ES2134388T5

ES2134388T5 - Combinaciones de antigenos del virus de la hepatitis c (hcv) para su uso en inmunoensayos para anticuerpos anti-hcv.

Info

Publication number: ES2134388T5
Application number: ES95114016T
Authority: ES
Inventors: Michael Houghton; Qui-Lim Choo; George Kuo
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1990-04-04
Filing date: 1991-04-03
Publication date: 2008-12-01
Anticipated expiration: 2011-04-03
Also published as: LV10344A; EP0693687B1; ATE139343T1; JP2733138B2; NO923839D0; EP0450931B1; DE69131488T2; UA41266C2; AU639560B2; PL172133B1; ATE182684T1; GB2257784B; ES2088465T3; IE911105A1; GB9220480D0; DE69120138T2; DK0693687T3; HU9203146D0; LV10344B; DK0693687T4

Abstract

SE PRESENTAN COMBINACIONES DE ANTIGENOS HCV QUE TIENEN UNA GAMA MAS AMPLIA DE REACTIVIDAD INMUNOLOGICA QUE CUALQUIER ANTIGENO HCV SIMPLE. LAS COMBINACIONES CONSTAN DE UN ANTIGENO DEL DOMINANTE C DE LA POLIPROTEINA DEL HCV, Y UN ANTIGENO ADICIONAL DEL HCV DEL DOMINANTE S, OPCIONALMENTE CON UN ANTIGENO ADICIONAL PARA CUALQUIERA DE LOS DOMINANTES NS3, NS4 O NS5, Y TIENEN LA FORMA DE UNA PROTEINA DE FUSION, UNA MEZCLA FISICA SIMPLE, O DE LOS ANTIGENOS INDIVIDUALES COMUNMENTE UNIDOS A UNA MATRIZ SOLIDA.

Description

Combinaciones de antígenos del virus de la hepatitis C (HCV) para su uso en inmunoensayos para anticuerpos anti-HCV.

Campo técnico

La presente invención se refiere al campo de los inmunoensayos para el HCV (anteriormente denominado virus de la hepatitis no A, no B). Más particularmente, se refiere a combinaciones de antígenos de HCV que permiten una amplia variedad de inmunoensayos para anticuerpos anti-HCV.

Fundamento

La enfermedad anteriormente conocida como hepatitis no A, no B (NANBH) se consideró que era una enfermedad o familia de enfermedades transmisible que se pensaba que eran inducidas por virus, y que podían ser distinguidas de otras formas de enfermedades hepáticas asociadas con virus, incluyendo las causadas por los virus de hepatitis conocidos, es decir, el virus de la hepatitis A (HAV), el virus de la hepatitis B (HBV), y el virus de la hepatitis delta (HDV), así como también la hepatitis inducida por citomegalovirus (CMV) o el virus de Epstein-Barr (EBV). El NANBH fue identificado primeramente en individuos sometidos a transfusiones. La transmisión desde el hombre al chimpancé y el paso seriado en chimpancés proporcionó evidencia de que el NANBH era debido a un agente o agentes infecciosos transmisibles. La evidencia epidemiológica ha sugerido que pueden existir tres tipos de NANBH: un tipo epidémico transportado por el agua; un tipo transportado por la sangre o transmitido por vía parenteral; y un tipo que ocurre esporádicamente (adquirido comunitariamente). Sin embargo, hasta épocas recientes, no había sido identificado ningún agente transmisible responsable del NANBH, y el diagnóstico clínico y la identificación del NANBH habían sido efectuados por exclusión de otros marcadores virales. Entre los métodos utilizados para detectar antígenos y anticuerpos putativos del NANBH estaban la difusión en gel de agar, la contrainmunoelectroforesis, la microscopía de inmunofluorescencia, la microscopía inmunoelectrónica, el radioinmunoensayo y el ensayo inmunoenzimático. No obstante, ninguno de estos ensayos había demostrado ser suficientemente sensible, específico y reproducible para ser utilizado como ensayo de diagnóstico del NANBH.

En 1987, los científicos de la Chiron Corporation (el propietario de la presente solicitud de patente) identificaron el primer ácido nucleico definitivamente unido al NANBH transportado por la sangre. Véase, por ejemplo, EPO Pub. No. 318.216; Houghton et al., Science 244:359 (1989). Estas publicaciones describen la clonación de un aislado procedente de una nueva clase viral denominada virus de la hepatitis C (HCV), denominándose "HCV1" al virus prototípico descrito. El HCV es un virus semejante a los Flavivirus, con un genoma de RNA. El documento EP-A-318.216 describe también la inmunogenicidad del polipéptido C100 expresado desde el cDNA del HCV y el uso de antígenos de HCV en inmunoensayos de diagnóstico.

La patente de EE.UU. No. 5.350.671 (Houghton et al.), describe la preparación de varios polipéptidos de HCV recombinantes por expresión del cDNA de HCV y la selección de esos polipéptidos por su reactividad inmunológica con sueros procedentes de pacientes con HCV. Tal selección limitada puso de manifiesto que al menos cinco de los polipéptidos ensayados eran muy inmunógenos; específicamente, los identificados como 5-1-1, C100, C33c, CA279c y CA290a. De estos cinco polipéptidos, el 5-1-1 está localizado en el dominio putativo NS4; el C100 abarca los dominios putativos NS3 y NS4; el C33c está localizado dentro del dominio putativo NS3 y el CA279a y el CA290a están localizados dentro del dominio putativo C. La selección mostró también que ninguno de los polipéptidos aislados ensayado era inmunológicamente reactivo con todos los sueros. Por tanto, son deseables ensayos mejorados que reaccionen con todas o más muestras procedentes de individuos HCV positivos. El documento WO 91/15574, publicado el 17 de Octubre de 1991, describe proteínas y glicoproteínas de HCV purificadas, útiles en un sistema de diagnóstico para la detección de antisueros de HCV humanos.

Descripción de la invención

Los Solicitantes han llevado a cabo estudios serológicos adicionales sobre antígenos de HCV que confirman que ninguno de los polipéptidos de HCV identificados hasta la fecha, es inmunológicamente reactivo por sí solo con todos los sueros. Esta carencia de un polipéptido único que sea universalmente reactivo con todos los sueros procedentes de individuos con HCV puede ser debida, entre otras causas, a variaciones de cepa a cepa en los epítopos del HCV, a variabilidad en la respuesta humoral de individuo a individuo y/o a variación de la serología con el estado de la enfermedad.

Estos estudios adicionales han permitido también a los Solicitantes identificar combinaciones de antígenos de HCV que proporcionan un detección más eficaz de anticuerpos de HCV que cualquier polipéptido del HCV por sí solo.

