EP0579823A1 - Nouveaux derives hexapeptidiques, procede de preparation et application a titre de medicaments de ces nouveaux derives - Google Patents

Nouveaux derives hexapeptidiques, procede de preparation et application a titre de medicaments de ces nouveaux derives

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Publication number
EP0579823A1
EP0579823A1 EP93905388A EP93905388A EP0579823A1 EP 0579823 A1 EP0579823 A1 EP 0579823A1 EP 93905388 A EP93905388 A EP 93905388A EP 93905388 A EP93905388 A EP 93905388A EP 0579823 A1 EP0579823 A1 EP 0579823A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
residue
trp
series
alanine
derivatives
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP93905388A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Pierre Broto
Gilles Hamon
Eve 825 avenue du Comté-de-Nice MAHE
Dung Le-Nguyen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi Aventis France
Original Assignee
Roussel Uclaf SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roussel Uclaf SA filed Critical Roussel Uclaf SA
Publication of EP0579823A1 publication Critical patent/EP0579823A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/57536—Endothelin, vasoactive intestinal contractor [VIC]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Definitions

  • the present application relates to new hexapep ⁇ tidic derivatives, the process for the preparation and the application as a medicament of these new derivatives.
  • endothelin is a potent vasoconstrictor extracted from aortic endothelium from pigs.
  • This recently isolated peptide contains 21 amino acids, has 2 disulfide bridges and has the formula:
  • X 1 represents a hydrogen atom or a residue of histidine, acetyl-histidine, or D-histidine
  • X 2 represents a residue of alanine, leucine, tryptophane, phenylalanine and their D-series counterparts
  • X 3 represents an alanine residue as well as its D-series counterpart
  • X 5 represents a residue of isoleucine, alanine, valine, norleucine, leucine and aspartic acid as well as their D-series counterparts,
  • X 6 represents a residue of tryptophan, leucine, isoleu ⁇ cine, norleucine and their D-series counterparts
  • X- ⁇ represents a hydrogen atom, a residue of histidine or of D-histidine,
  • X 2 represents an alanine or leucine residue, as well as their D-series counterparts
  • X 3 represents an alanine residue as well as its D-series counterpart
  • X 5 represents an isoleucine residue as well as its D-series counterpart
  • X 6 represents a tryptophan residue, as well as its homolog in series D.
  • the peptide derivatives are preferably used in which:
  • X- j _ represents a hydrogen atom or a histidine residue
  • X 2 represents an alanine residue
  • X 3 represents an alanine or aspartic acid residue
  • X 5 represents an isoleucine residue
  • X 6 represents a residue of tryptophan or of D-tryptophan.
  • X 6 represents a residue of tryptophan or of D-tryptophan.
  • the invention also relates to a process for the preparation of new hexapeptide derivatives as defined above, characterized in that a solid phase synthesis is carried out by sequentially introducing them onto a support of crosslinked polystyrene type. duly protected ino-acids, using a coupling agent, deprotects the amino acids, and releases from the resin the peptide chain thus formed, to obtain the peptide derivative of formula (I) thus sought.
  • the process described above is characterized in that: the support of the crosslinked polystyrene type is a resin of the "Boc-Trp-CM” type or of the “Boc-D-Trp- type CM "in which Boc is a tert-butyloxycarbonyl group, Trp is a tryptophyl group and D-Trp is a D-tryptophyl group and CM denotes the crosslinked polystyrene support,
  • the coupling agent is (benzotriazol-1-yloxy) tris (dimethylamino) phosphoniu hexafluorophosphate or Bop,
  • the new hexapeptide derivatives which are the subject of the present invention have very interesting pharmacological properties; there is in particular a remarkable practically pure antagonistic effect against hypertension induced by endothelin and an anti-dry effect, the vasoconstrictive activity of endothelin being abolished.
  • a subject of the present invention is thus also the application, as medicaments, of the new hexapeptide derivatives as defined by the general formula (I) above.
  • the drugs which are the subject of the invention there are in particular the drugs, characterized in that they consist of the products of formula (I) in which X- ⁇ represents a hydrogen atom, a histidine residue or of D-histidine, X 2 represents an alanine or leucine residue, as well as their D-series counterparts,
  • X 3 represents an alanine residue, as well as its D-series counterpart
  • X ⁇ represents an isoleucine residue, as well as its D-series counterpart
  • X 6 represents a residue of tryptophan, or of D-tryptophan.
