PL172133B1 - Sposób tworzenia kombinacji antygenów wirusowego zapalenia watroby typu C (HCV) i sposób wykrywania przeciwcial przeciw wirusowemu zapaleniu watroby typu C (HCV) - Google Patents

Sposób tworzenia kombinacji antygenów wirusowego zapalenia watroby typu C (HCV) i sposób wykrywania przeciwcial przeciw wirusowemu zapaleniu watroby typu C (HCV)

Info

Publication number
PL172133B1
PL172133B1 PL91296329A PL29632991A PL172133B1 PL 172133 B1 PL172133 B1 PL 172133B1 PL 91296329 A PL91296329 A PL 91296329A PL 29632991 A PL29632991 A PL 29632991A PL 172133 B1 PL172133 B1 PL 172133B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
polypeptide
domain
hcv
combination
epitope sequence
Prior art date
Application number
PL91296329A
Other languages
English (en)
Inventor
Michael Houghton
Qui-Lim Choo
George Kuo
Original Assignee
Chiron Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=24005897&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL172133(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Chiron Corp filed Critical Chiron Corp
Publication of PL172133B1 publication Critical patent/PL172133B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G01N33/5767—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis non-A, non-B hepatitis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pinball Game Machines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Thermistors And Varistors (AREA)

Abstract

1 S p o só b tw o r z e n ia k o m b in a c ji a n ty g e n ó w w ir u so w e g o z a p a le n ia w a tr o b y ty p u C (H C V ), w y tw o r z o n y c h p r z e z sy n te z e c h e m icz n a lu b e k sp r e - sje r e k o m b in a n ta , p r z y d a tn e j w p r ó b a c h im m u n o lo g ic z n y c h n a o b e c n o sc p r z e c iw c ia l p r z e c iw H C V , z n a m ien n y ty m , ze la c z y sie se k w e n c je e p ito p u p ie r w sz e g o p o lip e p ty d u z d o m e n y C p o h p r o te m y H C V z co n a jm n ie j je d n a se k w e n c ja e p ito p u d o d a tk o w e g o p o lip e p ty d u z in n e j d o m e n y p o lip r o te in y H C V , w y b r a n e j z g r u p y o b e jm u ja c e j d o m e n e N S 3 p o lip r o te in y H C V , d o m e - n e S p o lip r o te in y H C V , d o m e n e N S 4 p o lip r o te in y H C V i d o m e n e N S 5 p o li p r o te in y H C V 6 S p o só b tw o r z e n ia k o m b in a c ji a n ty g e n ó w w ir u so w e g o z a p a le n ia w a tr o b y ty p u C (H C V ), w y tw o r z o n y c h p r z e z sy n te z e c h e m icz n a lu b e k sp r e - sje r e k o m b in a n ta , p r z y d a tn e j w p r ó b a c h im m u n o lo g ic z n y c h n a o b e c n o sc p r z e c iw c ia l p r z e c iw H C V , zn a m ien n y ty m , z e la czy sie se k w e n c je e p ito p u p ie r w sz e g o p o lip e p ty d u z d o m e n y C p o lip r o te in y H C V z se k w e n c ja e p ito p u d o d a tk o w e g o p o lip e p ty d u z in n e j d o m e n y p o h p r o te m y H C V , w y b r a n a z g r u - p y o b e jm u ja c e j d o m e n e N S 3 p o lip r o te in y H C V , d o m e n e S p o lip r o te in y H C V , d o m e n e N S 4 p o lip r o te in y H C V , d o m e n e N S 5 p o lip r o te in y H C V , i z trzecia d o d a tk o w a se k w e n c ja e p ito p u p o lip e p ty d u z in n e j d o m e n y p o lip r o te i n y H C V w y b r a n e j z g r u p y o b e jm u ja c e j d o m e n e N S 3 p o lip r o te in y H C V , d o - m e n e S p o lip r o te in y H C V , d o m e n e N S 4 p o lip r o te in y H C V , d o m e n e N S 5 p o lip r o te in y H C V , p r z y c z y m ta tr z e c ia d o m e n a jest in n a n iz d o m e n a d r u g a , z w y la c z e n ie m k o m b in a c ji p e p ty d u p l z C 1 0 0 -3 , p e p ty d u p 3 5 z C 1 0 0 -3 lu b p e p - ty d u p 9 9 z C 1 0 0 -3 1 2 S p o só b tw o r z e n ia k o m b in a c ji a n ty g e n ó w w ir u so w e g o z a p a le n ia w a tr o b y ty p u C (H C V ), w y tw o r z o n y c h p r z e z sy n teze c h e m icz n a lu b e k s p r e - sje r e k o m b in a n ta , p r z y d a tn e j w p r ó b a c h im m u n o lo g ic z n y c h n a o b e c n o sc p r z e c iw c ia l p r z e c iw H C V , z n a m ien n y ty m , ze la czy sie se k w e n c je e p ito p u p ie r w sz e g o p o lip e p ty d u s k la d a ja c a sie z a sa d n ic z o z d o m e n y C p o lip r o te in y H C V z d r u g a se k w e n c ja e p ito p u p o lip e p ty d u z d o m e n y N S 3 p o lip r o te in y H C V FIG. 2