Por consiguiente, un aspecto de esta invención es una combinación de antígenos de virus de la hepatitis C (HCV) en uno o más polipéptidos obtenidos mediante síntesis química o expresión recombinante, que comprende:

(a): un primer antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio C de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1; y

\global\parskip0.880000\baselineskip

(b): un segundo antígeno de HCV seleccionado entre:

(i): un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio S de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1;

(ii): un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS3 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1;

(iii): un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS4 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1; y

(iv): un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS5 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1;

con la condición de que la combinación no sea el péptido p1 con C100-3, el péptido p35 con C100-3, el péptido p99 con C100-3, o un péptido que posea los aminoácidos 9 a 177 de la poliproteína de HCV-1.

Preferiblemente, el segundo antígeno de HCV comprende un epítopo procedente del dominio S de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1 y en este caso, la combinación comprende preferiblemente, además, al menos un antígeno de HCV adicional seleccionado entre:

(i): un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS3 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1;

(ii): un antígeno de HCB que comprende un epítopo procedente del dominio NS4 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1;

(iii): un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS5 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1;

Más preferiblemente, el antígeno adicional procede del dominio NS3 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1.

Otro aspecto de la invención es un método para detectar anticuerpos contra el HCV en un componente del cuerpo de un mamífero sospechoso de contener dichos anticuerpos, que comprende poner en contacto dicho componente del cuerpo con la combinación de antígenos de HCV anteriormente descrita, en condiciones que permiten la reacción anticuerpo-antígeno, y detectar la presencia de inmunocomplejos de dichos anticuerpos u dichos antígenos.

Otro aspecto de la invención es un método para detectar anticuerpos contra el HCV en un componentes del cuerpo de un mamífero sospechoso de contener dichos anticuerpos, que comprende poner en contacto dicho componente del cuerpo con una combinación de antígenos de HCV de la invención, en condiciones que permiten la reacción anticuerpo-antígeno, y detectar la presencia de inmunocomplejos de dichos anticuerpos y dichos antígenos.

Otro aspecto de la invención es un estuche (kit) para llevar a cabo un ensayo para detectar anticuerpos contra el HCV en un componente del cuerpo de un mamífero sospechoso de contener dichos anticuerpos, que comprende en combinación empaquetada.

(a): dicha combinación de antígenos de HCV

(b): reactivos testigo estándar; y

(c): instrucciones para llevar a cabo el ensayo.

Descripción breve de los dibujos

En los dibujos:

La Figura 1 es la secuencia de nucleótidos de la cadena de cDNA en orientación sentido y anti-sentido de la poliproteína de HCV y la secuencia de aminoácidos codificada por la cadena en orientación sentido.

La Figura 2 es una representación esquemática de la secuencia de aminoácidos de la Figura 1 que muestra los dominios putativos del polipéptido de HCV.

Modos para llevar a cabo la invención Definiciones

"Antígeno de HCV" significa un polipéptido de al menos aproximadamente 5 aminoácidos, más habitualmente al menos aproximadamente 8 a 10 aminoácidos, que define un epítopo encontrado en un aislado de HCV. Preferiblemente, el epítopo es único para el HCV. Cuando un antígeno se designa mediante un código alfanumérico, el epítopo procede del dominio de HCV especificado por la notación alfanumérica.

\global\parskip1.000000\baselineskip

"Sintético", tal como se usa para caracterizar un antígeno de HCV, significa que el antígeno de HCV ha sido hecho por la mano del hombre, por ejemplo mediante síntesis química o mediante síntesis recombinante.

"Dominios" significa aquellos segmentos de la poliproteína de HCV que se muestran en la Figura 2 que corresponden en general a las proteínas putativas estructurales y no estructurales, del HCV. Las designaciones de los dominios siguen, en general, la convención empleada para nombrar proteínas Flavivirales. Las localizaciones de los dominios que se muestran en la Figura 2 son solamente aproximadas. Las designaciones "NS" denotan dominios "no estructurales", mientras que "S" denota el dominio de la cubierta, y "C" denota el dominio de la nucleocápsida o del núcleo.

"Polipéptido de fusión" significa un polipéptido en el que el antígeno o antígenos de HCV forman parte de una cadena continua única de aminoácidos, cuya cadena no se presenta de modo natural. Los antígenos de HCV pueden estar conectados directamente unos a otros mediante uniones peptídicas o estar separados por secuencias de aminoácidos intervinientes. Los polipéptidos de fusión pueden contener también secuencias de aminoácidos exógenas respecto al HCV.

"Matriz sólida común" significa un cuerpo sólido al que los antígenos de HCV individuales o el polipéptido de fusión compuesto de antígenos de HCV, se unen covalentemente o por medios no covalentes tales como adsorción hidrófoba.

"Componente del cuerpo de un mamífero" significa un fluido o un tejido de un mamífero (por ejemplo, un ser humano) que contiene comúnmente anticuerpos producidos por el individuo. Tales componentes son conocidos en la técnica e incluyen, sin limitación, sangre, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, secreciones de los tractos respiratorio, intestinal o genitourinario, lágrimas, saliva, leche, glóbulos blancos, y mielomas.

"Inmunológicamente reactivo" significa que el antígeno en cuestión reacciona específicamente con anticuerpos anti-HCV presentes comúnmente en una proporción importante de sueros procedentes de individuos infectados con HCV.

"Inmunocomplejo" significa la combinación o agregado formados cuando un anticuerpo se une a un epítopo de un antígeno.

Combinaciones de antígenos de HCV

La Figura 2 muestra los dominios putativos de la poliproteína de HCV. Los dominios desde los que derivan los antígenos usados en la combinaciones son: C, S (o E), NS3, NS4, y NS5. Se cree que el dominio C define la proteína de la nucleocápsida del HCV. Este dominio se extiende desde el extremo N terminal de la poliproteína hasta aproximadamente el aminoácido 120 de la Figura 1. Se cree que el dominio S de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1 define la proteína de la cubierta del virión, y posiblemente la proteína (M) de la matriz, y se opina que se extiende desde aproximadamente el aminoácido 120 hasta el aminoácido 400 de la Figura 1. El dominio NS3 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1 se extiende desde aproximadamente el aminoácido 1050 hasta el aminoácido 1640 y se cree que constituye la proteasa viral. El dominio NS4 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1 se extiende desde el término del NS3 hasta aproximadamente el aminoácido 2000. La función de la proteína de NS4 no se conoce en la actualidad. Finalmente, el dominio NS5 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1 se extiende desde aproximadamente el aminoácido 2000 hasta el extremo de la poliproteína y se cree que define la polimerasa viral.

La secuencia mostrada en la Figura 1 es la secuencia del aislado de HCV1. Es de esperar que las secuencias de otras cepas del HCV transportado por la sangre difieran de la secuencia de la Figura 1, en particular en los dominios de la cubierta (S) y de la nucleocápsida (C).