  • the drugs containing the new peptide derivatives such as defined above, in which:
  • X 1 represents a hydrogen atom or a histidine residue
  • X 2 represents an alanine or leucine residue
  • X 3 represents an alanine residue
  • X 5 represents an isoleucine residue
  • Xg represents a residue of tryptophan or of D-tryptophan.
  • These drugs find, for example, their use in the treatment of all vascular spasms, in the treatment of cerebral post-hemorrhages, in the treatment of coronary spasms, peripheral vascular spasms as well as in the treatment of renal insufficiencies.
  • These drugs can also be used in the treatment of myocardial infarction, in the prevention of post-angioplasty restenosis, in the treatment of atherosclerosis, certain forms of hypertension, as well as in the treatment of asthma.
  • the usual dose which varies depending on the product used, the subject treated and the condition in question, may for example be from 1 to 300 g per day intravenously in humans.
  • a subject of the invention is also pharmaceutical compositions which contain at least one aforementioned derivative as active principle.
  • the peptide derivatives corresponding to the general formula (I) can be incorporated into pharmaceutical compositions intended for the digestive or parenteral route.
  • These pharmaceutical compositions may be, for example, solid or liquid and be in the pharmaceutical forms commonly used in human medicine, such as, for example, simple or coated tablets, capsules, capsules, granules, suppositories, injections, aerosols; they are prepared according to the usual methods.
  • the active ingredient (s) can be incorporated into excipients usually used in these pharmaceutical compositions, such as talc, gum arabic, lactose, starch, magnesium stearate, cocoa butter, aqueous vehicles or not, fatty substances of animal or vegetable origin, paraffinic derivatives, glycols, various wetting agents, dispersants or emulsifiers, preservatives.
  • excipients usually used in these pharmaceutical compositions such as talc, gum arabic, lactose, starch, magnesium stearate, cocoa butter, aqueous vehicles or not, fatty substances of animal or vegetable origin, paraffinic derivatives, glycols, various wetting agents, dispersants or emulsifiers, preservatives.
  • a support of the “Boc-Trp-CM-support” type is used in which Boc is a tert-butyloxycarbonyl group, Trp represents a tryptophyl group and CM-support denotes the crosslinked polystyrene support.
  • the support containing 0.6 mol Trp / g was prepared by the potassium fluoride method according to the technique described by Horiki K., Igano K. & Inouye K. (1978) Che istry Lett. , 165-168. All the amino acids are N-protected by the tert-butylcarbonyl group, the protective groups for the side chains were as follows:
  • the fraction obtained is lyophilized and finally 30 mg of expected product is collected.
  • excipient q.s.p. one tablet finished at 150 mg (composition of the excipient: lactose, starch, talc, magnesium stearate). 5
  • a membrane preparation is carried out from the posterior cortex plus the rat cerebellum.
  • the non-specific binding is determined by adding endothelin at 10 ⁇ 6 M (in triplicate). Incubate at 25 ° C for 60 minutes, return to a water bath at 0 ° C for 5 minutes, filter under reduced pressure, rinse with Tris 7.4 buffer and count the radioactivity in the presence of the scintillant Triton.
  • IC50 inhibitory concentration 50%
  • the animals receive endothelin 1 or the test compound in cumulative injections by venous route, the administrations being spaced 2 minutes apart.
  • the increase in mean arterial pressure (BP) induced by each compound is measured and expressed as a percentage change from the initial pressure.
  • the antagonistic activity is expressed as a percentage of inhibition of the pressure response of endothelin administered alone, at doses of 3 and 10 ⁇ g / kg. Results:
  • New hexapeptide derivatives process for the preparation and application as medicaments of these new derivatives.
  • New hexapeptide derivatives process for the preparation and application as medicaments of these new derivatives.
  • New hexapeptide derivatives process for the preparation and application as medicaments of these new derivatives.
  • New hexapeptide derivatives process for the preparation and application as medicaments of these new derivatives.
  • New hexapeptide derivatives process for the preparation and application as medicaments of these new derivatives.

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Abstract

Nouveaux dérivés peptidiques de formule générale (I): X1 X2 X3 Ile X5 X6, dans laquelle X1 représente un hydrogène, un résidu d'histidine, d'acétyl-histidine, ou de D-histidine, X2 représente un résidu d'alanine, de leucine, de tryptophane, de phenylalanine ainsi que leurs homologues en série D, X3 représente un résidu d'alanine, ainsi que son homologue en série D, X5 représente un résidu d'isoleucine, d'alanine, de valine, de norleucine, de leucine et d'acide aspartique ainsi que leurs homologues en série D, X6 représente un résidu de tryptophane, de leucine, d'isoleucine, de norleucine et leurs homologues en série D, procédé de préparation et application à titre de médicaments.

