п А1а Рго Агд Ьеи Тгр
35 40 45
Не Туг Бег ТЬг Бег Азп Ьеи А1а Бег 01у Уа1 Рго Уа1 Агд РЬе Бег
50 55 60
01у Бег С1у Зег С1у ТЬг Авр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Бег Ьеи 01и
65 70 75 80
Рго 01и Азр РЬе А1а Уа1 Туг РЬе сув Н1з 01п Тгр Бег ТЬг Туг Рго
85 90 95
РГО ТЬг
- 170 016342 <210> 88 <211> 98 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Последовательность легкой цепи 369ЬУ2 для ЬиЗС9 <400?83
(31и 1 11е Уа1 Ьеи ТНг С1п 5 Зег Рго А1а ТЬг 10 Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 15 С1у
С1и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Зег А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Зег Зег
20 25 30
Туг Ьеи. Туг тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у (31п А1а Рго Агд Ьеи Тгр
35 40 45
Т1е Туг Зег ТЬг зег АЗП Ьеи А1а Зег С1у Уа1 Рго А1а Агд РЬе Зег
50 55 60
С1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зец Зег Ьеи В1и
65 70 75 80
Рго С1и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз Н13 С1п Тгр Зег тьг туг Рго
35 90 95
Рго ТЬг <210>39 <211>98 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Последовательность легкой цепи 369ЬУЗ для ЬиЗСЭ <400? 89
31и 11е Уа1 Ьеи ТЬг <31п Зег Рго А1а ТЬг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у
10 15
- 171 016342
<31и Агд А1а ТЬг 20 Ьеи Бег Сув Бег А1а 25 Бег Зег Зег Уа1 Зег 30 Бег Зег
Туг Ьеи Туг Тгр Туг С1П С1п Ьуз Рго 01у С1п А1а Рго Агд Ьеи Тгр
35 40 45
Не Туг Бег ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Бег <31у Не Рго А1а Агд РЬе зег
50 55 60
О1у Бег 01у Бег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи 61и
65 70 75 80
Рго <31и Аер РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз ΗΪ3 С1п Тгр Бег ТЬг туг Рго
85 90 95
Рго ТЬг <210> 90 <211> 98 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность легкой цепи ЗС9ЬУ4 для ЬиЗС9 <400> 90
С1п Не Уа1 Ьеи ТЬг С1п Бег Рго А1а ТЬг Ьеи Зег Ьеи Бег Рго Сйу
1 5 10 15
С1и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Зег А1а Бег Бег Зег Уа1 Зег Бег Бег
20 25 30
Туг Ьеи туг Тгр туг Θΐη С1п Ьуз Рго О1у <Э1п А1а Рго Агд Ьеи Тгр
35 40 45
Не Туг Бег ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Бег С1у Не Рго А1а Агд РЬе Зег
50 55 60
С1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Аер РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Бег Ьеи О1и
70 75 80
- 172 016342
Рго 01и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз Н1з <31 η Тгр Зег ТЬг Туг Рго
9095
Рго тлг <210?91 <211?98 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность легкой цепи ЗС9ЬУ5 для ЬиЗСЗ <400>91
Б1и 1 Не Уа1 Ьеи ТЬг 5 С1п Зег Рго А1а ТЬг 10 Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 15 С1у
51и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Зег А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Зег Зег
20 25 30
Туг Ьеи Туг Тгр Туг Θΐη С1п Ьуз Рго 01у 61п А1а Рио Агд Ьеи Ьеи
35 40 45
Не туг Зег ТНг Зег АЗП Ьеи А1а Зег С1у Не Рго А1а Агд РЬе Зег
50 55 60
С1у Зег С1у Зег <31у ТНг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи <31и
65 70 75 80
Рго О1и АЗр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз ΗΪ5 <31п Тгр Зег ТЬг Туг Рго
85 90 95
Рго ТЬг <210?92 <211?71 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220?
- 173 016342 <223> Последовательность легкой цепи Ь6 для ЬиЗС9 <400>92
(31и 1 Не Уа1 Ьеи ТЬг <31 η 5 Зег Рго А1а ТЬг 10 Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 15 01у
С1и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Зег Тгр Туг О1п 01п Ьуз Рго С1у С1п
20 25 30
А1а Рго Агд Ьеи Ьеи Не Туг 01у Не Рго А1а Агд РЬе Зег 01у Зег
35 40 45
01у Зег 01у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег ьеи С1и Рго С1и
50 55 60
Азр РЬе А1а 7а1 Туг Туг Суз
6570 <210>93 <211>98 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Мышиная последовательность тяжелой цепи для Ьи86б <400> 93
01п Та1 С1п Ьеи С1п С1п Зег С1у Рго С1и Ьеи Уа1 Агд Рго С1у 15 Уа1
1 5 10
Зег Уа1 Ьуз Не Зег Суз Ьуз 01у Зег Зег Туг ТЬг РЬе ТЬг Азр Туг
20 25 30
А1а МеС Н1з Тгр Уа1 Ьуз Ьеи Зег Ηίε А1а Ьуз Зег Ьеи <31и Тгр 11е
35 40 45
С1у Уа1 Не Зег ТЬг Туг Туг 01у Азп ТЬг Азп Туг Азп С1п Ьуз РЬе
50 55 60
Ьуз <31у Ьуз А1а ТЬг МеЬ ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Зег Зег ТЬг А1а Туг
65 70 75 ВО
- 174 016342
Мее С1и Ьеи А1а Агд Ьеи ТЬг Зег С1и Азр Зег А1а Уа1 Туг Туг Суз
9095
А1а Агд <210=94 <211>93 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность тяжелой цепи 8С6НУ1 для КиЗСб <400>94
С1п Уа1 <31п Ьеи Уа1 (31п Зег С1у А1а 61и Уа1 Ьуз Ьуз ΡϊΌ С1у А1а
1 5 10 15
Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег Суз Ьуз С1у Зег Зег Туг ТЬг РЬе ТЬг Азр Туг
20 25 30
А1а Мее ΗΪ3 Тгр Уа1 Агд Ьеи А1а Рго <31у С1п <31у Ьеи С1и Тгр Не
35 40 45
<31у Уа1 11е Зег ТЬг Туг Туг <31у Аеп ТЬг Азп Туг Азп С1П Ьуз РЬе
50 55 60
Ьуз С1у Агд А1а ТЬг Мес ТЬг Уа1 Азр ьуз Зег 11е 5ег ТЬг А1а Туг
65 70 75 Θ0
МеЁ <31и Ьеи Зег Агд Ьеи Агд Бег АЗр АЗр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд <210=95 <211=93 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220 =
- 175 016342 <223> Последовательность тяжелой цепи 8С6НУ2 для ИиЙСб <400?95
С1п 1 Уа1 С1п Ьеи Уа! 5 Б1п Зег С1у А1а С1и Уа! 10 Ьуз Ьуз Рго С1у 15 А1а
Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг Тйг Рйе Тйг Авр Туг
20 25 30
А1а МеЬ Н1з Тгр Уа! Агд С1п А1а Рго О1у 51п С1у Ьеи 0111 Тгр 11е
35 40 45
(Ну Уа! 11е Зет ТЙГ Туг Туг 61у Азп тйг Азп туг Азп е1п Ьуз Рйе
50 55 60
Ьуз С1у Агд А1а Тйг меЬ тйг Уа1 Азр ьуз Зег 11е Зег Тйг А1а Туг
65 70 75 80
меь С1и Ьеи Зег Агд Ьеи Агд Зег Азр Азр Тйг А! а Уа! Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд <210?96 <211?98 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Последовательность тяжелой цепи 8Е6НУЗ для НиВСб <400? 96
□1п Уа1 1 <31п Ьеи Уа1 5 <Э1п Зег О1у А1а С1и 10 Уа! Ьуз Ьуз Рго С1у 15 А1а
Зег Уа1 Ьуз Уа! Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг ТЬг РИе ТНг Азр Туг
20 25 30
А1а МеЬ Н1з Тгр Уа! Агд 61п А1а Рго С1у <31п С1у Ьеи <Э1и Тгр МеЬ
35 40 45
- 176 016342
<31у Уа1 50 11е Зег ТЬг Туг Туг <31у Абп ТЬг Азп Туг Азп С1п Ьуз РЬе
55 60
Ьуз С1у Агд А1а ТЬг Мер ТЬг Уа1 Азр Ьуз Бег 11е Зег ТЬг А1а Туг
65 70 75 30
Мес. (31и Ьеи Зег Агд Ьеи Агд Зег Азр Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
90 95
А1а Агд <210>97 <211?76 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность тяжелой цепи УН1-2 ! для ΐ ЬибСб
<400> ! 37
01п Уа1 <31п Ьеи Уа1 С1п Зег <31у А1а С1и Уа1 Ьуз Ьуз Рго О1у А1а
1 5 10 15
Зег ν&ι Ьуз Уа1 Бег Суэ Ьуз А1а Бег С1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Тгр Уа1
20 25 30
Агд С1п А1а Рго С1у С1п С1у Ьеи (31и Тгр МеС О1у Агд ν»ι ТЬг Мес
35 40 45
ТЬг Агд Азр ТЬг Бег 11е Бег ТЬг А1а Туг МеЬ 01и Ьеи Зег Агд Ьеи
50 55 60
Агд Бег Азр Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суа А1а Агд
7075 <210>98 <211>99 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
- 177 016342 <223> Мышиная последовательность легкой цепи для ЬиВбб <400?98
Авр 1 11е Уа1 Ьеи ТЬг 5 <31п Зег Рго А1а Зег 10 Ьеи А1а Уа1 Зег Ьеи 15 <31у
О1п Агд А1а 11е Не Зег Суз Агд А1а Зег С1п Зег ν&1 Зег ТЬг Зег
20 25 30
Зег Туг Зег Туг МеЕ Туг Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у <31п Зег Рго
35 40 45
Ьуз РЬе Ьеи Не Ьуз Туг А1а Зег Азп Ьеи 61и Зег С1у ν&ι Рго А1а
50 55 60
Агд РЬе Зег С1у Зег <31у Зег (31у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи Азп 11е ΗΪ3
55 70 75 80
Рго Уа1 О1и С1и <31и Азр ТЬг А1а ТЬг Туг Туг Суз <31п ΗΪ8 Азп Тгр
85 90 95
С1и 11е Рго <210>99 <211>99 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Последовательность легкой цепи 8С6ЬУ1 для ЬиЗСб <400> 99
Азр 1 11е Уа1 Ьеи ТЬг С1п 5 Зег Рго А1а ТЬг Ьеи 10 Зег Ьеи Зег Рго 15 <31у
С1и Агд А1а ТЫ Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег 31п Зег Уа1 Зег ТЬг Зег
20 25 30
Зег Туг Зег Туг МеЕ туг Тгр Туг <31 п αΐη Ьуз Рго 61у <31п А1а Рго
35 40 45
- 178 016342
Агд РЬе 50 Ьеи Не Ьуз 1уг А1а 55 Зег Азп Ьеи С1и Зег С1у Не 60 Рго АТа
Агд РЬе Зег СТу Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег
65 70 75 80
Зег Ьеи (ЗТи Рго С1и Азр РЬе А1а УаТ Туг Туг Суз С1п ΗΪ5 Азп Тгр
85 90 95
С1и Не Рго <210> 100 <211? 99 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность легкой цепи 8ебЪУ2 для Ио8С6
ТПП
<31и 1 Не УаТ Ьеи ТЬг 5 <31п Зег Рго А1а ТЬг 10 Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 15 <Э1у
(ЗТи Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Агд АТа Зег αΐη Зег УаТ Зег ТЬг Зег
20 25 30
Зег Туг Зег Туг МеЬ Туг Тгр Туг <31п (ЗТп Ьуз Рго О Ту (ЗТп АТа Рго
35 40 45
Агд РЬе Ьеи Не Ьуз Туг АТа Зег Азп Ьеи ети Зег ету Не Рго А1а
50 55 60
Агд РЬе Зег (ЗТу Зег С1у Зег СТу ТЬг Аер РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег
65 70 75 80
Зег ьеи С1и Рго С1и Азр РЬе АТа УаТ Туг Туг Суз (ЗТп Н18 Азп Тгр
85 90 95
<31и Не Рго
- 179 016342
<210? 101
<211? 10 .
