ES2083764T5 - Vacuna para el sindrome respiratorio reproductivo porcino (srrp) y diagnostico. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SE DIRIGE A LA IDENTIFICACION DEL AGENTE PROVOCADOR DE VIRUS DEL SINDROME RESPIRATORIO REPRODUCTOR PORCINO Y A LAS VACUNAS DERIVADAS DEL MISMO. LA INVENCION TAMBIEN SE DIRIGE A AGENTES VIRALES PRODUCIDOS MEDIANTE EL CULTIVO DE TEJIDOS DE CELULAS INFECTADAS CON ESTE VIRUS, Y AL USO DE TALES ANTIGENOS EN PRUEBAS DE DIAGNOSTICO.
Description
Vacuna para el Síndrome Respiratorio
Reproductivo Porcino (SRRP) y diagnóstico.
La presente invención se refiere a un método
para la detección de anticuerpos frente al virus de SRRP, así como
un estuche de ensayo de diagnóstico para utilizarlo en este
método.
Una nueva enfermedad porcina ha atacado a más de
5.000 granjas de cerdos de la Europa del Norte desde finales de
1990. Esta enfermedad ahora se llama Síndrome Respiratorio
Reproductivo Porcino (SRRP). Identificado por primera en Alemania
en diciembre de 1990, el problema se fue haciendo cada vez más
crítico a principios de 1991. En enero y febrero de 1991, la
enfermedad se extendió a Holanda y Bélgica. También se han descrito
brotes en España. Se prevé que la enfermedad llegará a ser muy
costosa desde el punto de vista económico, comparable o incluso
peor que la Enfermedad de Aujeszky.
Los principales signos clínicos en las cerdas
son anorexia y aborto tardío hasta el día 110 de gestación. Con los
lechones, se observa una alta incidencia de lechones débiles nacidos
muertos además de problemas respiratorios. En cerdos de engorde se
observa neumonía crónica y mortalidad incrementada.
Con el fin de desarrollar una vacuna para
proteger a los cerdos contra el SRRP o desarrollar un método de
diagnóstico para determinar infección en cerdos, se ha de
identificar el agente causante de esta enfermedad. Sin embargo,
hasta ahora sólo se han descrito unas pocas características del
agente causante, tales como su naturaleza viral, propiedades de
hemaglutinación, densidad de flotación y características de
propagación in vitro (Wensvoort, G. y col., Vet. Quaterly
13, 121-130, 1991).
Las solicitudes de patentes internacionales WO
92/21375, WO 93/06211, WO 93/03760 y la solicitud de patente
europea EP 0529584 (Boehringer Ingelheim Animal Health Inc.) son
solicitudes en litigio disponibles como técnica anterior para la
presente invención bajo el Artículo 54(3) y (4) EPC. El
documento WO 92/21375 (Stichting Centraal Diergeneeskundig
Instituut) describe la identificación del agente causante, llamado
Agente Lelystad, de la Enfermedad Porcina Misteriosa (EPM).
Adicionalmente, se propone el uso de este agente para la preparación
de vacunas y ensayos de diagnóstico. Tanto el documento WO 93/03760
(Collins y col.) como el documento EP 0529584 describen el
aislamiento de un aislado US, es decir, aislado
ATCC-VR 2332, e identifican este aislado como el
agente causante de la EPM en los EEUU. También se describe allí la
preparación de una vacuna EPM atenuada por pase del aislado en un
cultivo de células. El documento WO 93/06211 (Collins y col.)
describen el aislamiento de un homogeneizado de tejido infeccioso
procedente de un animal enfermo. Sin embargo, no se pudo dar ninguna
identificación del agente causante presente en el
homogeneizado.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar características inequívocamente identificativas del
nuevo agente causante del SRRP, necesarias con el fin de preparar
una vacuna y un ensayo de diagnóstico para el agente causante.
Ahora se ha identificado un tipo novedoso de
virus, llamado virus del SRRP, responsable de esta enfermedad,
caracterizándose el tipo novedoso de virus por el virus depositado
en el CNCM con el número de entrada I-1140.
