JPH05504682A - 一定の細胞系又は微生物の内因性遺伝子の発現特徴の変性のための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 一定の細胞系又は微生物の内因性遺伝子の発現特徴の変性のための方法 】」１■ｊＬ団 本発明は、安定細胞系又はクローン化された微生物のゲノム内に天然に存在する 遺伝子の発現特徴の変性のための方法に関する。好ましいＭ様においては、本発 明は、安定細胞系内に存在し、そして通常、転写的に静かで又は不活性である遺 伝子の活性化及び発現のための方法に関する。結果として、その遺伝子のタンパ ク質生成物が発現される。この現象は、その生成物をコードするＤＮＡにより細 胞をトランスフェクトしないで生じる。むしろ、所望する生成物をコードする常 在性遺伝子が、細胞内で同定され、そしていわゆる相同的組換え技法を通して適 切な調節セグメントを挿入することによって活性化される。陽性及び／又は陰性 選択マーカーがまた、適切な相同的組換え出来事が生じている細胞の選択を助け るために挿入され得る。追加の態様として、特定化された遺伝子は、その遺伝子 が通常転写的に静かであり、そして本発明により活性化されているか又は内因的 に生成物を発現するかにかかわらず、早められた発現速度のために増幅され得る ゆ光」Ｌ■」Ｌ量 生物内の個々の細胞は、その生物内に見出されるすべてのタンパク質をコードす る遺伝子情報を含むことが良く知られている。しかしながら、一定細胞型内に存 在するひじょうに少数％の遺伝子のみが実際的に転写される。転写されるべき遺 伝子配列を調節する細胞内機構が現在理解される。核内に存在する細胞特異的タ ンパク質は、特定の遺伝子により連結されるＤＮＡ調節セグメントと相互作用す る。ＤＮＡ調節配列と核タンパク質とのこの相互作用は、遺伝子転写のために必 要とされる。これは、ｍＲＮＡの生合成及びコードされたタンパク質の究極的な 発現をもたらす（Ｍｉｔｃｈｅｌｌａｎｄ　Ｔｊｉａｎ、５ｃｉｅｎｃｅ、２４ ５：３７１，１９８９）。

個々の遺伝子のためのこれらのＤＮＡ８節セグメント又は要素は、コード領域か ら上流に及び多くの場合、コード領域内又はその下流に存在する。細胞特異的核 タンパク質との相互作用を通して、ＤＮＡ調節セグメントは、遺伝子の本体に接 近し、そしてｍＲＮＡ転写体を合成するためのＲＮＡポリマラーゼの能力、すな わちタンパク質発現における酵素を制限する速度に影響を及ぼす。従って、これ らのＤＮＡセグメント及び常在性核タンパク質は、特定遺伝子の発現の調節に臨 界的な役割を示す（Ｊｃｈ、ｎ５ｏｎ　ａｎｄ　Ｍｃｋｎｉｇｈｔ、Ａｎｎ、Ｒ ｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、５８　：　７９９゜１９８９）。

ＤＮＡ調節セグメントは、核タンパク質のための結合部位である。これらの核タ ンパク質は、ＤＮＡヘリックスに結合し、そして遺伝子転写を促進する、ＲＮＡ ポリマラーゼ認識のために利用できる所望する遺伝子を製造するためにその構造 を明らかに変える。これらの細胞特異的調節タンパク質の発現は、遺伝子が細胞 内で転写され、そしてその速度で発現が生じるであろうことを決定する。このシ ステムの特異的な例として、たとえ脳下垂体タンパク質のための遺伝子がすべて の肝臓細胞内に存在したとしても、脳下垂体細胞（但し、肝臓細胞ではない）は 脳下垂体タンパク質を発現する。肝臓細胞の核は、肝臓細胞内に存在する脳下垂 体遺伝子の要素と相互作用する特異的ＤＮＡ結合タンパク質を含まない。

えＤＮＡ　いて　ンバク　るために まｍしＬ友汰 特異的ＤＮＡ！節配列が特定細胞型内で遺伝子転写を活性化するために必要とさ れる知識により、科学者は、遺伝子工学を通して特定の細胞型内に外来性遺伝子 を発現して来た。

一般的に、細胞の核タンパク質により認識されるＤＮＡ調節セグメントは、発現 されるべき外来性遺伝子のコード領域から上流で１換される。この方法において は、細胞中への挿入の後、外来性ＤＮＡは、細胞の核調節タンパク質がこれらの ＤＮＡｍ節配列を認識するので、発現され得る。この技法は、従来の精製技法に より天然源から得又は精製するために困難であったタンパク質を生成するために 使用されて来た。

認識できるＤＮＡ配列及び対象の遺伝子の他に、選択可能マーカーがＤＮＡ構造 体に結合される。この手段においては、ＤＮＡを摂取した細胞のみが選択培地に おける培養の後、生存する。たとえば、耐ネオマイシン性のための遺伝子が発現 ヘクターに含まれ得る。トランスフェクションに続いて、細胞は、６４１８、す なわち哺乳類細胞に対しては致死的であるネオマイシン抗生物質中で培養される 。しがしながら、その細胞が耐ネオマイシン性遺伝子を得たならば、それらは薬 物の毒性効果に耐えることができるであろう。この手段においては、トランスフ ェクトされたＤＮＡを摂取した細胞のみが、培養物中に維持される。いづれかの 選択可能マーカーは、それがトランスフェクトされたＤＮＡを摂取した細胞の選 択を提供する限り使用され得ることが理解される。細胞内の挿入された遺伝子材 料の特異的位置に関しての臨界性は存在しないことがさらに理解される。調節セ グメント及び外来性遺伝子（並びに選択可能マーカー）の両者が一緒に挿入され る場合、それが核内のいづれかに摂取されることが単に重要である。

゛　云　の　在の　法における 上記技法は遺伝子工学の力を開発する助けになって来たが、それらは必ずしも遺 伝子を発現するのに最っとも効果的な方法ではなかった。これは、細胞系の核中 へのＤＮＡの挿入が通常、トランスフェクションとして知られる技法を通して達 成される事実による。対象の細胞系における発現のために構築されたＤＮＡが沈 澱せしめられ、そして細胞膜が、ＤＮＡの侵入を可能にするために溶解される。

上記のようにして、ＤＮＡがゲノム中に組込む正確な部位は決して予測できず； 実際、ＤＮＡはエビソーム（ゲノム中に組込まれていない）のまま存続すること ができる。これは、生成されるタンパク質の発現のレベル及び細胞系の安定性の レベルの非予測性をもたらす。

この技法の第２の欠点は、発現ベクターの構成が、対象の遺伝子が比較的大きい （５〜ＩＯＫ塩基以上）場合、ひじょうに困難である事実である。組換えＤＮＡ 技法により発現されるタンパク質の多くは、より大きなゲノムクローンよりもむ しろｃＤＮＡによりコードされていた。これは、対象の全体の大きさを減するた めに行なわれる。ｃＤＮＡの使用は遺伝子工学をより便利にするが、遺伝子転写 及びタンパク質生成の速度が結果として損害を受ける。発現レベルは、時々、ｃ ＤＮＡＤＮＡ構造体むしろゲノムの使用によりひじょうに高められることが最近 示された（Ｂｒｉｎｓｔｅｒなど、。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、８５：８３６〜８４０．１９８８及 びＣｈｕｎｇ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ。

Ｍｏ　１．Ｃｅ　Ｉ　Ｉ、Ｂｉｏ　１．．９　：　２０７５〜２０８２゜１９８ ９）。この観察を担当する機構は十分に理解されていないが、ある状況下で、イ ントロン内に存在するエンハンサ−要素が遺伝子の転写効能を改良することがで きることは知られている。イントロン、又はイントロンの存在に起因するスプラ イシング出来事が、転写の開始に続＜ＲＮＡプロセッシング出来事に対して効果 を有する証拠がまた存在する（Ｂｕｃｈｍａｎ　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ、Ｍｏｌ、Ｃ ｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、、８：４３９５〜４４０５．１９８８）、これは、転写体を安定化し 、それによってｍＲＮＡ蓄積の速度を改良する。上記に引用されなりｒｉｎｓｔ ｅｒなどの文献においては、遺伝子内のイントロンの位置がプロモーターに対す るヌクレオソームの相比のために重要であることがまた仮定される。真核生物の 遺伝子の転写に対する種々の調節要素の影響が、Ｋｈｏｕｒｙなど、、Ｃｅ１１ ，３３　：３１３〜１４（１９８３）、Ｍａｎｉａｔｉｓなど、５ｃｉｅｎｃｅ 、２３６　：１２３７〜４５　（１９８７）及びＭｕｌｌｅｒなど。

Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１７６：４８５〜９５　（１９８８）に論ぜら れている。

第３に、核中への侵入を得るために、外来性遺伝子の全コード領域を含むトラン スフェクトされたＤＮＡは、細胞の透過形質膜を通しての侵入に従って細胞質を 横切る。その時間の間、ＤＮＡは、ＤＮＡの統合を変えることができ又は完全に 破壊するリゾソーム酵素と接触することができる。従って、ＤＮＡのコード領域 は、トランスフェクトされた領域と同じではない。