En general, los antígenos de HCV comprenden dominios completos o truncados, pudiendo ser seleccionados fácilmente por su antigenicidad los fragmentos de los dominios, por los expertos en la técnica. Los antígenos de HCV individuales usados en la combinación comprenderán, preferiblemente, la parte inmunodominante (es decir, la parte principalmente responsable de la reactividad inmunológica del polipéptido) del dominio de que se trate. En el caso del dominio C, se prefiere que el antígeno del dominio C comprenda la mayor parte de la secuencia completa del dominio. El antígeno designado C22 (véase el Ejemplo 4 que figura más adelante), es particularmente preferido. El antígeno del dominio S incluye preferiblemente el subdominio hidrófobo situado en el extremo N terminal del dominio. Este subdominio hidrófobo se extiende desde aproximadamente el aminoácido 199 hasta el aminoácido 328 de la Figura 1. El antígeno de HCV designado S2 (véase el Ejemplo 3 que figura más adelante), es particularmente preferido. La secuencia aguas abajo del subdominio hidrófobo puede incluirse en el antígeno del dominio S si se desea.

Un antígeno del dominio NS3 preferido es el antígeno designado C33c. Este antígeno incluye los aminoácidos 1192 a 1457 de la Figura 1. Un antígeno de NS4 preferido es el C100 que comprende los aminoácidos 1569 al 1931 de la Figura 1. Un antígeno de NS5 preferido comprende los aminoácidos 2054 al 2464 de la Figura 1.

El antígeno de HCV puede estar en la forma de un polipéptido constituido enteramente por la secuencia de aminoácidos del HCV o puede contener una secuencia exógena al HCV (es decir, puede estar en la forma de una proteína de fusión que incluya la secuencia exógena). En el caso de antígeno de HCV obtenido recombinantemente, la producción del antígeno en forma de una proteína de fusión tal como con SOD, factor alfa o ubiquitina (véanse la patente de EE.UU. No. 4.751.180, la patente de EE.UU. No. 4.870.008 y la solicitud de patente de EE.UU. Ser. No. 390.599, presentada el 7 de Agosto de 1989, de propiedad común, que describen la expresión de proteínas de fusión de SOD, factor alfa y ubiquitina) puede aumentar el nivel de expresión y/o aumentar la solubilidad en agua del antígeno. Las proteínas de fusión tales como la fusión del factor alfa y la ubiquitina, son procesadas por el huésped de expresión para separar la secuencia heteróloga. Sin embargo, el factor alfa es un sistema de secreción mientras que las fusiones de ubiquitina permanecen en el citoplasma.

Además, la combinación de antígenos puede ser producida como una proteína de fusión. Por ejemplo, puede construirse un fragmento continuo de DNA que codifica C22 y C33c, clonado en un vector de expresión y usado para expresar una proteína de fusión de C22 y C33c. De un modo similar pueden prepararse proteínas de fusión de C22 y C100; C22 y S2; C22 y un antígeno de NS5; C22, C33c, y S2; C22, C100 y S2, y C22, C33c, C100 y S2. También pueden usarse fragmentos alternativos del dominio ejemplificado.

Preparación de antígenos de HCV

Los antígenos de HCV de la invención son producidos recombinantemente o mediante la conocida síntesis química en fase sólida.

Cuando son producidos mediante técnicas recombinantes, pueden emplearse procedimientos operatorios estándar para construir el DNA que codifica el antígeno, clonar el DNA en vectores de expresión, transformar células hospedantes tales como bacterias, levaduras, insectos o células de mamífero, y expresar tal DNA para producir el antígeno. Como se ha indicado anteriormente, puede ser deseable expresar el antígeno en la forma de una proteína de fusión para favorecer la expresión, facilitar la purificación, o mejorar la solubilidad. Ejemplos de procedimientos operatorios específicos para producir antígenos de HCV representativos están descritos en los Ejemplos que figuran más adelante, y en la patente de EE.UU. No. 5.350.671.

Formulación de antígenos para usar en inmunoensayos

Los antígenos de HCV pueden ser combinados produciéndolos en la forma de una proteína de fusión compuesta de dos o más de los antígenos, inmovilizándolos individualmente sobre una matriz común sólida, o mezclándolos físicamente. Las proteínas de fusión del antígeno pueden ser inmovilizadas también sobre (unidas a) una matriz sólida. Métodos y medios para unir covalente o no covalentemente proteínas a matrices sólidas, son conocidos en la técnica. La naturaleza de la superficie sólida puede variar dependiendo del formato del ensayo. Para ensayos llevados a cabo en pocillos de microtitulación, la superficie sólida será la pared del pocillo o copa. Para ensayos que utilizan bolas pequeñas, la superficie sólida será la superficie de la bola. En ensayos que utilizan una varilla de inmersión (dipstick) es decir, un cuerpo sólido fabricado a partir de un material poroso o fibroso tal como tela o papel) la superficie será la superficie del material con el que se ha fabricado la varilla de inmersión. En ensayos de aglutinación la superficie sólida puede ser la superficie de partículas de látex o de gelatina. Cuando se unen a la matriz antígenos individuales, estos pueden distribuirse homogéneamente sobre la superficie o distribuirse sobre ella según un modelo dado, tal como bandas, de modo que puede distinguirse el modelo de unión del antígeno.

Las mezclas simples de los antígenos comprenden los antígenos en cualquier disolvente o medio de dispersión adecuado.

Formatos de ensayo usando combinaciones de antígenos

Los antígenos de HCV pueden ser empleados en virtualmente cualquier formato de ensayo que emplee un antígeno conocido para detectar anticuerpos. Una característica común de todos estos ensayos es que el antígeno se ponga en contacto con el componente del cuerpo sospechoso de contener anticuerpos de HCV, en condiciones que permitan que el antígeno se una a cualquiera de tales anticuerpos presentes en el componente. Tales condiciones son, típicamente, temperatura fisiológica, pH y fuerza iónica, usando un exceso de antígeno. La incubación del antígeno con la muestra va seguida de detección de inmunocomplejos que comprenden el antígeno.

El diseño de los inmunoensayos está sujeto a un grado grande de variación, y muchos formatos son conocidos en la técnica. Los protocolos pueden utilizar, por ejemplo, soportes sólidos, o inmunoprecipitación. La mayor parte de los ensayos implican el uso de anticuerpos o polipéptidos marcados; los marcadores pueden ser, por ejemplo, enzimáticos, fluorescentes, quimiluminiscentes, radiactivos, o moléculas de colorantes. También son conocidos ensayos que amplifican las señales procedentes del inmunocomplejo, ejemplos de los cuales son los ensayos que utilizan biotina y avidina, e inmunoensayos marcados con enzimas y realizados con mediación de éstas, tales como ensayos ELISA.

Los inmunoensayos pueden tener, sin limitación, un formato heterogéneo o en un formato homogéneo, y ser de un tipo estándar o competitivo. En un formato heterogéneo, el polipéptido se une, típicamente, a una matriz sólida o un soporte sólido para facilitar la separación de la muestra del polipéptido después de realizar la incubación. Son ejemplos de soportes sólidos que pueden ser empleados, nitrocelulosa (por ejemplo, en forma de membrana o de pocillo de microtitulación), policloruro de vinilo (por ejemplo, en láminas o pocillos de microtitulación), látex de poliestireno (por ejemplo, en forma de bolas pequeñas o placas de microtitulación), polifluoruro de polivinilideno (conocido como Immulon^{TM}), papel diazotado, membranas de nilón, bolas activadas, y bolas de Proteína A. Por ejemplo, pueden utilizarse en el formato heterogéneo placas de microtitulación de Dynatech Immulon^{TM} 1 ó Immulon^{TM} 2, o bolas de poliestireno de 6,4 mm (Precision Plastic Ball). El soporte sólido que contiene los polipéptidos antigénicos se lava típicamente después de separarlo de la muestra de ensayo, y antes de la detección de los anticuerpos unidos. Ambos formatos, estándar y competitivo, son conocidos en la técnica.