El virus del nuevo tipo se puede aislar de
tejidos pulmonares de casos clínicos de SRRP. Se incubó una monocapa
de macrófagos alveolares con un homogeneizado al 50% de tejido
pulmonar en solución salina tamponada con fosfato (SSTF). El
cultivo de células macrófagas se estableció a partir de lavados de
pulmón de lechones SPF con SSTF. Los macrófagos se lavaron e
incubaron con medio RPM 1640 suplementado con suero vacuno fetal al
10% y antibióticos durante 24 horas en una incubadora con CO_{2}
al 5%. Se añade un pequeño volumen del homogeneizado los macrófagos,
después de 1 h de incubación a 37ºC se añadió nuevo medio otra vez
y los macrófagos infectados se incubaron adicionalmente a 37ºC en
atmósfera de CO_{2}. Es evidente un efecto citopático (ECP) total
después de 2-3 días de incubación.
El virus también se puede aislar de otras
fuentes tales como corazón, amígdalas, cerebro e hígado de cerdos
infectados.
Los homogeneizados de tejidos seleccionados de
un caso clínico de SRRP, utilizados para el aislamiento del virus
novedoso del SRRP, no mostraron consistentemente signos de la
presencia de otros agentes virales encontrados corrientemente con
cerdos, especialmente no se encontró virus de la pseudorrabia (VPR),
parvovirus porcino (PVP), paramixovirus, virus del cólera de los
cerdos (VCC) ni virus de la gastroenteritis transmisible.
Otras características del virus novedoso del
SRRP se mencionan a continuación:
El virus novedoso del SRRP aislado
específicamente como se ha descrito antes concordaba con la
descripción interna "Aislado nº 10" y se ha depositado el 6 de
septiembre de 1991 en la Colección Nacional de Cultivos de
Microorganismos (CNCM) del Instituto Pasteur de París, Francia, con
el número de entrada I-1140.
El virus novedoso se propaga en macrófagos pero
no lo hace a niveles medibles en las líneas celulares establecidas,
BHK21, Vero, SK-6 (riñón porcino), PK15 (riñón
porcino), ST (testículo porcino), L929 y BEL (pulmón embrionario
bovino).
\vskip1.000000\baselineskip
Utilizando técnicas establecidas, se excluyó que
uno de los siguientes agentes fuera el agente causante del
SRRP.
- N.D. =
- no determinado
- ^{a} =
- ensayo de neutralización del virus (NV), como se describe en Virologische Arbeitsmethoden, vol. 2, redactado por A. Mayr y col., Fisher Verlag Jena, 1977, págs. 457-535;
- ^{b} =
- ensayo gI Elisa, como se describe en el manual proporcionado con el estuche de Intertest Aujeszky gI Elisa;
- ^{c} =
- ensayo de inhibición de hemaglutinación (IH), Virology, a practical approach, redactado por B.W.J. Mahy, IRL Press, Oxford, 1985, págs. 245-248;
- ^{d} =
- ensayo de inmunofluorescencia; Virologische Praxis, redactado por G. Starke, Fischer Verlag Jena, 1968, pág. 227-241.
\vskip1.000000\baselineskip
Muestras de suero de campo, obtenidas a partir
de casos clínicos, se ensayaron en un ensayo de inmunofluorescencia
(EIF) utilizando macrófagos infectados.
Además, se ensayaron muestras de suero de cerdos
infectados experimentalmente con el nuevo virus.
Placas de microtítulo sembradas con macrófagos
alveolares (4.10^{4} por pocillo) se infectaron utilizando
Aislado nº 10 e incubaron durante 24 horas. Al cabo de este tiempo,
aparecen los primeros signos de ECP. Las células se fijan con
etanol del 96%, frío (30 min). Diluciones seriadas, partiendo de
1/10, de las muestras de suero se incubaron sobre los macrófagos
infectados fijados durante 1 hora a 37ºC. La segunda incubación se
hizo con IgG anti-cerdo de conejo, conjugada a FITC
(Nordic, Breda) (dilución 1/40, 30 min, 37ºC). Se determinó la
fluorescencia específica con un microscopio de inmunofluorescencia
Leitz invertido. La fluorescencia específica se caracteriza por
fluorescencia perinuclear falciforme.
En la Tabla siguiente se da una comparación de
un grupo de sueros de ensayo.
Aunque el virus del SRRP no está relacionado
antigénicamente con virus porcinos conocidos, se pudo demostrar que
diferentes aislados de virus del SRRP son antigénicamente similares
ya que experimentan reacciones inmunológicamente cruzadas en el
ensayo IF.
