EP3465320B1 - Dispositif et procede d'eclairage pour microscopie de fluorescence a onde evanescente - Google Patents

Dispositif et procede d'eclairage pour microscopie de fluorescence a onde evanescente Download PDF

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EP3465320B1
EP3465320B1 EP17726253.2A EP17726253A EP3465320B1 EP 3465320 B1 EP3465320 B1 EP 3465320B1 EP 17726253 A EP17726253 A EP 17726253A EP 3465320 B1 EP3465320 B1 EP 3465320B1
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EP
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substrate
light
angle
emitting devices
sample
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EP17726253.2A
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Alejandro GIACOMOTTI
Maia BRUNSTEIN
Andrea Cattoni
Sophie Bouchoule
Benjamin Damilano
Denis Lefebvre
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Publication date
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    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/648—Specially adapted constructive features of fluorimeters using evanescent coupling or surface plasmon coupling for the excitation of fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01Q—SCANNING-PROBE TECHNIQUES OR APPARATUS; APPLICATIONS OF SCANNING-PROBE TECHNIQUES, e.g. SCANNING PROBE MICROSCOPY [SPM]
    • G01Q60/00—Particular types of SPM [Scanning Probe Microscopy] or microscopes; Essential components thereof
    • G01Q60/18—SNOM [Scanning Near-Field Optical Microscopy] or apparatus therefor, e.g. SNOM probes
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    • G02B27/00—Optical systems or apparatus not provided for by any of the groups G02B1/00 - G02B26/00, G02B30/00
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    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy

Definitions

  • the invention relates to a lighting device for evanescent wave fluorescence microscopy, as well as to a method for evanescent wave fluorescence microscopy using such a device.
  • Evanescent wave fluorescence microscopy (TIRF, from the English “Total Internai Reflection Fluorescence”) is a fluorescence microscopy technique in which the excitation of the fluorescent molecules contained in the observed sample is confined to a region of thickness nanometric, located in the immediate vicinity of the sample slide. It allows, in particular, to selectively observe structures and processes localized on a cell membrane, with spatial resolution in an axial direction much better than the diffraction limit. In addition, compared to more conventional epi-fluorescence techniques, it makes it possible to obtain a better contrast of the fluorescence image and to reduce the effects of photo-bleaching.
  • the substrate SB can be constituted by a sample-holder slide, or by a glass element on which such a slide is placed, while the ambient medium MA can be an aqueous solution containing, in suspension, cells marked with fluorophores.
  • the beam FLI undergoes a total internal reflection (the reference FLR designates the reflected beam) and an evanescent wave OE appears in the ambient medium MA.
  • the evanescent wave excites the fluorophores contained in the ambient medium, but only over a thickness of the order of ⁇ , because beyond its intensity quickly becomes negligible.
  • FIGS. 1B and 1C illustrate two configurations normally used in TIRF microscopy.
  • the same OBJ microscope objective located on the side of the substrate opposite the MA medium, is used both to generate the evanescent waves by total internal reflection and to collect the fluorescence radiation.
  • ON numerical aperture
  • d ⁇ / 2O.N.
  • such an objective presents a very high cost and introduces significant aberrations.
  • a PR prism is used to generate the evanescent waves, and an OBJ objective immersed in the medium MA to collect the fluorescence radiation.
  • the OBJ objective of this configuration is of the water immersion type and generally has a moderate numerical aperture, of the order of 1.1. Compared to the configuration of the figure 1B we lose spatial resolution, but we reduce the cost and the aberrations. On the other hand, the use of a prism makes this configuration more complex and laborious to implement.
  • the invention aims to overcome the aforementioned drawbacks of the prior art. More particularly, it aims to provide a lighting device for evanescent wave fluorescence microscopy which is both economical and simple to use.
  • the device of the figure 2 comprises a planar substrate SB made of transparent material - more precisely, transparent to light in at least one spectral range in the near infrared, visible or near ultraviolet - inside which an EL light emitting device is arranged - typically a a semiconductor device such as a light emitting diode or an end of an optical fiber whose opposite end is coupled to an external light source.
  • the substrate SB can be made of a polymer material, such as PDMS, and be produced by molding, the device EL having previously been placed in the mold. The figure does not show the electrical connections of the EL device, which come out of the substrate.
  • the EL device has a non-directional emission, the light intensity emitted in a direction being proportional to the cosine of the angle formed between said direction and the normal to the emission surface of the device (Lambert law).
  • This emission surface is parallel to a surface S of the substrate SB, on which is placed a microscope slide LM, for example made of glass; an immersion oil HI (or any other material allowing adaptation of the refractive indices) is advantageously interposed between the surface S and the lamella LM.
  • the surface of the strip on the side opposite the substrate is in contact with an ambient medium MA, for example an aqueous solution, having a refractive index lower than that of the substrate SB and of the strip LM.
  • the substrate SB itself can serve as a microscope slide.
  • An opaque mask MO is arranged near the surface S (inside the substrate, or on the external side of the surface) directly above the light emitting device EL, so as to intercept all the light rays emitted by said light device and likely to reach the surface S with an angle of incidence less than the limit angle. Thus, only the rays having angles of incidence greater than the limit angle reach the microscope slide LM and undergo a total internal reflection at the surface between the latter and the ambient medium MA.
  • An ECH sample for example a cell labeled with a fluorescent marker (fluorophore) is positioned on the microscope slide, in an eccentric position relative to the EL device and to the opaque mask MO. More particularly, the sample is positioned in correspondence of a region of the surface of the coverslip where evanescent waves OE, produced by the total internal reflection of the light radiation emitted by the device EL, are present. In a manner known per se, these evanescent waves excite the fluorescence of the fluorophores contained in the sample; an OBJ microscope objective, of the water immersion type, positioned above the sample with an optical axis OA perpendicular to the surface S, is used to collect the fluorescence radiation and to form an image of the spatial distribution fluorophores.