En un formato homogéneo, la muestra de ensayo se incuba con la combinación de antígenos en solución. Por ejemplo, puede efectuarse en condiciones que precipitan los complejos antígeno-anticuerpo que se formen. Ambos formatos, estándar y competitivo, para estos ensayos, son conocidos en la técnica.

En un formato estándar, la cantidad de anticuerpos de HCV que forman el complejo antígeno-anticuerpo se comprueba directamente. Esto puede llevarse a cabo determinando si anticuerpos anti-xenógenos (por ejemplo, anti-humanos) marcados que reconocen un epítopo sobre anticuerpos anti-HCV se han unido debido a la formación de complejo. En un formato competitivo, la cantidad de anticuerpos de HCV existente en la muestra se deduce comprobando el efecto competitivo sobre la unión de una cantidad conocida de anticuerpo marcado (u otro ligando en competencia) en el complejo.

Los complejos formados que comprenden anticuerpo anti-HCV (o, en el caso de ensayos competitivos, la cantidad de anticuerpo en competencia) son detectados mediante cualquiera de diversas técnicas conocidas, dependiendo del formato. Por ejemplo, los anticuerpos de HCV sin marcar existentes en el complejo pueden ser detectados usando un conjugado de Ig anti-xenógena complejada con un marcador (por ejemplo, un marcador enzimático).

En un formato de ensayo de inmunoprecipitación o de aglutinación, la reacción entre los antígenos de HCV y el anticuerpo forma un retículo que precipita desde la solución o suspensión y forma una capa o película visible de precipitado. Si no se encuentra presente en la muestra de ensayo anticuerpo anti-HCV, no se forma precipitado visible.

Los antígenos de HCV típicamente pueden empaquetarse típicamente en la forma de un estuche (kit) para usar en estos inmunoensayos. El estuche contendrá normalmente, en recipientes separados, la combinación de antígenos (o bien ya unidos a una matriz sólida o separados con reactivos para unirlos a la matriz), formulaciones de anticuerpos testigo (positivos y/o negativos), anticuerpo marcado cuando el formato de ensayo lo requiere y reactivos generadores de señal (por ejemplo, un sustrato enzimático) si el marcador no genera directamente una señal. En el estuche se incluirán habitualmente instrucciones (por ejemplo, por escrito, en cinta, VCR, CD-ROM, etc.) para llevar a cabo el ensayo.

Los ejemplos que siguen están destinados a ilustrar la invención y no están destinados a limitar en modo alguno la invención.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1

Síntesis del antígeno de HCV C33c

El antígeno de HCV C33c contiene una secuencia procedente del dominio NS3. Específicamente, incluye los aminoácidos 1192-1457 de la Figura 1. Este antígeno ha sido producido en bacterias en forma de una proteína de fusión con superóxido dismutasa (SOD) humana del modo siguiente. El vector pSODcf1 (Steiner et al., J. Virol. 58:9 (1986)) se sometió a digestión hasta terminación con EcoRI y BamHI y el fragmento EcoRI,BamHI resultante fue ligado al engarce siguiente para formar el pcf1EF:

100

101

Un clon de cDNA que codifica los aminoácidos 1192-1457 y que tenía extremos EcoRI fue insertado en el pcf1EF formando el pcf1EF/C33c. Esta construcción de expresión fue transformada en células de E. coli D1210.

Los transformantes fueron usados para expresar una proteína de fusión que constaba de SOD en el extremo N terminal y antígeno de HCV C33c en el marco de lectura, en el extremo C terminal. La expresión se llevó a cabo por inoculación de 1500 ml de caldo Luria conteniendo ampicilina (100 microgramos/ml) con 15 ml de un cultivo de los transformantes realizado durante la noche. Las células se hicieron crecer hasta una D.O. de 0,3, se añadió IPTG para obtener una concentración final de 2 mM, y se continuó el crecimiento hasta que las células alcanzaron una densidad de 1 D.O. en cuyo momento fueron recolectadas por centrifugación a 3.000 x g, a 4ºC, durante 20 minutos. Las células empaquetadas pueden ser mantenidas a -80ºC durante varios meses.

Con objeto de purificar el polipéptido SOD-C33c las células bacterianas en las que el polipéptido fue expresado fueron sometidas a choque osmótico y disrupción mecánica, se aisló la fracción insoluble que contenía al SOD-C33c y se sometió a extracción diferencial con una solución de NaCl-compuesto alcalino, y el polipéptido de fusión existente en el extracto se purificó mediante cromatografía en columna de S-Sepharose^{(TM)} y Q-Sepharose^{(TM)}.

El extracto crudo resultante del choque osmótico y la disrupción mecánica, se preparó mediante el procedimiento siguiente. Un gramo de las células empaquetadas fue suspendido en 10 ml de una solución que contenía Tris-HCl 0,02 M, pH 7,5, EDTA 10 mM y sacarosa al 20%, y se incubó durante 10 minutos en hielo. Las células fueron aglomeradas después por centrifugación a 4.000 x g durante 15 minutos, a 4ºC. Después de separar el sobrenadante, los aglomerados de células fueron resuspendidos en 10 ml de Tampón A1 (Tris-HCl 0,01M, pH 7,5. EDTA 1 mM, beta-mercaptoetanol [BME] 14 mM), e incubados en hielo durante 10 minutos. Las células fueron aglomeradas de nuevo a 4.000 x g durante 15 minutos, a 4ºC. Después de separar el sobrenadante claro (fracción periplásmica I), los aglomerados de células fueron resuspendidos en Tampón A1, incubados en hielo durante 10 minutos y centrifugados de nuevo a 4.000 x g durante 15 minutos, a 4ºC. El sobrenadante claro (fracción periplásmica II) fue separado, y el aglomerado de células resuspendido en 5 ml de Tampón A2 (Tris-HCl 0,02M, pH 7,5, BME 14 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM). Con objeto de someter a disrrupción las células, la suspensión (5 ml) y 7,5 ml de bolas de vidrio lavadas con ácido, exentas de plomo, Dyno-mill^{TM} (0,10-0,15 mm de diámetro)(obtenidas de Glen-Mills, Inc.) fueron colocadas en un tubo Falcon^{TM}, y sometidas a rotación con formación de vórtice a la máxima velocidad durante dos minutos, seguido de enfriamiento durante al menos 2 minutos, en hielo; El procedimiento operatorio de rotación con formación de vórtice-enfriamiento se repitió otras cuatro veces. Después de la rotación con formación de vórtice, la suspensión se filtró a través de un embudo de vidrio sinterizado usando baja succión; las bolas de vidrio fueron lavadas dos veces con Tampón A2, y se reunieron el filtrado y los lavados.