下記遺伝子活性化及び／又は発現変性の新規方法は、所望する遺伝子のコード領 域が酵素変性にゆだねられないので、所望するタンパク質の変異形の生成をもた らすことができない。

要約すれば、従来技法を用いての細胞中にトランスフェクトされた多量のＤＮＡ 及び特にそのコード領域は、正確に転写されないであろう。それは酵素的に混乱 された核中への侵入の前、少化し、その結果、所望する全タンパク質をコードせ ず又は転写を可能にするすべての必要な調節セグメントを含まない。それは、転 写を妨げるゲノムの一部中に挿入され得る。ｃＤＮＡが転写される場合、対象の タンパク質は、エンハンサ−を含み、又は効果的なｍＲＮＡのプロセンシングを 可能にするイントロンの脱落により効果的に生成され得ない。最後に、それはエ ビソームのまま存続し、タンパク質生成を促進するが、しかし細胞集団は細胞分 裂を通して増殖するので不安定である。

存在する方法の陽性特性を組込んでいるが、しかし興味のない特徴を包含しない 細胞系を生成する遺伝子発現の誘発方法を開発することが最っとも所望される。

細胞タイプの選択において特定の遺伝子の内因性発現を発現し、又は変性するこ とができることがさらに所望される。適切なヌクレオソーム相化のためにイント ロンの適切な置換により又はより効果的なｍＲＮＡプロセッシング出来事により 、イントロン内に存在する隠れた転写ユンハンサーを含むことができる完全なゲ ノム配列により付与され得る可能性ある利点を利用するこがさらに所望される。

これらの利点は、遺伝子の大きさにより、組換えＤＮＡ発現方法に通常有されな い。ゲノムに通常存在する遺伝子、すなわち内因性遺伝子を発現することができ る場合、細胞系の安定性及び発現速度はより適合、且つ予測可能になる。

、ＩＬ■ＪＪｆｉ 従って、従来技術における上記欠点を排除することが本発明の目的である。

組換え遺伝子技法の陽正特性を組込んでいるが、しかし興味のない特徴を包含し ない遺伝子発現の調節及び／又は増幅の方法を提供することが本発明のもう１つ の目的である。

細胞系の選択において存在するが、しか通常、転写的には作動しない特定の遺伝 子を発現するための方法を提供することが本発明のもう１つの目的である。

ｍＲＮＡの蓄積及び／又は転写を担当する完全なゲノム配列の十分な利点を有す るタンパク質を発現するための方法を提供することがまた本発明の追加の目的で ある。

対象の生来の遺伝子の上流、その遺伝子内又はその遺伝子に最っとも近くの安定 細胞系又はクローン化された微生物のゲノム中にＤＮＡ調節セグメントを挿入し 、そして／又はセグメントを増幅することによって対象の遺伝子の発現特徴を変 性するための方法を提供することが本発明のさらにもう１つの目的である。

安定細胞系又はクローン化された微生物のゲノム内に天然に存在する遺伝子の発 現特徴及び同時に、適切に変性された細胞の選択において助力するであろう挿入 体特徴を変性するための方法を提供することが本発明の追加の目的である。

対象の遺伝子のコード領域又はエキソン近（に、そこで天然において現われない 調節又は増幅セグメントを有するゲノムを提供することが本発明のさらにもう１ つの目的である。

本発明の相同的組換え方法を達成するために使用され得るＤＮＡ構造体を提供す ることが本発明のもう１つの目的である。

本発明のゲノムを含む細胞系及び微生物を提供することが本発明のもうＬつの目 的である。

本発明のこれらの及び他の目的が相同的組換え技法により達成され、これにより 当業者は、常在性であるが、但し転写的には不活性な遺伝子の発現及び好ましく は増幅を引き起こすことができる。この技法によれば、たとえば発現を条件付き 、すなわち抑制可能又は誘発可能にするために、又は発現の速度を早めるために 、安定細胞系のゲノムで天然に存在するが、しかし必ずしも不活性でない遺伝子 の発現特徴をだれでも変性することができる。

本発明は、細胞系又は微生物のゲノム内での遺伝子の発現特徴を変性するための 方法を提供する。ＤＮＡ構造体は、相同的組換えの技法によりそのゲノム中に挿 入される。その構造体は、宿主細胞系又は微生物内で操作可能的に結合されるい づれかの遺伝子の発現特徴を変性することができるＤＮＡ調節セグメント、及び 挿入されるべきＤＮＡ調節セグメントのために所望されるゲノムの領域に相同の 標的セグメントを含む。構成及び挿入技法は、新規ＤＮＡ８節セグメントの、対 象の遺伝子への操作的結合を引き起こすために企画される。

従って、いづれか新規のコードエキソンを必ずしも挿入しなければ、その遺伝子 の発現特徴は変性される。好ましい態様においては、その遺伝子は、宿主細胞系 又は微生物内で通常転写的に静かであり又は不活性である遺伝子であり、そして 相同的組換えによりその遺伝子に関して適切な位置に直接的に目標を決定される ＤＮＡ調節領域により、その遺伝子はその遺伝子生成物の発現のために活性化さ れる。

ＤＮＡ構造体は好ましくは、ゲノム中に挿入されるそれらの要素により構造体に おいてお互いから分離されるが、好ましくは生来の遺伝子に隣接する２つの標的 セグメントを含む。

構造体はさらに好ましくは、少なくとも１種の発現可能な選択可能マーカー遺伝 子、たとえば耐ネオマイシン性を付与する遺伝子を含む。そのためのプロモータ ーを含むこのマーカー遺伝子はまた、構造体の２種の標的領域間に配置される。

もう１つの態様において、構造体は、対象の遺伝子の発現を増幅するために発現 可能な増幅可能遺伝子を含む、そのためのプロモーターを含むこの遺伝子はまた 、構造体の２種の標的領域間に配置される。多くの場合、選択可能マーカー及び 増幅可能マーカーは同じであり得る。

本発明の追加の態様においては、ＤＮＡ構造体は、そのＤＮＡ構造体が正しく挿 入されている細胞において発現されない負の選択可能マーカー遺伝子を含む。こ の負の選択可能マーカー遺伝子は、その構造体が均ｆ組換えにより遺伝子中に正 しく組合される場合、除去するために２種の標的領域外に配置される。そのよう な負の選択可能マーカー遺伝子の例は、単純ヘルペスウィルスのチミジンキナー ゼ遺伝子である。

さらにもう１つの態様においては、対象の細胞系又は微生物においてすでに生成 物を発現している特定の遺伝子の発現特徴を変性することが可能である。これは 、（１）細胞系又は微生物が増幅条件にゆだねられる場合、対象の遺伝子のコピ ー数を高める発現可能な増幅可能遺伝子及び／又は（２）たとえば転写速度を早 め、翻訳効率を高め、ｍＲＮＡの蓄積を高め、発現を誘導的にし、等により、対 象の遺伝子の発現を変性するプロモーター／エンハンサ−要素（又は他の調節要 素）を含むＤＮＡ構造体を均質組換えにより挿入することによって達成され得る 。この態様で変性される遺伝子発現は、細胞系又は微生物のこれまでの遺伝子操 作により引き起こされて来た天然の発現又は発現であり得る。これまでの遺伝子 操作は、従来の技法により又は本発明の相同的組換えによってであった。後者の 場合、発現特徴の変性をもたらすＤＮＡ挿入は、遺伝子の発現をもたらす同じ遺 伝子操作の一部として達成され得、又は続く段階として行なわれ得る。

本発明はまた、上記論議に従って調製された構造体及びそのような構造体により 相同的組換えに適切にゆだねられたゲノム並びにそれらのゲノムを含む細胞系及 び微生物も包含する。さらに、本発明の形質転換された細胞を培養することによ る所望する生成物の調製方法もまた包含される。

凹皿■呈皇星脱所 第１図は、本発明のＤＮＡ構造体の一般的な外形を示す。

第２Ａ図は、非相同又はランダム組換えの出来事におけるゲノム中へのＤＮＡ構 造体の組込みの態様を示す。

第２Ｂ図は、相同的ｍ換えの出来事におけるゲノム中へのＤＮＡ構造体の組込み の！！様を示す。

第３図は、本発明に従っての好ましい相同的組換えベクターの構成を示す。

第４図は、単にＤＮＡの単一の標的断片が使用される場合、相同的組換えによる ＤＮＡの環状断片の組込みの態様を示す。

第５図は、その制限部位を含むｐＲ３ＶｃＡＴプラスミドを示す。

第６図は、その制限部位を含むｐＲ３Ｖプラスミドの構成を示す。

第７図は、その制限部位を含むｐｓＶ２ＮＥｏプラスミドを示す。

第８図は、その制限部位を含むｐＳＶＮＥＯＢＡＭプラスミドの構成を示す。

第９図は、その制限部位を含むｐＲ５ＶＮＥｏプラスミドの構成を示す。

第１０図は、その制限部位を含むｐＲ３ＶｃＡＴＮＥｏプラスミドの構成を示す 。

第１１図は、ラットＴＳＨβ遺伝子の１５．３ｋｂフラグメント及びその覆々の 制限セグメントを示す。

第１２図は、ソ（７）制御［部位ヲｔムｐ　ＲＳ　Ｖ　ＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３ プラスミドの構成を示す。