  • a fluorescent marker fluorophore
  • the opaque mask intercepts all the light rays having an angle of incidence less than the limit angle; it suffices that this occurs on a region of the surface S.
  • the mask MO can pass rays of angle of incidence less than the limit angle propagating in a direction opposite to that where the sample and the objective are located.
  • the assembly constituted by the substrate SB, the opaque mask MO and the light emitting device EL is independent of the sample and of the objective, and is therefore easily reusable.
  • the assembly constituted by the substrate SB, the opaque mask MO and the light emitting device EL is independent of the sample and of the objective, and is therefore easily reusable.
  • the penetration length ⁇ of the evanescent waves OE is not constant over the entire surface S, but depends on the angle of incidence of the light rays; it therefore varies as a function of the distance from the vertical of the EL device.
  • the figure 3C shows penetration iso-length curves forming circles around the opaque mask MO.
  • the simplest way to obtain such a result is to replace the non-directional transmitter of the figure 2 by an ELD directional light emitting device (for example a super luminescent diode or a semiconductor laser) whose emission diagram has a maximum in a direction inclined with respect to the normal to the surface S; preferably, this direction forms with the normal to the surface S an angle greater than the limit angle.
  • an ELD directional light emitting device for example a super luminescent diode or a semiconductor laser
  • the emission diagram has a maximum in a direction inclined with respect to the normal to the surface S; preferably, this direction forms with the normal to the surface S an angle greater than the limit angle.
  • the opaque mask MP can be omitted.
  • the figure 5 illustrates a variant in which several directional light emitting devices ELD1, ELD2 are arranged one beside the other. These devices present emission diagrams having maxima in different directions, so as to define on the surface S of the substrate regions characterized by different penetration lengths of evanescent waves, as has been described with reference to figures 3A - 3C .
  • Amplification of the evanescent wave generated in the ambient medium MA can also be obtained by trapping the excitation light radiation in a planar waveguide on the surface of the substrate. SB.
  • a first transparent layer C1, of thickness e c1 and refractive index n c1 covers the surface S of the substrate SB;
  • a second transparent layer C2 of thickness e c2 and refractive index n c2 is arranged above the first layer, in contact with the ambient medium.
  • the thicknesses e c1 and e c2 do not exceed the wavelength of the light radiation emitted by the light emitting device (not shown) contained in the volume of the substrate.
  • the layer C2 is directly in contact with the ambient medium MA and the sample to be observed, without the interposition of a microscope slide separated from the substrate.
  • the refractive index n c1 of the first transparent layer is lower than that, n s , of the substrate: n c1 ⁇ n s ; consequently there is a limit angle such that the light rays coming from the substrate and arriving at its surface S with an angle of incidence greater than this limit angle undergo a total internal reflection.
  • an evanescent wave OE1 is generated in the layer C1.
  • the refractive index n c2 of the second transparent layer is greater both than that of the first transparent layer and that, n 1 , of the ambient medium: n c2 > n c1 ; n c2 > n 1 .
  • the second transparent layer constitutes a planar wave guide.
  • the evanescent wave OE1 generated in the first transparent layer excites a guide mode MG of this guide, which causes the appearance of an evanescent wave OE in the ambient medium - as in the other embodiments.
  • the figure 6B is a graph representing, on a logarithmic scale, the intensity of the evanescent field as a function of the angle of incidence ⁇ and the wavelength ⁇ , for a TE polarization (electric field perpendicular to the plane of incidence). It can be noted that the intensification of the evanescent field occurs only at a determined angle of incidence, a function of the wavelength.
  • the figure 6C shows the normalized intensity spatial profile (relative to the incident intensity) I N of the evanescent field, as a function of the distance z from the surface of the layer C2, for an optimal angle of incidence, equal to 64.2 °.
  • the penetration length is of the order of 110 nm.
  • CM a thin metallic layer
  • LM a few nanometers or tens of nanometers
  • S of the substrate if a separate microscope slide is not present.
  • the simple embodiment of the figure 2 does not make it possible to obtain a uniform illumination (more precisely, an excitation of evanescent waves), since the light rays incident on the surface S come from a single direction.
  • the useful region of the surface S, where the sample to be observed is to be positioned, is located in the vicinity of this axis.
  • an ELA annular emitting device - for example a custom-made light-emitting diode - with an opaque MOA mask in the shape of a circular crown.
  • the sample may contain several types of fluorophores, having different excitation wavelengths.
  • a lighting device according to an embodiment of the invention can then advantageously comprise a plurality of light emitting devices, having different emission wavelengths, adapted to excite the fluorescence of respective fluorophores. These devices can be activated simultaneously or in sequence.
  • the figure 9 illustrates an embodiment of the invention comprising three of these light emitting devices ELa, ELb, ELc, arranged symmetrically around an axis AS and each provided with a respective opaque mask MO1, MO2, MO3.

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Description

  • L'invention porte sur un dispositif d'éclairage pour microscopie de fluorescence à onde évanescente, ainsi que sur un procédé de microscopie de fluorescence à onde évanescente utilisant un tel dispositif.
  • La microscopie de fluorescence à onde évanescente (TIRF, de l'anglais « Total Internai Reflection Fluorescence ») est une technique de microscopie de fluorescence dans laquelle l'excitation des molécules fluorescentes contenues dans l'échantillon observé est confinée à une région d'épaisseur nanométrique, située à proximité immédiate de la lamelle porte-échantillon. Elle permet, en particulier, d'observer de manière sélective des structures et processus localisés sur une membrane cellulaire, avec une résolution spatiale dans une direction axiale bien meilleure que la limite de diffraction. En outre, par rapport aux techniques d'épi-fluorescence plus conventionnelles, elle permet d'obtenir un meilleur contraste de l'image de fluorescence et de réduire les effets de photo-blanchiment.