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220?
<223> Последовательность СОК1 тяжелой цепи для антитела 866
<400? 101
Зег Туг ТЬг РЬе ТЫ Азр Туг А1а Мес Ηίθ
1 5 10
<210? 102
<211? 10
<212> Белок
<213? Искусственная последовательность
<220?
<223> Последовательность С0К1 тяжелой цепи для антитела 1А8
<400? 102
Зег Туг ТЬг РЬе ТЬг Азр Туг ТЬг МеС Нтз
1 5 10
<210? 103
<211? 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220?
<223> Последовательность СРК1 тяжелой цели для антител 2В1 и 369
<400? 103
31у РЬе ТНг РНе Зег Агд Туг Уа1 НеЬ Зег
1 5 10
<210? 104
<211? 10
<212> Белок
- 180 016342 <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Последовательность СОК1 тяжелой цепи для антитела 2А1 <400?104
С31у Туг Азр РЬе Азп Азп Азр Ьеи 11е Е1и
1510 <210?105 <211> 10 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220?
<223? Последовательность СОК1 тяжелой цепи для антитела 2С2 <400?105
С1у Туг А1а РЬе ТЬг Азп Туг Ьеи Не 61и
1510 <210? 106 <211>17 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Последовательность СОК2 тяжелой цепи для антитела 866 <400? 106
7а1 11е 5ег ТЬг Туг Туг <31у Азп ТЬг Азп Туг Азп <31п Ьуз РЬе Ьуз
10 15
61у <210?
107 <211?
<212>
Белок <213>
Искусственная последовательность
- 181 016342 <220=· <223> Последовательность СЬК2 тяжелой цепи для антитела 1А8 <400> 107
Уа1 11е Азр ТЬг Туг Туг С1у Ьуз ТЬг Азп Туг Азп С1п Ьув РЬе 31и
10 15
С1у <210> 108 <211> 16 <21Ξ> Белок <213> Искусственная последовательность <220=· <223> Последовательность СБЙ2 тяжелой цепи для антитела 2В1 <400>108
Зег Не Зег Зег <31у С1у Зег ТЬг Туг Туг Рго Азр Зег Уа1 Ьуз С1у
1015 <210>109 <211> 16 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность СОК.2 тяжелой цепи для антитела ЗС9 <400>109
Зег 11е Зег Зег С1у С1у Агд МеС Туг Туг Рго Авр ТЬг Уа1 Ьуз С31у
1015 <210> 110 <211>17 <212> Белок <213> Искусственная последовательность
- 182 016342 <220?
<223> Последовательность СОП2 тяжелой цепи для антитела 2А1 <400?110
Уа1 11е Азп Рго 61у Зег 61у Агд ТЬг Азп Туг Азп 61и Ьуз РЬе Ьуз
1015 <31у <210? 111 <211>17 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220?
<22 3> Последовательность СБК.2 тяжелой цепи для антитела 262 <400?111
Уа1 11е Зег Рго С1у Зег С1у 11е 11е Азп Туг Азп 61и Ьуз РЬе Ьуз
1015 <31у <210? 112 <211?17 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Последовательность СОКЗ тяжелой цели для антитела 866 <400? 112
С1у С1у Ьеи Агд Агд С1у Азр Агд Рго Зег Ьеи Агд Туг А1а МеЬ Азр
10 15
Туг
- 183 016342 <210> 113 <211> 17 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Последовательность СРКЗ тяжелой цепи для антитела 1А8 <400>113
С1у С1у РЬе Агд Агд С1у Азр Агд Рго Бег Ьеи Агд Туг А1а МеЬ Азр
1015
Зег <210>114 <211? 12 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Последовательность СРКЗ тяжелой цепи для антитела 2В1 <400>114
О1у А1а Т1е Туг Азр <31у Туг Туг Уа1 РЬе А1а Туг
1510 <210>115 <211> 12 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Последовательность СБКЗ тяжелой цепи для антитела 369 <400> 115
61у Бег Не Туг Азр 01у Туг Туг 7а1 РЬе Рго Туг
Ю <210> 116
- 184 016342
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность СБК.З тяжелой цепи для антитела 2А1
<400> 116
Не Туг Туг Э1у Рго Нтз Зег Туг А1а Мее Азр Туг
1 5 10
<210> 117
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность СБЕ.З тяжелой цепи для антитела 262
<400 = 117
Не Авр Туг Зег С1у Рго Туг А1а Уа1 Азр Азр
1 5 10
<210> 118
<211 = 15
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220 =
<223> Последовательность СБК1 легкой цепи для антитела 866
<400 = 118
Агд А1а Зег 61п Зег Уа1 Зег ТЬг Зег Зег Туг Зег туг Мее туг
1 5 10 15
<210> 119
<211> 15
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
- 185 016342 <220?
<223> Последовательность СЬВ1 легкой цепи для антитела 1А8
<400? 119
Агд А1а Зег 31п Зег Та1 Зег 11е Зег ТЬг Туг Зег Туг 11е Ηίθ
1 5 10 15
<210? 120
<211? 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220?
<223> Последовательность СБВ1 легкой цепи для антитела 2В1
<400? 120
Зег А1а Зег Зег Зег 7а1 Зег Зег Зег Туг Ьеи Туг
1 5 10
__ П 7 Л ·-. £. XV Ί Ί Ί XX X
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220?
<223> Последовательность СОК1 легкой цепи для антитела ЗС9
<400? 121
Зег А1а Азп Зег Зег Уа! Зег Зег Зег Туг Ьеи Туг
1 5 10
<210? 122
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220?
<223> Последовательность СОК1 легкой цепи для антитела 2А1
<400? 122
- 186 016342 ьуз А1а Зег ьеи Азр Уа1 Агд ТЫ А1а Уа1 А1а
10 <210? 123 <211? 11 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Последовательность СПК1 легкой цели для антитела 262 <400?123
Ьуз А1а Зег βΐη А1а Уа1 Азп ТЫ А1а Уа1 А1а
1510 <210?124 <211?7 <212> Белок <213? Искусственная последовательность <220?
<223> Последовательность ΟϋΚ2 легкой цепи для антител 866 и 1А8 <400?124
Туг А1а Зег Азп Ьеи 61и Зег <210?125 <211?7 <212? Белок <213? Искусственная последовательность <220?
<223> Последовательность СЬН1 легкой цепи Для антител 2В1 и 369 <400? 125
Зег ТЫ Зег Азп Ьеи А1а Зег
5
- 187 016342
<210? 125
<211? 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220?
<223> Последовательность СВД2 легкой цепи для антитела 2А1
<400? 126
Зег А1а Зег Туг Агд Туг ТЫ
1 5
<210? 127
<211? 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220?
<223> Последовательность СБК2 легкой цепи для антитела 262
<400? 127
Зег А1а Зег Туг С1п Туг ТЫ
1 5
<210? 123
<211? 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220?
