ES2075438T5 - Suspensiones de microburbujas estables inyectables en organismos vivos. - Google Patents

Abstract

SUSPENSIONES MICROBURBUJAS RELLENAS DE GAS O AIRE EN FASES ACUOSAS UTILIZABLES COMO AGENTES DE CONTRASTE DE IMAGEN EN ECOGRAFIAS ULTRASONICAS. CONTIENEN SURFACTANTES LAMINADOS Y, OPCIONALMENTE, ESTABILIZADORES HIDROFILICOS. LOS SURFACTANTES LAMINADOS PUEDEN SERLO EN LA FORMA DE LIPOSOMAS. LAS SUSPENSIONES SE OBTIENEN POR LA EXPOSICION DE SURFACTANTES LAMINADOS AL AIRE O A UN GAS ANTES O DESPUES DE SU MEZCLA CON UNA FASE ACUOSA.

Description

Suspensiones de microburbujas estables inyectables en organismos vivos.

La presente invención se refiere a suspensiones inyectables de microburbujas de aire o gas, limitadas por una interfase de líquido a gas en el interior de una fase de vehículo acuoso fisiológicamente aceptable, en que las microburbujas de aire o gas no están encapsuladas dentro de vesículas liposómicas, útiles para ecografía ultrasónica del torrente sanguíneo y de cavidades corporales de seres vivos, comprendiendo la suspensión desde aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20% en peso de agentes tensioactivos disueltos o dispersados, caracterizado porque al menos uno de los agentes tensioactivos es un fosfolípido formador de película, presente al menos parcialmente en forma de laminillas o forma laminar, y la suspensión no contiene una sal de hierro (III).

La invención se refiere también a métodos para preparar las suspensiones de la invención, y al uso de composiciones secas que, cuando se mezclan con un vehículo líquido acuoso, generarán la suspensión de microburbujas estéril que antecede utilizable después como agente de contraste para ecografía ultrasónica y otros fines.

Es bien sabido que microcuerpos tales como microesferas o microglóbulos de aire o de un gas, p.ej. microburbujas o microbalones suspendidos en un líquido, son reflectores ultrasónicos excepcionalmente eficientes para ecografía. En esta descripción, el término "microburbuja" designa específicamente glóbulos de aire o gas en suspensión en un líquido que resulta generalmente de la introducción en él de aire o un gas en forma dividida, conteniendo también preferiblemente el líquido agentes tensioactivos con actividad superficial para controlar las propiedades de superficie de aquéllos y la estabilidad de las burbujas. Más específicamente, puede considerarse que el volumen interno de las microburbujas está limitado por la interfase gas/líquido, o en otros términos, que las microburbujas están limitadas únicamente por una envoltura más bien evanescente que implica las moléculas del líquido y del agente tensioactivo unidas con poca cohesión en los límites de la unión del gas con el líquido.

En contraste, el término de "microcápsula" o "microbalón" designa preferiblemente masas de aire o gas con un límite o envoltura material formado por moléculas distintas del líquido de suspensión, p.ej. una pared de membrana de polímero. Tanto las microburbujas como los microbalones son útiles como agentes de contraste ultrasónicos. Por ejemplo, la inyección en el torrente sanguíneo de los seres vivos de suspensiones de microburbujas o microbalones de gas (en el intervalo de 0,5 a 10 \mum) en un vehículo líquido reforzará fuertemente la formación de imagen por ecografía ultrasónica, ayudando así a la visualización de los órganos internos. La formación de imágenes de vasos y órganos internos puede ayudar notablemente al diagnóstico médico, por ejemplo para la detección de enfermedades cardiovasculares y de otros tipos.

La formación de suspensiones de microburbujas en un vehículo líquido inyectable adecuado para ecografía puede seguir diversos caminos. Por ejemplo, en el documento DE-A-3529195 (Max-Planck Gesell.), se describe una técnica para generar burbujas de 0,5-50 \mum en la cual una mezcla emulsionada acuosa que contiene un polímero soluble en agua, un aceite y sales minerales se impulsa alternativamente hacia atrás y hacia adelante, junto con una pequeña cantidad de aire, de una jeringuilla a otra a través de una pequeña abertura. En este caso, las fuerzas mecánicas son las responsables de la formación de burbujas en el líquido.

M. W. Keller y colaboradores (J. Ultrasound Med. 5 (1986), 439-8) han consignado el sometimiento a cavitación ultrasónica a la presión atmosférica de soluciones que contienen altas concentraciones de solutos tales como dextrosa. Renografin-76, Iopamidol (un agente de contraste de rayos X), y análogos. En este caso, el aire se hace pasar a la solución por la energía de cavitación.

Otras técnicas se basan en la agitación de un vehículo líquido en el cual se han incorporado micropartículas que contienen aire, conteniendo usualmente dicho vehículo líquido, como estabilizadores, agentes aumentadores de la viscosidad, p.ej. polipéptidos o carbohidratos y/o agentes tensioactivos solubles en agua. Se admite de hecho que la estabilidad de las microburbujas contra la destrucción o el escape a la atmósfera está controlada por la viscosidad y las propiedades de superficie del vehículo líquido. El aire o el gas contenido en las micropartículas puede estar constituido por gas inter-particular o intra-cristalino atrapado, así como gas adsorbido en la superficie, o gas producido por reacciones con el vehículo líquido, usualmente acuoso. Todo esto se describe en detalle por ejemplo en el documento EP-A-52.575 (Ultra Med. Inc.) en el cual se utilizan agregados de partículas de 1-50 \mum de carbohidratos (p.ej. galactosa, maltosa, sorbitol, ácido glucónico, sacarosa, glucosa y análogos), en soluciones acuosas de glicoles o poliglicoles, u otros polímeros solubles en agua.

Asimismo, en los documentos EP-A-123.235 y 122.624 (Schering, véase también el documento EP-A-320.433) se hace uso de aire atrapado en sólidos. Por ejemplo, el documento 122.624 reivindica una composición de contraste con vehículo líquido para ecografía ultrasónica que contiene micropartículas de un agente tensioactivo sólido, estando opcionalmente combinadas las últimas con micropartículas de un agente no tensioactivo. Como se explica en este documento, la formación de burbujas de aire en la solución es el resultado de la liberación del aire adsorbido en la superficie de las partículas, o atrapado en el interior de la red de partículas, o aprisionado entre partículas individuales, ocurriendo esto cuando las partículas se agitan con el vehículo líquido.