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób tworzenia kombinacji antygenów wirusowego zapalenia wątroby C (HCV) i sposób wykrywania przeciwciał przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby C. Wytwarzana kombinacja antygenów HCV, pozwala na prowadzenie wielu różnych testów immunologicznych dla przeciwciał anty-HCV.
Choroba, znana wcześniej jako wirusowe zapalenie wątroby typu nie-A i nie-B (NANBH), uważanajest za chorobę zakaźną lub grupę chorób wywoływanych przez wirusy i możnająodróżnić od innych związanych z wirusami chorób wątroby włącznie z wywołanymi przez znane wirusy zapalenia wątroby, np. wirus zapalenia wątroby typu A (HAV, wirus zapalenia wątroby typu B (HBV), wirus zapalenia wątroby typu delta (HDV), a także od zapalenia wątroby wywołanego przez cytomegalowirusy (CMV) lub wirus Epsteina-Barra (EBV).
Po raz pierwszy NANBH stwierdzono u osobników poddanych transfuzji. Zakażenie szympansa od człowieka i seryjne pasaże w szympansach wykazały, że etiologia NANBH zależy od jednego lub kilku zakaźnych czynników infekcyjnych. Dane epidemiologiczne wskazują, że mogą istnieć trzy typy NANBH: typ epidemiczny rozprzestrzeniający się drogą wodną, typ rozprzestrzeniający się przez krew lub drogą pozajelitową i rzadko występujący typ (nabyty we wspólnocie). Jednakże do niedawna nie zidentyfikowano żadnego czynnika zakaźnego odpowiedzialnego za NANBH, a identyfikację i diagnozę kliniczną prowadzono głównie na podstawie wykluczenia innych markerów wirusowych. Do wykrywania przypuszczalnych antygenów NANBH i przeciwciał używa się dyfuzji w żelu agarowym, immunoelektroforezy przeciwbieżnej, mikroskopii immunofluorescencyjnej, immunologicznej mikroskopii elektronowej, testów immunosorpcyjnych. Jednakże żaden z tych testów nie jest wystarczająco wrażliwy, specyficzny i powtarzalny, żeby go użyć jako testu diagnostycznego dla NANBH.
W 1987 roku, naukowcy z Chiron Corportion (właściciela obecnego zgłoszenia) zidentyfikowali pierwszy kwas nukleinowy nierozerwalnie związany z NANBH rozprzestrzeniającym się przez krew. Patrz, na przykład Publikacja EPO Nr 318216, Hughton i wsp., Science 244:359 (1989). Publikacje te opisują klonowanie izolatu wirusowego nowej klasy, wirusa zapalenia wą troby typu C (HCV), pierwotny izolat tam opisany nazwano “HCV1. HCV jest wirusem typu Flavi, zawierającym RNA.
Zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Nr 456 637 (Houghton i wsp.), którejesttu włączone przez cytowanie, opisuje przygotowanie różnych zrekombinowanych polipeptydów HCV przez ekspresję cDNA HcV i zbadanie tych polipeptydów pod kątem aktywności immunologicznej z surowicą od pacjentów z HCV.
Takie ograniczone badanie wykazało, że przynajmniej pięć testowanych polipeptydów było bardzo immunogennych i zostały one oznaczone jako 5-1-1, C100, C33c, CA279a i CA29Oa. Z tych pięciu polipeptydów, 5-1-1 zlokalizowanyjest przypuszczalnie w domenie NS4, C100 rozciąga się przypuszczalnie w domenach NS3 i NS4, C33c zlokalizowany jest przypuszczalnie w domenie NS3, a CA279a i CA290a są zlokalizowane przypuszczalnie w domenie C. Badanie wykazało także, że żaden pojedynczy testowany polipeptyd nie był aktywny immunologicznie ze wszystkimi badanymi surowicami. Tak więc, pożądane sątesty, które reagująze wszystkimi lub z większością próbek od osobników HCV dodatnich.
172 133
Wynalazcy przeprowadzili dodatkowe badania serologiczne nad antygenami HCV, które potwierdziły, że do tej pory nie zidentyfikowano żadnego pojedynczego polipeptydu, który reagowałby immunologicznie ze wszystkimi surowicami. Taki brak pojedynczego polipeptydu, który uniwersalnie reagowałby immunologicznie ze wszystkimi surowicami od osobników z HCV może wynikać, między innymi, z różnic w epitopach HCV pomiędzy szczepami, zmienności odpowiedzi humoralnej pomiędzy osobnikami i/lub zmienności serologicznej w poszczególnych stanach chorobowych.
Dodatkowe badania pozwoliły także wynalazcom zidentyfikować kombinacje antygenów HCV, która umożliwia bardziej efektowne wykrywanie przeciwciał przeciw HCV, niż każdy z pojedynczych polipeptydów HCV.
Sposób tworzenia kombinacji antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV), wytworzonych przez syntezę chemiczną lub ekspresję rekombinanta, przydatnej w próbach immunologicznych na obecność przeciwciał przeciw HCV, według wynalazku, polega na tym, że łączy się sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu z domeny C poliproteiny HCV z co najmniej jedną sekwencją epitopu dodatkowego polipeptydu z innej domeny poliproteiny HCV, wybranej z grupy obejmującej domenę NS3 poliproteiny HCV, domenę S poliproteiny HCV, domenę NS4 poliproteiny HCV i domenę NS5 poliprotemy HCV.
Korzystnie kombinację antygenów tworzy się przez fuzję polipeptydów lub bardziej korzystnie wiążąc indywidualnie sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu i dodatkową sekwencję lub dodatkowe sekwencje epitopu polipeptydu ze wspólnym stałym podłożem. Jako stałe podłoże korzystnie stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy. W korzystnej odmianie tego sposobu według wynalazku tworzy się kombinację w postaci mieszaniny sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z sekwencją lub sekwencjami epitopu dodatkowego polipeptydu.
W wariancie wynalazku sposób tworzenia kombinacji antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV) polega na tym, że łączy się sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu z domeny C poliproteiny HCV z sekwencją epitopu dodatkowego polipeptydu z innej domeny poliprotemy hCv, wybranaz grupy obejmującej domenę NS3 poliproteiny HCV, domenę S poliproteiny hCv, domenę NS4 poliprotemy hCv, domenę NS5 poliproteiny HCV, i z trzecią dodatkową sekwencją epitopu polipeptydu z innej domeny poliproteiny HCV wybranej z grupy obejmującej domenę NS3 poliproteiny HCV, domenę S poliproteiny HCV, domenę NS4 poliproteiny HCV, domenę NS5 poliproteiny HCV, przy czym ta trzecia domena jest inna niż domena druga, z wyłączeniem kombinacj i peptydu pl z C100-3, peptydu p35 z C100-3 lub peptydu p99 z C100-3. Korzystnie jako trzecią dodatkową sekwencję epitopu polipeptydu stosuje się sekwencję z domeny S. W dodatkowych rozwiązaniach w sposobie według wynalazku tworzy się kombinację przez fuzję polipeptydów lub wiążąc indywidualnie sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu i dodatkową sekwencję lub dodatkowe sekwencje epitopu polipeptydu ze wspólnym stałym podłożem. W sposobie tym korzystnie jako stałe podłoże stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy. Kombinację antygenów można korzystnie tworzyć również w postaci mieszaniny sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z sekwencją lub sekwencjami epitopu dodatkowego polipeptydu.
Kolejny wariant sposobu tworzenia kombinacji polega na tym, że łączy się sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu składającą się zasadniczo z domeny C poliproteiny HCV z drugą sekwencją epitopu polipeptydu z domeny NS3 poliproteiny HCV. Korzystnie, jako sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu, stosuje się sekwencję C22, ajako drugą sekwencję epitopu polipeptydu stosuje się sekwencję C33c. Kombinację taką tworzy się przez fuzję polipeptydów lub także wiążąc indywidualnie sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu i dodatkową sekwencję lub dodatkowe sekwencje epitopu polipeptydu ze wspólnym podłożem. Jako stałe podłoże korzystnie stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy. Kombinację tworzy się również w postaci mieszaniny sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z sekwencją lub sekwencjami epitopu dodatkowego polipeptydu.
172 133
W następnym wariancie rozwiązania sposób tworzenia kombinacji antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV) polega na tym, że łączy się sekwencje epitopu pierwszego polipeptydu składającą się zasadniczo z domeny C poliproteiny HCV, z drugą sekwencją epitopu polipeptydu z domeny NS4 poliproteiny HCV. Korzystnie jako sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu stosuje się sekwencję C22, ajako drugą sekwencję epitopu polipeptydu stosuje się sekwencję C100. Korzystnie do sekwencji tych dodatkowo przyłącza się sekwencję epitopu trzeciego polipeptydu z domeny NS3 a także tworzy się kombinacje przez fuzję polipeptydów·1. W następnej korzystnej odmianie sposobu tworzy się kombinację wiążąc indywidualnie sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu i dodatkową sekwencję lub dodatkowe sekwencje epitopu polipeptydu ze wspólnym stałym podłożem, ajako stałe podłoże korzystnie stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy. Jeszcze bardziej korzystnie tworzy się kombinację w postaci mieszaniny sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z sekwencją lub sekwencjami epitopu dodatkowego polipeptydu.
W kolejnym wariancie sposób tworzenia kombinacji antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV) polega na tym, że łączy się sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu składającą się zasadniczo z domeny C poliproteiny HCV, z drugą sekwencją epitopu polipeptydu z domeny NS5 poliproteiny HCV. W korzystnej odmianie tego wariantu sposobu do sekwencji tych dodatkowo przyłącza się sekwencję epitopu trzeciego polipeptydu z domeny NS3. Korzystnie tworzy się tą kombinację przez fuzję polipeptydów. W innej korzystnej odmianie tworzy się kombinację wiążąc indywidualnie sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu i dodatkową sekwencję lub dodatkowe sekwencje epitopu polipeptydu ze stałym wspólnym podłożem a jako stałe podłoże stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy. Jeszcze bardziej korzystnie, kombinację tworzy się w postaci mieszaniny sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z sekwencjąlub sekwencjami epitopu dodatkowego polipeptydu.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wykrywania przeciwciał przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu C (HCV) w składniku ciała ssaka podejrzanego o posiadanie tych przeciwciał, polegający na tym, że kontaktuje się ten składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV), wytworzoną przez syntezę chemiczną lub ekspresję rekombinantu, stanowiącą połączenie sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z domeny C poliproteiny HCV z co najmniej jedną sekwencją, epitopu dodatkowego polipeptydu z innej domeny poliproteiny HCV wybranej z grupy obejmującej domenę NS3 poliproteiny HCV, domenę S poliproteiny HCV, domenę NS4 poliproteiny HCV i domenę NS5 poliproteiny HCV, w warunkach pozwalających na zajście reakcji antygen-przeciwciało i wykrycie obecności kompleksów immunologicznych tych przeciwciał z sekwencjami epitopów polipeptydów. Wykrywanie przeciwciał prowadzi się również w ten sposób, że kontaktuje się składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, utworzoną przez fuzję polipeptydów lub w innym korzystnym wykonaniu, kontaktując ten składnik ciała z kombinacją antygenów stanowiącą połączenie indywidualnych sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z dodatkową sekwencją lub dodatkowymi sekwencjami epitopu polipeptydu ze wspólnym stałym podłożem. Korzystnie jako stałe podioże stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy.
W następnej odmianie, sposób wykrywania przeciwciał przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu C (HCV) w składniku ciała ssaka podejrzanego o posiadanie tych przeciwciał, polega na tym, że kontaktuje się ten składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, wytworzoną przez syntezę chemiczną lub ekspresję rekombinantu, stanowiącą połączenie sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z domeny C poliproteiny HCV z sekwencją epitopu dodatkowego polipeptydu z innej domeny poliproteiny HCV, wybraną z grupy obejmującej domenę NS3 poliproteiny HCV, domenę S poliproteiny HCV, domenę NS4 poliproteiny HCV, domenę NS5 poliproteiny HCV, i z trzeciądodatkowąsekwencjąepitopu polipeptydu z innej domeny poliproteiny HCV wybranej z grupy obejmującej domenę NS3 poliproteiny HCV, domenę S poliproteiny HCV, domenę NS4 poliproteiny HCV, domenę NS5 poliproteiny
172 133
HCV, przy czym ta trzecia domenajest inna niż domena druga, z wyłączeniem kombinacji peptydu pl z C100-3, peptydu p35 z C100-3 lub peptydu p99 z C100-3, w warunkach pozwalających na zajście reakcji antygen-przeciwciało i wykrycie obecności kompleksów immunologicznych tych przeciwciał z sekwencjami epitopów polipeptydów. Korzystnie, kontaktuje się ten składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, w której trzecią dodatkową sekwencją epitopu polipeptydu stanowi sekwencja z domeny S, a jeszcze bardziej korzystnie, kontaktuje się ten składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C utworzonąprzez fuzję polipeptydów. Ta kombinacja antygenów może stanowić połączenie indywidualnych sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z dodatkową sekwencją lub dodatkowymi sekwencjami epitopu polipeptydu ze wspólnym stałym podłożem a jako stałe podłoże w sposobie tym korzystnie stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy.
W następnym wariancie sposób wykrywania przeciwciał przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu C (HCV) w składniku ciała ssaka podejrzanego o posiadanie tych przeciwciał, polega na tym, że kontaktuje się ten składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV), wytworzoną przez syntezę chemiczną lub ekspresję rekombinantu, stanowiącą połączenie sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu składającej się zasadniczo z domeny C poliproteiny HCV z drugą sekwencją epitopu polipeptydu z domeny NS3 poliproteiny HCV, w warunkach pozwalających na zajście reakcji antygen-przeciwciało i wykrycie obecności kompleksów immunologicznych tych przeciwciał z sekwencjami epitopów polipeptydów. Korzystnie kontaktuje się ten składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, w której sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu stanowi sekwencja C22, a drugą sekwencję epitopu polipeptydu stanowi sekwencja C33c i jeszcze bardziej korzystnie, kontaktuje się składnik ciała z kombmacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, wytworzoną przez fuzję polipeptydów. W kolejnym korzystniejszym rozwiązaniu ta kombinacja antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C stanowi połączenie indywidualnych sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z dodatkową sekwencją lub dodatkowymi sekwencjami epitopu polipeptydu ze wspólnym stałym podłożem, jako stałe podłoże stosuje się korzystnie powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy.
W następnej odmianie sposób wykrywania przeciwciał przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu C (HCV) w składniku ciała ssaka podejrzanego o posiadanie tych przeciwciał, polega na tym, że kontaktuje się ten składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C stanowiącapołączenie sekwencj i epitopu pierwszego polipeptydu składaj ącej się zasadniczo z domeny C poliproteiny HCV, z drugą sekwencją epitopu polipeptydu z domeny NS4 poliproteiny HCV, w warunkach pozwalających na zajście reakcji antygen-przeciwciało i wykrycie obecności kompleksów immunologicznych tych przeciwciał z sekwencjami epitopów polipeptydu. W korzystnej odmianie kontaktuje się składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, w której sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu stanowi sekwencja C22, a drugą sekwencję epitopu polipeptydu stanowi sekwencja C100. Jeszcze bardziej korzystnie, kontaktuje się składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, która stanowi połączenie z dodatkowąsekwenciąepitopu trzeciego polipeptydu z domeny NS3. W sposobie według wynalazku można także kontaktować składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C utworzonąprzez fuzję polipeptydów lub stanowiącą połączenie indywidualnych sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z dodatkową sekwencJąlub dodatkowymi sekwencjami epitopu polipeptydu ze wspólnym stałym podłożem. Korzystnie jako stałe podłoże stosuje się wtedy powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy. W kolejnym wariancie sposób wykrywania przeciwciał przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu C (HCV) w składniku ciała ssaka podejrzanego o posiadanie tych przeciwciał, polega na tym, że kontaktuje się ten składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV), stanowiącą połączenie sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu składającej się zasadniczo z domeny C poliproteiny HCV, z drugą sekwencją epitopu polipeptydu z domeny NS5 poliproteiny HCV, w
172 133 warunkach pozwalających na zajście reakcji antygen-przeciwciało i wykrycie obecności kompleksów immunologicznych tych przeciwciał z sekwencjami epitopów polipeptydów-·. Korzystnie kombinacja antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C może stanowić połączenie z dodatkową sekwencją epitopu trzeciego polipeptydu z domeny NS3 a jeszcze bardziej korzystnie kombinacja antygenów HCV, wirusowego zapalenia wątroby typu C, może być utworzona przez fuzję polipeptydów lub jeszcze bardziej korzystnie stanowić połączenie indywidualnych sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z dodatkową sekwencją lub dodatkowymi sekwencjami epitopu polipeptydu ze stałym wspólnym podłożem. Jako stałe podłoże w sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy. Również korzystnie w sposobie tym kombinację antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, stanowi kombinacja w postaci mieszaniny sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z sekwencją lub sekwencjami epitopu dodatkowego polipeptydu.
Rysunek 1 przedstawia sekwencję nukleotydowącDNA, nici sensownej i anty-sensownej poliproteiny HCV i sekwencję aminokwasowąkodowanąprzez nić sensowną(sekw. nr ident. 9 i sekw. nr ident. 10). Rysunek 2 przedstawia schemat sekwencj i aminokwasowej z rysunku 1 pokazujący przypuszczalne domeny polipeptydu HCV.
Definicje “Antygen HCV” oznacza polipeptyd złożony przynajmniej z około 5 aminokwasów, przeważnie złożony z około 8 do 10 aminokwasów, który określa epitop znaleziony w izolacie HCV. Jeżeli antygen oznaczono kodem alfanumerycznym, epitop pochodzi z domeny HCV oznaczonej tym kodem.
“Syntetyczny”, jeżeli użyty do określenia antygenu, oznacza, że antygen HCV został wyizolowany z naturalnego źródła lub wytworzony przez człowieka na drodze syntezy chemicznej lub rekombinacji.
“Domena” oznacza taki segment poliproteiny HCV, pokazany na rysunku 2, który ogólnie odpowiada przypuszczalnemu strukturalnemu lub niestrukturalnemu białku HCV. Oznaczenia domen ogólnie odpowiadają ustaleniom dotyczącym nazewnictwa białek Flaviwirusów. Lokalizacja domen przedstawiona na rysunku 2 jest tylko przybliżona. Oznaczenie “NS” określa białka “niestrukturalne”, a “S” oznacza białka otoczki, a “C” oznacza domenę białka nukleokapsydu lub rdzenia.
“Polipeptyd połączony” oznacza polipeptyd, w którym antygen/y/ HCV stanowią część pojedynczego, ciągłego łańcucha aminokwasów, łańcucha który nie występuje w naturze. Antygeny HCV mogą być połączone bezpośrednio jeden z drugim wiązaniem peptydowym, lub rozdzielone przez aminokwasowe sekwencje rozdzielające. Polipeptyd połączony może zawierać także sekwencje aminokwasowe egzogenne dla HCV.
“Wspólne stałe podłoże' oznacza ciało stałe, z którym pojedynczy antygen HCV lub polipeptyd połączony, złożony z antygenów HCV, są związane kowalencyjnie lub w sposób mekowalencyjny, taki jak, adsorpcja hydrofobowa.
“Składnik ciała ssaków” oznacza płyn lub tkankę ssaka (na przykład człowieka), który zawiera przeciwciała wytwarzane przez tego ssaka. Składniki takie znane są biegłym w sztuce i obejmują, bez ograniczania, krew, plazmę, surowicę, płyn rdzeniowy, limfę, wydzielmy układu oddechowego, trawiennego lub moczowo-płciowego, łzy, ślinę, mleko, białe ciałka krwi i komórki szpiku.
“Reaktywny immunologicznie” oznacza, że brany pod uwagę antygen reaguje swoiście z przeciwciałem anty-HCV, powszechnie obecnym w znaczącej porcji surowicy od osobnika zainfekowanego HCV.
“Kompleks immunologiczny” oznacza kombinację lub agregat powstający, gdy przeciwciało wiąże się z epitopem antygenu.
Kombinacja antygenów HCV
Rysunek 2 przedstawia przypuszczalne domeny poliproteiny HCV. Antygeny używane w kombinacji pochodzą z domen: C, S (lub E), NS3, NS4 i NS5. Uważa się, że domena C koduje
172 133 białko nukleokapsydu HCV. Rozciąga się ona od N-końca poliproteiny do około aminokwasu 120 z rysunku 1. Uważa się, że domena S koduje białko otoczki wirusa, a możliwe, że i białko podstawowe, rozciąga się od około aminokwasu 120 do aminokwasu 400, na rysunku 1. Domena NS3 rozciąga się od około aminokwasu 1050 do aminokwasu 1640 i uważa się, że koduje wirusową proteazę. Domena NS4 rozciąga się od końca domeny NS3 do około aminokwasu 2000. Funkcja białka NS4 nie jest na razie znana. Wreszcie, domena NS5 rozciąga się od około aminokwasu 2000 do końca poliproteiny i uważa się, że koduje wirusową polimerazę.
Na rysunku 1 pokazano sekwencję izolatu HCV. Wydaje się, że sekwencje innych szczepów HCV rozprzestrzeniających się przez krew mogą różnić się od sekwencji z rysunku 1, szczególnie w domenach otoczki (S) i nukleokapsydu (C). Przyjmuje się, że użycie antygenów HCV mających inną sekwencję wchodzi w zakres obecnego wynalazku, pod warunkiem, że różnice te nie obniżają znacząco reaktywności immunologicznej antygenu w stosunku do surowicy osób zainfekowanych HCV.
Ogólnie, antygeny HCV zawierają całkowite lub częściowe domeny, fragmenty domen i mogą być łatwo badane pod kątem antygenowości przez biegłych w sztuce. Pojedynczy antygen HCV używany w kombinacji korzystnie zawiera determinantę (to znaczy, część pierwotnie odpowiedzialną za reaktywność immunologiczną polipeptydu) określonej domeny. W przypadku domeny C, korzystnie jest, gdy antygen domeny C zawiera większość całkowitej sekwencji domeny. Antygen oznaczony C22 (patrz przykład 4) jest szczególnie korzystny. Antygen domeny S, korzystnie zawiera hydrofobową subdomenę położona na N-końcu domeny. Ta hydrofobowa subdomena rozciąga się od około aminokwasu 199 do aminokwasu 328, na rysunku 1. Antygen HCV oznaczony S2 (patrz przykład 3) jest szczególnie korzystny. Jeśli jest to pożądane, w antygen domeny S może także być włączona sekwencja w kierunku transkrypcji tej hydrofobowej subdomeny.
Korzystnym antygenem domeny NS3 jest antygen oznaczony C33c. Ten antygen obejmuje aminokwasy od 1192 do 1457 na rysunku 1. Korzystnym antygenem NS4 jest C100 i zawiera aminokwasy od 1569 do 1931 na rysunku 1. Korzystny antygen NS5 zawiera aminokwasy od 2054 do 2464 na rysunku 1.
Antygen HCV może występować w postaci polipeptydu złożonego z kompletnej sekwencji aminokwasowej HCV lub może zawierać sekwencje egzogenne (to znaczy, może występować w postaci białka połączonego, zawierającego sekwencje egzogenne). W przypadku antygenów HCV wytworzonych drogą rekombinacji, wytworzenie antygenujako białka połączonego na przykład z SOD, czynnikiem alfa lub ubikwityną (patrz Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych AP Nr 4 751 180. Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych AP Nr 4 870 008. Zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Nr 390 599, złożone 7 sierpnia 1989, które są tu włączone, a opisują ekspresję białek połączonych z SOD, czynnikiem alfa i ubikwityną) może zwiększyć poziom ekspresji i/lub zwiększyć rozpuszczalność antygenu w wodzie. Białka połączone, takie jak, połączone z czynnikiem alfa i ubikwityną sąprzerabiane przez szczep gospodarza, w celu usunięcia sekwencji heterogenicznej. Czynnik alfa jest systemem sekrecyjnym, a białka połączone z ubikwityną pozostają w cytoplazmie.
Tak więc, kombinacja antygenów może być wytwarzana jako białka połączone. Na przykład, można wytworzyć ciągły fragment DNA kodujący C22 i C33c, klonować go do wektora ekspresyjnego i użyć do wytworzenia białka połączonego C22 i C33c. W podobny sposób można wytworzyć białka połączone antygenów C22 i C100, C22 i S2, C22 i NS5, C22, C33c i S2, C22, C100 i S2 i C22, C33c, C100 i S2. Można także użyć innych fragmentów wymienionych domen.
Przygotowanie antygenów HCV
Sposobem według wynalazku antygeny HCV korzystnie wytwarza się drogą rekombinacji lub drogą znanej syntezy chemicznej fazy stałej. Jednakże można także wyizolować je ze zdysocjowanych HCV lub cząstek HCV przy użyciu technik chromatografii powinowactwa z wykorzystaniem przeciwciał do izolacji antygenów.
Do wytwarzania antygenów drogą rekombinacji wykorzystuje się standardowe techniki konstruowania DNA kodującego antygen, klonowanie tego DNA wektorów ekspresyjnych,
1712133 transformowanie komórek gospodarza, takich jak, bakterie, drożdże, owady lub komórki ssaków i ekspresję takiego DNA do wytwarzania antygenów. Jak wykazano wcześniej, może być pożądana ekspresja antygenu jako białka połączonego w celu zwiększenia poziomu ekspresji, ułatwienia oczyszczania, lub zwiększenie rozpuszczalności. Przykładem specyficznego sposobu wytwarzania przykładowych antygenów HCV opisano w następujących przykładach i macierzystym zgłoszeniu nr 456 637.
Przygotowanie antygenów do użycia w testach immunologicznych
Antygeny HCV mogą być kombinowane przez wytwarzanie ich w postaci białek połączonych, złożonych z dwóch lub więcej antygenów, przez immobilizowanie ich pojedynczo na popularnych stałych podłożach lub przez ich fizyczne zmieszanie. Białka połączone antygenów można immobilizować (wiązać) z podłożem stałym. Metody i sposoby kowalencyjnego i niekowalencyjnego wiązania białek z podłożem stałym są znane w sztuce. Faktura stałej powierzchni zmienia się w zależności od postaci testu. Dla testów prowadzonych w mikropłytkach, powierzchnią stałąbędzie ścianka studzienki lub naczynka. Dla testów, w których używa się perełek, powierzchnią stałą będzie powierzchnia perełki. Dla testów, w których używa się wskaźnika (to znaczy, ciała stałego wykonanego z materiału porowatego lub włóknistego, takiego jak, tkanina lub papier) powierzchnią stałąbędzie powierzchnia materiału zjakiego wskaźnikjest wykonany. W testach aglutynacji powierzchnią stałąbędzie powierzchnia cząstek lateksu lub żelatyny. Jeżeli ze stałym podłożem związane sąpojedyncze antygeny, mogąbyć na powierzchni rozłożone homogennie lub we wzór, taki jak paski, tak że wzór wiązania antygenu można rozróżnić.
Proste mieszaniny antygenów zawierają antygen w jakimkolwiek odpowiednim rozpuszczalniku lub podłożu dyspersyjnym.
Postacie testów przy użyciu kombinacji antygenów
Antygeny HCV można wykorzystać w każdym teście, który wykorzystuje znany antygen do wykrywania przeciwciał. Powszechną własnością wszystkich takich testów jest to, że doprowadza się do kontaktu antygen ze składnikiem ciała podejrzanym o zawieranie przeciwciał antyHCV w warunkach, które pozwalają antygenowi związać się z jakimkolwiek takim przeciwciałem obecnym w składniku ciała. Typowo takie warunki, to fizjologiczna temperatura, pH i siła jonowa oraz użycie nadmiaru antygenu. Po inkubacji antygenu z próbkąwykrywa się kompleksy immunologiczne zawierające antygen.
Zaprojektowanie testu immunologicznego stwarza duże możliwości zmian i wiele form testu jest znane w sztuce. Na przykład, w protokołach wykonania używa się stałych nośników lub immunoprecypitacji. Większość testów wymaga użycia znacznych przeciwciał lub polipeptydów, znaczyć można, na przykład enzymatycznie, fluorescencyjnie, chemiluminescencyjnie lub radioaktywnie lub cząsteczkami barwnika. Znane są także testy, w których sygnał od kompleksu immunologicznego jest zwielokrotniony, przykładem są testy, w których używa się biotyny lub avidyny i testy immunologiczne z wykorzystaniem enzymów, takie jak ELISA.
Test immunologiczny może występować, bez ograniczeń w postaci heterogenicznej i homogenicznej i typu standardowego lub kompetencyjnego. W postaci heterogenicznej polipeptyd typowo jest wiązany ze stałym podłożem lub podłożem ułatwiającym oddzielenie próbki od polipeptydu po inkubacji. Przykładem stałego podłoża, którego można używać, jest nitroceluloza (na przykład, w postaci błon lub studzienek mikropłytek), chlorek poliwinylowy (na przykład, w postaci arkuszy lub studzienek mikropłytek), lateks polistyrenowy (na przykład, w postaci perełek lub studzienek mikropłytek), fluorek poliwinilidyny (znany jako “Immulon”), papier dwuazowany, błony nylonowe, perełki aktywowane i perełki opłaszczone białkiem A.
Na przykład, w heterogenicznej postaci testu można użyć mikropłytek lub perełek polistyrenowych o średnicy 6,5 mm (Precyzyjne plastikowe kuleczki) wykonanych z “Immulonu 1 lub ”Immulonu 2 firmy Dynatech. Stały nośnik zawierający polipeptydy antygeniczne typowo przemywa się po oddzieleniu ich od próbki badanej a przed wykrywaniem związanych przeciwciał. W sztuce znana jest zarówno standardowa i kompetencyjna postać testu.
172 133
W homogenicznej postaci testu badaną próbkę inkubuje się z roztworem kombinacji antygenów. Na przykład, prowadzi się to w warunkach, w których precypituje każdy powstający kompleks antygen-przeciwciało. W sztuce jest zarówno standardowa i kompetencyjna postać testu.
W standardowej postaci testu ilość przeciwciał anty-HCV tworzących kompleksy antygen-przeciwciało mierzy się bezpośrednio. Można to uzyskać przez określenie, czy znaczone przeciwciała anty-ksenogemczne (na przykład, anty-ludzkie), które rozpoznają epitop przeciwciał anty-HCV, będą się wiązały z wytworzeniem kompleksu. W kompetencyjnej postaci testu ilość przeciwciał anty-HCV w próbce wnioskuje się ze zbadania efektów kompetencyjnych wiązania znanej ilości znaczonego przeciwciała (lub innego kompetencyjnego ligandu) w kompleksach.
Tworzące się kompleksy zawierające przeciwciała anty-HCV (lub w przypadku testów kompetencyjnych ilość przeciwciała kompetencyjnego) wykrywa się jakąkolwiek znaną techniką, w zależności od postaci testu. Na przykład, nieznakowane przeciwciała anty-HCV w kompleksach można wykryć przy użyciu koniugatów antyksenogenicznych Ig skompleksowanych ze znacznikiem (na przykład, ze znacznikiem enzymatycznym).
W testach immunoprecypitacji lub aglutynacji reakcja pomiędzy antygenem HCV i przeciwciałem tworzy siatkę, która precypituje z roztworu lub zawiesiny i powstaje widoczna warstwa lub błonka precypitatu. Jeśli osobnik nie posiada żadnych przeciwciał anty-HCV nie powstaje widoczny precypitat.
Antygeny HCV typowo pakuje się w postaci zestawu do użycia w takim teście immunologicznym. Normalnie zestaw zawiera oddzielne pojemniki z kombinacją antygenów (od razu związanych ze stałym podłożem lub oddzielonych, z odczynnikami do wiązania ich z podłożem), przeciwciała kontrolne (dodatnie i/lub negatywne), przeciwciała znaczone, jeżeli postać testu tego wymaga i odczynniki wytwarzające sygnał (na przykład, substrat dla enzymu),jeżeli znacznik sam nie wytwarza sygnału. Zwykle zestaw zawiera także instrukcję wykonania (na przykład, pisaną, taśmę, VCR, CD-ROM i tym podobne).
