ES2144386T5 - Ligando para el activador del receptor de NF-kappa b, el ligando es miembro de la superfamilia de TNF - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNOS LIGANDOS AISLADOS, UNOS ADN QUE CODIFICAN PARA DICHOS LIGANDOS, Y COMPOSICIONES FARMACEUTICAS FABRICADAS A PARTIR DE DICHOS LIGANDOS. SE PUEDEN USAR LOS LIGANDOS AISLADOS PARA REGULAR UNA RESPUESTA INMUNITARIA. SON TAMBIEN UTILES PARA CRIBAR LOS INHIBIDORES DE DICHA RESPUESTA INMUNITARIA.

Description

Ligando para el activador del receptor de NF-kappa b, el ligando es miembro de la superfamilia de TNF.

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCiÓN

La presente invención se refiere en general al campo de las citoquinas, y más específicamente a pares receptor/ligando de citoquina que tienen actividad inmunorreguladora.

ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN

El funcionamiento eficiente del sistema inmunitario requiere un balance sutil entre la proliferación y diferenciación celular y la muerte celular, a fin de asegurar que el sistema inmunitario es capaz de reaccionar a los antígenos extraños, pero no a los propios. Integrales con el proceso de regulación de la respuesta inmunológica e inflamatoria son varios miembros de la superfamilia Receptor del Factor de Necrosis Tumoral (TNF)/Receptor del Factor del Crecimiento de los Nervios (Smith et al., Science 248: 1019; 1990). Esta familia de receptores incluye dos receptores TNF diferentes (Tipo I y Tipo 11; Smith et al., supra; y Schall et al., Cel! 61: 361, 1990), el receptor del factor de crecimiento de los nervios (Johnson et al., Cel! 47: 545, 1986), el antígeno CD40 de las células B (Stamenkovic et al., EMBO J. 8: 1403, 1989), CD27 (Camerini et al., J. Immunol. 147: 3165, 1991), CD30 (Durkop et al., Cel! 68: 421, 1992), el antígeno OX40 de las células T (Mallett et al., EMBO J. 9: 1063, 1990), el antígeno humano Fas (Itoh et al., Cel! 66: 233, 1991), el receptor murino 4-1 BB (Kwon et al., Proc. Nat!. Acad. Sci. USA 86: 1963, 1989) Y un receptor al que se hace referencia como Receptor Inductor de Apoptosis (AIR; USSN 08/720.864, presentada el 4 de octubre de 1996).

CD40 es un receptor presente en los linfocitos B, las células epiteliales y algunas líneas de células de carcinoma que interacciona con un ligando encontrado en las células T activadas, CD40L (documento USSN 08/249.189, presentado el 24 de mayo de 1994). La interacción de este par ligando/receptor es esencial para la respuesta inmunológica tanto celular como humoral. La transducción de señales por CD40 está mediada por la asociación del dominio citoplásmico de esta molécula con miembros de los factores asociados al receptor TNF (TRAFs; Baker y Reddy, Oncogene 12: 1, 1996). Se ha encontrado recientemente que los ratones que son deficientes en la expresión de TRAF3 debido a una disrupción direccionada en el gen que codifica TRAF3 parecen normales al nacer pero desarrollan hipoglucemia progresiva y empobrecimiento en glóbulos blancos periféricos, y mueren al cabo de aproximadamente 10 días de edad (Xu et al., Immunity 5: 407, 1996). Las respuestas inmunológicas de ratones quiméricos reconstituidos con células hepáticas fetales TRAF3-1-se asemejan a las de los ratones deficientes en CD40, aunque las células TRAF3-1-parecen ser funcionalmente normales.

El papel crítico de TRAF3 en la transducción de señales puede residir en su interacción con uno de los otros miembros de la superfamilia de receptores TNF, por ejemplo, CD30 o CD27, que están presentes en las células T. Alternativamente, pueden existir otros miembros, todavía no identificados, de esta familia de receptores que interaccionan con TRAF3 y juegan un papel importante en el desarrollo posnatal así como en el desarrollo de un sistema inmunitario competente. La identificación de miembros adicionales de la superfamilia de receptores TNF podría proporcionar un medio adicional de regulación de la respuesta inmunológica e inflamatoria, así como proporcionar potencialmente una mejor comprensión en cuanto al desarrollo post-natal de los mamíferos.

El documento WO 98/25958 describe una secuencia de aminoácidos murina a la que se hace referencia como 499E9 y un anticuerpo que es inmunorreactivo con la secuencia de aminoácidos murina 499E9.

SUMARIO DE LA INVENCiÓN

La presente invención proporciona una contraestructura, o ligando, para un nuevo receptor al que se hace referencia como RANK (para receptor activador de NF-KB), que es un miembro de la superfamilia TNF. El ligando, al que se hace referencia como RANKL, es una proteína transmembranal de Tipo 2 con un dominio intracelular que tiene menos de aproximadamente 50 aminoácidos, un dominio transmembranal y un dominio extracelular de aproximadamente 240 a 250 aminoácidos. Análogamente a otros miembros de la familia TNF a la que pertenece, RANKL tiene una región 'espaciadora' entre el dominio transmembranal y el dominio de fijación de receptores que no es necesaria para la fijación de receptores. De acuerdo con ello, formas solubles de RANKL pueden comprender el dominio extracelular entero o fragmentos del mismo que incluyen la región de fijación de receptores.

RANK es una proteína transmembranal de Tipo I que tiene 616 residuos de aminoácidos, que es un miembro de la superfamilia TNFR, e interacciona con TRAF3. La excitación de RANK por sobre-expresión, co-expresión de RANK Y RANKL fijado a la membrana, o por RANKL soluble o anticuerpos agonistas de RANK, da como resultado la regulación creciente del factor de transcripción NF-KB, un factor de transcripción ubicuo que es utilizado de modo muy extenso en células del sistema inmunitario.

Estos y otros aspectos de la presente invención resultarán evidentes después de considerar la descripción detallada que sigue de la invención.

BREVE DESCRIPCiÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 demuestra la influencia de RANK.Fc y hRANKL en el crecimiento de las células T activadas. Se cultivaron células T de sangre periférica humana como se describe en el Ejemplo 12; la recuperación de células T viables se determinó por conteos triplicados con azul tripán.

La Figura 2 ilustra la aptitud de RANKL para inducir la formación de aglomerados OC humanos. Células dendríticas (OC) funcionalmente maduras se generaron in vitro a partir de progenitores de médula ósea (BM) C034+, y se cultivaron como se describe en el Ejemplo 13. Se cultivaron OC C01 a+ en un cóctel de citoquinas aislado (Figura 2A), en cóctel más C040L (Figura 2B), RANKL (Figura 2C), o RANKL desactivado por calentamiento (LlH) (Figura 20), y se fotografiaron luego utilizando un microscopio de inversión.

La Figura 3 demuestra que RANKL aumenta la capacidad alo-estimuladora de OC. Se incubaron células T alogénicas con números variables de OC irradiadas, cultivadas como se describe en el Ejemplo 13. Los cultivos se pulsaron con [3H]-timidina y las células se cosecharon sobre hojas de fibra de vidrio para conteo. Los valores representan el valor medio ± la desviación estándar (SO) de cultivos triplicados.

La Figura 4 presenta una alineación de RANK humana con otros miembros de la familia TNFR en la región de pseudorrepeticiones extracelulares ricas en císteína, estructuralmente conservadas. Se indican los enlaces disulfuro predichos (OS1-0S3). RANK y C040 contienen sustituciones idénticas de aminoácidos (CAH, CAG) que eliminan OS2 en la segunda pseudorrepetición.

La Figura 5 presenta una alineación de RANKL humana con otros miembros de la familia TNF.

DESCRIPCiÓN DETALLADA DE LA INVENCiÓN

Una nueva inserción parcial de cONA con un marco de lectura abierto predicho que tiene cierta semejanza con C040 se identificó en una base de datos que contenía información de secuencias de cONAs generados a partir de células dendríticas (OC) derivadas de médula ósea humana. La inserción se utilizó para hibridación a transferencias de colonias generadas a partir de una genoteca de OC cONA que contenía cONAs de longitud total. Se analizaron varias hibridaciones de colonias, y se aislaron dos clones (SEQ ID NOs: 1 y 3). SEQ ID NO:5 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de una proteína de longitud total predicha basada en alineación de las secuencias solapantes de SEQ ID NOs: 1 y 3.

RANK es un miembro de la superfamilia de receptores TNF; el mismo se asemeja estrechamente a C040 en la región extracelular. Análogamente a C040, RANK se asocia con TRAF2 y TRAF3 (como se ha determinado por ensayos de co-inmunoprecipitación sustancialmente como ha sido descrito por Rothe et al., Ce1/83: 1243, 1995. Los TRAFs son críticamente importantes en la regulación de la respuesta inmunológica e inflamatoria. Por su asociación con diversos miembros de la superfamilia de receptores TNF, se transduce una señal a una célula. Dicha señal da como resultado la proliferación, diferenciación o apoptosis de la célula, dependiendo del receptor o receptores que se exciten y del o de los TRAF(s) que se asocien con el o los receptores; diferentes señales pueden transducirse a una célula por coordinación de diversos sucesos de señalización. Así, una señal transducida por un miembro de esta familia puede ser proliferativa, diferenciadora o apoptótica, dependiendo de otras señales que sean transducidas a la célula, y/o del estado de diferenciación de la célula. Dicha regulación exquisita de este camino proliferativo/apoptótico es necesaria para desarrollar y mantener protección contra los patógenos; los desequilibrios pueden dar como resultado una enfermedad autoinmune.

RANK se expresa en células epiteliales, algunas líneas de células B, y en células T activadas. Sin embargo, su expresión en las células T activadas es tardía, aproximadamente 4 días después de la activación. Esta evolución temporal de la expresión coincide con la expresión de Fas, un conocido agente de apoptosis. RANK puede actuar como señal anti-apoptótica, salvando las células que expresan RANK de la apoptosis como se sabe que hace C040. Alternativamente, RANK puede confirmar una señal apoptótica en las circunstancias apropiadas, nuevamente de modo análogo a C040. RANK y su ligando desempeñan probablemente un papel integral en la regulación de la respuesta inmunológica e inflamatoria.

Además, la letalidad post-natal de los ratones que tienen una disrupción direccionada del gen TRAF3 demuestra la importancia de esta molécula, no sólo en la respuesta inmunológica, sino en el desarrollo. El aislamiento de RANK, como proteína que se asocia con TRAF3, y su ligando, RANKL, permitirá la definición ulterior de este camino de señalización, y el desarrollo de modalidades diagnósticas y terapéuticas para utilización en el área de las enfermedades autoinmunes y/o inflamatorias.

ONAs, Proteínas y Análogos

La presente invención proporciona polipéptidos humanos RANKL aislados, análogos (o muteínas) de los mismos que tienen una actividad exhibida por la molécula nativa (es decir, muteínas RANKL que se fijan específicamente a un RANK expresado en las células o inmovilizado en una superficie, o a anticuerpos RANKL específicos; formas solubles de los mismos que inhiben la señalización por RANK inducida por el ligando RANK) y fragmentos que son capaces de fijar RANK. Tales proteínas están sustancialmente exentas de materiales contaminantes endógenos y,

opcionalmente, sin glicosilación asociada a un patrón nativo. Derivados de RANKL dentro del alcance de la invención incluyen también diversas formas estructurales de las proteínas primarias que retienen actividad biológica. Debido a la presencia de grupos amino y carboxilo ionizables, por ejemplo, una proteína RANKL puede hallarse en la forma de sales ácidas o básicas, o puede encontrarse en forma neutra. Los residuos de aminoácidos individuales pueden estar modificados también por oxidación o reducción. La estructura primaria de aminoácidos puede estar modificada por formación de conjugados covalentes o agregativos con otros restos químicos, tales como grupos glicosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo y análogos, o por creación de mutantes de las secuencias de aminoácidos. Se preparan derivados covalentes por enlace de grupos funcionales particulares a cadenas laterales de aminoácidos

o a los términos N o C.

Derivados de RANKL pueden obtenerse también por la acción de agentes de reticulación, tales como el éster de Mmaleimidobenzoil-succinimida y N-hidroxisuccinimida, en los residuos cisteína y lisina. Las proteínas de la invención pueden estar unidas también covalentemente por grupos laterales reactivos a diversos sustratos insolubles, tales como estructuras de agarosa activadas por bromuro de cianógeno, activadas por bisoxirano, activadas por carbonildiimidazol o activadas por tosilo, o por adsorción a superficies de poliolefinas (con o sin reticulación por aldehído glutárico). Una vez fijadas a un sustrato, las proteínas pueden utilizarse para fijar selectivamente (para propósitos de ensayo o de purificación) anticuerpos generados contra las proteínas o contra otras proteínas que son similares a RANKL, así como otras proteínas que fijan RANKL u homólogos del mismo.

Formas solubles de RANKL están también dentro del alcance de la invención. La secuencia de nucleótidos y la secuencia predicha de aminoácidos de RANKL se muestra en SEQ ID NO:12 (humana). El análisis por ordenador indicó que RANKL es una proteína transmembranal Tipo 2; RANKL murina contiene un dominio intracelular predicho de 48 aminoácidos, un dominio transmembranal de 21 aminoácidos y un dominio extracelular de 247 aminoácidos, y RANKL humana contiene un dominio intracelular predicho de 47 aminoácidos, un dominio transmembranal de 21 aminoácidos y un dominio extracelular de 249 aminoácidos.

RANKL soluble comprende un péptido de señal y el dominio extracelular o un fragmento del mismo que es capaz de fijar el polipéptido RANK. Un péptido de señal ilustrativo es el representado en SEQ ID NO:9; otros péptidos de señal (o conductores) son bien conocidos en la técnica, e incluyen el de interleuquina-7 murina o la hormona de crecimiento humana. RANKL es similar a otros miembros de la familia TNF en que tiene una región de aminoácidos entre el dominio transmembranal y la región de fijación de receptores que no parece ser necesaria para la actividad biológica; se hace referencia a ésta como región 'espaciadora'. La alineación de la secuencia de aminoácidos indica que la región de fijación de receptores comprende desde aproximadamente el aminoácido 162 de RANKL humana hasta aproximada-mente el aminoácido 317 (correspondiente a los aminoácidos 139 a 294 de RANKL murina, SEQ ID NO:10), comenzando con un residuo Ala que está conservado entre muchos miembros de la familia (aminoácido 162 de SEQ ID NO:12).

Además, fragmentos del dominio extracelular proporcionarán también formas solubles de RANKL. Los expertos en la técnica reconocerán que la región de fijación de receptores real puede ser diferente de la predicha por análisis mediante ordenador. Así, es de esperar que el aminoácido N-terminal de una RANKL soluble se encuentre dentro de aproximadamente 5 aminoácidos a cada lado del residuo Ala conservado. Alternativamente, la totalidad o una porción de la región espaciadora puede estar incluida en el término N de una RANKL soluble, como puede ser la totalidad o una porción de los dominios transmembranal y/o intracelular, con tal que la RANKL soluble resultante no esté asociada a la membrana. De acuerdo con ello, una RANKL soluble tendrá un aminoácido N-terminal seleccionado del grupo constituido por los aminoácidos 1 a 162 de SEQ ID NO:13. Preferiblemente, el aminoácido del terminal amino está comprendido entre los aminoácidos 69 y 162 de SEQ ID NO: 13 (RANKL humana). Análogamente, el aminoácido del terminal carboxi puede estar comprendido entre los aminoácidos 313 y 317 de SEQ ID NO: 13 (RANKL humana). Los expertos en la técnica pueden preparar estas formas y formas solubles adicionales por experimentación de rutina.

Pueden prepararse fragmentos utilizando técnicas conocidas para aislar una porción deseada de la región extracelular, y pueden prepararse, por ejemplo, por comparación de la región extracelular con las de otros miembros de la familia TNF (de la cual forma parte RANKL) y selección de formas similares a las preparadas para otros miembros de la familia. Alternativamente, pueden utilizarse sitios de restricción únicos o métodos PCR que se conocen en la técnica para preparar numerosas formas truncadas que pueden expresarse y analizarse en cuanto a actividad.

Otros derivados de las proteínas RANKL comprendidos dentro del alcance de esta invención incluyen conjugados covalentes o agregativos de las proteínas o sus fragmentos con otras proteínas o polipéptidos, por ejemplo por síntesis en cultivo recombinante como fusiones N-terminales o C-terminales. Por ejemplo, el péptido conjugado puede ser una secuencia de polipéptido de señal (o conductor) en la región N-terminal de la proteína que dirige por co-traducción o post-traducción la transferencia de la proteína desde su sitio de síntesis a su sitio de función dentro

o fuera de la membrana o pared celular (v.g., el conductor del factor a de levadura).

Las fusiones de proteínas pueden comprender péptidos añadidos para facilitar la purificación o identificación de proteínas RANKL y homólogos (v.g., poli-His). La secuencia de aminoácidos de las proteínas de la invención puede estar enlazada también a un péptido de identificación tal como ha sido descrito por Hopp et al., BiolTechn%gy6:

1204 (1988). Un péptido fuertemente antigénico de este tipo proporciona un epítope enlazado reversiblemente por un anticuerpo monoclonal específico, que permite el ensayo rápido y la purificación fácil de la proteína recombinante expresada. La secuencia de Hopp et al. es escindida también específicamente por la enteroquinasa mucosal bovina, permitiendo la eliminación del péptido de la proteína purificada. Proteínas de fusión protegidas terminal mente con tales péptidos pueden ser también resistentes a la degradación intracelular en E. eoli.

Las proteínas de fusión comprenden adicionalmente la secuencia de aminoácidos de una RANKL enlazada a una región Fc de inmunoglobulina. Una región Fc ilustrativa es una IgG1 humana, teniendo un nucleótido una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO:8. Pueden utilizarse también fragmentos de una región Fc, al igual que muteínas Fc. Por ejemplo, ciertos residuos dentro de la región bisagra de una región Fc son críticos para fijación de alta afinidad a FcyRI. Canfield y Morrison (J. Exp. Med. 173: 1483; 1991) consignaron que Leu(234) y Leu(235) eran críticas para fijación con afinidad alta de IgG3 a FcyRI presente en células U937. Resultados similares fueron obtenidos por Lund et al. (J. Immunol. 147: 2657, 1991; Molecular Immunol. 29: 53, 1991). Tales mutaciones, solas o en combinación, pueden producirse en una región Fc de IgG1 para disminuir la afinidad de IgG1 para FcR. Dependiendo de la porción de la región Fc utilizada, una proteína de fusión puede expresarse como un dímero, por formación de puentes disulfuro intercatenarios. Si las proteínas de fusión se producen con ambas cadenas pesada y ligera de un anticuerpo, es posible formar un oligómero proteínico con tantas como 4 regiones RANKL.

En otra realización, las proteínas RANKL comprenden adicionalmente un péptido de oligomerización tal como un dominio cremallera de leucina. Las cremalleras de leucina fueron identificadas originalmente en varias proteínas de fijación de DNA (Landschulz et al., Scienee 240: 1759, 1988). El dominio de cremallera de leucina es un término utilizado para hacer referencia a un dominio peptídico conservado presente en estas (y otras) proteínas, que es responsable de la dimerización de las proteínas. El dominio de cremallera de leucina (al que se hace referencia también en esta memoria como dominio de oligomerización, o formador de oligómeros) comprende una repetición de heptada repetitiva, con cuatro o cinco residuos leucina intercalados con otros aminoácidos. Ejemplos de dominios de cremallera de leucina son los encontrados en el factor de transcripción de levadura GCN4 y una proteína de fijación de DNA termoestable encontrada en hígado de rata (C/EBP; Landschulz et al. Scienee 243: 1681, 1989). Dos proteínas de transformación nucleares, fas y jun, exhiben también dominios de cremallera de leucina, como lo hace el producto génico del proto-oncogén murino, e-mye (Landschulz et al., Scienee 240: 1759, 1988). Los productos de los oncogenes nucleares fas y jun comprenden dominios de cremallera de leucina preferentemente en forma de un heterodímero (O'Shea et al., Scienee 245: 646, 1989; Turner y Tjian, Scienee 243: 1689, 1989). El domino de cremallera de leucina es necesario para la actividad biológica (fijación de DNA) en estas proteínas.

Las proteínas fusógenas de varios virus diferentes, con inclusión de paramixovirus, coronavirus, virus del sarampión y muchos retrovirus, poseen también dominios de cremallera de leucina (Buckland y Wild, Nature 338: 547, 1989; Britton, Nature 353: 394, 1991; Delwart y Mosialos, AIDS Researeh and Human Retroviruses 6: 703, 1990). Los dominios de cremallera de leucina en estas proteínas fusógenas virales están próximos a la región transmembranal de las proteínas; se ha sugerido que los dominios de cremallera de leucina podrían contribuir a la estructura oligómera de las proteínas fusógenas. La oligomerización de las proteínas fusógenas virales está implicada en la formación de poros de fusión (Spruce et al., Proe. Nat!. Aead. Sci. U.S.A. 88: 3523, 1991). Se ha comunicado también recientemente que los dominios de cremallera de leucina juegan un papel en la oligomerización de los factores de transcripción del choque térmico (Rabindran et al., Scienee 259: 230, 1993).

Los dominios de cremallera de leucina se pliegan como serpentines enrollados, cortos y paralelos. (O'Shea et al., Scienee 254: 539; 1991). La arquitectura general del serpentín enrollado paralelo ha sido bien caracterizada, con un empaquetamiento del tipo de "botones en ojales" como fue propuesto por Crick en 1953 (Acta Crystallogr. 6: 689). El dímero formado por un dominio de cremallera de leucina es estabilizado por la repetición de heptada, designada (abedefg)n de acuerdo con la notación de McLachlan y Stewart (J. Mol. Biol. 98: 293; 1975), en la cual los residuos a y d son generalmente residuos hidrófobos, siendo duna leucina, que están alineados en la misma cara de una hélice. Residuos de carga opuesta se encuentran comúnmente en las posiciones 9 y e. Así pues, en un serpentín enrollado paralelo formado por dos dominios de cremallera de leucina helicoidales, los "botones" formados por las cadenas laterales hidrófobas de la primera hélice están empaquetados en los "ojales" formados entre las cadenas laterales de la segunda hélice.

Los residuos leucina en la posición d aportan grandes energías de estabilización hidrófoba, y son importantes para la formación de dímeros (Krystek et al., Int. J. Peptide Res. 38: 229, 1991). Lovejoy et al. comunicaron recientemente la síntesis de un haz helicoidal a de tres cadenas en el cual las hélices están dirigidas arriba-arribaabajo (Scienee 259: 1288, 1993). Sus estudios confirmaron que la energía de estabilización hidrófoba proporciona la principal fuerza impulsora para la formación de serpentines enrollados a partir de monómeros helicoidales. Estos estudios indican también que interacciones electrostáticas contribuyen a la estequiometría y la geometría de los serpentines enrollados.

Varios estudios han indicado que aminoácidos conservadores pueden encontrarse en sustitución de residuos leucina individuales con una disminución mínima de la aptitud para la formación de dímeros; sin embargo, los cambios múltiples dan usualmente como resultado la pérdida de esta aptitud (Landschulz et al., Scienee 243: 1681, 1989; Turner y Tjian, Scienee 243: 1689, 1989; Hu et al., Scienee 250: 1400, 1990). Van Heekeren et al. comunicaron que cierto número de residuos amino diferentes pueden encontrarse en sustitución de los residuos

leucina en el dominio de cremallera de leucina de GCN4, y encontraron adicionalmente que algunas proteínas GCN4 que contienen dos sustituciones leucina eran débilmente activas (Nucl. Acids. Res. 20: 3721, 1992). La mutación de las leucinas heptádicas primera y segunda del dominio de cremallera de leucina de la proteína de fusión con el virus del sarampión (MVF) no afectaba a la formación de sincitios (una medida de la fusión celular inducida por virus); sin embargo, la mutación de la totalidad de los cuatro residuos leucina impedía la fusión completamente (Buckland et al., J. Gen. Virol. 3: 1703, 1992). Ninguna de las mutaciones afectaba a la aptitud de MVF para formar un tetrámero.

Se ha encontrado que las sustituciones de aminoácidos en los residuos a y d de un péptido sintético que representa el dominio de cremallera de leucina GCN4 cambian las propiedades de oligomerización del dominio de cremallera de leucina (Alber, Sexto Simposium de la Sociedad de Proteínas, San Diego, CA). Cuando todos los residuos en la posición a están cambiados a isoleucina, la cremallera de leucina forma todavía un dímero paralelo. Cuando, además de este cambio, todos los residuos leucina en la posición d están cambiados también a isoleucina, el péptido resultante forma espontáneamente un serpentín enrollado paralelo trímero en solución. La sustitución de todos los aminoácidos en la posición d con isoleucina y en la posición a con leucina da como resultado un péptido que se tetrameriza. Los péptidos que contienen estas sustituciones se designan también como dominios de cremallera de leucina.

La presente invención incluye también RANKL con o sin glicosilación de patrón nativo asociada. Las proteínas expresadas en levadura o sistemas de expresión de mamífero, v.g. las células COS-7, pueden ser similares o ligeramente diferentes en peso molecular y patrón de glicosilación a las moléculas naturales, dependiendo del sistema de expresión. La expresión de DNAs que codifican las proteínas de la invención en bacterias tales como E. coli proporciona moléculas no glicosiladas. Análogos mutantes funcionales de la proteína RANKL que tienen sitios de glicosilación en N desactivados pueden producirse por síntesis de oligonucleótidos y ligación o por técnicas de mutagénesis orientada. Estas proteínas análogas pueden producirse en una forma homogénea, de carbohidratos reducidos con buen rendimiento utilizando sistemas de expresión de levadura. Los sitios de glicosilación en N en proteínas eucariotas se caracterizan por el triplete de aminoácidos Asn-A1-l, donde A 1 es cualquier aminoácido excepto Pro, y l es Ser o Thr. En esta secuencia, la asparagina proporciona un grupo amino de cadena lateral para unión covalente de carbohidrato. Dicho sitio puede ser eliminado por reemplazamiento de Asn o del residuo l por otro aminoácido, deleción de Asn o l, o inserción de un aminoácido distinto de l entre A1 y l, o un aminoácido distinto de Asn entre Asn yA1.