El documento EP-A-131.540 (Schering), describe también la preparación de suspensiones de microburbujas en las cuales un vehículo líquido inyectable estabilizado, p.ej. una solución acuosa fisiológica de sal común, o una solución de un azúcar como maltosa, dextrosa, lactosa o galactosa, sin aumentador de viscosidad, se mezcla con micropartículas (en el intervalo de 0,1 a 1 \mum) de los mismos azúcares que contienen aire atrapado. Con objeto de que la suspensión de burbujas pueda desarrollarse en el seno del vehículo líquido, los documentos que anteceden recomiendan que los componentes líquidos y sólidos se agiten juntos enérgicamente en condiciones estériles; la agitación de ambos componentes juntos se realiza durante unos cuantos segundos y, una vez obtenida, la suspensión tiene que utilizarse luego inmediatamente, es decir debe inyectarse dentro de 5-10 minutos para las medidas ecográficas; esto indica que las burbujas en las suspensiones no tienen larga vida y un problema práctico con el uso de las suspensiones de microburbujas para inyección es la carencia de estabilidad con el tiempo. La presente invención remedia por completo este inconveniente.

En el documento US-A-4.466.442 (Schering), se describe una serie de técnicas diferentes para producir suspensiones de microburbujas de gas en un vehículo líquido utilizado (a) una solución de un agente con actividad superficial (tensioactivo) en un vehículo líquido (acuoso) y (b) una solución de un aumentador de la viscosidad como estabilizador. Para generar las burbujas, las técnicas utilizadas en dicho documento incluyen hacer pasar a alta velocidad una mezcla de (a), (b) y aire a través de una abertura pequeña; o inyectar (a) en (b) inmediatamente antes de su empleo junto con un gas fisiológicamente aceptable; o añadir un ácido a (a) y un carbonato a (b), mezclándose ambos componentes uno con otro inmediatamente antes de su empleo y reaccionando el ácido con el carbonato para generar burbujas de CO_{2}; o añadir un gas a sobrepresión a una mezcla de (a) y (b) en almacenamiento, liberándose dicho gas en forma de microburbujas en el momento en que la mezcla se utiliza para inyección.

Los agentes con actividad superficial utilizados en el componente (a) del documento US-A-4.466.442 comprenden lecitinas; ésteres y éteres de ácidos grasos y alcoholes grasos con polioxietileno y polioles polioxietilados como sorbitol, glicoles y glicerol, colesterol; y polímeros polioxietileno-polioxipropileno. Los compuestos que elevan y estabilizan la viscosidad incluyen por ejemplo mono- y polisacáridos (glucosa, lactosa, sacarosa, dextrano, sorbitol); polioles, p.ej. glicerol, poliglicoles y polipéptidos como proteínas, gelatina, oxipoligelatina, proteína de plasma y análogos.

En un ejemplo preferido típico de este documento, volúmenes equivalentes de (a) una solución acuosa de 0,5% en peso de Pluronic F-68 (un polímero polioxipropileno-polioxietileno) y (b) una solución de lactosa al 10% se agitan enérgicamente juntos en condiciones estériles (viales cerrados) para proporcionar una suspensión de micro-burbujas lista para su empleo como agente de contraste ultrasónico y que tiene una duración de al menos 2 minutos. Aproximadamente 50% de las microburbujas tenían un tamaño inferior a 50 \mum.

Aunque los logros de la técnica anterior son meritorios, los mismos presentan varios inconvenientes que limitan en grado importante su uso práctico en los médicos y en los hospitales, a saber su período de vida relativamente corto (que hace difícil la reproducibilidad de los ensayos), concentración inicial de burbujas relativamente baja (el número de burbujas excede raramente de 10^{4}-10^{5} burbujas/ml y el recuento disminuye rápidamente con el tiempo) y la escasa reproducibilidad del recuento inicial de burbujas de un ensayo a otro (lo cual hace también difíciles las comparaciones). Asimismo, se admite que para la formación eficiente de imágenes de ciertos órganos, p.ej. el lado izquierdo del corazón, se requieren burbujas menores que 50 \mum, preferiblemente comprendidas en el intervalo de 0,5-10 \mum; con burbujas de mayor tamaño, se presentan riesgos de coágulos y de embolia consiguiente.

Adicionalmente, la presencia obligada de micropartículas sólidas o concentraciones altas de electrólitos y otros solutos relativamente inertes en el vehículo líquido puede ser indeseable fisiológicamente en algunos casos. Finalmente, las suspensiones son totalmente inestables al almacenamiento y no pueden comercializarse como tales; por consiguiente se requiere una gran experiencia para preparar las microburbujas en el momento preciso inmediatamente antes de su empleo.

Por supuesto que existen suspensiones estables de microcápsulas, p.ej. microbalones con una membrana polímera rígida sólida, estanca al aire, que resisten perfectamente durante largos períodos de almacenamiento en suspensión, las cuales se han desarrollado para remediar este inconveniente (véase por ejemplo, K.J. Widder, documento EP-A-324.938); sin embargo, las propiedades de microcápsulas en las cuales un gas está atrapado en el interior de vesículas de membrana sólida difieren esencialmente de las de las microburbujas de gas de la presente invención y pertenecen a una clase de técnica diferente; por ejemplo, mientras que las microcápsulas de gas descritas en esta memoria se desprenden o se disuelven simplemente en el torrente sanguíneo cuando los estabilizadores del vehículo líquido son excretados o metabolizados, el material polímero sólido que forma las paredes de los microbalones mencionados anteriormente tiene que ser eliminado finalmente por el organismo que se ensaya, lo cual puede imponer una sobrecarga importante sobre el mismo. Asimismo, las cápsulas con membrana sólida, no elástica, pueden romperse irreversiblemente cuando se someten a variaciones de presión.

La composición de la presente invención, como se define en la reivindicación 1, remedia por completo las deficiencias mencionadas anteriormente.

La expresión "forma laminar" que define la condición de al menos una porción de los fosfolípidos de la presente composición, indica que los fosfolípidos, en contraste acusado con las micropartículas de la técnica anterior (por ejemplo el documento EP-A-
0 123 235), se encuentran en la forma de películas delgadas que implican una o más capas moleculares (en forma de estratificado). La conversión de los fosfolípidos que forman película en forma laminar puede realizarse fácilmente por ejemplo por homogeneización a alta presión o por tratamiento mediante ultrasonidos bajo frecuencias acústicas o ultrasónicas. En relación con esto, debe indicarse que la existencia de liposomas es un ejemplo bien conocido y útil de casos en los cuales agentes tensioactivos, más particularmente fosfolípidos, se encuentran en forma laminar.

Las soluciones de liposomas son suspensiones acuosas de vesículas microscópicas, generalmente de forma esférica, que retienen sustancias encapsuladas en su interior. Estas vesículas están formadas usualmente por una o más capas moleculares dispuestas concéntricamente (laminillas) de compuestos anfipáticos, es decir compuestos que tienen un resto hidrófilo lipófobo y un resto hidrófobo lipófilo. Véase por ejemplo "Liposome Methodology", compilador L.D. Leserman y colaboradores, Inserm 136, 2-8 de mayo, 1982). Gran número de agentes tensioactivos o agentes con actividad superficial, con inclusión de lípidos, en particular fosfolípidos, pueden disponerse en forma laminar para hacerlos corresponder con esta clase de estructura. En esta invención, se utilizan preferiblemente los lípidos empleados comúnmente para la fabricación de liposomas, por ejemplo las lecitinas y otros agentes con actividad superficial descritos con mayor detalle más adelante en esta memoria, pero esto no excluye en manera alguna el uso de otros agentes tensioactivos con tal que los mismos puedan conformarse en capas o películas.