第１３図は、その制限部位を含むｐＲ３ＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３−５Ｘｂａ　 Ｉプラスミドの構成を示す。

第１４図は、ＰＣＲ増幅のための個々のプライマーが対応するその領域にそって のＴＳＨβのヌクレオチド配列の一部を示す。エキソン２及び３は大文字で示さ れる。２４７個の塩基対の増幅されたフラグメントは、太線を引かれた星印によ り示される。

第１５図は、種々の細胞集団から抽出されたＲＮＡから合成されたｃＤＮＡのポ リアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示し、そしてそのＴＳＨβ　ｃＤＮＡは 、存在する場合、ＰＣＲにより増幅されている。種々のラインを表わす細胞の性 質がゲル下の第１５図に示される。

ましいヒ　のｉ細な記 相同的組換えは、転写的に活性的な遺伝子における変異を誘発し又は補正するた めの標的遺伝子のために過去数年間開発されて来た技法である（Ｋｕｃｈｅｒｌ ａｐａｔｃ；Ｐｒｏ　、ｉｎ　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、ａｎｄ　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、、３６：３０１　（１９８９））。この相同的組換えの技法は、哺乳 類ゲノムの特異的領域中への特異的変異の導入方法として（Ｔｈｏｍａｓなど、 、Ｃｅ１ｌ、４４：４１！９〜４２８，１９８６；Ｔｈｏｍａｓ　ａｎｄ　Ｃａ ｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅ１ｌ、５１：５０３〜５７８．１９８７；Ｄｏ　ｅ　ｔ　ｓ 　ｃ　ｈｍａ　ｎなど、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃｏｄ。

Ｓｃｉ、、８５：８５８３〜８５８７．１９８８）又は欠陥遺伝子内での特異的 変異を補正するために（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎなど、、Ｎａｔｕｒｅ、３３０： ５７６〜５７８．１９８７）開発された。

この技法を通して、ゲノム中に挿入したいＤＮＡの断片は、それを“標的ＤＮＡ ”に結合することによって対象の遺伝子の特異的領域に向けられ得る。“′標的 ＤＮＡ”とは、ゲノムＤＮＡの領域に相補的（相同）であるＤＮＡである。−末 鎖ＤＮＡの２つの相同断片（すなわち標的ＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ）がひじょう に隣接して存在する場合、それらは二本鎖へリソクスを形成するためにハイブリ ダイズするであろう。

ゲノム中に挿入することが所望されるＤＮＡ配列は、その標的ＤＮＡに結合され る。

相同的組換えが生じ得る多くの方法が存在する。１つの例は、細胞中での有糸分 裂の間、ＤＮＡの複製の工程である。

完全には理解されていない機構を通して、親二本ｉＤ　ＮＡは、複製バブルと呼 ばれる局部領域で、細胞分裂のすぐ前で開環される。２種の分離されたＤＮＡの 鎖は、新規ＤＮＡ鎖が合成される鋳型として作用することができる。複製フォー クの１つのアームは、５′から３′方向にＤＮＡコードを有し、それは酵素ＤＮ Ａポリマラーゼが“読取る”ことができる適切な配向である。この酵素は一本鎖 ＤＮＡの５′部分に結合し、そして鋳型としてその鎖を用いて、相補的ＤＮＡＩ を合成し始める。ＤＮＡの他の親類は、３′から５′の方向にコードされる。そ れはＤＮＡポリマラーゼによりこの方向で読取られ得ない。複製するこのＤＮＡ 鎖のためには、特別な機構が生じるはずである。

特殊化された酵素、すなわちＲＮＡプライマーゼは、ＤＮＡの３′から５′の鎖 にそれ自体結合し、そしてその鎖にそっである間隔で短いＲＮＡプライマーを合 成する。プライマーとしてそれらのＲＮＡセグメントを用いて、ＤＮＡポリマラ ーゼはプライムされたＤＮＡに結合し、そして５′から３′の方向にＤＮＡの相 補的断片を合成する。新しく合成されたＤＮＡのこれらの断片は、オカザキフラ グメントと呼ばれる。

全反応の開始を担当するＲＮＡプライマーは、ＤＮＡポリマラーゼのエキソヌク レアーゼ機能により除去され、そしてＤＮＡにより置換される。この現象は、ポ リマラーゼが、局部的合成工程が停止するＤＮＡのプライムされていない長さに 達するまで続く。従って、相補的親類は３′から５′の方向に全体的に合成され るが、それは実際、５′から３′の方向に“バンクスティチ（ｂａｃｋｓｔｉｔ ｃｈｉｎｇ）″することによって生成される。その゛ハックステイチ”工程の間 、ＤＮＡに生じ得るいづれかのニックは、いわゆるＤＮＡリガーゼと呼ばれる酵 素により閉じられる。

ＤＮＡコードの絶対的な正確さを維持するために、校正機能がＤＮＡポリマラー ゼ内に存在する。ＤＮＡポリマラーゼは、新規ＤＮＡ鎖の合成に基づいてＤＮＡ のプライムされた断片を必要とする。上記のように、これは、ＲＮＡによりプラ イムされた一本鎖ＤＮＡ又はＤＮＡの相補的鎖であり得る。

ＤＮＡポリマラーゼがＤＮＡの相補的断片をミスマ・ソチしたことが見出された 場合、それはエンドヌクレアーゼとして作用し、そしてそれが完全な対合に再び 達するまで、３′から５′の方向にＤＮＡ塩基を除去することができる。

この背景１より、本明細書に記載される技法の基本を理解することが可能である 。ゲノムの特定領域に対して相補的である標的ＤＮＡの小さな断片が、ＤＮＡ複 製工程の間、親類と接触せしめられる。それは、共有される相同領域を通してＤ ＮＡの他の断片とハイブリダイズし、そして従って組換えするために細胞中に挿 入されたＤＮＡの一般的な性質である。

この相補的鎖が変異又はＤＮＡの異なった配列を含むオリゴヌクレオチドに結合 される場合、それは組換えの結果として新しく合成された鎖中に組込まれる。校 正機能の結果として、そのＤＮＡの新規配列が鋳型として作用することが可能で ある。従って、トランスフェクトされたＤＮＡはゲノム中に組込まれる。

特定遺伝子の配列が知られている場合、遺伝子の選択された領域に対して相補的 であるＤＮＡの断片が、たとえば対象の領域の境界を示す特異的認識部位で生来 のＤＮＡの適切な制限により合成され又は得られる。この断片は、細胞中への挿 入に基づいて標的装置として作用し、そしてゲノム内でその相同領域にハイブリ ダイズするであろう。

このハイブリダイゼーションがＤＮＡ複製の間に生じる場合、このＤＮＡの断片 及びそれに結合されるいづれか追加の配列は、オカザキフラグメントとして作用 し、そして新しく合成されたＤＮＡの娘鎖中にバックスティチされるであろう。

本発明の技法においては、これらの標的ＤＮＡの断片に、細胞内に存在する核調 節タンパク質及び場合によっては、増幅可能で且つ選択可能なりＮＡママ−−と 相互作用することが知られているＤＮＡの領域が結合される。従って、特定タン パク質の発現は、遺伝子自体及びマーカーＤＮＡをコードするＤＮＡのトランス フェクシヨンによってではなく、むしろ、転写のための認識できるシグナルを遺 伝子に付与するＤＮＡＪ節セグメントにより結合される標的ＤＮＡ　（対象の内 因性遺伝子と相同性の領域）の使用により達成され得る。この技法により、その 遺伝子を実際にトランスフェクトしないで、細胞タイプ内に存在するいづれかの 同種遺伝子を発現し、そして増幅することが可能である。さらに、この遺伝子の 発現は、その遺伝子の一部又はｃＤＮＡよりもむしろ完全なゲノムＤＮＡにより 制御され、従って転写の速度及びｍＲＮＡプロセッシングの効率を改良する。さ らに、細胞タイプ内に存在するいづれかの同種遺伝子の発現特徴は、ＤＮＡ調節 セグメントの適切な挿入により及び対象の遺伝子の完全なコード部分の挿入を伴 わないで変性され得る。