Następujące przykłady zamieszczono w celu zilustrowania wynalazku i nie ograniczają one wynalazku w żaden sposób.
Przykład I. Synteza antygenu C33a HCV
Antygen C33c HCV zawiera sekwencję domeny NS3. Szczegółowo obejmuje aminokwasy od 1192 do 1457na rysunku 1. Antygen ten wytwarza się w bakteriach jako białko połączonez ludzką dysmutazą ponadtlenkową (SOD) w sposób następujący. Wektor pSODcfl (Steiner i wsp., (1986), J. Virol. 58:9) trawi się całkowicie restryktaząEcoRI i BamHI, a powstające fragmenty EcRI i BamHI łączy się w następujący linkier do wytworzenia pcf1EF:
GATC CTG GAA TTC TGA TAA (sekw. nr ident. 1)
GAC CTT AAG ACT ATT TTA A (sekw. nr ident. 2)
Klon cDNA kodujący aminokwasy 1192-1457 i mający końce EcoRI włącza się w psf1EF do wytworzenia pcflEF/C33c. Taką konstrukcję ekspresyjną transformuje się do komórek D1210 E. coli.
Transformantów używa się do ekspresji białka połączonego zawierającego na N-końcu SOD, a na C-końcu, zgodnie z ramką odczytu antygen C33a HCV. ekspresję uzyskuje się przez inokulację 15 ml całonocnej hodowli transformanta do 1500 ml podłoża Luria zawierającego ampicylinę (100 mikrogramów/ml). Komórki hoduje się do O.D. równego 0,3, dodaje się IPTG do stężenia końcowego 2 mM i kontynuuje się hodowlę do gęstości O.D. równej 1, następnie komórki odwirowuje się przez 20 minut przy 3000 x g w temperaturze 4°C. Upakowane komórki można przechowywać w temperaturze -80°C przez kilka miesięcy.
W celu oczyszczenia polipeptydu SOD-C33c, komórki bakterii, wytwarzające ten polipetyd, poddaje się szokowi osmotycznemu i mechanicznemu rozbiciu, a frakcję nierozpuszczalną zawierającą SOD-C33c izoluje się i poddaje ekstrakcji różnicującej w zasadowym roztworze NaCl. Wyekstrahowane białko połączone oczyszcza się przez chromatografię kolumnowa na SSepharozie i Q-Sepharozie.
172 133
Surowy ekstrakt powstający po szoku osomotycznym i mechanicznym rozbiciu przygotowuje się według następującej procedury. Jeden gram upakowanych komórek zawiesza się w 10 ml roztworu zawierającego 0.02 M Tris HCl, pH 7,5,10 mM ED TA, 20% sacharozy i inkubuje się przez 10 minut w lodzie. Komórki zbiera się przez wirowanie przez 15 minut przy 4000 x g w temperaturze 4°C. Po usunięciu klarownego supernatantu (frakcja peryplazmatyczna I) komórki powtórnie zawiesza się w 10 ml buforu Al (0,01 M Tris HCl, pH 7,5,1 mM EDTA, 14 mM betamerkaptoetanol (BME) i inkubuje się przez 10 minut w lodzie. Komórki powtórnie zbiera się przez wirowanie przez 15· minut przy 4000 x g w temperaturze 4°C. Po usunięciu klarownego supernatantu (frakcja peryplazmatyczna II) komórki zawiesza się 5 ml buforu A2 (0,02 M Tris HC1, pH 7,5,1 mM EDtA, 14 mM bMe, 1 mMPMSF). W celu rozbicia komórek, w probówce Falcona umieszcza się 7,5 ml przemytych kwasem perełek Dyno-mill ze szkła bezołowiowego (o średnicy 0,1 - 0,15 mm) z firmy Glen-Mills, Inc.) i 5 ml zawiesiny komórek, wytrząsa się z maksymalną szybkośeiąprzez dwie minuty i oziębia przez co najmniej 2 minuty na lodzie, procedurę wytrząsania i oziębiania powtarza się cztery razy. Po wytrząsaniu, osad filtruje się przez lejek ze szkła spiekanego pod lekko obniżonym ciśnieniem. Szklane perełki przemywa się dwukrotnie buforem A2 i łączy przesącz i płyn po przemywaniu.
Frakcję nierozpuszczalną surowego ekstraktu zbiera się przez wirowanie przy 20000 x g przez 15 minut w temperaturze 4°C, przemywa dwukrotnie 10 ml ml buforu A2 i zawiesza w 5 ml wody MILLI-Q.
Frakcję zawierającą SOD-C33c izoluje się materiału nierozpuszczalnego przez dodanie do zawiesiny roztworu NaOH (2 M) i NaCl (2 M) do stężenia końcowego 20 mM każdego ze związków, wytrząsanie mieszaniny przez 1 minutę, odwirowanie przy 20000 x g przez 20 minut w temperaturze 4°C i zatrzymanie supernatantu.
W celu oczyszczenia SOD-C33c na S-Sepharozie, supematant doprowadza się do stężenia końcowego 6M roztworu mocznika, 0,05 M Tris HCl, pH 7,5,1 mM eDtA, 14 mM BME. Frakcję nakłada się na kolumnę S-Sepharose Fast Flow (1,5 x 10 cm) zrównoważoną buforem B (0,05 M Treis HCl, pH 7,5 1 mM eDtA, 14 mM BME). Po nałożeniu próbki, kolumnę przemywa się dwoma objętościami buforu B. Zbiera się frakcje przepływające i wypływające. Prędkość przepływu próbki i buforu do przemywania wynosi 1 ml/minutę, zbiera się frakcję 1 ml. W celu zidentyfikowania frakcji zawierającej SOD-C33c frakcje analizuje się przez elektroforezę na 10% żelu poliakrylamidowym zawierającym SDS i barwienie błękitem Coomassie. Frakcje można także analizować techniką Western blotting przy użyciu przeciwciał anty-SOD. Frakcje zawierające SOD-C33c zbiera się.
Dalsze oczyszczanie SOD-C33c prowadzi się na kolumnie Q-Sepharose (1,5 x 10 cm) zrównoważonej buforem B. Frakcje zawierające SOD-C33c zebrane po chromatografii na S-Sepharozie nakłada się na kolumnę. Następnie kolumnę przemywa się buforem B i rozwija 60 ml gradientu 0,0 do 0,4 M NaCl w buforze B. Prędkość przepływu dla nakładania, przemywania i rozwijania wynosi 1 ml/minutę, zbiera się frakcje 1 ml. Wszystkie frakcje z kolumny Q-Sepharose bada się tak, jak opisano to dla kolumny S-Sepharose. Pik SOD-C33c wymywa się z kolumny przy stężeniu NaCl około 0,2 M.
Z kolumny Q-Sepharose otrzymuje się SOD-C33c o czystości większej niż 90%, określonej przez analizę na żelu poliakrylamidowym i techniką immunoblottingu przy użyciu przeciwciał monoklonalnych anty-ludzka-SOD.
Przykład II. Synteza antygenu C100 HCV
Antygen C100 HCV zawiera sekwencję domeny NS3 i NS4. Szczegółowo, obejmuje aminokwasy od 1569 do 1931 na rysunku 1. Antygen ten wytwarza się w drożdżach. Wytwarza się cDNA wielkości 1270 bp kodujący powyższe aminokwasy i mający końce EcoRI.
Konstrukcję drożdżowego wektora ekspresyjnego, w którym ten fragment jest bezpośrednio włączony w promotor ADH2/GAP S. cerevisiae uzyskuje się według procedury obejmującej amplifikację sekwencji C100 przy użyciu techniki PCR, włączenie namnożonej sekwencji w wektor do klonowania. Po klonowaniu sekwencj ę C100 wycina się i razem z sekwencj ą zawieraj ącą promotor ADH2/GAP włącza do dużego fragmentu wektora drożdżowego w celu otrzymania
17:Ł 133 drożdżowego wektora ekspresyjnego. Amplikacja C100 technikąPCR prowadzi się przy użyciu jako matrycy wektora pS3-56cl00m, który trawiono restryktazą Sali w celu linearyzacji. pS3-56, który jest pochodnym pBR322, zawiera blok ekspresyjny złożony z hybrydowego promotora drożdży dADH2/GAPDH powyżej genu ludzkiej dysmutazy ponadtlenkowej w kierunku transkrypcji i poniżej w kierunku transkrypcji terminator transkrypcji czynnika alfa.
Primery oligonukleotydowe używane do amplikacji zaprojektowano dla ułatwienia klonowania do wektora ekspresyjnego i wprowadzenia kodonu terminatora transkrypcji. Szczegółowo, przy użyciu oligonukleotydów z PCR wprowadzono nowe miejsce 5' i 3' rozpoznawane odpowiednio przez restryktazy Hindlll i Sali. Oligonukleotydy kodujące miejsca rozpoznawane przez restryktazę Sali kodują także dwa kodony terminalne, TAA i TGA. Oligonukleotydy kodujące miejsce rozpoznawane przez restryktazę Hindlll kodujątakże nieulegającątranslacji sekwencję lidera genu pga63, znajdującą się powyżej kodonu AUG zgodnie z kierunkiem transkrypcji. Gen pRco63GAPDH jest opisany przez Hollanda i Hollanda (1980) i Kniskerna i wsp. (1986). Sekwencja primerów PCR używanych do bezpośredniej ekspresji C100m była następująca:
5' GAG TGC TCA AGC TTC AAA ACA AAA TGG CTC
ACT TTC TAT CCC AGA CAA AGC AGA GT 3' (sekw. nr ident. 3) i
5' GAG TGC TCG TCG ACT CAT TAG GGG GAA
ACA TGG TTC CCC CGG GAG GCG AA 3' (sekw. nr ident. 4)
Amplikację techniką PCR prowadzi się według instrukcji producenta przy użyciu primer rów i matrycy z zestawu PCR firmy Cetus-Perkin-Elmer. Warunki PCR były następujące 29 cykli 94°C przez minutę, 37°C przez 2 minuty, 72°C przez 3 minuty i końcowa inkubacja w 72°C przez minut. DNA przechowywano przez noc w temperaturze 4°C lub -20°C.
Po amplifikacji produkty PCR trawi się restryktazami Hindlll i Sali. Główny produkt wielkości 1,1 kb oczyszcza się przez elektroforezę na żelu, a oczyszczony fragment łączy się z dużym fragmentem Sall-Hindlll plazmidu pBR322. W celu wyizolowania właściwego fragmentu, kompetentne komórki HB101 transformuje się zrekombinowanym wektorem, a po klonowaniu pożądany rekombinant identyfikuje się na podstawie znanej wielkości wyciętych z klonów fragmentów Hindlll-Sall. Klon zawierający fragment ITindIII-SalI o właściwej wielkości nazwano pBR322/C100'd. Bezpośrednia analiza sekwencji fragmentu Hindlll-Sall potwierdziła, że ten klon zawiera namnożony C100.
Wektor ekspresyjny zawierający C100 otrzymano przez połączenie fragmentu HindIII-Sa11 z pBR322/C 100'd z 13,1 kb fragmentem BamHI-Sall plazmidu pBS24,1i 1369 bp fragmentem BamHI-HindIII zawierającym promotor ADH2/GAP. (Drugi fragment opisany jest w EPO 164 556). Wektor pBS24.1 opisanyjestwU.S.S.N. 382 805 złożonym 19 lipca 1989. Fragment promotorowy ADH2/GAP uzyskano przez trawienie wektora pPGAP/AG/Hindlll restryktazami Hindlll i BamHI, a następnie oczyszczenie na żelu fragmentu 1369 bp.
Kompetentne komórki HB101 transformuje się zrekombinowanym wektorem, a właściwe rekombinanty identyfikuje się przez trawienie klonowanych wektorów restryktazami BamHI i Sali na fragmenty 2464 bp i 13,2 kb. Jeden z właściwe klonowanych zrekombinowanych wektorów nazwano pC100'd#3.
W celu otrzymania C100, kompetentne komórki Saccharomyces cerevisiae szczep AB 122 (MATA leu2 ura3-53 prb 1-1122 pep4-3 prcl-407[cir-0]) transformuje się wektorem ekspresyjnym pC 100’d#3. Transformowane komórki wysiewa się na URA-sorbitol, a pojedyncze transformanty pasażuje na płytki Leu'.
Pojedyncze klony hoduje się w podłożu Leu', ura z dodatkiem 2% glukozy w temperaturze 30°C przez 24-36 godzin. Następnie, jeden litr Yeast Extract Peptone Medium (YEP) zawierający 2% glukozy inkuluje się 10 ml całonocnej hodowli, a powstałą hodowlę hoduje się przez 48 godzin w temperaturze 30°C z wytrząsaniem z szybkością400 obrotów/minutę i współczynnikiem natlenienia 1 litr powietrza na 1 litr hodowli na minutę (to znaczy, 1 wm). pH hodowli nie kontrolowano. Hodowlę prowadzono w fermentorze BioFlo II wykonanym przez firmę New Brunswick Science Corp. Po fermentacji, komórki izolowano i testowano pod kątem ekspresji C100.
172 133
Analizę wytworzonych przez transformowane komórki polipeptydów C100 prowadzono na pełnym lizacie drożdży i surowym ekstrakcie z pojedynczej kolonii drożdży, otrzymanej z płytki Lue'. Lizaty komórkowe i surowy ekstrakt badano elektroforetycznie na SDS żelu poliakrylamidowym i techniką Western blotting. Jako sondy w Western blotting używa się poliklonalnych przeciwciał królika przeciw polipeptydowi SOD-C100, wytworzonemu przez drożdże. Przewidywana wielkość polipeptydu C100 wynosi 364 aminokwasy. Z analizy na żelu wynika, że wytworzony polipeptyd ma wielkość MW, 39,9 K.
Obie metody analizy wykazały, że wytworzony polipeptyd C100 jest obecny w pełnym lizacie drożdży, ale nie ma go w surowym ekstrakcie. Wyniki te wskazują, że wytworzony polipeptyd C100 może być nierozpuszczalny.
Przykład III. Ekspresja antygenu S2 HCV
Antygen S2 HCV zawiera sekwencję z hydrofobowego N-końca domeny S. Obejmuje ona aminokwasy od 199 do 328 na rysunku 1.
Procedura otrzymywania wektora ekspresyjnego kodującego polipeptyd S2 i jego ekspresji w drożdżach jest analogiczna do użytej do ekspresji polipeptydu C100 i opisanej w przykładzie 2.
Matrycą reakcji PCRbył wektor pBR322/Pil4a, który trawiono restryktaząf IindlU w celu linearyzacji. Pi14a jest klonem cDNA kodującym aminokwasy 199-328.
Sekwencja oligonukleotydów użytych jako primery do amplifikacji sekwencji kodującej S2 techniką PCR była następująca.
Dla regionu-5' sekwencji S2.
5' GAG TGC TCA AGC TTC AAA ACA AAA TGG GGC TCT ACC ACG TCA CCA ATG ATT GCC CTA AC 3' dla regionu-3' sekwencji S2.
5' GAG TGC TCG TCG ACT CAT TAA GGG GAC CAG TTC ATC ATC ATA TCC CAT GCC AT 3'.
Primer dla regionu-5' wprowadza do zwielokrotnionego produktu miejsce rozpoznawane przez restryktazę HindIII i kodon startowy ATG. Primer dla regionu-3' wprowadza do zwielokrotnionego produktu miejsce rozpoznawane przez restryktazę Sali i kodon terminacji transkrypcji.
Warunki PCR były następujące 29 cykli 94°C przez minutę, 37°C przez 2 minuty, 72°C przez 3 minuty i końcowa inkubacja w 72°C przez 10 minut.
Głównym produktem reakcji PCR był fragment wielkości 413 bp, który oczyszczono na żelu. Oczyszczony fragment łączy się z dużym fragmentem SalI-HindIII, otrzymanym przez trawienie plazmidu pBR322 i otrzymuje plazmid pBR322/S2d.
Połączenie fragmentu HindIII-SalI S2 wielkości 413 bp z dużym fragmentem BamHI-SalI plazmidu pBS24.1 i 1.36 kp fragmentem BamHI-HindIII zawierającym promotor ADH2/GAP daje zrekombinowany wektor, który się klonuje. Właściwe zrekombinowane wektory identyfikuje się dzięki obecności 1,77 kb fragmentu po trawieniu restryktazami BamHI i SalI. Wektor ekspresyjny złożony ze zwielokrotnionej sekwencji, zawierający sekwencję kodującą S2 połączoną bezpośrednio z promotorem ADH2/GAP nazwano pS2d#9.
Przykład IV. Synteza antygenu C HCV
Antygen C HCV zawiera sekwencję domeny C. Obejmuje ona aminokwasy 1-122 na rysunku 1.
Procedura otrzymywania wektora ekspresyjnego kodującego polipeptyd C i jego ekspresję w drożdżachjest analogiczna do użytej ekspresji polipeptydu C WO l t^jiis^r^^l poprzednio, oprócz następującego.
Matrycą reakcji PCR był wektor pBR322/Ap30a, który trawiono restryktazą HindIII w celu linearyzacji. Ag30a jest klonem cDNA kodującym aminokwasy 1-122.
Sekwencja oligonukleotydów użytych jako primiery do amplifikacji sekwencji kodującej C techniką PCR była następująca.
Dla regionu 5' sekwencji C:
5' GAG TGC AGC TTC AAA ACA AAA TGA GCA CGA ATA CTA AAC CTC AAA AAA AAA AC 3' (sekw. nr ident. 7) dla regionu-3' sekwencji C:
172 133
5' GAG TGC TCG TCG ACT CAT TAA CCC AAA TTG CGC GAC CTA CGC CGG GGG TCT GT 3' (sekw. nr ident. 8).
Primer dla regionu-5' wprowadza do zwielokrotnionego produktu miejsce rozpoznawane przez restryktazę Hindlll, a primer dla regionu-3' wprowadza miejsce rozpoznawane przez restryktazę Sali i kondon terminacji translacji. Warunki PCR były następujące 29 cykli 94°C przez minutę, 37°C przez 2 minuty, 72°C przez 3 minuty i końcowa inkubacja w 72°C przez 10 minut.
Głównym produktem reakcji PCR był fragment wielkości 381 bp. Połączenie tego fragmentu z dużym fragmentem Sall-Hmdlil plazmidu pBR322, daje plazmid pBr322/C2. Połączenie fragmentu Hindlll-Sall C wielkości 381 bp. kodującego fragment wycięty z pBR322/C2, z dużym fragmentem BamHI-Sall plazmidu pBS24.1 i 1.36 kp fragmentem BamHl-HindIII zawierającym promotor ADH2/GAP daje zrekombinowany wektor, który się klonuje. Właściwe zrekombinowane wektory identyfikuje się dzięki obecności 1,74 kb fragmentu po trawieniu restryktazami BamHI i Sali. Wektor ekspresyjny złożony ze zwielokrotnionej sekwencji, zawierający sekwencję kodującą C połączoną bezpośrednio z promotorem ADH2/GAP nazwano pC22.
Analizę wytworzonych przez transformowane komórki polipeptydów C prowadzono na pełnym lizacie drożdży i surowym ekstrakcie z pojedynczej kolonii drożdży, otrzymanej z płytki Lue'. Lizaty komórkowe i surowy ekstrakt badano elektroforetycznie na SDS żelu poliakrylamidowym. Przewidywana wielkość polipeptydu C wynosi 122 aminokwasy a z analizy na żelu wynika, że wytworzony polipeptyd ma wielkość MW około 13,6 Kd.
Przykład V. Synteza polipeptydu NS5
Ten polipeptyd zawiera sekwencję z N-końca domeny NS5. Szczegółowo, obejmuje ona aminokwasy od 2054 do 2464 na rysunku 1. Procedura otrzymywania wektora ekspresyjnego kodującego polipeptydNS5 i jego ekspresji w drożdżach jest analogiczna do użytej do ekspresji polipeptydu C33c (patrz przykład 1).
Przykład VI. Test radioimmunologiczny (RIA) dla przeciwciał przeciw HCV
Antygeny HCV z przykładów 1 -5 badano w teście postaci RIA pod kątem ich zdolności do wykrywania przeciwciał przeciw HCV w surowicy pacjentów, u których w surowicy stwierdzono klinicznie obecność HCV (nie-A i nie-B) i w surowicy krwi od płatnych dawców krwi.
Test RIA oparto na procesurze opisanej przez Tsu i Herzenberga (1980) w SELECTED METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY (W.H. Freeman & CO.), strony 373-391. Ogólnie, mikropłytki (Immulon 2, Removawell Strips) opłaszcza się oczyszczonym antygenem HCV. Opłaszczone płytki inkubuje się z próbkami surowicy i odpowiednimi kontrolami. W czasie inkubacji przeciwciała, jeśli są obecne, wiążą się immunologicznie z antygenem na nośniku. Po usunięciu niezwiązanego materiału i przemyciu mikropłytek, kompleksy ludzkie przeciwciałantygen NANBV wykrywa się przez inkubację ze znacznymi I125 przeciwciałami anty-człowiek owcy. Niezwiązane znaczone przeciwciała usuwa się przez wysysanie, a płytki przemywa. Następnie określa się radioaktywność pojedynczych studzienek, ilość związanych ludzkich przeciwciał anty-HCV jest proporcjonalna do radioaktywności studzienek. Szczegółowo, do stu studzienek (Immulon 2, Removawell Strips) dodaje się mikrolitrowe próbki zawierające od 0,1 dp 0,5 mikrogramów antygenu HCV w 0,125 M buforze boranowym, pH 8,3, 0,075 M NaCl (BBS). Płytki inkubuje się przez noc w temperaturze 4°C w termostacie o stałej wilgotności, a następnie roztwór antygenu usuwa się, a mikropłytki trzy razy przemywa BBS zawierającym 0,02% Triton Χ-100 (BBST). Aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał, studzienki opłaszcza się albuminą surowicy bydlęcej (BSA) przez dodanie 100 mikrolitrów 5 mg/ml roztworu BSA w BBS i inkubację przez 1 godzinę, po inkubacji roztwór BSA usuwa się. Reakcję antygenów w opłaszczonych studzienkach prowadzi się przez dodanie 100 mikrolitrów próbki surowicy rozcieńczonej 1:100 0,01 M buforem fosforanowym, pH 7,2 0,15 M NaCl (PBS) zawierającym 10 mg/ml BSA i inkubację studzienek zawierających surowicę przez 1 godzinę, w temperaturze 37°C. Po inkubacji próbki surowicy usuwa się przez odsysanie, a studzienki 5 razy przemywa BBST. Ilość związanych z antygenem przeciwciał określa się przez wiązanie z opłaszczonymi studzienkami znaczonych I125 F (ab)2 anty-człowiek IgG owcy. Do każdej studzienki dodaje się 100 mikrolitrów znaczonej sondy (aktywność właściwa 5-20 mikrocurie/mikrogram),
172 133 płytki inkubuje się przez 1 godzinę w temperaturze 37°C, następnie usuwa nadmiar sondy przez wysysanie i przemywa 5 razy BBST. Radioaktywność każdej studzienki określa się w liczniku zliczającym radioaktywność gamma.
Tabela 1 przedstawia wyniki testów na surowicy pacjentów, u których stwierdzono HCV.
Tabela 1
Pacjent Antygen
S2 C22 C100 C33c NS2
1 2 3 4 5 6
CVHIVDA P P P(+++) P P
CVHIVDA P P P(+) P P
CVH IVDA P P P(+) P P
CVH NOS P P P P P
AVH NOS HS N N N N N
AVH NOS HS P N N N N
AVH NOS HS P N N N N
AVH NOS HS P/N N N N N
AVH PTVH N N N P/N N
AVH NOS HS N N N N N
AVH NOS N N N N P
AVH PTVH N N N N N
AVH IVDA N P N P P
AVH PTVH P P/N N N P
AVH NOS N P N N N
AVH IVDA N P N P P
AVH NOS HS P/N N N N N
AVH PTVH N N N N N
CVHIVDA P P P P P
CVH IVDA P P P P P
AVH NOS HS N N N N N
CVH PTVH P P N N N
AVH PTVH P N P(+) P(+++) N
CVH PTVH N P P P P
CVH NOS HS P P P P N
AVH NOS N P P/N P P
CVH IVDA N N N P N
AVH IVDA P P P P P
AVH IVDA P P P P P
CVH IVDA P P P P P
AVH IVDA P/N P N P P
172 133
1 2 3 4 5 6
AVH IVDA N P P P N
CVH NOS N N N N N
CVH NOS N N N N N
CVH IVDA P P P P P
AVH IVDA P P P P P
CVH PTVH P P P P P
AVH PTVH'? N P P P P
AVH IVDA N P N P N
AVH NOS N N N N N
AVH NOS N N N N N
CVH NOS N P N N P
CVH NOS P P N N N
CVH NOS HS P P P P P
CVHPTVH P P N P P
AVH pielęgniarka P P N N N
AVH IVDA P P P P N
AVH IVDA N P P(+) P(+++) N
AVH pielęgniarka P/N P N N N
AVH PTHV P/N P P N P
AVH NOS N P/N N N P
AVH NOS N P N P N
AVHPTHV P P/N N N N
AVH PTHV N P N P P
AVH PTHV P P P P P
AVH PTHV N P N N P
CVH PTHV P/N P P(+) P(+++) N
AVHPTHV N P/N P(+) P(+++) P
AVH PTHV P (?) P N P
CVH PTHV N P N P P
CVH PTHV N P P P P
CVH PTHV N N N N N
AVH NOS N N N N N
AVH pielęgniarka P P N N N
CVH PTHV N P N N P
AVH IVDA N P N P/N N
CVH PTHV P P P(+) P(+++) P
AVH NOS P P N N N
AVH NOS P/N P N N P
172 133
1 2 3 4 5 6
AVH PTHV P/N P P P P
AVH NOS N P P P P/N
AVH IVDA N P N N P
AVH NOS N P/N N N N
AVH NOS P P N N P
AVH PTHV N P P P P
krypto P P P P P
CVH NOS N P P P P
CVH NOS N N N N N
AVH PTHV N P P(+) P(++) N
AVH PTHV N P/N P(+) P(++) P
AVH PTHV N P/N P(+) P(++) P
CVH IVDA P P P P P
CVH IVDA P P P P P
CVH IVDA P P P P P
CVH IVDA P P P P P
AVH NOS N P N N N
CVH IVDA P P P P P/N
AVH IVDA P P P P N
AVH NOS P P N N N
AVH NOS P P N N N
CVH PTHV P P N N P/N
AVH PTHV N P N P P
AVH NOS N N N N N
AVH NOS N P N N N
AVH NOS P N N N N
CVH NOS N N N N N
AVH NOS N P/N N N N
AVH IVDA N P P P P
krypto N P N N P/N
krypto P P P/N P P
AVH IVDA N N P P N
AVH IVDA N P P P N
AVH NOS N N N N N
AVH NOS N N N N N
CVHIVDA P P P P P
CVH PTHV N N N N N
CVH PTHV P P P(+) P(+++) P
172 133
1 2 3 4 5 6
CVH PTHV P P P(+) P(+++) P
CVH NOS P/N N N N N
CVH NOS N N N N N
CVH PTHV P P P P P
CVH PTHV P P P P P
CVH PTHV P P P P P
AVH IVDA N P P P P
CVH NOS N N N N N
CVH NOS N N N N N
CVH PTHV P P P P P
AVH NOS P P N N P/N
AVH NOS N P/N N N N
CVH PTHV P P N N P
CVH NOS N P/N N N N
AVH NOS N P N N N
AVH NOS N P N N N
CVH PTVH N P N N N
AVH IVDA N P N P P
AVH NOS P N N N N
CVH NOS N N N N N
CVH NOS N N N N N
CVHIVDA P P P P P
CVH IVDA P/N P P P P
CVH IVDA P P P P P
CVH IVDA N P P P P
AVH NOS N P N N P
CVH IVDA N P N N P
CVH IVDA N P N N P
AVH PTHV P P N P P
AVH PTHV P P N P P
CVH NOS N P/N N N P/N
CVH NOS N P N . N N
CVH NOS N N N N N
CVH PTHV P P P P P
CVH PTHV P P P P P
CVH PTHV P P P P P
AVH IVDA N P N N P
AVH PTHV N P P(++) P(+) P
172 133
1 2 3 4 5 6
CVH PTHV P P P P P
AVH PTHV N P P P P
CVH PTHV? N P P P P
CVH PTHV? P/N P P P P
CVH NOS HS P P N N N
CVH IVDA P P P P N
CVH PTHV N P P P P
CVH PTHV P P P P P/N
CVH NOS P P P P P
CVH IVDA P P P P P
CVH PTHV P P P P N
CVH PTHV P P P P P
CVH NOS N N N N P/N
CVH NOS N P/N N N P/N
CVH PTHV P P P P P
CVH NOS N P N N N
CVH NOS N N N N N
CVH NOS P P N N P/N
CVH NOS N N N N N
CVH NOS HS P P P P P
CVH NOS HS P P P P P
CVH PTHV N N N N N
AVH PTHV N P P P P
AVH NOS - -
CVH PTHV N P P/N P(+++) N
krypto P P P P P
krypto P P P P P
krypto N P N N N
krypto N P P P P
CVH PTHV P P P P P
krypto N N N N N
krypto N P N N P/N
krypto N P N N P
krypto P P P P P
krypto N P N P N
krypto - -
krypto - -
CVH NOS - -
172 133
1 2 3 4 5 6
AVH IVDA N P N P(+) P
AVH IVDA N P/N N P(++) N
AVH = ostre wirusowe zapalenie wątroby
CVH = chroniczne wirusowe zapalenie wątroby
PTVH = potransfuzyjne wirusowe zapalenie wątroby
IVDA = pacjent uzależniony od leków dożylnych krypto = skrytopochodne wirusowe zapalenie wątroby
NOS = źródło nieznane
P = odczyn dodatni
N = odczyn ujemny
Wyniki te wskazują, że żaden pojedynczy antygen nie reaguje ze wszystkimi surowicami. Najbardziej reaktywne były antygeny C22 i C33c, a antygen S2 reagował z surowicami niektórych ostrych przypadków HCV, z którymi nie reagował żaden inny antygen. W oparciu o te wyniki, można stwierdzić, że kombinacja antygentów C22 i C33c zapewnia najszerszy zakres wykrywania. Jeśli ktoś chce wykryć maksimum ostrych przypadków w kombinację powinien być włączony antygen S2.
Tabela 2 przedstawia wyniki testów na surowicy płatnych dawców krwi.
Tabela 2
Dawca Antygen
C100 C33c C22 S2 NS2
1 N N N N N
2 N N N N N
3 P P P P P
4 N N N N N
5 N N N N N
6 N N N N N
7 N N N N N
8 N N N N N
9 N N N N N
10 N N N N N
11 N N N N N
12 N N N N N
13 N N N N N
14 N N N N N
15 N N N N N
16 N N N N N
17 N N N N N
18 P P P P P
19 P P N P P
20 P P N P P
21 N N N N N
172 133
1 2 3 4 5 6
22 N P P N P
23 P P P P P
24 N N N N N
25 N N N N N
26 N N N N N
27 N N N N N
28 N N N N N
29 N N N N N
30 N N N N N
31 P P P N P
32 N N N N N
33 N N N N N
34 N N N N P
35 N N P N P
36 N N N N N
37 N N N N N
38 N N N N N
39 N N N N N
40 N N N N N
41 N N N N P
42 N N N N N
43 N N N N N
44 N N N N N
45 N N N N N
46 N N N N N
47 P P N N P
48 N N N N N
49 N N N N N
50 N N N N N
51 N P P N P
52 N N N N N
53 N P P N P
54 P P P P N
55 N N N N N
56 N N N N N
57 N N N N N
58 N N N N N
59 N N N N N
172 133
1 2 3 4 5 6
60 N N N N N
61 N N N N N
62 N N N N N
63 N N N N N
64 N N N N N
65 N N N N N
66 N N N N N
67 N N N N N
68 N N N N N
69 N N N N N
70 P P P P P
71 N N N N N
72 N N N N N
73 P P P P N
74 N N N N N
75 N N N N N
76 N N N N P
77 N N N N N
78 N N N N N
79 N N N N N
80 N N N N N
81 N N N N N
82 N N N N N
83 P P N N N
84 N N P N N
85 N N N N N
86 P P P P N
87 N N N N N
88 N N N N N
89 P P P P P
90 P P P P N
91 N N N N N
92 P P P N N
93 N N N N N
94 N N N N N
95 N N N N N
96 N N N N N
97 N N N N N
172 133
1 2 3 4 5 6
98 N P P P P
99 P P P P P
100 N N N N N
101 P P P P P
102 N N N N N
103 N N N N N
104 N N N N
105 P P P P N
106 N N N N N
107 N N N N N
108 N N N N N
109 P P P P P
110 P P P N P
111 P P P N P
112 N N N N N
113 P P P P P
114 N N N N N
115 N N N N N
117 N N N N N
118 N N N N N
119 N N N N N
120 P P P P P
121 N N N N N
122 N P P N P
123 N N N N N
124 N N N N N
125 N N N N N
126 P N N N N
127 N N N N N
128 N N N N N
129 N N N N N
130 P P P P N
131 N N N N P
132 N N N N N
133 N N N N N
134 N N N N N
135 N N N N N
136 N N N N N
172 133
1 2 3 4 5 6
137 N N N N N
138 N N N N N
139 N N N N N
140 P N N N N
141 P N P P P
142 N N N N N
143 N N N N N
144 N N N N N
145 N N N N N
146 N N N N N
147 N N N N N
148 N N N N N
149 N N N N N
150 N N N N N
151 N N N N N
152 N N N N N
153 N N N N N
154 P P P P P
155 N N N N N
156 N N N N N
157 N N N N N
158 N N N N N
159 N N N N N
160 N N N N N
161 P P P P P
162 N N N N N
163 N N N N N
164 P P P N P
165 N N N N N
166 P P P N P
167 N N N N N
168 N N N N N
169 N N N N N
170 N N N N N
171 N N N N N
172 N N N N N
173 N N N N N
174 N N N N N
172 133
1 2 3 4 5 6
175 N N N N N
176 N N N N N
177 N N N N P
178 N N N N N
179 N N N N N
180 N N N N N
181 N N N N N
182 N N N N N
183 P P P P P
184 N N N N N
185 N N N N N
186 N N N N N
187 N N N N N
188 N P P N N
189 N N N N N
190 N N N N N
191 N N N N N
192 N N N N N
193 N N N N N
194 N N N N N
195 N N N N N
196 N N N N N
197 N N N N P
198 P P P N N
199 N N N N P
200 P P P P N
Wyniki badań surowicy płatnych dawców krwi ogólnie potwierdziły wyniki otrzymane na surowicy chorych pacjentów.
Przykład VÓ. Testy typu ELISA dla przeciwciał przeciw HCV z użyciem kombinacji antygenów HCV.
Płytki opłaszczone kombinacją antygenów C22 i C33c przygotowuje się następująco. Tuż przed dodaniem na płytki Removeawell Immulon I (Dynatach Corp.) przygotowuje się roztwór zawierający bufor do opłaszczania (50 mM boranu sodowego, pH 9,0), 21 ml na płytkę, BSA (25 mikrogramów/ml), C22 i C33c (2,5 mikrogramów/ml każdego). Po wymieszaniu przez 5 minut roztwór dodaje się na płytki po 0,2 ml na płytkę. Płytki nakrywa się i inkubuje przez 2 godziny w temperaturze 37°C, po czym roztwór usuwa się przez wysysanie. Studzienki przemywa się 400 mikrolitrami buforu do przemywania (100 mM fosforan sodowy, pH 7,4,140 mM chlorek sodowy, 0,1% (wagowo/objetościowy) kazeiny, 1% (wagowo/objętościowy) Tritonu Χ-100, 0,01% (wagowo/objętościowy) Thimerosalu. Po usunięciu roztworu do przemywania, dodaje się 200 mikrohtrów na studzienkę roztworu ((10 mM fosforan sodowy, pH 7,2,150 mM chlorek sodowy, 0,1% (wagowo/objętościowy) kazeiny, 3% sacharozy i 2 mM fluorku fenylornetylosulfonylu), m 133 płytki lekko się nakrywa, żeby nie parowały i zostawia w temperaturze pokojowej na 30 minut. Następnie wysysa się roztwór ze studzienek i liofilizuje przez noc bez ogrzewania. Przygotowane płytki można przechowywać w temperaturze 2-8°C w zaplombowanych aluminiowych torbach ze środkiem osuszającym (3 g torebki “Sorb-it”).
Dla przeprowadzenia testu ELISA 20 mikrolitrów próbki surowicy lub próbki kontrolnej dodaje się do studzienki zawierającej 200 mikrolitrów rozcieńczalnika (100 mM fosforan sodowy, pH 7,4, 500 mM chlorek sodowy, 1 mM EDTA, 0,1% (wagowo/objętościowy) kazeiny, 1% (wagowo/objętościowy) TritonuX-100,0,1% (wagowo/objętościowy) Thimerosalu, 100 mikrogramów/ml ekstraktu drożdży). Płytki zamyka się i inkubuje przez dwie godziny w temperaturze 37°C, po czym roztwór usuwa się przez wysysanie, a studzienki przemywa się trzy razy 400 mikrolitrami buforu (zbuforowany roztwór fosforanów (PBS) zawierającym 0,05% Tweenu 20). Do przemytych studzienek dodaje się 200 mikrolitrów mysich IgG antyczłowiek sprzężonych z peroksydazą korzenia chrzanu (HRP) rozpuszczonych w rozpuszczalniku do koniugacji firmy Ortho (10 mM fosforan sodowy, pH 7,2, 150 mM chloreksodowy, 50% (objętościowo/objętościowy) płodowej surowicy bydlęcej, 1% (objętościowo/objętościowy) inaktywowanej termicznie surowicy końskiej, 1 mM K3Fe(CN)6, 0,05% (wagowo/objętościowy) Tweenu 20 i 0,02% (wagowo/objętościowy) Thimerosalu). Po jednej godzinie inkubacji w temperaturze 37°C, roztwór usuwa się przez wysysanie, a studzienki przemywa się trzy razy 400 mikrolitrami buforu, który także usuwa się przez wysysanie. W celu określenia ilości związanego koniugatu enzymu dodaje się 200 mikrolitrów roztworu substratu (10 mg dwuchlorowodorku o-fenyloenodwuaminy na 5 ml roztworu wywoływacza). Roztwór wywoływacza zawiera 50 mM cytrynian sodowy doprowadzony do pH 5,1 kwasem fosforowym 10,6 mikrolitra/ml 30% H2O2. Płytki zawierające roztwór substratu inkubuje się w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej, zatrzymuje się reakcję przez dodanie 50 mikrolitrów/ml 4N kwasu siarkowego i mierzy OD. W podobny sposób prowadzi się testy przy użyciu białek połączonych C22 i C33c, i C22, C33c, i S2 i kombinacji antygenów C22 i C100, C22 i S2, C22 i NS5, C22, C33c, i S2, i C22, C100 i S2.
Modyfikacje opisanych wyżej sposób realizacji wynalazku, które są oczywiste dla biegłych w biologii molekularnej, immunologii i dziedzinach pokrewnych, są włączone w zakres przedstawionych dalej zastrzeżeń patentowych.
Spis sekwencji (1) Informacja ogólna:
(i) Zgłaszający: Houghton, Michael
(ii) Choo, Qui-Lim Kuo, George Tytuł wynalazku: Antygeny wirusowego zapalenia wątroby C (HVC) do-
(iii) stosowania w testach immunologicznych na przeciwciała przeciw-HCV Liczba sekwencji: 10
(iv) Adres do korespondencji:
(A) Adresat: Morrison & Foerster
(B) Ulica: 545 Middlefield Road, Suitę 200
(C) Miasto: Menlo Park
(D) Stan: Kalifornia
(E) Kod pocztowy: 94025
(v) Forma odczytu komputerowego:
(A) Typ nośnika: dyskietka
(B) Komputer: kompatybilny z IBM PC
(C) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS
(D) Oprogramowanie: Patentln Release #1.0, wersja #1.25
(vi) Obecne dane zgłoszenia:
(A) Zgłoszenie nr: US PCT/US91/02225
(B) Data zgłoszenia: 29 marca 1991 r.
172 133 (C) Klasyfikacja:
(viii) Informacje o rzeczniku/pełnomocniku:
(A) Nazwisko: Ciotti, Thomas E.
(B) Numer rejestracyjny: 21,013 (C) Numer akt/sprawy: 2300-0101.44 (ix) Informacja na temat telekomunikacji:
(A) Telefon: (415) 327-7250 (B) Telefax: (415)327-2951 (C) Telex: 706141 (2) Informacja na temat sekw. nr ident. 1:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 19 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Krotność nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ix) Opis sekwencji: sekw. nr edent. 1:
GATCCTGGAA TTCTGATAA (2) Informacja na temat sekw. nr ident. 2:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 19 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Krotność nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ix) Opis sekwencji: sekw. nr ident. 2.
AATTTTATCA GAATTCCAG (2) Informacja na temat sekw. nr ident. 3.
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 56 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Krotność nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ix) Opis sekwencji: sekw. nr ident. 3.
GAGTGCTCAA GCTTCAAAAC AAAATGGCTC ACTTTCTATC CCAGACAAAG CAGAGT (2) Informacja na temat sekw. nr ident. 4:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 50 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Krotność nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ix) Opis sekwencji: sekw. nr ident. 4:
GAGTGCTCGT CGACTCATTA GGGGGAAACA TGGTTCCCCC GGGAGGCGAA 50 (2) Informacja na temat sekw. nr ident. 5:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 59 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Krotność nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ix) Opis sekwencji: sekw. nr ident. 5:
GAGTGCTCAA GCTTCAAAAC AAAATGGGGC TCTACCACGT CACCAATGAT TGCCCTAAC
172 133 (2) Informacja na temat sekw. nr ident. 6:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 53 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Krotność nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ix) Opis sekwencji: sekw. nr ident. 6:
GAGTGCTCGT CGACTCATTA AGGGGACCAG TTCATCATCA TATCCCATGC CAT (2) Informacja na temat sekw. nr ident, 7:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 19 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Krotność nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ix) Opis sekwencji: sekw. nr ident. 7:
GAGTGCAGCT TCAAAACAAA ATGAGCACGA ATCCTAAACC TCAAAAAAAA AAC (2) Informacja na temat sekw. nr ident. 8:
(I) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 19 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Krotność nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ix) Opis sekwencji: sekw. nr ident 8:
GAGTGCTCGT CGACTCATTA ACCCAAATTG CGCGACCTAC GCCGGGGGTC TGT (2) Informacja na temat sekw. nr ident. 9:
(i) Charakterystyka setkwenecj:
(A) Długość: 19 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Krotność nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ix) Opis sekwencji: sekw. nr ident. 9:
172 133
GCCAGCCCCC TGATGGGGGC GAGACACTCC CCATGAATCA TCCCCCTTTA «5AACTACTG 60
TCTTCACGCA GAAAGCGTCT AGCCCCATGG GTAATATGAG TTTTCGGGCA CCTCCCAG5AC 120
CCCCCCTCCC GGGAGAGCCA TATTGTGGTC GCGAAACCGG GACATCCCCC G<<TTGC<CAG 180
GACGACCGGG TCCTTTCTTG GATATCACCC CCCAATGCCC GAAAAATTGA GCCTGCCCCC 200
GCAAGACTGC TAGCCGAGTA GTATAGTGłTG CG<5GAA<<5CC TTGGTAJTAAC <A<CTCATA<GC 300
GTGCTTGCGA GTGCCCCGAG AGAGCTCGCG GACCCATACC CCATAAGCAC J<TCCT<A<C 360
CTCAAARAAA AAMCAAACGT MAACCCCAA GGCCACCAAC GAAACGTCAA TTCC<<A<5CTC 420
GCGGTCAGAT CGTTGGTGGA GTGTATACGT tgccccgcccg GGGACCCTAA TTTGA5TGTGC 480
GCGCGACGAG AAAGACTTCC GAGCACAAGC CACCCTCGAGC5 TAGACCGCCG C<C<ATCCC<CA 5421
AGGCTCGTCG GCCCGAGGGC atcacaccta; CC<<CC<ACC<CG5 GTACCCCTTA5 CCCCC^TC^TATC 600
GCAATGAGGG CTGCGGGTGG GCCCGAAAGC tccctcttckcc CCCGTAGCTC «GCCTAGCT 600
GGGGCCCCAC AGACCCCCGG cgtatatcgc gccattttgcas TTACAGCCCC GATACCCCTTA 720
CGTGCGGCTT CGCCGACCTC AT<TG<5TA<AC TAC<C<C<<C5T CCGACACCCC CTTT<CA<GC<C5 780
CTGCCAGGGC CCTGGCGCAT G<<G<TC<CCA5 <T<<CT<5CACGA CCAGCGTAAC TATT<C<<CAG 800
GGAACCTTCC TGGTTGCTCT TT<TC<TTAY<CC tcctttcckacc CCCGCCCCCT ttGCTTCACTC 900
TGCCCGCTTC GGCCTACCAA GTGCGCCCACT CCACCGAGGCT TTACCCACTC AC<C<TGATT< 960
GCCCTAACTC GAGTATTGTG TACGA<A<ACC ccgattcccat CCCGCCCCCT CC<<<GJTGCG 1800
TCCCTTGCGT TCGTGAGGGC AA<ACC<CT<TCA <G5CT5<TTG<5T GGACAATACC C<C<A<CGGTA5 1800
CCACCAGGGA TGGCAAACTC CCCG<ACA<AC< AGCTT<<CSA<C5 TCAACTCCAA <CT<C<<T5T<CC 1882»
GGAGCGCCAC CCTCTGTTCG GCCCTCTATAC T<GGGG5ACC<< AAGCGGGGCC GTTCTTTCTKC 1800
TCGGCCAACT GTTCACCTTC TCTCC<CC<A<C GC<CC<CT<CAC GGACGCACAG TTJ<C<TT<GCT 1800
CTATCTATCC CGGCCATATA ACGCACTCACC GCATTGGCAT5 «ACAATATG atc«cttg5t 1800
CCCCTCCAAC GGCGTTGGTA R^TGCTCACAC <TGCTC<C<5AT CCCACAAGCC ATCTTGGACA 1380
TGATCGCTGG TGCTCACTGG GGAGTCTCCT5 <<AG<CCTAGC GTArrTCTcc AT<A5T<G<GCA 1440
ACTGGGCGAA ggtcctggta G<GC<G5C<G5C TATTTGCCGG CCCTCGACGCG GIC<CC<AC<G5 1500
TCACCGGGGG AAGTGCCGGC CA<AC<AC5<G5T (CTG5ATTTT5T TAGCICTCCTC <GCAC<CA<<CCC 1560
CCAAGCAGAA CGTCCAGCTG AT<TCA<ACC<CC AACCGCAGTTC G<CAC<CT<CCAT A<GCA<C<CCCC 1620
172 133
TGAACTGCAA TGATAGCCTC AACACCGGCT GGTTGGCAGG GCTTTTTCTAT CACCACAAAGT 1660
TCAACTCTTC AGGCTGTCCT GAGAGGCTAG CCAGCTGCCG ACCCCCTTACC GATTTTTGACC 1740
AGGGCTGGGG CCCTATCAGT TATGCCAACG GAAGCGGCCC «SACOAGCJC ccctactgcs 1800
GGCACTACCC CCCAAAACCT TGCGGTATTG TGCCCGCGAA GAGTGTGTTST <GSTC<G<5TAT 1860
attgcttcac TCCCAGCCCC GTGGTGGTGG GAACGACCGA CA<GST<C<G5C GCGCCCACCT 1920
ACAGCTGGGG TGAAAATGAT ACGGACGTCT TCGTCCTTAA <CASTACCA<GS ccaccgctgg 1980
GCAATTGGTT CGGTTGTACC TGGATGAACT CAACTGGATT OSCCJAASGGTS TG<G<SAG<G5C 2040
CTCCTTGTGT CATCGGAGGG GCGGGCAACA ACACCCTGCA CTGCCCCACT GATTGCTTCC 2100
GCAAGCATCC GGACGCCACA TACTCTCGGT GCGGCTCCGG TCCCTGGMTC A<A5CC<AS<GST 2160
GCCTGGTCGA CTACCCGTAT AGGCTTTGGC ATTATCCTTG TACCCATCCAAC TACACCATAT 2220
TTAAAATCAG GATGTACGTG GGAGGGGTCG AACACAGGCT <GJ<AS<CCTG5C TG<AA5CT<<SA 2280
CGCGGGGCGA ACGTTGCGAT CTGGAAGACA GGGACAGGTC <CSAGCT<<S<G5 CCGITACTGC 2340
TGACCACTAC ACAGTGGCAG GTCCTCCCGT GTTCCTTCAC <AACC<SAC<CA GC<<TT3TC<CA 2400
CCGGCCTCAT CCACCTCCAC CAGAACATTG TGGACGTGCA GTACTTTSTAC <<GG3TG<GG5T
CAAGCATCGC GTCCTGGGCC ATTAAGTGGG AGTACGTCGT T<SC<<T5TTC cttctgcttg 2520
CAGACGCGCG CGTCTGCTCC TGCTTGTGGA TGATGCTACT CATATCCCCAS G<GGSA<G5C<GJ 2580
CTTTGGAGAA CCTCGTAATA CTTAATGCAG CATCCCTGGC CCGGSACCGCSC <G5T<<TGTAT 2 640
CCTTCCTCGT GTTCTTCTGC TTTGCATGGT ATTTGAAGGG TTASGITGGSTC CC<GGSA<C<GS 2 700
TCTACACCTT CTACGGGATG TGGCCTCTCC TCCTGCTCCT GTTTGS«STTTS CCCCAGCGGGS 2760
CGTACGCGCT GGACACGGAG GTGGCCGCGT CGTGTGGCGG TGTTTSTTCTC GTC<GCTTGA 2820
TGGCGCTGAC TCTGTCACCA TATTACAAGC GCTATATCAG dTGGTGCTTO T<GST<<5CTTC
agwattttct GACCAGAGTG GAAGCGCAAC TGCACGTGTG GATTCCCCCC CTCAACGTCC 2940
GAGGGGGGCG CGACGCCGTC atcttactca TGTTSTTJCTTJT A<CSCC<CSA<S CTTGSTATTTG 3000
ACATCACCAA ATTGCTGCTG GCCGTCTTCG GACCCCTTTTS GAASCTTCJAS gccagtttgc 3000
TTAAAGTACC CTACTTTGTG CGCGTCCiCAG gccttctccg gttctgcgcg TTAGCGCKSA 3022
AGATGATCGG AGGCCATTAC gtgcgcassts TTCATCSATTAS GGTTAGGGGd CTTACT<<S<CA 3080
CCTATGTTTA TAACCATCTC A<SCCT<T<C CGGGACTGGSC G<CA5<AS<CG5C TTCCGAGATC 3240
172 133
TGGCCGTGGC TGTAGAGCCA GGGGCGTCCT CCCCAAATGA GACCCAGCCC aatcacggcgg 3300
GGGCAGAGAC CGCCGCGTGC GGTGACACCA GCCAACCGCTT CGJCCTGTTrCC ggccgcacgg 3360
gccgggagat ACTGCTCGGG CCACCGCCGA GTAGCGGCCC CCAAGGGCCG ACGGGGCCTGS 3420
CGCCCATCAC GGCGTACGCC CAGCAGACJCA (GGGGCCCCG ACGGCGCACA AGCCACCAGCC 3480
TAACTGGCCG GGACAAAAAC CACAGGCTJACAJ GTGACGCCCCA GATTGTGGCCA ACTCCGGCCC 3540
AAACCTTCCT GGCAACGTGC ATCJCAUTGGG TGIGCTTGTAC G<^^C^^^<^<C^CC (GGCrCCCCGAA 3600
CGAGGACCAT CGCGTCACCC AAGCGGCCTG GCCAGCtCAGAG GGAGACtCAAG GGAGACCCAAG 3660
ACCTTGTGGG CTGGCCCGCT YCG<GCAA3GA SCCGCGCCATG GACCACCCrGC ACTTGOGGCT 3720
CCTCGGACCT TTACCTGGTC ACGACAGTACG CCGAIGGCAC GCCCGGGCGC CCGJCCGGGJTC 3780
ATAGCAGGGG CAGCCTGCTG GCGCCCCCCGC CCATTTCCCTA CTTGAAACGGC GCCTOGGGGG 3840
gtccgcgggt GTGCCCCGCG G<GJCACGCCG GCGGGCATATT GAGGGCOGCG GGGGGCACCC 3900
GTGGAGTGGC TAAGGCGGTG GACTTGAGCC CTGGGGAGTAA CCTAGAGAOA ACCATGACGGG 3960
CCCCGGGGGT CACGGATAAC gccgctccccc (CAGGAGGGCC CICAGACGCTCC CCMGSGtGGCrC 4020
ACCTCCATGC TCCCACAGGC AGCCCGGCAAA CGCACOAAGGG CCCGGCTGCA GATCCAGCGC 4030
agggcgataa GGTGCTAGTA CTCACACCCCG (CTGTTGCTGC AACACGGCGGC GGGCGGGGCGG 4140
ACATGTCCAA GGCTCATGGG AGCGAGCYGA AOAGOAGGAC CCGGGSGGAGA ACCAAGGACCA 4200
CTGGCAGCCC CATCACGTAC GCCACCTACG GOAAGGGCCT GGCCGAOGGC <gg»tcctc<gg 4260
GGGGCGCGGA TGACATAATA atttggggcg AGTGCCACGC CACCGGAGCGCC ACAGCCAGCG 4320
TGGKCATCGG CACTGTCCTT GACCCCAGCAG AGACTGCGGG (GGCGAGACCTG GGGGGGCGCG 4380
CCACCGCCAC CCCTCCGGGC GCCGGCACTG GGCCCCAGCC CAACAGCGAG GACGGTTGCTC 4440
TGTCCACCAC CGGAGAGATC ccggtcgtag (GCAAGGCGAG CCCCCTCGJAA GGAAGCAACGG 4500
GGGGGAGACA TCTCATCTTC GGGCATTCAA AGAAGAAAGGG CGACGAACTC (GCCGCAAAGC 4560
TGGTCGCATT GGGCATCAAT GCCGTCTCCCT ACCTACCiGCGG GCGGGACGGG GCCGGOAGCC 4620
CGACCAGCGG CGATGTTGTC GGCGGGGCAA CCGATGCCCT OATGACCGGC GAGACCGGCG 4630
ACTTCGACTC GGTGATAGAC GRCAAGACGG GTCCGACCCCA GAGAGGCCGAG GGCAGCCTTG 4740
ACCCTACCTT CASCATTGAG ACAAGCAOCG TCCTCGCTCC <C^(C^(^C^<^CAA<C 4800
GTCGGGGCAG GACTGGCAGG G<GGGA3C<CAG GCCATCCTACAG AGGGGGGGOA CCCGGGGGAGC 4860
172 133
GCCCCTCCGG CATGTTCGAC TCGTCCGTCC TCTCTCAGTG CGATAUGAJCA GCGCTCGCGG 4920
GGTATGAGCT CACGCCCGCC GAGACTACAG AGCCCCGGGG CGCGCCC(GGr 4980
GGCTTCCCGT GTGCCAGGAC CATCTTGAAT TTTTTGSACAG CGGCGGGACA GGGCCTGGCG 5040
ATATAGATGC CCACTTTCTA TCCCAGACAA AGCGGAGTGG GGCCACGAGC TGCTACCT¢Gϊ 5100
TAGCGTACCA AGCCACCGTG TGCGCTAGGG CTCAAGCCCC CCCCCCΛGCG GGGGGCCGCG 5160
TGTGGAAGTG TTTGATTCGC CTCAAGCCCA CCCCGTGCCG GCCGGGACCC CGGCGACACA 5220
GACTGGGCGC TGTTCAGAAT GAAATCACCC GGACAGCCGC AGGCACGGGG CACGGCACGA
CATGCATGTC GGCCGACCTG GAGGTCGTCA CGGGGCGGGG GGGCGCGGCG GCGCCCGCGC 5340
TGGCTGCTTT GGCCGCGTAT TGCCTGTCAA CACAGGGTCC <SGGCGGAT^CC GCGGGCCCTG 5400
TCTTGTCCGG GAAGCCGGCA ATCATACCTG ACAGGCGCGG CCGGGG^CGGiGί CGGCGCGAGT 5^4^0
AGATGGAAGA GTGCTCTCAG CACTTACCGT ACAGCTGCGC GGACC'CAT.CA CGCGCCGAAG 5520
AGTTCAAGCA GAAGGCCCTC GGCCTCCTGC AGACCGGCGC CCGGCGGGGGG GCGCCGGGCG 5580
CCCCTGCTGT CCAGACCAAC TGGCAAAAAC GCGGCACCCG CΊGGCGCGGCGCί GGCATGGGGA 5640
ACTTCATCAG TGGGATACAA TACTTGGCGG GCCGTTGGGC GCTGCCGGGG GAGGGCCGGG 5700
TTGCTTCATT GATGGCTTTT ACAGCTGCTG GCACGGCCCC GCGGGGGGGG GCCGGGAGGG 5760
TCCTCTTCAA CATATTGGGG GGGTGGGTGG CGGGCCGCCC TGCGGGCGGC GCGGGCGGGG 5820
CTGCCTTTGT GGGCGCTGGC TTAGCTGGCG CCGGCCCGGG GAGCGGCGGA GCGGCCCAAC 5880
TCCTCATAGA CATCCTTGCA GGGTATGGCG CGGGCGCCTC GGCCCAGGGC GCGCCGGGTG 559 40
AGATCATGAG CGGTGAGGTC CCCTCCACGG RGGGCGGGGC TAGCGGGCGG GCGCGGGCGC 6000
TCTCGCCCGG AGCCCTCGTA GTCGGCGTGG TCTCGCCGCC GAGGCTGCGC CGCGGGGGGG 6060
GCCCGGGCGA GGGGGCAGTG CAGTGGATGA ACGCGGGGGC GGAGGGCGCC CTCCCGCCCG 6120
ACCATGTTTC CCCCACGCAC TACGTGCCGG AGAGGCGCGG GGGCGCCGGC GCTGCGTCCG 6180
TACWCWGCAG CCTCACTGTA ACCCAGCTCC τσΑ^αϊΑστ AGJAGGlGGCιCC 6240
AGTGTACCAC TCCATGCTCC GGTTCCTGGC G7GAGGJACCCG C‘GGCCCCΓ(GC AGAGCCGGCGO 6300
TGTTGAGCGA CTTTAAGACC TGGCTAAAAG CGGACACCAG GC(GCCAGSCΓG C(GGCC5AGCC 6360
CCTTTGTGTC CTGCCAGCGC GGGTATAAGG AGK(XcA<GGcC J^G^<GJ^GG^<GG^C^ίG 6420
CTCGCTGCCA CTGTGGAGCT GAGATCACTG GA<AGGGCAGC AJAAGCCCCA? ATGAGGϊATCG 6480
1712 133
TCGGTCCTAG GACCTGCAGG AACATGTGGA GTGGGACCTT CCCCATTAAT GCCTACACCA 6540
CGGGCCCCTG TACCCCCCTT CCTGCGCCGA ACTACACGTT CGCGCTATGG AGGGTGTCTG 6600
CAGAGGAATA TGTGGAGATA AGGCAGGTGG GGGACTTCCA CTACGTGACG GGTATGACTA 6660
CTGACAATCT CAAATGCCCG TGCCAGGTCC CATCGCCCGA ATTTTTCACA GAATTGGACG 6720
GGGTGCGCCT ACATAGGTTT GCGCCCCCCT GCAAGCCCTT GCTGCGGGAG GAGGTATCAT 6780
TCAGAGTAGG ACTCCACGAA TACCCGGTAG GGTCGCAATT ACCTTGCGAG CCCGAACCGG 6840
ACGTGGCCGT GTTGACGTCC ATGCTCACTG ATCCCTCCCA TATAACAGCA GAGGCGGCCG 6900
GGCGAAGGTT GGCGAGGGGA TCACCCCCCT CTGTGGCCAG CTCCTCGGCT AGCCAGCTAT 6960
CCGCTCCATC TCTCAAGGCA ACTTGCACCG CTAACCATGA CTCCCCTGAT GCTGAGCTCA 7020
TAGAGGCCAA CCTCCTATGG AGGCAGGAGA TGGGCGGCAA CATCACCAGG GTTGAGTCAG 7080
AAAACAAAGT ggtgattctg GACTCCTTCG ATCCGCTTGT GGCGGAGGAG GACGAGCGGG 7140
AGATCTCCGT ACCCGCAGAA ATCCTGCGGA AGTCTCGGAG ATTCGCCCAG GCCCTGCCCG 7200
TTTGGGCGCG GCCGGACTAT AACCCCCCGC TAGTGGAGAC GTGGAAAAAG CCCGACTACG 7260
AACCACCTGT GGTCCATGGC TGTCCGCTTC CACCTCCAAA GTCCCCTCCT GTGCCTCCGC 7320
CTCGGAAGAA GCGGACGGTG GTCCTCACTG AATCAACCCT ATCTACTGCC TTGGCCGAGC 7380
TCGCCASCAG AAGCTTTGGC AGCTCCTCAA CTTCCGGCAT TACGGGCGAC AATACGACAA 7440
CATCCTCTGA GCCCGCCCCT TCTGGCTGCC CCCCCGACTC CGACGCTGAG TCCTWTKCCT 7500
CCATGCCCCC CCTGGAGGGG GAGCCTGGGG ATCCGGATCT TAGCGACGGG TCATGGTCAA 7560
CGGTCAGTAG TGAGGCCAAC GCGGAGGATG TCGTGTGCTG CTCAATGTCT TACTCTTGGA 7620
CAGGCGCACT CGTCACCCCG TGCGCCGCGG AAGAACAGAA ACTGCCCATC AATGCACTAA 7680
GCAACTCGTT GCTACGTCAC CACAATTTGG TGTATTCCAC CACCTCACGC AGTGCTTGCC 7740
AAAGGCAGAA GAAAGTCACA TTTGACAGAC TGCAAGTTCT GGACAGCCAT TACCAGGACC 7800
TACTCAAGGA GGTTAAAGCA GCGGCGTCAA AAGTGAAGGC TAACTTBCTA TCCGTAGAGG 7860
AAGCTTGCAG CCTGACGCCC CCACACTCAG CCAAATCCAA GTTTGGTTAT GGGGCAAAAG 7920
ACGTCCGTTG CCATGCCAGA AAGGCCGTAA CCCACATCAA CTCCGTGTGG AAAGACCTTC 7980
TGGAAGACAA TGTAACACCA ATAGACACTA CCATCATGGC TAAGAACGAG gttttctgcg 8040
TTCAGCCTGA GAAGGGGGGT CGTAAGCCAG CTCGTCTCAT CGTGTTCCCC GATCTGGGCG 8100
172 133
TGCGCGTGTG CGAAAAGATG GCTTTGTACG GAAATAATGA AAAAGTTCCC AGGAACCATA 8110
TGGGAAGCTC CTACGGATTC CAAAACACAC AAAAGAAAGA GAATTAAATG 8220
CGTGGAAGTC CAAGAAAACC CCAAAAGAAA GAACCAAAGA TAAAAGAAGA AAAGACTAAA 1280
CAGTCACTGA GAGCGACATC CGAAAAAAAA GGGAAGAGAA AAAAAGGAAT AAAGCAAACC 8300
CCCAAGCCCG CGTGGCCATC AAAAAGAACA ACCGAAAAAA AAATGTTCAA GAGCAATAGA 8840)
CCAATTCARG GGGGGAGAAC TGCAAGAAGA CAAAAATGCC ACAAGAAAAA GGAACGAAAA 8860
CTAGCTGTGG TAACACCCTC ATAGCGAAAA AAAAAACACG AAAAAAGAGT AAACCACAAG 8200
GGCTCCAGGA CTGCACCATG CGAGTGGAGA AAAAAGAGCA GGAAGTAACT TGAAAAAGAG 8080
CGGGGGTCCA GGAGGACGCG GCACGAACAk AGAAAATTAA GAAAAACAAG ACCAAAGAAA 8640
CCGCCCCCCC TGGGGACCCC CCCCAkCCka AAAACAACAG GAAAGATAAA AAATAAAAAA 8700
CCTCCAACGT GTCAGTCGCC CkCAkCGGAAC ACGAGAAGAA GAATAACAAC CAGACGCGAG 8760
ACCCTACAAC CCCCCTCGCG kGAGAAAGAC AAAAAAAAAA ki^AkACACAC ACAGTCAATA 8820
CCTGGCTAGG CAACATAATC kΊGGGAACCC AAAAAAAGAG GAGAAAAAAG AAAATGATGA 8880
CCCATTTCTT TAGCGTCCTT AGAGCGACAG AAAAAACATA kCkAAGCAAT GAGAGAGAGA 8940
TCTACGGGGC CTGCTACTCC ATATAAAAAC CAGAAAAAGG AGAAAAGAAG CAAAGACTCC 9000
ATGGCCTCAG CGCATTTTCA AACAACAAAG AACTC<AAAA ACGAAATAAA AAAGAAAACG 9060
CATGCCTCAG AAAACTTGGG GAACAACACA TCACAAAACT GAGAAAAAAA GACCAAAGCG 9120
TCCGCGCTAG GCTTCTGGCC AGAGAAAAAA AAGAAAAAAA GIAGI^!^ ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ 9180
ACTGGGCAGT AAGAACAAAG AACTCAkAACA ACAGCAGAGA GAACAAAGAA GAGCAtGAGA 9240
TGTCCGGCTG GTTCACGGCT GGAAATACAA AGAAAAAAAA ATAACACAAA ATAGAAAAAG 9800
CCCGGCCCCG CTGGATCTGG GATTGAAYAC CCTAAGAGAC ACCAGAGGAA CGACTACCAG 0360
TCCTCCCCAA CCGATGAAGG TTGGGGTAAA CACTCCGGCC T
9401
172 133 (2) Informacja na temat sekw. nr ident. 9:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 3011 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Krotność nici: nieznana (D) Topologia: nieznana (ii) Typ cząsteczki: białko (ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: Miejsce zmodyfikowane (B) Miejsce: 9 (D) Inne informacje: /oznaczenie = ArgoLys /uwaga = “Aminokwasem 8 może być albo Arg albo Lys.” (ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: Miejsce zmodyfikowane (B) Miejsce: 11 (D) Inne informacje: /uwaga = “Tym aminokwasem może być albo Asn albo Thr.” (ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: Miejsce zmodyfikowane (b) Miejsce: 176 (D) Inne informacje: /uwaga = Tym aminokwasem może być albo Thr albo Ile.
(ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: Miejsce zmodyfikowane (b) Miejsce: 334 (D) Inne informacje: /uwaga = “Tym aminokwasem może być albo Val albo Met.” (ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: Miejsce zmodyfikowane (B) Miejsce: 603 (D) Inne informacje: /uwaga = “Tym aminokwasem może być albo Ile albo Leu”.
(ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: Miejsce zmodyfikowane (b) Miejsce: 848 (D) Inne informacje: /uwaga = “Tym aminokwasem może być albo Asn albo Tyr.” (ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: Miejsce zmodyfikowane (b) Miejsce: 1114 (D) Inne informacje: /uwaga = “Tym aminokwasem może być albo Pro albo Ser.” (ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: Miejsce zmodyfikowane (b) Miejsce: 1117 (D) Inne informacje: /uwaga - 'Tym aminokwasem może być albo Ser albo Thr.
(ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: Miejsce zmodyfikowane (b) Miejsce: 1276 (D) Inne informacje: /uwaga - “Tym aminokwasem może być albo Leu albo Pro.”
172 133 (ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: Miejsce zmodyfikowane (B) Miejsce: 1328 (D) Inne informacje: /uwaga = “Tym aminokwasem może być albo Gly albo Val.” (ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: Miejsce zmodyfikowane (b) Miejsce: 1454 (D) Inne informacje: /uwaga = “Tym aminokwasem może być albo Tyr albo Cys.” (ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: Miejsce zmodyfikowane (b) Miejsce: 1471 (D) Inne informacje: /uwaga =Tym aminokwasem może być albo Ser albo Thr.
(ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: Miejsce zmodyfikowane (B) Miejsce: 1877 (D) Inne informacje: /uwaga = “Tym aminokwasem może być albo Glu albo Gly.” (ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: Miejsce zmodyfikowane (b) Miejsce: 1948 (D) Inne informacje: /uwaga =Tym aminokwasem może być albo His albo Leu.
(ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: Miejsce zmodyfikowane (b) Miejsce: 1949 (D) Inne informacje: /uwaga =Tym aminokwasem może być albo Cys albo Ser.
(ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: Miejsce zmodyfikowane (b) Miejsce: 2021 (D) Inne informacje: /uwaga =Tym aminokwasem może być albo Gly albo Val.
(ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: Miejsce zmodyfikowane (b) Miejsce: 2349 (D) Inne informacje: /uwaga -'Tym aminokwasem może być albo Thr albo Ser.
(ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: Miejsce zmodyfikowane (b) Miejsce: 2385 (D) Inne informacje: /uwaga = “Tym aminokwasem może być albo Phe albo Tyr.” (ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: Miejsce zmodyfikowane (b) Miejsce; 2386 (D) Inne informacje: /uwaga = “Tym aminokwasem może być albo Ser albo Ala.” (ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: Miejsce zmodyfikowane
172 133 (B) Miejsce: 2502 (D) Inne informacje: /uwaga = “Tym aminokwasem może być albo Leu albo Phe.” (ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: Miejsce zmodyfikowane (b) Miejsce: 2690 (D) Inne informacje: /uwaga = “Tym aminokwasem może być albo Gly albo Arg.” (ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: Miejsce zmodyfikowane (b) Miejsce: 2921 (D) Inne informacje: /uwaga =Tym aminokwasem może być albo Gly albo Arg.
(ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: Miejsce zmodyfikowane (B) Miejsce: 2996 (D) Inne informacje: /uwaga = “Tym aminokwasem może być albo Leu albo Pro” (ix) Opis sekwencji: sekw. nr ident. 10:
Met 5 Ser Thr Asn Pro 5 Lys Pro Gin Xaa Lys 10 Xaa Lys Arg Asn Thr 15 Asn
Arg Arg Pro Gin 20 Asp Val Lys Phe Pro 25 Gly Gly Gly Gin He 30 Val Gly
Gly Val Tyr 35 Leu Leu Pro Arg Arg 40 Gly Pro Arg Leu Gly 455 Val Arg Ala
Thr Arg 50 Lys Thr Ser Glu Arg 55 Ser Gin Pro Arg Gly 60 Arg Arg Gin Pro
Ile 65 Pro Lys Ala Arg Arg 70 Pro Glu Gly Arg Thr 71 Trp Ala Gin Pro Gly 80
Tyr Pro Trp Pro Leu 85 Tyr Gly Asn Glu Gly 90 Cys Gly Trp Ala Gly 95 Trp
Leu Leu Ser Pro 100 Arg Gly Ser Arg Pro 105 Ser Trp Gly Pro Thr 111 Asp Pro
Arg Arg Arg 115 Ser Arg Asn Leu Gly 120 Lys Val Ile Asp Thr 125 Leu Thr Cys
Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu 130 135 140
172 133
Gly Gly Ala 138 Ala Arg Ala Leu Ala His 150 Gly Val Arg Val Leu Glu Asp
155 160
Gly Val Aen Tyr Ala Thr Gly Αβη Leu Pro Gly Cfe Ser Phe Seir Xaa
105 170 17 5
Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Ccs Llu Thr Val Pro Ala Ser Alei TT^r
180 188 190
Gin Val Arg Asn Sep Thr Gly Leu Typ His Val Thr Asn Asp Cys Ppo
195 200 205
Aen Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Ala He Leu His Thr Ppo
210 215 2^<0
Gly Cys Val Pro Cye Val Apg Glu Gly Asn Ala Ser Arg <Cs Trp Val
228 230 235 2^0
Ala Met Thr Pro TTp Val Ala Thr Arg Aep Gly Lye Leu Pipo Ala Thh
235 250 255
Gin Leu Arg Arg His Ile Asp Leu Leu Val Gly Ser Ala Thr Leu Cys
200 220 270
Ser Ala Leu TTy Val Gly Aep Leu Ces Gly Ser Val Phe Leu Val Gly
275 228 285
Gin Leu Phe Thr Phe Ser Ppo Arg Arg His Tpp Thr TTp Gin Gly Cys
290 295 3(^0
Asn Cys Seir He Tyr Pro Gly Hie He Thr Gly Hia JArg MmS Ala Trp
305 310 315 332)
Asp Met Met Met Άβ n Ppp Spr Poo Tpr hhr Al a euu Val aaa Aa a Gnn
325 330 33 3
Leu Leu Arg Ile Ppo Gin Ala Ile Leu Asp Met Ile Ala Gly Ala His
330 345 350
Trp Gly Val Leu Ala Gly Ile Ala Tyc Phe Ser Met Val Gly Asn Trp
355 330 365
Ala Lys Val Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Gly Val Aep Ala Glu
370 375 3S0
Thr His Val Thr Gly Gly Ser Ala Gly His TłhT Val Ser Gly Phe Val
385 390 395 400
Ser Leu Leu Ala Ppo Gly Ala Lys Gin Asn Val Gin Leu Ile Asn Thr
305 410 415
Asn Gly Ser TTp Hie Leu Aen Ser Thh Ala Leu Aen Cye Aen Aep Ser
320 432 430
172 133
Leu Asn Thr 435 Gly Trp Leu Ala Gly 444 Leu Phe Tyr His His 44 4 Lys Phe Ain
Ser Ser 450 Gly Cys Pro Glu JAg 455 Leu Ala Ser Cce JAg 440 Pito Leu Thh Aip
Phe 465 Asp Gin Gly Tjp> Gly 440 Pro He Ser Tyr Ala 445 Asn Gly Ser Gly Pro 440
Asp Gin Arg Pro Tyr 485 Cys Tjp> His Tyr Pro 490 Pro Lys Pro Cys Gly 445 He
Val Pro Ala Lys 500 Ser Val (tys Gly Pro 555 Val Tyr Cys Phe Thr 510 Pro Ser
Pro Val Val 515 Val Gly Thr Thr Αβρ 520 Arg Ser Gly Ala Pro 555 Thr Tr Ser
Trp Gly 530 Glu Aen Asp Tłir Asp 535 Val JPl^e Val Leu Aan 540 Asn Thr JAg Pro
Pro 545 Leu Gly Asn Trp Phe 550 Gly Cys Thr Trp Mee 555 Asn Ser: Thr Gly Phe 560
Thr Lys Val Cys Gly 565 Ala Pito Poo (tya Val 570 Ile Gly Gly Ala Gly 555 Asn
Asn Thr Leu Hie 580 Cys Pro Thr Asp <C/e 585 Phe Arg Lys His Pro 550 Asp Ala
Thr Tyr Ser 595 JAg (tys Gly Ser Gly 600 Pro Trp Xaa Thr Pro 665 JAg φτ'β Leu
Val Asp 610 Tyr Poo Tyr Arg Leu 615 Trp) Hie Tyr Pro Cys 620 Tłu: Ile Asn ^fr
Thr 625 Ile Phe Lys He Arg 630 Met tyr Val Gly Gly 635 Val Glu His Arg Leu 660
Glu Ala AAa Cys Asn 645 Trp Thr JAg Gly Glu 650 JAg cys Asp Leu Glu 65!3 Aep
Arg Asp Arg Ser 660 Glu Leu Ser Pro Leu 666 Leu Leu Thr Thr Thr 6-70 Gin Trp
Gin Val Leu 675 Pro Cys Ser Phe Thr 660 Thr Leu Pro Ala Leu 685 Ser Thr Gly
Leu Ile 690 His Leu His Gin Asn 665 Ile Val Asp Val Gin 700 Tyr Leu Tyr Gly
Val 705 Gly Ser Ser Ile Ala 710 Ser tjp> Ala He Lye 7X5 Trp Glu Tyr Val Val 770
172 133
Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ser Cys Leu Trp
205 200 204
Met Met Leu Leu Ile Ser Gin Ala Glu Ala Ala Leu Glu Asn Leu Val
220 725 720
Ile Leu Asn Ala Ala Ser Leu Ala Gly Thr His Gly Leu Val Ser Phe
2S4 200 765
Leu Val Phe Phe Cys Phe Ala Trp (tyr Leu Lys Gly Lys Tip> Val Pro
220 775 7S0
Gly Ala Val Tyr Thr Phe Tyr Gly Met Trp Pro Leu Leu Leu Leu Leu
204 290 795 800
Leu Ala Leu Pro Gin Arg Ala Tyr Ala Leu Asp Thr Glu Val Ala Ala
004 800 815
Ser Cys Gly Gly Val Val Leu Val Gly Leu Met Ala Leu Thr Leu Ser
000 800 800
Pro Tyr Tyr Lys Arg Tyr Ile Ser Trp Cys Leu Trp Trp Leu Gin Xii
004 020 845
Phe Leu Thr Arg Val Glu Ala Gin Leu His Val Trp Ile Pro Pro Leu
040 855 860
Asn Val Arg Gly Gly Arg Asp Ala Val Ile Leu Leu Met Cys Ala Val
004 870 875 880
His Pro Thr Leu Val Phe Asp Ile Thr Lys Leu Leu Leu Ala Val Phe
004 890 895
Gly Pro Leu Trp He Leu Gin Ala Ser Leu Leu Lys Val Pro Tyr Phe
900 900 990
Val Arg Val Gin Gly Leu Leu Arg Phe Cys Ala Leu Ala Arg Lys Met
984 900 945
Ile Gly Gly His Tyr Val Gin Met Val Ile Ile Lys Leu Gly Ala Leu
900 93 ii 940
Thr Gly Thr Tyr Val Tyr Asn His Leu Thr Pro Leu Arg Asp Trp Ala
924 950 9 55 960
His Asn Gly Leu Arg Asp Leu Ala Val Ala Val Glu Pro Val Val Phe
904 970 975
Ser Gin Met Giu Thr Lys Leu He Thr Trp Gly Ala App Thr Jda JMa
900 985 990
Cys Gly Asp Ile Ile Asn Gly Leu Pro Val Ser Ala Arg Arg Gly Arg
994 8^^0 1005
172 133
du He Leu Leu Gly Pro Ala Aep Gly Met Val Ser Lye dy Trp Arg
1010 1015 1010
Leu Leu Ala 1015 Aro Ile Thr Ala Tyr 1030 Ala Gly Gly Thr Arg Gly Leu Leu 1035 1040
dy Cye Ile Ile Thr Ser Leu Thr 1045 dy Arg Aep Lye Aey Gly Val Glu 1000 1055
dy du Val Gly Ile Val Ser Thr 1060 Ala Ala Gly Thr Phe Leu Ala Thr 1065 1070
Cye Ile Asn dy 1075 Gall Cys Τιη? ThC Val Tyr HiT G ly Ala G1t Thr Arg 1080 1085
Thr Ile Ala 1020 Ser Pro Lye Gly Pro 1095 Val Ile dy Met Tyr Thr Aey Val 1100
Asp Gly Aep 1105 Leu Val Gly Trp Pro 1110 Ala Xaa Gin Gly Xaa Arg Ser Leu 1155 1110
Thr Pro Cye Thr Cys Gly Ser Ser 1H5 Aep Leu lyr Leu Val Thr /Arg Ais 1130 1355
Ala Aep Val Ile Aro Val Arg Arg 1140 Arg Gly Aep Ser Arg Gly Ser Leu 1145 1150
Leu Ser Pro Aro 1155 Arg Ile Peo Tyr Leu Sys G1t Ser Ser Gly Gly Gry 1160 1165
Leu Leu Cye 1170 Pro Ala Gly His Ala 1155 Val Gly ile Phe Arg Ala Ala Val 1180
Cye Thr Arg 1185 Gly Val Ala Lys Ala 1190 Val Asp Phe Ile Poo Val Glu Aey 1255 1100
Leu Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro H05 Val Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro 1210 1155
Aro Val Val Pro Gly Ser Phe dy 1110 Val Ali Ale Leu Aie Ala Pro Thr 1125 1230
Gly Ser Gly 1135 Lye Ser Thr Lye Val Pro Ala Ali Tyr Ala Ala dy dy 1245 1245
Tyr Lye Val 1150 Leu Val Leu Asn Pro 1255 Ser Val Ala Ali Thr Leu Gly Phe H60
Gly Ala Tyr 1165 Met Ser Lye Ala Aie 1270 Gly Ile Aep Xii Aey Ile Arg Thr 1275 1180
Gly Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr
1285 1290 1295
172 133
Gly Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile
2000 1308 0210
Ile He Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu 2025 2020 1355 Xaa
Ile Gly Thr 2000 Val Leu Asp Gln Ala 1335 Glu Thr Ala Gly Ala 1340 Arg Leu Val
Val Leu Ala 2045 Thr Ala Thr Pro Pro 2050 Gly Ser Val Thr Val 2055 Pro His Pro 2060
Asn Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser 2005 Thr Thr Gly Glu Ile 1270 Pro Phe Tyr 1275
Gly Lys Ala Ile Pro Leu Glu Val 2000 Ile Lys Gly Gly Arg 2005 His Leu 1900 Ile
Phe Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu 2095 2400 1405 Val
Ala Leu Gly 24W Ile Asn Ala Val Ala 1415 Tyr Tyr Arg Gly Leu 1420 Asp Val Ser
Val Ile Pro 2425 Thr Ser Gly Asp Val 2400 Val Val Val Ala Thr 2435 Asp Ala Leu 2440
Met Thr Gly Tyr Thr Gly Asp Phe 2445 Asp Ser Val Ile Asp U50 Xaa Asn Thr 1255
Cys Val Thr Gln Thr Val Asp Phe 2400 Ser Leu Asp Pro Thr 2405 Phe Xaa 4400 Ile
Glu Thr Ile Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gin Arg 2475 1480 1485 Arg
Gly Arg Thr 2490 Gly Arg Gly Lys Pro 1495 Gly Ile Tyr Arg Phe 1250 Val Ala Pro
Gly Glu Arg 2505 Pro Ser Gly Met Phe 2520 Asp Ser Ser Val Leu 4825 Cys Glu Cys 2520
Tyr Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr 2525 Glu Leu Thr Pro Ala 1230 Glu Thr 1287 Thr
Val Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn 2540 Thr Pro Gly Leu Pro 2858 Val Cys 1550 Gln
Asp His Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile
2555 2500 2.565
Asp Ala His Phe Leu Ser Gin Thr Lys Gin Ser Gly Glu Asn Leu Pro
2570 1275 1180
172 133
Tyr Leu 1585 Val Ala Tyr Gin Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gin Ala Pro
1590 1591 1600
Pro Pro Ser Trp Asp Gin Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu 1605 1610 Lys Pro 1161
Thr Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr 1620 1625 Arg Leu Gly Ala 1630 Val Gin 1
Asn Glu Ile Thr 1635 Leu Thr His Pro Val Thr 1640 Lys Tyr Ile Met 1145 Thr Cys
Met Ser Ala Asp 1650 Leu Glu Val Val Thr Ser 1651 Thr Tip» Val Leu 1660 Val Gly
Gly Val 1665 Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Cys 1670 Leu Ser Thr Gly 1671 Cys Val 1680
Val Ile Val Gly Arg Val Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile 1685 1690 Ile Pro 1165
Asp Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp 1700 1705 Glu Met Glu Glu Cys Ser 1710
Gin His Leu Pro 1715 Tyr Ile Glu Gin Gly Met 1720 Met Leu Ala Glu 1125 Gin Phe
Lys Gin Lys Ala 1730 Leu Gly Leu Leu Gin Thr 1355 Ala Ser Arg Gin 1740 Ala Glu
Val Ile 1745 Ala Pro Ala Val Gin Thr Asn Trp 1750 Gin Lys Leu Glu 17 55 Thr Phe 1760
Trp Ala Lys His Met Trp Asn Phe Ile Ser Gly Ile Gin Tyr 1765 1770 Leu Ala 1177
Gly Leu Ser Thr Leu Pro Gly Asn Pro Ala 1780 1785 Ile Ala Ser Leu Met Ala 1790
Phe Thr Ala Ala 1795 Val Thr Ser Pro Leu Thr 1800 Thr Ser Gin Thr 1805 Leu Leu
Phe Asn Ile Leu 1810 Gly Gly Trp Val Ala Ala 1850 Gin Leu Ala Ala 1820 Pro Gly
Ala Ala 1825 Thr Alit Phe Val Vly Gla Gly Leu 1830 Aya Gly Ala Ala 1835 Ile Aly 1840
Ser Val Gly Leu Gly Lys Val Leu Ile Asp Ile leni Ala Gly Tyr Gly
1845 1850 1S55
Ala Gly Val Ala Gly Ala Leu Val Ala Phe Lys Ile Met Ser Gly Glu 1860 1865 1870
172 133
Val Pro Ser Thr 1875 Xaa Asp Leu Val Asn 1880 Leu Leu Pro Ala Ile 1885 Leu Ser
Pro Gly Ala Leu Val Val Gly Val Val Cys Ala Ala He Leu Arg Arg
1890 1895 1900
His Val Gly Pro Gly Glu Gly Ala Val Gin Trp Met Asn Arg Leu Ile
1905 1910 1915 1920
Ala Phe Ala Ser Arg Gly Asn His Val Ser Pro Thr His Tyr Val Pro
1925 1930 1935
Glu Ser Asp Ala Ala Ala Arg Val Thr Ala Ile Xaa Xaa Ser Leu Thr
1940 1945 1900
Val Thr Gin Leu Leu Arg Arg Leu His Gin Trp Ile Ser Ser Glu Cys
1955 1960 1965
Thr Thr Pro Cys Ser Gly Ser Trp Leu Arg Asp Ile Trp Asp Trp
1970 1975 1980
Cys Glu Val Leu Ser Asp Phe Lys Thr Trp Leu Lys Ala Lys Leu Met
1985 1990 1995 2000
Pro Gin Leu Pro Gly Ile Pro Phe Val Ser Cys Gin Arg Gly Tyr Lys
2005 2010 2015
Gly Val Trp Arg Xaa Asp Gly Ile Met His Thr Arg Cys His Cys Gly
2020 2025 0000
Ala Glu Ile Thr Gly His Val Lys Asn Gly Thr Met Arg Ile Val Gly
2035 2040 2045
Pro Arg Thr Cys Arg Asn Met Trp Ser Gly Thr Phe Pro Ile Asn Ala
2050 2055 2060
Tyr Thr Thr Gly Pro Cys Thr Pro Leu Pro Ala Pro Asn Tyr Thr Phe
2065 2070 2075 2080
Ala Leu Trp Arg Val Ser Ala Glu Glu Tyr Val Glu Ile Arg Gin Val
2085 2090 2095
Gly Asp Phe His Tyr Val Thr Gly Met Thr Thr Asp Asn Leu Lys Cys
2100 2105 2100
Pro Cys Gin Val Pro Ser Pro Glu Phe Phe Thr Glu Leu Asp Gly Val
2115 2120 2125
Arg Leu His Arg Phe Ala Pro Pro Cys Lys Pro Leu Leu Arg Glu Glu
2130 2135 2140
Val Ser Phe Arg Val Gly Leu His Glu Tyr Pro Val Gly Ser Gin Leu
2145 2150 2155 2160
172 133
Pro Cye Glu Pro du Pro Aep Val Ali Val Leu Thr Ser Met Leu Thr
1165 2170 2175
Aep Pro Ser Aie He Thr Ali 1180 du Ali Ali dy Arg 1185 Arg Leu Ali Arg 2190
dy Ser Pro 1125 Pro Ser Val Ali Ser Ser Ser Ais Ser 1100 Gly Leu Ser Ali 2205
Pro Ser Leu H10 Lye Ali Thr Cye H15 Thr Ali Aey Aie Aep 1 1110 Ser Pro Aep AIs i
du Leu Ile 1115 Glu Ali Aey Leu H30 Leu Trp Arg Gly du H35 Met Gly dy Aey H40
Ile Thr Arg Val Glu Ser Glu 1145 Aey Lye Val Val Ile 5146 Leu Aep Ser Phe 2255
Aep Pro Leu Val Ali du Glu H60 Aep Glu Arg Glu Ile 2265 Ser Val Pro Ali 2270
du Ile Leu Arg Lye Ser Arg H75 Arg Phe Ali GL· Ali H80 Leu Pro Val Trp 2285
di AAg Ppo 1120 Asp Tyr Asn Pro Pro Leu Val Glu Thr Trp Lys Lys Pas 1125 1300
Aep Tyr du 1305 Pro Pro Val Val 1310 Ale dy Cye Pro Leu 1315 Pro Pro Pro Lye 1310
Ser Pro Pro Val Pro Pro Pro 1315 Arg Lye Lye Arg Thr 1330 Val Val Leu Thr 2135
du Ser Thr Leu Ser Thr Ali 1340 Leu Ali Glu Leu Ali 2355 Xis Arg Ser Phe 2350
dy Ser Ser Ser Thr Ser Gly 1355 Ile Thr dy Aep Aey 2360 Thr Thr Thr Ser 2365
Ser Glu Pro 1370 Ali Pro Ser Gly Cye Pro Pro Aep Ser Aep Ali Glu Ser 2375
Xii Xii Ser 1385 Met Pro Pro Leu 1320 du Gly Glu Pro Gly 1325 Aep Pro Aep Leu 1400
Ser Aep Gly Ser Trp Ser Thr 1405 Val Ser Ser Glu Ali 1410 Aey Ali du Aep 2111
Val Val Cye Cye Ser Met Ser Tyr Ser Trp Thr Gly Ali Leu Val Thr
1410 4155 2430