La fracción insoluble del extracto crudo se recogió por centrifugación a 20.000 x g durante 15 minutos, a 4ºC, se lavó dos veces con 10 ml de Tampón A2, y se volvió a suspender en 5 ml de agua de MILLI-Q^{(TM)}.

Se aisló del material insoluble una fracción que contenía el SOD-C33c, añadiendo a la suspensión NaOH (2 M) y NaCl (2 M), para obtener una concentración final 20 mM de cada uno, sometiendo la mezcla a rotación con formación de vórtice durante 1 minuto, centrifugando a 20.000 x g durante 20 minutos a 4ºC, y reteniendo el sobrenadante.

Con objeto de purificar el SOD-C33c sobre S-Sepharose^{(TM)} la fracción sobrenadante se ajustó a una concentración final de urea 6M, Tris-HCl 0,05M, pH 7,5. BME 14 mM y EDTA 1 mM. Esta fracción se aplicó después a una columna de S-Sepharose^{(TM)} Fast Flow (1,5 x 10 cm) que había sido equilibrada con Tampón B (Tris-HCl 0,05M, pH 7,5, BME 14 mM, EDTA 1 mM). Después de la aplicación, la columna se lavó con dos volúmenes de columna de Tampón B. Se recogieron el flujo a través de la columna y los lavados. El caudal de aplicación y los lavados fueron de 1 ml/min; y las fracciones recogidas fueron de 1 ml. Con objeto de identificar las fracciones que contenían el SOD-C33c, partes alícuotas de las fracciones fueron analizadas mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 10% conteniendo SDS seguido de tinción con azul de coomassie. Las fracciones pueden ser analizadas también mediante transferencias Western usando un anticuerpo dirigido contra SOD. Se reunieron las fracciones que contenían SOD-C33c.

La purificación posterior del SOD-C33c se llevó a cabo en una columna de Q-Sepharose^{(TM)} (1,5 x 5 cm) equilibrada con Tampón B. Las fracciones reunidas que contenían el SOD-C33c, obtenidas de la cromatografía sobre S-Sepharose, fueron aplicadas a la columna. La columna se lavó luego con Tampón B, y se eluyó con 60 ml de solución de NaCl en un gradiente de 0,0 a 0,4 M, en tampón B. El caudal de aplicación, los lavados y la elución fueron de 1 ml/min; las fracciones recogidas fueron de 1 ml. Todas las fracciones procedentes de la columna de Q-Sepharose^{(TM)} fueron analizadas como se ha descrito para la columna de S-Sepharose^{(TM)}. El pico de SOD-C33c eluyó desde la columna en aproximadamente NaCl 0,2 M.

El SOD-C33c obtenido de la columna de Q-Sepharose^{(TM)} tenía una pureza superior al 90%, determinada mediante análisis sobre geles de poliacrilamida SDS e inmunotransferencia usando un anticuerpo monoclonal dirigido contra SOD humano.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2

Síntesis del antígeno de HCV C100

El antígeno de HCV C100 contiene secuencias procedentes de los dominios NS3 y NS4. Específicamente, incluye los aminoácidos 1569-1931 de la Figura 1. Este antígeno fue producido en levadura. Se preparó un fragmento de cDNA de 1270 bp que codifica los aminoácidos anteriores y que tenía términos EcoRI.

La construcción de un vector de expresión de levadura en el que este fragmento estaba fusionado directamente al promotor de S. cerevisiae ADH2/GAP se llevó a cabo mediante un protocolo que incluía amplificación de la secuencia de C100 usando el método de PCR, seguido de ligación de la secuencia amplificada en un vector de clonación. Después de clonación, la secuencia C100 fue cortada, y con una secuencia que contenía el promotor ADH2/GAP, fue ligada a un fragmento grande de un vector de levadura obteniendo un vector de expresión de levadura.

La amplificación por PCR del C100 se llevó a cabo usando como molde el vector pS3-56_{C100m}, que había sido linearizado por digestión con SalI. El pS3-56, que es un derivado del pBR322, contiene una casete de expresión constituida por el promotor de levadura híbrido ADH2/GAPDH aguas arriba del gen humano de superóxido dismutasa, y un terminador de la transcripción de factor alfa aguas abajo.

\newpage

Los cebadores de oligonucleótidos usados para la amplificación fueron diseñados para facilitar la clonación en el vector de expresión, y para introducir un codón de terminación de la traducción. Específicamente, nuevos sitios 5'-HindIII y 3'-SalI fueron generados con los oligonucleótidos de la PCR. El oligonucleótido que contiene el sitio SalI codifica también los codones dobles de terminación, TAA y TGA. El oligonucleótido que contiene el sitio HindIII contiene también una secuencia conductora sin traducir derivada del gen pgap63, situada inmediatamente aguas arriba del codón AUG. El gen pEco63GAPDH ha sido descrito por Holland y Holland (1980) y por Kniskern et al. (1986). Las secuencias de cebador de la PCR usadas para la expresión directa de C100m fueron:

\vskip1.000000\baselineskip

1

\vskip1.000000\baselineskip

La amplificación mediante PCR, utilizando los cebadores, y el molde, fue realizada con un estuche de PCR Cetus de Perkin Elmer, y se llevó a cabo según las instrucciones del fabricante. Las condiciones de la PCR fueron 29 ciclos de 94ºC durante un minuto, 37ºC durante 2 minutos y 72ºC durante 3 minutos, y la incubación final se efectuó a 72ºC durante 10 minutos. El DNA puede guardarse a 4ºC ó -20ºC durante la noche.

Después de la amplificación, los productos de la PCR fueron sometidos a digestión con HindIII y SalI. El producto principal de 1,1 kb fue purificado mediante electroforesis en gel, y el producto purificado eluído fue ligado con un fragmento SalI-HindIII largo de pBR322. Con objeto de aislar recombinantes correctos, células HB101 competentes fueron transformadas con los vectores recombinantes, y después de clonación, los recombinantes deseados fueron identificados en base al tamaño predicho de los fragmentos de HindIII-SalI cortados de los clones. Uno de los clones, que contenía el fragmento de HindIII-SalI del tamaño correcto fue denominado pBR322/C100^{-}d. La confirmación de que este clon contenía C100 amplificado se efectuó mediante análisis secuencial directo del fragmento de HindIII-SalI.

El vector de expresión que contenía C100 fue construido ligando el fragmento de HindIII-SalI procedente del pBR322/C100^{-}d a un fragmento de BamHI-SalI de 13,1 kb de pBS24.1, y un fragmento de BamHI-HindIII de 1369 bp que contenía el promotor ADH2/GAP. (El último fragmento figura descrito en el documento EPO 164.556). El fragmento del promotor ADH2/GAP se obtuvo por digestión del vector pPGAP/AG/HindIII con HindIII y BamHI, seguido de purificación del fragmento de 1369 bp sobre un gel.