本発明のこれらの観点によれば、分化された細胞系内で、対象の通常転写的に不 活な遺伝子を発現し、又は対象の内因的に発現する遺伝子の発現を変性するため の新規方法が提供される。発現され、又は変性されたそれらの発現を有すること が所望される同種ゲノム配列が、細胞内での遺伝子の発現を指図し、又は変性す るために必要な細胞特異的ＤＮＡ配列（調節及び／又は増幅セグメント）により 供給されるであろう。得られるＤＮＡは、異種（同種ＤＮＡ配列に対して）調節 及び／又は増幅セグメントに操作的に直接的に結合される所望するタンパク質を コードするＤＮＡ配列を含むであろう。

正の選択マーカーは、場合によっては、得られる細胞のスクリーニングを促進す るために構造体内に含まれる。いづれの選択可能マーカーでも使用され得るが、 耐ネオマイシン性遺伝子の使用が好ましい。負の選択マーカーも、場合によって は使用され得る。たとえばヘルペス単純ウィルスのチミジンキナーゼ（Ｈ３Ｖｔ ｋ）遺伝子は、ランダムに組込まれたベクターＤＮＡに対して選択するマーカー として使用され得る。

融合されたＤＮＡ又は存在する発現ＤＮＡは、標的ＤＮＡが増幅可能なマーカー に結合される場合、増幅され得る。

従って、本発明の方法によれば、その特定の真核細胞系、特に分化された細胞系 に存在する場合に通常発現されるいづれかの遺伝子は、その遺伝子が不活性な形 で存在する、その遺伝子に対して特異的でない細胞系における発現を余儀なくさ れ得る。これは、その遺伝子のための十分なりＮＡ配列を実際に挿入しないで生 じる。さらに、その遺伝子、又は通常発現する遺伝子は、増強された発現速度の ために増幅され得る。さらに、完全には転写的に不活性でない遺伝子の発現特徴 は、微生物における遺伝子の発現特徴を変性できるように変性され得る。

本発明の１つの態様において、対象の特定遺伝子を含むが、しかし通常転写しな い真核細胞は、本明細書に記載される技法により転写するように誘導される。下 記相同組換えベクターはクローン性細胞系中に挿入され、そして化学的選択に従 って、いづれか適切な手段により、たとえば新しく活性化された遺伝子から転写 されるｍＲＮＡの検出、特定の遺伝子生成物の免疫学的検出又は特定の遺伝子生 成物についての機能的アッセイにより特定の遺伝子生成物の生成についてモニタ ーされる。

相同的組換えにより内因性遺伝子を転写的に活性化するために使用されるＤＮＡ 構造体の一般的な外形が第１図に示される。

一般的に、ＤＮＡ構造体は、少なくとも２種〜６種までの又はそれ以上の別々の ＤＮＡセグメントを含む。そのセグメントは、発現されることが所望される遺伝 子内の又はその遺伝子に最っとも近い細胞ゲノムの領域に相同の少なくとも１種 、好ましくは２種のＤＮＡ標的セグメント（Ａ及びＢ）、正の選択遺伝子（Ｃ） 、増幅可能な遺伝子（Ｄ）、負の選択遺伝子（Ｅ）及びトランスフェクトされる べき細胞において転写的に活性的であるＤＮＩＭＩ節セグメント（Ｆ）を含んで 成る。本発明の最っとも基本的な態様においては、単に、単一の標的セグメン） 　（Ｂ）及び調節セグメン）　（Ｆ）が存在すべきである。他の領域のすべては 任意であり、そして好ましい構造体を生成する。

領域Ａ及びＢは、転写的に活性化される対象の内因性遺伝子の領域に相同である ＤＮＡ配列である。内因性遺伝子の特定領域Ａ及びＢは、挿入されるべき調節セ グメントのために所望される特定の位置でのそれぞれ上流及び下流に存在するよ うに選択される。これらの領域は構造体において分離されるが、それらは好まし くは内因性遺伝子において隣接する。

ゲノムの非隣接部分が標的セグメントとして利用され、たとえばゲノムの一部、 たとえば負の調節セグメントを削除することが所望される出来事が存在し得る。

２種の標的領域、Ａ及びＢは、相同の全領域を高め、そして従って組換え効率を 高めるために好ましいが、本発明の方法はまた、単一の標的領域の使用も包含す る。その単純な形においては（調節セグメントＦ及び選択可能マーカー遺伝子Ｃ 及びプロモーターＣ′のみが挿入される予定である場合）、標的ＤＮＡと共にそ れらの要素を含むＤＮＡの環状断片が使用される。この手段においては、相同領 域（Ｂ）が、そのゲノム対応部分とハイブリダイズする。セグメントｃ’、ｃ及 びＦは、クロスオーバー出来事に続いて、同種遺伝子のＢ部分内に挿入される。

ＤＮＡＩＭ節配列が対象の遺伝子の上流に挿入されることが所望される場合、た とえば通常転写的に不活性的な遺伝子を活性化し、そして発現することが所望さ れる場合、相同の領域は好ましくは、対象の遺伝子のコード部分の上流のゲノム の非コード部分に相同である。２つの標的領域が存在する場合、下流の領域（Ａ ）はコード領域の一部を含むことができるが、但し、それはそのコード領域の完 全に上流に存在することが好ましい。相同領域は、ＤＮＡ調節配列が、特に生来 のプロモーターがターンオフされた正のプロモーターよりもむしろ負のプロモー ターである場合、対象の遺伝子のために生来のプロモーターの下流に挿入される ように選択されることがさらに好ましい。

標的領域、すなわち相同の領域の大きさは、臨界ではないが、但しより短い領域 はど、それらは相同の適切な領域を見出し、そして所望するスポットで組換えが 生じる傾向が低くなる。従って、相同領域が短いほど、相同組換えの効率がより 低くなり、すなわち都合良く組換えされるクローンの％が低くなる。配列相同の ための最少必要条件は、２５個の塩基対であることが示唆されている（Ａｙａｒ ｅｓなど、ＰＮＡΣ、ＵＳＡ、８３　：　５１９９〜５２０３．１９８６）。さ らに、構造体中の他の要素のいづれかがまた、宿主細胞のゲノムに見出される場 合、誤った場所で組換えの可能性が存在する。しかしながら、本発明の卓越した 正の及び負の選択能力の観点から、その効率が低くても、それは好都合良〈実施 され得る。両種的領域を含む相同の全領域が大きい、たとえば１〜３ｋｂである 場合に最適な結果が達成される。調節可能なセグメン）Ｆが対象の遺伝子に操作 的に結合され得る限り、標的領域及び特に上流の標的領域Ｂの大きさに対する限 界が存在しない。

標的領域が大き過ぎるか又はいなか、又は調節セグメントＦがそれに操作的に結 合される遺伝子のコード領域から遠く離れて過ぎているのか又はいなかは実験的 に容易に決定され得る。そのような場合、領域Ａ及びＢは対象の遺伝子の異なっ たセクシヨンに相同され得、そして調節可能なセグメントＦが対象の遺伝子に操 作的に結合されるように正しく挿入されるまで、その工程は反復される。たとえ ば、内因性遺伝子の組合された領域Ａ−Ｂの制限部位は変更され得、そしてその 工程は反復される。本発明の概念が本明細書に開示される技法と共に知られた後 、当業者は過度の実験を行なわないでいづれかの細胞系又は微生物における対象 のいづれか与えられた遺伝子に関して本発明を使用することができる。

領域Ｃは、トランスフェクトされた細胞系を通常毒性の環境に対して耐性にする ことができる正の選択可能マーカー遺伝子である。そのような遺伝子の例は、ア デノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）　、アミノグリコシドホスホトランスフェラー ゼ（ｎｅｏ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ヒグロマイシンーＢ− ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ｔｋ）、キサンチン −グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、複数薬物耐性遺伝子 （ＭＤＲ）、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）及びＮ−（ホスホンアセ チル）−Ｌ−アスバーシート耐性遺伝子（ＣＡＤ）である。

正の選択可能マーカー遺伝子の他に、増幅可能な遺伝子がまた、領域りで構造体 に任意に含まれる。増幅可能な遺伝子は、選択的な圧力下で、コピー数の上昇を 導びく遺伝子である。その増幅可能な遺伝子に隣接して位置づけされた遺伝子の コピー数がまた上昇するであろう。使用され得る増幅可能な遺伝子は、ＤＨＦＲ ，ＭＤＲ，ＯＤＣ，ＡＤＡ及びＣＤＡを包含する。正の選択可能マーカー遺伝子 群のメンバー及び増幅可能な遺伝子群のメンバーはオーバーラツプし、その結果 、理論的には、２種の遺伝子、たとえば正の選択のための遺伝子及び増幅のため の遺伝子を用いる代わりに、１種の遺伝子が両目的のために使用され得る。しか しながら、はとんどの細胞系はこれらの増幅可能遺伝子の内因性コピーを含むの で、細胞はその選択条件に対してすでにいく分針性であり、そしてトランスフェ クトされたＤＮＡを受容しない細胞とトランスフェクトされたＤＮＡを有する細 胞との区別は困難である。従って、たとえば増幅可能な遺伝子が所望される場合 、優性である正の選択遺伝子、たとえばＨＰＨ，ｇｐｔ、ｎｅｏ及びｔｋ（ｔｋ −細胞における）がまた、構造体に含まれるべきである。いくつかの用途のため には、増幅可能なマーカーを削除することが可能であり又は好ましい。たとえば 、対象の遺伝子は、たとえば異種ＤＮＡ調節配列による転写活性化が増幅を伴わ ないで十分である場合、増幅される必要はない。また、相同ｉ＆換え効率がひじ ょうに低い場合、非相同ＤＮＡ：相同ＤＮＡの比は相同組換え効率に直接的に関 係されるので、増幅可能遺伝子を険外することが必要である（Ｌｅｔｓｏｕ、Ｇ ｅｎｅｔｉｃｓ、ＩＩ７：７５９〜７７０．１９８７）。所望するタンパク質又 はｍＲＮＡの生成のためにスクリーニングにより、正の選択遺伝子を排除し、そ して細胞を単に選択することもまた可能である。しかしながら、はとんどの場合 、少なくとも正の選択遺伝子を含むことが好ましい。