Derivados de la proteína RANKL pueden obtenerse también por mutaciones de la RANKL nativa o subunidades de la misma. Una proteína RANKL mutada, como se contempla en esta memoria, es un polipéptido homólogo a una proteína RANKL nativa, pero que tiene una secuencia de aminoácidos diferente de la proteína nativa debido a una o una pluralidad de deleciones, inserciones o sustituciones. El efecto de cualquier mutación realizada en un DNA que codifica un péptido mutado puede ser determinado fácilmente por análisis de la aptitud del péptido mutado para fijar su contraestructura de una manera específica. Además, la actividad de análogos, muteínas o derivados de RANKL puede determinarse por cualquiera de los ensayos descritos en esta memoria (por ejemplo, inducción de la activación de NF-KB).

Análogos de las proteínas de la invención pueden construirse, por ejemplo, por realización de diversas sustituciones de residuos o secuencias o deleción de residuos terminales o internos o secuencias no necesarias para la actividad biológica. Por ejemplo, los residuos cisteína pueden ser delecionados o reemplazados con otros aminoácidos para impedir la formación de puentes disulfuro intramoleculares incorrectos después de renaturalización. Otros métodos distintos de la mutagénesis implican modificación de residuos de aminoácidos dibásicos adyacentes para intensificar la expresión en sistemas de levadura en los cuales está presente actividad de la proteasa KEX2.

Cuando se adopta una estrategia de deleción o inserción, debería considerarse el efecto potencial de la deleción o inserción sobre la actividad biológica. Subunidades de las proteínas de la invención pueden construirse por deleción de residuos o secuencias terminales o internos. Formas solubles de RANKL pueden prepararse y testarse fácilmente en cuanto a su aptitud para inducir la activación de NF-KB. Polipéptidos correspondientes a las regiones citoplásmicas, y fragmentos de los mismos (por ejemplo, un dominio de muerte) pueden prepararse por técnicas similares. Una orientación adicional en cuanto a los tipos de mutaciones que pueden hacerse se proporciona por una comparación de la secuencia de RANKL con proteínas que tienen estructuras similares, y por realización de análisis estructurales de las proteínas RANKL de la invención.

Generalmente, las sustituciones deberían hacerse de manera conservadora; es decir, los aminoácidos sustitutos más preferidos son aquéllos que no afectan a la actividad biológica de RANKL (es decir, la aptitud de las proteínas de la invención para fijar anticuerpos a la proteína nativa correspondiente de manera sustancialmente equivalente, la aptitud para fijar la contraestructura sustancialmente del mismo modo que la proteína nativa, la aptitud para inducir una señal de RANKL, o la aptitud para inducir la activación de NF-KB). Ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de aminoácidos situados fuera del o de los dominios de fijación (sean áreas ligando/receptor o áreas de fijación de anticuerpos para el dominio extracelular, o regiones que interaccionan con otras proteínas intracelulares en cuanto al dominio citoplásmico), y sustitución de aminoácidos que no alteran la estructura secundaria y/o terciaria de la proteína nativa. Ejemplos adicionales incluyen la sustitución de un residuo alifático por otro, tal como lIe, Val, Leu o Ala uno por otro, o sustituciones de un residuo polar por otro, tal como entre Lys y Arg;

Glu y Asp; o Gln y Asn. Otras sustituciones conservadoras de este tipo, por ejemplo, sustituciones de regiones enteras que tienen características de hidrofobicidad similares, son bien conocidas.

Las mutaciones en secuencias de nucleótidos construidas para expresión de proteínas análogas o fragmentos de las mismas deben preservar, por supuesto, la fase de marco de lectura de las secuencias codificantes y preferiblemente no crearán regiones complementarias que pudieran hibridarse para producir estructuras secundarias de mRNA tales como bucles u horquillas que podrían afectar de manera desfavorable a la traducción del mRNA.

No todas las mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína RANKL o fragmentos de la misma se expresarán en el producto final; por ejemplo, pueden hacerse sustituciones de nucleótidos para intensificar la expresión, fundamentalmente con objeto de evitar bucles de estructura secundaria en el mRNA transcrito (véase el documento EPA 75.444A, que se incorpora en esta memoria por referencia), o para proporcionar codones que son traducidos más fácilmente por el hospedador seleccionado, v.g., los codones de preferencia de E. eoli bien conocidos para expresión en E. eoli.

Aunque un sitio de mutación puede estar predeterminado, no es necesario que la naturaleza de la mutación esté predeterminada per se. Por ejemplo, con objeto de seleccionar características óptimas de mutantes, puede realizarse una mutagénesis aleatoria y las proteínas mutadas expresadas pueden escrutarse respecto a la actividad deseada. Las mutaciones pueden introducirse en loci particulares por síntesis de oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción que permiten la ligación a fragmentos de la secuencia nativa. Después de la ligación, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la inserción, sustitución o deleción de aminoácido deseada.

Alternativamente, pueden emplearse procedimientos de mutagénesis orientada dirigida a oligonucleótidos a fin de proporcionar un gen alterado que tenga codones particulares alterados de acuerdo con la sustitución, deleción, o inserción requerida. Métodos ilustrativos de realización de las alteraciones arriba expuestas han sido descritos por Walder et al. (Gene 42: 133, 1986); Bauer et al. (Gene 37: 73, 1985); Craik (BioTeehniques, enero de 1985, 12-19); Smith et al. (Genetie Engineering: Principies and Methods, Plenum Press, 1981); y las Patentes U.S. Núms.

4.518.584 Y 4.737.462 describen técnicas adecuadas, y se incorporan por referencia en esta memoria.

Una realización de la invención es

un ONA que codifica una proteína que tiene un aminoácido como se indica en SEQ ID NO: 13, en donde la proteína tiene un término amino seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre el aminoácido 1 y el aminoácido 162, inclusive, y un término carboxi seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre el aminoácido 313 y el aminoácido 317, inclusive;

moléculas de ONA que codifican fragmentos de proteínas codificadas por el ONA de la invención que son capaces de fijación de polipéptido;

un ONA que comprende un nucleótido como se indica en los nucleótidos 1-951 de SEQ ID NO:12; un ONA que comprende una secuencia de nucleótidos como se indica en los nucleótidos 484 a 951 de SEQ ID NO:12, y un ONA que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos entre el aminoácido 1 y el aminoácido 317 de SEQ ID NO:13.

Realizaciones adicionales de las proteínas de la invención incluyen polipéptidos RANKL codificados por un ONA que comprende una secuencia de nucleótidos como se indica en los nucleótidos 1 a 951 de SEQ ID NO:12, nucleótidos 484 a 951 de SEQ ID NO:12 y un polipéptido RANKL que tiene una secuencia de aminoácidos entre el aminoácido 1 Y el aminoácido 317 de SEQ ID NO:13. En una realización preferida, polipéptidos de la invención son aquéllos que son idénticos al menos aproximadamente en un 90% a un polipéptido RANKL codificado por un ONA que comprende una secuencia de nucleótidos como se indica en los nucleótidos 1 a 951 de SEQ ID NO:12, o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos entre el aminoácido 1 y el aminoácido 317 de SEQ ID NO:13.

El porcentaje de identidad puede determinarse utilizando un programa de ordenador, por ejemplo, el programa de ordenador GAP descrito por Oevereux et al. (Nuc!. Acids Res. 12: 387, 1984) Y disponible del Grupo de Genética de Ordenador de la Universidad de Wisconsin (UWGCG). Para fragmentos derivados de la proteína RANKL, la identidad se calcula sobre la base de la porción de la proteína RANKL que está presente en el fragmento.

La actividad biológica de los análogos o muteínas de RANKL puede determinarse testando la aptitud de los análogos o muteínas para inducir una señal a través de RANK, por ejemplo, activación o transcripción como se describe en los Ejemplos de esta memoria. Alternativamente, pueden utilizarse ensayos adecuados, por ejemplo, un inmunoensayo enzimático o una transferencia de puntos, empleando un anticuerpo que se fija a RANKL nativa, o una forma soluble de RANK, para evaluar la actividad de análogos o muteínas de RANKL. Ensayos adecuados incluyen también, por ejemplo, ensayos que miden la aptitud de un péptido o muteína de RANKL para fijar células que expresan RANK, y/o los efectos biológicos en las mismas. Tales métodos son bien conocidos en la técnica.

Fragmentos de las secuencias de nucleótidos RANKL que codifican fragmentos de proteínas que son capaces de fijar el polipéptido RANK son también útiles. En una realización, tales fragmentos comprenden al menos

aproximadamente 17 nucleótidos consecutivos, con preferencia aproximadamente al menos 25 nucleótidos, más preferiblemente al menos 30 nucleótidos consecutivos, del ONA de RANKL descrito en esta memoria. Complementos de ONA y RNA de tales fragmentos se proporcionan en esta memoria, junto con formas monocatenarias y bicatenarias de los ONAs RANKL de SEQ ID NOs: 10 Y 12, Y los que codifican los polipéptidos mencionados anteriormente. Un fragmento de ONA RANKL comprende por regla general al menos aproximadamente 17 nucleótidos, con preferencia desde aproximadamente 17 a aproximadamente 30 nucleótidos. Tales fragmentos de ácido nucleico (por ejemplo, una sonda que corresponde al dominio extracelular de RANKL) se utilizan como sonda o como iniciadores en una reacción en cadena de polimerasa (PCR).

Las sondas encuentran utilización también en la detección de la presencia de ácidos nucleicos RANKL en ensayos in vitro y en procedimientos tales como transferencias Northern y Southern. Pueden identificarse también tipos de células que expresan RANKL. Tales procedimientos son bien conocidos, y el técnico experto puede seleccionar una sonda de longitud adecuada, dependiendo de la aplicación particular propuesta. Para PCR, se emplean iniciadores 5' y 3' correspondientes a los términos de una secuencia de ONA RANKL dseada a fin de amplificar dicha secuencia, utilizando técnicas convencionales.

Otros fragmentos útiles de los ácidos nucleicos RANKL son oligonucleótidos de sentido o antisentido que comprenden una secuencia de ácido nucleico monocatenaria (sea RNA o ONA) capaz de fijarse a secuencias diana de mRNA RANKL (sentido) o ONA RANKL (antisentido). La aptitud para crear un oligonucleótido antisentido u oligonucleótido de sentido, basado en una secuencia de cONA para una proteína dada, se describe, por ejemplo, en Stein y Cohen, Cancer Res. 48: 2659, 1998 Y van der Krol et al., Bio Techniques 6: 958, 1988.

Utilizacións de ONAs, Proteínas y Análogos

Los ONAs, proteínas y análogos de RANKL descritos en esta memoria tendrán numerosos utilizacións, que incluyen la preparación de composiciones farmacéuticas. Por ejemplo, formas solubles de RANKL serán útiles para transducción de señales por vía de RANK. Composiciones RANKL (tanto proteína como ONAs) serán útiles también en el desarrollo de anticuerpos para RANKL, tanto aquéllos que inhiben la fijación a RANK como los que no lo hacen. Una realización de la invención es un anticuerpo inmunorreactivo con un polipéptido RANKL de la invención, que no es inmunorreactivo con la secuencia de aminoácidos murina denominada 499E9 en WO 98/25958. Los ONAs de la invención son útiles para la expresión de proteínas recombinantes, y como sondas para análisis (sea cuantitativo o cualitativo) de la presencia o distribución de transcritos RANKL.

Las proteínas de la invención serán útiles también en la preparación de kits que se utilizan para detectar RANK o RANKL soluble, o monitorizar la actividad relacionada con RANK, por ejemplo, en muestras de pacientes. Las proteínas RANKL encontrarán utilizacións también en la monitorización de la actividad relacionada con RANK en otras muestras o composiciones, como es necesario cuando se realiza un cribado para antagonistas o miméticos de esta actividad (por ejemplo, péptidos o moléculas pequeñas que inhiben o mimetizan, respectivamente, la interacción). Una diversidad de formatos de ensayo son útiles en tales kits, que incluyen (pero sin carácter limitante) ELlSA, transferencia de puntos, ensayos de fijación en fase sólida (tales como los que utilizan un biosensor), ensayos de formato rápido y bioensayos.

El RANKL purificado de acuerdo con la invención facilitará el descubrimiento de inhibidores de RANK, y por tanto, inhibidores de una respuesta inflamatoria (por inhibición de la activación de NF-KB). La utilización de un polipéptido RANKL purificado en el cribado para inhibidores potenciales es importante y puede eliminar vi rtualmente la posibilidad de reacciones de interferencia con contaminantes. Un ensayo de cribado de este tipo puede utilizar el dominio extracelular de RANKL, o un fragmento del mismo. La detección de la actividad inhibidora de una molécula implicaría típicamente La utilización de una forma soluble de RANKL derivada del dominio extracelular en un ensayo de cribado para detectar moléculas capaces de fijar RANK e inhibir la fijación de RANKL.

Adicionalmente, pueden utilizarse también polipéptidos RANKL para diseño basado en estructura de inhibidores de RANKL. Dicho diseño basado en estructura se conoce también como "diseño racional de fármacos". Los polipéptidos RANKL pueden analizarse tridimensionalmente mediante, por ejemplo, cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear o modelización de homología, todos los cuales son métodos bien conocidos. La utilización de información estructural de RANKL en sistemas de software de modelización molecular para ayudar al diseño de inhibidores se describe en esta memoria. Dicha modelización y diseño de fármacos asistida(o) por ordenador pueden utilizar información tal como análisis químico conformacional, potencial electrostático de las moléculas, plegado de proteínas, etc. Un método particular de la invención comprende analizar la estructura tridimensional de RANKL para sitios probables de fijación de sustratos, síntesis de una nueva molécula que incorpora un sitio reactivo predictivo, y ensayo de la nueva molécula como se ha descrito arriba.

Además, como se muestra en los ejemplos de esta memoria, formas solubles de RANKL serán útiles para inducir la maduración de células dendríticas (OC), y para mejorar su capacidad alo-estimulante. De acuerdo con ello, las proteínas RANKL serán útiles en el aumento de una respuesta inmunológica, y pueden utilizarse para estos propósitos sea ex vivo (es decir, en la obtención de células tales como OC de un individuo, exposición de las mismas a un antígeno y citoquinas ex vivo, y readministración de las mismas al individuo) o in vivo (es decir, como un adyuvante de vacuna que aumentará la inmunidad humoral y/o celular). RANKL será útil también para promover

la viabilidad de las células T en presencia de TGF~, que será útil también en la regulación de una respuesta inmunológica.

Expresión de RANKL Recombinante

Las proteínas de la presente invención se producen preferiblemente por métodos de ONA recombinante mediante inserción de una secuencia de ONA que codifica la proteína RANKL o un análogo de la misma en un vector de expresión recombinante y expresión de la secuencia de ONA en un sistema de expresión recombinante en condiciones que promueven la expresión. Las secuencias de ONA que codifican las proteínas proporcionadas por esta invención pueden ensamblarse a partir de fragmentos de cONA y enlazadores oligonucleotídicos cortos, o a partir de una serie de oligonucleótidos, a fin de proporcionar un gen sintético que es susceptible de ser insertado en un vector de expresión recombinante y expresarse en una unidad recombinante de transcripción.

Vectores de expresión recombinantes incluyen fragmentos de ONA sintéticos o derivados de cONA que codifican RANKL, u homólogos, muteínas o análogos bioequivalentes de los mismos, enlazados operativamente a elementos reguladores de la transcripción o la traducción adecuados derivados de genes de mamíferos, microbios, virus o insectos. Tales elementos reguladores incluyen un promotor de transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica sitios de fijación de ribosoma de mRNA adecuados, y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y traducción, como se describe en detalle más adelante. Adicionalmente, puede incorporarse la aptitud para replicarse en un hospedador, conferida usualmente por un origen de replicación, y un gen de selección para facilitar el reconocimiento de transformantes.

Las regiones de ONA están enlazadas operativamente cuando las mismas están relacionadas funcionalmente unas con otras. Por ejemplo, el ONA de un péptido de señal (conductor secretorio) está enlazado operativamente a ONA para un polipéptido si se expresa como precursor que participa en la secreción del polipéptido; un promotor está enlazado operativamente a una secuencia codificante si el mismo controla la transcripción de la secuencia; o un sitio de fijación de ribosoma está enlazado operativamente a una secuencia codificante si el mismo está posicionado de tal modo que permite la traducción. Por regla general, enlazado operativamente significa contiguo y, en el caso de conductores secretorios, contiguo y en marco de lectura. Las secuencias de ONA que codifican RANKL, u homólogos o análogos de las mismas que deben expresarse en un microorganismo no contendrán preferiblemente intrón alguno que pudiera terminar prematuramente la transcripción del ONA en mRNA.

Vectores de expresión útiles para utilización bacteriano pueden comprender un marcador seleccionable y un origen de replicación bacteriano derivado de plásmidos disponibles comercialmente que comprenden elementos genéticos del vector de clonación pBR322 bien conocido (ATCC 37017). Vectores comerciales de este tipo incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, EE.UU.). Estas secciones de "cadena principal" pBR322 se combinan con un promotor apropiado y con la secuencia estructural a expresar. E. coli se transforma típicamente utilizando derivados de pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli (Bolivar et al., Gene 2: 95, 1977). pBR322 contiene genes para resistencia a ampicilina y tetraciclina y proporciona por tanto medios simples para identificación de células transformadas.

Los promotores utilizados comúnmente en vectores de expresión microbiana recombinantes incluyen el sistema de promotores de ~-Iactamasa (penicilinasa) y lactosa (Chang et al., Nature 275: 615, 1978; Y Goeddel et al., Nature

281: 544, 1979), el sistema del promotor triptófano (trp) (Goeddel et al., Nuc!. Acids Res. 8: 4057, 1980; Y EPA 36.776) Y el promotor tac (Maniatis, Molecular C/oning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412, 1982). Un sistema de expresión bacteriano particularmente útil emplea el promotor PL del fago 11 y el represor termolábil c1857ts. Vectores plasmídicos disponibles de la American Type Cu Iture Collection que incorporan derivados del promotor PL 11 incluyen el plásmido pHUB2, residente en la cepa JMB9 de E. coli (ATCC 37092) Y pPLc28, residente en E. coli RR1 (ATCC 53082).

Secuencias de promotores adecuados en vectores de levadura incluyen los promotores para metalotioneína, 3fosfoglicerato-quinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980) u otras enzimas glicolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; Y Holland et al., Biochem. 17: 4900, 1978), tales como enolasa, gliceraldehído-3fosfato-deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato-descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato-isomerasa, 3fosfo-glicerato-mutasa, piruvato-quinasa, triosafosfato-isomerasa, fosfoglucosa-isomerasa, y glucoquinasa. Vectores y promotores adecuados para utilización en la expresión de levadura se describen adicionalmente en R. Hitzeman et al., EPA 73657.

Vectores de levadura preferidos pueden ensamblarse utilizando secuencias de ONA a partir de pBR322 para selección y replicación en E. coli (gen Ampr y origen de replicación) y secuencias de ONA de levadura que incluyen un promotor AOH2 reprimible por glucosa y un conductor de secreción del factor a. El promotor AOH2 ha sido descrito por Russell et al. (J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) Y Beier et al. (Nature 300: 724, 1982). El conductor del factor a de levadura, que dirige la secreción de proteínas heterólogas, puede insertarse entre el promotor y el gen estructural para ser expresado. Véase, v.g., Kurjan et al., Cel! 30: 933, 1982; Y Bitter et al., Proc. Nat!. Acad. Sci. USA 81: 5330, 1984. La secuencia conductora puede modificarse de modo que contenga, cerca de su extremo 3', uno o más sitios de restricción útiles para facilitar la fusión de la secuencia conductora a genes extraños.

Las secuencias de control de la transcripción y la traducción en vectores de expresión a utilizar en la transformación de células de vertebrados pueden ser proporcionadas por fuentes virales. Por ejemplo, promotores e intensificadores utilizados comúnmente se derivan de Polyoma, Adenovirus 2, el Virus 40 de los Simios (SV40), y citomegalovirus humano. Secuencias de DNA derivadas del genoma viral de SV40, por ejemplo, el origen de SV40, el promotor precoz y tardío, el intensificador, el sitio de remodelación y los sitios de poliadenilación pueden utilizarse para proporcionar los otros elementos genéticos requeridos para expresión de una secuencia de DNA heteróloga. Los promotores precoz y tardío son particularmente útiles debido a que ambos se obtienen fácilmente a partir del virus como un fragmento que contiene también el origen de replicación viral de SV40 (Fiers et al., Nature 273: 113, 1978). Pueden utilizarse también fragmentos de SV40 menores o mayores, con tal que se incluya la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio Hind III hasta el sitio BglI localizado en el origen de replicación viral. Adicionalmente, el promotor genómico viral, las secuencias de control y/o de señal pueden utilizarse, con tal que tales secuencias de control sean compatibles con la célula hospedadora seleccionada. Vectores ilustrativos pueden construirse como se describe por Okayama y Berg (Mol. Cel/. Biol. 3: 280, 1983).

Un sistema útil para expresión estable a alto nivel de cDNAs receptores de mamífero en células epiteliales mamarias de murino C127 puede construirse sustancialmente como ha sido descrito por Cosman et al. (Mol. Imm un01. 23: 935, 1986). Se hace referencia a un vector eucariota preferido para expresión de DNA de RANKL como pDC406 (McMahan et al., EMBO J. 10: 2821, 1991), e incluye secuencias reguladoras derivadas de SV40, el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), y el virus Epstein-Barr (EBV). Otros vectores preferidos incluyen pDC409 y pDC410, que se derivan de pDC406. pDC410 se derivó de pDC406 sustituyendo el origen de replicación de EBV con secuencias que codificaban el antígeno T grande de SV40. pDC409 difiere de pDC406 en que un sitio de restricción Bg/ll fuera del sitio de clonación múltiple ha sido delecionado, haciendo único el sitio Bg/ll dentro del sitio de clonación múltiple.

Una línea de células útil que permite la replicación episómica de vectores de expresión, tales como pDC406 y pDC409, que contienen el origen de replicación de EBV, es CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478). La línea de células CV1/EBNA se derivó por transfección de la línea de células CV-1 con un gen que codificaba el antígeno 1 nuclear del virus Epstein-Barr (EBNA-1) Y expresaba constitutivamente EBNA-1 dirigido por el intensificador/promotor inmediatoprecoz de CMV humano.

Células Hospedadoras

Las células hospedadoras transformadas son células que se han transformado o transfectado con vectores de expresión construidos utilizando técnicas de DNA recombinante y que contienen secuencias que codifican las proteínas de la presente invención. Las células hospedadoras transformadas pueden expresar la proteína deseada (RANKL, u homólogos o análogos de la misma), pero las células hospedadoras transformadas para propósitos de clonación o amplificación del DNA de la invención no precisan expresar la proteína. Las proteínas expresadas se secretarán preferiblemente en el sobrenadante de cultivo, dependiendo del DNA seleccionado, pero pueden depositarse en la membrana celular.

Células hospedadoras adecuadas para expresión de proteínas incluyen procariotas, levaduras o células eucariotas superiores, bajo el control de promotores apropiados. Los procariotas incluyen organismos gram-negativos o grampositivos, por ejemplo E. eoli o Baeillus spp. Las células eucariotas superiores incluyen líneas de células establecidas de origen mamífero como se describe más adelante. Podrían emplearse también sistemas de traducción exentos de células para producir proteínas utilizando RNAs derivados de las construcciones de DNA descritas en esta memoria. Vectores apropiados de clonación y expresión para utilización con hospedadores celulares bacterianos, fúngicos, de levadura, y de mamífero han sido descritos por Pouwels et al. (Cloning Veetors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, 1985), cuya descripción pertinente se incorpora por la presente como referencia.

Pueden utilizarse hospedadores de expresión procariotas para expresión de RANKL, u homólogos o análogos de la misma que no requieren procesamiento extensivo proteolítico y de disulfuro. Vectores de expresión procariotas comprenden generalmente uno o más marcadores fenotípicos seleccionables, por ejemplo un gen que codifica proteínas que confieren resistencia a antibióticos o que suministra un requerimiento autotrófo, y un origen de replicación reconocido por el hospedador que asegura la amplificación dentro del hospedador. Hospedadores procariotas adecuados para transformación incluyen E. eoli, Baeillus subtilis, Salmonel/a typhimurium, y diversas especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyees, y Staphyloeoeeus, aunque pueden emplearse también otros como cuestión de elección.

RANKL recombinante puede expresarse también en hospedadores de levadura, preferiblemente de las especies Saeeharomyees, tales como S. eerevisiae. Levaduras de otros géneros, tales como Piehia o Kluyveromyees pueden emplearse también. Los vectores de levadura contendrán generalmente un origen de replicación a partir del plásmido de levadura 21-1 o una secuencia de replicación autónoma (ARS), promotor, DNA codificante de la proteína, secuencias para poliadenilación y terminación de la transcripción, y un gen de selección. Preferiblemente, los vectores de levadura incluirán un origen de replicación y un marcador seleccionable que permita la transformación tanto de la levadura como de E. eoli, v.g. el gen de resistencia a la ampicilina de E. eoli y el gen trp1 de S. eerevisiae, que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la

capacidad para crecer en triptófano, y un promotor derivado de un gen de levadura fuertemente expresado que induce la transcripción de una secuencia estructural aguas abajo. La presencia de la lesión trp1 en el genoma de la célula hospedadora de levadura proporciona luego un entorno eficaz para detección de la transformación por crecimiento en ausencia de triptófano.

Protocolos adecuados de transformación de levadura son conocidos por los expertos en la técnica: una técnica ilustrativa ha sido descrita por Hinnen et al., Proc. Nat!. Acad. Sci. USA 75: 1929, 1978, seleccionando transformantes Trp+ en un medio selectivo constituido por 0,67% de base nitrogenada de levadura, 0,5% de casaminoácidos, 2% de glucosa, 10 I-lg/ml de adenina y 20 I-lg/ml de uracilo. Las cepas hospedadoras transformadas por vectores que comprenden el promotor ADH2 pueden dejarse crecer para la expresión en un medio rico constituido por 1% de extracto de levadura, 2% de peptona, y 1% de glucosa suplementado con 80 I-lg/ml de adenina y 80 I-lg/ml de uracilo. La desrepresión del promotor ADH2 ocurre después de agotamiento del medio glucosa. Los sobrenadantes de levadura brutos se recogen por filtración y se mantienen a 4°C antes de la purificación ulterior.