<223> Последовательность СБКЗ легкой цепи для антитела 866
<400? 128
η Ηί3 Авп Тгр 61и 11е Рго РЬе ТЫ
1 5
<210? 129
<211? 9
<212> Белок
- 188 016342
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность СЬКЗ легкой цепи для антитела 1Ά8
<400=> 129
<31η Н1з Зег Тгр <31и 11е Рго Туг ТЬг
1 5
<210> 130
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность СОЕЗ легкой цепи для антитела 2В1
<400> 130
Ηίβ Θΐη Τζρ Зег Зег Туг Рго Рго ТЬг
1 5
<210ь 131
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность СБКЗ легкой цепи для антитела 369
<400> 131
ΗίΒ εΐη Тгр Зег ТЬг Туг Рго Рго ТЬг
1 5
<210> 132
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность СБКЗ легкой цепи для антитела 2А1
- 189 016342 <400>132
61η 61п Н1з Туг 61у 11е Рго Тгр ТЬг <210>133 <211>9 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность СЭК.З легкой цепи для антитела 262 <400>133
С1п Н1з Нтз Туг 61у Уа1 Рго Тгр ТЬг <210>134 <211>99 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность легкой цепи ЗЕбЬУЗ для ЬиЙСб <400> 134
61и 1 Не Уа1 ьеи ТЬг 61п 5 Зег Рго А1а ТЬг Ьеи 10 Бег Ьеи Зег Рго 15 С1у
С1и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Агд А1а Бег <Э1п Бег Уа1 Зег ТЬг Зег
20 25 30
Бег туг зег Туг Мер Туг Тгр Туг 61П <31п Ьуз Рго 61у С1п А1а Рго
35 40 45
Агд Ьеи Ьеи Не Ьуз Туг А1а Бег АЗП ьеи С1и Бег б1у Не Рго А1а
50 55 60
Агд РНе Зег 61у Зег 61у Зег С1у ТЬг АЗр РЬе ТЬг Ьеи тЬг Не Бег
65 70 75 80
- 190 016342
Зег Ьеи. С1и Рго С1и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз С1п Н1з Азп. Тгр
9095
О1и Не Рго <210>135 <211>70 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность легкой цепи Ьб ДЛЯ ЬибБб <400=135
С1и 1 Не Уа1 Ьеи ТЬг С1п Зег Рго А1а ТЬг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго В1у 15
5 10
□ 1и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у С1п А1а
20 25 30
Рго Агд Ьеи Ьеи Не Туг (31у Не Рго А1а Агд РЬе Зег С1у Зег С1у
35 40 45
Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи <31и Рго С1и Азр
50 55 60
РНе А1а Уа1 туг туг Суз
5570 <210=136 <211=237 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220 =
<223> Вектор рКД3195 - Легкая цепь версии 5 ЗС9
<400 = 136
МеС Авр РЬе <31п Уа1 (31П Не РЬе Зег РЬе Ьеи Ьеи Не Зег Уа1 Зег
1 5 10 15
- 191 016342
та1 11е Мер Зег 20 Агд Й1у 01и 11е Уа1 ьеи тЬг αΐη зег 25 Рго 30 А1а ТЬг
Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 31у <31и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Зег А1а Зег
35 40 45
Зег Зег Уа1 Зег Зег Зег Туг Ьеи Туг Тгр Туг 31П 31П Ьуз Рго С1у
50 55 60
С1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи 11е Туг Зег ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег 31у
65 70 75 80
Не Рго А1а Агд РЬе Зег (31у Зег <31у Зег С1у ТЬг АЗр рЬе ТЬг Ьеи
85 90 95
ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1и Рго С1и Азр РЬе А1а Уа1 туг Туг Суз Н1з
100 105 110
(Э1п тгр Зег ТЬг Туг Рго ₽го ТЬг РЬе С1у 31у О1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и
115 120 125
Не Ьуз Агд ТЬг Уа1 А1а А1а Рго Зег Уа1 РЬе Не РЬе Рго Рго Зег
130 135 14 0
Азр С1и (Э1п Ьеи Ьуз Зег 61у ТЫ А1а Зег Уа1 Уа1 Суз Ьеи Ьеи Азп
145 150 155 160
Азп РЬе Туг Рго Агд О1и А1а Ьуз Уа1 31п Тгр Ьуз Уа1 Азр Азп А1а
165 170 175
Ьеи С1п Зег <Э1у Азп Зег βΐη С1и Зег Уа1 ТЬг <31и С1п Азр Зег Ьуз
180 185 190
Азр Зег ТЬг Туг Зег Ьеи Зег Зег ТЬг Ьеи ТЫ Ьеи Зег Ьуз А1а Авр
195 200 205
Туг С1и Ьуз ΗΪΞ Ьуз Уа1 Туг А1а Суз 31и Уа1 ТЬг ΗΪ8 С1п С1у Ьеи
210 215 220
Зег Зег РГО Уа1 ТЬг Ьуз Зег РЬе АЗП Агд О1у С1и Суз
225 230 235
- 192 016342 <210= 137 <211? 468 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220 =
<223> Вектор рК33189 - Тяжелая
<400? 137
Мер Азр РЬе 01у Ьеи Зег Тгр Уа1
1 5
Уа1 01п Суз <31и Уа1 С1п Ьеи Уа1
20
Рго 01у <31у Зег Ьеи Агд Ьеи Зег
35 40
Зег Агд Туг Уа1 Мер Зег Тгр \7а1
50 55
<3111 Тгр Уа1 А1а Зег 11е Зег Зег
65 70
ТЬг Уа1 Буз 01у Агд РЬе ТЬг 11е
85
Беи Туг Ьеи О1п Мер Азп Зег Ьеи
100
Туг Суз А1а Агд С1у Зег Не туг
115 120
Тгр С1у 01п <Э1у ТЬг ьеи Уа1 ТЬг
130 135
Рго Зег Уа1 РНе Рго Ьеи А1а Рго
145 150
ТЬг А1а А1а Ьеи С1у Суз Ьеи Уа1
165
цепь версии 3 ( 309
РЬе Ьеи 10 Уа1 Ьеи Уа1 Ьеи Ьуз 15 е1у
С1и 25 Зег 01у 01у 01у Ьеи 30 Уа1 01л
Суз А1а А1а Зег С1у 45 РЬе ТНг РНе
Агд С1п А1а Рго 60 С1у Ьуз <31у Ьеи
Е1у 01у Агд 75 Мер Туг Туг Рго Азр 80
Зег Агд 90 Авр АВП А1а Ьуз Азп 95 Зег
Агд 105 А1а О1и Азр ТЬг А1а но Уа1 Туг
Азр С1у Туг Туг Уа1 125 РЬе Рго Туг
Уа1 Зег Зег А1а 14 0 Зег ТЬг Ьуз 01у
Зег Зег Ьув 155 Зег ТЬг Зег 01у 51у 160
Ьуз Азр 170 Туг РЬе Рго 01и РГО 175 Уа1
- 193 016342
ТЬг Уа! Зег Тгр 180 Азп Зег С1у А1а Ьеи 185 ТЬг Зег С1у Уа1 Нхз 190 ТЬг РЬе
Рго А1а Уа1 Ьеи <Э1п Зег Зег 31у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1
195 200 205
ТЬг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи 31у ТЬг С1п ТЬг Туг Не Сув Азп Уа1
210 215 220
Азп Н13 Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьув Уа1 Авр Ьув Ьув Уа1 <31и Рго Ьуз
225 230 235 240
Зег Суз Азр Ьуз ТЬг Н1з ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго 01и Ьеи
245 250 255
Ьеи С1у О1у Рго Зег Уа! РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр Ткг
260 265 270
Ьеи мес Не зег Агд ТЬг Рго <31и Уа! ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1
275 280 385
Зег ΗΪ3 01и АЗр Рго (31 и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1
290 295 300
<31и Уа! Н13 Азп А1а Ьуз ТЬг Ьув Рго Агд С1и С1и □1п Туг АЗП Зег
305 310 315 320
ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Ηί.3 С1п Азр Тгр Ьеи
325 330 335
Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуэ Суз Ьув Уа! Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а
340 345 350
Рго Не 01и Ьуз ТЬг Не Зег Ьуз А1а Ьув С1у Θΐη Рго Агд С1и Рго
355 360 365
С1п УЭ1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи ТЬг Ьуз Азп αΐη
370 375 380
Уа! Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа! Ьуз <31у РЬе Туг Рго Бег Авр Не А! а
385 390 395 400
- 194 016342
ν&1 01 и Тгр С1и Зег 405 Азп 01 у О1ц Рго (51и 410 Азп Азп Туг Ьуз ТЬг 415 ТЬг
Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи
420 425 430
ТЬг Ча1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр <31п 01п Е1у Азп Ча1 РЬе Зег Суз Зег
435 440 445
Уа1 МеЬ ΗΪ3 С1и А1а Ьеи Н1з АЗП ΗΪ3 Туг ТЬг <31п Ьуз Зег Ьеи зег
450 455 460
Ьеи Зег Рго С1у
465 <210? 138 <211? 468 <212? Белок <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Вектор рКЛ3196 - Тяжелая цепь версии 3 агликозил-ЗСЭ <400? 138
меь 1 Азр рЬе С1у Ьеи 5 Зег Тгр Уа1 РЬе Ьеи Уа1 10 Ьеи Уа1 Ьеи Ьуз 15 С1у
Уа1 С1п Суз <31и Уа1 Е1П Ьеи Уа1 <31и Зег 61у С1у <31у Ьеи Уа1 01п
20 25 30
Рго С1у <31у Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег <Э1у РЬе ТЬг РЬе
35 40 45
Зег Агд Туг Уа1 МеЬ Зег Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи
50 55 60
01и Тгр Уа1 А1а Зег Не Зег Зег <31у <Э1у Агд МеЬ Туг Туг Рго Азр
65 70 75 80
ТЬг Уа1 Ьуз 01у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Авр Азп А1а Ьуз Азп зег
85 90 95
- 195 016342
Вен Туг Ьеи <31п Мес Азп Зег Ьеи Агд А1а 105 31и Азр ТЬг А1а 110 Уа1 Туг
100
Туг Суе А1а Агд С1у Зег 11е Туг Азр С1у Туг Туг Уа1 РЬе Рго Туг
115 120 125
Тгр 61у С1п О1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз С1у
130 135 14 0
Рго Зег Уа1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго Зег Зег Ьуз Зег ТЬг Зег 01у 01у
145 150 155 160
ТЬг А1а А1а Ьеи 01у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго 01и Рго Уа1
165 170 175
ТЬг Уа1 Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи ТЬг Зег 01у Уа1 Нтз ТЬг РЬе
180 185 190
Рго А1а Уа1 Ьеи С1п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег ьеи Зег Зег Уа1 Уа1
195 200 205
ТЬг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи <31у ТЬг 01П ТЬг туг 11е Суз Азп Уа1
210 215 220
АЗП Нтз Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Ьуз Уа1 01и Рго Ьуз
225 230 235 240
Зег Суз Азр Ьуз ТЬг Нтз ТЬг суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго О1и ьеи
245 250 255
Ьеи С1у 01у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе РГО Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг
260 265 270
Ьеи МеС 11е Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1
275 2Θ0 285
Зег Нтз <31и Азр Рго <Э1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр 01у Уа1
290 295 300
61и Уа1 Нтз Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд О1и 51и 01п Туг 01п зег
305 310 315 320
- 196 016342
ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи 330 ΗΪ8 61п Азр Тгр 335 Ьеи
325
Азп 61у Ьуз б1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег АЗП Ьуз А1а Ьеи Рго А1а
340 345 350
Рго Не <Э1и Ьуз ТЬг Не Зег Ьуз А1а Ьуз О1у С1п Рго Агд С1и Рго
355 360 365
61 η Уа1 туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи ТЬг Ьуз Азп <31п
370 375 380
Уа1 Зег Ьеи ТЬг суз Ьеи Уа1 Ьуз 61у РЬе Туг Рго Зег Азр Не А1а
385 390 395 400
Уа1 <31и Тгр д1и Зег Азп 61у <31п Рго 61и Азп Азп Туг ьуз ТЬг ТЬг
405 410 415
Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр <31у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи
420 425 430
ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п О1у Азп Уа1 РЬе Зег суз Зег
435 440 445
Уа1 МеЬ Ηίθ 01и А1а Ьеи Н1з Азп Ηΐθ Туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег
450 455 460
Ьеи Зег РГО 31у
465 <210? 139 <211? 108 <212? Белок <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Легкая цепь версии 1 ЬиЗС9 <400? 139
О1и Не Уа1 Ьеи ТЬг (Э1п Зег Рго А1а ТЬг Ьеи Зег ьеи Зег Рго С1у
1 5 10 15
- 197 016342
С1и Агд Д1а ТЫ Ьеи Зег Суз Зег А1а 25 Зег Зег Зег Уа1 Зег 30 Зег Зег
20
Туг Ьеи Туг Тгр Туг (31п 61п Ьуе Рго <31у 01п А1а Рго Агд Ьеи Тгр
35 40 45
Не Туг Зег ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег С1у Уа1 Рго Уа1 Агд РЬе Зег
50 55 60
С1у Зег 01у Зег С1у ТЫ Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЫ 11е Зег Зег Ьеи 01и
65 70 75 80
Рго <31и Аэр РЬе А1а Уа1 Туг РЬе Суз Н1в 01п Тгр Зег ТЫ Туг Рго
85 90 95
Рго ты РЬе 01у О1у 01у ТИг Ьуз Уа1 О1и Не Ьуз
100 105 <210> 140 <211> 108 <212> Белок <213> Искусственная последовательность
<220?