Description

Nouveaux dérives hexapeptidiques. procédé de préparation et application à titre de médicaments de ces nouveaux dérivés
La présente demande concerne de nouveaux dérivés hexapep¬ tidiques, le procédé de préparation et l'application à titre de médicament de ces nouveaux dérivés.
On sait que l'endothéline est un puissant vasoconstric- teur extrait à partir d'endothélium aortique de porc. Ce peptide qui a été isolé récemment comporte 21 amino acides, présente 2 ponts disulfures et a pour formule :
Cys Ser Cys Ser Ser Leu Met Asp Lys Glu Cys - 1 5 10
Val Tyr Phe Cys His Leu Asp Ile Ile Trp
15 20
(- A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascu- lar endothelial cells. M. Yanagisawa, H. Kurihara, S. Kimura, Y. To obe, M. Kobayashi, Y. Mitsui, Y. Yazaki, K. Goto & T. Masaki, Nature, (1988) 332, p. 411-415). Ce peptide est désigné dans ce qui suit sous le nom de ET1.
La nomenclature utilisée est celle de la commission IUPAC-IUB (1984) European J. Biochem 183, 9-37. Ce peptide qui renferme 21 résidus d'amino-acides, 2 ponts disulfures est capable de contracter à de très faibles doses les cellules des muscles lisses (artères et veines) de différentes espèces de mammifères (homme, chien, chat, cochon, cobaye, rat, lapin..). En essayant de raccourcir la chaine et de remplacer certains restes d'amino-acides de l'endothéline -par d'autres amino-acides, la demanderesse a préparé par syn¬ thèse de nouveaux dérivés hexapeptidiques renfermant seulement cinq ou six aminoacides dans lesquels l'activité vasoconstric- trice a pratiquement disparu et qui présentent de plus, la propriété de bloquer et de se fixer sur les récepteurs natu¬ rels de l'endothéline. Les produits présentent ainsi une activité qui s'opposera à toute action d'une libération ulté¬ rieure de l'endothéline. Ces produits présentent en outre, l'intérêt de pouvoir être préparés par synthèse totale en grandes quantités.
La présente demande a ainsi pour objet de nouveaux déri¬ vés hexapeptidiques répondant à la formule générale (I) :
Kχ x2 X3 Ile x5 X6 (I)
dans laquelle X1 représente un atome d'hydrogène ou un résidu d'histidine, d'acétyl-histidine, ou de D-histidine,
X2 représente un résidu d'alanine, de leucine, de trypto- phane, de phenylalanine ainsi que leurs homologues en série D,
X3 représente un résidu d'alanine ainsi que son homologue en série D,
X5 représente un résidu d'isoleucine, d'alanine, de valine, de norleucine, de leucine et d'acide aspartique ainsi que leurs homologues en série D,
X6 représente un résidu de tryptophane, de leucine, d'isoleu¬ cine, de norleucine et leurs homologues en série D.
Parmi les nouveaux dérivés hexapeptidiques, tels que définis ci-dessus, on retient notamment ceux caractérisés en ce que :
X-^ représente un atome d'hydrogène, un résidu d'histidine ou de D-histidine,
X2 représente un résidu d'alanine ou de leucine, ainsi que leurs homologues en série D, X3 représente un résidu d'alanine ainsi que son homologue en série D,
X5 représente un résidu d'isoleucine ainsi que son homologue en série D,
X6 représente un résidu de tryptophane, ainsi que son homolo- gue en série D.