Diversos sistemas de cultivo de células de mamífero o de insecto pueden emplearse para expresar la proteína recombinante. Sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insecto han sido revisados por Luckow y Summers, BiolTechnology 6: 47 (1988). Ejemplos de líneas de células hospedadoras de mamífero adecuadas incluyen las líneas COS-7 de células de riñón de mono, descritas por Gluzman (CeI/23: 175, 1981), y otras líneas de células capaces de expresar un vector apropiado que incluyen, por ejemplo, las líneas de células CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478), L, C127, 3T3, de ovario de hámster chino (CHO), HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamífero pueden comprender elementos no transcritos tales como un origen de replicación, un promotor e intensificador adecuado enlazado al gen a expresar, y otras secuencias 5' o 3' flanqueantes no transcritas, y secuencias 5' o 3' no traducidas, tales como los sitios de fijación de ribosoma necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de remodelación, y secuencias de terminación de la transcripción.

Purificación de RANKL recombinante

RANKL purificada, y homólogos o análogos de la misma se preparan por cultivo de sistemas hospedador/vector adecuados para expresar los productos de traducción recombinantes de los DNAs de la presente invención, que se purifican luego a partir de los medios de cultivo o extractos de células. Por ejemplo, los sobrenadantes de sistemas que secretan proteína recombinante en medios de cultivo pueden concentrarse primeramente utilizando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon.

Después del paso de concentración, el concentrado puede aplicarse a una matriz de purificación adecuada. Por ejemplo, una matriz de afinidad adecuada puede comprender una molécula de proteína o de lectina o anticuerpo de contraestructura unida a un soporte adecuado. Alternativamente, puede emplearse una resina de intercambio de anión, por ejemplo, una matriz o sustrato que tenga grupos dietilaminoetilo (DEAE) colgantes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos empleados comúnmente en purificación de proteínas. Alternativamente, puede emplearse un paso de intercambio de catión. Cambiadores de catión adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren los grupos sulfopropilo. La cromatografía de filtración con gel proporciona también un medio de purificación de las proteínas de la invención.

La cromatografía de afinidad es un método particularmente preferido de purificación de RANKL y homólogos de la misma. Por ejemplo, una RANKL expresada como proteína de fusión que comprende una región de inmunoglobulina Fc puede purificarse utilizando cromatografía de afinidad con proteína A o proteína G. Además, una proteína RANKL que comprende un dominio de oligomerización de cremallera puede purificarse en una resina que comprende un anticuerpo específico para el dominio de oligomerización de cremallera. Anticuerpos monoclonales contra la proteína RANKL pueden ser útiles también en purificación por cromatografía de afinidad, utilizando métodos que son bien conocidos en la técnica. Puede utilizarse también un ligando para preparar una matriz de afinidad para purificación de RANKL por afinidad.

Finalmente, pueden emplearse uno o más pasos de cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RPHPLC) que emplean medios RP-HPCL hidrófobos, v.g., gel de sílice que tiene grupos colgantes metilo u otros grupos alifáticos, para purificar ulteriormente una composición de RANKL. Algunos o la totalidad de los pasos de purificación que anteceden, en diversas combinaciones, pueden emplearse también para proporcionar una proteína recombinante homogénea.

La proteína recombinante producida en cultivo bacteriano se aísla usualmente por extracción inicial a partir de pelets de células, seguida por uno o más pasos de concentración, salificación, intercambio acuoso de iones o cromatografía de exclusión de tamaños. Finalmente, puede emplearse cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para los pasos de purificación finales. Las células microbianas empleadas en la expresión de proteína recombinante pueden someterse a disrupción por cualquier método conveniente, con inclusión de sometimiento a

ciclos congelación-descongelación, tratamiento por ultrasonidos, disrupción mecánica, o utilización de agentes de lisis celular.

La fermentación de levaduras que expresan la proteína de la invención como una proteína secretada simplifica notablemente la purificación. La proteína recombinante secretada que resulta de una fermentación en gran escala puede purificarse por métodos análogos a los descritos por Urdal et al. (J. Chromatog. 296: 171, 1984). Esta referencia describe dos pasos HPLC secuenciales de fase inversa para purificación de GM-CSF humano recombinante en una columna HPLC preparativa.

La proteína sintetizada en cultivo recombinante se caracteriza por la presencia de componentes celulares, con inclusión de proteínas, en cantidades y de un carácter que dependen de los pasos de purificación realizados para recuperar la proteína de la invención a partir del cultivo. Estos componentes serán ordinariamente de origen levadura, procariota o eucariota superior no humano, y preferiblemente están presentes en cantidades contaminantes inocuas, del orden de menos de aproximadamente 1 por ciento en peso. Adicionalmente, el cultivo de células recombinantes permite la producción de las proteínas de la invención exentas de otras proteínas que pueden estar asociadas normalmente con las proteínas cuando se encuentran en la naturaleza en las especies de origen.

Utilizacións y Administración de las Composiciones RANKL

Se describen también en esta memoria métodos de utilización de composiciones terapéuticas que comprenden una cantidad eficaz de una proteína y un diluyente y vehículo adecuado, y métodos para regulación de una respuesta inmunológica o inflamatoria. Se describe asimismo La utilización de RANKL en asociación con receptores de citoquinas o citoquinas solubles, u otras moléculas inmunorreguladoras.

Para utilización terapéutico, la proteína purificada se administra a un paciente, preferiblemente un humano, para tratamiento de una manera apropiada para la indicación. Así, por ejemplo, composiciones de proteína RANKL administradas para regular la función inmunitaria pueden administrarse por inyección de bolus, infusión continua, liberación sostenida desde implantes, u otra técnica adecuada. Típicamente, un agente terapéutico se administrará en la forma de una composición que comprende RANKL purificada, en asociación con vehículos, excipientes o diluyentes fisiológicamente aceptables. Tales vehículos serán no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas.

Ordinariamente, la preparación de tales composIciones proteínicas implica combinación de la proteína de la invención con tampones, antioxidantes tales como ácido ascórbico, polipéptidos de peso molecular bajo (menor que aproximadamente 10 residuos), proteínas, aminoácidos, carbohidratos con inclusión de glucosa, sacarosa o dextrinas, agentes quelantes tales como EOTA, glutatión y otros estabilizadores y excipientes. Solución salina tamponada neutra o solución salina mezclada con seroalbúmina coespecífica son diluyentes ilustrativos apropiados. Preferiblemente, el producto se formula como un liofilizado utilizando soluciones excipientes apropiadas (v.g., sacarosa) como diluyentes. Las dosificaciones apropiadas pueden determinarse en pruebas. La cantidad y frecuencia de administración dependerán, por supuesto, de factores tales como la naturaleza y gravedad de la indicación de que se trate, la respuesta deseada, el estado del paciente, etcétera.

Como se muestra en esta memoria, RANKL tiene efectos beneficiosos sobre diversas células importantes en el sistema inmunitario. De acuerdo con ello, RANKL puede administrarse a un individuo como un adyuvante de vacuna, o como un agente terapéutico para regular en el sentido creciente una respuesta inmunológica, por ejemplo, una enfermedad infecciosa. Además, se ha encontrado que NF-KB juega un papel protector en la prevención de la muerte apoptótica de las células inducida por TNF-a o quimioterapia. De acuerdo con ello, los agonistas de RANK (es decir, RANKL y anticuerpos agonistas) serán útiles en la protección de las células que expresan RANK contra los efectos negativos de la quimioterapia o la presencia de niveles altos de TNF-a tal como sucede en la se psi s (v.g., a saber, Barinaga, Science 274: 724, 1996, Y los artículos de Beg y Baltimore y Wang et al., páginas 782 y 784 del mismo ejemplar de Science).

Los ejemplos que siguen se ofrecen a modo de ilustración, y no con carácter de limitación. Los expertos en la técnica reconocerán que pueden hacerse variaciones de la invención materializada en los ejemplos, especialmente a la vista de la doctrina de las diversas referencias citadas en esta memoria, cuyas descripciones se incorporan por referencia.

Ejemplo 1

El ejemplo describe la identificación y el aislamiento de un ONA codificante de un nuevo miembro de la superfamilia de receptores TNF. Una inserción de cONA parcial con un marco de lectura abierto predicho que tiene cierta semejanza con C040 (un antígeno de la superficie celular presente en la superficie de las células B humanas tanto normales como neoplásticas, que se ha demostrado juega un papel importante en la proliferación y diferenciación de las células B; Stamenkovic et al., EMBO J. 8: 1403, 1989), se identificó en una base de datos que contenía información de secuencias de cONAs generados por células dendríticas (OC) derivadas de médula ósea humana. La inserción se separó del vector por digestión con endonucleasas de restricción, se purificó en gel, se marcó con 32P, y se utilizó para hibridación a transferencias de colonias generadas a partir de una genoteca de cONA de OC que contenía inserciones mayores de cONA utilizando técnicas de hibridación y lavado de alta severidad (hibridación en

5 x SSC, 50% de formamida a 42°C durante una noche, lavado en 0,5 x SSC a 63°C); otras condiciones adecuadas de alta severidad se describen en Sambrook et al. en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; 1989), 9.52-9.55. Los experimentos iniciales produjeron un clon al que se hace referencia como 90-8A (SEQ ID NO:1); el análisis subsiguiente indicó que este clon contenía la totalidad excepto el extremo 5' final de un cONA nuevo, con secuencia de intrones predicha en el extremo 5' final (nucleótidos 1-92 de SEQ ID NO:1). Se realizaron hibridaciones de colonias adicionales, y se aisló un segundo clon. El segundo clon, al que se hace referencia como 90-15C (SEQ ID NO:3), contenía el extremo 5' sin interrupción de intrones, pero no el extremo 3' entero. SEQ ID NO:5 muestra la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de una proteína de longitud total predicha basada en la alineación de las secuencias solapantes de SEQ ID NOs. 1 y 3.

La proteína codificada se designó RANK, para activador del receptor de NF-KB. El cONA codifica una proteína transmembranal predicha de Tipo 1 que tiene 616 residuos de aminoácidos, con una secuencia de señal predicha de 24 aminoácidos (el sitio de escisión predicho por el ordenador se encuentra después de Leu24), un dominio extracelular de 118 aminoácidos, un dominio transmembranal de 21 aminoácidos, y una cola citoplásmica de 383 aminoácidos. La región extracelular de RANK exhibía una homología de aminoácidos importante (38,5% de identidad, 52,3% de semejanza) a C040. Un vector de clonación (pBluescript SK-) que contenía la secuencia RANK humana, designado pBluescript:huRANK (en E. coli OH10B), se depositó en la American Type Culture Collection, Rockville, MO (ATCC) el 20 de diciembre de 1996, bajo los términos del Tratado de Budapest, y ha recibido el número de acceso 98285.

Ejemplo 2

Este ejemplo describe la realización de una construcción de ONA de RANK para expresar una proteína de fusión RANK/Fc. Se construyó una forma soluble de RANK fusionada a la región Fc de IgG1 humana en el vector de expresión de mamífero pOC409 (USSN 08/571.579). Este vector de expresión codifica la secuencia conductora del marco de lectura abierto del citomegalovirus (CMV) R27080 (SEQ ID NO:9), seguido por los aminoácidos 33-213 de RANK, seguido por una forma mutada del dominio constante de IgG1 humana, que exhibe afinidad reducida para los receptores Fc (SEQ ID NO:8; para la proteína de fusión, la porción Fc de la construcción consistía en Arg3 hasta Lys232). Se preparó también un vector de expresión alternativo que abarca los aminoácidos 1-213 de RANK (utilizando la secuencia conductora nativa) seguido por la muteína IgG1. Se encontró que ambos vectores de expresión inducían niveles altos de expresión de la proteína de fusión RANKlFc en las células transfectadas.

Para obtener la proteína RANKlFc, se transfecta un plásmido de expresión RANKlFc en células CV-1/EBNA, y se recogen los sobrenadantes durante aproximadamente una semana. La proteína de fusión RANKlFc se purifica por medios bien conocidos en la técnica para purificación de las proteínas de fusión Fc, por ejemplo, por cromatografía en columna de Sepharose con proteína A, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (a saber, Pharmacia, Uppsala, Suecia). El análisis por electroforesis en gel de SOS-poliacrilamida indicaba que la proteína RANKlFc purificada migraba con un peso molecular de -55 kOa en presencia de un agente reductor, y con un peso molecular de -110 kOa en ausencia de un agente reductor.

La secuenciación del aminoácido N-terminal de la proteína purificada producida utilizando el conductor R27080 de CMV demostró 60% de escisión después de Ala20, 20% de escisión después de Pr022 y 20% de escisión después de Arg28 (que es el sitio de escisión de Furina; los residuos de aminoácidos se refieren a SEQ ID NO:9); el análisis de aminoácidos N-terminal de la proteína de fusión expresada con el conductor nativo demostró escisión predominantemente después de Gln25 (80% después de Gln25 y 20% después de Arg23; los residuos de aminoácidos hacen referencia a SEQ ID NO:6, RANK de longitud total). Ambas proteínas de fusión eran capaces de fijarse a un ligando para RANK de manera específica (a saber, se fijaban a la superficie de diversas líneas de células tales como una línea de células de ti moma de murino, EL4), lo que indicaba que la presencia de aminoácidos adicionales en el término N de RANK no interfiere con su aptitud para fijarse a RANKL. Además, la construcción que comprendía el conductor de CMV codificaba RANK que comenzaba en el aminoácido 33: así pues, se espera que un péptido de RANK que tenga un término N en un aminoácido comprendido entre Arg23 y Pro33, inclusive, sea capaz de fijarse a un ligando para RANK de manera específica.

Otros miembros de la superfamilia de receptores TNF tienen una región de aminoácidos entre el dominio transmembranal y el dominio de fijación de ligandos al que se hace referencia como región 'espaciadora', que no es necesaria para la fijación de ligandos. En RANK, los aminoácidos comprendidos entre 196 y 213 se predice que forman una región espaciadora de este tipo. De acuerdo con ello, se espera que una forma soluble de RANK que termina con un aminoácido en esta región retenga la capacidad para fijarse a un ligando para RANK de una manera específica. Los aminoácidos C-terminales preferidos para péptidos RANK solubles se seleccionan del grupo constituido por los aminoácidos 213 y 196 de SEQ ID NO:6, aunque pueden utilizarse como término C otros aminoácidos comprendidos en la región espaciadora.

Ejemplo 3

Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales contra RANK. Preparaciones de RANK recombinante purificada, por ejemplo, o células transfectadas que expresan niveles altos de RANK, se emplean para generar anticuerpos monoclonales contra RANK utilizando técnicas convencionales, tales como las descritas en la

Patente U.S. 4.411.993. Puede utilizarse también como inmunógeno DNA que codifica RANK, por ejemplo, como ha sido revisado por Pardoll y Beckerleg en Immunity 3: 165, 1995. Tales anticuerpos serán probablemente útiles en la interferencia con la señalización inducida por RANK (anticuerpos antagonistas o bloqueantes) o en la inducción de una señal por reticulación de RANK (anticuerpos agonistas), como componentes de ensayos de diagnóstico o de investigación para RANK o actividad de RANK, o en purificación de RANK por afinidad.

Para inmunizar roedores, se emulsiona un inmunógeno RANK en un adyuvante (tal como adyuvante de Freund completo o incompleto, alumbre, u otro adyuvante, tal como el adyuvante R700 de Ribi (Ribi, Hamilton, MT), y se inyecta en cantidades que van desde 10 a 100 I-Ig subcutáneamente en un roedor seleccionado, por ejemplo ratones Balb/c o ratas Lewis. El DNA puede administrarse intradérmicamente (Raz et al., Proc. Nat!. Acad. Sci. USA 91: 9519, 1994) o por vía intramuscular (Wang et al., Proc. Nat!. Acad. Sci. USA 90: 4156, 1993); se ha encontrado que la solución salina es un diluyente adecuado para antígenos basados en DNA. De 10 días a 3 semanas más tarde, los ratones inmunizados se refuerzan con inmunógeno adicional y se refuerzan después periódicamente de acuerdo con un programa de inmunización semanal, bisemanal o cada tercera semana.

Se toman periódicamente muestras de suero por sangría retro-orbital o escisión en el extremo de la cola para sometimiento a test por ensayo de transferencia de puntos (sándwich de anticuerpos), ELlSA (ensayo de inmunosorbente unido a enzima), inmunoprecipitación, u otros ensayos adecuados, con inclusión del análisis FACS. Después de la detección de un título de anticuerpos apropiado, los animales positivos reciben una inyección intravenosa de antígeno en solución salina. Tres a cuatro días después, se sacrifican los animales, se recogen los esplenocitos, y se fusionan a una línea de células de mieloma murina (v.g., NS1 o preferiblemente Ag 8.653 [ATCC CRL 1580]). Las líneas de células de hibridoma generadas por este procedimiento se extienden en placas de microtitulación múltiples en un medio selectivo (por ejemplo, uno que contiene hipoxantina, aminopterina, y timidina,

o HAT) para inhibir la proliferación de las células no fusionadas, híbridos mieloma-mieloma, e híbridos esplenocitoesplenocito.

Los clones de hibridoma así generados pueden someterse a cribado por ELlSA respecto a reactividad con RANK, por ejemplo, por adaptaciones de las técnicas descritas por Engvall et al. Immunochem. 8: 871 (1971) Y en la Patente U.S. 4.703.004. Una técnica de cribado preferida es la técnica de captura de anticuerpos descrita por Beckman et al., J. Immunol. 144: 4212 (1990). Los clones positivos se inyectan luego en las cavidades peritoneales de roedores singénicos para producir ascitis que contiene concentraciones elevadas (>1 mg/ml) del anticuerpo monoclonal anti-RANK. El anticuerpo monoclonal resultante puede purificarse por precipitación con sulfato de amonio seguida por cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, puede utilizarse también cromatografía de afinidad basada en la fijación del anticuerpo a proteína A o proteína G, al igual que cromatografía de afinidad basada en fijación a la proteína RANK.

Se generaron anticuerpos monoclonales utilizando la proteína de fusión RANKlFc como inmunógeno. Estos reactivos se sometieron a cribado para confirmar la reactividad contra la proteína RANK. Utilizando los métodos descritos en esta memoria para monitorizar la actividad de los mAbs, se aislaron tanto anticuerpos bloqueantes (es decir, anticuerpos que se fijan a RANK e inhiben la fijación de un ligando a RANK) como no bloqueantes (es decir, anticuerpos que se fijan a RANK y no inhiben la fijación de ligando).

Ejemplo 4

Este ejemplo ilustra la inducción de la actividad de NF-KB por RANK en células 296/EBNA (la línea de células se derivó por transfección de la línea de células 293 con un gen que codificaba el antígeno-1 nuclear del virus EpsteinBarr (EBNA-1) que expresan constitutivamente EBNA-1 impulsado por el intensificador/promotor inmediato-precoz de CMV humano). La activación de la actividad de NF-KB se midió en las células 293/EBNA esencialmente como ha sido descrito por Yao et al., (Immunity 3: 811, 1995). Se prepararon extractos nucleares y se analizaron respecto a la actividad de NF-KB por un ensayo de retardación en gel utilizando un oligonucleótido de 25 pares de bases que abarcaba los sitios de fijación de NF-KB. Se sembraron dos millones de células en cápsulas de 10 cm dos días antes de la transfección del DNA y se cultivaron en medio DMEM-F12 que contenía 2,5% de FBS (suero bovino fetal). Las transfecciones de DNA se realizaron como se describe en esta memoria para los ensayos del promotor/informador IL-8.

Se prepararon extractos nucleares por solubilización de núcleos aislados con NaCI 400 mM (Yao et al., supra). Los oligonucleótidos que contenían un sitio de fijación de NF-KB se reasociaron y se marcaron terminalmente con 32P utilizando polinucleótido-quinasa de DNA T4. Las reacciones de desplazamiento de movilidad contenían 10 I-Ig de extracto nuclear, 4 mg de poli(dl-dC) y 15.000 cpm de oligonucleótido bicatenario marcado, y se incubaron a la temperatura ambiente durante 20 minutos. Los complejos proteína-DNA resultantes se resolvieron en un gel de poliacrilamida nativo a16% en tampón 0,25 X Tris-borato-EDTA.

La sobreexpresión de RANK dio como resultado la inducción de la actividad de NF-KB como se muestra por un desplazamiento apropiado en la movilidad de la sonda reactiva en el gel. Se observaron resultados similares cuando se excitó RANK por un ligando que fija y transduce una señal a las células que expresan el receptor (es decir, por co-transfección de células con DNA de RANK humano y RANKL murino; véase el Ejemplo 7 más adelante), y sería de esperar que ocurriera cuando la excitación se realiza con anticuerpos agonistas.

Ejemplo 5

Este ejemplo describe un sistema génico promotor/informador basado en el promotor humano de Interleuquina-8 (IL8) utilizado para analizar la activación de la transcripción génica in vivo. Se sabe que la inducción de la transcripción del gen de IL-8 humano por las citoquinas Interleuquina-1 (IL-1) o el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) depende de sitios de fijación de los factores de transcripción NF-KB y NF-IL-6 intactos. La fusión del promotor IL-8 que responde a las citoquinas con un cONA que codifica el receptor IL-4 murino (mIL-4R) permite la medida de la activación del promotor por detección de la proteína informadora heteróloga (mIL-4R) en la superficie celular de las células transfectadas.

Se transfectan células epiteliales de riñón humano (293/EBNA) (por el método DEAE/DEXTRANO) con plásmidos que codifican: 1) la construcción informador/promotor (a la que se hace referencia como pIL-8rep), y 2) el o los cDNAs de interés. Las concentraciones de DNA se mantienen siempre constantes por la adición de DNA de vector vacío. Las células 293/EBNA se extienden en placas a una densidad de 2,5 x 104 células/mi (3 mi/pocillo) en una placa de 6 pocillos y se incuban durante 2 días antes de la transfección. Dos días después de la transfección, se detecta el receptor m1L-4 por un radioinmunoensayo (RIA) descrito más adelante.

En un experimento de este tipo, las células 293/EBNA se co-transfectaron con DNA codificante de RANK y con DNA codificante de RANKL (véase el Ejemplo 7 más adelante). La co-expresión de este receptor y su contraestructura por las células da como resultado la activación del proceso de señalización de RANK. Para tales estudios de cotransfección, la concentración de DNAlpocillo para la transfección de DEAE era como sigue: 40 ng de plL-8rep [pBluescript SK-vector (Stratagene )]; 0,4 ng de CD40 (DNA codificante de CD40, un receptor de control; vector pCDM8); 0,4 ng de RANK (DNA codificante de RANK; vector pDC409), y o bien 1-50 ng de CD40L (DNA que codifica el ligando para CD40, que actúa como control positivo cuando se somete a co-transfección con CD40 y como control negativo cuando se somete a co-transfección con RANK; en pDC304) o RANKL (DNA codificante de un ligando para RANK; en pDC406). Pueden realizarse experimentos similares utilizando RANKL soluble o anticuerpos agonistas para RANK a fin de excitar las células transfectadas con RANK.

Para el RIA específico de mIL-4R, un anticuerpo monoclonal reactivo con mIL-4R se marca con 1251por un método de conjugación con cloramina T; la actividad específica resultante es típicamente 1,5 x 1016 cpm/nmol. Después de 48 horas, las células transfectadas se lavan una sola vez con medio (DMEM/F12, 5% FBS). Los sitios de fijación inespecífica se bloquean por la adición de medio de fijación precalentado que contiene 5% de leche desnatada seca e incubación a 37°C/5% C02 en una incubadora de cultivo de tejidos durante 1 hora. Se decanta el medio de bloqueo y se añade a las células un tampón de fijación que contiene 1251 anti-mIL-4R (clon M1; IgG1 de rata) y se incuba con sacudidas a la temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la incubación de las células con el anticuerpo radiomarcado, se lavan concienzudamente las células con tampón de fijación (2X) y dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las células se someten a lisis en 1 mi de NaOH 0,5M, y se mide la radiactividad total con un contador gamma.

Utilizando este ensayo, las células 293/EBNA co-transfectadas con DNAs que codificaban RANK demostraron activación transcripcional, como se muestra por la detección de mu1L-4R en la superficie celular. La sobreexpresión de RANK dio como resultado la transcripción de muIL-4R, como lo hace la excitación de RANK por RANKL. Se observaron resultados similares cuando se excita RANK por anticuerpos agonistas.

Ejemplo 6

Este ejemplo ilustra la asociación de RANK con proteínas TRAF. La interacción de RANK con proteínas citoplásmicas TRAF se demostró por ensayos de co-inmunoprecipitación esencialmente como ha sido descrito por Hsu et al. (Cel! 84: 299; 1996). Resumidamente, se co-transfectaron células 293/EBNA con plásmidos que dirigen la síntesis de RANK y TRAF2 (FLAG®; SEQ ID NO:7) marcado con epítope, o TRAF3. Dos días después de la transfección, se marcaron las proteínas de la superficie con éster de biotina, y se lisaron las células en un tampón que contenía 0,5% de NP-40. RANK y las proteínas asociadas con este receptor se inmunoprecipitaron con antiRANK, se lavaron concienzudamente, se resolvieron por separación electroforética en un gel de SDS-poliacrilamida al 6-10% Y se transfirieron por electroforesis a una membrana de nitrocelulosa para transferencia Western. La asociación de las proteínas TRAF2 y TRAF3 con RANK se visualizó por sondeo de la membrana con un anticuerpo que reconoce específicamente el epítope FLAG®. TRAFs 2 Y 3 no producían inmunoprecipitado con anti-RANK en ausencia de la expresión de RANK.