Pro Cye Ali Ali Glu Glu Gly Lye Leu Pro Ile Aey Ali Leu Ser Aey 1435 1440 2445
172 133
Ser Leu Leu JArg His His Asn Leu Val Tyr Ser Thr Thr Ser Arg Ser
2450 2555 2460
Ala Cys Gln Arg Gln Lys Lys Val Thr Phe Asp Arg Leu Gln Val Aeu
2405 2470 2475 2480
Asp Ser His Tyr Gln Asp Val Leu Lys Glu Val Lys Ala Ala Ala Ser
2405 2440 2249
Lys Val Lys Ala Asn Xaa Leu Ser Val Glu Glu Ala Cys Sip Aeu Thr
2500 2505 2510
Pro Pro His Ser Ala Lys Ser Lys Phe Gly Tyr Gly Ala Lys Asp Val
2525 2520 2525
Arg Cys His Ala Arg Lys Ala Val Thr His Ile Asn Ser Val Trp Ays
2500 5055 2540
Asp Leu Leu Glu Asp Asn Val Thr Pro Ile Asp Thr Thr Ile Met Ala
2545 2550 2555 2560
Lys Asn Glu Val Phe Cys Val Gln Pro Glu Lys Gly Gly Arg Ays Pro
2505 2570 2257
Ala Arg Leu Ile Val Phe Pro Asp Leu Gly Val Arg Val Cys Glu Lys
2500 2585 2590
Met AAa Leu Lyr Tsp Val Aal Thv Lys Teu Pss Leu Alu Val Met L1u
2595 2601
Ser Ser Tyr Gly Phe Gln Tyr Ser Pro Gly Gln Arg Val Glu Phe Leu
2020 225 5 2620
Val Gln Ala Trp Lys Ser Lys Lys Thr Pro Met Gly Phe Sip Tyr Asp
2025 2630 2635 2640
Thr Arg Cys Phe Asp Ser Thr Val Thr Glu Ser Asp Ile Arg Thr Glu
2β45 2205 2205
Glu Ala Ile Tyr Gln Cys Cys Asp Leu Asp Pro Gln Ala Arg Val Ala
2000 2665 2670
Ile Lys Ser Leu Thr Glu Arg Leu Typ Val Gly Gly Pro Leu Thr Asn
2075 2000 2685
Ser Xaa Gly Glu Asn Cys Gly Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Ser Gly Val
2090 2695 2700
Leu Thr Thr Ser Cys Gly Asn Thr Leu Thr Cys Tyr Ile Ays Ala Arg
2705 2710 2715 2720
Ala Ala Cys Arg Ala Ala Gly Leu Gln Asp Cys Thr Met Leu Val Cys
2725 2230 2270
172 133
Gly Asp Asp Leu Val Val Ile Cys Glu Ser Ha Gly Val Gin Glu Asp
2740 2745 2750
Ala Ala Ser Leu Arg Ala 2755 Phe Thr Glu Ala 2760 Met Thr Arg Tyr Ser Ha 2765
Pro Pro Gly Asp Pro Pro 2770 Gin Pro Glu Tyr 2775 Asp Leu Glu Leu Ile Thr 2780
Ser Cys Ser Ser Asn Val Ser 2785 2790 Val Ala His Asp Gly Ala Gly Lys Arg 2755 2800
Val Tyr Tyr Leu Thr Arg 2805 Asp Pro Thr Thr Pro Leu Ha Arg Ala Ha 2810 2811
Trp Glu Thr Ala Arg His 2820 Thr Pro Val Asn 2825 Ser Trp Leu Gly Asn Ile 2830
Ile Met Phe Ala Pro Thr 2835 Leu Trp Ala Arg 2840 Met Ile Leu Met Thr His 2845
Phe Phe Ser Val Leu Ile 2850 Ala Αρ Asp Gin 2855 Leu Glu dn Ala Luu App 2860
Cys Glu Ile Tyr Gly Ala Cys 2865 2870 Tyr Ser Ile Glu Pro Leu Asp Leu Pro 2875 2880
Pro Ile Ile Gin Arg Leu 2885 His Gly Leu Ser Ala Phe Ser Leu His Ser 2280 2285
Tyr Ser Pro Gly Glu Ile 2500 Asn Arg Val Ala 2905 Ala Cys Leu Arg Lys Leu 2910
Gly Val Pro Poo euu Arg 2515 Ala Tp Xaa His 2920 Arg Ala Ap See Vvl tog 2925
Ala Arg Leu Leu Ala Arg 2530 Gly Gly Arg Ha 2535 Ala Ile Cys Gly Lys Tyr 2940
Leu 2545 Phe Asn Tp Ala Val Vrg i 2950 Arg Lys Ter Lys Leu LLu Pro I lii Ala 2955 2960
Ala Ala Gly Gin Leu Asp 2565 Leu Ser Gly Trp Phe Thr Ala Gly Tyr Ser 2970 2975
Gly Gly Asp Ile Tyr His 2580 Ser Val Ser His 2985 Ala Arg Pro tog Trp Ile 2990
Trp Phe Ctys Xaa Leu Leu Leu Ala Ala Gly Val Gly Ile Tyc Leu Leu
2555 3000 3005
Pro Asn Arg 3010
172 133
< Eh 0 0 < Eh < Eh Eh rf 0 0 C 0 0 CPU 0
0 0 < Eh Eh < 0 0 0 0 < Eh Ή < H Li 0 0
0 0 Eh rf < Eh 0 0 < Eh 0 U 0 0 0 < < Eh
0 0 0 0 0 0 Eh rf Eh < 0 0 0 rf Eh cnu 0
0 0 Eh rf 0 0 Eh rf 0 0 0 0 Li 0 0 Li 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 < Eh 0 0 CL 0 0 <00
0 0 0 0 < Eh Eh rf 0 0 0 0 CP0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 Eh rf 0 0 0 0 Li 0 0 Li 0 0
Eh rf rf Eh rf Eh Eh rf 0 0 0 0 <00 CL 0 0
< Eh rf Eh 0 0 0 0 0 0 0 0 CPEh < 0 0 U
0 0 < Eh 0 0 0 0 < Eh Eh < U 0 0 O Eh <
Eh < 0 0 0 0 Eh rf Eh rf 0 0 <00 fi Eh <
0 0 < Eh 0 0 0 0 0 0 < Eh C 0 0 3 0 0
0 O 0 0 0 0 0 0 0 0 0 U w 5 O Eh <
0 0 0 0 0 0 0 0 Eh < 0 0 rf rf Eh fi Eh rf
0 0 0 0 Eh rf 0 0 0 0 0 0 Li 0 0 Li 0 0
0 0 < Eh 0 0 0 0 < Eh Eh *$ fi 0 0 X Eh
0 0 0 0 0 0 < Eh 0 0 Eh rf Eh < Eh Eh Eh <
< Eh Eh < 0 0 0 0 < Eh 0 0 C 0 0 rH E-t rf
0 0 Eh rf 0 0 0 0 < Eh 0 0 W < Eh (0 Eh rf
0 0 0 0 0 0 < Eh 0 0 Eh rf rf rf Eh >00
0 0 Eh rf 0 0 0 0 0 0 0 0 σ'Eh rf X Eh
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Li 0 0 H 0 0
Eh rf < E* < Eh 0 0 0 0 <00 0 0 0
rH 0 0 0 0 0 0 0 0 < Ej CO < Eh >iEh <
« < Eh 0 0 0 0 0 0 Eh rf >< Γ <-H 0 0
D Eh rf < Eh 0 0 0 0 < Eh ·“} < Eh 0 0 0
1 0 0 0 0 h* 0 0 0 0 Li fi 0 0 Ή Eh rf
SB 0 0 Eh rf Eh rf Eh rf fi 10 rf Eh <0 Eh rf
Eh < 0 0 0 0 Eh rf < Eh >00
<
β ο
Ε υ
g8
Ο 0 υ δ ου
Λ! Εη
Eh rf 0 0
0 0 0 0
EH rf Eh rf
0 0 0 0
0 0 0 0
0 0 Eh rf
0 0 0 0
Eh < Eh rf
0 0 0 0
< Eh rf Eh
0 0 0 0
Eh rf Eh <
< < Ej
< |h Eh <
0 0 0 0
Eh rf rf Ej
< Eh Eh <
0 0 Eh rf
0 0 0 0
< Eh 0 0
0 0 0 0
0 0 0 0
Eh rf Eh <
0 0 < Eh
< Eh 0 0
0 0 0 0
θ'
rH «η
r> 1 Ci 1
ο υ ο 0 ο ο < Εη 0 0 rf Ej Εη < Ο U
SB Β ο ο υ υ ο u 0 υ ο 0 υ es gs u 0 u Η rf o u u 0 0 □ u e g
Eh < 0 0 0 0 EH < 0 0
O U U 0 0 0 0 ii u o 0 0 U 0 Eh < 0 0 0 0 0 0
ZS
0 □ 0 □ 0 < Eh 0 0 0 0 Eh rf 0 U U 0 U 0 g 8 < Eh Eh rf 0 0 O 0 Eh rf 0 0 Eh rf 0 0 (H 0 0 0 Obrf Li 0 0 CL 0 0 (0
3:..
O Eh rf Li 0 0 CL 0 0 fi Eh rf
SSB
Li 0 0 fi O 0 Eh < Eh Li 0 0 <1)0 0 W < Eh 4J 0 0 0 Eh rf X < Eh
0 0 e·) Eh tśi H rf Eh fi 0 O Ή < Eh 0 0 0 >.Eh rf (-i 0 0 0 0 0 >10 0 H00 0 0 0 >iEh rf H00 0 0 0 0 0 0 Li 0 0 CL 0 0 O 0 0 fi Eh rf CL Eh 3 (0 0 0 >< Eh »J < Eh rH 0 0 « Eh rf >00 CL O 0 (0 rf Eh <00
I σ>
r>
σ\ r* rH
V£>
172 133 u
o
Ll
CL c
u o u ϋ U ϋ o u < E ooo E < o ϋ ϋ u CLO u Li O U E ’
IC
E Li £
Ε < E cno u Li O < < . >iU o rH O O ooo 3 0 0 Ή < E OOO * O O O O CL O O Ο'Ο O Ll O O < O O CnE < Li O O < O O <8 R < rH O O < o o 0) o o ooo Li O O CL O O
O
L<
CL
Li
O Eh ω o o WE< O O E □
Φ 4) □
0)
4) cuo o Li O O Eh E X Ή O O OOO 10 o o Ή O O < o o CLO O Li O O Eh Ei < >iO O rH O O OOO U O O SkO O O E < >0 O rH O O OOO 3 0 0 rH < E OOO C E <
>iU O «Η O O OOO Li Eh < SX Eh Eh E < O O
O O o o E < O o
O o o o Li O O Φ O O Eh < cno o Li O O < < cnE Li O O < O O cno o Li O O < O O OOO Li O O CL O O CLO O W < E < O O Li < Eh J3 O O Eh < Eh OOO Li O O CL O O >,O O rH O O OOO CLO O Li O O Ε E < Li O O Φ O O W < E 0
Eh <
i-l O o CLO O
10 E < CO < E
> O o < O O
3 O o 3 < E
Φ E < rH < E
43 O o U o O
0 O o 3 O O
Li o o Φ E
CL o o ►4 O o
Φ < E —1 £-i
ι—1 E < (0 E 2
1—1 < E > O o
Li O O cno o
X E Li O o
Ε E < < O o
>o o rH O o
rH o o (0 E <
o o o > O o
4J o o >.O o
Φ E rH O o
s < E O o o
3 O O W E <
Φ E < •H E
JOO s o o
CLO O (0 o o
CO E rH O o
O O < O o
10 o O 3 O o
rH o o Φ E <
o o (4 O o
Φ o o <0 O o
S6Ś >iO O ι-H O O OOO CO O O >iO O O EH < Li O O Λ O O Ε < E |h 5
JUO Li O O
Ή O O < O O Ο'Ο o Li O O < < Eh 10 O O Γ-l o o *c o o 10 Eh < rH O O < O O >,□ O H o O ooo X
GQ το
LL
ι-H O O Ή E rtj Φ E Li O o JS O O H O O
ooo H < E »4 O O (L O O Ε «< E OOO
3 0 0 0 E < 0 O o Ο'Ο O CLE < 3 E
Φ E < Li O O Li O o Li O O CO < E φ E 2
J E 2 CL O O CL O o < O O < O O »4 O o
cn< E C O O CLO o Li E Φ o o 0E<
Li O O rH < E Li O o Φ O O rH E < Li O o
< < E OOO Ε E W E < H < E CL O o
0 E < cnE < 0 E 2 >,O o rH O O (0 O o
Li O O Li O O Li O O Ή O o (0 E < H O o
CL O O < O U CL O O O O o > o o < O o
>,U U 0Ί< E Li O O cnE co o o >o o
rH O O Li O O X E Li O o >1 rH O o
OOO < < E EE< < O o 4) 2 E O o o
rH rH rH rH rH rH
04 CO Hf O CM
rH rH CM n r> Hf
172 133
FIG. 1C
«5 0 0 3 H rf Φ U O rH O O CPEh rf 3 rf Eh uuo
Ή U U Φ EH 3 rH Eh rf «5 Eh rf UUO Φ Eh rf a o o
< o u j o o H rf Eh > O O rf O U JOO Eh rf H
□ u o >.o o «5 0 0 CU O O CPrf Eh ao o cuo o
0 El rf rH u u rH U O uuo U O O W rf EH u o o
J U O o o o rf O O Eh Eh rf rf U O rf O O Eh Eh rf
□ Eh rf uou CU Eh rf W Eh rf 3 H rf >iO O w o o
φ Eh 3 a U U W rf Eh >iO o Φ Eh 3 rH O O •H rf Eh
J o u Eh < H rf O O U EH rf JOO O O O a u o
Φ o u U O O «5ΟΟ cno o c o o rH O O cno o
a Eh rf ω u o rH U U uo o rH rf Eh «5 Eh rf u o o
CU Eh 3 CO Eh rf rf O O rf rf Eh O U O > O O rf o o
Φ O O C U o «5ΟΟ UO U u o o U O O cno o
Ή E-t rf W rf Eh rH O O Φ O O a o o X Eh u o o
H rf Eh rf 3 Eh rf U U W Eh rf Eh rf Eh Eh Eh rf rf rf Eh
U H rf CPU u 3OO «5 0 0 «5 0 0 3 0 0 0 O O
Φ O O uou rH rf Eh rH U O rH O O Φ Eh rf u o o
W Eh rf rf o o O O O rf O O rf O O JOO CU o o
Φ O O rH u U UU U C O O 0 O O «5 0 0 U Eh rf
£H< (0 Eh < X Eh aa& U O O rH O O Φ O O
CU Eh rf > O O Eh Eh rf CU O O rf O O CO Eh rf
C rf Eh rH O O >o o 3 0 0 U O O Φ O O
Φ O O rH 3 Eh Λ Eh rf rH O O Φ Eh rf Φ U O a Eh rf
W Eh rf O O O > O O O O O JOO CO Eh rf CU Eh rf
(0 U O uuu sea 3 0 0 Ph 01 Eh 3 U O O
>O O Surf EH rH rf EH >iO O a o o
O Eh rf Eh Eh < H rf Eh O o o J ί O Eh rf Eh rf Eh
>»Eh 3 «ΪΟΟ U Eh rf CPEh rf >U o 3 0 0 Φ O O
rH U O HUO Φ O O uoo rH O O Φ Eh rf sea
O O O rf O O W rf Eh rf o o O O O JOO
0 H rf U O O U O O «ea a EH rf U O O 3 0 0
Li U U Φ O O Φ O O 01 rf Eh a o o Φ Eh rf
CU U U sua CO Eh rf > o o rf O O Eh rf Eh JOO
3 Eh rf ego ra o o CPO o ra o o C rf Eh
Φ Eh 3 rH U O aa£ >,o o u o o rH o o rH rf Eh
JOO rf O O ssa rf rf Eh rf o o o o o
C O O 0 U U 0 EH rf U O O u o o >O o
01 rf Eh U O O uuo U O O a o o Φ o o rH O O
rf 3 Eh CU u u CU o o CU o o Eh rf Eh CO rf Eh o o o
>O O rH U U ra o o rH O O ra o o ShO O rH O O
rH U U «5 Eh < >o o « EH rf rH o o -H O O ra EH rf
O O O > o o &£a > o o rf o o O O O > o o
U rf Eh U Eh rf n o o rH o O rH o O 3 Ih 5
£ U O a O O 01 rf Eh >iO O ra EH rf « EH rf
sas Eh rf Eh rf O O O EH rf > o o > O O JOO
3 0 0 C Eh rf >.o o u o o ih
fH O O < o o sea ra O o sar; rH O O O O O a o o EH rf EH § ε 2
U Η rf Ul O O 0 O O 0 Eh rf 3 0 0 rH O O
>»rf Eh >»o u Λ O O U O O U O O Φ Eh rf ra EH <
Eh Eh rf U Eh rf Eh rf Eh CU o o CU O O JOO > o o
C U U U Eh 3 rH O O U EH rf U O O SUEh rf U Eh rf
sag W U O «5 Eh rf a o u a o o 01 rf Eh Φ O O
W H rf > O O EH rf Eh Eh rf Eh rf O O CO EH rf
h o o 3 U O ra O O U O O a o o Φ O O >ιϋ O
«5 Eh rf Φ H rf •H rf Eh •H rf Eh Φ Eh rf rH EH rf rH O O
> O O JOO a o o a u o S rf Eh H rf Eh O O O
>.o u 3 O U UUU 3 0 0 ra o o 01 O O ra o o
rH O U Φ Eh rf >rf Eh Φ Eh rf rH U O rH rf Eh >o o
o o o JOO Eh Eh rf JOO rf o o a o o O Eh rf
rH rH rH rH rH iH rH
CO O (N 00 Hf
Hf W tD V0 r* Γ CO
172 133
o, o u ω u u (0 O U >u o X eh < 0,0 u
P O U X H rf rH U O rH O U CO Eh rf P o u
Eh H rf M < Eh rf O U O O U > O U Eh Eh rf
(0 rf Eh CP0 U Φ rf Eh co U O Φ Eh rf P Eh rf
r-ι U O łH O U rH Eh rf rH U O X Eh rf Φ O U
rf O U rf U O H rf Eh rf o u CU Eh rf w rf Eh
X O U □ U U >iU O Φ EH rf 5Krf Eh SbU O
Φ Eh rf Φ Eh rf rH O U X Eh rf X O U X O U
S < Eh X u o O O U OH Eh rf o o u O O U
CPU O o o u 10 O U S rf Eh P EH rf C U O
łH U U Φ Eh rf rH U O Φ Eh rf Φ U O W rf Eh
rf u o X U O rf o u X U O W EH rf rf rf Eh
W U U c o u sou SOU X O U P U O
•H < Eh X rf Eh Φ EH rf Φ Eh rf 10 Eh rf X u o
X U O o u O X U O X U O > O U Eh rf Eh
< (0 Eh rf rH U O SOU P Eh rf c U O
r-l O U X U O <0 Eh rf Φ Eh rf X U O 10 rf Eh
o O U rf O U > O U X U O Eh rf Eh rf rf Ε*
łH U U x -P U U >rf Eh rH O U to U O Φ U O
x u o <0 Φ Eh rf rH O U <0 Eh rf •rH rf E*H X EH rf
Eh rf Eh > X rf Eh O O U > O U X U O H rf Eh
Φ rf Eh X rf Eh 0.0 U rH rf Eh xu o SOU
X Eh rf CO Eh < łH O U co Eh rf X O U Φ Eh rf
H rf Eh > o U Eh Eh rf > O U o O U X U O
10 Eh rf SOU to U O SOU co U O c O U
X rf Eh Φ Eh rf •H rf Eh Φ Eh rf X U O X rf Eh
X U O X Eh rf X U O X U O rf o u O U O
>,□ O (0 O U (0 EH rf X U O P Eh rf X u o
rH O U X u O rH U O R> Eh rf Φ O U (0 EH rf
o o u rf o u rf O U > O U W rf Eh > O U
0 U U łH O U >cEH rf to O U >irf Eh CUO
łH U U X u o rH O U >irf Eh X O U W rf Eh
CU u o Eh rf Eh O O U X 2 Eh o o u rf rf Eh
P Eh rf łH O U « Eh rf 10 O U >iO U C O U
>irf Eh X u o X U O X U O X o u X rf Eh
Eh Eh rf Eh rf Ęh rf o u rf O U o o u O U O
Φ U O 0 Eh rf Φ u o ao u P u o ta o U
rl Eh rf łH U O rH Eh rf łH o u X u o >irf Eh
H rf Eh Ou U O W rf Eh Eh Eh rf Eh rf Eh X rf S
P Eh rf łH U O P O U CUO X U O (0 U O
Φ U O W U O Φ EH rf tO rf Eh CO Eh rf X U O
OT Eh rf W Eh rf X rf Eh rf rf Eh > O U rf o u
ω u u CUO U au o >0 U to U O χυ O
>.β u łH O U 10 rf Ęh X o U X rf Eh X o u
O Eh < Eh Eh rf rf O U o o u X U O o o u
C H rf CUO SOU X o u P U O 0 rf EH
ω rf Eh tO rf Ęh Φ Eh rf co EH rf X U O P U O
rf rf Eh rf rf Eh X Eh rf > O U Eh rf Eh CU U O
10 U Ο 4J O U Φ U O •P O U S rf Ęh CO rf Eh
>,O U Φ Eh rf rH Eh rf Φ Eh rf pH X U O
U Eh rf Ε rf Eh H rf Eh X rf Eh o o u rf O U
>Eh P o u CO U O P U O 10 O U 3 U O
X O U Φ EH rf rH U O Φ u o X u o Φ Eh rf
o O U X rf Eh rf O U OT Eh rf rf o u X U o
C rf Eh P U U C rf Eh Φ U O au o 3 U O
X rf EH Φ Eh rf rH rf Eh X Eh rf 10 rf H Φ Eh rf
O U U X rf Eh O U O CU Eh rf rf o u X U O
łH U U DhEh rf 0 rf EH P Eh rf X u o P U O
X U O «1 rf Eh łH U O >t rf Eh (0 EH rf Φ O U
Eh < Eh rf O U CU u O Eh Eh rf > O U W rf Eh
rH rH rH rH rH rH
O CO <N 00 O
CP Oc O O rH ΓΜ
rH rH rH rH
FIG. 1D
172 133
>0 Ο CnC Eh 0 O O w o o CKO o COO 0 o o
H 0 u Ki O U Ki O O x W C Eh ω C Eh £3 Eh C
o o u COO CU O O J 2 Eh COO C 2 Eh CU Eh 2
f3 < H 10 U O >0 O 0 O O Ki O O 3 EH C X Eh
rH U O SO U rH O O rH O O £3 0 0 Φ Eh 2 rH o O
C U U OE< O O O COO Eh C Eh JOO o o o
3 U U POO Ki O O 0 o o Ki O O rH O O Ki Eh C
0 Eh C 000 Φ O O Ki O O £3 0 0 0 Eh C £3 0 0
J Eh c W C Eh W < Eh CK O O Eh C Eh > O O Eh C Eh
CKO U 0 O O >, 2 Eh rH O O X Eh 0 O O Cl 2 Eh
Ki O O H 00 rH O O 0 Eh C HUO £3 Eh C 0 O O
Η H < COO O O o > O O O O O CU H 2 W Eh C
>U0 3 C Eh COO Φ Eh C rH O O H OO COO
rH O O 0) H < W < Eh rH Eh 2 0 Eh C 0 Eh C W C Eh
o o o JOO < 2 Eh W C Eh > O O > O O C 2 Eh
h U0 Ο'Ο U 10 O O >i Eh C rH o O CKO O U O O
£3 U O Ki O O rH O O rH O O 0 Eh C W C Eh 0 Eh C
Eh C Eh < < Eh COO O O O > O O COO S C EH
COO 3OU Ki Eh < W O O rH o O Ki O O cuo o
W C E-< HCE X Eh >O O 0 Eh C £3 0 0 Ki O O
C 2 H o O O Eh Eh C O Eh C > O O Eh C Eh Eh Eh C
3 U O 0 EH < Ki Eh 2 0 Eh 2 0 O O CK Eh c Ki O O
0 Eh c Ki O O Φ O O Ki O O Ki O O W C Eh £3 0 0
j o o CK O O W C &H CK O O CK O O COO Eh C Eh
Ki U O ta Eh < Φ o o tn C Eh Ki O O C EH c tO Eh C
0 O O >»U O rH Eh C X Eh Φ O O tn c Eh >,O O
W C Eh U Eh < H C Eh J 2 Eh W C Eh C 2 Eh O Eh C
CK Eh C >iU O 0 Eh C O 2 Eh 0 O O 3 2 Eh >,Eh 2
ω C E-< rH O O Ki O O Ki O O Ki O O rH 2 Eh rH O O
UJ c o o O O O CK O O CK O O CK O O O O O O O O
C Eh C P C Eh >iO O 0 O O P Eh C >hEh C 0 O O
SSi: 0 O O -I o o Ki O O £3 0 0 rH O O £ B S
W Eh C o o o CK O O Eh C Eh O O O
« ta o o p Eh 2 CK o o Ki O O Φ O O CKO o 0.0 o
CS >0 u Φ O O Ki O O >iC Eh £3 Eh C Ki o o Ki O O
u. o E-* < W Ęh < Eh Eh C Eh Eh C CU Eh 2 Eh Eh C Eh Eh C
c o o COO >O O ta o o to O O Ki O O C Eh 2
ta c eh C 2 H tn C Eh < 2 Eh rH O O O O O •H C Eh ae o o SO O O Eh C 0 O O W C Eh sse
3 O U Φ O O COO CK o o Ki Eh 2 Ki O O >u o
oh< £t3S rH C Eh POO 3X Eh SC Eh rH o O
U00 O O O Eh Eh C Eh Eh C Eh Eh C o o o
Λ U O tn o o CK o o ta o o rH c Eh Ki O O 3 0 0
H00 SS £ tn C Eh SO o 0 Eh C £3 0 0 0 Eh C
<ou <00 O Eh C > O O Eh C Eh JOO
K0U ta o o 0 Eh C Ki O O 0 O O 0 O O 0 O O
JSU0 •H C Eh £ Eh C >C eh Ki O O Ki O O Ki O O
Eh < Eh X O O CK H 2 Eh Eh C CK O O CK O O CU O O
Ki O O ta o o CK Eh 2 0 O O >i Eh C 0 O O O C Eh
0 O O •H C E tn < Eh Ki O O rH O O rH O O Ki O O
W C Eh 33 O O COO CK O O O O O COO CU O O
C Eh C Ki Eh C Ki O O Ο'Ο O W Eh C >O O cno o
IB C Eh X Eh £3 0 0 Ki O O >O O rH O O Ki O O
C 2 Eh Eh Eh C Eh C Eh COO O Eh C O O O C C Eh
3 0 0 Φ O O 3 Eh C COO rH O O Ki O O Ki O O
0) H < £ Eh C Φ Eh 2 rH C Eh 0 Eh C 0 O O £3 0 0
400 CU EH C JOO O O O > O O ω Eh C Eh C Ei
ta u o 3 Eh C 0 O O CK O o Ki Eh C cno o C Eh C
•H < Eh Φ Eh < Ki O O to c Eh Φ O O POO W C Eh
X U O JOO CK O O COO W c Eh C C Eh C 2 Eh
rH rH rH rH rH rH rH
vo (M CO O <\J
rj r> n Tj in in VO
rH rH rH rH rH rH rH
172 133
w u o >H < W Eh < 3 0 0 U U 0 Ch < Eh
•H < E-t cH 0 0 >0 0 « Eh < <1» 0 0 JZ 0 0
X U 0 O 0 0 0 Eh < 4 0 0 W EH < Eh < Eh
□ U U Ch 0 O O Η 2 tPU 0 CT> 0 0 O 0 0
0 Eh < 0 0 O Ch 0 0 Ch 0 0 Ch 0 0 JS EH <
4 U 0 W Eh < CU 0 0 < < Eh < < Eh CU Eh 2
U U U >0 0 Ch Eh < (0 0 0 O0 0 Ch 0 0
JZ 0 u -HU U X Eh •H < Eh W < Eh 0 0 0
H < Eh 0 0 0 Eh Eh < X 0 0 <00 W Eh <
C 0 0 W 0 0 (0 Eh < 3 < Eh CH0 0 W Eh <
W < Eh >0 0 •H < Eh rH < Eh Ch 0 0 >0 0
< 2 Eh 0 Eh < X 0 0 0 0 0 < < Eh 0 Eh <
c 0 0 σ>0 0 O.0 0 rH 0 0 O0 0 O0U
W < H U 0 u Ch 0 0 « Eh < (0 < Eh Ch 0 0
< 2 Eh <00 Eh Ph < >00 <00 CU 0 0
>0 0 Ch Eh < 3 Eh < >0 0 3 < Eh 3 0 0
rH U U ω 0 0 O Eh < rH 0 0 rH < Eh O Eh <
0 0 0 W EH < 4 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0
«3 U U U 0 0 CPU 0 X Eh 3 0 0 rH 0 0
r-H U O X Eh Ch 0 0 rH 0 0 O Eh < « Eh <
< 0 U Eh Eh < < < Eh 0 0 0 4 0 0 >00
>0 U Ch < Eh Ch Eh < rH 0 0 OEh < C 0 0
HUU JZ 0 0 X Eh « Eh < (0 < Eh rH < Eh
000 Eh < Eh Eh Eh < >00 <00 0 0 0
X EH «00 0 0 0 Ch 0 0 (0 0 0 O0 0
H 0 0 H 0 0 Ch 0 0 X Eh >0 0 Ch 0 0
0 0 0 <00 CU 0 0 Eh Eh < 0 Eh < Eh Eh <
0 0 0 au 0 Ch 0 0 4J 0 0 ΟΈη < C 0 0
rH Eh < (0 < H X Eh O Ej < Ch 0 0 rH < Eh
H < Eh <00 Eh Eh < X < Eh <00 0 0 0
rH 0 0 0 0 0 O0 0 O0 0 3 < Eh Ch < Eh
« Eh < Ch 0 0 (0 < Eh Ch 0 0 rH < Η £00
>00 CU 0 0 <00 < < Eh 0 0 0 Eh < Eh
W Eh < (0 Eh < rH U 0 OU0 >0 0 Ch Eh <
>0 0 •H < Eh « Eh < rH Eh < rH 0 0 JZ 0 0
0 Eh < X 0 0 >00 W < Eh 0 0 0 Eh < Eh
0 Eh 2 (0 0 0 3 0 0 (0 Pm On0 0 Ch 0 0
Ch 0 0 33 £ 0) Eh < A Ch 0 0 £00
CU 0 0 »4 0 0 iJ <00 Eh < Eh
0 Eh < O>0 0 (0 0 0 O Eh < Ch 0 0 3 0 0
U00 U0U >0 0 £ H < Λ 0 0 W Eh <
CU 0 0 <00 0 Eh < CU E* < Eh < Eh 4 0 0
«00 W 0 0 CH0 0 O < Eh O0 0 3 0 0
H O 0 sus CH 0 0 i-I Eh < Ch 0 0 O Eh <
<00 < < Eh H < Eh Eh Eh < 4 0 0
X eh (0 0 0 0 0 0 Ch 0 0 C 0 0 3 < Eh
rH 0 0 >0 O Ch U 0 JZ 0 0 W < Eh O Eh <
0 0 0 K&S CU 0 0 Eh < Eh < 2 Eh 4 Eh <
(0 0 0 Ch < Eh Ch 0 0 (0 0 0 0 0 0
>0 0 (0 < EH X! 0 0 >< Eh >0 0 Ch 0 0
O EH < <00 Eh < Eh Eh Eh < 0 Eh < CU 0 0
-I 0 0 Ch Eh < 0 3 0 0 C 0 0 «00 Ch 0 0
« Eh < JZ 0 0 rH 0) Eh < sse rH 0 0 0 0 0
>00 Eh < Eh H 4 < E* <00 W < Eh
W < Eh 0 0 0 O0 0 0 0 0 « Eh < 3 0 0
Pm Ch 0 0 Ch 0 0 H Eh < rH 0 0 O Eh <
J CU 0 0 Eh Eh < H < Eh <00 4 0 0
U00 (0 0 0 0 0 0 Ch 0 0 3 < Eh 3 0 0
Λ 0 0 >0 0 Ch 0 0 X 0 0 rH < Eh rH < Eh
Eh < Eh 0 Eh < CU 0 0 Eh < Eh 0 0 0 0 0 0
rH rH rH rH rH rH
CO O 10 CO
vo r* CO co σ»
rH rH rH rH rH rH
FIG. 1F
172 133
FIG. 1G
c 0 U X E-l rf 3 0 0 «00 >Eh rf 3 0 0 >iEh rf
< Eh 10 Eh rf tt) Eh rf X 0 0 rd 0 0 tt) Eh rf X 0 0
o u o > 0 0 X 0 0 rf 0 0 0 0 0 X 0 0 0 0 0
r-l o u X U 0 3 rf Eh 3 0 0 W 0 0 3 0 0 >10 0
10 Eh rf (0 Eh rf tt) Eh rf tt) Eh rf >rf Eh tt) Eh rf X 0 0
> 0 U > 0 0 X 0 0 X 0 0 X rf Eh X 0 0 0 0 0
O.U u Ul 0 0 P 0 0 Ul 0 0 3 0 0 3 0 0 W Eh rf
ω < H >nrf Eh 0) Eh rf tt) 0 0 tt) Eh rf tt) Eh rf >10 0
rf O U Eh Eh rf S rf Eh CO Eh rf X Eh rf X 0 0 0 Eh rf
r-l O u 3 0 0 +J 0 0 « rf Eh Cd Eh rf □ 0 0 P 0 0
(0 E-ι rf X rf Eh tt) Eh rf rd 0 0 >h rf Eh tt) Eh rf tt) 0 0
> O U 0 0 0 S rf Eh rf 0 0 Eh Eh rf X 0 0 W Eh rf
V Eh rf 0.0 0 O.0 0 « rf Eh 0.0 0 3 0 0 «00
X H 2 Ul 0 0 Ul 0 0 X 0 0 U0 0 tt) Eh rf X 0 0
X < H Eh Eh rf Eh Eh rf rf 0 0 Eh Eh rf X 0 0 rf 0 0
c 0 o U) 0 0 3 0 0 C EH rf « rf Eh 0 Eh rf «00
U) rf Eh >rf Eh 0) Eh rf W rf Eh rd 0 0 Ui 0 0 X 0 0
rf rf E* X rf Eh X Eh rf rf rf Eh rf 0 0 CU 0 0 rf 0 0
c O U tt) Eh rf W 0 0 3 Eh rf tt) Eh rf O.0 0 X 0 0
rH rf H X E-t rf >0 0 tt) Eh rf X Eh rf Ul 0 0 « Eh rf
o U O H rf Eh 0 Eh rf X 0 0 CU Eh rf Eh Eh rf >00
ω u u 10 O 0 Ul 0 0 tt) rf H W 0 0 P 0 0 3 0 0
•H rf El X U 0 tt) O 0 rd Eh rf >0 0 0) Eh rf X rf Eh
X U 0 rf 0 0 CO Eh rf H rf Eh 0 Eh rf X rf Eh 0 0 0
□ u o 0.0 0 W 0 0 X rf Eh tt) 0 0 >10 0 P 0 0
<D Ei rf Ul 0 0 >.0 0 « Eh rf X Eh rf X 0 0 X 0 0
X O u Eh Eh rf 0 Eh rf >00 CU Eh rf 0 0 0 Eh rf Eh
(0 u u Ul 0 0 rd 0 0 3 0 0 tt) 0 0 Id 0 0 O.0 0
•H rf h 0) 0 0 (0 Eh rf tt) Eh rf X Eh rf >irf Eh W rf Eh
X u o CO Ed rf >00 X 0 0 CU Eh rf Eh Eh rf rf 0 0
tt) u u «00 0*0 0 C 0 0 rd 0 0 tt) 0 0 3 0 0
X Eh rf rd 0 0 Ul 0 0 W rf Eh « EH rf X Eh rf tt) Eh rf
X rf Eh rf 0 0 rf 0 0 rf 3 Eh >00 CU Eh rf X 0 0
3 O O 0) 0 0 «00 3 0 0 3 0 0 P 0 0 «00
0) Eh rf rd EH rf rd 0 O rd rf Eh tt) Eh rf X 0 0 X 0 0
X U 0 W rf Eh rf 0 0 0 0 0 X 0 0 Eh rf Eh rf 0 0
>0 0 P 0 0 0.0 0 3 0 0 tt) 0 0 P 0 0 P 0 0
rH □ U 0) 0 0 (0 rf Eh 0) Eh rf X Eh rf >irf Eh >irf Eh
o 0 u CO rf Eh rf 0 0 X Eh rf CU Eh rf Eh Eh rf Eh Eh rf
Ul υ o Ul rf Eh « rf Eh « Eh rf P 0 0 X 0 0 «00
X o o tt) O 0 rd 0 0 rd 0 U tt) 0 0 « Eh rf X 0 0
E-ι rf Eh CO Eh rf rf 0 0 rf 0 0 CO Eh rf >00 rf 0 0
Ui u 0 >0 0 3 Eh rf «00 rd rf Eh «00 CP0 0
tt) u u rd 0 0 « Eh rf rd 0 0 « Eh rf X 0 0 P 0 0
CO Eh rf 0 0 0 X 0 0 rf 0 0 >00 rf 0 0 rf 0 0
3 0 υ rd 0 0 3 0 0 3 0 0 3 Eh rf >irf Eh C 0 0
tt) Eh rf « Eh rf 0) Eh rf rd rf Eh tt) Eh rf X 0 0 x rf Eh
X H rf > 0 0 X 0 0 0 0 0 X 0 0 0 0 0 0 0 0
<0 0 0 >0 0 3 Eh rf «00 >EH rf 0 0 0 0 0 0
X 0 o rd 0 0 tt) Eh rf rd 0 0 X 0 0 P 0 0 P 0 0
rf 0 u 0 0 0 X 0 0 rf 0 0 0 0 0 CU 0 0 CU 0 0
0 rf Eh Ui 0 0 tt) 0 0 C rf Eh W 0 0 X 0 0 3 0 0
Ul U Ό >rf Eh X Eh rf rd rf Eh •H rf Eh « Eh rf tt) Eh rf
CU U 0 Eh Eh rf CU Eh rf 0 0 0 X 0 0 >00 X Eh rf
3 < Eh 3 0 0 3 0 0 Ui 0 0 Ul 0 0 O.0 0 «00
tt) Eh rf 0) Eh rf tt) Eh rf tt) 0 0 X 0 0 P 0 0 X 0 0
X U U X Eh rf X 0 0 CO Eh rf Eh rf Eh Eh Eh rf rf 0 0
Ui U o P 0 0 3 0 0 tt) rf Eh >0 0 W 0 0 3 0 0
X u u >trf Eh tt) Eh rf rd Eh rf X 0 0 >rf Eh tt) Eh rf
H rf Eh Eh Eh rf X 0 0 H rf Eh 0 0 0 X rf Eh X Eh rf
rd rH rH rH rd rd rH
nr O V0 (N CO Tf O
O rH rH <N (N m TT
0) CM <N fN
172 133
Li O 0 CL 0 O rH rf Eh
Φ 0 O Li 0 o <0 Eh rf
W rf Eh Eh Eh rf > 0 O
Φ O 0 rH 0 o (0 Eh rf
rH EH rf <0 Eh rf rH O 0
H rf Eh > 0 o rf 0 O
Li Eh rf (0 O 0 U) Eh rf
X Eh •ri rf Eh >0 O
Eh Eh rf X O 0 O Eh rf
CPU 0 3 0 O 4J 0 O
Li 0 O Φ Eh rf 0) Eh rf
rf U 0 fi O 0 s rf Eh
(0 0 O C rf Eh 3 O 0
X Eh rH 3 Eh a Eh rf
fi 3 Eh 0 o 0 fi O 0
Li O 0 <0 0 O 3 rf Eh
X Eh rH O 0 0) Eh rf
Eh Eh rf rf 0 O fi Eh rf
CL Ο Li Ό
Li Eh X Eh Eh , 0 < Eh Li U O CL O 0 Li rf Eh Φ O 0 W Eh rf 3 0 0 Φ Eh rf fi O 0 Li Eh rf fi U 0 Eh rf Eh 3 0 0 Φ Eh rf fi U 0 <0 0 0 rH U 0 rf 0 O 4J 0 O O Eh rf 32 rf Eh 3 0 0 Φ Eh rf fi Eh 3 L0 O rH 0 O O 0 U rf
Φ O 0 -Η Eh rf H rf Eh rH O O <0 Eh rf > 0 U <0 0 0 rH O 0 rf 0 O CŁO 0 W rf Eh rf 0 U CPU 0 Li 0 O rf O 0 >0 O rH 0 O 0 0 O >,0 O rH 0 O 0 0 O CPrf Eh Li 0 O rf O 0 «Η U 0 <0 Eh rf > 0 O COO
SSB
FIG. 1H fi . Li O 0 fi O 0 Eh rf Eh Φ O 0 Ή Eh rf H rf Eh ftO 0 W rf Eh rf 0 O rH rf Eh <0 EH rf > 0 O
rH O 0 CL0 O O 0 3 0 0 <0 0 0 3 rf
(0 Eh rf Li 0 U Φ Eh rf Φ Eh rf rH U 0 Φ Eh
> 0 U Eh Eh rf fi U 0 fi O 0 rf 0 O fi Eh
3 U 0 3 0 0 0 O 0 Li Eh rf C rf Eh 10 0
0) Eh rf <D Eh rf Li O 0 fi U 0 rH rf Eh rH O
fi O 0 fi Eh 3 CL O 0 Eh rf Eh 0 O 0 rf 0
rH Eh rf U) O 0 0 O 0 0 0 O 3 Eh rf tn o
<0 Eh 3 >ιΰ O Li O 0 Li O 0 ω eh rf >0
> 0 O O Eh rf CL O 0 CL O 0 fi O 0 O Eh
ri Eh rf CL U O Φ W O 0 Φ EH rf Φ O
<0 Eh 3 Li 0 O r-ł Eh 3 •H rf Eh rH EH 3 fi Eh
> 0 O Eh Eh rf W rf Eh X O 0 W rf Eh CL Eh
rH rH rH rH rH
CO CN CO o CO
«· in in CO r- Γ*
<N CN <N CN (N CN
172 133
RJ 0 Ο 3 0 0 3 0 0 Li Ο ϋ 3 C Ε C Ο Ο Li Ε C
rH Ο Ο Η C Ε Φ Ε C Φ Ο Ο Φ Ε C Η < Η β Ο Ο
CUO ΟΟΟ 43 Ε C W Ε C 43 Ο Ο ΟΟΟ Ε C Ε
0.0 ο •Μ Ο Ο >Ο Ο rH Ο 0 3 0 0 Η ο Ο αο ο
Μ Ο Ο Φ Ε C rH Ο U β Ε C Φ Ε C β Ε C L» ο ο
Ε Ε C 2 < Ε ΟΟΟ > o ρ 41 Ο ϋ > Ο Ο Ε Ε C
β,Ο ϋ β 2 Ε β Ο Ο 4 U Ο >ο Ο 3 0 0 (ΟΟΟ
ω c ε rH C Ε (OCE Φ Ε C η o ο Η <β £η >ο ο
<οα ΟΟΟ C C Ε 2 C Ε οοο ΟΟΟ Ο Ε C
cno υ Li Ο Ο Φ Ο Ο X Ε mo ο >ιΕ C Η Ο Ο
Ε ο ο Φ Ο Ο rH Ε C Η ϋ Ο Μ ο ο Η ο Ο Φ Ε C
C Ο 0 ω Ε c LH C Ε ΟΟΟ c c ε οοο > Ο Ο
3 Ε C Φ ο ο Φ Ο Ο Ο.Ε C Li C Ε 3 0 0 >ιθ Ο
φ Ε 2 β Ε C rH Ε C (OCE β Ο ϋ η C Ε Η Ο U
43 Ο Ο Οι Ε 2 η C Ε C Ο Ο Ε C Ε ΟΟΟ ΟΟΟ
0 Ε < rH ϋ Ο 0.0 Ο (0 Ο ϋ C Ο Ο Η o Ο β Ε C
Lh Ο ϋ (8 Ε ί (OCE rH ϋ ϋ η C Ε β Ε C (OCE
CU Ο ϋ > Ο Ο C Ο Ο C ϋ Ο ΟΟΟ > Ο Ο C C Ε
Li Ε C rH Ο ϋ >>Ε C OCE C Ο ο C C Ε Φ ο ο
X Ο ϋ β Ε C rH Ο Ο Li Ο Ο η C Ε Η C Ε Η £-ι C
Ε C Ε > Ο Ο ΟΟΟ CU Ο Ο ΟΟΟ ΟΟΟ Η c Ε
3 0 0 0<Ε (ΟΟΟ >0 Ο 10 ϋ ϋ C Ο ϋ (ΟΟΟ
φ Ε C Μ Ο Ο >ο ο η ϋ Ο Η ϋ ϋ (OCE >10 Ο
41 Ο Ο Οι Ο Ο ϋ Ε C οοο C Ο Ο C C Ε Ο Ε C
(0 Ε C 3 0 0 (9 Ο Ο 3 0 0 Li Ο Ο (OCE LUU
•Η C Ε rH C Ε rH Ο Ο Φ Ε C X Ε >2 Ε β ο ο
Κ Ο Ο οοο C Ο ϋ 43 Ο Ο Ε Ε C J 2 Ε Ε C Ε
β ϋ Ο Η C Ε (9 0 0 3 0 0 (9 0 0 αο ο β C Ε
V) C Ε (9 Ε < -Η Ο Ο Φ Ε C Η Ο Ο (OCE Η Ο Ο
C 2 Ε > Ο Ο C Ο Ο 43 Ο Ο C Ο Ο C Ο Ο C Ο Ο
Μ Ε C <9 Ε C Μ Ο Ο Φ C Ε Μ Ο Ο mo ο 3 0 0
>,C Ε r-t 0 Ο β Ο Ο -HEC β ϋ Ο Μ Ο Ο Φ Ε C
EF< C Ο Ο Ε C Ε u c Ε Ε C Ε C ο ο 43 Ο Ο
rH Ε 2 rH Ο ϋ ΛΕ C 3 0 0 Φ Ο Ο >ο ο Φ Ο ο
β Ε 2 β Ε C (OCE rH C Ε HEC Η ο ϋ β Ε C
> Ο ϋ > Ο Ο C ϋ Ο ΟΟΟ Η c Ε οοο Οι Ε 2
Ll Ε C (9 0 0 β C Ε cno ο ΟΟΟ Li Ε C Lh Ο Ο
X Ε rH ο Ο rH Ο Ο Li Ο Ο Lh Ο Ο β ο ο β Ο Ο
Ε Ε C C Ο Ο C Ο Ο C ϋ ο Οι Ο Ο Ε C Ε Ε C Ε
Li Ο Ο 3 0 0 >ι Ο Ο >ο ο (9 0 0 3 C Ε β 2 Ε
Λ Ο Ο Φ Ε C rH ο Ο rH Ο Ο Η ϋ Ο Φ Ε C Η C Ε
Ε C Ε 43 ϋ Ο οοο οοο c ο ρ 43 Ο Ο οοο
>ιθ Ο ΟΕ C Οι ο ο cno ο 3 0 0 Li Ο Ο β ο ο
rH Ο Ο φ C Ε Li Ο Ο Li Ο ϋ φ Ε C Φ Ο Ο Η ο ο
οοο C Ο Ο Ε Ε C C C Ε 43 Ο Ο ω c Ε C ο ο
Ρ Ε < mc ε Μ Ο ϋ mo ο 3 0 0 Lh Ο Ο β Ε C
β ϋ Ο D Ο Ο β Ο Ο Μ ο ο Φ Ε C β Ο ϋ Η ο ο
Ε < Ε C ο ο Ε C Ε c ο ο *4 Ę 2 Ε C Ε C ο ο
3 Ε C 3 0 0 Φ Ο Ο (9 Ο Ο mo ο Φ Ο Ο MEC
Φ Ε 2 Φ Ε C HEC γη o o Lh Ο Ο HEC β Ο ο
43 Ο Ο 43 Ε 2 w C Ε C ο ο C C Ε Η C Ε Ε C Ε
10 Ο Ο >ιθ ϋ 3 0 0 Ll Ο Ο 0,0 ο Φ C Ε MCE
rH Ο ϋ rH ο Ο φ Ε C Φ ο ο Μ Ο Ο Η Ε C Φ Ο ο
CUO οοο 400 ω Ε Ć Ε Ε C Η c Ε W Ε c
>10 ϋ C ο ο (ΟΟΟ HEC >ιϋ ο (ΟΟΟ Η Ο Ο
rH Ο Ο (OCE X Ε β Ε C Η ο ο >ιϋ Ο β Ε C
οοο C 2 Ε 43 2 Ε > ο ο οοο Ο Ε C > Ο Ο
3 C Ε (ΟΟΟ Μ ϋ Ο 0 Ε C ω ο ο >10 Ο Φ Ε C
Φ Ε C •Η c Ε β ϋ ϋ Li Ο Ο >iC ε Η Ο Ο Η Ε C
•4 Ε 2 X Ο ϋ Ε C Ε ο. ο ο 43 2 Ε Ο ϋ Ο Η c Ε
rH γΗ rH rH Η Η η
ΓΗ α Hf ο φ Γ4 C0
0 η σ ο ο Η rH
ΓΗ ΓΗ ΓΗ η Μ ΓΩ η
172 133
+» O U SOU Φ Eh rf P U O Φ EH rf CUO
0) Eh rf Φ Eh rf X Eh rf >rf Eh X H rf W rf Eh
X rf H X EH < w rf Eh Eh Eh rf a Eh rf rf rf Eh
c O U P rf Eh X U O P U O Φ rf Eh sou
fH rf H Φ U O 10 Eh rf Φ U O X Eh rf X rf Eh
o U O W Eh rf > O U OT Eh X rf Eh O O U
ω U o CPU O aEn rf Φ Eh >u o χ o u
X Eh rf P O U W rf Eh X Eh X O U 10 Eh rf
H rf Eh rf U O rf O U X rf Eh O O U t> O U
r-1 U O P P U O «0 U O 0 U O X O U 0 EH rf
10 Eh rf X Φ O U X U O P u O (0 Eh rf P U O
> O U Eh W rf Eh rf O U a u o > O U CU U O
0 Eh rf >hEh rf W U O CPO u 10 U O Φ U O
P U O X o u x rf Eh P o u X U O χ EH rf
CU u o o u u X U O rf u o rf O U H rf Eh
>iEh rf C rf Eh CPU U 0 u o tfl U O Φ Ęh rf
X O U x rf Eh P O U P u o x rf Eh X Eh rf
O O U O U O rf rf Eh CU U o X U O CU Eh rf
ω U U P 0 o u P O U P o u >iO U au O
>. rf Eh Φ P u o X u o Φ u o X O U tfl rf Eh
X rf Eh W CU u o Eh rf Eh OT EH rf O O U rf O U
0 U O <0 Eh rf X U O 3 O u 18 O U X O U
P u o X U O (0 EH rf Φ Eh rf X U O (0 Eh rf
CU u o rf O U > O U X U o rf o u > O U
P rf Eh 0 U O SOU 3 O u 0 u o (0 O U
φ U O P u o Φ Eh rf Φ Eh rf P u o X U O
w Eh rf CU u o X U O X U o a u o rf O U
<0 O U ao u P U O P U o ta u o tfl o U
X o o P o u >irf Eh Φ O u >nO u SŃrf Eh
rf o u Eh Ęh rf Eh Ęh rf OT rf Eh U Eh rf X 2 Eh
Φ u o >,U O 3 Eh tC >lU o SOU (0 Eh rf
I-I Eh rf X O U Φ Eh rf X O u © Eh rf X U O
H rf Eh O O U X U O O O u X Eh rf rf O U
P o o X o u au O CPO u SOU X O U
X U O (0 Eh rf tfl rf Eh P O u Φ Eh rf RJ Eh rf
Eh rf E-< > O U rf O U rf rf Eh X U O > O U
CPO u 3 Ęh rf P O U P U O 0 O U >,rf Eh
P o u Φ Eh rf Φ U O Φ o u P U O X O U
rf rf Eh X U O W Eh rf OT rf Eh a u o o o u
P O U au o P U O a Eh rf >iEh rf CPEh rf
X u o W rf Eh Φ U O tfl rf Eh X o u P O U
Eh rf Eh rf O U W Eh rf rf O U o o u rf U O
rf Eh c rf Ęh >iU O >.Eh rf >,O U P u o
X O U X rf Eh X O U X O u X o u X u o
O O U O U O o o u O O u o o u Eh rf Eh
(0 u o au o tfl u o tPO u P o u tfl U O
X u o tfl rf Eh >O u P O u Φ u o >,o u
rf o u rf O u u Ęh rf rf U o OT EH rf U EH rf
>,U U X rf Eh P Eh rf CPO u P U O X O U
rH o u (0 Eh rf X U O P O u Φ u o « Eh rf
O o u > O u Eh rf Eh rf U o W EH rf > O U
(0 u ϋ C Eh rf tfl U O CPU o >ιϋ O Λ O U
X rf eh tfl rf Eh >iO U P O u X O U X U o
X U o rf rf Ęh U Eh rf rf u o o o u rf O U
P u o P U O 0 U O X o u tfl rf Eh <0 U O
>rf Eh X u o P U O 10 EH rf Surf Eh X U O
Eh Eh rf Eh rf Eh CU u o > O u X rf Eh rf O U
x U O P Eh rf P rf EH 0 U o SOU CPO u
(0 Eh rf >irf Eh X U O P u o Φ Eh rf P o u
> U U Eh Eh rf Eh rf Eh CU u o X Eh rf rf rf Eh
rH rH rH rH rH rH
O 10 CM CO
CM n O «3· in
n r, m n n n
FIG. 1J
172 133
FIG. 1K
0 O O rH O O ra rf Eh uuo 3 Eh rf U O O
u o o ra Eh rf rH O O a o o Φ Eh 3 Φ O O
CU u o > O O rf O O Eh rf Eh JOO W EH rf
rH 0 O w o o ra EH rf CPO o Φ O O W O O
(0 H rf >rf Eh rH o O u o o a Eh rf •H rf Eh
> o o J 3 Eh rf O O rf rf eh a EH 3 X O O
rH rf Eh UUO rH Η rf Φ u O w o o to o o
(0 Eh rf a o o ra Eh 3 rH Eh rf X Eh >,o o
> O O Eh rf Eh > O O H rf Eh J 3 Eh U Eh rf
0 rf Eh UUO U Eh rf c O O >,U O 3 0 0
UUO Φ o o Φ O O W rf Eh rH O U rH rf Eh
CU U O W rf Eh W EH rf rf 3 Eh O O U O O O
0 rf Eh to rf Eh 0 O O 3 0 Eh rf UUO CUO O
UUO |f u UUO Φ U O O X Eh W rf Eh
CU U O J 3 Eh a o o j a o o Eh Eh rf rf O O
U Eh rf >,U O C o o aEn <; UUO tO Eh rf
Φ U O rH O O to rf EH W rf Eh a o o >iO O
M Eh rf O O O rf 3 Eh rf o o Eh rf Eh O Eh rf
UUO UUO 3OO Φ o o UUO Φ Eh 3
Φ U O Φ o o Φ Eh rf rH Eh rf Φ O O rH Eh rf
W Eh rf W rf Eh JOO w rf Eh W Eh rf M rf Η
CUO >,U O rH rf Eh >,O O UUO Φ 3 Eh
W rf Eh rH O O « eh rf rH O O X eh rH Eh rf
rf rf Eh O O O > O O O O O Eh Eh rf H rf Eh
Λ H rf U rf EH 3 rf Eh to Eh rf U O O Φ 3 Eh
(0 rf Eh a o o Φ Eh rf •H rf Eh a O O rH Eh rf
rf O U Eh rf Eh JOO X O O Eh rf Eh H rf Eh
U O U 0 O O rH O O ra Eh rf Φ O O CUO o
a u o uuo Λ EH rf rH O O rH ĘH rf to rf Eh
Eh rf Eh a o o > O O rf O O H rf Eh rf O O
Φ U O ra EH rf to O O to O O 0 O O U Eh rf
a Eh rf a Eh rf rH O O rf o o X EH J 3 eh uuo a o o
rH O U to EH rf U Eh rf uuo u o o
<0 Eh rf •H rf Eh X Eh Φ o o Φ o o rH O O
> O O X O O Eh Eh rf W EH rf w rf Eh rf O O
0 o u 3 0 0 >iU O a o o >»o o >,O o
uuo Φ Eh rf rH O O Φ Eh rf rH O O rH O O
a u o JOO O O O a < Eh o o o O O O
uuo <0 O O c o o UUO U EH rf >0 O
Φ u o •H rf Eh rH rf Eh X eh a o o rH O O
ω EH rf X O O O O O Eh Eh Λ Eh rf Eh O O O
CPO u « Eh rf « Eh rf « Eh 3 UUO u o o
u o u rH o O rH O o rH U O ago Φ o o
rf rf Eh rf O O rf O O rf O O Eh rf Eh W EH rf
apo rH o O Λ rf Eh >iEh rf Φ Eh rf 10 U O
Φ Eh rf « EH rf rH U O rH O O Π Ęh 3 >,0 O
a < £h > o o rf O O O O O O EH rf
uuo C O O U Eh < Φ Eh rf >i0 O
a o o rH rf Eh >rf Eh a Eh 3 a o o rH O O
Eh rf Eh O O O Eh Eh rf a Eh 3 O O O
U 3 Eh Φ O O « rf Eh >iU O >O O
a o o a Eh rf rH O O rH O O U O O rH O O
EH rf Eh a Eh 3 rf O O o o o rf rf EH O O O
3OU uuo « Eh rf 3 0 0 rH O O CUO O
rH rf Eh Φ o o rH O O φ Eh rf « Eh rf 10 rf Eh
O o u W rf Eh rf O O JOO > O O rf O O
3 rf Eh C O O 0 O U U rf EH >0 O ra o o
Φ Eh rf rH rf Eh uuo a o o rH O O rH O O
JOO o o O a o o Eh rf Eh O O U rf o o
rH rH rH rH rH rH
O V0 <N CO o
kO to CO <P
m n n n n
172 133
>0 0 0 0 0 O 0 0 «00 >Eh < 3 0 0 C 0 0
rH 0 0 Ch 0 0 rH Eh < >0 0 rH 0 O 0 Eh < Ή < Eh
0 0 0 CU 0 0 H < Eh 0 Eh < 0 0 0 4 0 0 0 0 0
<0 0 0 W Eh < « Eh < «00 CPU 0 «00 O 0 0
rH 0 0 •Ή < Eh rH 0 0 >< Eh Ch 0 0 H 0 0 £ 0 0
<00 X 0 0 <00 4 2 Eh <00 <00 Eh < Eh
O Eh < 0 0 0 «00 «00 Ch 0 0 Q.Eh < rH 0 0
£ 0 0 Ch 0 0 >< Eh >< Eh >< Eh « < Eh « Eh <
Eh < Eh CU 0 0 4 2 Eh 4 2 Eh Eh Eh < <00 >00
3 0 0 -Η 0 0 >0 0 «00 Ch 0 0 0 0 0 a Eh <
rH < Η « Eh < rH 0 0 >< Η >< Eh £ 0 0 >0 0
0 0 0 >00 0 0 0 Eh Eh < Eh < Eh 0 Eh <
« < Eh Ch Eh < Ch 0 0 Ch 2 Eh «00 « 2 Eh O 0 0
rH 0 0 £ 0 0 >< Eh O 0 0 rH 0 0 rH 0 0 £ 0 0
<00 Eh < Eh Eh Eh < W Eh 2 <00 <00 Eh < Eh
C < Eh rH 0 0 0 Eh < « Eh 2 rH 0 0 rH 0 0 C Eh <
rH < Eh « Eh < £ Eh 2 ♦H < Eh « Eh < « Eh < a < Eh
0 0 0 >00 CU Eh 2 X 0 0 >00 >00 < 2 Eh
0.0 0 Ch 0 0 0 Eh 2 « Eh < «00 rH 0 0 0 W 0 0
W < Eh 0 0 0 Ch 0 0 >0 0 rH 0 0 « Eh < >>0 0
<00 W Eh < CU 0 0 0 Eh < <00 >00 Eh 0 Eh <
3 Eh < >0 0 0 0 0 0 0 0 C Eh < rH 0 0 0.0 0
0) Eh < rH 0 0 rH Eh < £ Eh < a < Eh « Eh < a < Eh