<223> Легкая цепь ι версии 2 ЬиЗС9
<400? : 140
О1и 11е Уа1 Ьеи ТЬг 01п Зег Рго А1а ты ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у
1 5 10 15
<31и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Зег А1а зег Зег Зег Уа1 Зег Зег Зег
20 25 30
Туг Ьеи Туг Тгр Туг С1п Θΐη Ьуз Рго С1у С1п А1а Рго Агд Ьеи Тгр
35 40 45
Не Туг Зег ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег С1у Уа1 Рго А1а Агд РЬе Зег
50 55 60
<31у Зег <51у Зег С1у ты Аэр РЬе ТЬг Ьеи ТЫ Не Зег Зег Ьеи 01и
65 70 75 80
- 198 016342
Рго С1и Азр РЬе А1а \'а1 Туг Туг Суз Н1з С1п Тгр Зег ТЬг Туг Рго
9095
Рго ТЬг РЬе С1у 01у С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз
100105 <210?141 <211? 108 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Легкая цепь версии 3 ЬиЗС9 <400? 141
01и 1 Не Уа1 Ьеи ТЬг 5 <31п Зег Рго А1а ТЬг 10 Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 15 Б1у
С1и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Зег А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Зег Зег
20 25 30
Туг Ьеи Туг Тгр Туг 61л <31п Ьуз Рго Б1у Б1л А1а Рго Агд Ьеи Тгр
35 40 45
Не Туг Зег ТЬг Зег АЗП ьеи А1а Зег Й1у Не Рго А1а Агд РЬе Зег
50 55 60
Й1у Зег <31у Зег <31у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи 01и
65 70 75 80
Рго Н1и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз Н13 С1п Тгр Зег ТЬг Туг Рго
85 90 95
Рго ТЬг РЬе С1у С1у 01у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз
100 105
<210? 142 <211? 108 <212> Белок
- 199 016342 <213? Искусственная последовательность <220?
<223? Легкая цепь версии 4 ЬиЗЕЭ <400?142
С1п 1 Не Уа1 Ьеи ТЫ С1п 5 Зег Рго А1а ТЬг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у
10 15
<31ы Агд А1а ТЫ Ьеи Зег Суз Зег А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Зег Зег
20 25 30
Туг Ьеи Туг Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго б1у С1п А1а Рго Агд Ьеи Тгр
35 40 45
Не Туг Зег ТЫ Зег Азп Ьеи А1а Зег <31у 11е Рго А1а Агд РЬе Зег
50 55 50
С1у Зег <31у Зег <31у ТЫ Азр РЬе ТЫ Ьеи ТЫ Не Зег Зег Ьеи <31и
55 7ϋ 75 80
Рго С1и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз ΗΪ3 О1п Тгр Зег ТЬг Туг Рго
85 90 95
Рго ТЫ РЬе С1у 01у С1у ТЫ Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз
100105 <210>143 <211? 108 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Легкая цепь версии 5 Ьи369 <400> 143
<31и 1 11е Уа1 Ьеи ТЫ 5 С1п Зег Рго А1а ТЫ Ьеи 10 Зег Ьеи Зег РГО 15 31у
<31и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Зег А1а Зег Зег Яег Уа1 Зег Зег Зег
20 25 30
- 200 016342
Туг ьеи Туг Тгр Туг 01П С1П Ьуз Рго 01у е1п А1а Рго Агд 45 Ьеи Ьеи
35 40
Не Туг Зег Тйг Зег Азп Ьеи А1а Зег 01у Не Рго А1а Агд РИе Зег
50 55 60
01у Зег 01у зег 01у Тйг Азр РИе Тйг Ьеи Тйг Не Зег Зег Ьеи <31и
65 70 75 80
Рго 01и Азр Рйе А1а Уа1 Туг Туг суз Н1з 01п Тгр Зег Тйг Туг Рго
85 90 95
Рго ТНг Рйе 01у 01у С1у Тйг Ьуз Уа1 О1и Не Ьуз
100 105 <210> 144 <211> 120 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Тяжелая цепь версии 1 НиЗСЭ
<400> 144
01и Уа1 МеЬ Ьеи Уа1 С1и Зег Э1у 61у С1у Ьеи Уа1 Θΐη Рго 01у <31у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег суз А1а А1а Зег В1у РИе ТЙГ РИе Зег Агд туг
20 25 30
Уа1 МеЬ Зег Тгр Уа1 Агд 01п А1а Рго О1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
А1а Зег Не Зег Зег <31у С1у Агд МеЬ Туг Туг Рго Азр ТНг Уа1 Ьуз
50 55 60
01у Агд РИе ТНг Не Зег Агд Азр Зег А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг Ьеи
65 70 75 80
С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а 01и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз А1а
85 90 95
- 201 016342
Агд <Э1у Зег 11е Туг Азр С1у Туг Туг Уа1
РЬе
Рго
Туг
Тгр
31у
31п
100
105
110
С1у ТЫ Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120 <210? 145 <211? 120 <212> Белок <213? Искусственная последовательность <220?
<223> Тяжелая цепь версии 2 ЬиЗС9 <400? 145
01и 1 Уа1 01η Ьеи Уа1 5 31и Зег С1у С1у С1у Ьеи 10 Уа1 01п Рго С1у 15 С1у
Зег Ьеи Агд Ьеи зег Суе А1а А1а Бег С1у РЬе ТЬг РЬе Бег Агд Туг
20 25 30
Уа1 МеЕ Зег Тгр Уа1 Агд <3111 А1а РГО (31у Ьуз С1у Ьеи <31и Тгр Уа1
35 40 45
А1а Зег Не зег Зег О1у <э1у Агд МеЕ Туг Туг Рго Авр ТЬг Уа1 Ьуз
50 55 60
СЯу Агд РЬе ты 11е Зег Агд Азр Зег А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг Ьеи
65 70 75 90
С1п МеЕ Азп Зег Ьеи Агд А1а О1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз А1а
85 90 95
Агд С1у Зег 11е Туг Азр С1у Туг Туг Уа1 РЬе Рго Туг Тгр С1у С1п
100 105 110
С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120
<210? 146 <211? 120
- 202 016342 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Тяжелая цепь версий 3 и 5 ЬиЗС9 <400> 146
<31и 1 Уа1 С1п Ьеи Уа.1 31и Зег 01у С1у 01у Ьеи Уа! С1п Рго С1у 15 С1у
5 10
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Сув А1а А1а Зег О1у РЬе ТЬг Р1те Зег Агд Туг
20 25 30
Уа1 Мер Зег Тгр Уа! Агд σΐη А1а Рго □1у Ьув □1у Ьеи О1и Тгр Уа1
35 40 45
А1а Зег Не Зег Зег С1у 31у Агд МОЁ Туг Туг Рго Азр ТЬг Уа! Ьув
50 55 60
<31у Агд РЬе ТЪг Не Зег Агд Азр Авп. А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг Ьеи
65 70 7Е £0
αΐη Мер Аэп Зег Ьеи Агд А1а <Э1и Адр ТЬг А! а Уа! Туг Туг Суз А1а
85 90 95
Агд С1у Зег Не Туг Авр С1у Туг Туг Уа! РЬе Рго Туг Тгр С1у С1п
100 105 110
<31у ТЬг Ьеи Уа.1 ТЬг Уа! Зег Зег
115 120
<210> 147 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, используемый для амплификации олигонуклеотидных стандартных матриц <400> 147 са^ддссСИс сдЬдС^ссДа
- 203 016342
<210> 14 8
<211> 16
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Олигонуклеотидный праймер, используемый для амплификации
олигонуклеотидных стандартных матриц
<400> 146
дсддсасдЬс адаЬсс 16
<210э 14 9
<211> 16
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
< 22 0 >
<223> Зонд для узнавания 3ΑΌΡΗ
<400> 14 9
ссссааидид ъссдис 16
<210> 150
«211> 63
<212> днк
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ПЦР-праймер, используемый для амплификации первой нити РНК
<400> 150
ддссад^даа ^Сд^аа^асд асссасоаоа дддаддсддТ: 1: ΐ: ϋ ΐ: 1: ΐ: 1: г £. ΐ: I: ΐ: ό С ί: ί 1: ΐ. 1: Ь ϊΐ:ί
<210> 151
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<22С>
- 204 016342 <223> ГК4 человека, полученный из консенсусной каркасной последовательности <400>151
Тгр С1у С1п <31у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
1510 <210>152 <211> 10 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ГР.4 человека, полученный из консенсусной каркасной последовательности <400> 152
РЬе (31у С1у С1у ТЬг Ьуз Уа1 <31и Не Ьуз
10

Claims (85)

1. Гуманизированное антитело, полученное из исходного антитела мыши, которое специфически связывается с ανβ6, где указанное гуманизированное антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 1 и вариабельный домен легкой цепи с последовательностью аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 2.
2. Гуманизированное антитело по п.1, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит определяющие комплементарность области (СЭР), характеризуемые аминокислотными остатками 31-35 (СОРТ), 50-65 (СЭР2) и 98-109 (СЭР3) последовательности 8Е0 Ю N0: 1; и/или вариабельный домен легкой цепи содержит определяющие комплементарность области (СОК), характеризуемые аминокислотными остатками 24-35 (СОРТ), 51-57 (С0Р2) и 90-98 (СЛЕЗ) последовательности 8Е0 Ю N0:2; и/или вариабельный домен тяжелой цепи содержит каркасные участки (ЕР), характеризуемые аминокислотными остатками 1-30 (ЕК1), 36-49 (ЕК2), 66-97 (ЕК3) и 110-120 (ЕК4) последовательности 8Е0 Ю N0: 1; и/или вариабельный домен легкой цепи содержит каркасные участки (ЕК), характеризуемые аминокислотными остатками 1-23 (ЕК1), 36-50 (ЕК2), 58-89 (ЕК3) и 99-108 (ЕК4) последовательности 8Е0 Ю N0: 2.
3. Гуманизированное антитело по п.1, содержащее по меньшей мере одну аминокислотную замену в вариабельном домене тяжелой цепи или легкой цепи в последовательностях СОРТ, последовательностях СОР2, последовательностях 0ΌΕ3 или каркасных последовательностях.
4. Гуманизированное антитело по п.3, содержащее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи 8Е0 Ю N0: 144.
5. Гуманизированное антитело по п.3, специфически связывающееся с ανβ6 и полученное из исходного гибридомного штамма 3С9 АТСС РТА-3649, где указанное гуманизированное антитело содержит СОРЕ СОР2, 0ΌΕ3 вариабельного домена тяжелой цепи и СОР1, 0ΌΕ2 и 0ΌΕ3 вариабельного домена легкой цепи и где указанное антитело содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 Ю N0: 144, 8Е0 Ю N0: 145 или 8Е0 Ю N0: 146.
6. Гуманизированное антитело по п.3, специфически связывающееся с ανβ6 и полученное из исходного гибридомного штамма 3С9 АТСС РТА-3649, где указанное гуманизированное антитело содержит СОР1, СОР2, 0ΌΕ3 вариабельного домена тяжелой цепи и СОРЕ 0ΌΕ2 и 0ΌΕ3 вариабельного домена легкой цепи и где указанное антитело содержит последовательность вариабельного домена легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 Ю N0: 139, 8Е0 ГО N0: 140, 8Е0 ГО N0: 141, 8Е0 ГО N0: 142 и 8ЕС ГО N0: 143.
7. Гуманизированное антитело, полученное из исходного антитела мыши, которое специфически связывается с ανβ6, где гуманизированное антитело содержит каждую из СОР1, СОР2, 0ΌΕ3 тяжелой цепи и СОР1, 0ΌΕ2 и 0ΌΕ3 легкой цепи и где указанное антитело содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 146 (НУ3) и последовательность вариабельного домена легкой цепи 8ЕС ГО N0: 143 (ЪУ5).
8. Гуманизированное антитело по п.1 или 7, где исходное антитело представляет собой мышиное антитело 3С9.