Ejemplo 7

Este ejemplo describe el aislamiento de un ligando para RANK, al que se hace referencia como RANKL, por clonación de la expresión directa. El ligando se clonó esencialmente como se descri be en USSN 08/249.189, presentado el 24 de mayo de 1994 (cuya descripción relevante se incorpora por referencia en esta memoria), para CD40L). Resumidamente, se preparó una genoteca a partir de un clon de una línea de células de ti moma de ratón EL-4 (ATCC TIB 39), denominada EL-40.5, derivada por clasificación 5 veces con la proteína de fusión CD40/Fc biotinilada en un FACS (clasificador de células activado por fluorescencia). La genoteca de cONA se preparó utilizando metodología estándar: el DNA plasmídico se aisló y se transfectó en células CV1-EBNA sub-confluentes

utilizando un método de OEAE-dextrano. Se cribaron los transfectantes por autorradiografía de diapositivas en cuanto a la expresión de RANKL utilizando un método de fijación en dos pasos con proteína de fusión RANKlFc como la preparada en el Ejemplo 2, seguido por anticuerpo anti-lgG humana de cabra radioyodado.

Se aisló y se secuenció un clon que codificaba una proteína que fijaba específicamente RANK; el clon se designó 11 H. Un vector de expresión que contenía la secuencia RANKL murina, designado pOC406: muRANK-L (en E. coli OH10B), se depositó en la American Type Culture Collection, Rockville, MO (ATCC) el20 de diciembre de 1996, de acuerdo con los términos del Tratado de Budapest, y recibió el número de acceso 98284. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos predicha de este clon se ilustran en SEQ ID NO: 1O. Este clon no contenía una metionina iniciadora; se obtuvieron clones de longitud total adicionales a partir de una genoteca 7B9 (preparada sustancialmente como se describe en la Patente U.S. 5.599.905, expedida el 4 de febrero de 1997); se encontró que la región 5' era idéntica a la de RANKL humana como se muestra en SEQ ID NO: 12, aminoácidos 1 a 22, excepto por la sustitución de un Gly en lugar de un Thr en el residuo 9.

Este ligando es útil para evaluar la capacidad de RANK para fijarse a RANKL por numerosos ensayos diferentes. Por ejemplo, pueden utilizarse células transfectadas que expresan RANKL en un ensayo FACS (o ensayo similar) para evalular la capacidad de RANK soluble para fijar RANKL. Además, pueden prepararse formas solubles de RANKL y utilizarse en ensayos que son conocidos en la técnica (a saber, los ensayos ELlSA o BIAcore esencialmente como se describe en el documento USSN 08/249.189, presentado el 24 de mayo de 1994). RANKL es útil también en la purificación de RANK por afinidad, y como reactivo en métodos para medir los niveles de RANK en una muestra. RANKL soluble es útil también en la inducción de la activación de NF-KB y por tanto en la protección de las células que expresan RANK contra la apoptosis.

Ejemplo 8

Este ejemplo describe el aislamiento de un ligando humano de RANK (RANKL) utilizando una técnica basada en PCR. Se utilizaron iniciadores oligonucleotídicos específicos del ligando murino de RANK en reacciones PCR que utilizaban como moldes cONAs de la primera cadena derivados de una línea de células humana. Los iniciadores correspondían a los nucleótidos 478-497 y al complemento de los nucleótidos 858-878 del ligando RANK murino (SEQ ID NO: 1O). Una banda amplificada de aproximadamente 400 pb de longitud procedente de una reacción que utilizaba la línea de células epidermoides humanas KB (ATCC CCL-17) se purificó en gel, y se determinó su secuencia de nucleótidos; la secuencia tenía 85% de identidad con la región correspondiente del ligando RANK murino, confirmando que el fragmento procedía de RANKL humana.

Para obtener cONAs de RANKL humana de longitud total, se radiomarcaron dos oligonucleótidos específicos de RANKL humana derivados de la secuencia de nucleótidos del producto PCR KB, y se utilizaron como sondas de hibridación para cribar una genoteca de cONA de PBL humano preparada en lambda gt10 (Stratagene, La Jolla, CA), sustancialmente como se describe en la Patente US 5.599.905, expedida el 4 de febrero de 1997. Se identificaron y purificaron varias placas de hibridación positivas, se subclonaron sus inserciones en pBluescript SK(Stratagene, La Jolla, CA), y se determinó su secuencia de nucleótidos. Se encontró un aislado, PBL3) que codificaba la mayor parte de la RANKL humana predicha, pero se encontró que faltaban aproximadamente 200 pb de la región codificante 5'. Se encontró un segundo aislado, POL5, que codificaba gran parte de la RANKL humana predicha, con inclusión del extremo 5' entero y 200 pb adicionales de secuencia 5' no traducida.

El extremo 5' de PBL5 y el extremo 3' de PBL3 se ligaron uno a otro para formar un cONA de longitud total que codificaba RANKL humana. La secuencia de nucleótidos y la secuencia predicha de aminoácidos del ligando RANK humano de longitud total se muestran en SEQ ID NO:12. El ligando RANK humano comparte 83% de identidad de nucleótidos y 84% de identidad de aminoácidos con el ligando RANK murino. Un vector plasmídico que contenía la secuencia RANKL humana, designado pBluescript:huRANK-L (en E. coli OH1 OB), se depositó en la American Type Culture Collection, Rockville, MO (ATCC) el 11 de marzo de 1997 de acuerdo con los términos del Tratado de Budapest, y recibió el número de acceso 98354.

RANKL murina y humana son proteínas transmembranales de Tipo 2. RANKL murina contiene un dominio intracelular predicho de 48 aminoácidos, un dominio transmembranal de 21 aminoácidos y un dominio extracelular de 247 aminoácidos. RANKL humana contiene un dominio intracelular de 47 aminoácidos predicho, un dominio transmembranal de 21 aminoácidos y un dominio extracelular de 249 aminoácidos.

Ejemplo 9

Este ejemplo describe el mapeado cromosómico de RANK humana utilizando estrategias de mapeado basadas en PCR. Se realizaron las asignaciones cromosómicas humanas iniciales utilizando iniciadores PCR específicos de RANK y RANKL Y un kit BIOS de ONA PCRable Híbrido de Células Somáticas procedente de BIOS Laboratories (New Haven, CT), siguiendo las instrucciones del fabricante. RANK mapeaba al cromosoma humano 18; el ligando de RANK mapeaba al cromosoma humano 13. Se analizó un mapeado más detallado utilizando un panel de mapeado híbrido de radiación Genebridge 4 Radiation Hybrid Panel (Research Genetics, HuntsVille, AL; descrito en Walter, MA et al., Nature Genetics 7:22-28, 1994). Los datos procedentes de este análisis se sometieron luego electrónicamente al Mapeador Híbrido de Radiación MIT (URL: http://www-genome.wi.mit.edu/cgi

bin/contig/rhmapper. pi) siguiendo las instrucciones contenidas en dicho documento. Este análisis proporcionaba nombres de marcadores genéticos específicos que, cuando se sometieron electrónicamente al navegador NCBI Entrez (U RL: http://www3.ncbi.nlm. nih. gov/htbin-postlEntrez/query?db=c&form=O), proporcionaron las localizaciones específicas del mapa. RANK mapeaba al cromosoma 18q22.1, y RANKL mapeaba al cromosoma 13q14.

Ejemplo 10

Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales contra RANKL. Se emplean preparaciones de RANKL purificado recombinante, por ejemplo, o células paralizadas que expresan niveles altos de RANKL, para generar anticuerpos monoclonales contra RANKL utilizando técnicas convencionales, tales como las descritas en la Patente US 4.411.993. DNA codificante de RANKL puede utilizarse también como inmunógeno, por ejemplo, como ha sido revisado por Pardoll y Beckerleg en Immunity 3: 165, 1995. Tales anticuerpos serán probablemente útiles en interferencia con la señalización de RANKL (anticuerpos antagonistas o bloqueantes), como componentes de ensayos de diagnóstico o de investigación para RANKL o actividad de RANKL, o en purificación de RANKL por afinidad.

Para inmunizar roedores, se emulsiona el inmunógeno RANKL en un adyuvante (tal como adyuvante de Freund completo o incompleto, alumbre, u otro adyuvante, tal como el adyuvante Ribi R700 (Ribi, Hamilton, MT), y se inyecta en cantidades comprendidas entre 10 Y 100 I-Ig subcutáneamente en un roedor seleccionado, por ejemplo, ratones BALB/c o ratas Lewis. Puede administrarse RNA intradérmicamente (Raz et al., Proc. Nat!. Acad. Sci. USA 91:9519,1994) o por vía intramuscular (Wang et al., Proc. Nat!. Acad. Sci. USA 90:4156,1993); se ha encontrado que la solución salina es un diluyente adecuado para antígenos basados en DNA. De 10 días a 3 semanas después, los ratones inmunizados se refuerzan con inmunógeno adicional y se refuerzan periódicamente después de ello de acuerdo con un protocolo de inmunización semanal, bisemanal o cada tercera semana.

Se toman periódicamente muestras de suero por hemorragia retro-orbital o escisión en el extremo de la cola para someter a test por el ensayo de transferencia de puntos (sándwich de anticuerpos), ELlSA (ensayo de inmunosorbente unido a enzima), inmunoprecipitación, u otros ensayos adecuados, con inclusión de análisis FACS. A continuación de la detección de un título de anticuerpos apropiado, los animales positivos reciben una inyección intravenosa de antígeno en solución salina. Tres a cuatro días después, se sacrifican los animales, se recogen los esplenocitos, y se fusionan a una línea de células de mieloma murina (v.g., NS1 o preferiblemente Ag 8.653 [ATCC CRL 1580]). Las líneas de células de hibridoma generadas por este procedimiento se extienden en placas de microtitulación múltiples en un medio selectivo (por ejemplo, uno que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina,

o HAT) para inhibir la proliferación de las células no fusionadas, híbridos mieloma-mieloma, e híbridos esplenocitoesplenocito.

Los clones de hibridoma así generados pueden cribarse por ELlSA respecto a reactividad con RANKL, por ejemplo, por adaptaciones de las técnicas descritas por Engvall et al., Immunochem. 8:871 (1971) y en la Patente US

4.703.004. Una técnica de cribado preferida es la técnica de captura de anticuerpos descrita por Beckmam et al., J. Immunol. 144:4212 (1990). Los clones positivos se inyectan luego en las cavidades peritoneales de roedores singénicos para producir ascitis que contiene concentraciones altas (> 1 mg/ml) de anticuerpo monoclonal antiRANK. El anticuerpo monoclonal resultante puede purificarse por precipitación con sulfato de amonio seguida por cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, puede utilizarse también cromatografía de afinidad basada en la fijación del anticuerpo a proteína A o proteína G, al igual que cromatografía de afinidad basada en la fijación a la proteína RANKL. Utilizando los métodos descritos en esta memoria para monitorizar la actividad de los mAbs, se aíslan anticuerpos tanto bloqueantes (es decir, anticuerpos que fijan RANKL e inhiben la fijación a RANK) como no bloqueantes (es decir, anticuerpos que fijan RANKL y no inhiben la fijación).

Ejemplo 11

Este ejemplo demuestra que la expresión de RANK puede estar regulada en sentido creciente. Se purificaron células T de sangre periférica humana por clasificación mediante citometría de flujo o por selección negativa utilizando cuentas recubiertas de anticuerpo, y se activaron con placas recubiertas con anti-CD3 (OKT3, Dako) o fitohemaglutinina en presencia o ausencia de diversas citoquinas, con inclusión de interleuquina-4 (IL-4), Factor ~ del Crecimiento Transformante (TGF-~) y otras citoquinas disponibles comercialmente (IL 1-a, IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-15, IFN-y, TNF-a). La expresión de RANK se evaluó por FACS en un experimento de evolución temporal desde el día 2 al día 8, utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón mAb144 (preparado como se describe en el Ejemplo 3), como se muestra en la tabla siguiente. Los resultados se expresan como '+' a '++++' haciendo referencia al aumento relativo en la intensidad de tinción con anti-RANK. Se realizaron también experimentos de doble marcación utilizando a la vez anticuerpos anti-RANK y anti-CD8 o anti-CD4.

Tabla 1: Regulación creciente de RANK por Citoquinas

Citoquina (concentración)

Resultados:

IL-4 (50 ng/ml) TGF-~ (5 ng/ml) IL-4 (50 ng/ml) + TGF-~ (5 ng/ml) IL 1-a (10ng/ml) IL-2 (20ng/ml) IL-3 (25ng/ml) IL-7 (20ng/ml) IL-8 (10ng/ml) IL-10 (50ng/ml) IL-12 (10ng/ml) IL-15 (10ng/ml) IFN-y (1 OOU/ml) TNF-a (1 Ong/ml)

+ + a ++ ++++ ----------

De las citoquinas ensayadas, IL-4 y TGF-~ aumentaban el nivel de expresión de RANK tanto en células CD8+ citotóxicas como en células CD4+ adyuvantes, desde el día 4 al día 8. La combinación de IL-4 y TGF-~ actuaba sinérgicamente para regular en sentido creciente la expresión de este receptor en las células T activadas. Esta combinación particular de citoquinas es secretada por las células T supresoras, y se cree que es importante en la generación de tolerancia (revisado en Mitchison y Sieper, Z. Rheumatol. 54: 141, 1995), implicando la interacción de RANK en la regulación de una respuesta inmunológica frente a la tolerancia o la inducción de una respuesta inmunológica activa.

Ejemplo 12

Este ejemplo ilustra la influencia de RANK.Fc y hRANKL en el crecimiento de las células T activadas. La adición de TGF~ a linfocitos T de sangre periférica humana activados con anti-CD3 induce parada de la proliferación y finalmente la muerte de la mayoría de los linfocitos dentro de los primeros pocos días de cultivo. Los autores de la invención ensayaron el efecto de las interacciones RANK:RANKL sobre las células T tratadas con TGF~ por adición de RANK.Fc o RANKL soluble humana a cultivos de células T.

Se cultivaron células T de sangre periférica humana (7x105 PBT) durante 6 días en placas de 24 pocillos recubiertas con anti-CD3 (OKT3, 5 I-lg/ml) y anti-Flag (M1, 5 I-lg/ml) en presencia de TGF~ (1 ng/ml) e IL-4 (10 ng/ml) con o sin hRANKL soluble recombinante marcada con FLAG (1 I-lg/ml) o RANK.Fc (10 I-lg/ml). La recuperación de células T viables se determinó por conteos triplicados con azul tripán.

La adición de RANK-Fc reducía significativamente el número de células T viables recuperadas al cabo de 6 días, mientras que RANKL aumentaba notablemente la recuperación de células T viables (Figura 1). Así pues, RANKL endógena o exógena aumenta el número de células T viables generadas en presencia de TGF~. TGF~, junto con IL4 ha sido implicado en la regulación de la respuesta inmunológica cuando es secretado por el subconjunto TH3/células reguladoras. Se cree que estas células T median la supresión circunstante de las células T efectoras. De acuerdo con ello, RANK y su ligando pueden actuar de una manera auto/paracrina para influir en la tolerancia a las células T. Además, se sabe que TGF~ juega un papel en la evasión del sistema inmunitario efectuada por ciertos organismos patógenos u oportunistas. Además de jugar un papel en el desarrollo de tolerancia, RANK puede jugar también un papel en la evasión del sistema inmunitario por los patógenos.

Ejemplo 13

Este ejemplo ilustra la influencia de la interacción de RANK en las células dendríticas (OC) CD1 a+. Se generaron células dendríticas (OC) funcionalmente maduras in vitro a partir de progenitores de médula ósea (BM) DC34+. De modo resumido, células BM humanas procedentes de individuos voluntarios sanos normales se fraccionaron por densidad utilizando medio Ficoll y se aislaron por inmunoafinidad células DC34+ utilizando una columna matriz antiCD34 (Ceprate, CeIlPro). Las células BM CD34+ se cultivaron luego en GM-CSF humano (20 ng/ml), IL-4 humana (20 ng/ml), TNF-a humano (20 ng/ml), Flt3L humana derivada de CHO (FL; 100 ng/ml) en medio Super McCoy's suplementado con 10% de suero de ternero fetal en una incubadora totalmente humidificada a 37°C (5% de C02) durante 14 días. Se clasificaron luego OC CD1a+ y HLA-DR+ utilizando un equipo FACStar Plus™, y se utilizaron para la evaluación biológica de RANK.

En OC CD1a+ humanas derivadas de células de la médula ósea CD34+, únicamente un subconjunto (20-30%) de CD1 a+ OC expresaban RANK en la superficie celular como se evaluó por análisis cito métrico de flujo. Sin embargo, la adición de CD40L a los cultivos de OC dio como resultado la expresión de RANK en la superficie de la mayoría de OC CD1 a+. Se ha demostrado que CD40L activa OC por intensificación de la formación de aglomerados in vitro, inducción de cambios morfológicos en OC y regulación creciente de la expresión de HLA-DR, CD54, CD58, CD80 y CD86.

La adición de RANKL a los cultivos de OC aumentaba significativamente el grado de agregación de OC y la formación de aglomerados con respecto a los cultivos de control, análogamente a los efectos observados con CD40L (Figura 2). OC CD1 a+ humanas clasificadas se cultivaron en un cóctel de citoquinas (GM-CSF, IL-4, TNF-a y FL) (panel superior izquierdo), en cóctel más CD40L (1 I-lg/ml) (superior derecho), en cóctel más RANKL (1 I-lg/ml) (inferior izquierdo), o en cóctel más RANKL desactivada por calentamiento (LlH) (1 I-lg/ml) (inferior derecho) en placas de cultivo de 24 pocillos con fondo plano en 1 mi de medio de cultivo durante 48-72 horas y se fotografiaron luego utilizando un microscopio de inversión. Un aumento en la agregación de OC y la formación de aglomerados por encima de los cultivos de control no era evidente cuando se utilizó RANKL desactivada por calentamiento, lo que indicaba que este efecto era dependiente de la proteína biológicamente activa. Sin embargo, el análisis fenotípico inicial de la expresión de moléculas de adhesión indicaba que la aglomeración inducida por RANKL no se debía a niveles incrementados de CD2, CD11 a, CD54 o CD58.

La adición de RANKL a OC CD1 a+ aumentaba su capacidad ala-estimuladora en una reacción de linfocitos mixtos (MLR) al menos de 3 a 18 veces, comparable a OC cultivadas con CD40L (Figura 3). Se incubaron células T alogénicas (1 x 105) con números variables de OC irradiadas (2000 rad) cultivadas como se ha indicado arriba para la Figura 2 en cápsulas de cultivo de 96 pocillos con fondo redondo en 0,2 mi de medio de cultivo durante 4 días. Los cultivos se pulsaron con 0,5 mCi de [3H]-timidina durante 8 horas y las células se recogieron sobre hojas de fibra de vidrio para conteo en un contador ~ de fase gaseosa. Los conteos de ruido de fondo para las células T o OC cultivadas solas eran < 100 cpm. Los valores representan la media ± la desviación estándar (SO) de cultivos triplicados. RANKL desactivada por calentamiento no tenía efecto alguno. La actividad ala-estimuladora de OC no aumentaba tampoco cuando se utilizaron RANKL y CD40L en combinación, debido posiblemente a que la capacidad funcional de OC había alcanzado un nivel máximo con cualquiera de las citoquinas sola. Ni RANKL Y CD40L mejoraban el crecimiento in vitro de OC a lo largo del periodo de cultivo de 3 días. Al contrario que CD40L, RANKL no aumentaba significativamente los niveles de expresión de HLA-DR ni la expresión de CD80 o CD86.

RANKL puede aumentar la formación de aglomerados de OC y la capacidad funcional sin modular moléculas conocidas implicadas en la adhesión celular (CD18, CD54), presentación de antígeno (HLA-DR) o coestimulación (CD86), todas las cuales están reguladas por señalización de CD40/CD40L. La falta de un efecto sobre la expresión de estas moléculas sugiere que RANKL puede regular la función de OC por uno o más caminos alternativos distintos de CD40/CD40L. Dado que CD40L regula la expresión superficial de RANK en OC generadas in vitro, y que CD40L está regulado en sentido creciente en las células T activadas durante las interacciones celulares DC-T, RANK y su ligando pueden formar una parte importante de la cascada de activación que se induce durante la expansión de las células T mediada por OC. Adicionalmente, el cultivo de OC en RANKL da como resultado niveles reducidos de la expresión de CD1 b/c, y niveles incrementados de CD83. Estas dos moléculas están moduladas análogamente durante la maduración de OC por CD40L (Caux et al. J. Exp. Med. 180:1263; 1994), indicando que RANKL induce la maduración de OC.

Se hace referencia a las células dendríticas como células presentadoras de antígeno "profesionales", y tienen una alta capacidad para sensibilizar las células T restringidas por el MHC. Existe un interés creciente en la utilización de células dendríticas ex vivo como adyuvantes de vacunas para enfermedades tumorales o infecciosas (véase, por ejemplo, Romani, et al., J. Exp. Med., 180:83, 1994). Por consiguiente, un agente tal como RANKL que induce la maduración de OC e intensifica la capacidad de las células dendríticas para estimular una respuesta inmunológica será probablemente útil en inmunoterapia de diversas enfermedades.

Ejemplo 14

Este ejemplo describe el aislamiento del homólogo murino de RANK, al que se hace referencia como muRANK. Se aisló muRANK por una combinación de PCR de especies cruzadas e hibridación de colonias. La conservación de los residuos Cys en las pseudorrepeticiones ricas en Cys de los dominios extracelulares de las proteínas miembros de la superfamilia TNFR se aprovechó para diseñar iniciadores PCR basados en RANK humana a utilizar en cDNAs murinos de la primera cadena procedentes de diversas fuentes. Tanto el iniciador de sentido aguas arriba como el iniciador antisentido aguas abajo se diseñaron de modo que tuvieran sus extremos 3' terminados con residuos Cys.

El iniciador de sentido aguas arriba codificaba los nuecleótidos 272-295 de SEQ ID NO:5 (región codificante de los aminoácidos 79-86); el iniciador antisentido aguas abajo codificaba el complemento de los nucleótidos 409-427 (región codificante de los aminoácidos 124-130). Se establecieron reacciones PCR estándar y se ejecutaron utilizando estos iniciadores y cDNAs de la primera cadena procedentes de diversas líneas de células o fuentes de tejidos murinos. Se realizaron 30 ciclos de reacción de 94°C durante 30 segundos, 50°C durante 30 segundos, y 72°C durante 20 segundos. Los productos PCR se analizaron por electroforesis, y se observaron bandas específicas en varias muestras. La banda procedente de una muestra se purificó en gel y la secuenciación del DNA reveló que

la secuencia entre los iniciadores era idéntica aproximadamente en un 85% a la secuencia de nucleótidos de RANK humana correspondiente.

Una genoteca de cONA basada en plásmidos preparada a partir de la línea de epitelio hepático fetal murina FLE18 (una de las líneas de células identificada como positiva en el cribado por PCR) se cribó respecto a cONAs de RANK de longitud total utilizando sondas oligonucleotídicas específicas de RANK murina derivadas de la secuencia RANK murina determinada por secuenciación del producto PCR. Dos cONAs, uno de los cuales codificaba el extremo 5', en tanto que el otro codificaba el extremo 3' de RANK murina de longitud total (basado en la comparación de secuencias con el RANK humano de longitud total) se recombinaron para generar un cONA de RANK murina de longitud total. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de muRANK se muestran en SEQ ID NOs: 14 y 15.

El cONA codifica una proteína transmembranal predicha de Tipo 1 que tiene 625 residuos de aminoácidos, con una secuencia señal predicha de 30 aminoácidos, un dominio extracelular de 184 aminoácidos, un dominio extramembranal de 21 aminoácidos, y una cola citoplásmica de 390 aminoácidos. La región extracelular de muRANK exhibía homología significativa de aminoácidos (69,7% de identidad, 80,8% de semejanza) con huRANK. Las personas con experiencia en la técnica reconocerán que el sitio de escisión real puede ser diferente del predicho por ordenador; de acuerdo con ello, el terminal N de RANK puede estar comprendido entre el aminoácido 25 y el aminoácido 35.

Otros miembros de la superfamilia de receptores TNF tienen una región de aminoácidos entre el dominio transmembranal y el dominio de fijación de ligando al que se hace referencia como región 'espaciadora', que no es necesaria para la fijación de ligandos. En muRANK, se predice que los aminoácidos comprendidos entre 197 y 214 forman una región espaciadora de este tipo. De acuerdo con ello, se espera que una forma soluble de RANK que termina con un aminoácido en esta región retenga la aptitud para fijar un ligando de RANK de manera específica. Aminoácidos preferidos del terminal C para péptidos solubles RANK se seleccionan del grupo constituido por los aminoácidos 214 y 197 de SEQ ID NO:14, aunque pueden utilizarse como término C otros aminoácidos comprendidos en la región espaciadora.

Ejemplo 15

Este ejemplo ilustra la preparación de varias formas solubles diferentes de RANK y RANKL. Se utilizaron técnicas estándar de corte y ligación con enzimas de restricción, en combinación con aislamiento basado en PCR de fragmentos para los cuales no existían sitios de restricción convenientes. Cuando se utilizó PCR, los productos PCR se secuenciaron para comprobar si se había introducido cualquier mutación; no se encontró mutación alguna de este tipo.

Además de la huRANKlFc descrita en el Ejemplo 2, se preparó otra proteína de fusión RANKlFc por ligación de ONA que codificaba los aminoácidos 1-213 de SEQ ID NO:6, a ONA que codificaba los aminoácidos 3-232 de la muteína Fe descrita previamente (SEQ ID NO:8). Se preparó una construcción similar para RANK murina, ligando el ONA codificante de los aminoácidos 1-213 de RANK murina de longitud total (SEQ ID NO: 15) a ONA codificante de los aminoácidos 3-232 de la muteína Fe (SEQ ID NO:8).

Se preparó una versión poli-His soluble y marcada de huRANKL por ligación de ONA codificante del péptido conductor de la cadena kappa de inmunoglobulina (SEQ ID NO:16) a ONA codificante de una versión corta del marcador FLAGTM (SEQ ID NO:17), seguido por codones que codificaban Gly Ser, ya continuación un marcador poli-His (SEQ ID NO:18), seguido por codones que codificaban Gly Thr Ser, y ONA que codificaba los aminoácidos 138-317 de SEQ ID NO:13. Se preparó una versión soluble marcada poli-His de RANKL murina por ligación de ONA que codificaba el conductor CMV (SEQ ID NO:9) a codones que codificaban Arg Thr Ser, seguido por ONA que codificaba poli-His (SEQ ID NO: 18) seguido por ONA que codificaba los aminoácidos 119-294 de SEQ ID NO: 11.