Es importante indicar que no debe producirse confusión alguna entre la presente invención y la descripción de Ryan (documento US-A-4.900.540) que consigna el uso de liposomas llenos con aire o gas para ecografía. En este método, Ryan encapsula aire o un gas en el interior de vesículas liposómicas; en las realizaciones de la presente invención, las microburbujas de aire o de gas se forman en una suspensión de liposomas (es decir liposomas llenos de líquido) y los liposomas estabilizan aparentemente las microburbujas. En el documento de Ryan, el aire se encuentra en el interior de los liposomas, lo cual significa que dentro de los límites de la terminología utilizada en el este documento, los liposomas llenos de aire de Ryan pertenecen a la clase de los microbalones y no a la de las microburbujas de la presente invención.

Prácticamente, para conseguir las suspensiones de microburbujas de acuerdo con la invención, puede partirse de suspensiones o soluciones de liposomas preparadas por cualquier método consignado en la técnica anterior, con la diferencia evidente de que en el caso presente las vesículas liposómicas están preferiblemente "descargadas", es decir que aquéllas no necesitan mantener encapsulado en ellas ningún material extraño distinto del líquido de suspensión, como sucede normalmente en los liposomas clásicos. Por consiguiente, preferiblemente, los liposomas de la presente invención contendrán una fase acuosa idéntica o similar a la fase acuosa de la solución propiamente dicha. Se introduce luego aire o un gas en la solución de liposomas de tal manera que se forme una suspensión de microburbujas, estabilizándose dicha suspensión por la presencia de los fosfolípidos en forma laminar. No obstante, el material que forma las paredes de los liposomas puede modificarse dentro del alcance de la presente invención, por ejemplo por injerto covalente sobre él de moléculas extrañas diseñadas para propósitos específicos como se explicará más adelante.

La preparación de soluciones de liposomas ha sido discutida abundantemente en muchas publicaciones, p.ej. los documentos US-A-4.224.179 y WO-A-88/09165 y en todas las referencias mencionadas en ellos. Esta técnica anterior se utiliza aquí como referencia para ilustrar los diversos métodos adecuados para convertir agentes con actividad superficial formadores de película en forma laminar. Otro documento básico de referencia, firmado por M.C. Woodle y D. Papahadjopoulus se encuentra en "Methods in Enzymology" 171 (1989), 193.

Por ejemplo, en un método descrito en D.A. Tyrrell y colaboradores, Biochimica & Biophysica Acta 457 (1976), 259-302, una mezcla de un lípido y un vehículo líquido acuoso se somete a agitación violenta y después de ello se trata por ultrasonidos a frecuencias acústicas o ultrasónicas a la temperatura ambiente o a temperatura elevada. En la presente invención, se ha encontrado que es conveniente el tratamiento por ultrasonidos sin agitación. Asimismo, un aparato para producción de liposomas, un homogeneizador de alta presión tal como el Microfluidizer, que puede adquirirse de Microfluidics Corp., Newton, MA 02164, Estados Unidos de América, puede utilizarse con ventaja. Grandes volúmenes de soluciones de liposomas se pueden preparar con este aparato a presiones que pueden alcanzar 600-1200 bares.

En otro método, de acuerdo con la doctrina del documento GB-A-2.134.859 (Squibb), micropartículas (de 10 \mum o menos) de un vehículo sólido hidrosoluble (NaCl, sacarosa, lactosa y otros carbohidratos) se revisten con un agente anfipático; la disolución del vehículo revestido en una fase acuosa producirá vesículas de liposomas. En el documento GB-A-2.135.647 partículas insolubles, p.ej. microperlas de vidrio o resina se revisten por mojado en una solución de un lípido en un disolvente orgánico seguido por separación del disolvente por evaporación. Las microperlas revestidas con lípido se ponen después de ello en contacto con una fase de vehículo acuosa, con lo cual se formarán vesículas liposómicas en dicha fase de vehículo.

La introducción de aire o gas en una solución de liposomas con objeto de formar en ella una suspensión de microburbujas puede efectuarse por medios usuales, entre otros por inyección, es decir, haciendo pasar dicho aire o gas a través de orificios diminutos a la solución de liposomas, o disolviendo simplemente el gas en la solución por aplicación de presión y disminución brusca de la presión después de ello. Otra vía consiste en agitar o tratar por ultrasonidos la solución de liposomas en presencia de aire o un gas que puede ser atrapado. Asimismo se puede generar la formación de un gas dentro de la solución de liposomas propiamente dicha, por ejemplo por una reacción química que desprenda gas, p.ej. la descomposición de un carbonato o bicarbonato disueltos con un ácido. El mismo efecto puede obtenerse disolviendo a presión un líquido que hierva a temperatura baja, por ejemplo butano, en la fase acuosa y dejando después de ello que dicho líquido hierva por disminución brusca de la presión.

Sin embargo, un método ventajoso consiste en poner en contacto el agente tensioactivo seco en forma laminar o de película delgada con aire o un gas adsorbible o susceptible de ser atrapado antes de introducir dicho agente tensioactivo en la fase de vehículo líquida. En este sentido, el método puede derivarse de la técnica descrita en el documento GB-A-2.135.647, es decir que micropartículas o perlas sólidas se sumergen en una solución de un agente tensioactivo formador de película (o mezcla de agentes tensioactivos) en un disolvente volátil, después de lo cual el disolvente se evapora y las perlas se dejan en contacto con aire (o un gas adsorbible), durante un tiempo suficiente para que el aire se fije superficialmente a la capa de agente tensioactivo. Después de ello, las perlas revestidas con agente tensioactivo lleno de aire se ponen en un vehículo líquido, usualmente agua con o sin aditivos, con lo cual se desarrollarán burbujas de aire en el seno del líquido por mezcla suave, siendo totalmente innecesaria una agitación violenta. Después de ello se pueden separar las perlas sólidas, por ejemplo por filtración, de la suspensión de microburbujas que es notablemente estable con el tiempo.

Es innecesario decir que, en lugar de perlas o esferas insolubles, puede hacerse uso como partículas de soporte de materiales solubles en agua como el descrito en el documento GB-A-2.134.869 (carbohidratos o polímeros hidrófilos), con lo cual dichas partículas de soporte se disolverán con el tiempo y la separación final de un sólido se hace innecesaria. Adicionalmente, en este caso, el material de las partículas puede seleccionarse para actuar eventualmente como estabilizador o aumentador de la viscosidad en caso deseado.