- 205 016342
9. Гуманизированное антитело по п.1 или 7, где указанное антитело может конкурировать с мышиным антителом 309 за связывание с ανβ6.
10. Гуманизированное антитело по п.1 или 7, где указанное антитело получают с использованием рекомбинантного вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую указанное антитело.
11. Гуманизированное антитело по п.10, где указанный рекомбинантный вектор является плазмидой, выбранной из группы, состоящей из рК18195, рК18189 и рКЛ8196. где плазмида рКЭ§195 содержит 8Е0 ГО N0: 5; плазмида рК1§189 содержит 8ЕЦ ГО N0: 6 и плазмида рК1§196 содержит 8ЕЦ ГО N0: 7.
12. Гуманизированное антитело, полученное из исходного антитела мыши 309, которое специфически связывается с ανβ6, причем гуманизированное антитело содержит версию 3 вариабельного домена тяжелой цепи (НУ3), продуцируемую рекомбинантным вектором, содержащим плазмиду рК1§189 (8ЕЦ 10 N0: 6), и версию 5 вариабельного домена легкой цепи (ЬУ5), продуцируемую рекомбинантным вектором, содержащим плазмиду рК1§195 (8ЕЦ ГО N0: 5).
13. Гуманизированное антитело, полученное из исходного антитела мыши 309, которое специфически связывается с ανβ6, причем гуманизированное антитело содержит дегликозилированную версию 3 вариабельного домена тяжелой цепи (а-НУ3), продуцируемую рекомбинантным вектором, содержащим плазмиду рК1§196 (8ЕЦ ГО N0: 7), и версию 5 вариабельного домена легкой цепи (ЬУ5), продуцируемую рекомбинантным вектором, содержащим плазмиду рК1§195 (8ЕЦ ГО N0: 5).
14. Выделенное антитело, которое специфически связывается с ανβ6, или антигенсвязывающий фрагмент антитела, которое связывается с ανβ6, где антитело содержит любую из последовательностей тяжелой цепи, выбранных из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 1, 8ЕЦ ΙΌ N0: 144, 8ЕЦ ΙΌ N0: 145 и 8Е0 ΙΌ N0: 146, или любую из последовательностей легкой цепи, выбранных из группы, состоящей из δΕΟ ГО N0: 2, 8Ер ГО N0: 139, 8Ер ГО N0: 140, δΕΟ ГО N0: 141, δΕΟ ГО N0: 142 и δΕΟ ГО N0: 143.
15. Способ рекомбинантного получения антитела по любому из пп.1-14, включающий получение рекомбинантного вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, которая кодирует любую аминокислотную последовательность из δΕΟ ГО N0:1, 2, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145 или 146, и экспрессию указанного рекомбинантного вектора в клетке-хозяине в условиях, обеспечивающих продукцию антитела с любой из последовательностей δΕΟ ГО N0: 1, 2, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145 или 146, и выделение указанного антитела, продуцированного указанной клеткой-хозяином.
16. Способ по п.15, в котором указанный рекомбинантный вектор дополнительно содержит слитый ген, кодирующий легкую цепь гуманизированного иммуноглобулина, причем указанный ген содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую СЭК., происходящую из легкой цепи нечеловеческого антитела, имеющего специфичность связывания в отношении ανβ6, и каркасную область, происходящую из легкой цепи антитела человека.
17. Способ по п.15, в котором указанный рекомбинантный вектор выбран из группы, состоящей из плазмиды рК18195, плазмиды рК18189 и плазмиды рК18196.
18. Способ по п.15, в котором указанный рекомбинантный вектор дополнительно содержит слитый ген, кодирующий тяжелую цепь гуманизированного иммуноглобулина, причем указанный ген содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую СЭК, происходящую из тяжелой цепи нечеловеческого антитела, имеющего специфичность связывания в отношении ανβ6, и каркасную область, происходящую из тяжелой цепи антитела человека.
19. Способ по п.16 или 18, в котором нечеловеческим антителом является мышиное антитело 309.
20. Способ по п.16 или 18, в котором нечеловеческим антителом является мышиное антитело 806.
21. Рекомбинантная клетка-хозяин, которая экспрессирует гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело по любому из пп.1-14, содержащее любую аминокислотную последовательность из δΕΟ ГО N0: 1, 2, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145 или 146.
22. Гуманизированное антитело, полученное из исходного антитела мыши, которое специфически связывается с ανβ6, причем указанное гуманизированное антитело содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью δΕΟ ГО N0: 3 и вариабельный домен легкой цепи с аминокислотной последовательностью δΕΟ ГО N0: 4.
23. Гуманизированное антитело по п.22, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит определяющие комплементарность области (СЭК), характеризуемые аминокислотными остатками 31-35 (СЭК.1), 50-66 (СЭК2) и 99-115 (СЭК.3) последовательности δΕΟ ГО N0: 3; и/или вариабельный домен легкой цепи содержит определяющие комплементарность области (СЭК), характеризуемые аминокислотными остатками 24-38 (СЭК1), 54-60 (СЭК2) и 93-101 (СЭК3) последовательности δΕΟ ГО N0: 4; и/или вариабельный домен тяжелой цепи содержит каркасные участки (ЕК), характеризуемые аминокислотными остатками 1-30 (ЕК1), 36-49 (ЕК2), 67-98 (ЕК3) и 116-126 (ЕК4) последовательности δΕΟ ГО N0: 3; и /или где вариабельный домен легкой цепи содержит каркасные участки (ЕК), характеризуемые аминокислотными остатками 1-23 (ЕК1), 39-53 (ЕК2), 61-92 (ЕК3) и 102-111 (ЕК4) последовательности δΕΟ ГО N0: 4.
- 206 016342
24. Гуманизированное антитело по любому из пп.22 или 23, содержащее по меньшей мере одну аминокислотную замену в вариабельном домене тяжелой цепи или легкой цепи в последовательностях СЭРЕ последовательностях СЭР2. последовательностях СЭР3 или каркасных участках.
25. Гуманизированное антитело по п.24, содержащее по меньшей мере одну из аминокислотных замен в вариабельном домене тяжелой цепи. состоящих из А246. 0268. О39Е. Μ48Ι, У68А. Р72У и Т74К последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 3.
26. Гуманизированное антитело по п.25. содержащее аминокислотные замены в вариабельном домене тяжелой цепи (НУГ). состоящие из А246. С268. О39Е. Μ48Ι. У68Л. Р72У и Т74К последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 3; и/или содержащее аминокислотные замены в вариабельном домене тяжелой цепи (НУ2'). состоящие из Μ48Ι. У68А. Р72У и Т74К последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 3; и/или содержащее аминокислотные замены в вариабельном домене тяжелой цепи (НУ3'). состоящие из У68А. Р72У и Т74К последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 3.
27. Гуманизированное антитело по п.24. специфически связывающееся с ανβ6 и полученное из исходного гибридомного штамма 8С6 АТСС РТА-3645. причем указанное гуманизированное антитело содержит СОРТ. СЭР2. СЭР3 вариабельного домена тяжелой цепи и СЭРЕ СЭР2 и СЭР3 вариабельного домена легкой цепи и содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену в вариабельном домене тяжелой или легкой цепи в последовательностях СОРТ. СЭК2. СЭК3 или каркасных последовательностях. где последовательность вариабельного домена тяжелой цепи имеет последовательность. выбранную из группы. состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 78. 8Е0 ΙΌ N0: 79 или 8Е0 ΙΌ N0: 80. причем СЭР1 легкой цепи имеет последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 75. 8Е0 ΙΌ N0: 76 или 8Е0 ΙΌ N0: 77.
28. Гуманизированное антитело по любому из пп.22 или 23. где исходное антитело представляет собой мышиное антитело 8С6.
29. Гуманизированное антитело по любому из пп.22-28. где указанное антитело может конкурировать с мышиным антителом 8С6 за связывание с ανβ6.
30. Композиция для предотвращения или лечения заболевания. опосредованного ανβ6. у млекопитающего. содержащая антитело по любому из пп.1. 7. 22 или 23 и фармацевтически приемлемый носитель.
31. Композиция по п.30. где указанное антитело конъюгировано с цитотоксическим агентом.
32. Способ получения гуманизированного антитела по любому из пп.1-14. предусматривающий культивирование клетки-хозяина по п.21 в условиях. подходящих для экспрессии гуманизированного антитела. в которых экспрессируются цепи гуманизированного антитела и образуется гуманизированное антитело.
33. Способ по п.32. дополнительно предусматривающий выделение гуманизированного антитела.
34. Способ по п.32. где клеткой-хозяином является клетка СНО.
35. Способ лечения субъекта. имеющего заболевание. опосредованное ανβ6. или рискующего приобрести такое заболевание. предусматривающий введение указанному субъекту композиции по п.30. где указанное введение приводит к уменьшению или отсрочке начала указанного заболевания.
36. Способ по п.35. где субъектом является человек.
37. Способ по п.35. где заболеванием является фиброз.
38. Способ по п.37. где фиброзом является склеродермия. образование рубцов. фиброз печени. фиброз почек или фиброз легких.
39. Способ по п.35. где заболеванием является псориаз.
40. Способ по п.35. где заболеванием является рак.
41. Способ по п.40. где раком является эпителиальный рак.
42. Способ по п.40. где раком является рак полости рта. рак кожи. рак шейки матки. рак яичника. фарингеальный. ларингеальный рак. рак пищевода. рак легкого. рак почки. рак молочной железы или колоректальный рак.
43. Способ по п.35. где заболеванием является синдром Альпорта.
44. Способ уменьшения или предотвращения вторичной локализации метастазов первичной опухоли у пациента. предусматривающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества одного или нескольких антител по любому из пп.1-14. 22-29 или их (/.ДЕ-эпитоп-связывающих фрагментов. которые связываются с одной или несколькими субъединицами интегрина ανβ6 на одной или нескольких клетках в указанной первичной опухоли. причем связывание указанного антитела или его (/.,Д36-эпитоп-связывающего фрагмента с указанным интегрином приводит к гибели. чувствительности к химиотерапии или пониженной инвазивности указанной опухолевой клетки.
45. Способ элиминации (/.ДТ-положительных метастатических опухолевых клеток у пациента. предусматривающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества одного или нескольких антител по любому из пп.1-14. 22-29 или их (/.ДЕ-эпитоп-связывающих фрагментов. которые связываются с одной или несколькими субъединицами интегрина ανβ6 на одной или нескольких ανβ6положительных метастатических опухолевых клетках. причем такое связывание указанного антитела или
- 207 016342 его (/.ДС-эпитоп-связывающего фрагмента с указанным интегрином приводит к гибели, чувствительности к химиотерапии или пониженной инвазивности указанной метастатической опухолевой клетки.
46. Способ элиминации оставшихся (/.ДС-положительных опухолевых клеток из организма пациента после хирургического удаления опухоли из ткани или органа указанного пациента, предусматривающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества одного или нескольких антител по любому из пп.1-14, 22-29 или их (/.ДС-эпитоп-связывающих фрагментов, которые связываются с одной или несколькими субъединицами интегрина ανβ6 на одной или нескольких оставшихся опухолевых клетках в указанной ткани или органе, причем такое связывание указанного антитела или его ανβ6эпитоп-связывающего фрагмента с указанным интегрином приводит к гибели, чувствительности к химиотерапии или пониженной инвазивности указанной опухолевой клетки.