Se preparó una forma oligómera soluble de huRANKL por ligación de ONA que codificaba el conductor CMV (SEQ ID NO:9) a un codón que codificaba Asp seguido por ONA que terminaba una cremallera de "Ieucina" formadora de trímero (SEQ ID NO:19), y luego por codones que codificaban Thr Arg Ser, seguido por los aminoácidos 138-317 de SEQ ID NO:13.

Estas y otras construcciones se preparan por experimentación rutinaria. Los diversos ONAs se insertan luego en un vector de expresión adecuado, y se expresan. Vectores de expresión particularmente preferidos son aquéllos que pueden utilizarse en células de mamífero. Por ejemplo, pOC409 y pOC304, descritos en esta memoria, son útiles para expresión transitoria. Para transfección estable, se prefiere La utilización de células CHO; varios vectores útiles se describen en el documento USSN 08/785.150, actualmente concedida, por ejemplo, uno de los vectores de expresión 2A5-3 derivados de 11 descritos en dicho documento.

Ejemplo 16

Este ejemplo demuestra que la expresión de RANKL puede regularse en sentido creciente en células T murinas. Se obtuvieron las células de ganglios linfáticos mesentéricos de ratones C57BL/6, y se activaron con placas recubiertas con anti-C03, Concanavalina A (ConA) o miristato-acetato de forbol en combinación con ionomicina (anti-C03: 500A2; Immunex Corporation, Seattle, WA; ConA, PMA, ionomicina, Sigma, St. Louis, MO) sustancialmente como

se describe en esta memoria, y se cultivaron durante aproximadamente 2 a 5 días. La expresión de RANKL se evaluó en un análisis tricolor por FACS, utilizando anticuerpos para los marcadores de las células T CD4, CD8 y CD45RB, y RANKlFc, preparados como se describe en esta memoria.

RANKL no se expresaba en las células T murinas no estimuladas. Las células T estimuladas con cualquiera de antiCD3, ConA, o PMAlionomicina, exhibían expresión diferencial de RANKL: las células CD4+/CD45RLo y CD4+ /CD45RBHi eran positivas para RANKL, pero las células CD8+ no lo eran. No se observaba RANKL en las células B, análogamente a los resultados observados con las células humanas.

Ejemplo 17

Este ejemplo ilustra los efectos de RANKL murina sobre la proliferación y activación celulares. Diversas células o líneas de células representativas de células que juegan un papel en una respuesta inmunológica (bazo, timo y ganglios linfáticos murinos) se evaluaron por cultivo de las mismas en condiciones que promovían su viabilidad, en presencia o ausencia de RANKL. RANK no estimulaba la proliferación de ninguna de las células ensayadas. Una sola línea de células, una línea de células de macrófagos a la que se hace referencia como RAW 264.7 (número de acceso a ATCC , TIB 71) exhibía algunos signos de activación.

Las células RAW producen constitutivamente pequeñas cantidades de TNF-a. La incubación con RANKL humana o murina aumentaba la producción de TNF-a por estas células de una manera dependiente de la dosis. Los resultados no se debían a contaminación de las preparaciones de RANKL con endotoxina, dado que la ebullición de RANKL durante 10 minutos anulaba la producción de TNF-a, mientras que un tratamiento similar de la endotoxina purificada (LPS) no afectaba a la aptitud de la LPS para estimular la producción de TNF-a. A pesar del hecho de que RANKL activaba la línea de células de macrófagos RAW T64.7 para la producción de TNF-a, ni RANKL humana ni RANKL murina estimulaban la producción de óxido nítrico por estas células

Ejemplo 18

Este ejemplo ilustra los efectos de RANKL murina sobre el crecimiento y desarrollo del timo en ratones fetales. Se inyectaron ratones hembra preñadas con 1 mg de RANK/Fc o proteína de control de vehículo (seroalbúmina murina; MSA) los días 13, 16 Y 19 de gestación. Después del nacimiento, los neonatos continuaron siendo inyectados con RANKlFc por vía intraperitoneal (IP) sobre una base diaria, comenzando a una dosis de 1 I-Ig, Y duplicando la dosis aproximadamente cada 4 días, para una dosis final de 4 I-Ig. Los neonatos se recuperaron los días 1, 8 Y 15 después del nacimiento, se extirparon sus timos y sus bazos, y se examinaron respecto a tamaño, celularidad y composición fenotípica.

Se observó una ligera reducción en el tamaño del timo el día 1 en los neonatos nacidos de la hembra inyectada con RANKlFc; no se observó una disminución similar en tamaño en los neonatos de control. El día 8, se redujeron el tamaño del timo y la celularidad aproximadamente un 50% en los animales tratados con RANKlFc en comparación con los ratones tratados con MSA. El análisis fenotípico demostró que las proporciones relativas de poblaciones diferentes de células T en el timo eran las mismas en los ratones RANKlFc que en el grupo de control, lo que indicaba que la celularidad disminuida era debida a una depresión global en el número de células T tímicas, lo que se oponía a una disminución en una o más poblaciones específicas. Los neonatos tratados con RANKlFc no eran significativamente diferentes de los neonatos de control el día 15 con respecto a tamaño, celularidad o fenotipo de las células tímicas. No se observó diferencia significativa alguna en el tamaño del bazo, la celularidad o la composición en ninguno de los momentos evaluados. La diferencia en celularidad el día 8 y no el día 15, puede sugerir que RANKlFc pueda hacer valer su efecto al principio del desarrollo del timo.

Ejemplo 19

Este ejemplo demuestra que la región C-terminal del dominio citoplásmico de RANK es importante para la fijación de varias proteínas TRAF diferentes. RANK contiene al menos dos motivos PXQX(X)T reconocibles que son probablemente sitios de acoplamiento de TRAF. Por esta razón, se evaluó la importancia de diversas regiones del dominio citoplásmico de RANK para fijación de TRAF. Se preparó una proteína de fusión RANKlGST sustancialmente como se describe en Smith y Johnson, Gene 67:31 (1988), y se utilizó en la preparación de diversas truncaciones como se describe a continuación.

La comparación de la secuencia de nucleótidos de RANK murina y humana indicó que existían varias regiones conservadas que podrían ser importantes para la fijación de TRAF. En consecuencia, se desarrolló una técnica basada en PCR para facilitar la preparación de diversas truncaciones C-terminales que podrían retener las regiones conservadas. Se diseñaron iniciadores PCR para introducir un codón de parada y un sitio de enzima de restricción en los puntos seleccionados, produciendo las truncaciones descritas a continuación en la Tabla 1. La secuenciación confirmó que no se había introducido mutación indeseable alguna en las construcciones.

Se prepararon proteínas TRAF radiomarcadas (35S-Met, Cys) por traducción in vitro utilizando un kit de lisado de reticulocitos disponible comercialmente, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega). Las proteínas de fusión GST truncadas se purificaron sustancialmente como se describe en Smith y Johnson (supra). Resumidamente, se transfectaron E. coli con un vector de expresión que codificaba una proteína de fusión, y se indujeron para expresar la proteína. Se lisaron las bacterias, se retiró el material insoluble, y la proteína de fusión se aisló por precipitación con cuentas recubiertas de glutatión (Sepharose 4B, Pharmacia, Uppsala, Suecia).

Se lavaron las cuentas y se incubaron con diversas proteínas TRAF radiomarcadas. Después de los pasos de incubación y lavado, los complejos proteína de fusiónlTRAF se separaron de las cuentas por ebullición en SOS al

5 0,1% + ~-mercaptoetanol, y se cargaron en geles de SOS al 12% (Novex). Los geles se sometieron a autorradiografía, y se registró la presencia o ausencia de material radiomarcado. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 2.

Tabla 2: Fijación de Diversas Proteínas TRAF al Dominio Citoplásmico de RANK

Truncaciones C-terminales

E206-S339 E206-Y421 E206-M476 E206-G544 Longitud total

TRAF1

- - - - ++

TRAF2

- - - - ++

TRAF3

- - - - ++

TRAF4

- - - - -

TRAF5

- - - - +

TRAF6

- + + + ++

Estos resultados indican que TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF5 Y TRAF6 se fijan a la porción más distal del dominio 10 citoplásmico de RANK (entre los aminoácidos G544 y A616). TRAF6 tiene también un sitio de fijación entre S339 e y 421. En este experimento, TRAF5 se fijaba también al dominio citoplásmico de RANK.

LISTADO DE SECUENCIAS

(1) INFORMACiÓN GENERAL:

(i) SOLICITANTE: Immunex Corporation

15 (ii) TíTULO DE LA INVENCiÓN: Ligando para el Activador del Receptor de NF-kappa B

(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 19

(iv) DIRECCiÓN DE CORRESPONDENCIA:

(A) DESTINATARIO: Immunex Corporation, Law Department

(B) CALLE: 51 University Street 20 (C) CIUDAD: Seattle

(O)

ESTADO: WA

(E)

PAís: EE.UU.

(F)

CÓDIGO POSTAL: 98101

(v) FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

25 (A) TIPO DE MEDIO: disco flexible

(B)

ORDENADOR: Apple Power Macintosh

(C)

SISTEMA OPERATIVO: Apple Operating System 7.5.5

(O)

SOFTWARE: Microsoft Word para Power Macintosh 6.0.1

(vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

30 (A) NÚMERO DE SOLICITUD:

(B)

FECHA DE PRESENTACiÓN: 22 de diciembre de 1997

(C)

CLASIFICACiÓN:

(vii) DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

(A) NÚMERO DE SOLICITUD: USSN 60/064.671 35 (B) FECHA DE PRESENTACiÓN: 14 de octubre de 1997

(C) CLASIFICACiÓN:

(vii) DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: USSN 08/813.509

(B)

FECHA DE PRESENTACiÓN: 7 de marzo de 1997

(C) CLASIFICACiÓN:

(vii) DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: USSN 08/772.330 (60/064.671)

(B)

FECHA DE PRESENTACiÓN: 23 de diciembre de 1996

(C)

CLASIFICACiÓN:

(viii) INFORMACiÓN DE PROCURADOR/AGENTE:

(A)

NOMBRE: Perkins, Patricia Anne

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 34.693

(C)

REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 2852-WO

(ix) INFORMACiÓN DE TELECOMUNICACIONES:

(A)

TELÉFONO: (206)587-0430

(B)

TELEFAX: (206)233-0644

(2) INFORMACiÓN PARA SEQ ID NO:1:

(i)

CARACTERíSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 3115 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CLASE DE CADENA: simple

(O)

TOPOLOGíA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cONA

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(A)

GENOTECA: CÉLULAS DENDRíTICAS DERIVADAS DE MÉDULA ÓSEA

(B)

CLON: 9D-8A

(ix)

CARACTERíSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACiÓN: 93.. 1868

(xi)

DESCRIPCiÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

GCTGCTGCTG

CTCTGCGCGC TGCTCGCCCG GCTGCAGTTT TATCCAGAAA GAGCTGTGTG 6C

GACTCTCTGC

CTGACCTCAG TGTTCTTTTC AG GTG GCT TTG CAG ATC GCT Val Ala Leu Gln Ile Ala 1 5 CCT Pro 113

CCA TGT Pro Cys

ACC AGT GAG AAG CAT Thr Ser Glu Lys Bis 10 TAT GAG CAT CTG GGA CGG TGC TGT AAC Tyr Glu Bis Leu Gly Arg Cys Cys Asn 15 20 161

AAA TGT Lys Cys 25

GAA CCA GGA AAG TAC ATG Glu Pro Gly Lys Tyr Met 30 TCT TCT AAA TGC Ser Ser Lys Cys 35 ACT ACT ACC Thr Thr Thr TCT Ser 209

GAC AGT GTA TGT Asp Ser Val Cys 40

CTG CCC TGT GGC CCG GAT GAA TAC Leu Pro Cys Gly Pro Asp Glu Tyr 45 50 TTG GAT AGC TGG Leu Asp Ser Trp 55 257

AAT Asn

GAA GAA GAT AAA TGC Glu Glu Asp Lys Cys 60 TTG CTG CAT AAA GTT Leu Leu His Lys Val 65 TGT GAT ACA GGC AAG Cys Asp Thr Gly Lys 70 305

GCC Ala

CTC CTC CCC GTG GTC Leu Val Ala Val Val 75 GCC GGC AAC AGC ACG ACC CCC CGG CGC TGC Ala Gly Asn Ser Thr Thr Pro Arg Arg Cys 80 85 353

GCG TGC Ala Cys

ACC GCT GGG TAC Thr Ala Gly Tyr 90 CAC Bis TGG AGC CAG GAC TGC Trp Ser G1n ASp Cys 95 GAG TGe TGC CGC Glu Cys Cys Arg 100 401

CGC AAC ACC GAG TGC GCG CCG GGC CTG GGC GCC CAG CAC CCG TTC CAG Arg Asn Thr Glu Cys Ala Pro Gly Leu Gly Ala Gln Bis Pro Leu Gln 105 110 115

449

eTC AAC AAG GAC ACA GTC TGC AAA CCT TOe CTT GCA GGC TAC Leu Asn Lys Asp Thr Val Cys Lys Pro Cys Leu Ala Gly Tyr 120 125 130

TTC Phe TCT Ser 135 497

GAT Asp

GCC Ala TTT Phe TCC Ser TCC ACG GAC AAA TGC AGA Ser Thr Asp Lys Cys Arg 140 145 CCC TGG ACC AAC Pro Trp Thr Asn TGT Cys 150 ACC Thr 545

TTC Phe

CTT Leu GGA AAG AGA GTA G1y Lys Arg Val 155 Gk~ CAT Glu His CAT Eis 160 GGG Gly ACA Thr GAG Glu AAA Lys 'ICC GAT Ser Asp 165 GCG Ala 593

GTT Val

TGC Cys AGT Ser 170 TCT TCT Ser Ser CTG ~eu CCA GCT Pro Ala 175 AGA AAA Arg Lys CCA Pro CCA Pro AAT Asn 180 GAA Glu cce Pro eA~ His 641

GTT Val

TAC Tyr 185 TTG Leu CCC GGT Pro Gly TTA ATA Le~ Ile 190 ATT Ile CTG Leu eTT Leu CTC TTC Le~ Phe 195 GeG Ala TeT GTG Ser Val GCC Ala 689

CTG GTG Le~ Val 200

GCT Ala GCC Ala ATC Ile A~C TTT GGe GTT Ile Phe Gly Val 205 TGe Cys TAT AGG Tyr Arg 210 AAA Lys AAA GGG AAA Lys Gly Lys 2~5 737

GCA Ala

CTC Leu ACA Thr GCT Ala AAT Asn 220 TTG Leu TGG Trp CAC His TGG Trp ATC AAT Ile Asn 225 GAG Glu GCT ':'GT GGC CGC Ala Cys G1y Arg 230 735

CTA Leu

AGT GGA GAT AAG Ser Gly Asp Lys 235 GAG TCC Gl~ Ser TCA GGT GAC Ser Gly Asp 240 AGT Ser 'TGT Cys GTC Val AGT Ser 245 AC.n. Thr CAC H~s 833

ACG Thr

GCA Ala AAC Asn 250 TTT Phe GGT CAG CAG GGA GCA Gly GIn Gln Gly Ala 255 TGT Cys GAA GGT Glu Gly GTC Val 260 TTA Leu CTG Leu CTG Leu 881

ACT Thr

CTG Leu 265 GAG GAG AAG Gl~ G1~ Lys ACA T~r TTT Phe 270 CCA GAA Pro Glu GAT Asp ATG Met 'IGC Cys 275 TAC Tyr CCA Pro GA':' Asp CAA Gln 929

GGT GGT GTC Gly Gly Val 280

TGT Cys CAG CGC ACG Gln Gly Thr 285 TGT Cys GTA Val CGA GGT GGT Gly Gly Gly 290 CCC Pro TAC Tyr GCA Ala CAA GIn 295 977

GGC GAA GAT Gly Glu ASp

GCC Ala AGG ATG Arg Met 300 CTC Leu TCA Ser TTG Leu GTC Val 305 AGC Ser AAG Lys ACC Thr GAG Glu ATA GAG IIe Glu 310 1025

GAA GAC Glu Asp

AGC Ser TTC Phe 315 AGA Arg CAG ATG Gln Met CCC Pro ACA Thr 320 GAA Glu GAT Asp GAA Glu TAC Tyr ATG Mee 325 GAC AGG Asp Arg ~073

cec Pro

TCC CAG Ser Gln 330 cee Pro ACA Thr GAC Asp CAG Gln TTA Leu 335 CTG Leu TTC Phe CTC Leu .l>..CT Thr GAG Glu 340 eCT GGA Pro G1y AGC Ser 1121

AAA Lys

TCC ACA Ser Thr 345 CCT CCT Pro Pro TTC Phe TCT GAA Ser Glu 350 CCC Pro CTG Leu GAG Glu GTG Val 355 GGG GAG Gly G:u AAT Asn GAC Asp 1169

AGT Ser 3 6 O

TTA Leu AGC Ser CAG TGC Gln Cys 'eTC Phe 3 6 5 ACG GGG ACA Thr Gly Thr CAG Gln AGC Ser 37 O ACA Thr GTG Val GGT TCA GA:, Gly Ser Glu 37 :> 1217

AGC Ser

TGC Cys AAC Asn TGC Cys ACT Thr 380 GAG Glu CCC Pro CTG Leu TGC AGG Cys Arg 385 ACT Thr GAT TGG Asp Trp ACT Thr CCC Pro 390 ATG Met 1265

TCC Ser

TCT Ser GAA Glu AAC Asn 395 TAC Tyr TTG Leu CAA Gln AAA Lys GAG Glu 400 GTG Val GAC Asp AGT Ser GGC Gly CAT His 405 TGC Cys CCG Pro 1313

CAC His

TGG GCA Trp Ala 410 GCC Ala AGC Ser CCC Pro AGC Ser CCC Pro 415 AAC Asn TGG Trp GCA GAT Ala Asp G~C TGC Val Cys 420 ACA Thr GGC Gly 1361

TGC CGG Cys Arg 425

AAC Asn CCT Pro CCT Pro GGG GAG GAC TGT Gly Glu Asp Cys 430 GAA Glu CCC Pro CTC Leu 435 GTG Val GGT TCC Gly Ser CCA Pro 1409

AAA Lys 440

CGT GGA Arg Gly CCC Pro TTG Leu CCC Pro 445 CAG Gln TGC Cys GCC Ala TAT GGC ATG Tyr Gly Met 450 GGC Gly CTT Leu CCC Pro CCT Pro 455 1457

GAA Glu

GAA GAA G1u GIu GCC Ala AGC Ser 460 AGG Arg ACG Thr GAG Glu GCe Ala AGA GAC Arg Asp 465 CAG GIn cec Pro GAG GAT GGG Glu Asp Gly 470 1505

GCT Ala

GAT GGG AGG Asp Gly Arg 475 eTC Leu CCA Pro AGC Ser TeA Ser GCG Ala 480 AGG Arg GeA Ala GGT Gly Gce Ala GGG Gly 485 TCT Ser GGA Gly 1553

AGC Ser

TCC Ser CCT Pro 490 GGT Gly GGC CAG G~y Gln TCC Ser CCT Pro 495 GCA Ala TCT Ser GGA A~T GTG Gly Asn Val 500 AC~ GGA AAC Thr G1y Asn 1601

AGT Ser

AAC Asn 505 TCC Ser ACG Thr TTC Phe ATC TCC 11e Ser 510 AGC GGG Ser Gly CAG GTG Gln Val ATG Met 515 AAC Asn TTC Phe AAG GGC Lys Gly 1649

GAC Asp 520

ATC ATC GTG 11e Ile Val GTC Val TAC Tyr 525 GTC Val AGC Ser CAG Gln ACC Thr TCG CAG Ser Gln 530 GAG Glu GGC GCG Gly Ala GCG Ala 535 1697

GCG Ala

GCT Ala GCG Ala GAG Glu CCC Pro 540 A~G GGC CGC Met Gly Arg CCG GTG Pro Val 545 CAG Gln GAG Glu GAG Glu ACC Thr CTG Leu 550 GCG Ala 1745

CGC CGA GAC Arg Arg Asp

TCC Ser 555 TTC Phe GCG Ala GGG AAC Gly Asn GGC Gly 560 CCG Pro CGC Arg TTC Phe CCG Pro GAC Asp 565 CCG Pro TGC Cys 1793

GGC GGC Gly Gly

CCC Pro 570 GAG Glu GGG Gly CTG Leu CGG Arg GAG Glu 575 CCG Pro GAG Glu AAG Lys GCC Ala TCG Ser 580 AGG Arg ceG GTG Pro Val 1841

CAG Gln

GAG Glu 585 CAA Gln GGC GGG Gly Gly GCC Ala AAG Lys 590 GCT Ala TGA GCGCCCCCCA TGGCTGGGAG 1888

CCCGAAGCTC

GGAGCCAGGG CTCGCGAGGG CAGCACCGCA GCCTCTGCCC CAGCCCCGGC 1948

CACCCAGGGA

TCGATCGGTA CAGTCGAGGA AGACCACCCG GCATTCTCTG CCCACTTTGC 2008

CTTCCAGGAA

ATGGGCTTTT CAGGAAGTGA ATTGATGAGG ACTGTCCCCA TGCCCACGGA 2068

TGCTCAGCAG CCCGCCGCAC TGGGGCAGAT GTCTCCCCTG CCACTCCTCA AACTCGCAGC 2128 AGTAATTTGT GGCACTATGA CAGCTATTTT TATGACTATC CTGTTCTGTG GGGGGGGGG'r 2188 CTATGTTTTC CCCCCATATT TGTATTCCTT TTCATAACTT TTCTTGATAT CTTTCCTCCC 2248 TCTTTTTTAA TGTAAAGGTT TTCTCAAAAA TTCTCCTAAA GGTGAGGGTC TCTTTCTTT'r 2308 CTCTTTTCCT TTTTTTTTTC TTTTTTTGGC AACCTGGCTC TGGCCCAGGC TAGAGTGCAG 2368 TGGTGCGATT ATAGCCCGGT GCAGCCTCTA ACTCCTGGGC TCAAGCAATC CAAGTGATCC 2428 TCCCACCTCA ACCTTCGGAG TAGCTGGGAT CACAGCTGCA GGCCACGCCC AGCTTCCTCC 2488 CCCCGACTCC CCCCCCCCAG AGACACGGTC CCACCATGTT ACCCAGCCTG GTCTCAAACT 2548 CCCCAGCTAA AGCAGTCCTC CAGCCTCGGC CTCCCAAAGT ACTGGGATTA CAGGCGTGAG 2608 CCCCCACGCT GGCCTGCTTT ACGTATTTTC TTTTGTGCCC CTGCTCACAG TGTTTTAGAG 2668 ATGGCTTTCC CAGTGTGTGT TCATTGTAAA CACTTTTGGG AAAGGGCTAA ACATGTGAGG 2728 CCTGGAGl'.TA GTTGCTAAGT TGCTAGGAAC ATGTGGTGGG 1'.CTTTCATAT TCTGAAAAA'r 2788 GTTCTATATT CTCATTTTTC TAAAAGAAAG AAAAAAGGAA ACCCGATTTA TTTCTCCTGi'c 2848 ATCTTTTTAA GTTTGTGTCG TTCCTTAAGC AGAACTAAGC TCAGTATGTG ACCTTACCCG 2908 CTAGGTGGTT AATTTATCCA TGCTGGCAGA GGCACTCAGG TACTTGGTAA GCAAATTTCT 2968 AAAACTCCAA GTTGCTGCAG CTTGGCATTC TTCTTATTCT AGAGGTCTC'I CTGGAAAAGi'c 3028 TGGAGAAAAT GAACAGGACA TGGGGCTCCT GGAAAGAAAG GGCCCGGGAA GTTCAAGGAA 3088 G&~TAAAGTT GAAATTTTAA AAAAAAA 3115

(2) INFORMACiÓN PARA SEQ ID NO:2:

(i) CARACTERíSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 591 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(O) TOPOLOGíA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCiÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

Val Ala Leu G1n 11e Ala Pro Pro Cys Thr Ser Glu Lys His Tyr Glu 1 5 10 15

His Leu Gly Arg Cys Cys Asn Lys Cys Glu Pro Gly Lys Tyr Met Ser 20 25 30

Ser Lys Cys Thr Thr Thr Ser Asp Ser Val Cys Leu Pro Cys Gly Pro 35 40 45

Asp Glu Tyr Leu Asp Ser Trp Asn Glu Glu Asp Lys Cys Leu Leu His 50 55 60

Lys Val Cys Asp Thr Gly Lys Ala Leu Val Ala Val Val Ala Gly Asn 65 70 75 80

Ser Thr Thr Pro Arg Arg Cys Ala Cys Thr Ala Gly Tyr His Trp Ser 85 90 95

Gln Asp Cys Glu Cys Cys Arg Arg Asn T~r Glu Cys Ala Pro Gly Leu 100 105 110

Gly Ala Gln His Pro Leu Gln Leu Asn Lys Asp 'I'hr 'Val Cys Lys Pro 115 120 125

Cys Leu Ala Gly Tyr Phe Ser Asp Ala Phe Ser Ser Thr Asp Lys Cys 130 135 ::AO

Arg Pro Trp Thr Asn Cys Thr Phe Leu Gly Lys Arg Val Glu His His 145 150 155 160

Gly 'I'hr Glu Lys Ser Asp Ala Val Cys Ser Ser Ser Leu Pro Ala Arg 165 170 175

Lys Pro Pro Asn Glu Pro His Val Tyr Leu Pro Gly Leu Ile Ile Leu 180 185 190

Leu Leu Phe Ala Ser Val Ala Leu Val Ala Ala Ile Ile Phe Gly Val 195 200 205

Cys Tyr Arg Lys Lys Gly ~ys Ala Leu Thr Ala Asn Leu Trp His Trp 210 215 220

Ile Asn Glu Ala Cys Gly Arg Leu Ser Gly Asp Lys Glu Ser Ser Gly 225 230 235 240

Asp Ser Cys Val Ser Thr His Thr Ala Asn Phe Gly Gln Gln Gly Ala 245 250 255

Cys Glu Gly Val Leu Leu Leu Thr Leu Glu Glu Lys Thr Phe Pro Glu 260 265 270

Asp Met Cys Tyr Pro Asp Gln Gly Gly Val Cys Gln Gly Thr Cys val 275 280 285

Gly Gly Gly Pro Tyr Ala Gln Gly Glu Asp Ala Arg Met Leu Ser Leu 290 295 300

Val Ser Lys Thr Glu Ile Glu Glu Asp Ser phe Arg Gln Net Pro ':'hr 305 310 315 320