Parmi ces derniers, on retient de préférence les dérivés peptidiques dans lesquels :
X-j_ représente un atome d'hydrogène ou un résidu d'histidine, X2 représente un résidu d'alanine,
X3 représente un résidu d'alanine ou d'acide aspartique, X5 représente un résidu d'isoleucine,
X6 représente un résidu de tryptophane ou de D-tryptophane. Parmi les nouveaux dérivés hexapeptidiques préférés de l'invention, on retient plus particulièrement l'un des dérivés peptidiques suivants :
His Ala A a Ile Ile Trp, 1 5
Leu Ala Ile Ile Trp , 1 5
His Leu Ala Ile Ile D Trp, 1 5 Leu Ala Ile Ile D Trp,
1 5
Ala Ala Ile Ile Trp 5 5
Parmi les nouveaux dérivés hexapeptidiques tels que définis ci-dessus, on retient tout particulièrement le dérivé peptidique suivant :
His Ala Ala Ile Ile Trp. 1 5
L'invention a également pour objet, un procédé de prépa¬ ration des nouveaux dérivés hexapeptidiques tels que définis ci-dessus, caractérisé en ce que l'on effectue une synthèse en phase solide en introduisant séquentiellement sur un support de type polystyrène réticulé les a ino-acides dûment protégés, à l'aide d'un agent de couplage, déprotège les amino-acides, et libère de la résine la chaîne peptidique ainsi formée, pour obtenir le dérivé peptidique de formule (I) ainsi recherché. Dans des conditions préférentielles de mise en oeuvre, le procédé ci-dessus décrit est caractérisé en ce que : - le support de type polystyrène réticulé est une résine de type "Boc-Trp-CM" ou de type "Boc-D-Trp-CM" dans laquelle Boc est un groupement tertiobutyloxycarbonyl, Trp est un groupe¬ ment tryptophyl et D-Trp est un groupement D-tryptophyl et CM désigne le support de polystyrène réticulé,
- l'agent de couplage est le (benzotriazol-1-yloxy) tris(dimé- thylamino) phosphoniu hexafluorophosphate ou Bop,
- la libération du support de la chaîne peptidique ainsi que la déprotection des amino-acides est effectuée au moyen de l'acide fluorhydrique en opérant à basse température de préfé-' rence vers 0°C. Les nouveaux dérivés hexapeptidiques, objet de la présente invention présentent de très intéressantes propriétés pharmacologiques ; on note en particulier un remarquable effet antagoniste pratiquement pur contre l'hypertension induite par l'endothéline et un effet antiisché ique, l'activité vasocons- trictrice de l'endothéline étant abolie.
Certaines de ces propriétés sont illustrées plus loin dans la partie expérimentale.
Ces propriétés justifient l'utilisation des nouveaux dérivés hexapeptidiques répondant à la formule (I) ci-dessus à titre de médicaments.
La présente invention a ainsi également pour objet, l'application à titre de médicaments des nouveaux dérivés hexapeptidiques tels que définis par la formule générale (I) ci-dessus. Parmi les médicaments, objet de l'invention, on retient notamment les médicaments, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les produits de formule (I) dans laquelle X-^ représente un atome d'hydrogène, un résidu d'histidine ou de D-histidine, X2 représente un résidu d'alanine ou de leucine, ainsi que leurs homologues en série D,
X3 représente un résidu d'alanine, ainsi que son homologue en série D, Xς représente un résidu d'isoleucine, ainsi que son homologue en série D,
X6 représente un résidu de tryptophane, ou de D-tryptophane.
Parmi ces derniers on retient de préférence les médi¬ caments renfermant les nouveaux dérivés peptidiques tels que définis ci-dessus, dans lesquels :
X1 représente un atome d'hydrogène ou un résidu d'histidine, X2 représente un résidu d'alanine ou de leucine, X3 représente un résidu d'alanine, X5 représente un résidu d'isoleucine,
Xg représente un résidu de tryptophane ou de D-tryptophane.
Parmi les médicaments préférés de l'invention, on retient plus particulièrement ceux constitués par l'un des dérivés peptidiques suivants :
His Ala Ala Ile Ile Trp, 1 5
Leu Ala Ile Ile Trp, 1 5 His Leu Ala Ile Ile D Trp,
1 5
Leu Ala Ile Ile D Trp,
1 5
Ala Ala Ile Ile Trp. 1 5
Parmi les médicaments de l'invention on retient tout particulièrement le dérivé peptidique suivant :
His Ala Ala Ile Ile Trp.
1 5
Ces médicaments trouvent, par exemple, leur emploi dans le traitement de tous les spasmes vasculaires, dans le traite- ment des post-hémorragies cérébrales, dans le traitement des spasmes coronariens, des spasmes vasculaires périphériques ainsi que dans le traitement des insuffisances rénales. Ces médicaments peuvent également être utilisés dans le traitement de l'infarctus du myocarde, dans la prévention des resténoses post-angioplastie , dans le traitement de l'athérosclérose, de certaines formes d'hypertension, ainsi que dans le traitement de l'asthme.
La dose usuelle, variable selon le produit utilisé, le sujet traité et l'affection en cause, peut être par exemple de 1 à 300 g par jour par voie intraveineuse chez l'homme.
L'invention a également pour objet les compositions phar¬ maceutiques qui renferment au moins un dérivé précité à titre de principe actif.