La tabla siguiente demuestra que el suero SRRP
positivo reacciona con los diversos aislados de SRRP en el EIF.
Así, cualquier aislado de virus del SRRP se puede utilizar en la
presente invención debido a su fuerte relación antigénica, como se
demuestra con el EIF.
El virus del SRRP es un virus con envolvente
(sensible a tratamiento con cloroformo y éter) con pequeñas
nudosidades en la superficie y es similar al virus de lactato
deshidrogenasa y al virus de la artritis equina. La partícula de
virus mide aproximadamente 65 nm y tiene una densidad de flotación
de 1,1 g/cm^{3}.
En cultivo de células macrófagas infectadas con
el virus, se pueden detectar al menos dos proteínas específicas del
virus de aproximadamente 14.000 y 21.000 (Da).
También se pueden concentrar fluidos de SRRP
inactivados por cualquiera de las diversas técnicas disponibles,
tal como utilizando un dispositivo concentrador Amicon, técnicas de
precipitación tales como con cloruro de amonio o polietilenglicol,
concentración con Carbowax® o por medio de ultracentrifugación, o
técnicas de concentración con un coadyuvante, tal como con fosfato
de aluminio.
El objeto de la inactivación de los virus del
SRRP es eliminar la reproducción de los virus. En general, esto se
puede conseguir por medios químicos o físicos. La inactivación
química se puede efectuar tratando los virus con, por ejemplo,
formaldehído, \beta-propiolactona, etilenimina o
uno de sus derivados, un disolvente orgánico (tal como Tween®,
Triton X®, desoxicolato de sodio, sulfobetaína o sales de
octiltrimetilamonio). Si es necesario, el compuesto inactivante se
neutraliza seguidamente; el material inactivado con formaldehído se
puede neutralizar, por ejemplo, con metabisulfito. Preferiblemente,
la inactivación física se puede llevar a cabo sometiendo los virus
a una radiación rica en energía, tal como luz UV, radiación X o
radiación \gamma. Si se desea, el pH se puede llevar de nuevo a
un valor de aproximadamente 7 después del tratamiento.
Un método para preparación de antígeno viral del
SRRP, que incluye las etapas de
- a)
- inocular células de cultivo de tejido susceptible con el virus del SRRP,
- b)
- cultivar las células, y
- c)
- recolectar el antígeno viral del cultivo.
Preferiblemente, el virus del SRRP se cultiva a
títulos elevados, es decir, al menos 10^{6,0} DICT_{50}/ml.
En particular, el Aislado nº 10 del virus del
SRRP, nº de entrada en CNCM I-1140 se utiliza para
la preparación de altas cantidades de antígeno viral del SRRP.
El antígeno viral se puede preparar por la
propagación de los aislados de virus del SRRP en macrófagos
(alveolares, peritoneales, periféricos, médula ósea o de cualquier
otro sitio). También son útiles otras células con propiedades del
estilo de los macrófagos, como los promonocitos, monocitos, células
endoteliales vasculares del cerebro y células microgliales. Las
células macrófagas o del estilo de los macrófagos pueden ser de
origen SPF o no-SPF (v.g., de cerdos del comercio
regular). En los últimos casos, hay que tomar precauciones para
evitar contaminación no deseada, v.g., por el uso de antibióticos
apropiados en el cultivo.
Otro grupo de rutas que pueden conducir a un
procedimiento muy útil de propagación de virus es el establecimiento
de una línea de células macrófagas. A continuación, se mencionan
diversas posibilidades que pueden conducir a dichas líneas
deseables de células macrófagas.
Inmortalización de macrófagos utilizando medio
acondicionado de células L(929), células SK6, ST, Vero o BHK.
En estos medios acondicionados, es importante al menos la presencia
de linfocinas del estilo del Factor Estimulador de Colonias (FEC)
de macrófagos (Stanley, E.R., Methods Enzymology 116,
564-587, 1985).
Tratamiento de macrófagos de cualquier fuente
con productos químicos para inducir inmortalización, v.g.,
\beta-propiolactona como un ejemplo de un agente
alquilante que afecta al metabolismo del ADN (Logrippo, G.A. y
Harman, F.W., J. Immunol. 75, 123-128,
1955).