  • Le principe à la base de la microscopie de fluorescence à onde évanescente est illustré sur la figure 1A. On considère le cas d'un substrat SB d'indice de réfraction n2, présentant une surface S en contact avec un milieu ambiant MA d'indice n1<n2. Par exemple, le substrat SB peut être constitué par une lamelle porte-échantillon, ou par un élément en verre sur lequel est posée une telle lamelle, tandis que le milieu ambiant MA peut être une solution aqueuse contenant, en suspension, des cellules marquées par des fluorophores. Un faisceau lumineux FLI, provenant du substrat SB, est incident sur la surface S ; sa direction de propagation forme avec la normale z à la surface un angle θ supérieur à une valeur critique θc (angle limite) θ c = arcsin n 1 n 2 .
    Figure imgb0001
     Par conséquent le faisceau FLI subit une réflexion totale interne (la référence FLR désigne le faisceau réfléchi) et une onde évanescente OE apparait dans le milieu ambiant MA. Cette onde évanescente présente une intensité qui décroit exponentiellement avec la distance z de la surface S : I(z) = I 0 e -z/δ , où la longueur de pénétration δ est donnée par δ = λ 4 ⁢ π n 2 2 sin 2 θ − n 1 2 ,
    Figure imgb0002
     λ étant la longueur d'onde du rayonnement lumineux. L'onde évanescente excite les fluorophores contenus dans le milieu ambiant, mais seulement sur une épaisseur de l'ordre de δ, car au-delà son intensité devient rapidement négligeable. A titre d'exemple, pour λ=488 nm, n2=1,514 (verre BK7), n1=1,33 (eau) et θ=67°>θc≅61,45°, on trouve δ≅93 nm, ce qui signifie que seuls les fluorophores situés dans une couche d'environ 100 nm d'épaisseur sont excités et contribuent à la réalisation d'une image de fluorescence.
  • Les figures 1B et 1C illustrent deux configurations normalement utilisées en microscopie TIRF.
  • Dans le cas de la figure 1B, un même objectif de microscope OBJ, situé du coté du substrat opposé au milieu MA, est utilisé à la fois pour générer les ondes évanescentes par réflexion totale interne et pour collecter le rayonnement de fluorescence. L'objectif est généralement du type à immersion dans l'huile et peut présenter une ouverture numérique (O.N.) importante, par exemple de l'ordre de 1,45, ce qui permet à son tour d'obtenir une résolution spatiale latérale (perpendiculairement à la direction z) élevée car la résolution spatiale latérale est donnée par d=λ/2O.N. Par contre, un tel objectif présente un coût très élevé et introduit des aberrations significatives.
  • Dans le cas de la figure 1C, on utilise un prisme PR pour générer les ondes évanescentes, et un objectif OBJ immergé dans le milieu MA pour collecter le rayonnement de fluorescence. L'objectif OBJ de cette configuration est du type à immersion dans l'eau et présente généralement une ouverture numérique modérée, de l'ordre de 1,1. Par rapport à la configuration de la figure 1B on perd en résolution spatiale, mais on réduit le coût et les aberrations. Par contre, l'utilisation d'un prisme rend cette configuration plus complexe et laborieuse à mettre en œuvre.
  • Plusieurs configurations alternatives ont été proposées dans la littérature scientifique.
  • L'article de A. Hassanzadeh et al. « Waveguide evanescent field fluorescence microscopy : Thin film fluorescence intensifies and its application in cell biology » Applied Physics Letters 92, 233503 (2008) décrit une configuration dans laquelle un guide d'onde planaire est utilisé en tant que support porte échantillon. Un faisceau lumineux émis par une source externe est couplé dans le guide grâce à un réseau de diffraction. Le principal inconvénient de cette approche est constitué par la complexité de la procédure d'alignement, qui nécessite l'intervention d'un opérateur spécialisé. Un microscope basé sur ce principe ne peut donc pas être utilisé simplement par un biologiste sans expérience dans l'alignement de systèmes optiques.
  • L'article de A. Asanov et al. « A novel form of Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (LG-TIRFM) reveals different and independent lipid raft domains in living cells », Biochimica et Biophysica Acta 1801 (2010), 147 - 155 divulgue un montage similaire, présentant sensiblement les mêmes avantages et inconvénients, mais dans lequel la lumière est couple dans un guide d'onde planaire servant de porte échantillon au moyen d'un conditionneur de faisceau.
  • L'article de S. Ramachandran et al. « High performance, LED powered, waveguide based total internal reflection microscopy», Scientific reports 3 : 2133 (2013) divulgue l'utilisation, en tant que support porte échantillon, d'un guide d'onde planaire en forme de disque. Des diodes électroluminescentes (DEL) agencées autour de ce guide injectent de la lumière dans ce dernier par sa tranche. Le principal inconvénient de cette approche est son efficacité extrêmement faible. Si on considère le cas d'une DEL présentant un cône d'émission d'ouverture égale à 140° situé à 3 mm du bord du guide d'onde, un guide d'onde en forme de disque de 25 mm de diamètre et 0,17 mm d'épaisseur et on s'intéresse à la fraction de la lumière émise qui atteint une région centrale du disque de 1 mm2 de surface, on trouve une efficacité de couplage de l'ordre de 0,05%. Et encore cette valeur constitue une approximation par excès, car on néglige la réflexion par la face d'entrée et on ne considère par le fait que certains des rayons qui pénètrent dans le guide le font avec une direction de propagation qui ne permet pas de réflexion totale interne. Ainsi, il est nécessaire d'utiliser plusieurs DELs de forte puissance, qui sont couteuses et engendrent un échauffement du substrat pouvant s'avérer problématique.