En una variante del método, puede partirse también de liposomas deshidratados, es decir liposomas que se han preparado normalmente por medio de técnicas convencionales en la forma de soluciones acuosas y después de ello se han deshidratado por medios usuales, p.ej. como se describe en el documento GB-A-4.229.360 que se incorpora también en esta memoria como anterioridad. Uno de los métodos para deshidratar liposomas recomendado en esta referencia es la congelación seguida por secado (liofilización), es decir la solución de liposomas se congela y se seca por evaporación (sublimación) a presión reducida. Antes de efectuar la congelación seguida por secado, un compuesto estabilizador hidrófilo se disuelve en la solución, por ejemplo un carbohidrato como lactosa o sacarosa o un polímero hidrófilo como dextrano, almidón, PVP, PVA y análogos. Esto es útil en la presente invención, dado que tales compuestos hidrófilos ayudan también a la homogeneización de la distribución de tamaños de las microburbujas y aumentan también la estabilidad al almacenamiento. Actualmente, la fabricación de soluciones acuosas muy diluidas (0,1-10% en peso) de liposomas congelados y secados posteriormente, estabilizados por ejemplo con una relación en peso 5:1 a 10:1 de lactosa a lípido permite producir suspensiones acuosas de microburbujas cuyo recuento arroja 10^{8}-10^{9} microburbujas/ml (distribución de tamaños principalmente 0,5-10 \mum) que son estables durante al menos un mes (y probablemente mucho más tiempo) sin un cambio importante apreciable. Y esto se consigue por simple disolución de los liposomas secados almacenados al aire sin sacudidas o ninguna agitación violenta. Adicionalmente, la técnica de la liofilización a presión reducida es muy útil debido a que la misma permite, después de secado, restablecer la presión sobre los liposomas secados con cualquier gas susceptible de ser atrapado, es decir nitrógeno, CO_{2}, argón, metano, freón, etc., con lo cual después de la disolución de los liposomas elaborados en tales condiciones se obtienen suspensiones de microburbujas que contienen los gases arriba indicados.

Las suspensiones de microburbujas formadas por aplicación de una presión de gas sobre una solución diluida de lípidos estratificados en agua (0,1-10% en peso) y disminución brusca posterior de la presión tienen una concentración de burbujas aún más alta, p.ej. del orden de 10^{10}-10^{11} burbujas/ml. Sin embargo el tamaño medio de las burbujas es algo superior a 10 \mum, estando comprendido p.ej. en el intervalo de 10-50 \mum. En este caso, la distribución del tamaño de las burbujas puede hacerse más estrecha por centrifugación y decantación por capas.

Los fosfolípidos que son convenientes en esta invención se pueden seleccionar entre todos los compuestos anfipáticos capaces de formar películas estables en presencia de agua y gases. Los fosfolípidos preferidos que se pueden disponer en forma laminar incluyen las lecitinas (fosfatidilcolina) y otros fosfolípidos, entre otros el ácido fosfatídico (PA), fosfatidilinositol, fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina (PS), fosfatidilglicerol (PG), cardiolipina (CL), esfingomielinas, los plasmógenos, los cerebrósidos, etc. Ejemplos de líquidos adecuados son los fosfolípidos en general, por ejemplo, lecitinas naturales, tales como lecitina de huevo o lecitina de haba de soja, o lecitinas sintéticas tales como lecitinas sintéticas saturadas, por ejemplo, dimiristoil-fosfatidilcolina, dipalmitoil-fosfatidil-colina o diestearoil-fosfatidil-colina o lecitinas sintéticas insaturadas tales como dioleil-fosfatidil-colina o dilinoleil-fosfatidil-colina, siendo preferidas la lecitina de huevo o la lecitina de haba de soja. Aditivos como colesterol y otras sustancias (véase más adelante) pueden añadirse a uno o más de los lípidos anteriores en proporciones que van desde cero a 50% en peso.

Tales aditivos pueden incluir otros agentes tensioactivos que se pueden utilizar en mezcla con los agentes tensioactivos formadores de película y la mayoría de los cuales están indicados en la técnica anterior expuesta en la introducción de esta memoria descriptiva. Por ejemplo, pueden citarse ácidos grasos libres, ésteres de ácidos grasos con compuestos de polioxialquileno tales como poli(oxipropilen-glicol) y poli(oxietilen-glicol); éteres de alcoholes grasos con poli(oxialquilen-glicoles), ésteres de ácidos grasos con poli(sorbitan oxialquilado); jabones; poli(alquilen-estearato de glicerol); poli(oxietilen-ricinoleato de glicerol); homo- y copolímeros de poli(alquilen-glicoles); aceite de soja y aceite de ricino polietoxilados así como sus derivados hidrogenados; éteres y ésteres de sacarosa u otros carbohidratos con ácidos grasos y alcoholes grasos, estando éstos opcionalmente polioxialquilados; mono-, di- y tri-glicéridos de ácidos grasos saturados o insaturados; glicéridos de aceite de soja y sacarosa. La cantidad de los agentes con actividad superficial o agentes tensioactivos no formadores de película puede ser hasta 50% en peso de la cantidad total de agentes tensioactivos en la composición, pero preferiblemente está comprendida entre cero y 30%.

La cantidad total de agentes tensioactivos con relación al vehículo líquido acuoso está comprendido óptimamente en el intervalo de 0,01 a 25% en peso, pero son ventajosas cantidades comprendidas en el intervalo de 0,5-5% debido a que siempre se intenta mantener la cantidad de sustancias activas en una solución inyectable lo más baja posible, teniendo esto por objeto minimizar la introducción de materias extrañas en los seres vivos aun cuando las mismas sean inocuas y fisiológicamente compatibles.

Otros aditivos opcionales para los agentes tensioactivos incluyen:

a) sustancias que se sabe proporcionan una carga negativa sobre los liposomas, por ejemplo, ácido fosfatídico, fosfatidilglicerol o fosfato de dicetilo;

b) sustancias que se sabe proporcionan una carga positiva, por ejemplo, estearil-amina o acetato de estearil-amina;

c) sustancias que se sabe afectan a las propiedades físicas de las películas de lípidos de una manera más deseable; por ejemplo, capro-lactama y/o esteroles tales como colesterol, ergosterol, fitosterol, sitosterol, piroglutamato de sitosterol, 7-deshidro-colesterol o lanosterol, pueden afectar a la rigidez de las películas de lípidos;

d) sustancias que se sabe tienen propiedades antioxidantes para mejorar la estabilidad química de los componentes en las suspensiones, tales como tocoferol, galato de propilo, palmitato de ascorbilo, o hidroxi-tolueno butilado.

El vehículo acuoso de esta invención es la mayoría de las veces agua con posiblemente pequeñas cantidades de líquidos fisiológicamente compatibles tales como isopropanol, glicerol, hexanol y análogos (véase por ejemplo el documento EP-A-52.575). En general, la cantidad de los líquidos hidrosolubles orgánicos no excederá de 5-10% en peso.