構造体中の領域Ｅは、負の選択可能マーカー遺伝子である。

そのような遺伝子は、ＤＮＡ構造体が相同的組換えにより正しく挿入されている 細胞においては発現されないが、しかしＤＮＡ構造体が、たとえばランダム組込 みにより不適切に挿入されている細胞においては発現される。１つのそのような 遺伝子は、ヘルペス単純ウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶｔｋ）であ る。ＨＳＶｔｋは、ヌクレオチドに対して低い緊縮性を有し、そして通常の哺乳 類細胞がリン酸化できないヌクレオチド相同体をリン酸化することができる。Ｈ ＳＶｔｋが細胞に存在する場合、ヌクレオチド相同体、たとえばアシクロバー（ ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）及びガンシクロバー（ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ）がリン酸 化され、そして宿主細胞のＤＮＡ中に組込まれ、従って細胞を殺害する。負の選 択可能マーカー遺伝子の存在は、Ｍａｎｓｏｕｒなど（凡１ｔｕｎｅ、３３６： ３４８〜３５２．１９８８）により記載されるように相同組換えのために負−正 の選択の使用を可能にする。Ｃａｐｅｃｃｈｉは、線状化されたベクターＤＮＡ がランダム組込みにより挿入する場合に比べて、それが相同的組換により挿入す る場合に生じる組込みの異なった態様の利点を有する手段を使用する。ベクター ＤＮＡがランダムに挿入する場合、その挿入体の大部分は、末端を通して挿入す るであろう（Ｆｏｌｇｅｒなど、Ｍｏｌ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉ。

土、、２：１３７２〜１３８７，１９８２；Ｒｏｔｈなど、Ｍｏ１．Ｃｅｌ　１ ．Ｂｉｏｌ、、５：２５９９〜２６０７゜１９８５；及びＴｈｏｍａｓなど、Ｃ ｅ１ｌ、４４：４１９〜４２８．１９８６）、他方、ベクターが相同的！換によ り挿入する場合、それは、それらの領域の外側の配列の損失を引き起こす相同の 領域を通して組換えするであろう。

例として第１図に示される構造体を用いて、相同的組換えのための組込みｖｓラ ンダム組込みのａｍが第２Ａ及び２Ｂ図に示される。非相同的組換えの場合（第 ２Ａ図）、ベクターは、構造体の末端を通して挿入される。これは、領域Ｅ、こ の場合Ｈ３Ｖｔｋ遺伝子のゲノム中への挿入を可能にする。

しかしながら、相同的組換えが起こる場合（第２Ｂ図）、Ｈ３Ｖｔ　ｋ遺伝子は 失なわれる。第１回目の選択は、構造体内に存在する正の選択のために適切な薬 物又は条件を使用する。

相同的組換え又はランダム組込みのいづれかにより組込まれるＤＮＡを有する細 胞は、この回の選択を生存するであろう。

次に生存細胞が、薬物、たとえばＨ３Ｖｔｋ遺伝子を含むすべての細胞を殺害す るであろうガンシクロバーに暴露される。

この場合、ランダム組込みにより組込まれたベクターがＨ３Ｖｔｋ遺伝子を含む 細胞のほとんどは殺害されるが、しかし相同的組換えにより組込まれたベクター がＨ３Ｖｔｋ遺伝子を失っている細胞は生存する。これは、ランダムに組込まれ たＤＮＡを含む細胞のほとんどの排除を可能にし、相同的組換えを通して組込ま れたＤＮＡを含む生存細胞の大部分を残す。これは、正しい組換え出来事の同定 をひじょうに促進する。

負の選択段階はまた、必要なら排除され得る。それは、ポリマラーゼ鎖反応（Ｐ ＣＲ）又は免疫学的スクリーニングのような技法の必要性を包含するスクリーニ ング段階はより集中的な労力を必要とするであろう。

６番目の領域（Ｆ）は、対象の遺伝子を転写的に活性にするために使用されるＤ ＮＡ８節セグメントを含む。適切なりＮＡ調節セグメントは、使用される細胞タ イプに依存して選択される。使用される調節セグメントは、分化された宿主細胞 系における与えられた遺伝子の発現を促進することが知られているセグメントで ある。たとえば、宿主細胞系が、タンパク質、たとえば成長ホルモン及びプロラ クチンを天然で発現する脳下垂体細胞から成る場合、それらの遺伝子のいづれか のためのプロモーターは、ＤＮＡ調節要素Ｆとして使用され得る。本発明に従っ て挿入される場合、調節セグメントは、通常転写的に不活性な対象の遺伝子に操 作的に結合され、そして宿主細胞系におけるその遺伝子の転写及び／又は発現を 刺激するであろう。細胞タイプを通して作用する熱差的なりＮＡ調節セグメント 、たとえばラウス肉腫ウィルス（Ｒ３Ｖ）プロモーターもまた有用である。調節 セグメントが転写及び／又は発現を刺激し、又は本発明により対象の遺伝子に操 作的に結合されるように宿主細胞系中に挿入された後、対象の遺伝子の転写及び ／又は発現を刺激するために誘発され得る限り、それは本発明に使用され得る。

それは開始コドンが配列中に突然的に導入されていない標的セグメン）Ａに調節 セグメントＦを連結する場合、そのような発生が発現されることが所望される遺 伝子の読取り枠を変えるので、重要である。

もちろん、構造体は、調節セグメン）Ｆが対象の遺伝子に操作的に結合されるよ うに構成され、そして挿入されるべきである。

ＤＮＡ調節セグメント、すなわち領域Ｆは、たとえばそれは細胞系において天然 において発現するので又は細胞系はそのような発現を引き起こすために操作され たそのＤＮＡを前もって有しているので、対象の細胞系においてすでに発現して いる遺伝子の転写を増強し、又は増幅することが所望される場合、存在する必要 はない。そのような場合、増幅可能遺伝子、領域Ｄ、好ましくは正の選択可能マ ーカー遺伝子、領域Ｃ及び場合によってはまた、負の選択可能マーカー遺伝子、 領域Ｅの挿入は、対象の遺伝子のコピー数を高め、そして従って全体量の転写を 高めるのに十分であろう。他方、対象の遺伝子のための存在する調節領域に比べ て転写の増強された（又は変性された）速度を本質的に促進する新規調節セグメ ント、領域Ｆは、対象の存在する発現遺伝子の転写をさらに増強するために含ま れ得る。そのような新規調節セグメントは、転写効率を改良するプロモーター又 はエンハンサ−を含む。

領域Ｃ’、Ｄ’及びＥ′は、それぞれ領域Ｃ，Ｄ及び已における遺伝子を誘導す るために使用されるプロモーター領域である。これらのプロモーターは、選択さ れた細胞系において転写的に活性であり、そして対象の内因性遺伝子を誘導する ために使用される領域Ｆにおけるプロモーターと同しか又は異なったものであり 得る。第１図に特定された転写の特異的方向は臨界ではない。当業者は、対象の 遺伝子又は構造体中の他のいづれかの遺伝子の発現を同時に妨げないで、プロモ ーターがそれらの関連する遺伝子の発現を刺激するように、遺伝子Ｃ，Ｄ及びＥ 及びそれらのプロモーターＣ’、Ｄ’及びＥ′のいづれか適切な配置を決定する ことができる。