  • L'invention vise à surmonter les inconvénients précités de l'art antérieur. Plus particulièrement, elle vise à procurer un dispositif d'éclairage pour microscopie de fluorescence à onde évanescente qui soit à la fois économique et simple à utiliser.
  • Un objet de l'invention permettant d'atteindre ce but est un dispositif d'éclairage pour microscopie de fluorescence à onde évanescente comprenant :
    • un substrat transparent à la lumière dans au moins une plage spectrale et présentant, dans ladite plage spectrale, un indice de réfraction supérieur à celui de l'eau;
    • au moins un dispositif émetteur de lumière agencé à l'intérieur dudit substrat, adapté pour émettre un rayonnement lumineux dans ladite plage spectrale en direction d'une surface du substrat, ledit dispositif émetteur de lumière étant agencé de telle sorte qu'au moins une portion dudit rayonnement atteigne ladite surface avec un angle d'incidence supérieur ou égal à un angle limite de réflexion totale interne pour une interface entre ledit substrat et de l'eau ; et
    • au moins un masque opaque, agencé à l'intérieur ou à la surface dudit substrat de manière à intercepter une portion dudit rayonnement qui, en l'absence dudit masque, atteindrait ladite surface avec un angle d'incidence inférieur audit angle limite.
  • Selon des modes de réalisation particuliers d'un tel dispositif d'éclairage :
    • Ledit ou au moins un dit dispositif émetteur de lumière peut présenter une émission lumineuse de type directionnel, avec un diagramme d'émission présentant un maximum suivant une direction oblique par rapport à ladite surface du substrat.
    • Le dispositif d'éclairage peut comprendre une pluralité de dits dispositifs émetteurs de lumière présentant des émissions lumineuses de type directionnel avec des diagrammes d'émission présentant des maxima suivant des directions obliques respectives, différentes entre elles, par rapport à ladite surface du substrat.
    • Le dispositif d'éclairage peut comprendre : soit une pluralité de dits dispositifs émetteurs de lumière, agencés de manière symétrique autour d'un axe perpendiculaire à ladite surface du substrat ; soit un dit dispositif émetteur de lumière en forme d'anneau.
    • Le dispositif d'éclairage peut comprendre une pluralité de dits dispositifs émetteurs de lumière adaptés pour émettre ledit rayonnement lumineux dans des portions différentes de ladite plage spectrale.
    • Le dispositif d'éclairage peut comprendre également : une première couche transparente, agencée à la surface dudit substrat et présentant un indice de réfraction inférieur à celui dudit substrat, de telle sorte qu'au moins une portion du rayonnement lumineux émis par ledit ou lesdits dispositifs émetteurs de lumière atteigne une interface entre le substrat et la première couche transparente avec un angle d'incidence supérieur ou égal à un angle limite de réflexion totale interne pour cette interface ; et une deuxième couche transparente, agencée à la surface de ladite première couche transparente opposée audit substrat, présentant un indice de réfraction supérieur à celui de ladite première couche ; lesdites première et deuxième couche présentant des épaisseurs inférieures à au moins une longueur d'onde du rayonnement lumineux émis par ledit ou lesdits dispositifs émetteurs de lumière.
    • Le dispositif d'éclairage peut comprendre également une couche métallique déposée à sa surface éclairée par ledit ou lesdits dispositifs émetteurs de lumière.
  • Un autre objet de l'invention est un système de microscopie de fluorescence à onde évanescente comprenant :
    • un tel dispositif d'éclairage ; et
    • un objectif de microscope agencé pour observer une surface dudit dispositif d'éclairage, ou d'une lamelle de microscope posée sur ladite surface, et ayant un axe optique orthogonal à ladite surface et décalé par rapport au ou aux dispositifs émetteurs de lumière du dispositif d'éclairage.
  • Encore un autre objet de l'invention est un procédé d'éclairage pour microscopie de fluorescence à onde évanescente comprenant des étapes consistant à :
    • mettre un substrat transparent à la lumière dans au moins une plage spectrale en contact avec un milieu présentant, dans ladite plage spectrale, un indice de réfraction inférieur à celui dudit substrat ;
    • activer un dispositif émetteur de lumière agencé à l'intérieur dudit substrat transparent pour qu'il émette un rayonnement lumineux dans ladite plage spectrale en direction d'une surface du substrat, ledit dispositif émetteur de lumière étant agencé de telle sorte qu'au moins une portion dudit rayonnement atteigne ladite surface avec un angle d'incidence supérieur ou égal à un angle limite de réflexion totale interne pour une interface entre ledit substrat et ledit milieu optique ;
      moyennant quoi des ondes évanescentes sont générées à la surface dudit substrat.
  • Selon des modes de réalisation particuliers d'un tel procédé :
    • Au moins un masque opaque peut être agencé à l'intérieur ou à la surface dudit substrat de manière à intercepter une portion dudit rayonnement qui, en l'absence dudit masque, atteindrait ladite surface avec un angle d'incidence inférieur audit angle limite.
    • Ledit milieu peut être aqueux.
    • Ledit ou au moins un dit dispositif émetteur de lumière peut présenter une émission lumineuse de type directionnel, avec un diagramme d'émission présentant un maximum suivant une direction oblique par rapport à ladite surface du substrat.
    • Une première couche transparente peut être agencée à la surface dudit substrat, présentant un indice de réfraction inférieur à celui dudit substrat, de telle sorte qu'au moins une portion du rayonnement lumineux émis par ledit ou lesdits dispositifs émetteurs de lumière atteigne une interface substrat - première couche transparente avec un angle d'incidence supérieur ou égal à un angle limite de réflexion totale interne pour cette interface ; et une deuxième couche transparente peut être agencée à la surface de ladite première couche transparente opposée audit substrat, présentant un indice de réfraction supérieur à celui de ladite première couche ; lesdites première et deuxième couche présentant des épaisseurs inférieures à au moins une longueur d'onde du rayonnement lumineux émis par ledit ou lesdits dispositifs émetteurs de lumière.