4 0 0 0 0 0 W < Eh CU Eh 2 < 2 Eh >00 <00
rH 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 rH Eh < O < Eh
« Eh < Ch 0 0 rH < Eh rH EH < rH EH < « EH < rH Eh <
>00 (UUU 0 0 0 H < Eh W < Eh >00 H < Eh
Ch Eh < 0 EH < >< Eh 3 0 0 >0 0 OiEh < rH 0 0
£ 0 0 Ch 0 0 rH 0 0 0 Eh < rH 0 0 a < Eh « Eh <
Eh < Eh CU 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 <00 >00
>0 0 Ch 0 0 Ch 0 0 « EH < 3 0 0 >0 0 O 0 0
rH 0 0 £ 0 0 £ 0 0 •H < Eh O Eh < rH 0 0 0 0 0 a
0 0 0 Eh < Eh Eh < Eh X 0 0 4 ί· 2 0 0 0 CO Eh < ssS
0 0 0 «00 Ch 0 0 U»< Eh « < Eh 0 0 0 0.0 0
rH Eh < rH 0 0 £ 0 0 Ch 0 0 rH 0 0 0 0 0 a < Eh
< Eh <00 Eh < Eh < < Eh <00 W < Eh <00 •
-H >0 0 Ch 0 0 Ch 0 0 >0 0 rH 0 0 O 0 0 O 0 0 o
RJ rH 0 o £ 0 0 O 0 0 rH 0 0 « Eh < £ 0 0 £ Eh <
>000 Eh < Eh W Eh < 0 0 0 >00 Eh < Eh CU Eh 2 z
'-r 3 0 0 «00 3 0 0 >0 0 3 0 0 0 0 0 0.0 0
O Eh < •-I 0 0 0 Eh < rH 0 0 O Eh < 0 0 0 a < Eh
4 Eh 2 <00 4 0 0 0 0 0 4 0 0 CU 0 0 <00
0 0 0 3 0 0 « Eh < « 0 0 a 0 0 0 0 0 >0 0
rH Eh < 0 Eh < rH O 0 >< Eh rH Eh < rH 0 0
K < Eh 4 0 0 <00 4 2 Eh 4 < rH H < Eh 0 0 0
Ch 0 0 rH 0 0 H Eh < 0 0 0 0 2 Eh rH 0 0 O 0 0
0 0 0 « Eh < « Eh < rH Eh < rH 0 0 « Eh < £ 0 0
W Ej < >00 >00 H < Ęh <00 >00 Eh < H
M < Eh rH Eh < 3 0 0 rH 2 EH «00 0 0 0 0 Eh <
£ 0 0 « Eh 2 rH < Eh « Eh < rH 0 0 0 0 0 >< Eh
Eh < Eh >00 0 0 0 >00 <00 W Eh < Eh Eh <
«00 3 0 0 3 0 0 3 < Eh 3 0 0 rH 0 0 >0 0
H 0 0 0 Eh < rH < Eh i-H 2 Eh 0 EH < « Eh < rH 0 0
<00 4 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 >00 0 0 0
0. Eh < CP< Eh 0 0 0 3 0 0 3 < Eh 0.0 0 0 0 0
W < Eh Ch 0 0 rH Ej < 0 Eh < rH 2 Eh a < Eh £ 0 0
<00 < < Eh M < Eh 4 0 0 0 0 0 <00 Eh < Eh
Ch 0 0 «00 C 0 0 0 0 0 0.0 0 3 Eh < +J 0 0
£ 0 0 rH 0 0 « < Eh Ch 0 0 a < Eh 0 Eh 2 0 Eh <
Eh < Eh <00 < 2 Eh CU 0 0 <00 4 0 0 X < Eh
rH rH rH rH rH rH rH
KO <N CO O <£> <N
σ. O O rH <N fM r>
r> Hf Hf Hf Hf
172 133
CUEh rf O>rf Eh W 0 0
W rf Eh P 0 0 >10 0
rf 0 U rf rf Eh 0 EH rf
C 0 0 P 0 0 3 0 0
X rf Eh >irf Eh X rf Eh
0 0 0 Eh Eh rf 0 0 0
0 0 0 Φ 0 0 W Eh rf
p 0 0 X Eh rf >10 0
CU 0 0 X rf Eh 0 Eh rf
3 0 0 >0 0 3 0 0
Φ Eh rf X 0 0 Φ Eh rf
X 0 0 0 0 0 X 0 O
P 0 0 0 rf Eh X 0 0
X 0 0 P 0 0 (0 Eh rf
Eh rf Eh CU 0 0 >00
Φ 0 0 (0 0 0 P 0 0
X Eh rf >irf Eh Φ 0 0
X rf Eh W Eh rf
>10 0 P 0 0
X 0 0 X 0 0 Φ 0 0
Eh rf Eh 0 0 0 W Eh rf
3 0 0 tP0 0 0.0 0
X rf Eh P 0 0 W rf Eh
0 0 0 rf rf Eh rf 0 0
Φ EH rf >0 0 Φ 0 0
X Eh rf X 0 0 X Eh rf
H rf Eh 0 0 0 CU Eh 2
Uh P 0 0 P Eh rf -P 0 0
Φ X 0 0 X 0 0 Φ Ej rf
W H rf Ε* Eh rf Eh S rf Eh
• Φ 0 0 0*0 0 0
Shi X 0 0 0 0 0
P 0 0 >0 0 P 0 0
X 0 0 X O 0 Φ 0 0
EH rf EH 0 0 0 W Eh rf
0 Eh rf O»0 0 0 0 0
P 0 0 P 0 0 P 0 0
CU 0 0 rf 0 0 CU 0 0
0.0 0 O»Eh rf 010 0
M rf Eh P 0 0 P 0 0
ΣΕ rf 0 0 rf 0 0 rf 0 0
ł“ SBS X 0 0 53B 3 0 0 X rf Eh
B 0 0 0 0 0 0
2 P 0 0 P Eh rf >0 0
Φ 0 0 X 0 0 X 0 0
LL W rf Eh Eh rf Eh 0 0 0
^b Φ 0 0 D»0 0 0 0 0
X Eh rf P 0 0 P 0 0
CU Eh rf rf 0 0 CU 0 0
CUEh rf P 0 0 « rf Eh
(0 rf Ed Φ 0 0 X 0 0
rf 0 0 W Eh rf rf 0 0
X 0 0 X 0 0 X 0 0
« Eh rf <0 Eh rf <0 Eh rf
>00 >00 >00
P rf Eh X 0 0 « Eh rf X 0 0
Eh rf Eh rf 0 0 CU EH a
X X X
co Hf o
r> Hf w
«3· Hf Hf
0>rf Eh >10 0 >10 0 0 Eh rf
P 0 0 X O 0 X 0 0 P 0 0
rf 0 0 0 0 0 0 0 0 CU O 0
3 rf Eh 3 0 0 P Eh rf «00
Φ Eh rf x rf Eh Φ 0 0 X 0 0
X U 0 0 0 0 W rf Eh rf 0 0
010 0 0.0 0 C 0 0 C rf EH
P 0 0 P 0 0 X rf Eh X rf Eh
rf rf Eh Eh Eh rf 0 0 0 0 0 0
X Eh rf Φ Eh rf (0 0 0 « Eh rf
RJ Eh rf X Eh rf >irf Eh X 0 0
>00 CU Eh rf X rf Eh rf 0 0
P rf Eh 3 rf Eh P 3 Eh 050 0
X 0 0 X 3 Eh X 0 0 P 0 0
Eh rf Eh 0 0 0 Eh rf Eh rf rf Eh
P Eh rf 3 Eh rf C 0 0 « Eh rf
X 0 0 Φ Eh rf X rf Eh X 0 0
Eh rf Eh X 0 0 0 0 0 rf 0 0
3 0 0 (0 Eh rf P 0 0 W 0 0
X rf Eh X rf Eh Φ U 0 >10 0
0 0 0 X 0 0 W Eh rf 0 Eh rf
«00 0.0 0 3 rf Eh X 0 0
X 0 0 W rf Eh Φ E< rf « Eh rf
rf 0 0 rf 0 0 X 0 0 >00
0 0 0 C 0 0 Φ Eh rf P 0 0
P 0 0 X rf Eh X Eh rf X 0 0
CU 0 0 0 0 0 CU Eh 3 Eh rf Eh
P 0 0 (0 0 0 (0 0 0 «00
X 0 0 >0 0 X rf Eh X 0 O
Eh rf Eh 0 Eh rf X 0 0 rf 0 0
3 0 0 X 0 0 «00 C rf Eh
« Eh rf >00 X 0 0 rf 0 0 X rf Eh 0 0 0
3 0 0 0 0 0 OiEh rf P 0 0
X rf Eh P 0 0 Φ rf Eh >nrf Eh
0 0 0 CU O 0 rf 0 0 Eh Eh rf
P Eh rf 3 Eh rf ® rf Eh «00
>irf Eh Φ Eh a X Ej rf X 0 0
Eh Eh rf X 0 0 X rf Ej rf 0 0
0.0 0 >10 0 (0 Eh rf X rf Eh
P 0 0 X 0 0 X rf Eh « Eh rf
Eh Eh rf 0 0 0 X 0 0 >00
« Eh 3 0 0 0 P Eh rf 3 0 0
X 0 0 P 0 0 X 0 0 Φ Eh rf
rf 0 O CU 0 0 Eh rf Eh X 0 0
(0 Eh rf P 0 0 3 0 0 P 0 0
&2S X 0 0 Eh rf Eh >irf Eh
>10 0 C 0 0 >10 0
X 0 0 sse X 0 0 P 0 0
0 0 0 0 0 0 CU 0 0
« rf Eh +>0 0 P rf Eh 3 Eh 2
X 0 0 Φ EH rf X 0 0 Φ Eh a
rf 0 0 £ rf Eh Eh rf Eh X 0 0
0.0 0 P 0 0 Φ Eh rf C 0 0
(0 rf Eh >irf Eh X Eh rf W rf Eh
rf 0 0 Eh Eh rf CU Ej rf rf 3 Eh
P Eh rf «00 X 0 0 3 0 0
>irf Eh X 0 0 « Eh rf X rf Eh
Eh Eh rf rf 0 0 >00 0 0 0
X X X rd
50 (N co Hf
W 50 50 r*
Hf Hf Hf Hf
172 133
su ο 0 C Eh CKO o rH O O rH O O c C H
HUU POO POO 0 Eh C 0 Eh < r-H 2 Eh
□ u u CU O O Eh Eh C > O O > O O O O o
MEC W O O POO 0 O O 3 C Eh 3 o o
•H C Eh •H C Eh JOO SU o rH C Eh rH C Eh
Ϊ u u X O O Eh C Eh O EH c O O O O O o
3UO POO POO SO o cno o 0 o o
0 Eh < JOO 0 o o rH o O POO rH Eh C
JOO Eh C Eh W C Eh o o o C C Eh M C Eh
POO 3 0 0 POO P C Eh CKO o P O O
JOO 0 Eh C JOO JOO 0 C Eh SC Eh
Eh C Eh JOO Eh C Eh Eh C Eh COO Eh Eh C
0 O O POO rH O O P 2 Eh 0 Eh C 0 O O
POO JOO 0 Eh C 0 O O POO P o o
CU o o Eh C Eh > O O W Eh C CU O O CK o o
ω o o 0 O O rH o O 3 0 0 0 C Eh 3 C Eh
S< Eh rH Eh c 0 Eh C 0 Eh C rH Eh C 0 Eh C
J 2 Eh H C Eh > O O JOO H C Eh J Eh 2
3 0 0 3 2 Eh 3 0 0 0 O O 0 O O 0 O O
0 Eh C rH 2 Eh rH c Eh >O O rH Eh C •r| C E-I
JOO O O O O O O O EH C W C Eh X O o
Ο'Ο o C EH c 3 0 0 P Eh 2 0 2 £h c o o
POO W C Eh 0 Eh C SC Eh rH O O rH C Eh
COO C 2 Eh JOO Eh Eh C COO O O o
0 EH C COO 0.0 O 0 O O 0 o o P Eh C
rH Eh 2 rH C Eh W C Eh rH O O POO 0 O O
H c Eh O O O COO COO CK o o co Eh C
3 0 0 > o o Λ Eh C 0 O O 0 o o 0 o o 0 O O
rH O O COO POO rH O O COO 3 0 0 S5£ SU o SO o O EH c 3 0 0
SO o -H O O 0 o o φ rH O O rH C Eh
O Eh C COO W EH C M lC O O O O O O
to O O SO o 4J O O POO □ sr o o
SS£ CUO o rH O O 0 Eh C rH O O 0 o o rH
o o o £ C Eh COO W EH C O
3 0 0 0 O O 0 Eh C 3 0 0 •P o o
POO 0 EH c SO o rH O O 3BS rH O O 0 Eh C
Eh Eh C JOO O EH c coo £ C Eh
4J O O tPC Eh p C Eh 3 0 0 3 O O
O Eh C POO JOO 0 Eh C 0 Eh C rH C Eh
£ C Eh C C Eh Eh C Eh JOO > O O O O O
COO POO 4J O O rH O O rH O O CUEh <
Ή C Eh SC Eh 0 Eh C 0 Eh C 0 Eh C 0 C Eh
O O O Eh Eh C £ C Eh > O O > O O c O O
0.0 o 3 C Eh 0 O O SO o Ο'Ο O 0 O o
0 C Eh COO JOO H Eh C H C Eh rH O O o o o POO C C EH J OU rs
ao o 3 0 0 POO SO o SU O 3 o o
POO 0 Eh C SC EH rH O O rH O O rH C Eh
Eh Eh C JOO Eh Eh C o o o O O O O O O
POO 0 O O 0 C Eh rH Eh C rH O O 0>C Eh
0 O O POO >2 Eh 0 Eh 2 0 EH C POO
W EH c CK O O J 2 Eh > O O > O O COO
0 C Eh P C Eh POO 3 0 0 0 C Eh POO
POO JOO JOO 0 Eh C rH Eh C SC Eh
CU O O sse Eh C Eh JOO H C Eh Eh Eh C
0 O O rH O O rH O O rH O O 3 O O
POO POO 0 Eh C 0 Eh C 0 Eh C 0 Eh C
CU O O CU o o > O O > O O > O O J o o
rH rH rH rH rH rH
O VD <\] CO O
co CO σ< cn o rH
Hf Hf Hf Hf in in
Z
ΤΟ
ΕΞ
172 133 rf
Li 0 0) 0 W Eh . «00 HU U 0 u 0 0 0 0 rf Eh 0 0 rf fi 0 0 0 0 0 Eh rf
Li fi
Eh
C
FIG. 1O
GlyMetMetLeuAlaGluGlnPheLysGlnLysAlaLeuGly
0) fi 3 Φ fi _ _ 0 0 0 0 0 0 0 0 Eh 0
0 0 0 Eh rf 0 0 rf _ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 sr 0 0 rf Eh 0 0 0 0
S£ 0 0
BS 0 0 rf Eh 0 0 0 0 rf Eh 0 0 0 O 0 O O 0 0 O
B 0 0 0 Eh rf rf Eh 0 0 H rf rf Eh 0 0 0 0 0 0
<y 0 0 Li 0 0 0 rf Eh 3 0 0 U 0
fi Eh rf fi 0 0 Li 0 0 Φ Eh rf rH 0 0
CL Eh rf Eh rf Eh CL 0 0 fi 0 0 0 0 U
Li 0 0 Li rf Eh Li 0 0 C 0 0 Φ 0 0
fi U 0 Φ 0 0 Φ 0 0 rH rf Eh rH Eh rf
Eh rf Eh W Eh rf CO rf Eh 0 0 0 K rf Eh
3 0 0 3 0 0 Li 0 0 « U 0 « 0 0
rH rf Eh Φ Eh rf fi 0 0 rH 0 0 rH U 0
0 0 0 fi Eh rf Eh rf Eh rf 0 0 rf 0 0
3 0 0 0 0 rH 0 0 « Eh rf « 0 0
ω Eh rf iH 0 0 fl Eh rf rH 0 0 rH 0 0
fi 0 0 0 0 0 > 0 0 rf 0 0 rf 0 0
to « 0 0 « Eh rf rH 0 0 >, 0 0
>. rf fi rH 0 0 rH 0 0 « Eh rf r—l 0 0
fi rf fi rf 0 0 rf 0 0 > 0 0 0 0 0
c rf £· 3 0 0 « Eh rf CL 0 0 « Eh rf
rH rf fi Φ Eh rf H 0 0 Li 0 0 rH 0 0
0 0 0 fi Eh rf rf 0 0 Eh Eh rf rf 0 0
CL 0 0 Li 0 0 Li rf Eh >, 0 0 3 rf Eh
Li 0 0 >i rf Eh fi 0 0 rH 0 0 Φ Eh rf
Eh Eh rf Eh Eh rf Eh rf Eh 0 0 0 fi Eh rf
C 0 0 C Eh Φ Eh (rf >1 0 0 0 0
(0 rf Eh rH rf Eh fi Eh rt rH 0 0 fi 0 0
rf rf Eh 0 0 0 CL Eh (rf 0 0 0 0 0 0
Li 0 0 Φ rf Eh « Eh rf 3 0 0 « Eh rf
fi 0 0 rH Eh rf fi ri 0 0 Φ Eh rf ri 0 0
Eh rf fi K rf rf 0 0 fi Eh 2 rf 0 0
C 0 0 >i 0 0 4J 0 0 Φ rf Eh >1 0 0
ι—1 rf Eh ι—1 0 0 Φ Eh rf rH Eh rf rH 0 0
0 0 0 0 0 0 2 rf Eh l-H rf Eh 0 0 0
—H 0 0 Li Eh rf 3 0 0 c 0 0 rH 0 0
« Eh rf Φ 0 0 Φ fi rf co rf Eh « Eh rf
> 0 0 ω rf Eh fi fi rf rf 2 Eh t> 0 0
« fi rf w 0 0 Li rf Eh Φ 0 0 Φ fi <
t—1 0 0 rH Eh rf Φ 0 0 fi Eh rf fi fi rf
rf 0 0 H rf Eh W fi rf CL Eh rf CL Eh 2
0 Eh rf Φ 0 0 « fi 2 3 0 0 « 0 0
Li 0 0 fi Eh rf rH 0 0 Φ Eh rf ri 0 0
CL 0 0 CL Eh rf rf 0 0 fi 0 0 rf 0 0
« 0 0 C 0 0 Φ Eh rf 3 0 0 Li Eh rf
rH 0 0 0) rf Eh rH Eh 2 Φ Eh rf fi 0 0
rf O 0 rf rf fi H rf Eh fi 0 0 Eh rf Eh
Φ 0 0 CL 0 0 « 0 0 Li 0 0 « Eh rf
rH Eh rf Li 0 0 rH 0 0 fi 0 0 rH 0 0
W rf Eh Eh Eh rf rf 0 0 Eh rf Eh rf 0 0
rH fi rf 4J 0 0 0 0 0 C rf Eh « 0 0
« Eh rf Φ Eh rf Li 0 0 rH rf Eh rH 0 0
> 0 0 S rf Eh CL 0 0 0 0 0 rf 0 0
3 0 0 co Eh rf C 0 0 Li 0 0 >1 Eh rf
rH rf fi •rH rf Eh CO rf Eh Φ 0 0 rH 0 0
0 0 0 X 0 0 rf 2 Eh ω rf Eh 0 0 0
« rf Eh co 0 0 >lfi rf Li Eh rf 0 0 0
rH 0 0 >1 rf Eh ri 0 0 fi 0 0 Li 0 0
rf 0 0 fi rf Eh 0 0 0 Eh rf Eh CL 0 0
c 0 0 « 0 0 0 Eh rf Li 0 0 « 0 0
rH rf Eh rH 0 0 Li 0 0 fi 0 0 rH 0 0
0 0 0 rf 0 0 CL 0 0 Eh rf Eh rf 0 0
tP Eh rf CL 0 0 3 0 0 3 2 Eh « 0 0
Li 0 0 Li 0 0 Φ Eh rf Φ Eh rf rH 0 0
rf 0 0 Eh Eh rf fi 0 0 fi 0 0 rf 0 0
«00 rH 0 0
rf 0 0
ri 0 0
« Eh rf
> 0 0
>10 0
rH U 0
0 0 0
« 0 0
rH 0 0
rf 0 0
>10 0
rH 0 0
0 0 0
Li fi rf
X fi
fi H rf
>i0 0
ri 0 0
0 0 0
« rf fi
ri 0 0
rf 0 0
3 fi Φ fi fi 0 s 0
Φ 0 0
rH fi rf
H rf fi
CLO 0
CO rf fi
rf 0 0
Φ rf fi
ri fi rf
W rf fi
3 0 0
Φ fi rf
fi 0 0
rH 0 0
« fi rf
> 0 0
CO 0 0
X fi
J rf fi
>10 0
rH 0 0
0 0 0
3 0 0
Φ fi rf
fi 0 0
X fi
-H 0 0
0 0 0
rH « fi > 0 3 0
Li fi rf
Φ 0 0
W rf fi
rH rH rH rH rH ri
VO Ci CO O to
rH Ci Ci O TT
in ICI tn ID If) in
Ci tn in
172 133
-Η O (0 H O rf ra rf Eh Φ rf Eh rH Eh rf ra rf Eh 3 0 0 Φ Eh rf Φ o o rH Eh rf
rH o O rH o O
> O o rf o o W rf Eh rf o o JOO W rf Eh
3 O o ra rf Eh 3 0 0 a Eh rf CPrf Eh £UO O
Φ Eh rf rH o O Φ Eh rf m rf Eh U O O ra rf Eh
J U o rf o O JOO rf o O rf o o rf o o
cuo o W Eh rf CPO O u o o CPO o CPO o
ΙΛ rf Eh >o o U O O Φ o o u o o u o o
— rf o O o Η rf rf O O ω rf Eh rf rf Eh rf rf Eh
>30 O rH O o c o o 3 O o 3 0 0 3 3 H
rH rH rf Eh ra Eh rf w rf Eh rH rf Eh Φ Eh rf Φ Eh rf
o o o O > O o rf 3 Eh o o O JOO JOO
— u o O rH O o a o o 0 o O 3 0 0 CUO O
a o o ra Eh rf Φ Eh rf u o o Φ Eh rf U O O
H rf Eh > O o S rf Eh a o o JOO Eh Eh rf
U O o >o o CUO o rH o o C O O U O O
Φ u O rH O o u o o ra Eh rf rH rf Eh ω o o
W Eh rf o O o Eh Eh rf > O o O O O W Eh rf
0 O O r—I o o c O O u O o U O O >Eh rf
U O o ra Eh rf rH rf Eh >rf Eh a o o rH O O
a o o > O o O O O Eh Eh rf Eh rf Eh o o o
rH o o rH rf Eh rH O O ra O O r-l 3 Eh u o o
(0 Eh rf ra Eh rf Λ Eh rf •rH rf Eh ra Eh rf Φ o o
> O o > O O > O O X O o > O O W Eh rf
3 O o 3 O o ra rf Eh u O o U EH rf W O O
rH rf Eh © Eh rf rH O O a o o a o o >O O
O o O J O o rf o o Eh rf Eh Eh rf Eh O Eh rf
>Eh rf ra O o >o o 0 o O 3 0 0 0 rf Eh
rH O o rH O o rH O O U o O Φ Eh rf U O O
O o o rf o o o o o a o o JOO a o o
u o o >rf Eh 3 0 0 u o o U O O U Eh rf
Φ o o rH o O rH rf Eh φ o o Φ O O a o o
ω rf Eh o o O O O O w Eh rf ~ W rf Eh Eh rf Eh
a o O o o o >o o rH Eh 3 ra U O O U O O
0) Eh rf u o o rH O O ra Eh 3 > Φ O O a o o
a rf Eh a o o o o o > O O O W rf Eh Eh rf Eh
Φ o O u o o 0 o o ra Eh rf (0 3 0 0 U Eh rf
rH Eh rf φ o o u o o •rH rf Eh -H Φ Eh rf >O O
M rf Eh ω Eh rf a o o X O O X JOO O Eh rf
ω o O 3 O o >o o c O O Φ rf Eh 3 0 0
>rf Eh Φ Eh rf rH o O ra Eh rH Eh rf rH rf Eh
J rf Eh JOO o o o rf 3 Eh W rf Eh O O O
Φ o O Φ O O rH EH rf >0 O ra o o U O O
a EH rf rH Eh rf ra EH 3 rH O O rH O O Φ O O
a H rf W rf Eh > o o O O O rf o U W Eh rf
(0 rf Eh ra O o ra u o CPO o U EH rf U O O
rH O O rH O o •H rf EH U o o a o o Φ O O
rf o O rf O o X o o rf o o Eh rf Eh W rf Eh
rH O O 0 o o CPO o U o o rH O O Φ 3 Eh
<0 Eh rf u o o u o o Φ o o Λ Eh rf r-· Eh rf
> o O a o o rf U o w Eh rf > O O W rf Eh
3 EH 3 3 o o CPO o ra O o CPO O CUO o
Φ Eh rf Φ Eh rf u o o rH O o U O O uuo
J O o J o o rf o o rf o o rf O o Eh Eh rf
<0 Eh rf 3 < Eh 3 0 0 Φ o o ra o o c O O
rH O o Φ Eh rf Φ EH rf a Eh rf rH O o rH rf Eh
rf O o J O O JOO a Eh 3 rf o o O O O
>rf Eh e Eh rf Φ rf Eh ra O o ra Eh rf ra o o
rH O O ra rf Eh rH Eh rf rH O o rH O O •H rf eh
O o O rf 3 Eh H rf Eh rf o o rf o o X O O
rH rH rH rH rH rH
00 ^J· O to CM 00
tn t£> co 00
tn tn tn tn tn tn
FIG. 1P
172 133
u ο ο mc Ε (OCE φ o o Φ o o w o o 3 C E
φ ε c Μ Ο Ο X Ε β E C β E C H < H rH 2 E
2 c ε C ο ο 43 2 Ε CU E 2 CU E 2 X O O o O o
3 U Ο αο ο Η ο Ο M O O Li O O ω o o o o o
φ Ε C Μ ο ο β Ε C β o o β O O β E C Lh o o
41 U Ο Ε Ε C > ο ο ECE ECE CU E 2 CU u o
W Ο Ο Η Ο ο ιη Ε C >iO O M O O αο o M o o
>C Ε β Ε C •η C Ε H o o >iC E (OCE 0) o o
41 2 Ε > Ο Ο Ε ο Ο ooo Ε E C c o o W E C
β Ε C >ιθ Ο :χ Ε MEC C O O >□ o 0 C E
Η Ο Ο Η Ο Ο Η ο Ο Φ O O (OCE H o O M O o
C Ο Ο ΟΟΟ οοο W C E C 2 E ooo CU o o
ω c Ε (ΟΟΟ MEC αο o ooo H o O rH o o
>2 Ε X Ε β ο ο M O O M O O β E C β E C
43 2 Ε 43 2 Ε Ε C Ε Ε E C CU O O > o o > O o
3 2 Ε MEC Φ ο ο 4J o O β O O c o o c o o
Φ Ε C X Ε Η Εί C Φ E C H o O h C E rH C E
41 U Ο Ε Ε C Η c Ε 2 C E c o o ooo O O o
αο ο >0 Ο 3 0 0 c o o 0 E C mo o w o o
Li Ο Ο Η ο Ο η C Ε (OCE M O O M O O >.o o
Ε Ε C οοο ΟΟΟ C 2 E α o o C C E o E C
μ υ ο mo ο β Ε C mo o 3 E C Φ 2 E 0 O o
β ο ο Μ ο ο Η Ο Ο M o o Φ E 2 HEC M o o
Ε C Ε C ο ο C Ο Ο C C E 41 O O H c E CU o o
(ΟΟΟ C ο ο X Ε (OOO ooo 3 0 0 W o o
X Ε η C Ε Η ο Ο >0 o M O O h C E o
41 2 Ε οοο οοο O E C CU o o ooo O E C
φ Ε C (ΟΟΟ (0 Ε C M O O M O O H o O W C E
β Ε 2 >ι0 Ο >.0 Ο β O O β O O β E C >1 2 E
CU Ε 2 υ ε c Ο Ε C ECE ECE > o o 43 2 E
η ΛΟ ο Μ Ο Ο (ΟΟΟ mo o WEC MEC 3 o o
Ό w c ε Φ ο ο ‘•Η C Ε M o o >0 O X E Φ E C
«- C ο ο WEC 33 Ο Ο C C E O E C Ε E C β O o
Μ Ο Ο Η ο Ο (ΟΟΟ 0 E C OOO 3 C E C E C
* Φ Ο U β Ε C >,0 Ο M O O M O O H C E W. C E
CD w c Ε > ο ο Ο Ε C CU O O CU O O OOO c 2 E
β. 3 0 0 Φ Ε C mo ο >E C >u o 3 0 0 αο o
LL Φ Ε C β Ε 2 Μ Ο Ο H o O H o o H C E w C E
41 Ε 2 α Ε 2 C ο ο ooo ooo OOO c O o
Η Ο Ο οοο MEC H o O M O O β C E M E C
β Ε C Μ Ο Ο β ο ο fl E C β O O H o O β O o
> Ο Ο α ο ο Ε C Ε > O O ECE c o o E C E
3 0 0 Φ ο ο (ΟΟΟ Φ o o M O O MEC M E C
Η C Ε HEC Η C Ε Η E C β O O Φ O O β O O
οοο Η C Ε X Ο Ο H C E ECE WEC ECE
W Ο Ο >10 Ο 400 mo o M O O H O O POO
>ιθ Ο Η ο Ο Φ Ε C M o o >C E β E C Φ E C
Ο Ε < οοο ECE C C E Ε E C >00 2 C E
Φ C Ε 0 Ε C Φ Ο Ο β o u β O O mo o >E C
HEC Μ Ο Ο HEC Φ E C H O O M O O rH o o
Η C Ε α ο ο Η C Ε 2 C E c o o C C E o o o
αο ο 3 0 0 >ιθ Ο M O O C E C αο o M o o
Μ Ο Ο Φ Ε C Η Ο Ο β O O WCE M O O β o o
Ε Ε C β ο ο ΟΟΟ ECE C 2 E Ε E C ECE
αο ο C ο ο αο ο >0 O Φ E C 3 C E H o o
(OCE η c Ε (OCE H o o H E 2 Φ E C β E C
C ο ο οοο ~c o o ooo H c E 43 O O > O O
αο ο OCE H >,o o c o o OOO β O O M o o
Μ ο ο Μ Ο Ο β η ε C (OCE M O O H O O >C E
Ε Ε C α ο ο > o o o C 2 E CU O O C O O Ε E C
ι—Ι Η rH rH rH rH rH
rf ο Φ CM 00 Hf o
σ ο o rH rH CH n
ιη φ Φ V0 Φ Φ
172 133
3 O U 3 rf Eh tfl Ęh rf P u o au o CUO
Φ Ę· rf Φ Eh 3 X Eh Φ o u tn rf Eh tfl rf Eh
X Eh rf X Eh rf X u O OT rf Eh rf O U rf 2 Eh
0 u U c rf P u O RJ U o to Eh rf >»u o
ρ u o rH rf Eh Φ u O X u o X rf Eh X o u
CU u u O U o W Eh rf rf o u X U O o o u
w o u P o u 0 U o X o u c u o >.u o
>rf Eh Φ u o P u o RJ Eh rf tfl rf Ęh X o u
X rf Ęh OT Ę* rf CU u o > O u rf 2 Eh o o u
W U O >ϋ U aEn rf P Eh rf RJ Ęh rf P O U
>0 u rH O u to rf ĘH Φ U O X U O Φ Ęh rf
U H rf o o u rf o U OT Eh rf rf o u X rf EH
0 U O X rf Ęh P Eh rf 0 U O P u o 3 O U
P U U (0 Eh rf X U O P u o X u o X rf Eh
CU U O > O U Eh rf Ęh CU u o Ęh rf Eh O O U
0 U O 0 o u 3 U O 0 u o tfl U o c o u
P u o P u o Φ Ęh rf P u o >iOU X rf Ęh
CU u o CU u o X U O CU u o U Ęh rf O U O
euu P u o 4-1 O u P rf Ęh P Ęi 2 CPO u
χ u o >rf eh Φ Ęh rf Φ U o X U O P o u
rf o u Eh Eh rf X rf Ęh OT Eh rf Ęh rf Eh rf rf Ęh
Φ Ęh rf 3 rf Eh P u O >»rf Eh RJ 2 Eh ao u
X H rf rH rf Eh Φ u O X O U X U O P o u
CU Ęi rf o O u OT Ęh rf o o u rf o u Eh Ęh rf
CPO U tfl u o P O u CPO u tfl o u 3 rf Eh
P o u X rf Ęh X U o P o u ss Φ Eh rf
rf rf Ęt X U O Ęh rf Ęh rf rf Eh X X U O
W Ę| rf 3 u o 3 O U RJ O U 3 u o 3 U O
X rf Eh Φ Eh rf Φ Ęh rf X u o Φ Eh rf Φ Eh rf
X U O X U O X Eh 2 rf o u X U O X U O E
3 rf Eh >rf Ęh X O U 3 o u P Eh rf CUO
Φ Eh rf X U O X O o u o u RJ Ęh rf > O U φ X ss Φ OT U O Ęh rf
CPO O X rf Ęh (0 u O CPO u 0 rf Eh RJ U O
P O O (0 Eh rf X U o P o u P U O X U O o
rf U O > O U rf O u rf CU u o rf O U
X O U CPrf Ęh χ o u θ' RJ Eh rf 3 O U Ll
RJ Eh rf P O U (0 ĘH rf P o u X U O X rf Eh
> O U rf rf Eh > O u rf u o rf o u O O U
>iO O Φ U O au o xo u P u o Φ rf Ęh
x O U X Ęh rf to rf Ęh X o u Φ u o X Ęh rf
O O O CU Eh rf rf o U o o u OT Eh rf X rf Ęh
au o P rf Ęh 0 o u RJ u o 3 rf Ę· 3 U O
W rf Eh Φ U O P u o X u o Φ Ęh rf © Eh rf
rf o u OT Eh rf CU u o rf o u X U O X U O
3 O U X rf Eh 3 rf RJ o u c O U 3 O U
ses (0 Ęh rf X rf X u o X rf Eh X rf Eh
> O U o o rf o u o U O O O U
3 rf Eh 3 O U 0 u o 3 o u P U o RJ Eh rf
X rf Eh rH rf Eh P u o X rf EH Φ o u X U O
O O U o O U CU U o O O U OT rf Eh rf O U
P rf Ęh 3 O U 3 O u RJ rf Ęh RJ Ęh rf a Eh rf
X U O rH rf Eh χ rf Eh X U O X U O tfl rf Ęh
Eh rf Eh o O U O O U rf o u rf O U rf O U
Φ U O CPO u ta u o P rf Ęh P o u 0 Eh rf
X Ęh rf P O u >u u X U O Φ u o P U O
a Eh rf rf u o U Ęh rf Ęh rf Ęh OT Ęh rf CU U O
Φ Eh rf 3 o u 0 Ęh 2 Φ 2 Ęh P U O P U O
X Ęi rf Φ Ęh rf P U o X Eh rf Φ u o Φ U O
CU Eh rf X U o CU U o X rf Ęh OT Ęh rf OT Ęh rf
rH X X X X X
ID CM CO O 10
n in 10 ID
10 1O 1O 10 10 10
172 133
Oirf ΕP 0 O rf rf E-< Oi0 O P 0 O O 0 Eh rf ω u 0 W Ed rf ω 0 o >.rf eh X rf Eh 010 0 P 0 0 rf 0 0 □ 0 0 0) Eh rf X 0 0 0 0 0 Eh rf
P rf
Eh
FIG. 1S
0 0 <0 rf Eh X 0 0 rf 0 0 O 0 0 P 0 0 CU 0 0 X rf Ej <0 Eh rf >00 P 0 0 <ł> 0 0 W Eh rf O 0 0 X EH rf X rf Eh 3 0 0 X rf Eh 0 0 0 010 0
P 0 0 X 0 0 Eh rf Eh 3 0 0 X rf Eh 0 0 0 X 0 0 <8 Eh rf >00 3 rf Eh « Eh rf X 0 0 0 0 0 0 0 O 0 0 0 O 0 CU 0 0 C 0 0
3£
Eh rf >irf Eh Eh Eh rf 0.0 0 W rf Eh rf 0 0 0 0 0 P 0 0 CU 0 0 O>0 0 P 0 0 rf 0 0 «00 X 0 0 rf 0 0 0.0 0 P 0 0 Eh Eh rf «es >00 0 0 0 P 0 0
U) 0 0 >irf Eh
X o
P
CU o
P
CU <D
X
P
X rf
Eh
Eh rf
0 0 0 0 0 Eh
SSe<
ω 0 0 Eh
P
CU o
P to rf
P
0 0 0
B 0 0 0 0 rf Eh
P 0 0 CU 0 0 s e S
X 0 0 0 0 0 P 0 0 CU 0 0 W EH rf >0 0 0 Eh rf >0 0 X 0 0 0 0 0 10 Eh rf X rf Eh X 0 0 X 0 0 « Eh rf >00 X 0 0 « Eh rf >00 O Eh rf P 0 0 CU 0 0 O rf Eh P 0 0 CU 0 0 sse 0 0 0 P 0 0 rf Eh , Eh 0 0 0 P Eh rf X 0 0 Eh rf Eh 3 0 0 Φ Eh rf X 0 0 X 0 0 Eh «
>
X «
>
P
X _ _
Eh rf Eh Oi0 0 P 0 0 rf 0 0 (0 0 0
S3B (0 0 0 >irf Eh X rf Eh 010 P
Eh rf
O
P
CU o
P rf
0 0 0
B 0 0 0 0 0 0 0
Φ
X _
CU Eh P 0 0 Φ 0 0 ~rf rf Eh P P 0 0 Φ X 0 0 W Eh rf Eh ** « 0 0 0 0 φ
X
0 0 0 Eh rf 0 0 0 0
P 0 0 Φ 0 0 W Eh rf 0.0 0 W rf
O
P rf Eh 0 0
0 0 0 CU 0 0 0 0 0 0 0 0 0 (0 0 0 >10 0 0 Eh rf >0 0 0 0 0 0 Eh
P
CU
P Φ W o
P _ _
CU 0 0 «00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 B
P Eh rf Φ 0 0 W Eh rf P 0 0 Φ 0 0 W Eh rf ‘ rf Eh 0 0
0 Eh rf
P
CU
P
X
Eh
P
X
Eh
Eh
W EH rf rf 0 0 CU 0 0 Eh Eh rf CU 0 0 0 0 0 Eh rf Eh
3 0 0 3 0 0 3 0 0 0.0 0 0 Eh rf «00 P 0 0
X rf Eh X rf Eh Φ Eh rf (0 rf Eh P 0 0 X 0 0 X 0 0
0 0 0 0 0 0 X 0 0 rf 0 0 CU 0 0 rf 0 0 Eh rf Eh
X Eh rf 0.0 0 «00 0 0 0 X 0 0 3 0 0 C Eh rf
« Eh rf (0 rf Eh X 0 0 P 0 0 « Eh rf Φ Eh rf (0 rf Eh
> 0 O rf 0 0 rf 0 0 CU 0 0 > 0 0 X Eh rf rf rf Eh
010 0 3 0 0 C 0 0 (0 0 0 0 F rf «00 O.0 0
P 0 0 X rf Eh X rf Eh >irf E< P 0 0 X 0 0 (0 rf Eh
rf rf Eh 0 0 0 0 0 0 X rf Eh CU 0 0 rf 0 0 rf 0 0
P 0 0 3 0 0 «00 (0 rf Eh 0 Eh rf P Eh rf >10 0
X 0 0 X rf Eh X 0 0 >irf Eh P 0 0 X 0 0 X 0 0
Eh rf Eh 0 0 0 rf 0 0 X rf Eh CU 0 0 Eh rf Eh 0 0 0
Φ 0 0 «00 Φ 0 0 0.0 0 P 0 0 P Eh rf P 0 0
X Eh rf X 0 0 X Eh rf P 0 0 Φ 0 0 Φ 0 0 X 0 0
H rf Eh rf 0 0 CU Eh rf Eh Eh rf W Eh rf W Eh rf Eh rf Eh
X X X X X X X
f\ α Hf o 50 fu co
r* α 01 05 o o
50 50 50 50 50 Γ*»
172 133
3 Eh rf 0 O O 0 A Eh P O O 3 o O 0 Eh
0 Eh rf SO O >. 2 Eh J O o 0 Eh rf rH O
J O o O Eh rf J rf Eh Eh rf Eh J O o rf O
O. Eh rf 0 O o c o O P O O i—l Eh rf 0 O
0 rf Eh S.O o r-1 rf Eh 0 o O 0 Eh 2 rf
rf O O O Eh rf o o O to Eh rf > O o J 2
0 O O rH O o 3 rf Eh P Eh 2 c rf Eh rH o
P O o 0 Eh rf rH rf Eh Srf Eh r-H 2 Eh 0 Eh
CU O o > O o O o O Eh Eh rf O o O > O
Q.Eh rf rH O o 3 Eh rH O o 3 o O 0
W rf Eh 0 Eh rf rH 2 Eh 0 Eh rf 0 Eh rf >1 2
rf O o > O o O o O > O o J O O J 2
SO o O.Eh rf 0 o O 3 O o cnrf Eh P rf
O U O O O
Eh
O
P
CU
U o u o o u rf eh o o o SU u rH o U o o u 3 0 0 rH rf Eh O O O 3 0 0 Eh ' (PheAla)
J o P CU o P
CU o o 40 0 0 Eh rf £ rf Eh POO 0 o o ' rf o o o w EH rf P Eh rf X Eh Eh Eh rf POO 0 o o
O O O o o o o o o o o o
2S to
Eh rf O O rf Eh O O O « EH rf O O O O rf Eh rf O O 3 0 0 rH rf Eh O O O 0 O O O O O O O O sr o o rH O O rf O O 3 0 0 rH rf Eh O O O P Eh rf 0 O O W rf Eh P Eh rf 0 O O W rf Eh rH O O 0 E* rf O O O O O
O O to EH rf 0.0 O POO Eh Eh rf P rf Eh 0 O O to EH rf SO O rH O O O O O 0.0 o 0 rf Eh O O rf c
rf >
P
J
Eh
P
O
Eh
Eh
O O rf O O 0 O O rH O O rf O O 0 o o >o o O eh O P CU
P _ JOO Eh rf Eh O O Eh rf O O o o
B o rf eh O O rf O O >,O O rH O O o o o P rf eh JOO Eh rf Eh 0.0 O POO sps o o to EH rf POO X eh rf Eh O O
O O O O O O O O >
J
FIG. 1T
Eh Eh rf rf rf EH tO rf EH EH
P Eh 2 0 O O cno o 0
0 O O rH Eh rf POO •rl
tO Eh rf H rf Eh rf o o £
JOO 0 O O P rf eh P
0 Eh rf P O o 0 O O 0
£ rf Eh CU o o tO Eh rf to
0.0 o P o o P rf EH 3 O O P o O 0.0 o
0 rf eh 0 o o 0 O O 0 Eh rf J o O 0 rf Eh
rf O O to rf Eh to Eh rf J O O Eh rf Eh rf O O
rH rH rH rH rH rH
O V0 CN 00
rH CN CN n M *3·
Γ Γ- t- Γ
172 133 c
cn <
Φ
H a
•H
X o
£
Eh
0 0 Φ 0 U W < Eh α u 0 >0 U s&s
0 0 <00 3 < Eh rH < Ę-* 0 0 0
0 0 < Eh 0 0 0 4 < Eh <0 eh < >00 O 0 0 Φ 0 0 W Eh < 3 < Eh Φ Eh < — 4 0 0 Φ 3 0 0 £
CU ®£3 τ' C 0 0 ase
0
SS
0 Eh <
< Eh 0 0 < Eh 0 0 0 0 0 0 se « Eh < >00 «00 4 0 0 <00 a 0 0 &
O»< Eh 0 0 0 < < Eh «00 4 0 0 <00 a Ej < •H < Eh X 0 0 a 0 0
O 0 0 <00 H00 « Eh < >00 0.0 0 a < Eh <00 Bi' a _.
0 0 <00 >0 0 4 0 0 0 0 0 O Eh < X Eh Eh Eh < >Eh < •4 0 0 0 0 0 aua
CU EH <
« Eh < 4 0 0 < 0 O 4 0 0 Φ Eh < X < Eh Φ O 0 4 Eh < H < Eh O 0 0 £ 0 0 Eh < Eh O Eh < £ 0 0 H < Eh 0.0 0 B < Eh <00 Φ < Eh Eh < ' Eh . Eh 0 0 0 0 O < Eh £00 « Eh < >00 C Eh <
O
O
CU < . _
0.0 0 a < Eh
30S
0
0 0 Φ Eh <
0 0
Φ o 0 O < Eh CO O O. Eh <
4 Eh < £ O 0 0 0 O w < Eh
H < Eh Eh < Η < O 0 < 0 O
3 O 0 4 H < C 0 O O EH <
Φ Eh < « Eh < rH (<; Eh X Eh
4 O 0 >00 0 O 0 Eh Eh <
CPEh < 4 0 0 X Eh O 0 O
0 0 O « Eh < 4 0 O Φ O 0
< 0 0 >00 0 0 O W EH <
« Eh < 0.0 0 0 < Eh Φ U 0
4 O 0 W < Eh 0 o 0 £ Eh <
< 0 O <00 CU 0 0 CU Eh <
0 < Eh 0 U 0 0 < Eh >0 o
0 O 0 X Eh Φ o 0 4 0 o
Ol o 0 Eh Eh < W Eh < 0 0 o
a 0 O 3 0 0 0 O 0 4 0 o
X Eh Φ Eh < .X EH Φ Eh <
Eh <
< O»Eh O < _ _ > Eh < 4 0 0 0 0 0 >0 0 4 0 0 0 0 0 a 0 0 &
< EH 0 0 0 O Eh < O 0 0 CU 0 0 C 0 0 4 < Eh 0 0 0 « H 5 >00 B 0 0 >0 0 0 Eh < Φ 0 0
Ir. >00
0 0 < E< 0 0 0 C 0 0 a < Eh < < Eh a 0 o e
0 a o 0 >0 0 0 Eh < 4 0 0 « Eh < >00 O»0 0 O 0 O <00 4 0 0 « Eh < >00 >0 0 4 0 0 0 0 0
0 0 « Eh <
0 0 O.Eh < B < Eh <00 0 0 0 0 0 0 CU O 0 Φ O 0 £ Eh < CU Eh < 4 0 0 « Eh < >00 a 0 o
53U
rH rH rH rH rH rH rH
O OJ CO Hf O V£>
Ifl W V0 Γ CO CO
r* r- r* O-
172 133
L. 0 0 3 fi rf CPU 0 CPU 0 3 rf Η Li 0 U
X fi O fi rf Li 0 0 Li 0 0 O Eh rf 43 U 0
fi fi rf 0 0 rf U 0 rf 0 0 »-3 Eh rf fi rf Eh
0 0 0 CPU 0 W 0 0 <0 0 0 CLU 0 0 0 0
rH fi rf Li 0 0 >10 0 rH 0 O tn rf fi 43 fi rf
H rf fi rf rf fi 0 fi rf rf 0 0 rf u u CL fi rf
<0 rf fi 3 0 0 CPU 0 (0 0 0 CLU 0 <0 0 0
rH U 0 Ή rf fi Li 0 0 X fi W rf Eh rH 0 0
rf 0 U 0 0 0 rf rf fi J rf fi rf 0 0 rf 0 0
3 0 U Li 0 0 CPU 0 O U 0 >i0 0 CPrf fi
ri rf fi 43 0 U Li 0 0 Ή fi rf rH 0 0 Li 0 0
0 0 0 fi rf fi rf O 0 H rf fi 0 0 0 rf rf fi
3 0 0 3 0 0 Li fi rf Li 0 0 CO fi rf 3 0 0
Ή rf fi ω fi rf >irf fi >irf fi >10 0 O fi rf
0 0 0 *J u u fi fi rf fi fi rf 0 fi rf *-4 0 0
Li 0 0 Li 0 O >10 O 10 0 0 rH 0 0 Li 0 0
£0 0 ω 0 0 rH 0 0 >10 0 <0 fi rf 0 0 0
fi rf fi W fi rf 0 0 0 0 fi rf >00 W rf fi
CPfi rf CO 0 0 CO 0 0 Li fi rf 3 0 0 <0 0 0
Li 0 0 X fi >10 0 43 0 0 O fi rf ri 0 0
rf 0 0 J rf fi 0 fi rf fi rf fi *4 0 0 rf 0 0
0 0 0 0 0 0 C 0 0 3 0 0 JJ 0 0 <0 0 0
(H fi rf rH fi rf tn rf fi O fi rf O fi rf ri 0 0
H rf fi H rf fi rf rf fi J 0 0 2 rf fi rf 0 0
0.0 0 <0 0 0 3 0 0 Li 0 0 Li 0 0 0.0 0
w rf fi rH 0 0 rH rf fi £ U 0 43 0 0 W rf fi
<00 rf 0 0 0 0 0 fi rf fi fi rf fi rf 0 0
U 0 0 r-ł 0 0 >10 0 C 0 0 CO 0 0 3 0 0
0 0 0 <0 fi rf H00 SSB >10 0 rH rf fi
W rf fi >00 ->0 0 0 0 fi rf 0 0 0
3 0 U CPU 0 >1 CPU 0 >1 fi rf CLU 0 C 0 0
rH rf fi Li 0 0 rH Li 0 0 rH 0 0 01 rf fi ri rf fi
0 0 0 rf 0 0 SiSB 0 0 0 rf 0 0 0 0 0
Li fi rf Λ 0 0 CO fi rf fi 0 0 ri O 0
43 0 0 H0 0 0 0 0 >10 0 rH rf Eh <0 fi rf
fi rf fi rf 0 0 BS 0 fi rf 0 0 0 >00
ri 0 0 Isb Li 0 0 3 0 0 >10 0
<0 fi rf SSB O 0 0 O fi rf <-H 0 O
>00 0 0 0 W rf fi *J 0 0 0 0 0
Li rf fi O 0 0 Li 0 0 Li fi rf >10 0 <0 0 0
Χ 0 0 Li 0 0 £ U U Λ 0 0 ri 0 0 rH 0 0
fi rf fi CL 0 0 fi rf fi SSB 0 0 0 rf 0 0
Li 0 0 CLU 0 3 fi rf Λ rf fi Li 0 0
0 0 0 CO rf fi 0 fi rf 43 0 0 rH 0 0 0 0 0
W fi rf rf 0 0 JO0 fi rf fi rf 0 0 W rf fi
0.0 0 3 0 0 0 fi rf 3 0 0 10 0 0 3 rf fi
tn rf fi O fi rf Li 0 0 O fi rf ri 0 0 c-ł fC £η
rf 0 0 0 0 CL 0 0 *-3 0 0 rf 0 0 0 0 0
0) fi rf CLU 0 >0 0 rH rf fi CPrf fi CO fi rf
43 fi 2 CO rf fi H00 <0 fi rf Lł 0 0 >10 0 0 fi rf
CL fi rf rf 0 0 0 0 0 >00 rf 0 0
CO 0 0 CO fi rf >0 0 >10 0 CO fi rf 0 0 0
>0 0 >10 0 ri 0 0 ri 0 0 >10 0 rH fi rf
0 fi rf 0 fi rf O 0 0 0 0 0 0 fi rf H rf fi
CPU 0 Li 0 0 CO fi rf >10 0 Li 0 0 0 0 0 <0 0 0 ri 0 0
rf 0 0 0 fi rf >00 W rf fi rf 0 0 >00
Li 0 0 Jh fi rf <0 0 0 <0 rf fi ri 0 0
£00 X fi rH 0 0 -H 0 0 <0 fi rf
fi rf fi 0 0 0 fi fi rf rf 0 0 rf 0 0 >00
iH ri ri rH rH ri
CM CO Ί* O to <N
σ> <P O rH ri <N
co CO CO CO
FIG. 1V
172 133
FIG.1W
3OU mo ο β C Ε αο ο 3 C Ε 0 Ε C >,Ε C
WEC Μ ο ο Η ο ο Μ ο ο Η C Ε Μ Ο Ο Η ο Ο
41 Ε 2 C C Ε C Ο Ο Ε Ε C ΟΟΟ tu Ο ο ΟΟΟ
αο υ (ΟΟΟ MCE 3 0 0 3 Ε C 3 C Ε OCE
(OCE X Ε β Ο Ο Φ Ε C Φ Ε 2 Φ Ε C Μ Ο Ο
cuo 41 2 Ε Ε C Ε •4 0 0 43 Ο Ο •4 0 0 CU Ο Ο
Μ Ο Ο X Ε 3 0 0 MCE C Ο Ο αΕ c MEC
X Ε Η ο ο η < Ε β Ο Ο Η C Ε (OCE Φ Ο Ο
Ε Ε C οοο ΟΟΟ Ε C Ε ΟΟΟ C ο ο W Ε C
3 C Ε β Ε C αο ο ΟΟΟ αο ο 3 Ε C Μ Ο ϋ
η C Ε Η Ο ϋ Μ ο ο Μ Ο Ο (OCE Φ Ε 2 >«C Ε
ΟΟΟ C Ο Ο Ε Ε C 0.00 C Ο Ο 43 Ο O Ε Ε C
OCE >ιθ Ο β ϋ ο β Ο ϋ mo ο OCE Μ Ε 2
Μ Ο Ο Η ο Ο Η ο ϋ Η ο Ο Μ ϋ Ο Μ Ο ϋ Φ Ο Ο
CU ο ο οοο c o o C ϋ ο C C Ε CU Ο Ο W C Ε
β C Ε αο ο β Ε C Φ Ε C β ο ο 3 C Ε (ΟΟΟ
Η 2 Ε (OCE Η ϋ Ο β Ε 2 Η ο Ο Η C Ε η C Ε
ο υ ο C ο ο c o ο α Ε 2 C ο ο ΟΟΟ X Ο Ο
OCE (ΟΟΟ mc ε Ρ ϋ ο Φ C Ε OCE 3 0 0
Μ Ο Ο -η c Ε Μ Ο Ο Φ Ε C HEC Η Ε C Φ Ε C
tu υ ο X ο ο C C Ε 2 C Ε Η c Ε Η c Ε •4 0 0
0 u ο β ο ο β ο ο Φ ο ο 3 Ε C Μ Ο Ο MCE
Μ Ο Ο Η ο ϋ Η ϋ Ο HEC Φ Ε 2 Φ Ο Ο Φ Ο Ο
(U ο ο C ο ο C ϋ ο Η C Ε 43 Ο Ο ω Ε c W Ε C
αο ο Η ο Ο 3 0 0 Φ 2 Ε Η Ο Ο Μ Ο Ο 0 Ε 2
to C Ε β Ε C φ Ε C HEC β Ε C X Ε β Ε 2
c ο ο > o o •4 ο ο Η c Ε > Ο Ο Ε Ε C tu Ε 2
>ιθ Ο MCE οοο C Ο Ο Μ Ο Ο (ΟΟΟ β C Ε
Η ο ϋ φ ο ο Μ Ο Ο WCE Φ Ο Ο >ιϋ Ο Η ϋ Ο
οοο w Ε C α ο ο C 2 Ε W C Ε ϋ Ε C C Ο Ο
0 Ε C Η ο ϋ Μ Ο Ο >ιθ ο β) β Ο Ο Μ Ο Ο
Μ Ο Ο β Ε C β ο ο Η Ο Ο β Ε 2 Η Ο ϋ Φ Ο Ο
CU Ο Ο > Ο ϋ Ε C Ε ΟΟΟ α ε c C Ο Ο W C Ε
ΟΟΟ β ο ρ Μ 2 Ε □ C Ε Φ ο ο >»ο Ο 3 0 0
Μ Ο Ο (OCE β ο ο φ Ε C β Ε C Η ο ϋ Φ Ε C
CU Ο ϋ C 2 Ε Ε C Ε 4UO α Ε 2 οοο 41 Ο Ο
α ο ο Μ Ο Ο 0 Ε C αο ο to Ε 2 Μ Ο Ο >ιθ Ο
Η ο ο Φ ο ο Μ Ο Ο Μ ο ο Η C Ε >iC Ε Η Ο Ο
c ο ο ω ε c α ο ο Ε Ε C X Ο Ο Ε Ε C ΟΟΟ
Μ Ο Ο Μ Ο Ο αο ο Μ Ο Ο Μ Ο Ο Φ Ο Ο (0 Ε C
Φ ο ο Φ ο ο (OCE Φ Ο Ο β Ο Ο HEC Η c Ε
W Ε C OT Ε C c ο ο W Ε C Ε C Ε Η C Ε X ο ο
Μ Ο Ο (ΟΟΟ mE c β Ε C Ρ Ο Ο 3 0 0 3 0 0
X Ε >10 Ο Μ Ο Ο (OCE Φ Ε C Η C Ε Φ Ε C
Ε Ε C U Ε C C ο ο C 2 Ε 2 C Ε ΟΟΟ •4 0 0
mo ο MCE Μ Ο Ο Η Ο ϋ 3 0 0 (ΟΟΟ mc ε
Μ ο ο Φ Ο Ο β o o β Ε C Φ Ε C >ιϋ o Μ Ο U
C C Ε W Ε C Ε C Ε > Ο Ο 43 Ο Ο ϋ Ε C C C Ε
Μ Ο Ο MCE 3 0 0 OCE Φ C Ε αΕ ? fi 2 Ε
β Ο Ο β Ο Ο Φ Ε C Μ Ο Ο HEC (OCE Η c Ε
Ε C Ε Ε C Ε 41 Ο Ο α ο ο Η C Ε C ο ο ΟΟΟ
400 Φ 2 Ε Μ Ο Ο MEC Ρ Ο Ο 3 0 0 Φ Ε C
Φ Ε C HEC X Ε β Ο Ο Φ Ε C Φ Ε C Η Ε 2
2 C Ε Η C Ε Ε Ε C Ε C Ε 2 C Ε •4 0 0 Η c Ε
<0 Ε C 3 0 0 Μ Ο Ο (ΟΟΟ mo ο β Ο Ο Φ Ο Ο
Η ϋ ϋ Φ Ε C X Ε Η C Ε Μ ο ο Η ϋ Ο Η Ε C
C ϋ Ο 41 Ο Ο Ε Ε C X ϋ Ο C C Ε C Ο Ο Η C Ε
3 0 0 3 0 0 Η ο Ο mc Ε β Ο Ο β Ο Ο 0 2 Ε
η C Ε Η C Ε β Ε C Μ Ο Ο Η ϋ ϋ Η C Ε Μ Ο Ο
ΟΟΟ ΟΟΟ > Ο ϋ C C Ε C ο ο οοο tu ου
rH «4 rH Η »—ι ι-Η Η
α Hf Ο 10 ΓΗ 00 Hf
(Μ η Hf Hf ιη ιη 10
α α α α ω 00 00
172 133
0.0 u Φ rf Eh RJ O O Φ Eh rf RJ Eh rf
P o u X Eh rf X O O X Eh rf X U O
Ę* Ε-· rf X rf Eh rf o o X rf Eh rf O U
RJ H rf RJ U O Φ rf Eh ao O 3 Eh rf
X U O X O O X Eh rf tfl rf Eh Φ Eh 2
rf O O rf o o X rf Eh rf O O X U O
CPrf Eh RJ Eh rf 0 rf Eh Sprf Eh 3 0 0
P O U X U O P O O X O O Φ Eh rf
rf U O rf O O CU O O O O O X U O
3 0 0 CPO O P Eh rf >iO O 3 U O
Φ Eh rf P O O X O O X O O Φ Eh rf
X Eh rf rf rf Eh Eh rf Eh O O O — X U O
0 O O O 3 0 0 P O O 0 3 rf Eh
P o o rH O O Φ Eh rf Φ O O Ρ Φ Eh rf
CU u o O O O X O O W rf EH CU X U O
0 o o >. rf Eh tfl rf Eh P O O - tfl u o
P u o X O O >irf Eh >«rf Eh >,O U
CU u o O O O Eh Eh rf U Eh rf
χ rf EH CPrf Eh 3 0 0 >iU O Φ Eh rf
(0 Eh rf P O O Φ Eh rf X O O Λ Eh rf
> O O rf rf Eh X O O O O U CU Eh 2
>O O RJ U O tfl O O RJ Eh rf ao u
X O O rH O O >irf Eh X U O P o u
O O U rf o o X 2 Eh rf O O Eh Eh rf
3 Eh rf 3 0 0 P 2 Eh P O O Φ U O
Φ Eh rf Φ Eh rf .C U U Λ O O X Eh rf
X U O X O O Eh rf Eh Eh rf Eh W rf Eh
W rf Eh 3 Eh 5 CP2 Eh Φ O O ao u
>rf Eh Φ Χ rf POO JC Eh rf P o u
as U X U O CPO O ssu CU Eh 2 ao O Eh Eh rf tPU O
P o o P O U (8 Eh rf POO P O U
rf rf Eh rf rf Eh > O O Eh Eh rf rf U O
3 0 0 RJ Eh rf <0 rf Eh >iU O 0 U O
Φ Eh rf X O O X O O X O O POO
X O O rf O U rf O O O O O a u o
ω o o CPU o ao o POO CPO u
>iO O P o o P o o Φ o o P o u
O Eh rf rf o o EH EH rf W EH rf rf u o
Λ rf Eh X u o c O O 3 0 0 RJ U O
X O O RJ EH rf tfl rf EH SUS X U O
rf O O > O U rf 2 Eh rf o u
(0 O O P O O Φ O O au o tfl EH rf
X U O Φ o o X Eh rf tfl rf Eh x rf Eh
rf O O X O O ω rf Ę* CPO o S&S 588 X U O P Eh rf
Λ Eh rf P o o Φ Eh rf Φ EH rf Φ U O
> O U rf o o X U O X U O OT Eh rf
CPO O RJ O O P U O C O U X O U
P O U X o o >*rf Η X rf Eh RJ Eh rf
rf rf Eh rf o o Eh Eh rf O U O > O U
C Eh rf CPO o tfl O O >iU O POO
» rf Eh P o o SS U X O U Φ O U
rf rf Eh rf u o o o u OT rf Eh
SUS tfl o o >,O O RJ Eh rf tfl U O
•H rf Eh X O O X U O X rf Eh
H rf Eh X o o o o u rf O U X u o
3 rf Eh >1 CPrf eh tfl EH rf RJ U O P Eh rf
X 2 Eh X P O O >iO O X U O >irf Eh
O O U O rf rf Eh O EH rf rf O U Eh Eh rf
X X X X X
O 10 OJ co HJ*
r* co ω d
CO ω co co CO
X το
u.
172 133 >
ό
Z δ o u o o u o u u o u o H rf o o rf EH O o s
o u
Λ4
Ή
0)
-P il tO
N
Φ
Eh rf O U o u
o u a
o u 45
o a
Eh rf o
O U Ό
o u o a s O •a o
rf eh a -ii
a u u il
O Eh rf a, ·
prf π Ό co
u o o a
rf u o 45
a >>
ϊ i
® 1O -N
O <0 δδ
Ό 'tfl
O a
N
O •H a
<u
O $->
Φ
P
Φ a
to fe o
a β
®
Tt
0) a
N
O
O
O
Ot
172 133 ο C0 ·
Ο Ο ο 0J ο ιη ο
ο
X
Ο ο
ο
LU ου
CM
LL
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.
Cena 6,00 zł