本発明は、ＧＨ，（ＡＴＣＣＣＣＬ８２）、ＧＨ３（ＡＴＣＣＣＣＬ　８２．１ ）又はＧＨ４ｃｌ細胞系（ＧＨ）においてのラットチロトロピンβサブユニット （ＴＳＨβ）活性化により例示され得る。ＧＨ細胞系は、Ｍ　ｔ　Ｔ／Ｗ５　（ Ｔ　ａｋｅｍｏｔｏ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、２２：９１７，１９６２）と命 名され、そしてＴａ５ｈｊｉａｎなど、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ　、８２：３４ ２〜３５２，１９６８により培養で増殖するように適合された、ラットにおける 放射線誘発性脳下垂体腫瘍に由来する。これらの細胞系は、成長ホルモン及びＴ ＳＨβを生成するそれらの能力についてサブクローンされ、そしてスクリーンさ れ得る。そのようなスクリーニングは、好ましくはノザンプロット分析により行 なわれ、ラット成長ホルモン遺伝子のためのｍＲＮＡが存在するかいづれかが決 定され、そして生成されるＴＳＨβ遺伝子のためのｍＲＮＡが存在しないことが 確立される。その細胞系はまた、ゲノム内に存在するＴＳＨβ遺伝子の少なくと も１つのコピーが存在することを決定するためにサガン分析によりスクリーンさ れ得る。成長ホルモンを生成し、そしてＴＳＨβを生成しないが、しかしＴＳＨ β遺伝子のコピーを含むＧＨ細胞系のみが使用される。

ＧＨ細胞に使用するための特定の相同的組換えベクターは、次の態様で企画され 得る（第３図）、領域Ａは、−７４から−２７８５に伸びるＨｉｎｄＩＩＩフラ グメントにより定義されるＴＳＨβ遺伝子の５′上流の未翻訳領域から成り、そ して領域Ｂは、−２７８５Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ部位から、さらに上流のＮｃｏ Ｉ部位に伸びる約２．１ｋｂのＤＮＡフラグメントを含むことができる（Ｃａｒ ｒなど、Ｊ、Ｂ　ｉ　ｏ　Ｉ、Ｃｈ　ｅｍ、。

２６２：９８１〜９８７．１９８７及びＣｒｏｙｌｅなど、ＤＮＡ、５：２９９ 〜３０４．１９８６）、正の選択遺伝子（領域Ｃ）は、プラスミドｐＳＶＺｎｅ ｏ（ＡＴＣＣＮｏ。

３７．１４９）に由来るす１０６７ｂｐのＢｇ　ＩＩＩ−３ｍａ　１フラグメン トであり得る（Ｓｏｕｔｈｅｒｎなど、ＪｏＭ。

１、Ａ　Ｉ、Ｇｅｎ、、１：３２７〜３４１．１９８２）。

そのｎｅｏ遺伝子は、プラスミドｐＲ３Ｖｃａｔ　（ＡＴＣＣＮｏ、３７，１５ ２）からのＮｄｅ　ｌ−Ｈｌｎｄ　ＩＮフラグメントに由来するラウス肉腫ウィ ルス（Ｒ３Ｖ）のプロモーター（６Ｊｆ域Ｃ’）により駆動され得る。この例に おいては、増幅可能マーカーは使用される必要がなく、そして従って、相同的組 換えの効率を最適化するためにＭ域りの必要性が存在しない。その効率は、構造 体に存在する非相同配列：相同配列の割合に反比例する（Ｌｅｔｓｏｕなど、Ｃ ｒｅｎｅｔｉｃｓ、１１７：７５９〜７７０．１９８７）、６Ｊ［域Ｅ又は負の 選択遺伝子は、プラスミドｐＭＣＩＴＫ　（Ｃａ　ｐ　ｅ　ｃ　ｃｈｉなど、Ｎ ａｔｕｒｅ、３３６：３４８〜３５２．１９８８）から得られる２ｋｂのＸｈｏ フラグメントであるＨ５Ｖｔｋ遺伝子から成る。その構造体におけるＨ３Ｖｔｋ 遺伝子は、Ｔｈｏｍａｓなど（Ｃｅｌｌ、５１：５０．３〜５１２，１９８７） により構成されるようにポリオーマウィルスのプロモーター及びエンハンサ−（ 領域Ｅ’）により駆動され得る。

第２のＤＮＡ構造体において、そのポリオーマプロモーターは、上記のＲ３Ｖプ ロモーターにより置換され得る。ＴＳＨβ遺伝子を活性化するために使用される ＤＮＡｆｆ１節配列は、Ｒ３Ｖ７”ロモーター又はラント成長ホルモンプロモー ターのいづれかであり得る。ラット成長ホルモンプロモーターは、プラスミドｐ ＲＣ；Ｈ２３７ＣＡ７　（Ｌａｒｓｏｎなど、且Σ旦、８３：８２Ｂ３〜８２８ ７．１９８６）から得られるＳａ　ｃ　Ｉ−Ｅｃ　ｏＲＴフラグメントから成る 。Ｒ３Ｖプロモーターは、ＧＨ細胞の他に他の細胞系において有用である利点を 有し、そしてＧＨプロモーターは、ＧＨ細胞において活性的であることが知られ ており、そして特異的に誘発され得る（Ｂ　ｒ　ｅ　ｎ　ｔなど、Ｊ、Ｂｉｏ　 １．Ｃｈｅｍ、、２６４　：１７８〜１８２．１９８９）。ラット成長ホルモン プロモーター及びＲ５Ｖプロモーターは、別々の構造体において位置Ｆで挿入さ れ得る。

ＧＨ細胞系中への上記構造体のトランスフェクションの後、その細胞はＧ４１８ を含む培地中で増殖され得る。これは、相同的組換え又はランダム組込みのいづ れかによりゲノム中にプラスミドＤＮＡを組込まれたそれらの細胞のみの増殖を 可能にするであろう。生存細胞は、ガンシクロバーを含む培地中で増殖され得る 。この回の選択を生存する細胞の大部分は、ベクタープラスミドＤＮＡが相同的 組換えにより組込まれているものであろう。これらの細胞は、それらがＴＳＨβ 遺伝子に対応するｍＲＮＡを生成し、そしてそれらがＴＳＨβタンパク質を生成 することを示すためにスクリーンされ得る。ゲノムＤＮＡはまた、適切な組換え 出来事が生じたかを確めるために異種プロモーターの挿入の部分近くを配列決定 され得る。

一ラット　垂　におけるＴＳＨ゛　云　のＳ　ヒ次の手段を用いて、ラッ）ＧＨ ，脳下垂体細胞系においては通常存在しないチロトロピンβサブユニット（ＴＳ Ｈβ）遺伝子転写を、相同的組換えの方法を用いることによってそれらの細胞中 で活性化し、ＴＳＨβコード領域の上流の活性化要素の標的を決定した。ラウス 肉腫ウィルス（ＲＳ　Ｖ）プロモーターは、Ｇ　Ｈｓ細胞において効果的に機能 することが知られており（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ　Ｎｅ１ｓｏｎなど、Ｎａｔｕｒ ｅ、３２２：５５７〜５６２　（１９８６）；Ｚｈｅｎｇ−３ｈｅｎｇ　Ｙｅな ど、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　。

ｆ　Ｂｉｏｌｏ　１ｃａｌ　Ｃｈｏｍｉｓｔｒ　、２６３ニア８２１〜７８２９ 　（１９８８））、そして従って、活性化要素として選択された。トランスフェ クトされた細胞集団の単離のために、Ｒ３Ｖ活性化要素、ＴＳＨβ遺伝子座の５ ′フランキング領域の部分及び選択可能な薬物マーカー、たとえばアミノグリコ シド　ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＮＥＯ）を含むプラスミドベクターを 構成した。リボ核酸（ＲＮＡ）を、プールされた耐薬物性Ｇ　Ｈ３細胞集団から 抽出し、そして相補的デオキシリボ核酸（ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　）に転換した。次に 、そのｃＤＮＡを、ＴＳＨβ　ｃＤＮＡの存在について、ポリマラーゼ鎖反応（ ＰＣＲ）の技法によりスクリーンした。相同的組換えベクター及び制御ベクター の構成は、実験方法及び結果と共に、下記に概略されている。

プラスミド構成 西、え（ＨＲ）バンクボーンベクター　Ｒ３ＶＣＡ工Σ旦旦Ｌ ラウス肉腫ウィルス（Ｒ５Ｖ）プロモーターを、機能的なプロモータ一単位を含 む５８０塩基対（ｂｐ）のＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを単離するこ とによって、プラスミドｐＲ５ＶＣＡＴ（Ｇｏｒｎｅｌｉａ　Ｍ、Ｇｏｒｍａｎ な７７７〜６７８１　（１９８２）（第５図）から誘導した。このフラグメント の末端を、ＤＮＡポリマラーシークレノウフラグメントを用いてプラント化し、 そしてＸｂａ　Ｉリンカ−をそのプラント末端に連結した。Ｘｂａｌ制限エンド ヌクレアーゼによる消化及びゲル精製の後、得られたフラグメントをＰＵＣ１８ のＸｂａＩ部位中に連結した。第６図に示される配向でＲ３Ｖ挿人体を有するプ ラスミドを含む細菌コロニーを、ｐＲ３Ｖと命名した。アミノグリコシドホスホ トランスフェラーゼ遺伝子（ＮＥＯ）を、ＢｇＩＩＩ及びＢａｍＨＩフラグメン ト（第７図）を単離し、そしてそのフラグメントをＰＲ３ＶのＢａｍＨ１部位（ 第６図）中に連結することによって、ｐｓＶ２ＮＥｏ　（Ｐ、Ｊ、Ｓｏｕｔｈｅ ｒｍなど、。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　ＡＬ土工エエ一旦ｌ工二 工±互ｓ、１：３２７〜３４１　（１９８２））からクローン化した。第８図に 示される配向でＮＥＯ遺伝子を含むプラスミドを取り出し、そしてｐＲ３ＶＮＥ ＯＢＡＭと命名した。そのｐＲ５ＶＮＥＯＢＡＭを、Ｓｍａ■により消化し、そ してＲ３Ｖプロモーター領域、ＮＥＯ遺伝子の大部分及びｐＵｃ１８を含む４３ ２８ｂｐのフラグメントを、ゲル電気泳動により単離した。このフラグメントの Ｓｍａｌ末端にＸｈｏｌを連結し、ＸｈｏＩ制限酵素により切断し、そしてその プラスミドを連結により再環状化した。得られたプラスミドは第９図に示され、 そしてｐＲ３ＶＮＥ。