    • Une couche métallique peut être agencée à la surface dudit substrat ou à sa proximité, de telle sorte que des plasmons de surface sont excités par lesdites ondes évanescentes.
    • Un échantillon contenant au moins un fluorophore peut être amené en contact de la surface dudit substrat ou à sa proximité, de telle sorte qu'une émission fluorescente dudit fluorophore soit excitée par lesdites ondes évanescentes, ou des ondes évanescentes associées auxdits plasmons de surface, et au moins une image de fluorescence dudit échantillon peut être acquise au moyen d'un objectif de microscope.
    • Ledit ou lesdits dispositifs émetteurs de lumière peuvent être agencés de telle sorte que lesdites ondes évanescentes présentant des longueurs de pénétration différentes en correspondance de différents points de la surface dudit substrat ; ledit substrat est déplacé par rapport audit échantillon, une pluralité d'images de fluorescence étant acquises pour une pluralité de différentes positions relative entre l'échantillon et le substrat, de telle sorte qu'un même point de l'échantillon soit exposé à des ondes évanescentes de longueurs de pénétration différentes ; le procédé pouvant comprendre également une étape de reconstruction d'une image tridimensionnelle d'une distribution des fluorophores à l'intérieur de l'échantillon à partir desdites images de fluorescence.
  • D'autres caractéristiques, détails et avantages de l'invention ressortiront à la lecture de la description faite en référence aux dessins annexés donnés à titre d'exemple et qui représentent, respectivement :
    • les figures 1A à 1C, la technique de microscopie à onde évanescente connue de l'art antérieur ;
    • les figures 2 et 3A à 3C, un premier mode de réalisation de l'invention ;
    • la figure 4, un deuxième mode de réalisation de l'invention ;
    • la figure 5, un troisième mode de réalisation de l'invention ;
    • les figures 6A à 6C, un quatrième mode de réalisation de l'invention ;
    • la figure 7, un cinquième mode de réalisation de l'invention ;
    • les figures 8A et 8B, deux variantes d'un sixième mode de réalisation de l'invention ; et
    • la figure 9, un septième mode de réalisation de l'invention.
  • Le dispositif de la figure 2 comprend un substrat planaire SB en matériau transparent - plus précisément, transparent à la lumière dans au moins une plage spectrale dans le proche infrarouge, le visible ou le proche ultraviolet - à l'intérieur duquel est agencé un dispositif émetteur de lumière EL - typiquement un dispositif à semi-conducteur tel qu'une diode électroluminescente ou une extrémité d'une fibre optique dont l'extrémité opposée est couplée à une source lumineuse externe. Par exemple, le substrat SB peut être en matériau polymère, tel que du PDMS, et être réalisé par moulage, le dispositif EL ayant préalablement été placé dans le moule. La figure ne montre pas les connexions électriques du dispositif EL, qui sortent du substrat. Dans le mode de réalisation de la figure 2, le dispositif EL présente une émission non directionnelle, l'intensité lumineuse émise dans une direction étant proportionnelle au cosinus de l'angle formé entre ladite direction et la normale à la surface d'émission du dispositif (loi de Lambert). Cette surface d'émission est parallèle à une surface S du substrat SB, sur laquelle est posée une lamelle de microscope LM, par exemple en verre ; une huile d'immersion HI (ou tout autre matériau permettant une adaptation des indices de réfraction) est avantageusement interposée entre la surface S et la lamelle LM. La surface de la lamelle du côté opposé au substrat est en contact avec un milieu ambiant MA, par exemple une solution aqueuse, présentant un indice de réfraction inférieur à ceux du substrat SB et de la lamelle LM. En variante, le substrat SB lui-même peut servir de lamelle de microscope.
  • Un masque opaque MO est agencé à proximité de la surface S (à l'intérieur du substrat, ou du côté externe de la surface) directement au-dessus du dispositif émetteur de lumière EL, de manière à intercepter tous les rayons lumineux émis par ledit dispositif et susceptibles de parvenir à la surface S avec un angle d'incidence inférieur à l'angle limite. Ainsi, seul les rayons possédant des angles d'incidence supérieurs à l'angle limite parviennent à la lamelle de microscope LM et subissent une réflexion totale interne à la surface entre cette dernière et le milieu ambiant MA.
  • Un échantillon ECH, par exemple une cellule marquée avec un marqueur fluorescent (fluorophore), est positionné sur la lamelle de microscope, à une position excentrée par rapport au dispositif EL et au masque opaque MO. Plus particulièrement, l'échantillon est positionné en correspondance d'une région de la surface de la lamelle où des ondes évanescentes OE, produites par la réflexion totale interne du rayonnement lumineux émis par le dispositif EL, sont présentes. D'une manière connue en soi, ces ondes évanescentes excitent la fluorescence des fluorophores contenus dans l'échantillon ; un objectif de microscope OBJ, du type à immersion dans l'eau, positionné au-dessus de l'échantillon avec un axe optique OA perpendiculaire à la surface S, est utilisé pour recueillir le rayonnement de fluorescence et former une image de la répartition spatiale des fluorophores.
  • On remarquera qu'il n'est pas indispensable que le masque opaque intercepte tous les rayons lumineux présentant un angle d'incidence inférieur à l'angle limite ; il suffit que cela se produise sur une région de la surface S. Par exemple, dans le cas de la figure 2, le masque MO peut laisser passer des rayons d'angle d'incidence inférieur à l'angle limite se propageant dans une direction opposée à celle où se trouvent l'échantillon et l'objectif. Il est cependant préférable que le masque MO intercepte au moins la plus grande partie des rayons lumineux ayant un angle d'incidence inférieur à l'angle limite, de manière à minimiser la lumière parasite susceptible de parvenir à l'objectif.