47. Способ уменьшения или предотвращения прогрессирования первичной преметастатической или прединвазивной опухоли в метастатическую или инвазивную опухоль у пациента, предусматривающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества одного или нескольких антител по любому из пп.1-14, 22-29 или их (/.ДЦ-эпитоп-связывающих фрагментов, которые связываются с одной или несколькими субъединицами интегрина /νβ6 на одной или нескольких клетках в указанной преметастатической или прединвазивной опухоли, причем такое связывание указанного антитела или его (/.ДЦ-эпитоп-связывающего фрагмента с указанным интегрином приводит к уменьшению или предотвращению инвазии клеток указанного преметастатического или прединвазивного рака в области ткани, окружающей указанную первичную опухоль у указанного пациента.
48. Способ по п.47, где указанная преметастатическая или прединвазивная опухоль является карциномой.
49. Способ диагностики карциномы, которая с большей вероятностью будет прогрессировать в инвазивную карциному, предусматривающий:
(a) получение из организма пациента пробы раковой эпителиальной ткани, содержащей опухоль или ее часть, и пробы нераковой эпителиальной ткани;
(b) обеспечение контактирования указанных проб ткани с одним или несколькими антителами по любому из пп.1-14, 22-29, которые связываются с одной или несколькими субъединицами интегрина ανβ6, или их (/.ДЦ-эпитоп-связывающими фрагментами; и (c) определение уровня экспрессии интегрина ο.νβ6 в указанных пробах ткани, причем увеличение уровня экспрессии интегрина ο.νβ6 в указанной пробе раковой ткани относительно уровня экспрессии интегрина /νβ6 в указанной пробе нераковой ткани указывает на наличие у пациента карциномы, которая имеет большую вероятность прогрессирования в инвазивную карциному.
50. Способ по пп.44-47 или 49, где указанные опухолевые клетки являются клетками из метастатической карциномы.
51. Способ по п.44-46 или 47, где указанная опухоль является карциномой.
52. Способ по пп.49, 51, где указанной карциномой является аденокарцинома.
53. Способ по пп.49, 51, где указанная карцинома выбрана из группы, состоящей из рака молочной железы, рака эндометрия, рака поджелудочной железы, колоректального рака, рака легкого, рака яичника, рака шейки матки, рака предстательной железы, рака печени, рака пищевода, рака головы и шеи, рака желудка и рака селезенки.
54. Способ по п.53, где указанной карциномой является рак молочной железы.
55. Способ по п.54, где указанной карциномой является рак молочной железы ίη 8Йи.
56. Способ по п.55, где указанный рак молочной железы ίη кйи выбран из группы, состоящей из внутрипротокового рака ίη δίΐιι (ΌΟδ) и дольчатого рака ίη δίΐιι (ЬС18).
57. Способ по пп.49, 51, где указанная карцинома является раком эндометрия.
58. Способ по пп.49, 51, где указанная карцинома является раком поджелудочной железы.
59. Способ по пп.49, 51, где указанная карцинома является колоректальным раком.
60. Способ по пп.49, 51, где указанная карцинома является раком шейки матки.
61. Способ по пп.49, 51, где указанная карцинома является раком легкого.
62. Способ по пп.44-47 или 49, где указанным антителом является йи3С9 (ВС00011).
63. Способ по пп.44-47 или 49, где указанным антителом является 1ш8С6.
64. Способ по пп.44-47, где указанное антитело или его /ДС-эпитоп-связывающий фрагмент конъюгировано по меньшей мере с одним цитотоксическим соединением.
65. Способ по пп.44-47, где указанное антитело или его /ДС-эпитоп-связывающий фрагмент вводят указанному пациенту вместе с введением указанному пациенту по меньшей мере одного цитотоксического соединения.
66. Способ по п.64 или 65, где указанное цитотоксическое соединение выбрано из группы, состоящей из цисплатина, карбоплатина, оксалиплатина, паклитаксела, мелфалана, доксорубицина, метотрексата, 5-фторурацила, этопозида, мехлоретамина, циклофосфамида, блеомицина, калихеамицина, майтансина, трихотена, СС1065, А-цепи дифтерийного токсина, А-цепи экзотоксина Рхсиботонах аегидшока, Ацепи рицина, А-цепи абрина, А-цепи модекцина, ο,-сарцина, белка Л1сип1с5 Еогби, белка диантина, белка
- 208 016342
Рбу1о1асса атепсапа, ингибитора МотогЛса сбагаиба, курцина, кротина, ингибитора 8ароиапа ойюшаЛ, гелонина, митогеллина, рестриктоцина, феномицина, эномицина, трикотецена, рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы.
67. Способ по п.64 или 65, где указанное цитотоксическое соединение выбрано из группы, состоящей из радиоизотопа и активирующего пролекарство фермента.
68. Способ по п.67, где указанный радиоизотоп выбран из группы, состоящей из 2ΠΛΐ, 131Ι, 125Ι, 90Υ, 186Ке, 188Ке, 1538т, 212Βί, 32Р и радиоактивных изотопов Ьи.
69. Способ по п.67, где указанный активирующий пролекарство фермент выбран из группы, состоящей из щелочной фосфатазы, арилсульфатазы, цитозиндезаминазы, протеазы, Όаланилкарбоксипептидазы, расщепляющего углеводы фермента, Р-лактамазы и пенициллинамидазы.
70. Способ по пп.44-47, где указанное антитело или его /ДС-эпитоп-связывающий фрагмент вводят указанному пациенту в виде фармацевтической композиции, содержащей указанное антитело или его /ДС-эпитоп-связывающий фрагмент и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей или эксципиентов.
71. Способ по п.70, где указанные антитело или его /ДС-эпитоп-связывающий фрагмент или композицию вводят указанному пациенту способом, выбранным из группы, состоящей из перорального введения, парентерального введения, внутричерепного введения, внутрилегочного введения и интраназального введения.
72. Способ по п.71, где указанные антитело или его /ДС-эпитоп-связывающий фрагмент или композицию вводят указанному пациенту парентеральным путем, выбранным из группы, состоящей из внутримышечного введения, внутривенного введения, внутриартериального введения и подкожного введения.
73. Способ по п.72, где указанный парентеральный способ предусматривает введение указанных антитела или его /ДС-эпитоп-связывающего фрагмента или композиции указанному пациенту посредством инъекции.
74. Способ по п.49, где указанное антитело или его /ДС-эпитоп-связывающий фрагмент конъюгировано по меньшей мере с одной детектируемой меткой.
75. Способ по п.51, где указанная детектируемая метка выбрана из группы, состоящей из хромогенной метки, ферментной метки, радиоизотопной метки, нерадиоизотопной метки, флуоресцентной метки, токсической метки, хемилюминесцентной метки, рентгенографической метки, спиновой метки и метки контрастного агента ядерного магнитного резонанаса.
76. Способ по п.75, где указанная хромогенная метка выбрана из группы, состоящей из диаминобензидина и 4-гидроксиазобензол-2-карбоновой кислоты.
77. Способ по п.75, где указанная ферментная метка выбрана из группы, состоящей из малатдегидрогеназы, стафилококковой нуклеазы, дельта-5-стероидизомеразы, дрожжевой алкогольдегидрогеназы, /-глицеролфосфатдегидрогеназы, триозофосфатизомеразы, пероксидазы, щелочной фосфатазы, аспарагиназы, глюкозооксидазы, β-галактозидазы, рибонуклеазы, уреазы, каталазы, глюкозо-6фосфатдегидрогеназы, глюкоамилазы и ацетилхолинэстеразы.
78. Способ по п.75, где указанная радиоизотопная метка выбрана из группы, состоящей из 3Н, 'Ιη. 125Ι, 131Ι, 35δ, 14С, 51Сг, 57Ее, 58Со, 59Ре, 758е, 152Еи, 90Υ, 67Си, 217Λΐ, 211Л1, 212РЬ, 478с и Рс1.
79. Способ по п.75, где указанная нерадиоактивная изотопная метка выбрана из группы, состоящей из 157Сб, 55Ми, 162Эу, 52Сг, 56Ее, 99тТс или 112Ιη.
80. Способ по п.75, где указанная флуоресцентная метка выбрана из группы, состоящей из метки 152Еи, флуоресцеиновой метки, изотиоцианатной метки, родаминовой метки, фикоэритриновой метки, фикоцианиновой метки, аллофикоцианиновой метки, зеленого флуоресцирующего белка (СЕР), метки в виде о-фталевого альдегида и флуорескаминовой метки.
81. Способ по п.75, где указанная токсическая метка выбрана из группы, состоящей из метки в виде дифтерийного токсина, рициновой метки и метки в виде холерного токсина.
82. Способ по п.75, где указанная хемилюминесцентная метка выбрана из группы, состоящей из люминоловой метки, изолюминоловой метки, метки в виде акридинийзамещенного ароматического сложного эфира, имидазольной метки, метки в виде соли акридиния, метки в виде оксалатного эфира, люцифериновой метки, люциферазной метки или эквориновой метки.
83. Способ по п.75, где указанной меткой для рентгеновской радиографии является барий или цезий.
84. Способ по п.75, где указанной спиновой меткой является дейтерий.
85. Способ по п.75, где указанная метка контрастного агента для ядерного магнитного резонанса выбрана из группы, состоящей из Сб, Ми и железа.