Un modo más definido de inmortalización es el
uso de virus transformantes. Hasta ahora, se han descrito
especialmente, pero sin limitarse a ellos, retrovirus (v.g., virus
de leucemia), virus SV40 y Papiloma, para inmortalizar macrófagos
de otras especies, como hombres y ratones. (Robinson, D.H. y col.,
Blood 77, 294-305, 1991; Righi, M. y col.,
Oncogene 6, 103-111, 1991; Choi, C.S. y col.,
Arch. Virol. 115, 227-237, 1990; Gendelman,
H.E. y col., Lab. Invert. 51, 547-555, 1984;
catálogo ATCC de líneas macrófagas humanas y de ratón
disponibles).
Un modo aun más preciso de inmortalización es el
uso de genes de cualquier virus mencionado anteriormente, u otros,
que sean responsables de la inmortalización, por ejemplo, se pueden
utilizar genes Vmyc o Vmsf y/o el gen T grande de SV40. La
construcción de un vector retroviral que permita la integración de
un gen no transformante, como el gen T grande de SV40, en el genoma
de la célula hospedadora sería la solución más preferible para que
se obtenga inmortalización sin la replicación y excreción reales de
partículas virales o del estilo de las virales. También, un
plásmido que contuviera un marcador seleccionable (v.g., Neo®) y el
gen T grande de SV40 sería un método para inmortalización.
Como fuente de inmortalización, se pueden tomar
macrófagos maduros, sin embargo, también son muy útiles fases
celulares antes de la diferenciación a los macrófagos maduros, ya
que estas son células en división con características de macrófagos
y tienen marcadores de macrófagos tales como CD1, CD11 y CD14. Las
fases previas se pueden seleccionar y obtener en forma pura libre
de contaminación por otros linfocitos utilizando diversas técnicas
de separación, por ejemplo, recuento de células con un CCAF
(Contador de Células Activadas por Fluorescencia) y anticuerpos
específicos, marcados con fluorocromos, contra los marcadores
CD.
La demanda de métodos específicos, sensibles,
para rastrear e identificar vehículos de virus del SRRP es
importante.
Por lo tanto, la presente invención también se
refiere a un ensayo rápido y sensible para la detección de
anticuerpos frente al virus del SRRP.
Un objeto adicional de la invención es
proporcionar estuches de pruebas de diagnóstico para realizar el
método de ensayo de la invención.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona un método para la detección de anticuerpos frente al
virus del SRRP, que comprende:
- a)
- incubar una muestra sospechosa de contener anticuerpos anti-virus del SRRP con reactivo antigénico viral del SRRP, derivado de virus de un tipo novedoso de virus caracterizado por el virus depositado en la CNCM con el nº de entrada I-1140, en condiciones que permitan la formación de un complejo de anticuerpo-antígeno, y
- b)
- detectar el complejo de anticuerpo-antígeno.
El antígeno viral de células infectadas con
SRRP, que reacciona inmunológicamente con suero que contiene
anticuerpos anti-virus del SRRP, es útil como
reactivo en inmunoensayos para detectar la presencia de anticuerpos
frente al virus del SRRP en muestras biológicas. El reactivo
antigénico viral puede ser, entre otros, partículas de virus
purificados o parcialmente purificados o polipéptidos virales, virus
fragmentados o células infectadas o lisado de dichas células. El
diseño del inmunoensayo puede variar. Por ejemplo, el inmunoensayo
se puede basar en una reacción de competición o directa, o en
ensayos de tipo sandwich. Más aún, los protocolos pueden utilizar
soportes sólidos o se pueden hacer por inmunoprecipitación. La
detección del complejo de anticuerpo-antígeno puede
implicar el uso de anticuerpo marcado; los marcadores pueden ser,
por ejemplo, marcadores fluorescentes, quimiluminiscentes,
radiactivos, moléculas de tinte o marcadores enzimáticos.
Los presentes métodos útiles para la detección
de anticuerpos frente al virus del SRRP incluyen el ensayo del
inmunosorbente unido a una enzima (ELISA; del inglés
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), el ensayo de
inmunofluorescencia (EIF) y la técnica de Manchado Western.