  • L'ensemble constitué par le substrat SB, le masque opaque MO et le dispositif émetteur de lumière EL est indépendant de l'échantillon et de l'objectif, et est donc facilement réutilisable. Par ailleurs, peut être très peu couteux, et sa structure « monolithique » évite d'avoir à effectuer des opérations complexes d'alignement.
  • Une caractéristique intéressante du dispositif de la figure 2 est que la longueur de pénétration δ des ondes évanescentes OE n'est pas constante sur toute la surface S, mais dépend de l'angle d'incidence des rayons lumineux ; elle varie donc en fonction de la distance par rapport à la verticale du dispositif EL. Les figures 3A et 3B montrent que pour une longueur d'onde λ=488 nm, en supposant un substrat d'indice de réfraction égal à 1,514 et un milieu ambiant aqueux, la profondeur de pénétration varie de 290 nm à 90 nm lorsque l'angle d'incidence passe de 62° à 67°. La figure 3C montre des courbes d'iso-longueur de pénétration formant des cercles autour du masque opaque MO. Cela est avantageux, car il suffit de décaler latéralement le substrat SB par rapport à la lamelle de microscope LM pour choisir une longueur de pénétration adaptée à une application particulière. Il est même possible d'acquérir plusieurs images de fluorescence d'un même échantillon avec des longueurs de pénétration différentes. En soustrayant ces images deux à deux il est possible de reconstruire, par tranches, la distribution tridimensionnelle de fluorophores, et cela avec une résolution nanométrique dans une direction axiale.
  • On considère le cas d'un dispositif EL à émission non directionnelle situé 1,8 mm au-dessous de la surface S d'un substrat en PDMS (indice de réfraction 1,41), sur lequel est posée une lamelle de microscope en verre de 0,5 mm d'épaisseur ; le milieu ambiant est l'air. Dans ces conditions, la réflexion totale est atteinte au-delà d'une circonférence de diamètre égal à environ 4,5 mm, centrée autour de la normale à la surface S passant par le centre du dispositif EL. Des ondes évanescentes sont générées sur une couronne circulaire dont le diamètre externe atteint 11 mm. Sur une surface de 1 mm2 à une distance horizontale de 5 mm de la normale à la surface S passant par le centre du dispositif EL, on récupère 0,7% de l'intensité lumineuse totale émise par le dispositif. Cette efficacité est supérieure de plus d'un ordre de grandeur s à celle atteinte en utilisant la configuration proposée dans l'article précité de S. Ramachandran et al. Il faut néanmoins reconnaître que cette efficacité reste relativement faible ; d'autres modes de réalisation de l'invention permettent de l'améliorer.
  • La manière la plus simple d'obtenir un tel résultat consiste à remplacer l'émetteur non directionnel de la figure 2 par un dispositif émetteur de lumière directionnel ELD (par exemple une diode super luminescente ou un laser à semi-conducteur) dont le diagramme d'émission présente un maximum suivant une direction inclinée par rapport à la normale à la surface S ; de préférence, cette direction forme avec la normale à la surface S un angle supérieur à l'angle limite. Cela est illustré par la figure 3. Dans certains cas, si l'émission du dispositif ELD est suffisamment directionnelle, le masque opaque MP peut être omis.
  • La figure 5 illustre une variante dans laquelle plusieurs dispositifs émetteur de lumière directionnels ELD1, ELD2 sont agencés les uns à côtés des autres. Ces dispositifs présentent des diagrammes d'émission ayant des maxima selon des directions différentes, de manière à définir à la surface S du substrat des régions caractérisées par des longueurs de pénétration des ondes évanescentes différentes, comme cela a été décrit en référence aux figures 3A - 3C.
  • Une amplification de l'onde évanescente générée dans le milieu ambiant MA peut également être obtenue en piégeant le rayonnement lumineux d'excitation dans un guide d'onde planaire à la surface du substrat SB. Une telle configuration est illustrée sur la figure 6A. Plus précisément, une première couche transparente C1, d'épaisseur ec1 et indice de réfraction nc1 recouvre la surface S du substrat SB ; une deuxième couche transparente C2 d'épaisseur ec2 et indice de réfraction nc2 est agencée au-dessus de la première couche, en contact avec le milieu ambiant. Les épaisseurs ec1 et ec2 n'excèdent pas la longueur d'onde du rayonnement lumineux émis par le dispositif émetteur de lumière (non représenté) contenu dans le volume du substrat. De préférence, la couche C2 est directement en contact avec le milieu ambiant MA et l'échantillon à observer, sans interposition d'une lamelle de microscope séparée du substrat.
  • L'indice de réfraction nc1 de la première couche transparente est inférieur à celui, ns, du substrat : nc1<ns ; par conséquent il existe un angle limite tel que les rayons lumineux provenant du substrat et parvenant à sa surface S avec un angle d'incidence supérieur à cet angle limite subissent une réflexion totale interne. Ainsi, une onde évanescente OE1 est générée dans la couche C1.
  • L'indice de réfraction nc2 de la deuxième couche transparente est supérieur à la fois à celui de la première couche transparente et à celui, n1, du milieu ambiant : nc2>nc1 ; nc2>n1. Dans ces conditions, la deuxième couche transparente constitue un guide d'onde planaire. L'onde évanescente OE1 générée dans la première couche transparente excite un mode guide MG de ce guide, ce qui provoque l'apparition d'une onde évanescente OE dans le milieu ambiant - comme dans les autres modes de réalisation. Des simulations numériques permettent de vérifier que, pour un angle d'incidence particulier, l'intensité de l'onde évanescente dans le milieu MA est augmentée très sensiblement (jusqu'à trois ordres de grandeur) par rapport au cas de la figure 2, où les couches transparentes C1 et C2 ne sont pas présentes.