EA200800278A 2005-07-08 2006-07-10 АНТИ-αβ-АНТИТЕЛА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ EA016342B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US69744205P 2005-07-08 2005-07-08
US77331006P 2006-02-15 2006-02-15
PCT/US2006/026598 WO2007008712A2 (en) 2005-07-08 2006-07-10 Anti-alpha v beta 6 antibodies and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200800278A1 EA200800278A1 (ru) 2008-06-30
EA016342B1 true EA016342B1 (ru) 2012-04-30

Family

ID=37637797

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200800278A EA016342B1 (ru) 2005-07-08 2006-07-10 АНТИ-αβ-АНТИТЕЛА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

Country Status (18)

Country Link
US (3) US7943742B2 (ru)
EP (4) EP1920065B1 (ru)
JP (2) JP5116671B2 (ru)
KR (3) KR101531317B1 (ru)
CN (3) CN104072614B (ru)
AU (1) AU2006269266B2 (ru)
BR (1) BRPI0612778B1 (ru)
CA (1) CA2614183C (ru)
CY (1) CY1120924T1 (ru)
DK (1) DK1920065T3 (ru)
EA (1) EA016342B1 (ru)
ES (1) ES2700025T3 (ru)
HU (1) HUE039034T2 (ru)
LT (1) LT1920065T (ru)
PL (1) PL1920065T3 (ru)
PT (1) PT1920065T (ru)
SI (1) SI1920065T1 (ru)
WO (1) WO2007008712A2 (ru)

Families Citing this family (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ535425A (en) 2002-03-13 2008-05-30 Biogen Idec Inc Anti-alphavbeta6 antibodies
CN104072614B (zh) 2005-07-08 2017-04-26 生物基因Ma公司 抗-αvβ6 抗体及其用途
CN101563105B (zh) 2006-07-10 2013-01-23 拜奥根Idec马萨诸塞公司 用于抑制smad4-缺陷癌症的组合物和方法
EP2064244B1 (en) 2006-08-03 2019-06-05 MedImmune Limited ANTIBODIES DIRECTED TO alphaVbeta6 AND USES THEREOF
JP2010506944A (ja) 2006-10-19 2010-03-04 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア インテグリンαＶβ６のアンタゴニストを用いる慢性喘息の処置および予防
KR100879239B1 (ko) * 2007-04-19 2009-01-16 (주)케어젠 Ｔｇｆｐ－ｃａｐ 펩타이드 및 그의 용도
BRPI0813645A2 (pt) 2007-06-25 2014-12-30 Esbatech Alcon Biomed Res Unit Métodos para modificar anticorpos, e anticorpos modificados com propriedades funcionais aperfeiçoadas
EP2031064A1 (de) * 2007-08-29 2009-03-04 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG Verfahren zur Steigerung von Proteintitern
GB0718843D0 (en) 2007-09-26 2007-11-07 Cancer Rec Tech Ltd Materials and methods relating to modifying the binding of antibodies
WO2009059115A1 (en) * 2007-10-31 2009-05-07 Trustees Of The University Of Pennsylvania Culture based screening assay and methods of use thereof to identify agents which modulate tumor development, invasion and differentiation
CA2700197C (en) 2007-11-08 2020-09-08 Neogenix Oncology, Inc. Recombinant monoclonal antibodies and corresponding antigens for colon and pancreatic cancers
US8795667B2 (en) * 2007-12-19 2014-08-05 Macrogenics, Inc. Compositions for the prevention and treatment of smallpox
WO2011091181A1 (en) 2010-01-20 2011-07-28 Tolerx, Inc. Immunoregulation by anti-ilt5 antibodies and ilt5-binding antibody fragments
CA2787783A1 (en) * 2010-01-20 2011-07-28 Tolerx, Inc. Anti-ilt5 antibodies and ilt5-binding antibody fragments
PT2666872T (pt) * 2010-02-05 2016-07-08 Astute Medical Inc Processos e composições para o diagnóstico e o prognóstico de lesões renais e de insuficiência renal
US8911952B2 (en) 2010-03-24 2014-12-16 Stc. Unm Method for integrin ligand discovery
KR101239320B1 (ko) * 2010-10-25 2013-03-06 (주)파이토엠앤에프 여주 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물
SG11201404354UA (en) 2012-02-17 2014-10-30 Seattle Genetics Inc ANTIBODIES TO INTEGRIN αVβ6 AND USE OF SAME TO TREAT CANCER
HK1208470A1 (en) * 2012-03-29 2016-03-04 Biogen Ma Inc. Biomarkers for use in integrin therapy applications
CN110078827A (zh) 2012-04-27 2019-08-02 西托姆克斯治疗公司 结合表皮生长因子受体的可活化的抗体其使用方法
MX338711B (es) 2012-10-12 2016-04-28 Medimmune Ltd Pirrolobenzodiazepinas y conjugados de las mismas.
CN109776676A (zh) 2012-11-28 2019-05-21 Cnj控股公司 针对艰难梭菌的抗体
TWI635098B (zh) 2013-02-01 2018-09-11 再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
MX362970B (es) 2013-03-13 2019-02-28 Medimmune Ltd Pirrolobenzodiazepinas y conjugados de las mismas.
WO2014143739A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Biogen Idec Ma Inc. Anti-alpha v beta 6 antibodies and uses thereof
WO2014144466A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Biogen Idec Ma Inc. Anti-alpha v beta 6 antibodies and uses thereof
ES2823648T3 (es) 2013-04-01 2021-05-07 Univ California Métodos y composiciones para tratar y prevenir enfermedades asociadas con la integrina AVB8
TWI636065B (zh) * 2013-08-05 2018-09-21 伊瑪提克斯生物科技有限公司 新穎肽類，細胞及其用於治療多種腫瘤的用途，其製造方法及包含其等之醫藥組成物
KR102150616B1 (ko) 2013-09-12 2020-09-03 삼성전자주식회사 c-Met 표적 화합물-생체활성 물질 접합체 및 그 용도
CA2925057A1 (en) * 2013-10-01 2015-04-09 Simon T. BARRY Methods of treating and diagnosing alpha-v-beta-6 overexpressing cancer
WO2015066279A2 (en) 2013-10-30 2015-05-07 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies that bind epidermal growth factor receptor and methods of use thereof
WO2015089283A1 (en) 2013-12-11 2015-06-18 Cytomx Therapeutics, Inc. Antibodies that bind activatable antibodies and methods of use thereof
WO2015095553A1 (en) * 2013-12-20 2015-06-25 Nephrogenesis, Llc Methods and apparatus for kidney dialysis
TWI680138B (zh) 2014-01-23 2019-12-21 美商再生元醫藥公司 抗ｐｄ-ｌ１之人類抗體
TWI681969B (zh) 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
EA035419B9 (ru) 2014-05-29 2020-08-07 Мэкроудженикс, Инк. Триспецифичные связывающие молекулы и способы их применения
US20170202478A1 (en) * 2014-07-03 2017-07-20 University Of Virginia Patent Foundation Systems and methods for identifying and profiling muscle patterns
DK3166973T3 (da) * 2014-07-10 2020-04-06 Univ Zuerich Immunstimulerende monoklonale antistoffer mod human interleukin-2
EP3193940A1 (en) 2014-09-10 2017-07-26 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2016161010A2 (en) 2015-03-30 2016-10-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Heavy chain constant regions with reduced binding to fc gamma receptors
CN106699888B (zh) * 2015-07-28 2020-11-06 上海昀怡健康科技发展有限公司 一种pd-1抗体及其制备方法和应用
AU2016325630B2 (en) * 2015-09-23 2022-11-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Optimized anti-CD3 bispecific antibodies and uses thereof
HK1254295A1 (zh) 2015-11-23 2019-07-19 默克专利股份有限公司 用於治疗纤维化和/或纤维化病症的抗-αＶ整合素抗体
AU2016360661B2 (en) * 2015-11-23 2023-12-14 Merck Patent Gmbh Anti-alpha-v integrin antibody for the treatment of fibrosis and/or fibrotic disorders
CN108883173B (zh) * 2015-12-02 2022-09-06 阿吉纳斯公司 抗体和其使用方法
LT3394103T (lt) 2015-12-22 2023-09-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antikūnų prieš pd-1 ir bispecifinių antikūnų prieš cd20/cd3 derinys, skirtas vėžiui gydyti
WO2017122130A1 (en) 2016-01-11 2017-07-20 Novartis Ag Immune-stimulating humanized monoclonal antibodies against human interleukin-2, and fusion proteins thereof
TWI910495B (zh) 2016-05-13 2026-01-01 美商再生元醫藥公司 藉由投予pd-1抑制劑治療皮膚癌之方法
AU2017281421B2 (en) * 2016-06-23 2024-07-25 Ablynx N.V. Improved pharmacokinetic assays for immunoglobulin single variable domains
CN109862910A (zh) * 2016-08-03 2019-06-07 小利兰·斯坦福大学托管委员会 破坏巨噬细胞上的Fc受体接合增强抗SIRPα抗体疗法的功效
GB201616596D0 (en) * 2016-09-29 2016-11-16 Nascient Limited Epitope and antibodies
EP3525829A1 (en) 2016-10-11 2019-08-21 Medimmune Limited Antibody-drug conjugates with immune-mediated therapy agents
US11603407B2 (en) 2017-04-06 2023-03-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Stable antibody formulation
AU2018322475A1 (en) * 2017-08-22 2020-03-05 Biogen Ma Inc. Pharmaceutical compositions and dosage regimens containing anti-alpha(v)beta(6) antibodies
CN116693686A (zh) * 2018-02-11 2023-09-05 江苏豪森药业集团有限公司 抗b7-h4抗体、其抗原结合片段及其医药用途
JP2021516682A (ja) * 2018-03-13 2021-07-08 スミヴェット ビー．ブイ．Ｓｍｉｖｅｔ Ｂ．Ｖ． 破傷風神経毒素に結合する単一ドメイン抗体
CA3098103A1 (en) 2018-05-23 2019-11-28 Adc Therapeutics Sa Molecular adjuvant
CA3110513A1 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Dosing strategy that mitigates cytokine release syndrome for cd3/c20 bispecific antibodies
JP7654539B2 (ja) * 2018-09-07 2025-04-01 ファイザー・インク 抗αｖβ８抗体、組成物及びその使用
JP7317379B2 (ja) * 2019-01-04 2023-07-31 国立大学法人京都大学 潰瘍性大腸炎及び原発性硬化性胆管炎の検査方法
KR20220005471A (ko) * 2019-04-08 2022-01-13 바이오젠 엠에이 인코포레이티드 항-인테그린 항체 및 이의 용도
CN113557246B (zh) * 2019-07-24 2023-09-01 韩国基础科学支援研究院 靶向αvβ3整联蛋白的单域抗体
US11827709B2 (en) * 2019-12-05 2023-11-28 Seagen Inc. Anti-AVB6 antibodies and antibody-drug conjugates
JP2023529849A (ja) * 2020-06-02 2023-07-12 マイクロビアル マシーンズ インコーポレイテッド 画像診断用の改変微生物
US11970546B2 (en) 2020-07-31 2024-04-30 R.P. Scherer Technologies, Llc Antibody specific for Mucin-1 and methods of use thereof
US20230372528A1 (en) 2020-10-16 2023-11-23 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Glycoconjugates
GB202102396D0 (en) 2021-02-19 2021-04-07 Adc Therapeutics Sa Molecular adjuvant
EP4426727A2 (en) 2021-11-03 2024-09-11 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Specific conjugation of an antibody
AU2024346987A1 (en) 2023-09-19 2026-04-02 Telix Targeting Technologies, Inc. Antigen binding constructs
WO2025149667A1 (en) 2024-01-12 2025-07-17 Pheon Therapeutics Ltd Antibody drug conjugates and uses thereof
WO2025163120A1 (en) * 2024-02-01 2025-08-07 Adcytherix Sas ANTIBODY-DRUG CONJUGATES COMPRISING AN ANTI-INTEGRIN ΑVβ6 BINDING ANTIBODY
EP4595981A1 (en) * 2024-02-01 2025-08-06 Jack Elands Antibody-drug conjugates comprising an anti-integrin v 6 binding antibody
WO2026067489A1 (zh) * 2024-09-29 2026-04-02 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 ITGβ6结合蛋白及其用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003087340A2 (en) * 2002-04-12 2003-10-23 Raven Biotechnologies, Inc. Antibodies that bind to integrin alpha-v-beta-6 and methods of use thereof
WO2003100033A2 (en) * 2002-03-13 2003-12-04 Biogen Idec Ma Inc. ANTI-αvβ6 ANTIBODIES

Family Cites Families (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
US5223493A (en) 1984-12-28 1993-06-29 Alcon Laboratories, Inc. Anti-inflammatory compounds for ophthalmic use
US4732863A (en) 1984-12-31 1988-03-22 University Of New Mexico PEG-modified antibody with reduced affinity for cell surface Fc receptors
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5019368A (en) 1989-02-23 1991-05-28 Cancer Biologics, Inc. Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy
GB8705477D0 (en) 1987-03-09 1987-04-15 Carlton Med Prod Drug delivery systems
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
AU7247191A (en) 1990-01-11 1991-08-05 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
GB9009549D0 (en) 1990-04-27 1990-06-20 Celltech Ltd Recombinant antibody and method
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DE69230142T2 (de) 1991-05-15 2000-03-09 Cambridge Antibody Technology Ltd. Verfahren zur herstellung von spezifischen bindungspaargliedern
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
US5962643A (en) 1991-07-11 1999-10-05 The Regents Of The University Of California Integrin β subunit and uses thereof
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5869619A (en) 1991-12-13 1999-02-09 Xoma Corporation Modified antibody variable domains
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
DK0752248T3 (da) 1992-11-13 2000-11-13 Idec Pharma Corp Terapeutisk anvendelse af kimæriske og radioaktivt mærkede antistoffer mod humant B-lymfocytbegrænset differentieringsantig
US6307026B1 (en) 1992-12-10 2001-10-23 Celltech Limited Humanized antibodies directed against A33 antigen
US5420120A (en) 1993-12-17 1995-05-30 Alcon Laboratories, Inc. Anti-inflammatory glucocorticoid compounds for topical ophthalmic use
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US6417324B1 (en) 2000-04-21 2002-07-09 Tripep Ab Synthetic peptides that bind to the hepatitis B virus core and e antigens
EP0719859B1 (en) 1994-12-20 2003-07-02 MERCK PATENT GmbH Anti-alpha V-integrin monoclonal antibody
US5688960A (en) 1995-05-02 1997-11-18 Schering Corporation Substituted oximes, hydrazones and olefins useful as neurokinin antagonists
US5696267A (en) 1995-05-02 1997-12-09 Schering Corporation Substituted oximes, hydrazones and olefins as neurokinin antagonists
US5795894A (en) 1995-05-02 1998-08-18 Schering Corporation Piperazino derivatives as neurokinn antagonists
US5719156A (en) 1995-05-02 1998-02-17 Schering Corporation Piperazino derivatives as neurokinin antagonists
US5654316A (en) 1995-06-06 1997-08-05 Schering Corporation Piperidine derivatives as neurokinin antagonists
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
ATE265861T1 (de) * 1995-08-17 2004-05-15 Protein Design Labs Inc Antikörper gegen l-selectin zur vorbeugung von multiplem organversagen und akuter organschädigung
ES2176484T3 (es) 1995-08-18 2002-12-01 Morphosys Ag Bancos de proteinas/(poli)peptidos.