と命名される。この最後のクローニング段階は、その機能的な発現のためには必 要でないＮＥＯフラグメントの３′末端から７８６ｂ９のフラグメントの欠失を もたらした。この構成は、ＮＥＯ遺伝子がＲ５Ｖプロモーターにより転写的に駆 動されるプラスミドを生成する。

次に、ｐＲ３ＶＣＡＴ（第５図）におけるＲ３Ｖプロモーターの５′に位置する ＮｄｅＩ部位を、５ａｌＩ部位に転換した。これは、ＮｄｅＴによりｐＲ３Ｖｃ ＡＴを消化し、ＤＮＡポリマラーシークレノウフラグメントを用いてそれらの末 端をフィルインし、そして得られたプラント末端にＳａｌ■リンカ−を連結する ことによって達成された。リンカ−を、５ａｌｌにより完全に消化し、そしてそ のプラスミドを連結により再環状化した。新しく構成された５ａｌＩ部位中に、 Ｒ３Ｖプロモーター及びＮＥＯ遺伝子を含むｐＲ３ＶＮＥ。

（第９図）からの５ａｌＩ−Ｘｈｏｌフラグメントをクローン化した。第１０図 に示されるように配向されたＲ３Ｖプロモーター及びＮＥＯフラグメントを有す るプラスミドを単離し、そしてｐＲ３ＶｃＡＴＮＥｏと命名した。このプラスミ ドは、ＧＨ：ｌ細胞中にトランスフェクトされる場合、それらの細胞に耐Ｇ４１ ８性を付与することができ、ＮＥＯ遺伝子の転写を駆動するＲ３Ｖプロモーター の能力及び機能的タンパク質中に翻訳されるそのＲＮＡの能力を示す（データは 示されていない）、上記安定したトランスフェクシントからの全体のＲＮＡを、 ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により分析し、ＣＡＴ遺伝子が転写されたかどう かを決定した。ＰＣＲ結果は、ＣＡＴ遺伝子が試験される耐６４１８性コロニー のすべてにおいて実際に転写されたことを示しくデータは示されていない）、Ｃ ＡＴ遺伝子のＲ５Ｖプロモータ５′がそれに対して３′のりに位置する遺伝子の 転写を駆動することができたことを示した。これは、このＲ３Ｖプロモーターが 、下記ＴＳＨβＨＲベクターが相同的組換によりＧＨ３ゲノム中に組込む場合、 そのＴＳＨβ遺伝子の転写の駆動を担当するであろうから重要である。

ＴＳＨＨＲベクター 相同的組換えによりＧ　Ｈｘゲノム中に組込むことができるベクターを、ｐＲ３ ＶｃＡＴＮＥｏ　（第１０図）に含まれるユニーク５ａｌＩ及びＨｉｎｄｌｌＩ 部位中にチロトロピンβサブユニッ）−（ＴＳ）ｆβ）遺伝子の５′フランキン グｇＪ域の２種の拡張部を挿入することによって創造した。λＤＡＳＨ中にクロ ーン化された１５ｋｂ又はそれ以上の挿入体を含むラット肺臓ゲノムライブラリ ーを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから得た。標準方法（ 旦且ＬＩ土ユｔ　ＰｒｏｔｏｃｏＩｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉユ土且 工ｘ、ｐｐ、１．９．１−１．１３．６，６．１．１−６．４．１０）を用いて 、第１エキソンの９ｋｂの配列５′を含むラットゲノムＴＳＨβ遺伝子の１５． ３ｋｂクローンを単離した。その１５．３ｋｂのフラグメントは、２種のＸｂａ Ｉフラグメント、すなわち１５．３ｋｂフラグメントの５′末端に対応する１０ ．６ｋｂのフラグメント及び１５．３ｋｂフラグメントの３′領域に対応する４ 、７ｋｂ断片から成った（第１１図）これらのＸｂａ　Ｉフラグメントの両者を 、ＰＵＣＩＳ中にサブクローンし、そして両配向で挿入体を含むプラスミドを単 離した。４．７ｋｂのＸｂａ　Ｉフラグメント（第１１図）に含まれる２、３ｋ ｂのＸｂａ　ｌ−Ｈｌｎｄ　Ｉｆｆフラグメントを精製し、そしてこのフラグメ ントのＸｂａ　１部位を、フレノウフラグメントによりそれらの末端をフィルイ ンし、そしてＨｉｎｄ［Ｉリンカ−上で連結することによってＨｉｎｄＨ１部位 に転換した。このフラグメントを、ｐＲ３ＶＣＡＴＮＥＯ（第１０図）に含まれ るユニークＨｉｎｄｌ１１部位中に連結した。第１２図に示されるような正しい 配向で２．３ｋｂの挿入体を有するプラスミドに対応する単離体を、ｐＲ３Ｖｃ ＡＴＮＥＯＴｓＨＢ３と命名した。

ラットＴＳＨβ細胞からのサブクローンされた１０．６ｋｂのＸｂａＩフラグメ ント（第１１図）を単離し、そしてｘｂａＴ末端を、そのフラグメントをＤＮＡ ポリマラーシークレノウフラグメントによりプラント末端化し、そして５ａｌＩ リンカ−を結合することによって５ａｌＩ部位に転換した。

次に、この１０．６ｋｂの５ａｌｌフラグメントを、ｐＲ３ＶＣＡＴＮＥＯＴＳ ＨＢ３の５ａｌＩ部位中にクローン化した（第１２図）。正しい配向でその挿入 体を含むプラスミドを同定し、そしてｐＲ３ＶｃＡＴＮＥＯＴｓＨＢ３−５χｂ ａ■　（第１３図）と命名した。後者のプラスミドを、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙ ｐｅ　Ｃａ１Ｌｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉ。

ｎ、Ｒｏｃｋｖｉ　Ｉ　Ｉｅ、ＭＤに寄託し、そして寄託番号ＡＴＣＣ４０９３ ３号を得た。この寄託のために、前記プラスミドをｐＨＲＴｓＨと命名した。こ の寄託は、ブタペスト条約のすべての必要条件に従って行なわれた。

細胞系 Ｇ　Ｈ３細胞は、放射線誘発されたラットの脳下垂体腫瘍に由来しくＢ、に、Ｔ ａｋｅｍｏｔｏ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、２２：９１７　（１９６２ ））、そしてＴａ５ｈｊｉａｎなど、、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ　、８２：３４ ２〜３５２　（１９６８）により培養増殖するように適合されたＭｔＴ／Ｗ５の サブクローンされた集団である。Ｇ　Ｈ３細胞をＡＴＣＣ細胞バンクから得、そ してダルベツコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１５％・馬血清（Ｈ３）＋２． ５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋１％Ｌ−グルタミン（Ｇｌ（３培地）中で３７° Ｃで５％ＣＯ２において増殖することによって培養維持する。

ＤＮＡ調製 プラスミドＤＮＡの　ｉＴｌ 安定したトランスフェクションのために使用されるすべて１．７．１−１．７． ２に記載されるように大規模なプラスミドＤＮＡ精製のためにアルカリ溶解方法 を用いて精製した。

そのアルカリ溶解方法により単離されたＤＮＡを、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏ ｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＢ’１ｏｌｏ　、第１巻、ｐｐ、　Ｌ、　 ７．５−１．７．７に記載されるように塩化セシウムグラジェントでの二重バン ディング（ｄｏｒｉｂｌｅ　ｂａｎｄｉｎｇ）によりさらに精製した。