  • Des simulations numériques ont été effectuées dans le cas λ=470 nm, ns=1,52, nc1=1,23, ec1=450 nm, nc2=1,7, ec2=290 nm, n1=1,33 (milieu ambiant constitué par de l'eau). La figure 6B est un graphique représentant, en échelle logarithmique, l'intensité du champ évanescent en fonction de l'angle d'incidence θ et de la longueur d'onde λ, pour une polarisation TE (champ électrique perpendiculaire au plan d'incidence). On peut remarquer que l'intensification du champ évanescent ne se produit qu'à un angle d'incidence déterminé, fonction de la longueur d'onde. La figure 6C montre le profil spatial d'intensité normalisée (par rapport à l'intensité incidente) IN du champ évanescent, en fonction de la distance z de la surface de la couche C2, pour un angle d'incidence optimal, égal à 64,2°. La longueur de pénétration est de l'ordre de 110 nm.
  • Une autre possibilité, illustrée sur la figure 7, consiste à déposer une couche métallique mince CM (quelques nanomètres ou dizaines de nanomètres) sur la surface de la lamelle de microscope LM (cas illustré sur la figure) ou sur la surface S du substrat, si une lamelle de microscope distincte n'est pas présente. En choisissant de manière opportune l'épaisseur de la couche CM, la longueur d'onde du rayonnement lumineux et son angle d'incidence il est possible de générer des plasmons de surface, qui amplifient grandement les ondes évanescentes. Cet effet a été décrit, dans une configuration d'éclairage tout à fait différente, dans l'article de K. Balaa et E. Fort « Surface Plasmon Enhanced TIRF Imaging », Imaging & Microscopy - Octobre 2009.
  • Le mode de réalisation simple de la figure 2 ne permet pas d'obtenir un éclairage (plus précisément, une excitation d'ondes évanescentes) homogène, car les rayons lumineux incidents sur la surface S proviennent d'une seule direction. Comme illustré sur la figure 8A, pour obtenir un éclairage plus uniforme, il est possible d'utiliser une pluralité de dispositifs émetteurs de lumière EL1, EL2, EL3, chacun pourvu d'un masque opaque respectif, MO1, MO2, MO3, agencés de manière symétrique autour d'un axe perpendiculaire à la surface S du substrat. La région utile de la surface S, où doit être positionné l'échantillon à observer, se trouve dans le voisinage de cet axe. Il est également possible d'utiliser un dispositif émetteur de forme annulaire ELA - par exemple une diode électroluminescente fabriquée sur mesure - avec un masque opaque MOA en forme de couronne circulaire.
  • Dans certaines applications, l'échantillon peut contenir plusieurs types de fluorophores, présentant des longueurs d'onde d'excitation différentes. Un dispositif d'éclairage selon un mode de réalisation de l'invention peut alors comprendre, de manière avantageuse, une pluralité de dispositifs émetteurs de lumière, présentant des longueurs d'onde d'émission différentes, adaptées pour exciter la fluorescence de fluorophores respectifs. Ces dispositifs peuvent être activés de manière simultanée ou en séquence. La figure 9 illustre un mode de réalisation de l'invention comprenant trois de ces dispositifs émetteurs de lumière ELa, ELb, ELc, agencés de manière symétrique autour d'un axe AS et pourvus chacun d'un masque opaque respectif MO1, MO2, MO3.
  • Ces différents modes de réalisation peuvent être combinés entre eux. Ainsi, par exemple, il est possible d'agencer de manière symétrique autour d'un axe une pluralité de groupes de dispositifs émetteurs, éventuellement directionnels, chaque dispositif d'un groupe présentant une longueur d'onde d'émission différente. De même, l'utilisation d'un guide d'onde ou d'une couche métallique pour amplifier les ondes évanescentes est compatible avec celle de dispositifs d'émission directionnels. Il est également possible de combiner, dans un même dispositif, l'utilisation d'un guide d'onde (cf. figure 6A) et une couche métallique (cf. figure 4).

Claims (16)

  1. Dispositif d'éclairage pour microscopie de fluorescence à onde évanescente comprenant :
    - un substrat (SB) transparent à la lumière dans au moins une plage spectrale et présentant, dans ladite plage spectrale, un indice de réfraction supérieur à celui de l'eau;
    - au moins un dispositif émetteur de lumière (EL) agencé à l'intérieur dudit substrat, adapté pour émettre un rayonnement lumineux dans ladite plage spectrale en direction d'une surface (S) du substrat, ledit dispositif émetteur de lumière étant agencé de telle sorte qu'au moins une portion dudit rayonnement atteigne ladite surface avec un angle d'incidence supérieur ou égal à un angle limite de réflexion totale interne pour une interface entre ledit substrat et de l'eau ; et
    - au moins un masque opaque (MO), agencé à l'intérieur ou à la surface dudit substrat de manière à intercepter une portion dudit rayonnement qui, en l'absence dudit masque, atteindrait ladite surface avec un angle d'incidence inférieur audit angle limite.
  2. Dispositif selon la revendication 1 dans lequel ledit ou au moins un dit dispositif émetteur de lumière (ELD, ELD1, ELD2) présente une émission lumineuse de type directionnel, avec un diagramme d'émission présentant un maximum suivant une direction oblique par rapport à ladite surface du substrat.
  3. Dispositif selon la revendication 2 comprenant une pluralité de dits dispositifs émetteurs de lumière (ELD1, ELD2) présentant des émissions lumineuses de type directionnel avec des diagrammes d'émission présentant des maxima suivant des directions obliques respectives, différentes entre elles, par rapport à ladite surface du substrat.
  4. Dispositif selon l'une des revendications précédentes comprenant :
    - soit une pluralité de dits dispositifs émetteurs de lumière (EL1, EL2, EL3), agencés de manière symétrique autour d'un axe (AS) perpendiculaire à ladite surface du substrat ;
    - soit un dit dispositif émetteur de lumière (ELA) en forme d'anneau.