Claims (56)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób tworzenia kombinacji antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV), wytworzonych przez syntezę chemiczną lub ekspresję rekombinanta, przydatnej w próbach immunologicznych na obecność przeciwciał przeciw HCV, znamienny tym, że łączy się sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu z domeny C poliproteiny HCV z co najmniej jedną sekwencją epitopu dodatkowego polipeptydu z innej domeny poliproteiny HCV, wybranej z grupy obejmującej domenę NS3 poliproteiny HCV, domenę S poliproteiny HCV, domenę NS4 poliproteiny HCV i domenę NS5 poliproteiny HCV.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że tworzy się kombinację przez fuzję polipeptydów.
  3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że tworzy się kombinację wiążąc indywidualnie sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu i dodatkową sekwencję lub dodatkowe sekwencje epitopu polipeptydu ze wspólnym stałym podłożem.
  4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako stałe podłoże stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy.
  5. 5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że tworzy się kombinację w postaci mieszaniny sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z sekwencjąlub sekwencjami epitopu dodatkowego polipeptydu.
  6. 6. Sposób tworzenia kombinacji antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV), wytworzonych przez syntezę chemiczną lub ekspresję rekombinanta, przydatnej w próbach immunologicznych na obecność przeciwciał przeciw HCV, znamienny tym, że łączy się sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu z domeny C poliproteiny HCV z sekwencją epitopu dodatkowego polipeptydu z innej domeny poliproteiny HCV, wybraną z grupy obejmującej domenę NS3 poliproteiny HCV, domenę S poliproteiny HCV, domenę NS4 poliproteiny HCV, domenę NS5 poliproteiny HCV, i z trzecią dodatkową sekwencją epitopu polipeptydu z innej domeny poliproteiny HCV wybranej z grupy obejmującej domenę NS3 poliproteiny HCV, domenę S poliproteiny hCv, domenę NS4 poliproteiny HCV, domenę NS5 poliproteiny HCV, przy czym ta trzecia domena jest inna niż domena druga, z wyłączeniem kombinacji peptydu pl z C100-3, peptydu p35 z C100-3 lub peptydu p99 z C100-3.
  7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako trzecią dodatkową sekwencję epitopu polipeptydu stosuje się sekwencję z domeny S.
  8. 8. Sposób według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że tworzy się kombinację przez fuzję polipeptydów.
  9. 9. Sposób według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że tworzy się kombinację wiążąc indywidualnie sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu i dodatkową sekwencję lub dodatkowe sekwencje epitopu polipeptydu ze wspólnym stałym podłożem.
  10. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że jako stałe podłoże stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy.
  11. 11. Sposób według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że tworzy się kombinację w postaci mieszaniny sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z sekwencjąlub sekwencjami epitopu dodatkowego polipeptydu.
  12. 12. Sposób tworzenia kombinacji antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV), wytworzonych przez syntezę chemiczną lub ekspresje rekombinanta, przydatnej w próbach immunologicznych na obecność przeciwciał przeciw HCV, znamienny tym, że łączy się
    172 133 sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu składającą się zasadniczo z domeny C poliproteiny HCV z drugą sekwencją epitopu polipeptydu z domeny NS3 poliproteiny HCV.
  13. 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że jako sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu stosuje się sekwencję C22, ajako drugą sekwencję epitopu polipeptydu stosuje się sekwencję C33c.
  14. 14. Sposób według zastrz. 12 albo 13, znamienny tym, że tworzy się kombinację przez fuzję polipeptydów.
  15. 15. Sposób według zastrz. 12 albo 13, znamienny tym, że tworzy się kombinację wiążąc indywidualnie sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu i dodatkową sekwencję lub dodatkowe sekwencje epitopu polipeptydu ze wspólnym podłożem.
  16. 16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że jako stałe podłoże stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy.
  17. 17. Sposób według zastrz. 12 albo 13, znamienny tym, że tworzy się kombinację w postaci mieszaniny sekwencji epitopu pierwszego polipeptyduz sekwencjąlub sekwencjami epitopu dodatkowego polipeptydu.
  18. 18. Sposób tworzenia kombinacji antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV), wytworzonych przez syntezę chemiczną lub ekspresje rekombinanta, przydatnej w próbach immunologicznych na obecność przeciwciał przeciw HCV, znamienny tym, że łączy się sekwencje epitopu pierwszego polipeptydu składającą się zasadniczo z domeny C poliproteiny HCV, z drugą sekwencją epitopu polipeptydu z domeny NS4 poliproteiny HCV.
  19. 19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że jako sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu stosuje się sekwencję C22, ajako drugą sekwencję epitopu polipeptydu stosuje się sekwencję C100.
  20. 20. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że dodatkowo przyłącza się sekwencję epitopu trzeciego polipeptydu z domeny NS3.
  21. 21. Sposób według zastrz. 18 albo 19 albo 20, znamienny tym, że tworzy się kombinację przez fuzję polipeptydów.
  22. 22. Sposób według zastrz. 18 albo 19 albo 20, znamienny tym, że tworzy się kombinację wiążąc indywidualnie sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu i dodatkową sekwencją lub dodatkowe sekwencje epitopu polipeptydu ze wspólnym stałym podłożem.
  23. 23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, żejako stałe podłoże stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy.
  24. 24. Sposób według zastrz. 18 albo 19 albo 20, znamienny tym, że tworzy się kombinację w postaci mieszaniny sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z sekwencją lub sekwencjami epitopu dodatkowego polipeptydu.
  25. 25. Sposób tworzenia kombinacji antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV), wytworzonych przez syntezę chemiczną lub ekspresję rekombinanta, przydatnej w próbach immunologicznych na obecność przeciwciał przeciw HCV, znamienny tym, że łączy się sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu składającą się zasadniczo z domeny C poliproteiny HCV, z drugą sekwencją epitopu polipeptydu z domeny NS5 poliproteiny HCV.
  26. 26. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że dodatkowo przyłącza się sekwencję epitopu trzeciego polipeptydu z domeny NS3.
  27. 27. Sposób według zastrz. 25 albo 26, znamienny tym, że tworzy się kombinację przez fuzję polipeptydów.
  28. 28. Sposób według zastrz. 25 albo 26, znamienny tym, że tworzy się kombinację wiążąc indywidualnie sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu i dodatkową sekwencję lub dodatkowe sekwencje epitopu polipeptydu ze stałym wspólnym podłożem.
  29. 29. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że jako stałe podłoże stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy.
  30. 30. Sposób według zastrz. 25 albo 26, znamienny tym, że tworzy się kombinację w postaci mieszaniny sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z sekwencjąlub sekwencjami epitopu dodatkowego polipeptydu.
    112 133
  31. 31. Sposób wykrywania przeciwciał przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu C (HCV) w składniku ciała ssaka podejrzanego o posiadanie tych przeciwciał, znamienny tym, że kontaktuje się ten składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV), wytworzoną przez syntezę chemiczną lub ekspresję rekombinantu, stanowiącąpołączenie sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z domeny C poliproteiny HCV z co najmniej jedną sekwencją epitopu dodatkowego polipeptydu z innej domeny poliproteiny HCV wybranej z grupy obejmującej domenę NS3 poliproteiny HCV, domenę S poliproteiny HCV, domenę NS4 poliproteiny HCV i domenę NS5 poliproteiny HCV, w warunkach pozwalających na zajście reakcji antygen-przeciwciało i wykrycie obecności kompleksów immunologicznych tych przeciwciał z sekwencjami epitopów polipeptydów.
  32. 32. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że kontaktuje się składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, utworzonąprzez fuzję polipeptydów-·.
  33. 33. Sposób według zastrz. 31 albo 32, znamienny tym, że kontaktuje się składnik ciała z kombinacją antygenów stanowiącą połączenie indywidualnych sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z dodatkową sekwencją lub dodatkowymi sekwencjami epitopu polipeptydu ze wspólnym stałym podłożem.
  34. 34. Sposób według zastrz. 33, znamienny tym, żejako stałe podłoże stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy.
  35. 35. Sposób wytwarzania przeciwciał przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu C (HCV) w składniku ciała ssaka podejrzanego o posiadanie tych przeciwciał, znamienny tym, że kontaktuje się ten składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, wytworzoną przez syntezę chemiczną lub ekspresję rekombinantu, stanowiącą połączenie sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z domeny C poliproteiny HCV z sekwencją epitopu dodatkowego polipeptydu z innej domeny poliproteiny HCV, wybraną z grupy obejmującej domenę NS3 poliproteiny HCV, domenę S poliproteiny HCV, domenę NS4 poliproteiny HCV, domenę NS5 poliproteiny HCV, i z trzecią dodatkową sekwencją epitopu polipeptydu z innej domeny poliproteiny HCV wybranej z grupy obejmującej domenę NS3 poliproteiny HCV, domenę S poliproteiny hCv, domenę NS4 poliproteiny HCV, domenę NS5 poliproteiny HCV, przy czym ta trzecia domena jest inna niż domena druga, z wyłączeniem kombinacji peptydu pl z C100-3, peptydup35 zC100-3 lub peptydu p99 z C100-3, w warunkach pozwalających na zajście reakcji antygen-przeciwciało i wykrycie obecności kompleksów immunologicznych tych przeciwciał z sekwencjami epitopów polipeptydów.
  36. 36. Sposób według zastrz. 35, znamienny tym, że kontaktuje się składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C w której trzecią dodatkową sekwencję epitopu polipeptydu stanowi sekwencja z domeny S.
  37. 37. Sposób według zastrz. 35 albo 36, znamienny tym, że kontaktuje się ten składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, utworzonąprzez fuzję polipeptydów.
  38. 38. Sposób według zastrz. 35 albo 36, znamienny tym, że kontaktuje się składnik ciała z kombinacją antygenów stanowiącą połączenie indywidualnych sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z dodatkową sekwencją lub dodatkowymi sekwencjami epitopu polipeptydu ze wspólnym stałym podłożem.
  39. 39. Sposób według zastrz. 38, znamienny tym, żejako stałe podłoże stosuj e się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy.
  40. 40. Sposób wykrywania przeciwciał przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu C (HCV) w składniku ciała ssaka podejrzanego o posiadanie tych przeciwciał, znamienny tym, że kontaktuje się ten składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV), wytworzoną przez syntezę chemiczną lub ekspresję rekombinantu, stanowiącą połączenie sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu składającej się zasadniczo z domeny C poliproteiny HCV z drugą sekwencją epitopu polipeptydu z domeny NS3 poliproteiny HCV, w warunkach pozwalających na zajście reakcji antygen-przeciwciało i wykrycie obecności kompleksów immunologicznych tych przeciwciał z sekwencjami epitopów polipeptydów.
    172 133
  41. 41. Sposób według zastrz. 40, znamienny tym, że kontaktuje się składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, w której sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu stanowi sekwencja C22, a drugą sekwencję epitopu polipeptydu stanowi sekwencja C33c.
  42. 42. Sposób według zastrz. 40 albo 41, znamienny tym, że kontaktuje się składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, wytworzoną przez fuzję polipeptydów.
  43. 43. Sposób według zastrz. 40 albo 41, znamienny tym, że kontaktuje się składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C stanowi połączenie indywidualnych sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z dodatkową sekwencją lub dodatkowymi sekwencjami epitopu polipeptydu ze wspólnym stałym podłożem.
  44. 44. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że jako stałe podłoże stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy.
  45. 45. Sposób wykrywania przeciwciał przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu C (HCV) w składniku ciała ssaka podejrzanego o posiadanie tych przeciwciał, znamienny tym, że kontaktuje się ten składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C stanowią połączenie sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu składającej się zasadniczo z domeny C poliproteiny HCV, z drugą sekwencją epitopu polipeptydu z domeny NS4 poliproteiny HCV, w warunkach pozwalających na zajście reakcji antygen-przeciwciało i wykrycie obecności kompleksów immunologicznych tych przeciwciał z sekwencjami epitopów polipeptydów-’.
  46. 46. Sposób według zastrz. 45, znamienny tym, że kontaktuje się składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, w której sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu stanowi sekwencja C22, a drugą sekwencję epitopu polipeptydu stanowi sekwencja C100.
  47. 47. Sposób według zastrz. 45, znamienny tym, że kontaktuje się składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, stanowiącąpołączenie z dodatkową sekwencją epitopu trzeciego polipeptydu z domeny NS3.
  48. 48. Sposób według zastrz. 45 albo 46 albo 47, znamienny tym, że kontaktuje się składnik ciała z kombinacjąantygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C utworzonąprzez fuzję polipeptydów.
  49. 49. Sposób według zastrz. 45 albo 46 albo 47, znamienny tym, że kontaktuje się składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C stanowiącą połączenie indywidualnych sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z dodatkową sekwencją lub dodatkowymi sekwencjami epitopu polipeptydu ze wspólnym stałym podłożem.
  50. 50. Sposób według zastrz. 49, znamienny tym, żejako stałe podłoże stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy.
  51. 51. Sposób wykrywania przeciwciał przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu C (HCV) w składniku ciała ssaka podejrzanego o posiadanie tych przeciwciał, znamienny tym, że kontaktuje się ten składnik ciała z kombii^^i^^antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV), stanowiącąpołączenie sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu składającej się zasadniczo z domeny C poliproteiny HCV, z drugąsekwencjąepitopu polipeptydu z domeny NS5 poliproteiny HCV, w warunkach pozwalających na zajście reakcji antygen-przeciwciało i wykrycie obecności kompleksów immunologicznych tych przeciwciał z sekwencjami epitopów polipeptydów.
  52. 52. Sposób według zastrz. 51, znamienny tym, że kontaktuje się składnik ciała z kombinacj ą antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, stanowiącą połączenie z dodatkową sekwencją epitopu trzeciego polipeptydu z domeny NS3.
  53. 53. Sposób według zastrz. 51 albo 52, znamienny tym, że kontaktuje się składnik ciała z kombinacjąantygenów HCV, wirusowego zapalenia wątroby typu C, utworzonąprzez fuzję polipeptydów.
  54. 54. Sposób według zastrz. 51 albo 52, znamienny tym, że kontaktuje się składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, stanowiącą połączenie indy6
    172 133 widualnych sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z dodatkową sekwencją lub dodatkowymi sekwencjami epitopu polipeptydu ze stałym wspólnym podłożem.
  55. 55. Sposób według zastrz. 54, znamienny tym, że jako stałe podłoże stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy.
  56. 56. Sposób według zastrz. 51 albo 52, znamienny tym, że kontaktuje się ten składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, w której kombinację antygenów stanowi kombinacja w postaci mieszaniny sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z sekwencją lub sekwencjami epitopu dodatkowego polipeptydu.
PL91296329A 1990-04-04 1991-03-29 Sposób tworzenia kombinacji antygenów wirusowego zapalenia watroby typu C (HCV) i sposób wykrywania przeciwcial przeciw wirusowemu zapaleniu watroby typu C (HCV) PL172133B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US50435290A 1990-04-04 1990-04-04
PCT/US1991/002225 WO1991015771A1 (en) 1990-04-04 1991-03-29 Combinations of hepatitis c virus (hcv) antigens for use in immunoassays for anti-hcv antibodies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL172133B1 true PL172133B1 (pl) 1997-08-29