La técnica ELISA implica la reacción de una
muestra de ensayo con reactivo antigénico viral obtenido a partir
de virus del SRRP. Preferiblemente, el reactivo antigénico es un
lisado celular de macrófagos infectados con el virus del SRRP.
Típicamente, el reactivo antigénico se aplica sobre una fase sólida,
v.g., una microplaca o copa de plástico. Después de lavar para
separar los anticuerpos no unidos, se añade
anti-inmunoglobulina marcada con enzima a la fase
sólida, se incuba y lava de nuevo. Las enzimas adecuadas para
marcaje son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo,
peroxidasa de rábano picante. A continuación, se añade un sustrato
enzimático a la mezcla y se forma un producto de color medible,
detectable, en presencia de anticuerpos frente al virus del
SRRP.
Además, se puede utilizar la técnica EIF de
acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, macrófagos
infectados con el virus del SRRP se cultivan en placas de
microtítulo durante 24 horas. A continuación, las células se fijan,
por ejemplo, con acetona o etanol, o por
congelación-descongelación en combinación con
tratamiento con formalina. Después, se añade la muestra de ensayo a
las células fijadas y se incuba durante 1 h a 37ºC.
Subsiguientemente, se añade anti-inmunoglobulina
conjugada con un compuesto fluorescente tal como fluoresceína a las
células fijadas. Después se examinan las mezclas de reacción para
determinar la fluorescencia bajo un microscopio. Se puede demostrar
un modelo típico de fluorescencia de macrófagos infectados con el
virus del SRRP, incubados con un suero positivo de un cerdo
infectado con SRRP.
El método de diagnóstico preferido de acuerdo
con la invención está enfocado a la detección de anticuerpos frente
al SRRP utilizando la técnica de Manchado Western.
En esta técnica, se resuelve
electroforéticamente el antígeno viral del SRRP sobre geles de
DSS-poliacrilamida. Preferiblemente, el antígeno
viral del SRRP es el lisado celular de macrófagos infectados con
virus del SRRP. Las bandas de proteína resultantes se
electro-transfieren, preferiblemente a papel de
nitrocelulosa. También son adecuados otros tipos de papel,
conocidos por los expertos en la técnica, tales como papel diazo.
(Tsang y col., En: Methods in Enzymology 92, capítulo 29,
1983). Después, las tiras de nitrocelulosa que contienen el
antígeno viral resuelto se incuban con las muestras de ensayo y, si
se desea, con muestras de referencia positivas y negativas. Si se
desea, también se incuban con la muestra de ensayo tiras de
referencia negativas, que contienen, por ejemplo, lisado de
macrófagos, resuelto electroforéticamente, obtenido a partir de
macrófagos no infectados con el virus del SRRP. Típicamente, la
muestra de referencia positiva es una muestra que se sabe que
contiene anticuerpos frente al virus del SRRP, v.g., suero
procedente de casos clínicos de SRRP o de animales infectados
experimentalmente con el virus del SRRP. La muestra de referencia
negativa es una muestra que se sabe que está desprovista de
anticuerpos frente al virus del SRRP. Después, se puede llevar a
cabo la detección del complejo de
anticuerpo-antígeno ya sea por ELISA o por técnicas
de radioinmunoensayo en tiras de fase sólida. Se pueden llevar a
cabo lavados después de cada incubación.
Preferiblemente, la incubación de las tiras se
lleva a cabo en contenedores.
Sorprendentemente, la técnica de manchado
Western es particularmente adecuada para la detección de
polipéptidos específicos del virus del SRRP, obtenidos a partir de
un cultivo de células in vitro debido a la presencia de dos
o tres proteínas pequeñas, específicas del virus, identificables
separadamente a partir de otro material reactivo con suero SRRP.
Como se indica en la Figura 1, la reactividad inmune principal o
especificidad se dirige contra una proteína de aproximadamente
14.000 y 21.000 (Da) del virus del SRRP (manchado Western de virus
del SRRP cultivado en macrófagos, purificado en un gradiente de
glicerol). La banda de 21.000 (Da) es difusa y, por lo tanto, la
designación 21.000 (Da) sólo representa una indicación del tamaño de
esta proteína. Otras proteínas específicas del virus, reconocidas
por anticuerpos frente al virus del SRRP, en el manchado Western,
tienen pesos moleculares de aproximadamente 46.000, 49.000 y 55.000
(Da).