La presente composición puede contener también disueltos o suspendidos en ella compuestos hidrófilos y polímeros definidos generalmente bajo el nombre de aumentadores de la viscosidad o estabilizadores. Aunque la presencia de tales compuestos no es obligada para asegurar la estabilidad de las burbujas de aire o gas con el tiempo en las presentes dispersiones, aquéllos son ventajosos por el hecho de que dan cierta clase de "cuerpo" a las soluciones. Cuando se desea, las concentraciones superiores de tales aditivos en el caso de ser totalmente inocuos pueden ser muy altas, por ejemplo hasta 80-90% en peso de la solución con Iopamidol y otros agentes de contraste de rayos X yodados. Sin embargo, con otros aumentadores de la viscosidad como por ejemplo azúcares, p.ej. lactosa, sacarosa, maltosa, galactosa, glucosa, etc. o polímeros hidrófilos como almidón, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, dextrina, xantano u oligómeros de celulosa parcialmente hidrolizada, así como proteínas y polipéptidos, las concentraciones están comprendidas óptimamente entre aproximadamente 1 y 40% en peso, siendo preferido un intervalo de aproximadamente 5-20%.

Al igual que en la técnica anterior, las composiciones inyectables de esta invención pueden contener también electrólitos fisiológicamente aceptables; un ejemplo es una solución isotónica de sal común.

La presente invención incluye también el uso de mezclas pulverulentas almacenables en seco para formar las presentes dispersiones que contienen microburbujas por simple mezcla de la formulación pulverulenta con agua o una fase de vehículo acuosa. Preferiblemente, tales mezclas o formulaciones secas contendrán todos los ingredientes sólidos necesarios para proporcionar las suspensiones de microburbujas deseadas por la simple adición de agua, es decir principalmente los agentes tensioactivos en forma laminar que contienen atrapado o adsorbido en ellos el aire o gas requerido para la formación de las microburbujas, y accesoriamente los otros agentes tensioactivos no formadores de película, los aumentadores de viscosidad y estabilizadores y posiblemente otros aditivos opcionales. Como se ha indicado anteriormente, el atrapamiento del aire o gas por los fosfolípidos estratificados se produce por simple exposición de dichos agentes tensioactivos al aire (o gas) a la presión ambiente o a presión superior a la atmosférica durante un tiempo suficiente para hacer que dicho aire o gas llegue a quedar atrapado en el seno del agente tensioactivo. Este período de tiempo puede ser muy corto, p.ej. del orden de unos pocos segundos a unos pocos minutos, aunque no es de modo alguno perjudicial la sobreexposición, es decir el almacenamiento en aire o en una atmósfera gaseosa. Lo que es importante es que el aire pueda ponerse perfectamente en contacto con tanta proporción como sea posible de la superficie disponible del fosfolípido estratificado, es decir que el material seco debe encontrarse preferiblemente en una condición "harinosa" que fluye fácilmente. Es precisamente esta condición la que resulta de la liofilización de una solución acuosa de liposomas y agente hidrófilo como se describe en el documento US-A-4.229.360. En general, la relación en peso de agentes tensioactivos a aumentador de la viscosidad hidrófilo en las formulaciones secas será del orden de 0,1:10 a 10:1, estando presentes los ingredientes opcionales adicionales, en su caso, en una proporción que no exceda de 50% con relación al total de agentes tensioactivos más aumentadores de la viscosidad.

Las formulaciones de mezcla seca usadas en esta invención se pueden preparar por métodos muy simples. Como se ha visto anteriormente, un método preferido consiste en preparar en primer lugar una solución acuosa en la cual los lípidos que forman la película están dispuestos en forma laminar, por ejemplo por tratamiento mediante ultrasonidos, o por empleo de cualquier técnica convencional utilizada habitualmente en el campo de los liposomas, conteniendo también esta solución los otros aditivos deseados, es decir aumentadores de la viscosidad, agentes tensioactivos no formadores de película, electrólito, etc., y liofilización después de ello para dar un polvo capaz de fluir libremente, que se almacena luego en presencia de aire o un gas susceptible de ser atrapado.

La mezcla seca puede mantenerse durante cualquier período de tiempo en el estado seco y venderse como tal. Para ponerla en condiciones de empleo, es decir, para preparar una suspensión de microburbujas de gas o aire para la formación de imágenes ultrasónicas, se disuelve simplemente un peso conocido de la formulación pulverulenta seca en una fase acuosa estéril, p.ej. agua o un medio fisiológicamente aceptable. La cantidad de polvo dependerá de la concentración deseada de burbujas en el producto inyectable, siendo por lo general un recuento de aproximadamente 10^{8}-10^{9} burbujas/ml el resultante de la producción de una solución de 5-20% en peso del polvo en agua. Ahora bien, naturalmente esta cifra es solo indicativa, siendo la cantidad de burbujas esencialmente dependiente de la cantidad de aire o gas atrapada durante la fabricación del polvo seco. Al mantenerse bajo control los pasos de fabricación, la disolución de las formulaciones secas proporcionará suspensiones de microburbujas con recuentos perfectamente reproducibles.

Las suspensiones de microburbujas resultantes (burbujas en el intervalo de 0,5-10 \mum) son extraordinariamente estables con el tiempo, manteniéndose inalterado el recuento original medido al comienzo o cambiando sólo ligeramente durante semanas y aun meses; el único cambio apreciable es cierto tipo de segregación, tendiendo las burbujas de mayor tamaño (alrededor de 10 \mum) a ascender más rápidamente que las pequeñas.

Se ha encontrado también que las suspensiones de microburbujas de esta invención se pueden diluir con una pérdida muy pequeña en el número de microburbujas como resultado de la dilución, es decir incluso en el caso de altas relaciones de dilución, p.ej. 1/10^{2} a 1/10^{4}, la reducción del recuento de microburbujas coincide exactamente con la relación de dilución. Esto indica que la estabilidad de las burbujas depende del fosfolípido en forma laminar más bien de la presencia de estabilizadores o aumentadores de viscosidad como en la técnica anterior. Esta propiedad es ventajosa en el sentido de la reproducibilidad del ensayo de formación de imágenes, dado que las burbujas no se ven afectadas por la dilución con la sangre una vez inyectadas a un paciente.

Otra ventaja de las burbujas de esta invención frente a las microcápsulas de la técnica anterior rodeadas por una membrana rígida pero susceptible de rotura que puede romperse de modo irreversible bajo esfuerzo es que, cuando las presentes suspensiones se someten a cambios bruscos de presión, las burbujas de la presente invención se contraerán momentáneamente de manera elástica y recuperarán luego su forma original cuando se retira la presión. Esto es importante en la práctica clínica cuando las burbujas se bombean a través del corazón y se ven expuestas por consiguiente a pulsaciones de presión alternativas.