Glu Asp Glu Tyr Met Asp Arg Pro Ser Gln Pro Thr Asp Gln Leu Leu 325 330 335

Phe Leu Thr Glu Pro Gly Ser Lys Ser Thr Pro Pro Phe Ser Glu Pro 340 345 350

Leu Glu Val Gly Glu Asn Asp Ser Leu Ser Gln Cys Phe Thr Gly Thr 355 360 365

Gln Ser Thr Val Gly Ser Glu Ser Cys Asn Cys Thr Glu Pro Leu Cys 370 375 380

Arg Thr Asp Trp Thr Pro Met Ser Ser GIu Asn Tyr Leu GIn Lys Glu 385 390 395 400

Val Asp Ser GIy His Cys Pro His Trp Ala Ala Ser Pro Ser Pro Asn 405 410 415

Trp A:'a Asp Val Cys Thr Gly Cys Arg Asn Pro Pro Gly Glu Asp Cys 420 425 430

Glu Pro Leu Val Gly Ser Pro Lys Arg Gly Pro Leu Pro Gln Cys Ala 435 440 445

Tyr Gly Met Gly Leu Pro Pro Glu Glu Glu Ala Ser Arg Thr Glu Ala 450 455 460

Arg Asp Gln Pro Glu Asp Gly Ala Asp Gly Arg Leu Pro Ser Ser Ala 465 470 475 480

Arg Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ser Ser Pro Gly Gly Gln Ser Pro Ala 485 490 495

Ser Gly Asn Val ~hr Gly Asn Ser Asn Ser Thr Phe 11e Ser Ser Gly 500 505 510

Gln Val Met Asn Phe Lys Gly Asp 11e 11e Val Val 'l'yr Val Ser Gln 515 520 525

Thr Ser Gln Glu Gly Ala Ala Ala Ala Ala Glu Pro Met Gly Arg Pro 530 535 540

Val GIn Glu Glu T~r Leu Ala Arg Arg Asp Ser Phe Ala Gly Asn Gly 545 550 555 560

Pro Arg Phe Pro Asp Pro Cys GIy Gly Pro Glu Gly Leu Arg Glu Pro 565 570 575

Glu Lys Ala Ser Arg Pro Val GIn Glu Gln Gly Gly Ala Lys Ala 580 585 590

(2) INFORMACiÓN: PARA SEQ ID NO:3:

(i) CARACTERíSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 1391 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico

(C)

CLASE DE CADENA: simple

(O)

TOPOLOGíA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cONA

(iii) HIPOTÉTICA: NO

10 (iv) ANTI-SENTIDO: NO

(vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(A) GENOTECA: CÉLULAS DENDRíTICAS DERIVADAS DE MÉDULA ÓSEA 15 (B) CLON: 9D-15C

(ix)

CARACTERíSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACiÓN: 39.. 1391

(xi)

DESCRIPCiÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

CCGCTGAGGC CGCGGCGCCC GCCAGCCTGT CCCGCGCC ATG GCC CCG CGC GCC 53 Met Ala Pro Arg Ala 1 5

CGG CGG CGC CGC CCG CTG TTC GCG CTG CTG CTG CTC TGC GCG CTG CTC 10: Arg Arg Arg Arg Pro Leu Phe Ala Leu Leu Leu Leu Cys Ala Leu Leu 10 15 20

GCC CGG CTG CAG GTG GCT TTG CAG ATC GCT CC1' CCA TG1' ACC AGT GAG 149 Ala Arg Leu G:~ Val Ala Leu Gln I1e Ala Pro Pro Cys 1'hr Ser Glu 25 30 35

AAG CA1' TAT GAG CAT CTG GGA CGG TGC TGT AAC AAA TG1' GAA CCA GGA 197 Lys His Tyr Glu His Leu Gly Arg Cys Cys Asn Lys Cys Glu Pro Gly 40 45 50

AAG 1'AC ATG TCT TC1' Ak~ 1'GC AC1' AC1' ACC TC1' GAC AGT G1'A TGT CTG 245 Lys 'I'yr Het Ser Ser Lys Cys Thr Thr 1'hr Ser Asp Ser Val Cys Leu 55 60 65

CCC TG1' GGC CCG GAT GAA 1'AC TTG GAT AGC TGG AAT GAA GAA GAT AAA 293 Pro Cys Gly Pro Asp Glu Tyr Lec: Asp Ser Trp Asn Glu Glu Asp Lys 70 75 80 85

TGC T'TG CTG CAT AAA GTT TGT GAT ACA GGC AAG GCC CTG GTG GCC GTG 341 Cys Le'.l Leu His Lys Val Cys Asp Thr Gly Lys Ala Leu val Ala Val 90 95 100

GTC GCC GGC AAC AGC ACG ACC CCC CGG CGC TGC GCG TGC ACG GCT GGG 389 Val Ala Gly Asn Ser Thr Thr Pro Arg Arg Cys Ala Cys Thr Ala Gly 105 110 115

TAC CAC TGG AGC CAG GAC TGC GAG TGC TGC CGC CGC AAC ACC GAG TGC 437 Tyr His Trp Ser Gln Asp Cys Glu Cys Cys Arg Arg Asn Thr Glu Cys 120 125 130

GCG CCG GGC CTG GGC GCC CAG CAC CCG TTG CAG CTC AAC AAG GAC ACA 485 Ala Pro Gly Leu Gly Ala Gln His Pro Leu Gln Leu Asn Lys Asp Thr 135 140 145

GTG TGC AAA CCT TGC CTT GCA GGC TAC TTC TCT GAT GCC TTT TCC TCC 533 Val Cys Lys Pro Cys Leu Ala G1y 1'yr Phe Ser Asp Ala Phe Ser Ser 150 155 160 165

ACG GAC AAA TGC AGA CCC TGG ACC AAC TGT ACC TTC CTT GGA AAG AGA 581 Thr Asp Lys Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Thr Phe Leu Gly Lys Arg 170 175 180

GTA GAA CAT CAT GGG ACA GAG AAA TCC GAT GCG GTT TGC AGT TCT TCT 629 Val Glu His His Gly Thr G1u Lys Ser Asp Ala Val Cys Ser Ser Ser 185 190 195

CTG Leu

CCA GCT AGA AAA Pro Ala Arg Lys 200 CCA Pro CCA AAT Pro Asn 205 GAA Glu CCC Pro CAT GTT His Val TAC TTG Tyr Leu 210 CCC GGT Pro Gly 677

TTA Leu

ATA ATT CTG Ile Ile Leu 215 CTT Leu CTC Leu TTC Phe 220 GCG Ala TCT GTG Ser Val GCC Ala CTG GTG Leu Val 225 GCT GCC Ala Ala ATC Ile 725

ATC TTT GGC GTT Ile Phe Gly Val 230

TGC Cys TAT AGG AAA Tyr Arg Lys 235 AAA GGG AAA GCA Lys Gly Lys A:a 240 CTC Leu ACA GCT AAT Thr Ala Asn 245 773

TTG TGG CAC Leu Trp His

TGG Trp ATC AAT Ile Asn 250 GAG Glu GCT Ala TGT GGC CGC Cys Gly Arg 255 CTA Leu AGT GGA GAT AAG Ser Gly Asp Lys 260 821

GAG ':'CC Gl~ Ser

TCA GGT GAC Ser Gly Asp 265 AG'f Ser TGT Cys GTC Val AGT Ser 270 ACA Thr CAC gis ACG Thr GCA AAC Ala Asn 275 TTT GGT Phe Gly 869

CAG CAG GGA GCA Gln Gln GIy Ala 280

TGT Cys GAA GGT GTC GIu Gly Val 285 TTA Leu CTG Leu CTG ACT Leu Thr CTG GAG GAG AAG Leu Glu Glu Lys 290 917

ACA Thr

TTT CCA GAA GA'I ATG Phe Pro Glu Asp Met 295 'IGC TAC Cys Tyr 300 CCA GAT Pro Asp CAA GGT GGT GTC GIn Gly Gly Val 305 TGT Cys CAG Gln 965

GGC ACG G1y Thr 310

TGT Cys GTA GGA GGT GG'I CCC Val Gly G1y Gly Pro 315 TAC Tyr GCA Ala CAA GGC GAA GAT Gln Gly Glu Asp 320 GCC Ala AGG Arg 325 013

ATG Met

CTC Le·...! TCA Ser TTG GTC Leu Val 330 AGC AAG Ser Lys ACC Thr GAG Glu ATA GAG GAA Ile Glu Glu 335 GAC Asp AGC Ser TTC Phe 340 AGA Arg 061

CAG Gln

ATG Met CCC Pro ACA GAA GA'I Thr Glu Asp 345 GAA Glu TAC Tyr ATG Met 350 GAC AGG CCC TCC CAG Asp Arg Pro Ser GIn 355 CCC Pro ACA Thr 109

GAC Asp

CAG TTA Gln Leu 360 CTG TTC CTC ACT GAG Leu Phe Leu Thr Glu 365 CCT Pro GGA AGC AAA TCC ACA Gly Ser Lys Ser Thr 370 CCT Pro CCT Pro 157

TTC Phe

TCT GAA Ser Glu 375 CCC Pro CTG GAG GTG Leu Glu Val 380 GGG GAG AAT GAC Gly Glu Asn Asp AGT TTA Ser Leu 385 AGC CAG Ser Gln TGC Cys 205

TTC Phe 390

ACG GGG ACA CAG AGC ACA GTG GGT TCA Thr Gly Thr Gln Ser Thr Val Gly Ser 395 GAA Glu 400 AGC TGC Ser Cys &~C TGC Asn Cys ACT Thr 405 253

GAG CCC CTG TGC AGG ACT GAT TGG ACT Glu Pro Leu Cys Arg Thr Asp Trp Thr 410

CCC ATG Pro Met 415 TCC Ser TCT GAA AAC Ser Glu Asn 420 TAC Tyr 301

TTG Leu

CAA Gln AAA GAG Lys Glu 425 GTG Val GAC AGT GGC CAT Asp Ser Gly His 430 TGC Cys CCG CAC Pro His TGG GCA Trp Ala 435 GCC Ala AGC Ser 349

CCC Pro

AGC Ser CCC AAC TGG Pro Asn Trp 440 GCA GAT Ala Asp GTC Val 445 TGC Cys ACA GGC TGC CGG AAC Thr Gly Cys Arg Asn 450 391

(2) INFORMACiÓN PARA SEQ ID NO:4:

(i) CARACTERíSTICAS DE LA SECUENCIA:

5

(A) LONGITUD: 451 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido

(O) TOPOLOGíA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCiÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

Met Ala Pro Arg Ala Arg Arg Arg Arg Pro Leu Phe Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15

Leu Cys Ala Leu Leu Ala Arg Leu Gln Val Ala Leu Gln Ile Ala Pro 20 25 3 O

Pro Cys Thr Ser Glu Lys His Tyr Glu His Leu Gly Arg Cys Cys Asn 35 40 45

Lys Cys Glu Pro Gly Lys Tyr Met Ser Ser Lys Cys Thr Thr Thr Ser 50 55 60

Asp Ser Val Cys Leu Pro Cys Gly Pro Asp Glu Tyr Leu Asp Ser Trp 65 70 75 80

Asn Glu Glu Asp Lys Cys Leu Leu His Lys Val Cys Asp Thr Gly Lys 85 90 95

Ala Leu Val Ala Val Val Ala Gly Asn Ser Thr Thr Pro Arg Arg Cys 100 105 110

Ala Cys Thr Ala Gly Tyr His Trp Ser Gln Asp Cys Glu Cys Cys Arg 115 120 125

Arg Asn Thr Glu Cys Ala Pro Gly Leu Gly Ala Gln His Pro Leu Gln 130 135 140

Leu Asn Lys Asp Thr Val Cys Lys Pro Cys Leu Ala Gly Tyr Phe Ser 145 150 155 160

Asp Ala Phe Ser Ser Thr Asp Lys Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Thr 165 170 175

Phe Leu Gly Lys Arg Val Glu His His G1y Thr Glu Lys Ser Asp Ala 180 185 190

Val Cys Ser Ser Ser Leu Pro Ala Arg Lys Pro Pro Asn Glu Pro His 195 200 205

Val Tyr Leu Pro Gly Leu Ile Ile Leu Leu Leu Phe Ala Ser Val Ala 210 215 220

Leu Val Ala Ala Ile Ile Phe Gly Val Cys Tyr Arg Lys Lys Gly Lys 225 230 235 240

Ala Leu Thr Ala Asn Leu Trp His Trp Ile Asn Glu Ala Cys Gly Arg 245 250 255

Leu Ser Gly Asp Lys Glu Ser Ser Gly Asp Ser Cys Val Ser Thr His 260 265 270

Thr Ala Asn Phe Gly Gln Gln Gly Ala Cys Glu Gly Val Leu Leu Leu 275 280 285

Thr Leu Glu Glu Lys Thr Phe Pro Glu Asp Met Cys Tyr Pro Asp Gln 290 295 300

Gly Gly Val Cys Gln Gly Thr Cys Val Gly Gly Gly Pro Tyr Ala Gln 305 310 315 320

Gly Glu Asp Ala Arg Met Leu Ser Leu Val Ser Lys Thr Glu Ile Glu 325 330 335

GIu Asp Ser Phe Arg Gln Met Pro Thr Glu Asp Glu Tyr Met Asp Arg 340 345 350

Pro Ser Gln Pro Thr Asp Gln Leu Leu Phe Leu Thr Glu Pro Gly Ser 355 360 365

Lys Ser Thr Pro Pro Phe Ser Glu Pro Leu Glu Val G1y Glu Asn Asp 370 375 380

Ser Leu Ser GIn Cys Phe Thr Gly Thr Gln Ser Thr Val Gly Ser Glu 385 390 395 400

Ser Cys Asn Cys Thr Glu Pro Leu Cys Arg Thr Asp Trp Thr Pro Met 405 410 415

Ser Ser Glu Asn Tyr Leu Gln Lys GIu Val Asp Ser Gly His Cys Pro 420 425 430

His Trp Ala Ala Ser Pro Ser Pro Asn Trp Ala Asp Val Cys Thr Gly 435 440 445

Cys Arg Asn 450

(2) INFORMACiÓN PARA SEQ ID NO:5:

(i) CARACTERíSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 3136 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico

(C)

CLASE DE CADENA: simple

(O)

TOPOLOGíA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cONA

(iii) HIPOTÉTICA: NO 10 (iv) ANTI-SENTIDO: NO

(vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(A) GENOTECA: CÉLULAS DENDRíTICAS DERIVADAS DE MÉDULA ÓSEA 15 (B) CLON: RANGO DE LONGITUD TOTAL

(ix)

CARACTERíSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACiÓN: 39 .. 1886

(xi)

DESCRIPCiÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

CCGCTGAGGC CGCGGCGCCC GCCAGCCTGT CceGCGce ATG Gec CCG CGC GCC 53 Met Ala Pro Arg Ala 1 5

CGG CGG CGC CGC CCG CTG TTC GCG CTG CTG CTG CTC TGC GCG CTG CTC 101 Arg Arg Arg Arg Pro Leu Phe Ala Leu Leu Leu Leu Cys Ala Leu Leu 10 15 20

GCC CGG CTG CAG GTG GCT TTG CAG ATC GCT CCT CCA TGT ACC AGT GAG 149 Ala Arg Leu Gln Val Ala Leu Gln Ile Ala Pro Pro Cys Thr Ser Glu 25 30 35

AAG CAT TAT GAG CAT CTG GGA CGG TGC TGT AAC AAA TGT GAA CCA GGA 197 Lys His Tyr Glu His Leu Gly Arg Cys Cys Asn Lys Cys Glu Pro Gly 40 45 50

AAG TAC ATG TCT TCT AAA TGC ACT ACT ACC TCT GAC AGT GTA TGT CTG 245 Lys Tyr Met Ser Ser Lys Cys ~hr Thr Thr Ser Asp Ser Val Cys Leu 55 60 65

cce TGT GGC CCG GAT GAA TAC TTG GAT AGC TGG AAT GAA GAA GAT AAA 293 Pro Cys Gly Pro Asp Glu ~yr Leu Asp Ser ~rp Asn Glu Glu Asp Lys 70 75 80 85

TGC TTG CTG CAT AAA GTT TGT GAT ACA GGC AAG GCC CTG GTG GCC GTG 341 Cys Leu Leu Bis Lys Val Cys Asp Thr Gly Lys Ala Leu Val A:a Val 90 95 100

GTC GCC GGC AAC AGC ACG ACC CCC CGG CGC TGC GCG TGC ACG GCT GGG 389 Val Ala G1y Asn Ser Thr Thr Pro Arg Arg Cys Ala Cys Thr A:a Gly 105 110 115

TAC CAC TGG AGC CAG GAC TGC GAG TGC TGC CGC CGC AAC ACC GAG TGC 437 Tyr His Trp Ser Gln Asp Cys Glu Cys Cys Arg Arg Asn Thr Glu Cys 120 125 130

GCG CCG GGC CTG GGC GCC CAG CAC CCG TTG CAG CTC AAC AAG GAC ACA 485 Ala Pro Gly Leu Gly Ala Gln His Pro Leu Gln Leu Asn Lys Asp Thr 135 140 145

GTG TGC AAA CCT TGC CTT GCA GGC TAC TTC TCT GAT GCC TTT TCC TCC 533 Val Cys Lys Pro Cys Leu Ala Gly Tyr Phe Ser Asp Ala Phe Ser Ser 150 155 160 165

ACG GAC AAA TGC AGA CCC TGG ACC AAC TGT ACC TTC CTT GGA AAG AGA 581 Thr Asp Lys Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Thr Phe Leu Gly Lys Arg 170 175 180

GTA GAA CAT CAT GGG ACA GAG AAA TCC GAT GCG GTT TGC AGT TCT TCT 629 Val Glu His Bis Gly Thr Glu Lys Ser Asp Ala Val Cys Ser Ser Ser 185 190 195

CTG Leu

CCA GCT Pro Ala 200 AGA AAA Arg Lys CCA Pro CCA AAT Pro Asn 205 GAA Glu CCC Pro CAT GTT His Val TAC Tyr 210 TTG Leu CCC GGT Pro Gly 677

TTA ATA ATT CTG Leu Ile Ile Leu 215

CTT CTC Leu Leu TTC Phe 220 GCG Ala TCT GTG Ser Val GCC Ala CTG GTG Leu Val 225 GCT GCC Ala Ala ATC Ile 725

ATC TTT GGC GTT Ile Phe Gly Val 230

TGC TAT AGG AAA Cys Tyr Arg Lys 235 AAA GGG AAA Lys Gly Lys 240 GCA Ala CTC Leu ACA Thr GCT Ala AAT Asn 245 773

TTG Leu

TGG CAC Trp His TGG Trp ATC AAT GAG GCT Ile Asn Glu Ala 250 TGT GGC CGC Cys Gly Arg 255 CTA Leu AGT GGA GAT Ser Gly Asp 260 AAG Lys 821

GAG Glu

TCC Ser TCA GGT GAC Ser Gly Asp 265 AGT Ser TGT Cys GTC Val AGT ACA Ser Thr 270 CAC His ACG Thr GCA AAC Ala Asn 275 TTT Phe GGT Gly 869

CAG CAG GGA GCA TGT Gln Gln Gly Ala Cys 280

GAA GGT GTC Glu Gly Val 285 TTA Leu CTG Leu CTG ACT Leu Thr CTG GAG GAG Leu Glu Glu 290 AAG Lys 917

ACA Thr

TTT Phe 295 CCA Pro GAA Glu GAT Asp ATG Met TGC TAC Cys Tyr 300 CCA GAT Pro Asp CAA GGT GGT GTC Gln Gly Gly Val 305 TGT Cys CAG Gln 965

GGC Gly 310

ACG TGT Thr Cys GTA Val GGA GGT GGT Gly Gly G1y 315 CCC TAC GCA CAA GGC Pro Tyr Ala Gln Gly 320 GAA GAT GCC AGG Glu Asp Ala Arg 325 1013

ATG Met

CTC Leu TCA Ser TTG GTC Leu Val 330 AGC Ser AAG Lys ACC Thr GAG Glu ATA GAG GAA Ile Glu Glu 335 GAC Asp AGC Ser TTC Phe 340 AGA Arg 1061

CAG ATG Gln Met

CCC Pro ACA Thr 345 GAA GAT Glu Asp GAA Glu TAC Tyr ATG Met 350 GAC AGG Asp Arg CCC Pro TCC Ser CAG Gln 355 CCC ACA Pro Thr 1109

GAC Asp

CAG Gln TTA Leu 360 CTG Leu TTC Phe CTC Leu ACT Thr GAG Glu 365 CCT Pro GGA AGC Gly Ser AAA Lys TCC ACA Ser Thr 370 CCT Pro CCT Pro 1157

TTC Phe

TCT GAA Ser Glu 375 CCC Pro CTG GAG GTG Leu Glu Val 380 GGG GAG AAT GAC Gly Glu Asn Asp AGT Ser 385 TTA Leu AGC Ser CAG TGC Gln Cys 1205

TTC Phe 390

ACG Thr GGG ACA CAG AGC ACA GTG Gly Thr Gln Ser Thr Val 395 GGT TCA GAA Gly Ser Glu 400 AGC Ser TGC Cys AAC Asn TGC Cys ACT Th~ 405 1253

GAG Glu

CCC Pro CTG Leu TGC AGG Cys Arg 410 ACT GAT TGG ACT Thr Asp Trp Thr CCC Pro 415 ATG Met TCC Ser TCT GAA AAC Ser Glu Asn 420 TAC ~yr 1301

TTG CAA Leu Gln

AAA Lys GAG GTG Glu Val 425 GAC Asp AGT GGC CAT Ser Gly His 430 TGC Cys CCG CAC Pro His TGG GCA GCC Trp Ala Ala 435 AGC Ser 1349

CCC Pro

AGC Ser CCC AAC Pro Asn 440 TGG GCA GAT Trp Ala Asp GTC Val 445 TGC Cys ACA GGC TGC CGG AAC Thr Gly Cys Arg Asn 450 CCT CCT Pro Pro 1397

GGG GAG GAC TGT Gly Glu Asp Cys 455

GAA Glu CCC Pro CTC Leu 460 GTG Val GGT TCC Gly Ser CCA AAA CGT GGA CCC TTG Pro Lys Arg Gly Pro Leu 465 1445

CCC Pro 470

CAG TGC Gln Cys GCC TAT GGC ATG Ala Tyr Gly Met 475 GGC CTT Gly Leu CCC Pro CCT Pro 480 GAA GAA Glu Glu GAA Glu GCC AGC Ala Ser 485 1493

AGG ACG GAG GCC Arg Thr Glu Ala

AGA GAC Arg Asp 490 CAG Gln CCC GAG ?ro Glu GAT GGG GC? Asp Gly Ala 495 GAT GGG AGG CTC Asp Gly Arg Leu 500 1541

CCA AGC Pro Ser

TCA GCG Ser Ala 505 AGG Arg GCA Ala GGT Gly GCC Ala GGG TCT GGA AGC Gly Se~ Gly Ser 510 TCC Ser CCT GGT GGC Pro Gly Gly 515 1589

CAG Gln

TCC Ser CCT Pro 520 GCA Ala TCT Ser GGA Gly AAT GTG Asn Val 525 ACT Thr GGA AAC Gly Asn AGT Ser AAC TCC Asn Ser 530 ACG Thr TTC Phe 1637

ATC TCC Ile Ser 535

AGC Ser GGG CAG Gly Gln GTG Val ATG Met 540 AAC Asn TTC AAG GGC GAC Phe Lys Gly Asp 545 ATC ATC GTG 1le 1le Val GTC Val 1685

TAC Tyr 550

GTC Val AGC Ser CAG ACC Gl~ Thr TCG Ser 555 CAG GAG Gln Glu GGC GCG Gly Ala GCG GCG Ala Ala 560 GCT Ala GCG Ala GAG Glu CCC Pro 565 1733

ATG GGC CGC Met Gly Arg

CCG GTG Pro Val 570 CAG GAG Gln Glu GAG Glu ACC Thr CTG GCG Leu Ala 575 CGC CGA GAC Arg Arg Asp TCC Ser 580 TTC Phe 1781

GCG GGG AAC Ala Gly Asn

GGC CCG CGC Gly Pro Arg 585 TTC Phe CCG Pro GAC Asp 590 CCG Pro TGC GGC GGC CCC GAG GGG Cys Gly Gly P~o Glu Gly 595 1829

CTG Leu

CGG GAG CCG A~g Glu Pro 600 GAG Glu AAG Lys GCC Ala TCG Ser 605 AGG Arg CCG GTG Pro Val CAG Gln GAG Glu 610 CAA GGC GGG Gln Gly Gly 1877