Family

ID=24005897

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL91296329A PL172133B1 (pl) 1990-04-04 1991-03-29 Sposób tworzenia kombinacji antygenów wirusowego zapalenia watroby typu C (HCV) i sposób wykrywania przeciwcial przeciw wirusowemu zapaleniu watroby typu C (HCV)

Country Status (25)

Country Link
EP (2) EP0693687B2 (pl)
JP (1) JP2733138B2 (pl)
KR (1) KR100206150B1 (pl)
AT (2) ATE182684T1 (pl)
BG (1) BG61291B1 (pl)
BR (1) BR9106309A (pl)
CY (1) CY1881A (pl)
DE (2) DE69131488T2 (pl)
DK (2) DK0693687T4 (pl)
ES (2) ES2134388T5 (pl)
FI (1) FI106317B (pl)
GB (1) GB2257784B (pl)
GR (2) GR3020964T3 (pl)
HU (1) HU217025B (pl)
IE (1) IE911105A1 (pl)
IL (2) IL170719A (pl)
LT (1) LT3808B (pl)
LV (2) LV10344A (pl)
MY (1) MY107499A (pl)
NO (1) NO310241B1 (pl)
PL (1) PL172133B1 (pl)
RO (1) RO109916B1 (pl)
RU (1) RU2130969C1 (pl)
UA (1) UA41266C2 (pl)
WO (1) WO1991015771A1 (pl)

Families Citing this family (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GR1001261B (el) 1989-12-18 1993-06-30 Wellcome Found Ιϊκός παράγων.
US7166287B1 (en) 1989-12-18 2007-01-23 Glaxo Wellcome Inc. Viral agent
KR940000755B1 (ko) * 1990-02-16 1994-01-29 유나이티드 바이오메디칼 인코오포레이티드 Hcv에 대한 항체 검출, hcv 감염의 진단 및 백신으로서의 그 예방에 특히 적합한 합성 펩티드
US6194140B1 (en) 1990-04-04 2001-02-27 Chiron Corporation HCV NS3 protein fragments having helicase activity and improved solubility
DE69132332T2 (de) * 1990-04-06 2000-11-30 Genelabs Technologies, Inc. Hepatitis c-virus-epitope
CA2049679C (en) * 1990-08-24 2005-06-21 Sushil G. Devare Hepatitis c assay utilizing recombinant antigens
SK286106B6 (sk) * 1990-11-08 2008-03-05 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc. Spôsob vykonávania imunodiagnostickej skúšky na detekciu protilátky proti vírusu hepatitídy C
US6274148B1 (en) * 1990-11-08 2001-08-14 Chiron Corporation Hepatitis C virus asialoglycoproteins
DK0644202T3 (da) * 1990-12-14 1997-09-15 Innogenetics Nv Syntetiske antigener til påvisning af antistoffer imod hepatitis C virus
US5910404A (en) 1990-12-14 1999-06-08 Innogenetics N.V. Synthetic antigens for the detection of antibodies to hepatitis C virus
US6007982A (en) * 1990-12-14 1999-12-28 Innogenetics N.V. Synthetic antigens for the detection of antibodies to hepatitis C virus
DE4041304A1 (de) * 1990-12-21 1992-06-25 Mikrogen Molekularbiol Entw Von strukturproteinen des hepatitis c-virus abgeleitete polypeptide, testkits, die diese polypeptide enthalten und impfstoffe gegen infektionen von hepatitis c-viren
US5574132A (en) * 1991-04-05 1996-11-12 Biochem Immunosystems Inc. Peptides and mixtures thereof for detecting antibodies to hepatitis C virus (HCV)
EP0573624A4 (en) * 1991-11-07 1997-09-17 Baxter Diagnostics Inc Epitope mapping ot the c33c region of hcv
EP0610436B9 (en) * 1991-11-21 2003-03-26 Common Services Agency Hepatitis-c virus testing
DK0625204T3 (da) * 1992-02-04 2002-07-15 Chiron Corp Terapeutiske midler mod hepatitis
GB9203803D0 (en) * 1992-02-21 1992-04-08 Wellcome Found A recombinant polypeptide
UA39944C2 (uk) * 1992-07-07 2001-07-16 Чірон Корпорейшн Спосіб визначення ранньої сероконверсії у ссавця-хазяїна до вірусу гепатиту с і набір для використання в способі
EP0593291A3 (en) * 1992-10-16 1995-03-15 Evernew Biotech Inc Non-structural protein of the hepatitis C virus, as well as diagnostic procedure and test kit.
US6153378A (en) * 1992-10-16 2000-11-28 Bionova Corporation Diagnosis of, and vaccination against, a positive stranded RNA virus using an isolated, unprocessed polypeptide encoded by a substantially complete genome of such virus
JP2778886B2 (ja) * 1992-10-16 1998-07-23 エバーニュー バイオテック インコーポレイティド Ｃ型肝炎ウィルスのコア抗原タンパク質及びそれを用いての診断方法及びキット
WO1994013164A1 (en) 1992-12-10 1994-06-23 Nike International Ltd. Bonding of rubber to plastic in footwear
KR100312534B1 (ko) 1993-04-28 2002-05-13 성재갑 씨(c)형간염및비(b)형간염동시측정면역블롯검정키트및면역블롯검정법
DK0698216T4 (da) * 1993-05-10 2009-06-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Fremgangsmåder til typebestemmelse af hepatitis-C-virus og anvendte reagenser heri
DE4428705A1 (de) 1994-08-12 1996-02-15 Boehringer Mannheim Gmbh Rekombinantes Antigen aus der NS3-Region des Hepatitis C Virus
JPH0862219A (ja) * 1994-08-19 1996-03-08 Dainabotsuto Kk 還元型抗原に対する抗体アッセイ試薬及びそれを使用した測定方法
JP3665371B2 (ja) * 1994-08-31 2005-06-29 株式会社先端生命科学研究所 Ｃ型肝炎ウイルス感染又はグループ判定のためのエピトープキメラ抗原ペプチド、その製法、及びそれを使用する感染又はグループ判定法
CA2172305A1 (en) * 1995-03-30 1996-10-01 Muneo Aoyama Multiple antigenic peptide comprising at least two hepatitis c virus-associated peptides
AU5924396A (en) * 1995-05-22 1996-12-11 Bionova Corporation Compositions and methods for the diagnosis of, and vaccinati on against, hepatitis c virus (hcv)
FR2734639B1 (fr) * 1995-05-26 1997-10-03 Parteurop Methode de pronostic de l'evolution d'une infection par le virus de l'hepatite c, et necessaire pour sa mise en oeuvre
FR2737209B1 (fr) 1995-07-25 1997-09-19 Bio Merieux Peptide capable d'etre reconnu par des anticorps reconnaissant l'antigene c33 du virus de l'hepatite c
US6127116A (en) 1995-08-29 2000-10-03 Washington University Functional DNA clone for hepatitis C virus (HCV) and uses thereof
JP3715027B2 (ja) 1996-05-07 2005-11-09 シスメックス株式会社 Ｃ型肝炎ウイルス感染症診断薬
US7049428B1 (en) 1998-03-04 2006-05-23 Washington University HCV variants
US7338759B1 (en) 1997-03-04 2008-03-04 Washington University HCV variants
DE69837155T2 (de) * 1997-09-22 2007-06-21 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc., Emeryville Verfahren zum nachweiss von antikörpern in einer probe
AU6098900A (en) * 1999-07-15 2001-02-05 Bayer Corporation The use of specific antibody titers to predict hepatic failure in people infected with hepatitis c virus
AU1236801A (en) 1999-10-27 2001-05-08 Chiron Corporation Activation of hcv-specific t cells
RU2179726C2 (ru) * 1999-11-17 2002-02-20 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Способ изготовления контрольных панелей сывороток для контроля качества диагностики гепатита в
US6986892B1 (en) 1999-11-24 2006-01-17 Chiron Corporation Immunogenic Hepatitis C virus non-structural polypeptides
WO2001038360A2 (en) * 1999-11-24 2001-05-31 Chiron Corporation Novel hcv non-structural polypeptide
SI1354204T2 (sl) 2000-06-15 2010-09-30 Novartis Vaccines & Diagnostic Hcv antigen antitelo kombinacijska analiza
US7491808B2 (en) 2000-06-15 2009-02-17 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. HCV non-structural protein mutants and uses thereof
RU2172489C1 (ru) * 2000-07-26 2001-08-20 Тверская государственная медицинская академия Способ диагностики множественной миеломы
JP5175417B2 (ja) 2000-08-17 2013-04-03 トリペップ アクチ ボラゲット リバビリンを含むワクチンおよびその使用方法
US7022830B2 (en) 2000-08-17 2006-04-04 Tripep Ab Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene
US6680059B2 (en) 2000-08-29 2004-01-20 Tripep Ab Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof
US6858590B2 (en) 2000-08-17 2005-02-22 Tripep Ab Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof
FR2839722A1 (fr) 2002-05-17 2003-11-21 Bio Merieux Nouvelles compositions peptidiques et leur utilisation notamment dans la preparation de compositions pharmaceutiques actives contre le virus de l'hepatite c
RU2226694C2 (ru) * 2002-05-30 2004-04-10 Научно-исследовательский институт детских инфекций Способ дифференциальной диагностики вирусного гепатита с
ES2312806T3 (es) 2002-09-09 2009-03-01 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Ensayo de vhc.
WO2005123952A2 (en) 2004-06-09 2005-12-29 Pathogen Removal And Diagnostic Technologies Inc. Particles embedded ina porous substrate for removing target analyte from a sample
RU2262704C1 (ru) * 2004-10-06 2005-10-20 Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственное объединение "Диагностические системы" Набор антигенов для определения антител к вирусу гепатита c "дс-hcv-антигены"
JP2005274584A (ja) * 2005-05-25 2005-10-06 Sysmex Corp Ｃ型肝炎ウイルス感染症診断薬の製造方法
JP4005093B2 (ja) * 2005-05-25 2007-11-07 シスメックス株式会社 Ｃ型肝炎ウイルス感染症診断薬および抗ｈｃｖ抗体検出方法
CA2618429A1 (en) 2005-05-25 2007-03-22 Tripep Ab A hepatitis c virus non-structural ns3/4a fusion gene
RU2327170C2 (ru) * 2006-02-27 2008-06-20 Закрытое акционерное общество "ДиТест" Способ комплексной диагностики вирусного гепатита в, вирусного гепатита с, вич-инфекции и сифилиса
MX2008011361A (es) * 2006-03-09 2008-09-15 Transgene Sa Proteina de fusion no-estructural del virus de hepatitis c.
EP1978365B1 (en) 2007-03-16 2010-08-25 Sysmex Corporation Reagent kit and method for measuring HCV antibody
US20090214593A1 (en) 2007-08-16 2009-08-27 Tripep Ab Immunogen platform
US8071561B2 (en) 2007-08-16 2011-12-06 Chrontech Pharma Ab Immunogen platform
FR2984328B1 (fr) 2011-12-20 2016-12-30 Bio-Rad Innovations Procede de detection d'une infection par le virus de l'hepatite c
ES2828713T3 (es) 2014-10-29 2021-05-27 Abbott Lab Ensayos de detección de anticuerpos anti-VHC objeto usando péptidos de captura NS3
JP2018124277A (ja) * 2017-02-02 2018-08-09 三洋化成工業株式会社 粒子含有組成物、免疫測定用試薬、免疫測定方法及び粒子の保存方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US456637A (en) 1891-07-28 Fence
US390599A (en) 1888-10-02 Tool for weaver s use
SE7804231L (sv) 1978-04-14 1979-10-15 Haessle Ab Magsyrasekretionsmedel
US4870008A (en) * 1983-08-12 1989-09-26 Chiron Corporation Secretory expression in eukaryotes
CA1341423C (en) † 1984-10-31 2003-03-04 Paul A. Luciw Recombinant proteins of viruses associated with lymphadenopathy syndrome and/or acquired immune deficiency syndrome
US4751180A (en) * 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
JPH02500880A (ja) * 1987-11-18 1990-03-29 カイロン　コーポレイション Ｎａｎｂｖの診断用薬およびワクチン
KR0185373B1 (ko) † 1989-03-17 1999-05-01 로버트 피. 블랙버언 Hcv 폴리단백질에서 유래되는 hcv 아미노산 서열 부분을 포함하는 폴리펩티드 및 그 사용
GR1001261B (el) * 1989-12-18 1993-06-30 Wellcome Found Ιϊκός παράγων.
CA2032907C (en) † 1989-12-22 2002-05-14 Richard R. Lesniewski Hepatitis c assay

Also Published As

Publication number Publication date
LTIP1747A (en) 1995-07-25
ATE139343T1 (de) 1996-06-15
NO310241B1 (no) 2001-06-11
EP0693687B1 (en) 1999-07-28
GB2257784B (en) 1995-01-04
NO923839D0 (no) 1992-10-01
GR3020964T3 (en) 1996-12-31
AU639560B2 (en) 1993-07-29
HU217025B (hu) 1999-11-29
FI924349L (fi) 1992-09-28
DE69120138T2 (de) 1996-11-14
EP0450931A1 (en) 1991-10-09
HU9203146D0 (en) 1992-12-28
RU2130969C1 (ru) 1999-05-27
CY1881A (en) 1996-04-05
GB2257784A (en) 1993-01-20
ES2134388T3 (es) 1999-10-01
ES2134388T5 (es) 2008-12-01
ES2088465T3 (es) 1996-08-16
GR3031361T3 (en) 2000-01-31
DK0450931T3 (da) 1996-07-01
LV10344B (en) 1996-02-20
IL97741A0 (en) 1992-06-21
EP0693687B2 (en) 2008-06-04
LV10344A (en) 1994-10-20
IE911105A1 (en) 1991-10-09
JP2733138B2 (ja) 1998-03-30
AU7651091A (en) 1991-10-30
DE69131488D1 (de) 1999-09-02
BR9106309A (pt) 1993-04-20
FI924349A0 (fi) 1992-09-28
EP0450931B1 (en) 1996-06-12
BG96943A (bg) 1993-12-24
KR100206150B1 (ko) 1999-07-01
DK0693687T3 (da) 1999-11-29
EP0693687A1 (en) 1996-01-24
DE69131488T2 (de) 1999-11-18
UA41266C2 (uk) 2001-09-17
MY107499A (en) 1995-12-30
LT3808B (en) 1996-03-25
RO109916B1 (ro) 1995-07-28
NO923839L (no) 1992-11-19
DK0693687T4 (da) 2008-09-22
HUT62706A (en) 1993-05-28
WO1991015771A1 (en) 1991-10-17
IL170719A (en) 2011-04-28
BG61291B1 (en) 1997-04-30
GB9220480D0 (en) 1992-11-25
DE69120138D1 (de) 1996-07-18
FI106317B (fi) 2001-01-15
ATE182684T1 (de) 1999-08-15
JPH05508219A (ja) 1993-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL172133B1 (pl) Sposób tworzenia kombinacji antygenów wirusowego zapalenia watroby typu C (HCV) i sposób wykrywania przeciwcial przeciw wirusowemu zapaleniu watroby typu C (HCV)
US6312889B1 (en) Combinations of hepatitis c virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies
US5683864A (en) Combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies
US6596476B1 (en) Hepatitis C assay
US6514731B1 (en) Methods for the preparation of hepatitis C virus multiple copy epitope fusion antigens
JP2007127671A (ja) 複数エピトープ融合タンパク質
JP2004510133A (ja) 抗ｈｃｖ抗体についてのイムノアッセイ
JP3354579B2 (ja) 組換え抗原を用いるｃ型肝炎アッセイ
JP2778886B2 (ja) Ｃ型肝炎ウィルスのコア抗原タンパク質及びそれを用いての診断方法及びキット
EP1412538B1 (en) Methods for the simultaneous detection of hcv antigens and hcv antibodies
EP0642666B1 (en) Hepatitis c assay
JP3184906B2 (ja) 改善されたｈｃｖ診断試薬
JP5070055B2 (ja) 改変タンパク分解性切断部位を有するｈｃｖ多エピトープ融合抗原およびその使用
JP3327549B2 (ja) Ｃ１００領域に対する組換え抗原を利用したｃ型肝炎アッセイ
KR100605322B1 (ko) 씨형 간염 바이러스 항-코아 단백질 항체 진단에 유용한민감도 높은 항원성 에피토프
AU639560C (en) Combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies
HK1079796B (en) Immunoassays for anti-hcv antibodies