Células HB101 competentes fueron transformadas con los vectores recombinantes, y los recombinantes correctos fueron identificados mediante la generación de un fragmento de 2464 bp y un fragmento de 13,1 kb generado por digestión con BamHI y SalI de los vectores clonados. Uno de los vectores recombinantes correctos clonados se denominó pC100^{-}dnº3.

Con objeto de expresar al C100, células competentes de Saccharomyces cerevisiae cepa AB122 (MATa leu2 ura3-53 prb 1-1122 pep4-3 prcl-407[cir-0]) fueron transformadas con el vector de expresión pC100^{-}dnº3. Las células transformadas fueron depositadas en placa sobre URA-sorbitol, y los transformantes individuales fueron extendidos después por rayado sobre placas de Leu^{-}.

Se cultivaron clones individuales en medio de Leu^{-}, ura^{-} con glucosa al 2%, a 30ºC, durante 24-36 horas. Un litro de Yeast Extract Peptone Medium (YEP) (medio peptonado de extracto de levadura) que contenía glucosa al 2% fue inoculado con 10 ml de cultivo de la noche, y el cultivo resultante se hizo crecer a 30ºC con una velocidad de agitación de 400 rpm y una velocidad de aireación de 1 litro de aire por litro de medio, por minuto, (es decir 1vvm) durante 48 horas. El pH del medio no se reguló. El cultivo se hizo crecer en un fermentador BioFlo II fabricado por New Brunswick Science Corp. Después de fermentación, las células fueron aisladas y analizadas para determinar la expresión de C100.

El análisis del polipéptido C100 expresado por las células transformadas se llevó a cabo sobre lisados de células totales y extractos crudos preparados a partir de colonias de levadura aisladas obtenidas de las placas de Leu^{-}. Los lisados de células y los extractos crudos fueron analizados por electroforesis en geles de poliacrilamida SDS, y mediante transferencias Western. Las transferencias Western fueron tratadas empleando como sondas anticuerpos policlonales de conejo dirigidos contra el polipéptido SOD-C100 expresado en la levadura. El tamaño del polipéptido C100 esperado es 364 aminoácidos. Mediante análisis en gel el polipéptido expresado tiene una masa molecular relativa (MW_{r}) de 39,9 K.

\newpage

Ambos métodos analíticos demostraron que el polipéptido C100 expresado estaba presente en lisados de células totales, pero estaba ausente de extractos crudos. Estos resultados sugieren que el polipéptido C100 expresado puede ser insoluble.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3

Expresión del antígeno de HCV S2

El antígeno de HCV S2 contiene una secuencia procedente del extremo N terminal hidrófobo del dominio S. Incluye los aminoácidos 199-328 de la Figura 1.

El protocolo de construcción del vector de expresión que codifica el polipéptido S2 y su expresión en levadura, fue análogo al usado para la expresión del polipéptido C100, descrito en el Ejemplo 2.

El molde para la reacción PCR fue el vector pBR322/Pi14a, que había sido linearizado por digestión con HindIII. El Pi14a es un clon de cDNA que codifica los aminoácidos 199-328.

Los oligonucleótidos usados como cebadores para la amplificación mediante la PCR de la secuencia de codificación de S2 fueron los siguientes:

\vskip1.000000\baselineskip

2

3

\vskip1.000000\baselineskip

El cebador para la región 5' introduce un sitio HindIII y un codón de iniciación ATG en el producto amplificado. El cebador para la región 3' introduce codones de terminación de la traducción y un sitio SalI en el producto amplifi-
cado.

Las condiciones de realización de la PCR fueron 29 ciclos de 94ºC durante un minuto, 37ºC durante 2 minutos, 72ºC durante 3 minutos, y la incubación final se realizó a 72ºC durante 10 minutos.

El producto principal de la reacción PCR fue un fragmento de 413 bp, que se purificó en gel. El fragmento purificado se ligó al fragmento largo obtenido de pBR322 sometido a digestión con el fragmento de HindIII y SalI, obteniendo el plásmido pBR322/S2d.

La ligación del fragmento de S2 HindIII-SalI de 413 bp con el fragmento de BamHI-HindIII de 1,36 kb que contenía el promotor ADH2/GAP, y con el fragmento largo de BamHI-SalI del vector de levadura PBS24.1, proporcionó vectores recombinantes, que fueron clonados. Los vectores recombinantes correctos fueron identificados por la presencia de un fragmento de 1,77 kb después de digestión con BamHI y SalI. Un vector de expresión construido partiendo de la secuencia amplificada y que contenía la secuencia que codifica S2, fusionado directamente al promotor ADH2/GAP, se identificó como pS2dnº9.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4

Síntesis del antígeno de HCV C

El antígeno de HCV C22 procede del dominio C. Este antígeno comprende los aminoácidos 1-122 de la Figura
1.

El protocolo de construcción del vector de expresión que codifica el polipéptido C y su expresión en levadura, fue análogo al utilizado para la expresión del polipéptido C100, antes descrito en esta memoria, excepto lo siguiente.

\newpage

El molde para la reacción PCR fue el pBR322/Ag30a que había sido linearizado con HindIII. Ag30 es un clon de cDNA que codifica los aminoácidos 1-122. Los oligonucleótidos usados como cebadores para la amplificación mediante la PCR de la secuencia que codifica C fueron los siguientes:

4

El cebador para la región 5' introduce un sitio HindIII en el producto amplificado, y el cebador para la región 3' introduce codones de terminación de la traducción y un sitio SalI. La PCR se llevó a cabo durante 29 ciclos de 94ºC de un minuto, 37ºC durante 2 minutos y

\hbox{72ºC durante 3 minutos, y la
incubación final se realizó a  72ºC durante 10 minutos.}

El producto principal de la amplificación por PCR es un polinucleótido de 381 bp. La ligación de este fragmento con el fragmento SalI-HindIII largo de SalI-HindIII del pBR322 proporcionó el plásmido pBR322/C2.

La ligación del fragmento de HindIII-SalI de 381 bp que codifica C, cortado del pBR322/C2, con el fragmento de BamHI-HindIII de 1,36 kb que contiene el promotor ADH2/GAP, y con el fragmento de BamHI-SalI largo del vector de levadura pBS24.1 proporcionó vectores recombinantes, que fueron clonados. Los vectores recombinantes correctos fueron identificados por la presencia de un fragmento de 1,74 kb después de digestión con BamHI y SalI. Un vector de expresión construido a partir de la secuencia amplificada, y que contenía la secuencia que codifica C, fusionado directamente con el promotor ADH2/GAP, es identificado como pC22.