A titre de principe actif, les dérivés peptidiques répon¬ dant à la formule générale (I) , peuvent être incorporés dans des compositions pharmaceutiques destinées à la voie digestive ou parentérale. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être, par exem¬ ple, solides ou liquides et se présenter sous les formes pharmaceutiques couramment utilisées en médecine humaine, comme par exemple, les comprimés simples ou dragéifiés, les gélules, les capsules, les granulés, les suppositoires, les préparations injectables, les aérosols ; elles sont préparées selon les méthodes usuelles. Le ou les principes actifs peuvent être incorporés à des excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, les divers agents mouillants, dispersants ou émulsifiants, les conservateurs.
Il va être donné maintenant à titre non limitatif, des exemples de mise en oeuvre de l'invention.
EXEMPLE 1 : His Ala Ala Ile Ile Trp 1 5
STADE A : Assemblage de la chaîne peptidique
On utilise un support de type "Boc-Trp-CM-support" dans laquelle Boc est un groupement tertiobutyloxycarbonyl, Trp représente un groupement tryptophyl et CM-support désigne le support de polystyrène réticulé. Le support renfermant 0,6 mol Trp/g a été préparé par la méthode au fluorure de potassium selon la technique décrite par Horiki K. , Igano K. & Inouye K. (1978) Che istry Lett. , 165-168. Tous les aminoacides sont N-protégés par le groupement tertiobutylcarbonyl, les groupements protecteurs des chaînes latérales ont été les suivants :
- ester de cyclohexyl pour l'acide aspartique, - Nim-tertiobutyloxycarbonyl pour l'histidine,
- le tryptophane n'est pas protégé.
Les réactions de couplage ont été effectuées en utilisant le Bop ou (benzotriazol-1-yloxy tris (di éthylamino) phospho- nium hexafluorophosphate. Un cycle de couplage peut être résumé comme suit : Déprotectiσn : 1 - Traitement avec une solution d'acide trifluoroacétique
(50 %) dans le dichlorométhane contenant 3 % d'éthanedi- thiol pendant 1 minute. 2 - Vidange puis traitement avec une solution d'acide tri- fluoroacétique à 50 % dans le dichlorométhane contenant
3 % d'éthanedithiol pendant 30 minutes. 3 - Vidange puis lavage avec de l'isopropanol contenant 5 % d'éthanedithiol. 4 - Lavage au dichlorométhane, 2 fois. Couplage :
1 - Addition de Bop et de Boc-acide aminé.
2 - Addition de diisopropyléthylamine (6 équivalents) puis de solvant (dichlorométhane ou diméthylfor amide) sous agi- tation.
3 - Après réaction négative à la ninhydrine lavage 2 fois au dichlorométhane.
Les tests de contrôle utilisant la ninhydrine ont été effectués suivant le procédé décrit par Kaiser, E., Colescott, R.L., Bossinger, CD. & Cook, P.I. (1970) Anal. Bioche . 24, 595-598.
Avant le traitement par l'acide fluorhydrique le dernier groupement Boc est éliminé par l'acide trifluoroacétique.
Au départ de 1 g de résine " Boc-Trp-CM-résine" on a ain- si obtenu en opérant manuellement 1,5 g de complexe chaîne peptidique protégée, résine que l'on utilise directement au stade suivant. STADE B : Libération du complexe chaîne peptidique protégée- résine
On fait réagir 1,5 g de complexe chaîne peptidique proté¬ gée-résine pendant 60 minutes avec 15 ml d'acide fluorhydrique 5 à 0°C en présence d'anisole (1 ml) . La résine est lavée à l'éther ; le peptide brut est extrait par une solution aqueuse d'acide acétique à 20 %. Après lyophilisation, on obtient 250 mg de produit brut.
On lyophilise la fraction obtenue et recueille finalement 10 30 mg de produit attendu.
EXEMPLES 2 à 5 :
En opérant de la même manière qu'à l'exemple 1, mais avec d'autres amino-acides, on a préparé les autres peptides qui 15 figurent ci-après .
EXEMPLE 2 : Leu Ala Ile Ile Trp
1 5
20 EXEMPLE 3 ï His Leu Ala Ile Ile D Trp
1 5
EXEMPLE 4 : Leu Ala Ile Ile D Trp
1 5
25
EXEMPLE 5 : Ala Ala Ile Ile Trp.