  5. Dispositif selon l'une des revendications précédentes comprenant une pluralité de dits dispositifs émetteurs de lumière (ELa, ELb, ELc) adaptés pour émettre ledit rayonnement lumineux dans des portions différentes de ladite plage spectrale.
  6. Dispositif selon l'une des revendications précédentes comprenant également :
    - une première couche transparente (C1), agencée à la surface dudit substrat et présentant un indice de réfraction inférieur à celui dudit substrat, de telle sorte qu'au moins une portion du rayonnement lumineux émis par ledit ou lesdits dispositifs émetteurs de lumière atteigne une interface entre le substrat et la première couche transparente avec un angle d'incidence supérieur ou égal à un angle limite de réflexion totale interne pour cette interface ; et
    - une deuxième couche transparente (C2), agencée à la surface de ladite première couche transparente opposée audit substrat, présentant un indice de réfraction supérieur à celui de ladite première couche ;
    lesdites première et deuxième couche présentant des épaisseurs inférieures à au moins une longueur d'onde du rayonnement lumineux émis par ledit ou lesdits dispositifs émetteurs de lumière.
  7. Dispositif selon l'une des revendications précédentes comprenant également une couche métallique (CM) déposée à sa surface éclairée par ledit ou lesdits dispositifs émetteurs de lumière.
  8. Système de microscopie de fluorescence à onde évanescente comprenant :
    - un dispositif d'éclairage selon l'une des revendications précédentes ; et
    - un objectif de microscope (OBJ) agencé pour observer une surface (S) dudit dispositif d'éclairage, ou d'une lamelle de microscope posée sur ladite surface, et ayant un axe optique (AO) orthogonal à ladite surface et décalé par rapport au ou aux dispositifs émetteurs de lumière du dispositif d'éclairage.
  9. Procédé d'éclairage pour microscopie de fluorescence à onde évanescente comprenant des étapes consistant à :
    - mettre un substrat (SB) transparent à la lumière dans au moins une plage spectrale en contact avec un milieu (MA) présentant, dans ladite plage spectrale, un indice de réfraction inférieur à celui dudit substrat ;
    - activer un dispositif émetteur de lumière (EL) agencé à l'intérieur dudit substrat transparent pour qu'il émette un rayonnement lumineux dans ladite plage spectrale en direction d'une surface (S) du substrat, ledit dispositif émetteur de lumière étant agencé de telle sorte qu'au moins une portion dudit rayonnement atteigne ladite surface avec un angle d'incidence supérieur ou égal à un angle limite de réflexion totale interne pour une interface entre ledit substrat et ledit milieu optique ;
    moyennant quoi des ondes évanescentes (OE) sont générées à la surface dudit substrat.
  10. Procédé selon la revendication 9 dans lequel au moins un masque opaque (MO) est agencé à l'intérieur ou à la surface dudit substrat de manière à intercepter une portion dudit rayonnement qui, en l'absence dudit masque, atteindrait ladite surface avec un angle d'incidence inférieur audit angle limite.
  11. Procédé selon l'une des revendications 9 ou 10 dans lequel ledit milieu est aqueux.
  12. Procédé selon l'une des revendications 9 à 11 dans lequel ledit ou au moins un dit dispositif émetteur de lumière présente une émission lumineuse de type directionnel, avec un diagramme d'émission présentant un maximum suivant une direction oblique par rapport à ladite surface du substrat.
  13. Procédé selon l'une des revendications 9 à 12 dans lequel :
    - une première couche transparente (C1) est agencée à la surface dudit substrat et présente un indice de réfraction inférieur à celui dudit substrat, de telle sorte qu'au moins une portion du rayonnement lumineux émis par ledit ou lesdits dispositifs émetteurs de lumière atteigne une interface substrat - première couche transparente avec un angle d'incidence supérieur ou égal à un angle limite de réflexion totale interne pour cette interface ; et
    - une deuxième couche transparente (C2) est agencée à la surface de ladite première couche transparente opposée audit substrat et présente un indice de réfraction supérieur à celui de ladite première couche ;
    lesdites première et deuxième couche présentant des épaisseurs inférieures à au moins une longueur d'onde du rayonnement lumineux émis par ledit ou lesdits dispositifs émetteurs de lumière.
  14. Procédé selon l'une des revendications 9 à 13 dans lequel une couche métallique (CM) est agencée à la surface dudit substrat ou à sa proximité, de telle sorte que des plasmons de surface sont excités par lesdites ondes évanescentes.
  15. Procédé selon l'une des revendications 9 à 14 dans lequel un échantillon (ECH) contenant au moins un fluorophore est amené en contact de la surface dudit substrat ou à sa proximité, de telle sorte qu'une émission fluorescente dudit fluorophore soit excitée par lesdites ondes évanescentes, ou des ondes évanescentes associées auxdits plasmons de surface, et dans lequel au moins une image de fluorescence dudit échantillon est acquise au moyen d'un objectif de microscope.
  16. Procédé selon la revendication 15 dans lequel :
    - ledit ou lesdits dispositifs émetteurs de lumière sont agencés de telle sorte que lesdites ondes évanescentes présentant des longueurs de pénétration différentes en correspondance de différents points de la surface dudit substrat ;
    - ledit substrat est déplacé par rapport audit échantillon et une pluralité d'images de fluorescence sont acquises pour une pluralité de différentes positions relative entre l'échantillon et le substrat, de telle sorte qu'un même point de l'échantillon soit exposé à des ondes évanescentes de longueurs de pénétration différentes ;
    - le procédé comprenant également une étape de reconstruction d'une image tridimensionnelle d'une distribution des fluorophores à l'intérieur de l'échantillon à partir desdites images de fluorescence.
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