El análisis para el polipéptido C expresado por las células transformadas se llevó a cabo sobre lisados de células totales y extractos crudos preparados a partir de colonias de levadura aisladas, obtenidas de las placas de Leu^{-}. Los lisados celulares y los extractos crudos fueron analizados mediante electroforesis en geles de poliacrilamida SDS. Se esperaba que el polipéptido C tuviera 122 aminoácidos y mediante análisis en gel el polipéptido expresado tiene una masa molecular relativa de aproximadamente 13,6 Kd.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5

Síntesis del polipéptido NS5

Este polipéptido contiene la secuencia procedente del extremo N terminal del dominio NS5. Específicamente incluye los aminoácidos 2054 a 2464 de la Figura 1. El protocolo de construcción del vector de expresión que codifica el polipéptido NS5 y de su expresión fueron análogos a los utilizados para la expresión de C33c (véase el Ejemplo 1).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6

Radioinmunoensayo (RIA) para anticuerpos contra el HCV

Los antígenos de HCV de los Ejemplos 1-5 fueron ensayados en un formato RIA para determinar su aptitud para detectar anticuerpos contra el HCV en el suero de individuos diagnosticados clínicamente como poseedores del HCV (No A, No B) y en el suero procedente de sangre proporcionada por donantes de sangre retribuidos.

El RIA se basó en el procedimiento operatorio de Tsu y Herzenberg (1980) en SELECTED METHODS IN
CELLULAR IMMUNOLOGY (W.H. Frreman and Co.), páginas 373-391. En general, placas de microtitulación (Immulon 2, tiras Removawell) se revisten con antígeno de HCV purificado. Las placas revestidas se incuban con las muestras de suero o testigos apropiados. Durante la incubación, el anticuerpo, si se encuentra presente, se une inmunológicamente al antígeno en la fase sólida. Después de separar el material que no se ha unido y lavar las placas de microtitulación, los complejos de anticuerpo humano-antígeno NANBV son detectados por incubación con inmunoglobulina anti-humana de oveja marcada con ^{125}I. El anticuerpo marcado sin unir se separa por aspiración, y se lavan las placas. Se determina la radiactividad en pocillos individuales; la cantidad de anticuerpo humano anti-HCV unido es proporcional a la radiactividad existente en el pocillo.

Específicamente, alícuotas de cien microlitros conteniendo 0,1 a 0,5 microgramos del antígeno de HCV en tampón de borato sódico 0,125 M, pH 8,3, NaCl 0,075 M (BBS), se añadieron a cada uno de los pocillos de la placa de microtitulación (Dynatech Immulon 2, Tiras Removawell). La placa fue incubada a 4ºC durante la noche en una cámara húmeda, después de lo cual, se separó la solución de antígeno y los pocillos se lavaron 3 veces con BBS que contenía Triton X-100^{(TM)} al 0,02% (BBST). Para evitar la unión inespecífica, los pocillos fueron revestidos con albúmina de suero bovino (BSA) por adición de 100 microlitros de una solución de 5 mg/ml de BSA en BBS seguido de incubación a temperatura ambiente durante 1 hora; después de esta incubación se separó la solución de BSA. Los antígenos existentes en los pocillos revestidos fueron hechos reaccionar con suero por adición de 100 microlitros de muestras de suero diluidas 1:100 en tampón de fosfato sódico 0,01M, pH 7,2, NaCl 0,15 M (PBS) conteniendo 10 mg/ml de BSA, e incubando los pocillos que contenían suero durante 1 hora a 37ºC. Después de incubar, las muestras de suero fueron separadas mediante aspiración, y los pocillos fueron lavados 5 veces con BBST. El anticuerpo unido al antígeno se determinó mediante la unión de IgG anti-humana de oveja F'(ab)_{2} marcada con ^{125}I, a los pocillos revestidos. Alícuotas de 100 microlitros de la sonda marcada (actividad específica 5-20 microcuries/microgramo) fueron añadidas a cada uno de los pocillos, y las placas fueron incubadas a 37ºC durante 1 hora, seguido de separación de la sonda en exceso mediante aspiración y 5 lavados con BBST. La cantidad de radiactividad unida existente en cada uno de los pocillos se determinó por recuento en un contador que detecta la radiación gamma.

La Tabla 1 que figura seguidamente presenta los resultados de los ensayos realizados sobre el suero de individuos diagnosticados como poseedores de HCV.

TABLA 1

5

6

7

8

9

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Según estos resultados, ningún antígeno aislado reaccionó con todos los sueros. El C22 y el C33c fueron los más reactivos y el S2 reaccionó con algunos sueros procedentes de algunos casos putativos de HCV agudos con los que no reaccionó ningún otro antígeno. Basándose en estos resultados, la combinación de dos antígenos que podría proporcionar el máximo grado de detección, es C22 y C33c. Si se desea detectar un máximo de infecciones agudas, debería incluirse en la combinación S2.

La Tabla 2 que sigue presenta los resultados del ensayo sobre los donantes de sangre retribuidos.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2 Antígenos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

12

13

14

15

16

17

18

Los resultados obtenidos en los donantes retribuidos confirman, en general, los resultados de los sueros de individuos infectados.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7

Determinaciones ELISA de anticuerpos de HCV empleando una combinación de antígenos de HCV

Se preparan del modo siguiente placas revestidas con una combinación de antígenos C22 y C33c. Una solución que contiene tampón de revestimiento (Borato sódico 50 mM, pH 9,0), 21 ml/placa, BSA (25 microgramos/ml), C22 y C33c (2,50 microgramos/ml de cada uno), se prepara inmediatamente antes de su adición a las placas Removeawell Immulon I (Dynatech Corp.). Después de mezclar durante 5 minutos, se añaden a las placas 0,2 ml/pocillo de la solución, se tapan y se incuban durante 2 horas a 37ºC, después de lo cual la solución se retira por aspiración. Los pocillos se lavan una vez con 400 microlitros de tampón de lavado (fosfato sódico 100 mM, pH 7,4, cloruro de sodio 140 mM, caseína al 0,1% (p/v), Triton-X-100^{(TM)} al 1% (p/v), timerosal al 0,01% (p/v)). Después de retirar la solución de lavado se añaden 200 microlitros/pocillo de solución "Postcoat" (fosfato sódico 10 mM, pH 7,2, cloruro de sodio 150 mM, caseína al 0,1% (p/v), sacarosa al 3% y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 2 mM. Las placas se tapan flojamente para evitar la evaporación, y se dejan en reposo a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los pocillos se aspiran luego para separar la solución y se somete a liofilización durante la noche sin dar calor a las bandejas. Las placas preparadas pueden mantenerse a 2-8ºC en bolsas de aluminio herméticamente cerradas, con desecante (bolsitas de 3 g de Sorb-it ^{TM}).