1 5
Chaque produit des exemples 1 à 5 a été séquence et sa masse a été vérifiée en spectrométrie de masse. 30 EXEMPLE 6 :
On a préparé un soluté injectable répondant à la formula¬ tion suivante :
- Produit de l'exemple 1 1 mg
- excipient aqueux stérile 2 ml 35
EXEMPLE 7 :
On a préparé des comprimés répondant à la formule sui¬ vante : - Produit de l'exemple 1 2 mg
- excipient q.s.p. un comprimé terminé à 150 mg (composition de l'excipient : lactose, amidon, talc, stéarate de magnésium) . 5
ETUDE DE L'ACTIVITE SUR RECEPTEUR DE L'ENDOTHELINE
On effectue une préparation membranaire à partir de cortex postérieur plus cervelet de rat. Le tissu est broyé au POLYTRON dans un tampon Tris 50 mM pH = 7,4.
10 Après 30 minutes à 25 °C (B.M.) l'homogénat est centrifugé à 30000 g pendant 15 minutes (2 centrifugations avec reprise intermédiaire dans le tampon Tris pH. 7,4). Les culots sont remis en suspension dans un tampon d'incubation (Tris 25 mM, pepstatine A 5 microg/ml, aprotinine
15 3 microg/ml, PMSF 0,1 mM, EDTA 3mM, EGTA ImM pH 7,4).
On répartit des aliquotes de 2 ml dans des tubes à hémolyse et ajoute de la 1251 Endothéline (environ 50000 dpm/tube) et le produit à étudier. (Le produit est d'abord testé à 3*10~5 M en triple) . Lorsque le produit testé déplace
20 de plus de 50 % la radioactivité liée spécifiquement au récepteur, il est testé à nouveau selon une gamme de 7 concentrations afin de déterminer la concentration qui inhibe de 50 % la radioactivité liée spécifiquement au récepteur. On détermine ainsi la concentration inhibitrice 50 %.
25 La liaison non spécifique est déterminée par addition d'endothéline à 10~6 M (en triple) . On incube à 25 °C pendant 60 minutes, remet au bain-marie à 0 °C, pendant 5 minutes, filtre sous pression réduite, rince au tampon Tris 7,4 et compte la radioactivité en présence du scintillant Triton.
30 Le résultat est exprimé directement en concentration inhibitrice 50 % (CI50) , c'est-à-dire en concentration de produit étudié exprimée en nM, nécessaire pour déplacer 50 % de la radioactivité spécifique fixée sur le récepteur étudié.
Ir-
35 Résultat ;
Les CI50 trouvées pour les produits des exemples 1 et 2 sont données dans le tableau I ci-après, en nano oles. TABLEAU I
ETUDE DE L'ACTIVITE VASOCONSTRICTRICE ET DE L'ANTAGONISME DES EFFETS DE L'ENDOTHELINE CHEZ LE RAT DEMEDULLE
Des rats mâles Sprague-Dawley sont anesthésiés au ne butal (60 mg/kg) injecté par voie intrapéritonéale. Les animaux sont ensuite démédullés, mis sous assistance respira¬ toire (1 ml/100 g - 50 insuflations par minute) , puis les nerfs vagues sont sectionnés. Une artère carotide est cathéte- risée pour enregistrer la pression artérielle et les produits à étudier sont injectés dans la veine pudendale. . Etude de l'activité vasoconstrictrice
Les animaux reçoivent l'endothéline 1 ou le composé à tester en injections cumulées par voie veineuse, les administrations étant espacées de 2 minutes. L'augmentation de pression artérielle moyenne (PA ) induite par chaque composé est mesurée et exprimée en pourcen¬ tage de variation par rapport à la pression initiale. • Etude de l'activité antagoniste de l'endothéline
Dix minutes après l'injection intraveineuse du solvant ou des composés à tester, les animaux reçoivent des administra¬ tions d'endothéline 1 de façon cumulative (1, 3, 10 et 30 Mg/kg i.v.) chaque 2 minutes.