GCC Ala

AAG Lys 615 GCT Ala TGAGCGCCCC CCATGGCTGG GAGCCCGAAG CTCGGAGCCA 1926

GGGCTCGCGA

GGGCAGCACC GCAGCCTCTG CCCCAGCCCC GGCCACCCAG GGATCGATCG 1986

GTACAGTCGA

GGAAGACCAC CCGGCATTCT CTGCCCACTT TGCCTTCCAG GAAATGGGCT 2046

TTTCAGGAAG

TGAATTGATG AGGACTGTCC CCATGCCCAC GGATGCTCAG CAGCCCGCCG 2106

CACTGGGGCA

GATGTCTCCC CTGCCACTCC TCAAACTCGC AGCAGTAATT TGTGGCACTA 2166

TGACAGCTAT

TTTTATGACT ATCCTGTTCT GTGGGGGGGG GGTCTATGTT TTCCCCCCAT 2226

ATTTGTATTC

CTTTTCATAA CTTTTCTTGA TATCTTTCCT CCCTCTTTTT TAATGTAAAG 228E

GTTTTCTCAA

AAATTCTCCT AAAGGTGAGG GTCTCTTTCT TTTCTCTTTT CCTTTTTTTT 234E

TTCTTTTTTT GGCAACCTGG CTCTGGCCCA GGCTAGAGTG CAGTGGTGCG ATTATAGCCC 2406

GG':'GCAGCCT CTAACTCCTG GGCTCAAGCA ATCCAAGTGA TCCTCCCACC TCAACCTTCG 2466 GAGTAGCTGG GATCACAGCT GCAGGCCACG CCCAGCTTCC TCCCCCCGAC TCCCCCCCCC 2526 CAGAGACACG GTCCCACCAT GTTACCCAGC CTGGTCTCAA ACTCCCCAGC TAAAGCAGTC 2586 CTCCAGCCTC GGCCTCCCAA AGTACTGGGA TTACAGGCGT GAGCCCCCAC GCTGGCCTGC 2646 TTTACGTATT TTCTT':'TGTG CCCCTGCTCA CAGTGTTTTA GAGATGGCTT TCCCAGTGTG 2706 TGTTCATTGT AAACACTTTT GGGAAAGGGC TAAACATGTG AGGCCTGGAG ATAGTTGCTA 2766 AGTTGCTAGG AACA':'GTGGT GGGACTTTCA TATTCTGAAA AATGTTCTAT ATTCTCAT'IT 2826 TTCTAP.AAGA AAGAAAAAAG GAAACCCGAT TTATTTCTCC TGAATCTTTT TAAGTTTG'IG 2886 TCGTTCCTTA AGCAGAACTA AGCTCAGTAT GTGACCTTAC CCGCTAGGTG GTTAATTTAT 2946 CCATGCTGGC AGAGGCACTC AGGTACTTGG TAAGCAAATT TCTAAAACTC CAAGTTGC'I'G 3006 CAGCTTGGCA TTCTTCTTAT TCTAGAGGTC TCTCTGGAAA AG.'A.TGGAGAA AATGAACACG 3066 ACATGGGGCT CCTGGAAAGA AAGGGCCCGG GAAGTTCAAG GAAGAATAAA GTTGA.'A.AT'I'T 3126 TAAAAAAAAA 3136

(2) INFORMACiÓN PARA SEQ ID NO:6:

(i)

CARACTERíSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 616 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(O)

TOPOLOGíA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCiÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

Met Ala Pro Arg Ala Arg Arg Arg Arg ?ro Leu Phe Ala Leu Leu Leu 1 S 10 15

Leu Cys Ala Leu Leu Ala Arg Leu Gln Val Ala Leu G1n 11e Ala Pro 20 25 30

Pro Cys Thr Ser Glu Lys His Tyr Glu His Leu Gly Arg Cys Cys Asr. 35 40 45

Lys Cys Glu Pro Gly Lys Tyr Met Ser Ser Lys Cys Thr Thr Thr Ser se 55 60

Asp Ser Val Cys Leu Pro Cys Gly Pro Asp Glu Tyr Leu Asp Ser Trp 65 70 75 80

Asn Glu Glu Asp Lys Cys Leu Leu His Lys Val Cys Asp Thr Gly Lys 85 90 95

Ala Leu Val Ala Val Val Ala Gly Asn Ser Thr Thr Pro Arg Arg Cys 100 105 110

Ala Cys Thr Ala Gly Tyr His Trp Ser Gln Asp Cys Glu Cys Cys Arg 115 120 125

Arg Asn Thr Glu Cys Ala Pro Gly Leu Gly Ala Gln His Pro Leu Gln 130 135 140

Leu Asn Lys Asp Thr Val Cys Lys Pro Cys Leu Ala Gly Tyr Phe Ser

145 :50 155 160

Asp JI.la Phe Ser Ser Thr Asp Lys Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Thr 165 170 175

Phe Leu Gly Lys Arg Val Glu Bis His Gly Thr Glu Lys Ser Asp Ala 180 185 190

Val Cys Ser Ser Ser Leu Pro Ala Arg Lys Pro Pro Asn Glu Pro His 195 200 205

Val Tyr Leu Pro Gly Leu Ile Ile Leu ::"eu Leu Phe Ala Ser Val Ala 210 215 220

l:..Jeu Val Ala Ala 11e Ile Phe Gly Val Cys Tyr Arg Lys Lys Gly Lys 225 230 235 240

Ala Leu Thr Ala Asn Leu Trp His Trp Ile Asn Glu Ala Cys Gly Arg 245 250 255

Leu Ser Gly Asp Lys Glu Ser Ser Gly Asp Ser Cys Val Ser Thr His 260 265 270

Thr Ala Asn Phe Gly Gln Gln Gly Ala Cys Glu Gly Val Leu Leu Leu 275 280 285

Thr Leu Glu Glu Lys Thr Phe Pro Glu Asp Met Cys Tyr Pro Asp Gln 290 295 300

Gly Gly Val Cys Gln Gly Thr Cys Val Gly Gly Gly Pro Tyr Ala Gln 305 310 315 320

Gly Glu Asp Ala Arg Met Leu Ser Leu Val Ser Lys Thr Glu Ile Glu 325 330 335

Glu Asp Ser Phe Arg Gln Met Pro Thr Glu Asp G::'u Tyr Met Asp Arg 340 345 350

Pro Ser Gln Pro Thr Asp Gln Leu Leu Phe Leu Thr Glu Pro Gly Ser 355 360 365

Lys Ser Thr Pro Pro Phe Ser Glu Pro Leu Glu Val Gly Glu Asn Asp 370 375 380

Ser Leu Ser Gln Cys Phe Thr Gly Thr Gln Ser Thr Val Gly Ser Glu 385 390 395 400

Ser Cys Asn Cys Thr Glu Pro Leu Cys Arg Thr Asp Trp TJ::r Pro Met 405 410 415

Ser Ser Glu Asn Tyr Leu Gln Lys Glu Val Asp Ser Gly His Cys Pro 420 425 430

Bis Trp Ala Ala Ser Pro Ser Pro Asn Trp Ala Asp Val Cys Thr Gly 435 440 445

Cys Arg Asn Pro Pro Gly Glu Asp Cys Glu Pro :L.eu Val Gly Ser Pro 450 455 460

Lys Arg Gly Pro Leu Pro Gln Cys Ala Tyr Gly Met Gly Leu Pro Pro 465 470 475 480

Glu Glu Gh: Ala Ser Arg Thr Glu Ala Arg Asp Gln Pro G:'u Asp Gly 485 490 495

Ala Asp Gly Arg Leu Pro Ser Ser Ala Arg Ala Gly Ala Gly Ser Gly 500 505 510

Ser Ser Pro Gly Gly Gln Ser P~o Ala Ser Gly Asn Val Thr Gly Asn

515

520 525

Ser Asn 530

Ser Thr Phe lle Ser 535 Ser Gly Gln Val Met 540 As~ Phe Lys Gly

Asp 545

lle lle Val Val Tyr 550 Val Ser Gln Thr Ser 555 Gln Glu Gly Ala Ala 560

Ala

Ala

Ala Glu Pro Met 565 Gly Arg Pro Val 570 Gln Glu Glu Thr Leu A:'a 575

Arg Arg Asp

Ser 58C Phe Ala Gly Asn Gly 585 Pro Arg Phe Pro Asp 590 Pro Cys

Gly Gly

Pro 595 Gl~ G:y Leu Arg Glu 600 Pro Glu Lys A:a Ser Arg 6CS Pro Val

Gln GIu GIn 610

Gly GIy Ala Lys 615 Ala

(2) INFORMACiÓN PARA SEQ ID NO:?:

(i) CARACTERíSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 8 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácido (C) CLASE DE CADENA: no relevante (O) TOPOLOGíA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B) CLON: Péptido FLAG®

(xi) DESCRIPCiÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:?:

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5

(2) INFORMACiÓN PARA SEQ ID NO:8:

(i)

CARACTERíSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 232 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(C)

CLASE DE CADENA: no relevante

(O)

TOPOLOGíA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Humano

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B) CLON: Muteína IgG1 Fc 5 (xi) DESCRIPCiÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

Glu Pro Arg Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15

Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met 11e Se~ Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Pne Asn Trp Tyr Val 50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80

Tyr Asn Ser Tnr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Asp Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110

Leu Pro Ala Pro Met Gln Lys Thr 11e Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Arg 145 150 155 160

His 11e Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175

Lys Tnr Thr Pro Pro Val Leu Asp Se~ Asp Gly Ser Phe Phe Leu 'Iyr 180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Tnr Gln Lys 210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

(2) INFORMACiÓN PARA SEQ ID NO:9:

(i) CARACTERíSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 31 aminoácidos 10 (B) TIPO: aminoácido

(C)

CLASE DE CADENA: no relevante

(O)

TOPOLOGíA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIOO: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: CMV (Conductor R2780)

(ix)

CARACTERíSTICA:

5 (O) OTRA INFORMACiÓN: Metl-Arg28 es el péptido conductor real; Arg29 refuerza el sitio de escisión de furina; los nucleótidos codificantes Thr30 y Ser31 añaden un sitio Spe1.

(xi) DESCRIPCiÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

Mee Ala Arg Arg Leu Trp 11e Leu Ser Le~ Leu Ala Val Thr LeG Thr 1 5 10 15

Val Ala Le~ Ala Ala Pro Ser Gln Lys Ser Lys Arg Arg Thr Ser 20 25 30

(2)

INFORMACiÓN PARA SEQ ID NO:10: 10 (i) CARACTERíSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1630 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CLASE DE CADENA: simple

(O)

TOPOLOGíA: lineal 15 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cONA

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTI-SENTIOO: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: Mus musculus 20 (vii) FUENTE INMEDIATA:

(A)

GENOTECA:

(B)

CLON: RANKL

(ix) CARACTERíSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: COS 25 (B) LOCALIZACiÓN: 3 .. 884

(xi) DESCRIPCiÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

CC

GGC GTC Gly Val 1 CCA CAC Pro His GAG GGT Glu G1y 5 CCG Pro CTG CAC Leu His CCC GCG Pro Ala 10 CCT Pro TCT GCA Ser Ala CCG Pro 15 47

GCT Ala

CCG GCG Pro Ala CCG Pro CCA Pro 20 CCC Pro GCC Gec Ala Ala TCC eGe Ser Arg 25 Tec Ser ATG Met TTC Phe CTG GCC Leu Ala 30 CTC Leu 95

CTG Leu

GGG Gly CTG Leu GGA Gly 35 CTG Leu GGC CAG GTG Gly Gln Val GTC Val 40 TGe Cys AGC Ser ATC GCT Ile Ala CTG Leu 45 TTC Phe CTG Leu 143

TAC Tyr

TTT Phe CGA Arg 50 GCG CAG Ala Gln ATG GAT Me~ ASp CCT AAC Pro Asn 55 AGA Arg ATA TCA GAA 11e Ser Glu 60 GAC Asp AGC ACT Ser Thr 191

CAe His

TGC Cys 65 TTT TAT AGA Phe Tyr Arg ATe CTG AGA Ile Leu Arg 70 CTC Leu CAT His GAA AAC Glu Asn 75 GCA Ala GAT Asp TTG Leu CAG Gl~ 239

GAC ASp 80

TCG ACT Ser Thr CTG Leu GAG Glu AGT GAA Ser Glu 85 GAC Asp ACA CTA Tnr Leu CCT GAC Pro Asp 90 TCC Ser TGC AGG AGG Cys Arg Arg 95 287

ATG Met

AAA Lys CAA Gce Gln Ala TTT Phe 100 CAG GGG GCC GTG Gln Gly Ala Val CAG Gln 105 AAG Lys GAA Glu CTG Leu CAA Gln CAC His 110 ATT 1le 335

GTG Val

GSG Gly CeA CAG CGC Pro Gln Arg 115 TTC Phe TCA GGA GCT Ser Gly Ala 120 CCA Pro GCT ATG Ala Met ATG Met GAA GGC Glu Gly 125 TCA Ser 383

TGG Trp

TTG GAT Leu Asp 130 GTG Val GCC CAG CGA GGC AAG Ala Gln Arg GIy Lys 135 CCT GAG GCC Pro Glu Ala CAG GIn 140 CCA Pro TTT GCA Pne Ala 431

CAC His

CTC Leu 145 ACC Thr ATe AAT GeT Gce AGC Ile Asn Ala Ala Ser 150 ATe CCA Ile Pro TCG GGT Ser Gly 155 TCC Ser CAT AAA H1S Lys GTe Val 479

ACT Thr 160

CTG Leu TCC Ser TCT TGG TAe Ser Trp Tyr 165 CAC GAT eGA GGC TGG Gec His Asp Arg Gly Trp Ala 170 AAG Lys ATC TCT AAC =le Ser Asn 175 527

ATG Met

ACG Thr TTA AGe Leu Ser AAC GGA AAA Asn Gly Lys 180 CTA AGG Leu Arg GTT Val 185 AAC CAA Asn GIn GAT GGC Asp Gly TTC Phe 190 TAT Tyr 575

TAC Tyr

CTG Leu TAC Tyr GCC Ala 195 AAC Asn ATT TGC Ile Cys TTT Phe CGG Arg 200 CAT His CAT His GAA ACA Glu Thr TCG GGA AGC Ser Gly Ser 205 623

GTA Val

CCT ACA GAC TAT Pro Thr Asp Tyr 210 CTT Leu CAG Gln eTG ATG Leu Met 215 GTG Val TAT GTC Tyr Val GTT Val 220 AAA Lys ACC Thr AGC Ser 671

ATC A&~ ATC CCA 11e Lys 1le Pro 225

AGT Ser TCT CAT Ser His 230 AAC Asn CTG ATG Leu Met AAA GGA GGG AGC ACG Lys Gly Gly Ser Thr 235 AAA Lys 719

AAC TGG TCG GGC AAT TCT GAA TTC CAC TTT TAT TCC ATA AAT GTT GGG 767 Asn Trp Ser G1y Asn Ser G1u Phe His Phe Tyr Ser I1e Asn Val Gly 240 245 250 255 GGA TTT TTC AAG CTC CGA GCT GGT GAA GAA A~T AGC ATT CAG GTG TCC 815 Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu I1e Ser Ile Gln Val Ser 260 265 270 AAC CCT TCC CTG CTG GAT CCG GAT CAA GAT GCG ACG TAC TTT GGG GCT 863 Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp Ala Thr Tyr Phe G1y Ala 275 280 285 TTC AAA GTT CAG GAC ATA GAC ~GAGACTCAT TTCGTGGAAC ATTAGCATGG 914 Phe Lys Val Gln Asp Ile Asp 290 ATGTCCTAGA ?G':'TTGGAAA CTTCTTAAAA AATGGATGAT GTCTATACAT GTGTAAGACT 974 ACTAAGAGAC ATGGCCCACG GTGTATGAAA CTCACAGCCC TCTCTCTTGA GCCTGTACAG 1034 GTTGTGTATA TGTAAAGTCC ATAGGTGATG TTAGATTCAT GGTGA'ITACA CAACGGTT~:T 1094 ACAATT':'TGT AATGATTTCC TAGAATTGAA CCAGATTGGG AGAGGTATTC CGATGCTTl\T 1154 GAAAAACTTA CACGTGAGCT ATGGAAGGGG GTCACAGTCT CTGGGTC~AA CCCCTGGACA 1214 TGTGCCACTG AGAACCTTGA AATTAAGAGG ATGCCATGTC ATTGCAAAGA AATGATAG"G 1274 TGAAGGGTTA AGTTCTTTTG AATTGTTACA TTGCGCTGGG ACCTGCAAAT AAGTTCTTé2T 1334 TTTCTAATGA GGAGAGAAAA ATATATGTAT TTTTATATAA TGTCTAAAGT TATATTTCj~G 1394 GTGTAATGTT TTCTGTGCAA AGTTTTGTAA ATTATATTTG TGCTATAGTA TTTGATTCi~ 1454 AATATTTAAA AATGTCTCAC TGTTGACATA TTTAATGTTT TAAATGTACA GATG'IATTTA 1514 ACTGGTGCAC TTTGTAATTC CCCTGAAGGT ACTCGTAGCT AAGGGGGCAG AATACTG1"rT' 1574 CTGGTGACCA CATGTAGTTT ATTTCTTTAT TCTT~TTAAC TTAATAGAGT CTTCAG 1630

(2) INFORMACiÓN PARA SEQ ID NO: 11:

(i) CARACTERíSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 294 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(O) TOPOLOGíA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCiÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

Gly Val Pro His GIu Gly Pro Leu His Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala 1 5 10 15

Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ala Ser Arg Ser Met Phe Leu Ala Leu Leu

20 25 30

Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys Ser Ile Ala Leu Phe Leu Tyr 35 40 45

Phe Arg Ala GIn Met Asp Pro Asn Arg Ile Ser Glu Asp Ser Thr His 50 55 60

Cys Phe Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His GIu Asn Ala Asp Leu Gln Asp 65 70 75 80

Ser Thr Leu GIu Ser GIu Asp Thr Leu Pro Asp Ser Cys Arg Arg Met 85 90 95

Lys GIn Ala Phe GIn Gly Ala Val Gln Lys Glu Leu Gln His Ile Val 100 105 110

Gly Pro Gln Arg Phe Ser Gly Ala Pro Ala Met Met Glu Gly Ser Trp 115 12 O 125

Leu Asp Val Ala Gln Arg GIy Lys Pro GIu Ala GIn Pro Phe Ala His 130 135 140

Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro Ser Gly Ser His Lys Val Thr 145 150 155 160

Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met 165 170 175

Thr Leu Ser Asn G1y Lys Leu Arg Val Asn G1n Asp Gly Phe Tyr Tyr 180 185 190

Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His His G1u Thr Ser Gly Ser Val 195 200 205

Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val Tyr Val Val Lys Thr Ser Ile 210 215 220

Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Met Lys Gly Gly Ser Thr Lys Asn 225 230 235 240

Trp Ser Gly Asn Ser G1u pr.e His Phe Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly 245 250 255

Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu Ile Ser I1e Gln Val Ser Asn 260 265 270

Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Pne

275 280 285

Lys Val Gln Asp Ile Asp 290

(2) INFORMACiÓN PARA SEQ ID NO:12:

(i) CARACTERíSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 954 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico

(C)

CLASE DE CADENA: simple

(O)

TOPOLOGíA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cONA

(iii) HIPOTÉTICA: NO 10 (iv) ANTI-SENTIOO: NO

(vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Hamo sapiens

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(A) GENOTECA: (B) CLON: huRANKL (longitud total)

(ix) CARACTERíSTICA:

5

(A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACiÓN: 1 .. 951

(xi) DESCRIPCiÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

ATG Met 1

CGC CGC Gec Arg Arg Ala AGC AGA GAC TAC Ser Arg Asp Tyr 5 ACC Thr AAG TAC Lys Tyr :'0 CTG Leu CGT GGC TCG GAG Arg Gly Ser Glu 15 48

GAG Glu

ATG Met GGC GGC GGC Gly Gly Gly 20 CCC GGA GCC Pro Gly Ala CCG Pro 25 CAC His GAG GGC Glu Gly CCC Pro CTG Leu 30 CAC His GCC Ala 96

CCG Pro

CCG Pro

CCG Pro 35 CCT GCG Pro Ala CCG Pro CAC His CAG Gln 40 CCC Pro CCC Pro GCC Ala GCC Ala TCC CGC Ser Arg 45 TCC ATG Ser Met 144

TTC GTG Phe Val 50

GCC Ala CTC Leu CTG Leu GGG CTG GGG Gly Leu Gly 55 CTG GGC CAG GTT Leu Gly Gln Val 60 GTC Val TGC Cys AGC GTC Ser Val 192

GCC Ala 65

CTG Leu TTC Phe TTC Phe TAT Tyr TTC Phe 70 AGA Arg GeG CAG ATG Ala Gln Met GAT Asp 75 CCT AAT AGA Pro Asn Arg ATA TCA 1le Ser 80 240

GAA GAT GGC ACT Glu Asp Gly Thr

CAC His 85 TGC Cys ATT TAT AGA 1le Tyr Arg ATT TTG 1le Leu 90 AGA Arg CTC CAT Leu Eis GAA AAT Glu Asn 95 288

GCA Ala

GAT Asp TTT Phe CAA GAC Gln Asp 100 ACA Thr ACT Thr CTG Leu GAG Glu 105 AGT CAA GAT Ser Gln Asp ACA Thr AAA Lys 110 TTA ATA Leu 1le 336

CCT GAT Pro Asp

TCA TGT AGG AGA ATT AAA Ser Cys Arg Arg 1le Lys 115 120 CAG GCC Gln Ala TTT Phe CAA GGA GCT GTG Gln Gly Ala Val 125 CAA Gln 384

AAG Lys

GAA Glu 130 TTA Leu CAA Gln CAT His ATC GTT 1le Val 135 GGA Gly TCA CAG Ser Gln CAC His ATC AGA 1le Arg 140 GCA Ala GAG Glu AAA Lys 432

GCG ATG Ala Met 145

GTG Val GAT GGC TCA Asp Gly Ser 150 TGG Trp TTA GAT Leu Asp CTG Leu GCC Ala 155 AAG AGG Lys Arg AGC Ser AAG Lys CT~ Leu 160 480

GAA GCT CAG Glu Ala Gln

CCT Pro TTT Phe 165 GCT Ala CAT His CTC Leu ACT Thr ATT AAT GCC ACC 1le Asn Ala Thr 170 GAC Asp ATC CCA 1le Pro 175 528

TCT GGT TCC CAT AAA GTG AGT CTG TCC TCT TGG TAC CAT GAT CGG GGT 576 Ser Gly Ser Bis Lys Val Ser Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly 180 185 190

TGG GCC AAG ATC TCC AAC ATG ACT TTT AGC AAT GGA AAA CTA ATA GTT 624 Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Phe Ser Asn Gly Lys Leu 11e Val 195 200 205

AAT CAG GAT GGC TTT TAT TAC CTG TAT GCC AAC ATT TGC TTT CGA CAT 672 Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His 210 215 220

CAT GAA ACT TCA GGA GAC CTA GCT ACA GAG TAT CTT CAA CTA ATG GTG 720 His Glu Thr Ser Gly Asp Leu Ala Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Met Val 225 230 235 240

TAC GTC ACT AAA ACC AGC ATC AAA ATC CCA AGT TCT CAT ACC CTG ATG 768 Tyr Val Thr Lys Thr Ser =le Lys Ile Pro Ser Ser His Thr Leu Met 245 250 255

AAA GGA GGA AGC ACC AAG TAT TGG TCA GGG AAT TCT GAA TTC CAT '::'TT. 816 Lys Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe 260 265 270

TAT TCC ATA AAC GTT GGT GGA TTT TTT AAG TTA CGG TCT GGA GAG GAA 864 Tyr Ser I1e Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ser G1y Glu Glu 275 280 285

ATC AGC ATC GAG GTC TCC AAC CCC TCC TTA CTG GA'I' CCG GAT CAG GAT 912 Ile Ser I1e Glu Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp 290 295 300

GCA ACA TAC TTT GGG GCT TTT AAA GTT CGA GAT ATA GAT TGA 954 Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Arg Asp I1e Asp 305 310 315

(2) INFORMACiÓN PARA SEQ ID NO:13:

(i)

CARACTERíSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 317 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(O)

TOPOLOGíA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCiÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:

Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Thr Lys Tyr Leu Arg Gly Ser Glu 1 5 10 15

Glu Met Gly Gly Gly Pro Gly Ala Pro His Glu Gly Pro Leu His Ala 20 25 30

Pro Pro Pro Pro Ala Pro His Gln Pro Pro Ala Ala Ser Arg Ser Met 35 40 45

Phe Val Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys Ser Val 50 55 60

Ala Leu Phe Phe Tyr Phe Arg Ala Gln Met Asp Pro Asn Arg Ile Ser 65 70 75 80

Glu Asp Gly Thr His Cys Ile Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His Glu Asn 85 90 95

Ala Asp Phe Gl:1 Asp Thr Thr Leu Glu Ser Gln Asp Thr Lys Leu Ile 108 105 110

Pro Asp Ser Cys Arg Arg Ile Lys Gln Ala ?he Gln Gly Ala Val Gln 115 120 125

Lys GlL:. Leu Gln His Ile Val Gly Ser Gln His Ile Arg Ala GLl Lys 130 135 140

Ala Met Val Asp Gly Ser Trp Leu Asp Leu Ala Lys Arg Ser Lys Leu 145 150 155 160

Glu ,,'.la Gln Pro P:'l.e Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Thr Asp Ile Pro 155 170 175

Ser Gly Ser His Lys Val Ser Leu Ser Ser Trp Tyr Bis Asp Arg Gly 180 185 190

Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Phe Ser Asn Gly Lys Leu Ile Val 195 200 205

Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg H' ~

~'"

210 215 220

Eis Glu Thr Ser Gly Asp :"eu Ala Thr Glu Tyr Leu Gln :"eu Het Val 225 230 235 240

Tyr Val Tnr Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Thr Leu Met 245 250 255

Lys Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe 260 265 270

Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ser Gly Glu Glu 275 280 285

Ile Ser Ile Glu Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gl:l. ASp 290 295 300

Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Arg Asp :le Asp

305 310 315

(2) INFORMACiÓN PARA SEQ ID NO:14:

(i) CARACTERíSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 1878 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico

(C)

CLASE DE CADENA: simple

(O)

TOPOLOGíA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cONA

(iii) HIPOTÉTICA: NO

10 (iv) ANTI-SENTIOO: NO

(vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Murino

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(A) GENOTECA: Epitelio de Hígado Fetal Murino (B) CLON: muRANK

(ix) CARACTERíSTICA:

5

(A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACiÓN: 1 .. 1875

(xi) DESCRIPCiÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

ATG Met 1

GCC Ala CCG CGC Pro Arg GCC Ala 5 CGG CGG CGC CGC CAG Arg Arg Arg Arg Gln 10 CTG Leu CCC GCG Pro Ala CCG Pro CTG Leu 15 CTG Leu 48

GCG A::'a

CTC TGC Leu Cys GTG Val 20 CTG Leu CTC Leu GTT Val CCA Pro CTG CAG GTG Leu Gln Val 25 ACT Thr CTC CAG GTC Leu GIn Val 30 ACT Thr 96

CCT Pro

CCA Pro TGC Cys 35 ACC Thr CAG GAG AGG Gln Glu Arg CAT Bis 40 TAT GAG Tyr Glu CAT His CTC Leu GGA CGG TGT TGC Gly Arg Cys Cys 45 144

AGC Ser

AGA TGC Arg Cys 50 G."f\A Glu CCA GGA AAG Tl,C Pro Gly Lys Tyr 55 CTG Leu TCC Ser TCT Ser AAG TGC Lys Cys 60 ACT Thr CCT Pro ACC Thr 192

TCC GAC Ser Asp 65

AGT GTG Ser Val TGT Cys CTG Leu 70 CCC TGT GGC CCC GAT GAG TAC Pro Cys Gly Pro Asp Glu Tyr 75 TTG Leu GAC Asp ACC Thr 80 240

TGG AAT Trp Asn

GAA GAA GAT AAA TGC Glu Glu Asp Lys Cys 85 TTG Leu CTG Leu CAT His 90 AAA Lys GTC Val TGT GAT Cys Asp GCA Ala 95 GGC Gly 288

AAG Lys

GCC CTG GTG Ala Leu Val 100 GCG GTG Ala Val GAT Asp CCT GGC AAC Pro Gly Asn 105 CAC ACG GCC His Thr Ala CCG CGT CGC Pro Arg Arg 110 336

TGT Cys

GCT TGC Ala Cys 115 ACG Thr GCT GGC TAC Ala Gly Tyr CAC His 120 TGG AAC Trp Asn TCA GAC TGC Ser Asp Cys 125 GAG G::'u TGC TGC Cys Cys 384

CGC AGG AAC ACG Arg Arg Asn Thr 130

GAG TGT Glu Cys GCA Ala 135 CCT GGC TTC GGA GCT CAG CAT Pro Gly Phe Gly Ala Gln His 140 CCC TTG Pro Leu 432

CAG Gln 145

CTC Leu AAC Asn MG GAT ACG GTG Lys Asp Thr Val 150 TGC Cys ACA Thr CCC TGC Pro Cys 155 CTC Leu CTG GGC TTC Leu Gly Phe TTC Phe 160 480

TCA GAT Ser Asp

GTC Val TTT Phe TCG TCC ACA GAC AAA TGC AAA Ser Ser Thr Asp Lys Cys Lys 165 170 CCT TGG ACC Pro Trp Thr AAC Asn 175 TGC Cys 528

ACC CTC CTT GGA AAG CTA GAA GCA CAC CAG GGG ACA ACG GAA TCA GAT 576 Thr Leu Leu Gly Lys Leu Glu Ala His Gln Gly Thr Thr Glu Ser Asp 180 185 190

GTG GTC TGC AGC TCT TCC ATG ACA CTG AGG AGA CCA CCC AAG GAG GCC 624 Val Val Cys Ser Ser Ser Met Thr Leu Arg Arg Pro Pro Lys Glu Ala 195 200 205

CAG GCT TAC CTG CCC AGT CTC ATC GTT CTG CTC CTC TTC ATC TCT GTG 672 Gln Ala Tyr Leu Pro Ser Leu Ile Val Leu Leu Leu Phe 11e Ser Val 210 215 220

GTA GTA GTG GCT GCC ATC ATC TTC GGC GTT TAC TAC AGG AAG GGA GGG 720 Val Val Val Ala Ala Ile Ile Phe Gly Val Tyr Tyr Arg Lys Gly Gly 225 230 235 240

AAA GCG CTG ACA GCT AAT TTG TGG AAT TGG GTC AAT GAT GCT TGC AGT 768 Lys Ala Leu Thr Ala Asn Leu Trp Asn Trp Val Asn Asp Ala Cys Ser 245 250 255

AGT CTA AGT GGA AAT AAG GAG TCC TCA GGG GAC CGT TGT GCT GGT TCC 816 Ser Leu Ser Gly Asn Lys Glu Ser Ser Gly Asp Arg Cys Ala Gly Ser 260 265 270

CAC TCG GCA ACC TCC AGT CAG CAA GAA GTG TGT GAA GGT ATC TTA CTA 864 His Ser Ala Thr Ser Ser Gln Gln Glu Val Cys Glu Gly Ile Leu Leu 275 280 285

ATG ACT CGG GAG GAG AAG ATG GTT CCA GAA GAC GGT GCT GGA GTC TGT 912 Met Thr Arg Glu Glu Lys Met Val Pro Glu Asp Gly Ala Gly Val Cys 290 295 308

GGG CCT GTG TGT GCG GCA GGT GGG CCC TGG GCA GAA GTC AGA GAT TCT 960 Gly Pro Val Cys Ala Ala Gly Gly Pro Trp Ala Glu Val Arg Asp Ser 305 310 315 320

AGG ACG TTC ACA CTG GTC AGC GAG GTT GAG ACG CAA GGA GAC CTC TCG ~008 Arg Thr Phe Thr Leu Val Ser Glu Val Glu Thr GIn GIy Asp Leu Ser 325 330 335

AGG AAG ATT CCC ACA GAG GAT GAG TAC ACG GAC CGG CCC TCG CAG CCT 1056 Arg Lys Ile Pro Thr Glu Asp Glu Tyr Thr Asp Arg Pro Ser Gln Pro 340 345 350

TCG ACT GGT TCA CTG CTC CTA ATC CAG CAG GGA AGC AAA TCT ATA CCC 1104 Ser Thr Gly Ser Leu Leu Leu Ile Gln Gln Gly Ser Lys Ser 11e Pro 355 360 365

CCA TTC CAG GAG CCC CTG GAA GTG GGG GAG AAC GAC AGT TTA AGC CAG 1152 Pro Phe Gln Glu ?ro Leu Glu Val Gly Glu Asn Asp Ser Leu Ser Gln 370 375 380

TGT TTC ACC GGG ACT GAA AGC ACG GTG GAT TCT GAG GGC TGT GAC TTC 1200 Cys Phe Thr Gly T~r Glu Ser Thr Val Asp Ser Glu Gly Cys Asp Phe 385 390 395 400

ACT GAG CCT CCG AGC AGA ACT GAC TCT ATG CCC GTG TCC CCT GAA AAG 1248 Thr Glu Pro Pro Ser Arg Thr Asp Ser Met Pro Val Ser Pro Glu Lys 405 410 415

CAC His

CTG ACA Le~ Thr AAA Lys 420 GAA Glu ATA GAA GGT GAC Ile Glu Gly Asp 425 AGT Ser TGC Cys CTC Leu CCC TGG GTG Pro Trp Val 430 GTC Val 1296

AGC Ser

TCC AAC Ser Asn 435 TCA ACA Ser Thr GAT GGC TAC Asp Gly Tyr 440 ACA GGC Thr Gly AGT GGG AAC ACT Ser Gly Asn Thr 445 CCT GGG Pro Gly 1344

GAG Glu

GAC Asp 450 CAT His GAA Glu CCC Pro TTT Phe CCA Pro 455 GGG TCC Gly Ser CTG Leu AAA Lys TGT GGA Cys Gly 460 CCA Pro TTG Leu CCC Pro 1392

CAG Gln 465

TGT Cys GCC Ala TAC Tyr AGC Ser ATG Met 470 GGC Gly TTT Phe CCC Pro AGT GAA GCA GCA GCC AGC Ser Glu Ala Ala Ala Ser 475 ATG Met 480 1440

pCA GAG GCG GGA GTA Ala Glu Ala Gly Val 485

CGG Arg CCC CAG Pro GIn GAC AGG Asp Arg 490 GCT GAT Ala Asp GAG AGG GGA GCC GIu Arg Gly Ala 495 1488

TCA GGG Ser Gly

TCC Ser GGG AGC Gly Ser 500 TCC Ser CCC Pro AGT Ser GAC Asp 505 CAG GIn CeA Pro CCT GCC Pro Ala TCT GGG AAC Ser Gly Asn 510 1536

GTG Val

ACT Thr GGA AAC AGT AAC GIy Asn Ser Asn 515 TCC ACG Ser Thr 520 TTC Phe ATC TCT AGC GGG CAG GTG Ile Ser Ser Gly GIn Val 525 ATG Met 1584

AAC Asn

TTC Phe 530 AAG GGT GAC Lys Gly Asp ATC ATC GTG GTG Ile Ile Val Val 535 TAT GTC Tyr Val AGC CAG ACC Ser Gln Thr 540 TCG Ser CAG Gln 1632

GAG GGC Glu GIy 545

CCG Pro GGT TCC GCA GAG Gly Ser Ala Glu 550 CCC GAG Pro Glu TCG GAG Ser Glu 555 CCC GTG Pro Val GGC CGC Gly Arg CCT Pro 560 1680

GTG Val

CAG GAG Gln Glu GAG Glu ACG Thr 565 CTG GCA Leu Ala CAC AGA GAC His Arg Asp 570 TCC Ser TTT Phe GCG Ala GGC Gly ACC Thr 575 GCG Ala 1728

CCG Pro

CGC Arg TTC Phe CCC GAC Pro ASp 580 GTC Val TGT Cys GCC Ala ACC GGG GCT GGG CTG CAG Thr Gly Ala Gly Leu Gln 585 590 GAG GIu CAG GIn 1776

GGG GCA GIy Ala

CCC CGG CAG Pro Arg Gln 595 AAG GAC GGG ACA Lys Asp Gly Thr 600 TCG CGG Ser Arg CCG GTG Pro Val 605 CAG GAG CAG Gln Glu Gln 1824

GGT GGG GCG Gly Gly Ala 610

CAG ACT Gln Thr TCA Ser CTC Leu 615 CAT His ACC CAG GGG TCC GGA CAA Thr Gln Gly Ser Gly GIn 620 ~GT GCA Cys Ala 1872

GAA TGA Glu 625

:878

(2) INFORMACiÓN PARA SEQ ID NO:15:

(i) CARACTERíSTICAS DE LA SECUENCIA:

5

(A) LONGITUD: 625 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (O) TOPOLOGíA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCiÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

Met Ala Pro Arg Ala Arg Arg Arg Arg Gln Leu Pro Ala Pro Leu Leu 1 5 10 15

Ala Leu Cys Val Leu Leu Val Pro Leu Gln Val Thr Leu Gln Val Thr 20 25 30

Pro Pro Cys Thr Gln Glu Arg His Tyr Glu His Leu Gly Arg Cys Cys 35 40 45

Ser Arg Cys Glu Pro Gly Lys Tyr Leu Ser Ser Lys Cys Thr Pro Thr 50 55 60

Ser Asp Ser Val Cys Leu Pro Cys Gly Pro Asp Glu Tyr Leu Asp Thr 65 70 75 80

Trp Asn Glu Glu Asp Lys Cys Leu Leu His Lys Val Cys Asp Ala Gly 85 90 95

Lys Ala Leu Val Ala Val Asp Pro Gly Asn His Thr Ala Pro Arg Arg 100 105 110

Cys Ala Cys Thr Ala Gly Tyr His Trp Asn Ser Asp Cys Glu Cys Cys 115 120 125

Arg Arg Asn Thr Glu Cys Ala Pro Gly Phe Gly Ala Gln His Pro Leu 130 135 140

Gln Leu Asn Lys Asp Thr Val Cys Thr Pro Cys Leu Leu Gly Phe Phe 145 150 155 160

Ser Asp Val Phe Ser Ser Thr Asp Lys Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys 165 170 175

Thr Leu Leu Gly Lys Leu Glu Ala His Gln Gly Thr Thr Glu Ser Asp 180 185 190

Val Val Cys Ser Ser Ser Met Thr Leu Arg Arg Pro Pro Lys Glu Ala 195 200 205

Gln Ala Tyr Leu Pro Ser Leu Ile Val Leu Leu Leu Phe I1e Ser Val 210 215 220

Val Val Val Ala Ala Ile I1e Phe G1y Val Tyr Tyr Arg Lys Gly G1y 225 230 235 240

Lys Ala Leu Thr Ala Asn Leu Trp Asn Trp Val Asn Asp Ala Cys Ser 245 250 255

Ser Leu Ser Gly Asn Lys Glu Ser Ser Gly Asp Arg Cys Ala Gly Ser 260 265 270

His Ser Ala Thr Ser Ser Gln Gln Glu Val Cys G1u Gly Ile Leu Leu 275 280 285

Met Thr Arg Glu Glu Lys Met Val Pro Glu Asp Gly Ala Gly Val Cys 290 295 300

Gly Pro Val Cys Ala Ala Gly Gly Pro Trp Ala Glu Val Arg Asp Ser 305 310 315 320

Arg Thr Phe Thr Leu Val Ser Glu Val Glu Thr Gln Gly Asp Leu Ser 325 330 335

Arg Lys 1le Pro Thr Glu Asp Glu Tyr Thr Asp Arg Pro Ser Gln Pro 340 345 350

Ser Thr Gly Ser Leu Leu Leu Ile Gln Gln Gly Ser Lys Ser 1le Pro 355 360 365

Pro Phe Gln Glu Pro Leu Glu Val Gly Glu Asn Asp Ser Leu Ser Gln 370 375 380

Cys Phe Thr Gly Thr Glu Ser Thr Val Asp Ser Glu Gly Cys Asp Phe 385 390 395 400

Thr Glu Pro Pro Ser Arg Thr Asp Ser Met Pro Val Ser Pro Glu Lys 405 410 415

His Leu Thr Lys Glu 1le Glu Gly Asp Ser Cys Leu Pro Trp Val Val 420 425 430

Ser Ser Asn Ser Thr Asp Gly Tyr Thr Gly Ser Gly Asn Thr Pro Gly 435 440 445

Glu Asp His Glu Pro Phe Pro Gly Ser Leu Lys Cys Gly Pro Leu Pro 450 455 460

Gln Cys Ala Tyr Ser Met Gly Phe Pro Ser Glu Ala Ala Ala Ser Met 465 470 475 480

Ala Glu Ala Gly Val Arg Pro Gln Asp Arg Ala Asp Glu Arg Gly Ala 485 490 495

Ser Gly Ser Gly Ser Ser Pro Ser Asp Gln Pro Pro Ala Ser Gly Asn 500 505 510

Val Thr Gly Asn Ser Asn Ser Thr Phe Ile Ser Ser Gly Gln Val Met 515 520 525

Asn Phe Lys Gly Asp 1le 1le Val Val Tyr Val Ser Gln Thr Ser Gln 530 535 540

Glu Gly Pro Gly Ser Ala Glu Pro Glu Ser Glu Pro Val Gly Arg Pro 545 550 555 560

Val Gln Glu Glu Thr Leu Ala His Arg Asp Ser Phe Ala Gly Thr Ala 565 570 575

Pro Arg Phe Pro Asp Val Cys Ala Thr Gly Ala Gly Leu Gln Glu Gln 580 585 590

Gly Ala Pro Arg Gln Lys Asp Gly Thr Ser Arg Pro Val Gln Glu Gln

595

600 605

Gly Gly

Ala Gln Th r Se~ Leu His Thr Gln Gly Ser Gly Gln Cys Ala

610

615 620

Glu

625

(2) INFORMACiÓN PARA SEQ ID NO:16:

(i) CARACTERíSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 20 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido 5 (O) TOPOLOGíA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCiÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:

Me~ Glu ~h~ Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly 20

(2)

INFORMACiÓN PARA SEQ ID NO:17: 10 (i) CARACTERíSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(O)

TOPOLOGíA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína 15 (xi) DESCRIPCiÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:

Asp Tyr Lys Asp Glu 5

(2) INFORMACiÓN PARA SEQ ID NO:18:

(i) CARACTERíSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 6 aminoácidos 20 (B) TIPO: aminoácido

(O) TOPOLOGíA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCiÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:

His His His His His His

5 25 (2) INFORMACiÓN PARA SEQ ID NO:19:

(i) CARACTERíSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 33 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(O) TOPOLOGíA: lineal 30 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCiÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:

Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu 1le Leu Ser Lys 1le 1 5 10 15

Tyr Hís lle Glu Asn Glu lle Ala Arg Ile Lys Lys Leu 1le Gly Glu 20 25 30

Arg

Claims (30)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un ONA aislado seleccionado del grupo constituido por:

   (a) un ONA que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO: 13, en donde la proteína tiene un término amino seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre

   5 el aminoácido 1 y el aminoácido 162, inclusive, y un término carboxi seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre el aminoácido 313 y el aminoácido 317, inclusive;

   (b) moléculas de ONA que codifican fragmentos de proteínas codificadas por el ONA de (a) que son capaces de fijar el polipéptido RANK; y

   (c)

   un ONA que comprende una secuencia de nucleótidos como se indica en los nucleótidos 1-951 de SEQ ID 10 NO:12;

   (d)

   un ONA que comprende una secuencia de nucleótidos como se indica en los nucleótidos 484 a 951 de SEQ ID NO:12; y

   (e)

   un ONA que codifica una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos entre el aminoácido 1 y el aminoácido 317 de SEQ ID NO:13.

   15 2. El ONA aislado de la reivindicación 1, que codifica un polipéptido RANKL que es idéntico al menos aproximadamente en un 90% en secuencia de aminoácidos a RANKL tal como es codificado por el ONA de la reivindicación 1(c) o la reivindicación 1(e).

2. 3.

   El ONA aislado de la reivindicación 1(a), (b) o (d) que codifica un polipéptido RANKL soluble.

3. 4.

   Un ONA aislado que codifica un RANKL soluble, seleccionado del grupo constituido por:

   20 (a) un ONA que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO: 13, en donde la proteína tiene un término amino seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre el aminoácido 69 y el aminoácido 162, inclusive, y un término carboxi seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre el aminoácido 313 y el aminoácido 317, inclusive; y

   (b) moléculas de ONA que codifican fragmentos de proteínas codificadas por el ONA de (a) que son capaces de 25 fijar el polipéptido RANK.
4. 5. El ONA aislado de la reivindicación 4, que comprende adicionalmente un ONA que codifica un polipéptido seleccionado del grupo constituido por un dominio de inmunoglobulina Fc, una muteína de inmunoglobulina Fc, una cremallera de leucina, y combinaciones de los mismos.
5. 6. Un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de ONA de acuerdo con una cualquiera de 30 las reivindicaciones 1 a 5.
6. 7. Una célula hospedadora transformada o transfectada con un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación
7. 6.
8. 8. Un proceso para preparar una proteína RANKL, que comprende cultivar una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 7 en condiciones que promueven la expresión y recuperación de RANKL.

   35 9. Un polipéptido RANKL aislado seleccionado del grupo constituido por:

   (a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO:13, en donde el polipéptido tiene un término amino seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre el aminoácido 1 y el aminoácido 162, inclusive, y un término carboxi seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre el aminoácido 313 y 317, inclusive;

   40 (b) fragmentos del polipéptido de (a) que son capaces de fijar el polipéptido RANK; y

   (c)

   un polipéptido RANKL codificado por un ONA que comprende una secuencia de nucleótidos como se indica en los nucleótidos 1 a 951 de SEQ ID NO:12;

   (d)

   un polipéptido RANKL codificado por un ONA que comprende una secuencia de nucleótidos como se indica en los nucleótidos 484 a 951 de SEQ ID NO:12;

   45 (e) un polipéptido RANKL constituido por la secuencia de aminoácidos entre el aminoácido 1 y el aminoácido 317 de SEQ ID NO:13.

9. 10.

   La proteína de acuerdo con la reivindicación 9, que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos aproximadamente en un 90% al polipéptido de la reivindicación 9(c) o la reivindicación 9(e).

10. 11.

    La proteína de acuerdo con la reivindicación 9(a), (b) o (d), que es una RANKL soluble.

11. 12.

    Una proteína de acuerdo con la reivindicación 9, 10 ó 11 que tiene una secuencia de aminoácidos diferente por tener una deleción, inserción o sustitución.

12. 13.

    Una proteína RANKL soluble de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende adicionalmente un péptido

    5 seleccionado del grupo constituido por un dominio de inmunoglobulina Fc, una muteína de inmunoglobulina Fc, una cremallera de leucina, y combinaciones de los mismos.
13. 14. Un anticuerpo inmunorreactivo con el polipéptido RANKL de acuerdo con la reivindicación 9, que no es inmunorreactivo con el polipéptido que tiene la secuencia siguiente:

    1!fet:. A%:g ArR Al. ser Mg A.ep Tyr Gly ¡ * S

    Giu Het ~ly 5ell:" QlY '):"0 -Oly Va1 Pr:o Hb Q1u Gly pI:'<) Leu Hla Pl:"(I 20 as

    1\1.6 ~o Sar Ala 1'11:'0 Al. i'l;Q Ale. ,,,"o ko Pro JUa JUs SJe!:' "Arf1 3S 40 45

    Wu Gly Wu CUy Le\! Gl;Y Gl~ VAl Val Cy¡¡¡ Ser S5 GO

    Phe AJ:'v Ala aln Het:. A.sp Pro Asn AJ:V Ile 75 ea

    Ser Ol.U Jl.1lp Ser '.I'tir Kili" c:!fa Pbe 'fYr AJ:g 1l-..u A:r;g Leu. Jlbl Glu es 90. 95

    Asn Ala CUy Leu Gln AIIl~ SaZ' 'l'hJ: L!IIu Olu aar Glu l\1fp Thr Lftu Pro 100 lOS 110

    J"u>p Ser Cya A!;tr 1U:'g Mel! l4'S Gln Ala PhI GID G1y 1\1. Val GIa Lya 115 130 125

    al:u Leu Gln Bis Ile Val. Gl.y Pro Gln Ar, PhA ser Gl.y l\1111. Pl:'O 1I.la 110 llS 140

    H@~ Hat Glu aly ser Lftu A$p Vel ~la Gln Arg Gly Lya Pro Clu 145 l!iS lJíQ

    1U.a Gln Pro 1Pl:>. Ala Hi. ~Thr 1:1e AIm Ala Al. SillA: ;¡l. P:n:o SliIr lU 1'10. 115

    Gl.y Ser xis IJys 1I'al 'l'br L<>u Sw: Ser ~Tyr Bil!l ABp Arg Gly T.t:p 180 1&5 190

    Ala IQrs :llé ser MA Mee 'fhr Wu. Gel" 1IJm al)!' Lys LmJ. A.rv VB.i Al!;n 195 200 lOS

    Oln Asp Qiy Pbe 'fYr T:rr Le\! 'I.'yr 1I.ln Asn !la Cys Phe Arg Bis 1(:1..9 2111 z1.S 220

    01u Th:1." Ser GIl' Se.r Val Fro '1'br Asp ~Leu Gln W\l Met Val Tyr 225 :'no Z35 240

    Val Val Lys 'rbr Ser llee Lys l:b Pro SIiIr 5.1: Ilis JU¡¡n Leu. Met. LY$ :U5 2S0 :255

    Gly Ser 'l'hr Lys MI"!. 'l";t;p S<!!r GIl" AIIln SI!ll:" 011.1 Pbé Hia Pite Tyr afiO 2115 270

    ~or :Ele Mn val aly Oly Ph9 Phe IJ,ys Leu AJ:g Al.a Gly Gl.u...Gl.u :tl.e 2'15 280 JI85

    Ser :Il.é <:>1rt V!l.l. Ser As... PrO. rlc:C LéU loéu. Mp 1'%"0 J\sp Gm .I\.sp Mil.

    2:90 2'5 lOQ

    '1"l;:¡;r: T:J¡n;"" Phe G1l'" Ud ~Phé Lis V..l. Qln A::rp 1:10 Asp lOS 310, 315
14. 15. Utilización de un polipéptido RANKL seleccionado de: 10

    (a)

    un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO:13, en donde el polipéptido tiene un término amino seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre el aminoácido 1 y el aminoácido 162, inclusive, y un término carboxi seleccionado del grupo constituido por un aminoácido entre el aminoácido 313 y 317, inclusive; y

    (b)

    fragmentos del polipéptido de (a) que son capaces de fijar el polipéptido RANK, para cribado respecto a un inhibidor de la activación de NF-KB.

15. 16.

    Una composición que comprende el polipéptido RANKL como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 9-13, y un vehículo, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable.

16. 17.

    Un kit para detectar RANK o RANKL solubles, o monitorizar la actividad relacionada con RANK, que comprende un polipéptido RANKL como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 9-13.

17. 18.

    Un polipéptido RANKL como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 9-13, para utilización en el cribado respecto a un inhibidor de RANK.

18. 19.

    Un polipéptido RANKL como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 9-13, para utilización en el diseño basado en estructura de inhibidores de RANKL.

19. 20.

    Utilización de un polipéptido RANKL como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 9-13 en el desarrollo de anticuerpos para RANKL.

20. 21.

    Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 14 para utilización en la inhibición de la fijación a RANK.

21. 22.

    Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 14 para utilización en la interferencia con la señalización de RANKL.

22. 23.

    Una composlclon que comprende un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 14 para utilización en la inhibición de la fijación a RANK.

23. 24.

    Un polipéptido RANKL soluble de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11, 12 ó 13 para utilización como agonista de RANK.

24. 25.

    La utilización de acuerdo con la reivindicación 24, en la cual el polipéptido induce actividad de NF-kappa B.

25. 26.

    Una composición que comprende un polipéptido RANKL soluble de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11, 12 ó 13 para utilización como un agonista de RANK.

26. 27.

    Una composición de acuerdo con la reivindicación 26 para inducir la actividad de NF-kappa B.

27. 28.

    Un método de preparación de un anticuerpo que comprende utilizar un polipéptido RANKL de acuerdo con la reivindicación 9 como inmunógeno.

28. 29.

    Un método de preparación en un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 14, que comprende utilizar un polipéptido RANKL de acuerdo con la reivindicación 9 como inmunógeno.

29. 30.

    Una composición que comprende un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 14.

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    Figura 5 (cont.)