Con objeto de llevar a cabo la determinación ELISA, se añaden 20 microlitros de muestra de suero o muestra testigo a un pocillo conteniendo 200 microlitros de diluyente de las muestras (fosfato de sodio 100 mM, pH 7,4, cloruro de sodio 500 mM, EDTA 1 mM, caseína al 0,1% (p/v), timerosal al 0,01% (p/v), Triton X-100^{(TM)} al 1% (p/v), extracto de levadura 100 microgramos/ml). Las placas se cierran herméticamente y se incuban a 37ºC durante dos horas, después de lo cual la solución se retira por aspiración, y los pocillos se lavan tres veces con 400 microlitros de tampón de lavado (solución salina tamponada con fosfato (PBS) conteniendo Tween 20^{(TM)} al 0,05%. Los pocillos lavados se tratan con 200 microlitros de conjugado de IgG de ratón anti-humana- peroxidasa de rábano picante (HRP) contenidos en una solución de diluyente conjugado Orto (fosfato sódico 10 mM, pH 7,2, cloruro de sodio 150 mM, suero fetal bovino al 50% (v/v), suero de caballo tratado por calor, al 1% (v/v), K_{3}Fe(CN)_{6} 1 mM, Tween 20 al 0,05% (p/v), timerosal al 0,02% (p/v). El tratamiento se lleva a cabo durante 1 hora a 37ºC, se separa la solución mediante aspiración, y los pocillos se lavan tres veces con 400 ml de tampón de lavado, que también se retira por aspiración. Para determinar la cantidad de conjugado enzimático unido, se añaden 200 microlitros de solución de sustrato (10 mg de dihidrocloruro de O-fenilenodiamina por 5 ml de solución Reveladora). La solución Reveladora contiene citrato de sodio 50 mM ajustado a pH 5,1 con ácido fosfórico, y 0,6 microlitros/ml de H_{2}O_{2} al 30%. Las placas que contienen la solución de sustrato se incuban en oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente, se detienen las reacciones mediante la adición de 50 microlitros/ml de ácido sulfúrico 4N, y se determinan las DOs.

De un modo similar, pueden llevarse a cabo ensayos ELISA usando proteína de fusión de C22 y C33c, y C22, C33c y S2 y combinaciones de C22 y C100, C22 y S2, C22 y un antígeno de NS5, C22, C33c y S2, y C22, C100 y S2.

Las modificaciones de los modos anteriormente descritos para llevar a cabo la invención, evidentes para los expertos en los campos de la biología molecular, inmunología y campos afines, están destinadas a quedar incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones que siguen.

Claims

```
\global\parskip0.930000\baselineskip
```
1. Un método para detectar anticuerpos contra el virus de la hepatitis C (HCV) en un componente del cuerpo de un mamífero sospechoso de contener dichos anticuerpos, que comprende poner en contacto dicho componente del cuerpo con una combinación de antígenos de HCV en condiciones que permiten la reacción anticuerpo-antígeno y detectar la presencia de inmunocomplejos de dichos anticuerpos y dichos antígenos, en el que los antígenos están en uno o más polipéptidos obtenidos mediante síntesis química o expresión recombinante, inmovilizados sobre la superficie de una matriz sólida adecuada para la detección de HCV por inmunoensayo, que comprende:

(a)

un primer antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio C de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1; y

(b)

un segundo antígeno de HCV seleccionado de:

(i)

un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio S de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1;

(ii)

un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS3 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1;

(iii)

un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS4 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1; y

(iv)

un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS5 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1;

con la condición de que la combinación no sea el péptido p1 con C100-3, el péptido p35 con C100-3, el péptido p99 con C100-3, o un péptido que tenga los aminoácidos 9 a 177 de la poliproteína de HCV-1.
2. Un método según la reivindicación 1, en el que dicho segundo antígeno de HCV comprende un epítopo procedente del dominio S de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1 y cuya combinación comprende, además, al menos un antígeno de HCV adicional seleccionado entre:

(i)

un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS3 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1;

(ii)

un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS4 de la poliproteína HCV1 mostrada en la Figura 1; y

(iii)

un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS5 de la poliproteína HCV1 mostrada en la Figura 1.
3. Un método según la reivindicación 2, en el que el antígeno adicional procede del dominio NS3 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1.
4. Un método según la reivindicación 2, en el que el primer antígeno de HCV es el C22 y el antígeno de HCV adicional es el C33c.
5. Un método según la reivindicación 2, en el que el antígeno adicional procede del dominio NS4 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1.
6. Un método según la reivindicación 5, en el que el primer antígeno es el C22 y el segundo antígeno de HCV es el C100.
7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el antígeno procedente del dominio S de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1 es el antígeno S2.
8. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la combinación está en la forma de un polipéptido de fusión.
9. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la combinación está en la forma de dicho primer antígeno de HCV y dichos antígenos adicionales unidos a una matriz sólida común.
10. Un método según la reivindicación 8, en el que la matriz sólida es la superficie de un pocillo de una placa de microtitulación, una bola pequeña o una varilla de inmersión.
11. Una combinación de antígenos de virus de la hepatitis C (HCV) en uno o más polipéptidos obtenidos por síntesis química o expresión recombinante, que comprende:

(a)

un primer antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio C de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1; y

(b)

un segundo antígeno de HCV seleccionado de

(i)

un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio S de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1;

(ii)

un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS3 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1;

(iii)

un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS4 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1; y

(iv)

un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS5 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1;

con la condición de que la combinación no sea el péptido p1 con C100-3, el péptido p35 con C100-3, el péptido 99 con C100-3 ó un péptido que tenga los aminoácidos 9 a 177 de la poliproteína de HCV-1.
12. Una combinación según la reivindicación 11, en la que dicho segundo antígeno de HCV comprende un epítopo procedente del dominio S de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1 y cuya combinación comprende, además, al menos un antígeno de HCV adicional seleccionado entre:

(i)

un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS3 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1;

(ii)

un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS4 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1; y

(iii)

un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS5 de la poliproteína HCV1 mostrada en la Figura 1.
13. Una combinación según la reivindicación 12, en la que el antígeno adicional procede del dominio NS3 de la poliproteína HCV1 mostrada en la Figura 1.
14. Una combinación según la reivindicación 13, en la que el primer antígeno de HCV es el C22 y el antígeno de HCV adicional es el C33c.
15. Una combinación según la reivindicación 14, en la que el antígeno adicional procede del dominio NS4 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1.
16. Una combinación según la reivindicación 15, en la que el primer antígeno de HCV es el C22 y el antígeno de HCV adicional es el C100.
17. Una combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en la que el antígeno procedente del dominio S de la poliproteína HCV1 mostrada en la Figura 1 es el antígeno S2.
18. Una combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17, en la que la combinación está en la forma de un polipéptido de fusión.
19. Una combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18, en la que la combinación está en la forma de dicho primer antígeno de HCV y dichos antígenos adicionales unidos a una matriz sólida común.
20. Una combinación según la reivindicación 19, en la que dicha matriz sólida es la superficie de un pocillo de una placa de microtitulación, de una bola pequeña o de una varilla de inmersión.
21. Una combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 20, en la que la combinación está inmovilizada sobre la superficie de una matriz sólida adecuada para la detección de HCV mediante inmunoensayo.
22. Un kit para llevar a cabo un ensayo para detectar anticuerpos contra el antígeno de la hepatitis C (HCV) en un componente del cuerpo de un mamífero sospechoso de contener dichos anticuerpos, que comprende en una combinación empaquetada:

(a)

la combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 21;

(b)

reactivos testigo estándar; e

(c)

instrucciones para efectuar el ensayo.