Las razones por las cuales las microburbujas de esta invención son tan estables no se conocen con exactitud. Dado que para prevenir el escape de las burbujas las fuerzas de desplazamiento deben estar equilibradas con las fuerzas de retención debidas a la fricción, es decir a la viscosidad, se teoriza que las burbujas están rodeadas probablemente por el agente tensioactivo en forma laminar. Si este agente tensioactivo laminar se encuentra en forma de una membrana continua o discontinua, o incluso como esferas cerradas unidas a las microburbujas, se desconoce por el momento, pero es objeto de investigación. Sin embargo, la falta de un conocimiento detallado de los fenómenos implicados realmente no excluye la operabilidad industrial plena de la presente invención.

Las suspensiones de burbujas de la presente invención son útiles también en otras aplicaciones de tipo médico o de diagnóstico en las cuales es deseable dirigir deliberadamente las microburbujas estabilizadas a sitios específicos del cuerpo después de su inyección, por ejemplo a trombos presentes en vasos sanguíneos, a lesiones ateroescleróticas (placas) en arterias, a células tumorales, así como para el diagnóstico de superficies alteradas de cavidades corporales, p.ej. sitios de ulceración en el estómago o tumores de la vejiga. Para esto, pueden unirse anticuerpos monoclonales elaborados por ingeniería genética, fragmentos de anticuerpos o polipéptidos diseñados para mimetizar anticuerpos, polímeros bioadhesivos, lectinas y otras moléculas de reconocimiento de sitios a la capa de agente tensioactivo que estabiliza las microburbujas. Así, se pueden unir anticuerpos monoclonales a bicapas de fosfolípido por el método descrito por L. D. Leserman, P. Machy y J. Barbet ("Liposome Technology Vol. III", p. 29, compilado por G. Gregoriadis, CRC Press, 1984). En otro enfoque, se sintetiza primeramente un anticuerpo de palmitoílo de acuerdo con L. Huang, A. Huang, y S. J. Kennel ("Liposome Technology Vol. III", p. 29, compilado por G. Gregoriadis, CRC Press, 1984). Alternativamente, algunos de los fosfolípidos utilizados en la presente invención se pueden seleccionar cuidadosamente con objeto de conseguir una absorción preferencial en órganos o tejidos o una semi-vida aumentada en la sangre. Así, liposomas GMI que contienen gangliósidos o fosfatidilinositol, preferiblemente en adición a colesterol, conducirán a semi-vidas aumentadas en la sangre después de la administración intravenosa en analogía con A. Gabizon, D. Papahadjopoulus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 6949.

Los gases contenidos en las microburbujas de la presente invención pueden incluir, además de gases inocuos fisiológicamente aceptables corrientes como CO_{2}, nitrógeno, N_{2}, metano, butano, freón y mezclas de los mismos, gases radiactivos tales como ^{133}Xe
ó ^{81}Kr que son de interés particular en medicina nuclear para medidas de circulación de la sangre, para escintigrafía pulmonar, etc.

Los ejemplos siguientes ilustran la invención desde un punto de vista práctico.

Medidas ecogénicas

Se llevaron a cabo medidas de ecogenicidad en un sistema pulso - eco constituido por un contenedor de muestras de plexiglás (diámetro 30 mm) y un receptor transductor sumergido en un baño de agua a temperatura constante, un pulsador-receptor (Accutron M3010S) que tenía para la parte receptora un preamplificador externo con una ganancia fija de 40 dB y un amplificador interno con ganancia ajustable desde -40 a +40 dB. Se insertó un filtro de paso bajo de 10 MHz en la parte receptora para mejorar la relación de señal a ruido. El cuadro A/D en el PC IBM era un Sonotek STR 832. Las medidas se realizaron a 2,25, 3,5, 5 y 7,5 MHz.

Ejemplo 1

Se preparó una solución de liposomas (50 mg de lípidos por ml) en agua destilada por el método REV (véase F. Szoka Jr. y D. Papahadjopoulus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978) 4194) utilizando lecitina de soja hidrogenada NC 95 H, Nattermann Chemie, Colonia, Alemania Occidental) y fosfato de dicetilo en una relación molar 9/1. Esta preparación con liposomas se extruyó a 65ºC (para calibrar el tamaño de vesícula) a través de un filtro de policarbonato de 1 \mum (Nucleopore). Se mezclaron 2 ml de esta solución con 5 ml de una solución de iopamidol al 75% en agua y 0,4 ml de aire y la mezcla se impulsó alternativamente hacia atrás y hacia adelante a través de un sistema de dos jeringuillas como se describe en el documento DE-A-3529195, mientras que se mantenía continuamente una ligera sobrepresión. Esto dio como resultado la formación de una suspensión de microburbujas de aire en el líquido (10^{5}-10^{6} burbujas por ml, tamaño de burbuja 1-20 \mum como se estimó por microscopía óptica) que era estable durante varias horas a la temperatura ambiente. Esta suspensión dio una señal de eco fuerte cuando se ensayó por ecografía ultrasónica a 7,5, 5, 3,5 y 2,25 MHz.

Ejemplo 2

Una solución de agua destilada (100 ml) que contenía 2% en peso de lecitina de soja hidrogenada y fosfato de dicetilo en una relación molar 9/1 se trató por ultrasonidos durante 15 min a 60-65ºC con un sonificador de sonda Branson (Tipo 250).

Después de enfriar, la solución se centrifugó durante 15 min a 10.000 g y el sobrenadante se recuperó y se añadió lactosa para producir una solución al 7,5% en peso. La solución se puso en un recipiente hermético en el cual se estableció una presión de 4 bares de nitrógeno durante unos pocos minutos mientras que se agitaba el recipiente. Después de ello, la presión se retiró bruscamente, con lo que se obtuvo una suspensión de burbujas de alta concentración (10^{10}-10^{11} burbujas/ml). La distribución de tamaños de las burbujas era sin embargo más amplia que en el Ejemplo 1, es decir de aproximadamente 1 a 50 \mum. La suspensión era muy estable, pero al cabo de unos pocos días se produjo una segregación en la fase de reposo, tendiendo las burbujas mayores a concentrarse en las capas superiores de la suspensión.

Ejemplo 3

20 g de perlas de vidrio (diámetro aproximado 1 mm) se sumergieron en una solución de 100 mg de dipalmitoilfosfatidilcolina (Fluka A.G. Buchs) en 10 ml de cloroformo. Las perlas se mantuvieron en rotación a presión reducida en un evaporador rotativo hasta que hubo escapado la totalidad del CHCl_{3}. Después de ello, las perlas se mantuvieron en rotación ulteriormente a la presión atmosférica durante unos cuantos minutos y se añadieron 10 ml de agua destilada. Se retiraron las perlas y se obtuvo una suspensión de microburbujas de aire que se demostró contenía aproximadamente 10^{6} urbujas/ml después de examen al microscopio. El tamaño medio de las burbujas era aproximadamente 3-5 \mum. La suspensión era estable durante al menos varios días.