KR100308764B1 (ko) 1995-08-29 2001-12-17 마나배게이사꾸 키메라동물및그의제작법
US5691362A (en) 1996-06-05 1997-11-25 Schering-Plough Corporation Substituted benzene-fused hetero- and carbocyclics as nuerokinin antagonists
CA2257357C (en) 1996-06-07 2010-04-13 Neorx Corporation Humanized antibodies with modified glycosylation
WO1998006839A1 (en) 1996-07-15 1998-02-19 Human Genome Sciences, Inc. Cd44-like protein
US5789422A (en) 1996-10-28 1998-08-04 Schering Corporation Substituted arylalkylamines as neurokinin antagonists
US5783579A (en) 1996-12-20 1998-07-21 Schering Corporation Spiro-substituted azacyclic-substituted piperazino derivatives as neurokinin antagonists
ATE511850T1 (de) 1997-08-08 2011-06-15 Univ California Behandlung von blasenfibrose mit antikörpern gegen alpha-v-beta-6-integrin
BR9907218A (pt) 1998-01-23 2000-10-24 Merck Patent Gmbh Anticorpo monoclonal anti alfav-integrina e seu uso para inibir a fixação de alfav-beta6-integrina à fibronectina
CZ20012212A3 (cs) 1998-12-19 2001-09-12 Merck Patent Gmbh Peptidická sloučenina, její použití a farmaceutický prostředek, který ji obsahuje
US7163681B2 (en) 2000-08-07 2007-01-16 Centocor, Inc. Anti-integrin antibodies, compositions, methods and uses
US7288390B2 (en) 2000-08-07 2007-10-30 Centocor, Inc. Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses
US7776315B2 (en) 2000-10-31 2010-08-17 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Pharmaceutical compositions based on anticholinergics and additional active ingredients
DE10063173A1 (de) 2000-12-18 2002-06-20 Merck Patent Gmbh Harnstoff- und Urethanderivate
DE60236735D1 (de) 2001-04-13 2010-07-29 Biogen Idec Inc Antikörper gegen vla-1
DE10118550A1 (de) 2001-04-14 2002-10-17 Merck Patent Gmbh Liganden des Integrins alpha¶nu¶beta¶6¶
GB2380127A (en) 2001-09-26 2003-04-02 Isis Innovation Treatment of chronic joint inflammation
DK1485127T3 (da) 2002-02-25 2011-10-03 Elan Pharm Inc Anvendelse af midler til behandling af inflammation
AU2003229305A1 (en) 2002-05-17 2003-12-02 Scios, Inc. TREATMENT OF FIBROPROLIFERATIVE DISORDERS USING TGF-Beta INHIBITORS
JP4741242B2 (ja) * 2002-11-26 2011-08-03 アボット バイオセラピューティクス コーポレイション 新脈管形成を調節するα５β１インテグリンへのキメラ及びヒト化抗体
US20040253311A1 (en) 2002-12-18 2004-12-16 Roger Berlin Multi-layer tablet comprising non-steroidal anti-inflammatory drugs, decongestants and non-sedating antihist amines
ES2343840T3 (es) 2003-11-04 2010-08-11 Bayer Healthcare Llc Procedimientos inmunohistoquimicos para supervisar los niveles de perk.
CN104072614B (zh) 2005-07-08 2017-04-26 生物基因Ma公司 抗-αvβ6 抗体及其用途
CN101563105B (zh) 2006-07-10 2013-01-23 拜奥根Idec马萨诸塞公司 用于抑制smad4-缺陷癌症的组合物和方法
JP2010506944A (ja) 2006-10-19 2010-03-04 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア インテグリンαＶβ６のアンタゴニストを用いる慢性喘息の処置および予防
GB0803192D0 (en) 2008-02-22 2008-04-02 Mubio Products Bv SCLC biomarker panel
WO2012031008A2 (en) 2010-08-31 2012-03-08 The General Hospital Corporation Cancer-related biological materials in microvesicles

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003100033A2 (en) * 2002-03-13 2003-12-04 Biogen Idec Ma Inc. ANTI-αvβ6 ANTIBODIES
WO2003087340A2 (en) * 2002-04-12 2003-10-23 Raven Biotechnologies, Inc. Antibodies that bind to integrin alpha-v-beta-6 and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US20110305629A1 (en) 2011-12-15
CN104072614A (zh) 2014-10-01
AU2006269266A1 (en) 2007-01-18
CN104072614B (zh) 2017-04-26
EP1920065B1 (en) 2018-08-29
JP5116671B2 (ja) 2013-01-09
CN102875681A (zh) 2013-01-16
KR20140068200A (ko) 2014-06-05
US8992924B2 (en) 2015-03-31
BRPI0612778A8 (pt) 2018-01-30
CA2614183C (en) 2017-02-28
HUE039034T2 (hu) 2018-12-28
PT1920065T (pt) 2018-12-04
WO2007008712A8 (en) 2007-11-01
EP2458013A1 (en) 2012-05-30
WO2007008712A2 (en) 2007-01-18
JP5780599B2 (ja) 2015-09-16
LT1920065T (lt) 2018-09-25
US7943742B2 (en) 2011-05-17
ES2700025T3 (es) 2019-02-13
EP1920065A2 (en) 2008-05-14
EP2447372A3 (en) 2012-05-30
SI1920065T1 (sl) 2018-10-30
AU2006269266B2 (en) 2012-09-20
CA2614183A1 (en) 2007-01-18
EP1920065A4 (en) 2009-07-15
BRPI0612778A2 (pt) 2009-05-05
EP2447372A2 (en) 2012-05-02
KR101531317B1 (ko) 2015-06-24
US20080286269A1 (en) 2008-11-20
AU2006269266A2 (en) 2010-03-04
BRPI0612778B1 (pt) 2022-04-05
JP2009500041A (ja) 2009-01-08
PL1920065T3 (pl) 2019-02-28
CY1120924T1 (el) 2019-12-11
CN101287841A (zh) 2008-10-15
WO2007008712A3 (en) 2007-08-02
EA200800278A1 (ru) 2008-06-30
KR101363780B1 (ko) 2014-02-21
EP2458012A8 (en) 2012-08-22
EP2447372A8 (en) 2012-08-22
JP2012183077A (ja) 2012-09-27
US20140294809A1 (en) 2014-10-02
KR20130042636A (ko) 2013-04-26
KR20080031049A (ko) 2008-04-07
DK1920065T3 (en) 2018-09-17
EP2458012A1 (en) 2012-05-30
CN101287841B (zh) 2013-12-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA016342B1 (ru) АНТИ-αβ-АНТИТЕЛА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
US11312787B2 (en) Antibodies and vaccines for use in treating ROR1 cancers and inhibiting metastasis
US10711068B2 (en) Anti-CD133 monoclonal antibodies and related compositions and methods
JP2009500041A5 (ru)
JP2009500041A6 (ja) 抗αＶβ６抗体およびその使用
JP2013039140A (ja) Ｓｍａｄ４欠損癌の増殖を阻害するための組成物および方法
US20130089872A1 (en) Anti-human trop-2 antibody having anti-tumor activity in vivo
UA118749C2 (uk) Конструкція антитіла до cdh19 і cd3
UA128387C2 (uk) Антитіло до lag3
EA029271B1 (ru) Анти-hpg моноклональное антитело, полинуклеотид, кодирующий его цепи, экспрессионный вектор, клетка-хозяин, фармацевтическая композиция и набор, содержащие это моноклональное антитело, и способы его применения
EA023555B1 (ru) АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ c-fms ЧЕЛОВЕКА
US20030082188A1 (en) Treatment of prostate cancer by inhibitors of NCAM2
UA125208C2 (uk) Антитіло до cd40
EA019636B1 (ru) Связывающие белки, включающие антитела, производные антител и фрагменты антител, которые специфически связываются с cd154, и их применения
EA011669B1 (ru) Антитела против m-csf
EA028336B1 (ru) Полностью человеческие антитела, специфические в отношении cadm1
US20120107364A1 (en) Antibody having anti-cancer activity
AU2012258386B2 (en) Anti-alpha v beta 6 antibodies and uses thereof
HK1170537A (en) Anti alpha v beta 6 antibodies and uses thereof
HK1118578B (en) Anti-alpha v beta 6 antibodies and uses thereof
HK1118578A (en) Anti-alpha v beta 6 antibodies and uses thereof
UA99276C2 (ru) ВЫДЕЛЕННОЕ МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, КОТОРОЕ СВЯЗЫВАЕТСЯ С ErbB3, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

TC4A Change in name of a patent proprietor in a eurasian patent