Con viriones marcados con
^{35}S-Met/Cys, se observó que eran prominentes
las proteínas 14K, 24K, 33K y 46K. La radioinmunoprecipitación de
lisados celulares infectados, marcados con
^{35}S-Met/Cys dio como resultado la demostración
de dos proteínas específicas del virus, de aproximadamente 24K y
33K. Las proteínas específicas del virus, indicadas anteriormente,
también se pueden utilizar para la diagnosis de infección con
SRRP.
En una realización preferida de la invención, la
proteína del virus del SRRP, de 14.000 y/o 21.000 (Da), purificada,
se puede utilizar en la técnica de ELISA y manchado Western como
reactivo antigénico viral con el fin de proporcionar un ensayo más
sensible.
De acuerdo con otra realización de la invención,
se proporciona un estuche de ensayo de diagnóstico, que permite
rastrear "en el sitio" anticuerpos frente al virus del SRRP. El
estuche de ensayo incluye al menos una tira que contiene antígeno
viral del SRRP resuelto, (electro-)transferido a partir de un gel de
EGPA-DSS. Además, el estuche puede comprender una
tira de referencia de control negativo, v.g., que contiene antígeno
resuelto a partir de un cultivo de células in vitro, v.g.
cultivo de células macrófagas, no infectado con el virus del
SRRP.
Preferiblemente, las tiras están contenidas en
contenedores individuales, facilitando las etapas subsiguientes de
incubación.
Más aún, es ventajoso incluir en el estuche de
ensayo las muestras de referencia positiva y negativa con el fin de
facilitar la evaluación de los resultados del ensayo por comparación
con los resultados obtenidos para la muestra de ensayo.
Si se desea, también se proporcionan en el
estuche tiras de referencia positivas y negativas previamente
desarrolladas. Las tiras previamente desarrolladas se utilizan para
evaluar los resultados del ensayo por una comparación visual con
las tiras de ensayo después de acondicionar una reacción de color.
Las tiras previamente desarrolladas facilitan la lectura de los
resultados del ensayo y prácticamente eliminan la necesidad de un
técnico experto para evaluar los resultados.
En el estuche, también se pueden incluir viales
de reactivo antisuero conjugado con una enzima, preferiblemente
inmunoglobulinas conjugadas con peroxidasa de rábano picante,
sustrato o indicador de cambio de color, tampones de lavado y
solución para detener la reacción de color. El sustrato, el agente
para detener la reacción y los tampones de lavado preferidos son
DAB, agua destilada y SSTF Tween® y SSTF, respectivamente.
En una realización de las más preferidas de este
estuche de ensayo, las bandas de proteína de aproximadamente 14.000
y 21.000 (Da) de las tiras de ensayo del virus del SRRP que
contienen el antígeno viral del SRRP, resuelto, son identificables
separadamente, es decir, estas bandas están separadas de otros
antígenos virales o no virales, reactivos con el suero SRRP.
Para medir el antígeno viral del SRRP en una
muestra de ensayo, se utilizan antisuero o anticuerpos específicos
contra SRRP, conocidos, como reactivo, preferiblemente fijados a una
fase sólida. Se añade la muestra de ensayo que contiene antígeno y,
después de la incubación dejando que se forme un complejo de
antígeno-anticuerpo, se lava la fase sólida y se
añade un segundo anticuerpo marcado para detectar el complejo de
antígeno-anticuerpo.
Más aún, la presente invención se refiere a
estuches de ensayo que se utilizan de acuerdo con el método para la
detección del antígeno viral del SRRP en una muestra de ensayo como
se ha descrito anteriormente.
Lechones SPF mantenidos en instalaciones con
aislamiento se anestesian y se realiza lavado pulmonar utilizando
solución salina tamponada con fosfato (SSTF) templada. Se recogen
aproximadamente 100 ml de suspensión de macrófagos en botellas de
vidrio silicónico. Los macrófagos se lavan con SSTF y se incuban con
medio RPM 1640 (Flow Labs) suplementado con suero vacuno fetal al
10% y antibióticos durante 24 horas en una incubadora con CO_{2}
al 5%. Las células se sembraron en matraces Roux de 25 cm^{2}
(Falcon) a una densidad de 3 x 10^{5} por cm^{2}.