Ejemplo 4

Una suspensión de lecitina de soja hidrogenada/fosfato de dicetilo en agua se dispuso en forma laminar utilizando la técnica REV como se describe en el Ejemplo 1. Se añadieron 2 ml de la preparación de liposomas a 8 ml de solución de maltosa al 15% en agua destilada. La solución resultante se congeló a -30ºC, y se liofilizó luego a presión de 0,1 Torr. La sublimación completa del hielo se obtuvo en unas pocas horas. Después de ello, se restableció la presión de aire en el recipiente sometido al vacío de tal manera que el polvo liofilizado llegó a saturarse con aire en unos pocos minutos.

El polvo seco se disolvió luego en 10 ml de agua estéril con mezcladura suave, con lo cual se obtuvo una suspensión de microburbujas (10^{8}-10^{9} microburbujas por ml, viscosidad dinámica < 20 mPa.s). Esta suspensión, que contenía en su mayor parte burbujas comprendidas en el intervalo de 1-5 \mum, era estable durante un período muy largo, dado que pudieron detectarse todavía numerosas burbujas al cabo de dos meses de reposo. Esta suspensión de microburbujas daba una respuesta fuerte en la ecografía ultrasónica. Si, en este ejemplo, la solución se congela por pulverización en aire a -30 a -70ºC para obtener una nieve congelada en lugar de un bloque monolítico y la nieve se evapora luego a vacío, se obtienen resultados excelentes.

Ejemplo 5

Muestras de 2 ml de la solución de liposomas obtenida como se ha descrito en el Ejemplo 4 se mezclaron con 10 ml de una solución acuosa al 5% de gelatina (muestra 5A), albúmina humana (muestra 5B), dextrano (muestra 5C) e iopamidol (muestra 5D). Todas las muestras se liofilizaron. Después de liofilización e introducción de aire, las diversas muestras se mezclaron suavemente con 20 ml de agua estéril. En todos los casos, la concentración de burbujas era superior a 10^{8} burbujas por ml y casi todas las burbujas tenían un tamaño inferior a 10 \mum. El procedimiento del ejemplo anterior se repitió con 9 ml de la preparación de liposomas (450 mg de lípidos) y solamente 1 ml de una solución de albúmina humana al 5%. Después de la liofilización, exposición al aire y adición de agua estéril (20 ml), la solución resultante contenía 2 x 10^{8} burbujas por ml, la mayoría de ellas inferiores a 10 \mum.

Ejemplo 6

Lactosa (500 mg), molida finamente a un tamaño de 1-3 \mum, se mojó en una solución de cloroformo (5 ml) de 100 mg de dimiristoilfosfatidilcolina/colesterol/ácido dipalmitoilfosfatídico (de Fluka) en una reacción molar de 4:1:1 y se evaporó después de ello a vacío en un evaporador rotativo. El polvo blanco resultante que fluía libremente se mantuvo en rotación durante unos pocos minutos en atmósfera de nitrógeno a presión normal y se disolvió después de ello en 20 ml de agua estéril. Se obtuvo una suspensión de microburbujas con aproximadamente 10^{5}-10^{6} microburbujas por ml en el intervalo de tamaños de 1-10 \mum como se comprobó por observación al microscopio. En este ejemplo, la relación en peso de agente tensioactivo revestido a vehículo soluble en agua era 1:5. Se obtienen también resultados excelentes (10^{7}-10^{8} microburbujas/ml) cuando se reduce esta relación a valores más bajos, es decir inferiores a 1:20, lo cual aumentará realmente la eficiencia del agente tensioactivo para la absorción de aire, es decir, que esto disminuirá el peso de agente tensioactivo necesario para producir el mismo recuento de burbujas.

Ejemplo 7

Una solución acuosa que contenía 2% de lecitina de soja hidrogenada y 0,4% de Pluronic® F68 (un agente tensioactivo copolímero de polioxietileno - polioxipropileno no iónico) se trató por ultrasonidos como se describe en el Ejemplo 2. Después de enfriamiento y centrifugación, se añadieron 5 ml de esta solución a 5 ml de una solución de maltosa al 15% en agua. La solución resultante se congeló a -30ºC y se evaporó a 0,1 Torr. Se restableció luego la presión de aire en el recipiente que contenía el polvo seco. Este se dejó en reposo de lo cual se utilizó para producir una solución acuosa al 10% en peso que, observada al microscopio, demostró ser una suspensión de burbujas muy diminutas (inferiores a 10 \mum); la concentración de burbujas era del orden de 10^{7} burbujas por ml. Esta preparación dio una respuesta muy fuerte en la ecografía ultrasónica a 2,25, 3,5, 5 y 7,5 MHz.

Ejemplo 8

Se llevó a cabo una ecografía bidimensional en un perro experimental a continuación de la inyección en una vena periférica de 0,1-2 ml de la preparación obtenida en el Ejemplo 4. Se observó la opacificación del lado izquierdo del corazón con una silueta clara del endocardio, configurando con ello que las microburbujas (o al menos una parte importante de ellas) eran capaces de atravesar la circulación capilar pulmonar.

Ejemplo 9

Se preparó un polvo liofilizado de fosfolípido/maltosa como se describe en el Ejemplo 4. Sin embargo, al final del paso de liofilización, se introdujo una mezcla de gas que contenía ^{133}Xe en el recipiente evacuado en lugar de aire. Unos pocos minutos después, se introdujo agua estéril y, después de mezclar suavemente, se produjo una suspensión de microburbujas que contenía ^{133}Xe en la fase gaseosa. Esta suspensión de microburbujas se inyectó en cuerpos vivos para realizar investigaciones que requerían el uso de ^{133}Xe como trazador. Se obtuvieron resultados excelentes.

Ejemplo 10

(Comparativo)

En el documento US-A-4.900.540 Ryan y colaboradores describen liposomas llenos de gas para investigaciones ultrasónicas. De acuerdo con la cita, los liposomas se forman por medios convencionales pero con la adición de un gas o precursor de gas en la composición acuosa que forma el núcleo de los liposomas (col. 2, líneas 15-27).

La utilización de un precursor de gas (bicarbonato) se detalla en los Ejemplos 1 y 2 de la referencia. La utilización de un vehículo acuoso con un gas añadido para encapsular el gas en los liposomas (no citada como ejemplo por Ryan y colaboradores) requería que el gas se encuentre en la forma de burbujas muy pequeñas, es decir de tamaño similar o menor que el tamaño de las vesículas de liposomas.

Medios acuosos en los cuales puede atraparse aire en la forma de burbujas muy pequeñas (2,5-5 \mum) han sido descritos por M.W. Keller y colaboradores, J. Ultrasound Med. 5 (1986), 413-498.