L'activité antagoniste est exprimée en pourcentage d'inhibition de la réponse pressive de l'endothéline admi- nistrée seule, aux doses de 3 et 10 μg/kg. Résultats :
L'activité vasoconstrictrice du composé de l'exemple 1 est donnée dans le tableau II ci-après : Tableau II
L 'activité antagoniste du composé de l'exemple 1 est donnée dans le tableau III ci-après :
Tableau III
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE :
(i) DEPOSANT :
(A) NOM : ROUSSEL-UCLAF
(B) RUE : 35, Boulevard des Invalides
(C) VILLE : PARIS
(E) PAYS : FRANCE
(F) CODE POSTAL : 75007
(ii) TITRE DE L'INVENTION :
Nouveaux dérivés hexapeptidiques, procédé de préparation et application à titre de médicaments de ces nouveaux dérivés.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES : 5
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR :
(A) TYPE DE SUPPORT : Floppy Disk 5,25 pouces
(B) ORDINATEUR : IBM PC compatible
(C) SYSTEME D'EXPLOITATION : PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL : Wordperfect 5.1
OEB
(V) DONNEES DE LA DEMANDE ACTUELLE : NUMERO DE DEPOT : FR 92 01558
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N' : 1
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 6 acides aminés
(B) TYPE : peptide
(C) NOMBRE DE BRINS : simple
(D) CONFIGURATION : linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : peptide
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQ ID N* 1 :
His Ala Ala Ile Ile Trp 1 5 LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE :
(i) DEPOSANT :
(A) NOM : ROUSSEL-UCLAF
(B) RUE : 35, Boulevard des Invalides
(C) VILLE : PARIS
(E) PAYS : FRANCE
(F) CODE POSTAL : 75007
(ii) TITRE DE L'INVENTION :
Nouveaux dérivés hexapeptidiques, procédé de préparation et application à titre de médicaments de ces nouveaux dérivés.
(iϋ) NOMBRE DE SEQUENCES : 5
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR :
(A) TYPE DE SUPPORT : Floppy Disk 5,25 pouces
(B) ORDINATEUR : IBM PC compatible
(C) SYSTEME D'EXPLOITATION : PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL : Wordperfect 5.1
OEB
(V) DONNEES DE LA DEMANDE ACTUELLE : NUMERO DE DEPOT : FR 92 01558
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 2
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 5 acides aminés
(B) TYPE : peptide
(C) NOMBRE DE BRINS : simple
(D) CONFIGURATION : linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQ ID N'2 :
Leu Ala Ile Ile Trp 1 5 LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE :
(i) DEPOSANT :
(A) NOM : ROUSSEL-UCLAF
(B) RUE : 35, Boulevard des Invalides
(C) VILLE : PARIS
(E) PAYS : FRANCE
(F) CODE POSTAL : 75007
(ii) TITRE DE L'INVENTION :
Nouveaux dérivés hexapeptidiques, procédé de préparation et application à titre de médicaments de ces nouveaux dérivés.
(iϋ) NOMBRE DE SEQUENCES : 5
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR :
(A) TYPE DE SUPPORT : Floppy Disk 5,25 pouces
(B) ORDINATEUR : IBM PC compatible
(C) SYSTEME D'EXPLOITATION : PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL : Wordperfect 5.1
OEB
(V) DONNEES DE LA DEMANDE ACTUELLE : NUMERO DE DEPOT : FR 92 01558
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N' : 3
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 7 acides aminés
(B) TYPE : peptide
(C) NOMBRE DE BRINS : simple
(D) CONFIGURATION : linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQ ID N'3 :
His Leu Ala Ile Ile D Trp
1 5 LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE :
(i) DEPOSANT :
(A) NOM : ROUSSEL-UCLAF
(B) RUE : 35, Boulevard des Invalides
(C) VILLE : PARIS
(E) PAYS : FRANCE
(F) CODE POSTAL : 75007
(ii) TITRE DE L'INVENTION :
Nouveaux dérivés hexapeptidiques, procédé de préparation et application à titre de médicaments de ces nouveaux dérivés.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES : 5
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR :
(A) TYPE DE SUPPORT : Floppy Disk 5,25 pouces
(B) ORDINATEUR : IBM PC compatible
(C) SYSTEME D'EXPLOITATION : PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL : Wordperfect 5.1
OEB
(V) DONNEES DE LA DEMANDE ACTUELLE : NUMERO DE DEPOT : FR 92 01558
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N' : 4
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 6 acides aminés
(B) TYPE : peptide
(C) NOMBRE DE BRINS : simple
(D) CONFIGURATION : linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : peptide
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQ ID N'4 :
Leu Ala Ile Ile D Trp 1 5 LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE :
(i) DEPOSANT :
(A) NOM : ROUSSEL-UCLAF
(B) RUE : 35, Boulevard des Invalides
(C) VILLE : PARIS
(E) PAYS : FRANCE
(F) CODE POSTAL : 75007
(ii) TITRE DE L'INVENTION :
Nouveaux dérivés hexapeptidiques, procédé de préparation et application à titre de médicaments de ces nouveaux dérivés.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES : 5
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR :
(A) TYPE DE SUPPORT : Floppy Disk 5,25 pouces
(B) ORDINATEUR : IBM PC compatible
(C) SYSTEME D'EXPLOITATION : PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL : Wordperfect 5.1
OEB
(V) DONNEES DE LA DEMANDE ACTUELLE : NUMERO DE DEPOT : FR 92 01558
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N* : 5
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 5 acides aminés
(B) TYPE : peptide
(C) NOMBRE DE BRINS : simple
(D) CONFIGURATION : linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE : peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQ ID N"5 :
Ala Ala Ile Ile Trp 1 5

Claims

REVENDICATIONS 1) Nouveaux dérivés hexapeptidiques répondant à la formule générale (I) :
χ X2 3 Ile X5 Xg (I)
dans laquelle X-^ représente un atome d'hydrogène ou un résidu d'histidine, d'acétyl-histidine, ou de D-histidine, X2 représente un résidu d'alanine, de leucine, de trypto¬ phane, de phenylalanine ainsi que leurs homologues en série D,
X3 représente un résidu d'alanine, ainsi que son homologue en série D,
X5 représente un résidu d'isoleucine, d'alanine, de valine, de norleucine, de leucine et d'acide aspartique ainsi que leurs homologues en série D,
Xg représente un résidu de tryptophane, de leucine, d'isoleu¬ cine, de norleucine et leurs homologues en série D.