La cerda 266 que padecía síntomas clínicos de
SRRP (aborto, falta de hambre) diagnosticada por un veterinario del
Instituto Regional de la Salud Animal se tomó para hacer la
autopsia.
Se preparó un homogeneizado al 50% de tejido
pulmonar en SSTF, utilizando un Ultraturrax®. Se utilizó
centrifugación a baja velocidad para clarificar la suspensión. Se
sacó un ml del sobrenadante clarificado y se inoculó en una
monocapa de 24 horas de macrófagos alveolares. Después de la
incubación durante 1 h a 37ºC, el medio se añadió de nuevo y los
macrófagos infectados se incubaron además a 37ºC en atmósfera de
CO_{2}. Después de dos días fueron evidentes los primeros signos
de ECP. El día 3, los macrófagos mostraron lisis completa, lo que
se confirmó por la captación de azul de tripano. Las células viables
excluyen el tinte azul de tripano, como lo hacían los macrófagos
control no infectados. La recolección de este primer pase se guardó
a -70ºC. Se hicieron pases adicionales de este aislado por
incubación de 1 ml de virus prediluido 1:10 - 1:100 en cultivos
adicionales de macrófagos. El ECP total es evidente después de
2-3 días de incubación. A este aislado de SRRP, se
le asignó el código interno "Aislado nº 10". Una muestra de
este aislado se ha depositado en la CNCM con el nº de entrada
I-1140.
El método para la preparación del antígeno viral
del SRRP, que se ha descrito anteriormente, da como resultado la
capacidad de propagación del virus a altos títulos in vitro.
La Tabla 1 muestra los resultados del rendimiento de virus después
de varios niveles de pase del Aislado nº 10.
Sobrenadantes de cultivos de macrófagos
infectados así como no infectados se clarificaron a 3.000 g. Los
sobrenadantes se centrifugaron en un rotor SW 28.1 a 25.000 rpm
durante 3 horas. Los sedimentos se resuspendieron en tampón TEN y
utilizaron en electroforesis en gel.
El material se separó por electroforesis en
condiciones reductoras en un gel de dodecilsulfato de sodio
(DSS)-poli-acrilamida al 10%. Los
geles se equilibraron en tampón renaturalizante (urea 4 M, NaCl 50
mM, Tris-hidrocloruro 10 mM, ditiotreitol 0,1 mM
[pH 7]) durante 30 min y después se incubaron en tampón de
electroforesis sin DSS durante 30 minutos adicionales. La
transferencia electroforética a membranas de nitrocelulosa
(Schleicher & Schuell, Dassel, FRG) se realizó en una cuba de
transferencia electroforética Mini Trans-Blot
(Bio-Rad, Munich, FRG) a 2 A durante 1 h. La unión
no específica de proteínas a la membrana se bloqueó por incubación
con una solución de leche en polvo en SSTF durante 2 h. Los
antisueros de cerdo positivos en VSRRP diluidos en solución de
leche en polvo en SSTF se dejaron estar durante una noche para que
transcurriera la unión, y la unión específica se detectó utilizando
un antisuero conjugado con peroxidasa anti-porcina
de cabra (Dianova) y 2,3-cloronaftol (Sigma) como
el sustrato.
Claims (1)
1. Un método para la supresión de anticuerpos
del virus del SRRP, cuyo método es un ensayo de inmunoabsorbente
unido a una enzima (ELISA) o un ensayo inmunológico de tipo Manchado
Western, que comprende las etapas de:
- a.
- incubar una muestra de ensayo sospechosa de contener anticuerpos anti-virus del SRRP con un reactivo antigénico viral del SRRP derivado de un virus del SRRP depositado en la CNCM con el nº de entrada I-1140 o un aislado de virus del SRRP relacionado inmunológicamente con aquel, en condiciones que permitan la formación de un complejo de anticuerpo-antígeno, y
- b.
- detectar el complejo de anticuerpo-antígeno que implica el uso de un anticuerpo marcado, seleccionándose el marcador a partir del grupo formado por marcadores fluorescentes, marcadores quimiluminiscentes, marcadores radiactivos, marcadores de moléculas de tinte y marcadores enzimáticos siempre que el marcador enzimático no se utilice en un inmunoensayo de monocapa de peroxidasa (IEMP).
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