Cantidades de 126 mg de lecitina de huevo y 27 mg de colesterol se disolvieron en 9 ml de cloroformo en un matraz de 200 ml con fondo redondo. La solución de lípidos se evaporó a sequedad en un Rotavapor, con lo que se formó una película de los lípidos en las paredes del matraz. Una cantidad de 10 ml de una solución acosa de dextrosa al 50% en peso se trató por ultrasonidos durante 5 min de acuerdo con M.W. Keller y colaboradores (citado arriba) para generar en ella microburbujas de aire y la solución tratada por ultrasonidos se añadió al matraz que contenía la película de lípido, con lo cual la agitación manual del recipiente dio como resultado la hidratación de los fosfolípidos y formación de liposomas multilaminares en el interior de las burbujas que contenían vehículo líquido.

Después de dejar en reposo durante un rato, la suspensión de liposomas resultante se sometió a centrifugación a 5000 g durante 15 min para separar del vehículo el aire no atrapado en las vesículas. Se esperaba también que, durante la centrifugación, los liposomas llenos de aire se segregarían a la superficie por flotabilidad.

Después de la centrifugación, los tubos se examinaron y se observó un residuo en el fondo constituido por liposomas llenos de dextrosa aglomerados y un líquido sobrenadante claro, no quedando sustancialmente burbuja alguna. La cantidad de liposomas llenos de aire que habían ascendido por flotación era despreciablemente pequeña y no pudo determinarse.

Ejemplo 11

(Comparativo)

Se preparó una composición inyectable de contraste de acuerdo con Ryan (documento US-A-4.900.540, col. 3, Ejemplo 1). Se disolvieron en lecitina de huevo (126 mg) y colesterol (27 mg) en 9 ml de éter dietílico. Se añadieron a la solución 3 ml de bicarbonato acuoso 0,2 molar y el sistema bifásico resultante se trató por ultrasonidos hasta que se volvió homogéneo. La mezcla se evaporó en un aparato Rotavapor y se añadieron 3 ml de bicarbonato acuoso 0,2 molar.

Una porción de 1 ml de la suspensión de liposomas se inyectó en la vena yugular de un conejo experimental, manteniéndose el animal en condiciones para formación de imagen ultrasónica del corazón utilizando un formador de imagen ultrasónica Acuson 128-XP5 (sonda del transductor 7,5 para la obtención de la imagen del corazón). La sonda proporcionó una imagen en sección transversal de los ventrículos derecho e izquierdo (músculo papilar medio). Después de la inyección, se observó un aumento ligero y transitorio (unos pocos segundos) en la silueta del ventrículo derecho. El efecto era, sin embargo, muy inferior al efecto observado utilizando la preparación del Ejemplo 4. No se observó mejora alguna de la formación de imagen del ventrículo izquierdo, lo cual indica probablemente que los liposomas cargados con CO_{2} no pasaban la barrera de los capilares pulmonares.

Claims (13)

1. Un método para la preparación de suspensiones estables de microburbujas de aire o gas en una fase de vehículo acuosa, en que las microburbujas de aire o gas no están encapsuladas dentro de vesículas liposómicas, que comprende desde aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20% en peso de uno o más agentes tensioactivos disueltos o dispersados, y en el cual al menos uno de los agentes tensioactivos es un fosfolípido formador de película presente en la suspensión al menos parcialmente en forma de laminillas o forma laminar, cuya suspensión no contiene una sal de hierro (III), caracterizado por los pasos siguientes:

(a)

seleccionar al menos un fosfolípido formador de película y convertirlo en forma de laminillas;

(b)

poner en contacto el fosfolípido en forma de laminillas con aire o un gas adsorbible o susceptible de ser atrapado durante un tiempo suficiente para que el aire o gas llegue a ser fijado por dicho fosfolípido; y

(c)

mezclar el fosfolípido en forma de laminillas con un vehículo líquido acuoso, con lo cual se obtiene una dispersión estable de microburbujas de aire o gas en dicho vehículo líquido.

2. El método de la reivindicación 1, en el cual el paso (c) se lleva a cabo antes del paso (b), efectuándose el último por introducción de aire o gas a presión en el vehículo líquido y disminución posterior de la presión.

3. El método de la reivindicación 1, en el cual el paso (c) se lleva a cabo por mezcla suave de los componentes, sin que sea necesaria sacudida alguna, con lo que el aire o gas fijado al agente tensioactivo en forma de laminillas en el paso (b) se transformará en una suspensión de microburbujas estables.

4. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, en el cual el vehículo líquido contiene disueltos en él compuestos estabilizadores seleccionados entre proteínas hidrosolubles, polipéptidos, azúcares, poli- y oligo-sacáridos y polímeros hidrófilos.

5. El método de la reivindicación 1, en el cual la conversión del paso (a) se efectúa aplicando como revestimiento el fosfolípido sobre partículas de materiales solubles o insolubles: el paso (b) se efectúa dejando en reposo las partículas revestidas durante un rato en atmósfera de aire o de un gas; y el paso (c) se efectúa por mezcla de las partículas revestidas con un vehículo líquido acoso.

6. El método de la reivindicación 1, en el cual la conversión del paso (a) se efectúa tratando por ultrasonidos u homogeneización a alta presión una solución acuosa de lípidos formadores de película, conduciendo esta operación, al menos parcialmente, a la formación de liposomas.

7. El método de la reivindicación 6, en el cual el paso (b) se efectúa por liofilización de una solución que contiene liposomas, conteniendo la última opcionalmente estabilizadores hidrófilos y puesta en contacto del producto liofilizado resultante con aire o un gas durante un período de tiempo.

8. El método de las reivindicaciones 6 y 7, en el cual la solución acuosa de lípidos formadores de película contienen también aumentadores de la viscosidad o estabilizadores seleccionados entre polímeros y carbohidratos hidrófilos en una relación en peso referida a los lípidos, comprendida entre 1:5 y 100:1.

9. Un método para la preparación de suspensiones estables de microburbujas de aire o gas en una fase de vehículo acuosa que comprende desde aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20% en peso de uno o más agentes tensioactivos disueltos o dispersados, en el cual se disuelve una formulación pulverulenta seca que, después de disolución en agua, formará una suspensión acuosa estable de microburbujas, caracterizado porque dicha formulación pulverulenta seca contiene uno o más fosfolípidos formadores de película en forma de laminillas y estabilizadores hidrosolubles.

10. El método de la reivindicación 9, en el cual los fosfolípidos en forma de laminillas se encuentran en forma de capas finas depositadas sobre la superficie del material constituido por partículas sólidas solubles o insolubles.

11. El método de la reivindicación 10, en el cual las partículas sólidas insolubles son perlas de vidrio o de material polímero.

12. El método de la reivindicación 10, en el cual las partículas sólidas solubles están hechas de carbohidratos, polisacáridos, polímeros sintéticos, albúmina, gelatina o iopamidol, hidrosolubles.

13. El método de la reivindicación 9, en el cual la formulación seca comprende liposomas liofilizados.