2) Dérivés hexapeptidiques selon la revendication 1, caractérisés en ce que :
X-^ représente un atome d'hydrogène, un résidu d'histidine ou de D-histidine, 2 représente un résidu d'alanine ou de leucine, ainsi que leurs homologues en série D, X3 représente un résidu d'alanine, ainsi que son homologue en série D,
X5 représente un résidu d'isoleucine, ainsi que son homologue en série D, g représente un résidu de tryptophane, ainsi que son ho olo- gue en série D.
•3) Dérivés hexapeptidiques selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce que :
X^ représente un atome d'hydrogène ou un résidu d'histidine,
X2 représente un résidu d'alanine, X3 représente un résidu d'alanine,
X5 représente un résidu d'isoleucine,
X6 représente un résidu de tryptophane ou de D-tryptophane.
4) Dérivés peptidiques selon la revendications 3, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par l'un des dérivés peptidiques suivants :
His Ala Ala Ile Ile Trp, 1 5
Leu Ala Ile Ile Trp,
1 5
His Leu Ala Ile Ile D Trp,
1 5 Leu Ala Ile Ile D Trp,
1 5
Ala Ala Ile Ile Trp.
1 5
5) Dérivés hexapeptidiques selon l'une quelconque des revendi¬ cations 1 , 2 ou 3, caractérisés en ce qu'il est constitué par le dérivé peptidique suivant :
His Ala Ala Ile Ile Trp. 1 5
6) Procédé de préparation des nouveaux dérivés hexapeptidiques tels que définis à la revendication 1, caractérisé en ce que l'on effectue une synthèse en phase solide en introduisant séquentiellement sur un support de type polystyrène réticulé les amino-acides dûment protégés, à l'aide d'un agent de couplage, déprotège les amino-acides, et libère de la résine la chaîne peptidique ainsi formée, pour obtenir le dérivé peptidique de formule (I) ainsi recherché. 7) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que :
- le support de type polystyrène réticulé est une résine de type "Boc-Trp-CM" ou de type "Boc-D-Trp-CM" dans laquelle Boc est un groupement tertiobutyloxycarbonyl, Trp est un groupe¬ ment tryptophyl et D-Trp est un groupement D-tryptophyl et CM désigne le support de polystyrène réticulé,
- l'agent de couplage est le (benzotriazol-1-yloxy) tris(dimé- thylamino) phosphoniu hexafluorophosphate ou Bop,
- la libération du support de la chaîne peptidique ainsi que la déprotection des amino-acides est effectuée au moyen de l'acide fluorhydrique en opérant à basse température de préfé¬ rence vers 0°C.
8) Médicaments, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par 5 les nouveaux dérivés hexapeptidiques tels que définis par la formule générale (I) de la revendication 1.
9) Médicaments, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les nouveaux dérivés hexapeptidiques tels que définis à l'une quelconque des revendications 2, 3, 4 ou 5.
10 10) Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment à titre de principe actif, l'un au moins des médi¬ caments tels que définis à l'une quelconque des revendications 8 ou 9.
EP93905388A 1992-02-12 1993-02-11 Nouveaux derives hexapeptidiques, procede de preparation et application a titre de medicaments de ces nouveaux derives Withdrawn EP0579823A1 (fr)

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