トランスフェクションの前、ＨＲベクターを、Ａａｔｌｌ又はＡｐａｌのいづれ かにより消化した。Ａｐａｌを用いて、対照のプラスミドｐＲ３ＶｃＡＴＮＥｏ を線状化し、そしてＡａｔｌｌを用いて、ＨＲプラスミドｐＲ３ＶＣＡＴＮＥＯ ＴＳＨＢ３−５Ｘｂａ　Ｉを線状化した。ＡｐａＩ及びＡａｔｌＩの切断部位の 位置は、それぞれ第１Ｏ及び１３図に見出され得る。適切な制限酵素による消化 の後、その反応をフェノールクロロホルム抽出し、クロロホルム抽出し、エタノ ール沈殿化し、そして７０％エタノールにより１度洗浄した。次に、プラスミド を、脱イオン水（ｄＨ２０）に再懸濁し、ＯＤ、、。

での吸光度により測定される場合、１Ｍｇ／μｍの濃度にした。トランスフェク ション効率及び／又は相同的組換え陽性：ランダム組込みによる陽性の比を高め るために、ｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３−５Ｘｂａ　ＩをＡｐａｌにより消 化した。Ａｐａｌによる消化は、ｐＲ３ＶｃＡＴＮＥＯＴｓＨＢ３−５Ｘｂａｌ において３種の別々の部位で切断し、そして相同的組換えのために必要なものを 除く、すべてのベクターＳＮ域を除去する（第１３図）、Ａｐａｌによる消化の 後、その反応を０．８％アガロースゲル上で電気泳動し、そしてＴＳＨβ遺伝子 の２つの５′フランキング領域、Ｒ３Ｖプロモーター−ＮＥＯ碩域及びＴＳＨβ 遺伝子−活性化Ｒ３Ｖプロモーターを含む１０．９９２りρのフラグメントに対 応する上部バンドを、透析管への電気溶出によりゲルがら単離した。

電気溶出されたＤＮＡを、製造業者の標準の方法により、ｅｌｕｔｉｐ　ｍｉｎ ｉｃｏｌａｍｎ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ）を用いるこ とによってさらに精製した。ＤＮＡを、そのカラムがら溶出し、エタノール沈殿 し、７０％エタノールにより洗浄し、そして再懸濁し、１Ｍｇ／μＩの濃度にし た。

安定トランスフェクション リン　カルシウムトランスフェクショントランスフェクションの４８時間前、３ Ｘ１０ｈ個のＧＨ。

細胞を、１０ｃＩの皿上にプレートした。個々の皿のために、ベクターＤＮＡ１ ０μｇ及び音波処理されたサケ精子ＤＮＡ３０μｇを、トランスフェクション緩 衝液０．５ｍｌに添加した。トランスフェクション緩衝液は、ＮａＣｌ４ｇ、ｋ ｃｌＯ８１８ｇ、０１０５ｇのＮａ２ＨＰＯ，、デキストロース０．５ｇ、ＨＥ ＤＥ３２．５ｇをｄＨｚＯと共に組合シテ５０Ｑａ＋２の最終体積にし、そして そのｐＨを７．５にすることによって調製された。３１１！Ｉの２ＭのＣａ　Ｃ Ｉ　ｚを、ＤＮＡ０．５層１＋−）ランスフェクション緩衝液に添加し、そして 撹拌した。この溶液を、室温で４５分間静置した。ＤＮＡ−Ｃａｃｌ、−トラン スフェクション緩衝液が準備された後、ＧＨ１培地をＧＨ３細胞から除き、そし テＤ　Ｎ　Ａ　Ｃａ　ＣＩ　ｚ−トランスフェクション緩衝液を細胞上に被覆し た。細胞を室温で２０分間静置した。２０分後、５１のＧＨ□培地を添加し、そ してプレートを３７°Ｃで６時間インキュベートした。

次に、培地をアスピレートし、そして１５％グリセロールを含む新鮮なトランス フェクション緩衝液５ｍｌを３．５分間にわたって添加することによってショツ クをその細胞に与えた。

細胞をＰＢＳにより２回すすぎ、そしてＧＨ，培地１０ｉ１を供給した。トラン スフェクションの４８時間後、培地を除き、そして４０ｃＩｇ／ｎ＋ｌのＧ４１ ８を含むＧＨ，培地１０ａ＋１を添加した。

エレクトロポレーション エレクトロポレーションを、３．５ＷＩ＋のギャップの電極を有するＢＴＸ３０ ０Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｒを用いて行なった。対数相で増殖するｌＸｌ０？個の ＧＨ，細胞を、トリプシン処理によりそれらのプレートから除去し、遠心分離に よりペレット化し、そしてＰＢＳにより１度洗浄した。細胞を、ＰＢＳＩ、Ｏｉ ｌに再！Ａ％し、そして氷上２．　９ＩｌｌのＵｌｔｒａ−ＵＶ（吏いＩ舎でキ ュベツト（Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）に移 した。ＤＮＡ１０μｇを細胞に添加し、混合し、そして氷上に５分間戻した。５ 分後、電極をチャンバーに配置し、そして細胞を、７５０μフアラド及び２００ ｖのパルスの設定下でエレクトロボレートした。そのキュヘットを１０分間氷上 に戻した。細胞を、１５１の円錐形管において室温で１％ペニシリン及び１％ス トレプトマイシンを含む（１，Ｈ３培地９１に前記キュヘットから移した。ｌＸ １０７個の細胞の全体のエレクトロポレーションを、３個の１０ｃｍプレートに 移し、約３Ｘ１０ｂ個の細胞／プレートを付与した。４８時間後、４０ｃＩｇ／ ｉｆのＧ４１８を含むＧＨ，培地を添加した。

ＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３−５Ｘｂａ　Ｉ　Ａａ　ｔＨ）、　Ｒ５ＶＣＡＴ ＮＥＯＴＳＨＢ３−５ＸｂａＩ　ＡａＩ　）　び　Ｒ５ＶＣＡＴＮＥＯ（Ａ　ａ 　Ｉ　によるＧ　Ｈ３のトランスフェクション ｐＲ３ＶｃＡＴＮＥＯＴｓＨＢ３−５Ｘｂａ　Ｉ　（Ａａ　ｔｌｌ切断）　、ｐ Ｒ３ＶｃＡＴＮＥＯＴｓＨＢ３−５Ｘｂａ　Ｉ　（Ａｐａｌ切断）及びｐＲ３Ｖ ｃＡＴＮＥｏ　（Ａｐ　ａ　Ｉ切断）プラスミドを、リン酸カルシウム法及びエ レクトロポレーション法の両者を用いて、ＤＮＡ対照と共にＯＨ，細胞中にトラ ンスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞をＧ４１８選択下 に置いた。約１４〜２１日後、コロニーは１０ｃｍの皿上で眼により見えるよう になり、そして計数した。ＤＮＡ対照のすべてにおいては、眼に見えるコロニー は存在せず、これは、６４１８選択が作用し、そしてＲ３Ｖ−Ｎ　Ｅ　ＯｔｉＩ 域を含むプラスミドの存在が６４１８耐性を付与するために必要であることを示 す。この時点で、コロニーを取り、そして１７ＩＩ１１の幅のクローニング環を 有する１０ｃｍの皿上の領域を単離することによってプールした。これらの大き なりローニング環は、プレート当たりのコロニーの密度に依存して１０〜７０個 のコロニーを包含し、そしてその単離された領域におけるＧＨ，細胞の除去を可 能にし、そして同時に、トリプシン処理によりプールした０個々の環におけるト リプシン処理されたコロニーを、６ウエルプレートに移し、そしてＧ４１８を含 むＧＨ３培地での増殖を可能にした。７０％〜８０％の集密性に達した後、８０ ，０００個の細胞を２４ウエルプレートに移し、そして残る細胞を後でさらに試 験するために凍結保存した。２４ウエルプレートにおける細胞を、それらが５０ ％〜８０％の集密性に達するまで増殖せしめた。次に、全体のＲＮＡをそれらの ＧＨ，細胞から次の方法により収穫した。

２４ウエルプレートにおいて増殖されたトランスフェクトされたＧ　Ｈ３細胞か らのＲＮＡ単離 次の方法は、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ　ａｎｄ　５ａｃｃｈ　ｉ、Ａｎａ　ｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１６２　：　１５６〜１５９　（１９８７）により記載され る方法の改良である。２４ウエルプレートにおけるＧＨ，細胞を被覆する培地を 除去し、そして細胞をＰＢ３１ｍｌにより洗浄した。ＧＴＣ溶液溶液１壱ｌ加し 、そして細胞を室温で５分間インキュベートした。ＧＴＣ溶液を、ｄ　Ｈｚ　Ｏ ２９３ｍｌにグアニジウムチオシアネート（Ｆｌａｋａ）２５０ｇを溶解し、そ して次に０．７５μのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）１７．６ｍｌ及び１０ ％のサルコシル（Ｌ−ラウリルサルコシン）　２６．４　ｍｌヲｌｆ’ｍするこ とによって調製した。使用のすぐ前、ＧＴＣ溶液５０ｍ１当たりβ−メルカプト エタノール３６０μＩを添加した。室温で５分後、ＣＴＣ−細胞溶解物１ａ＋１ を、ＧＴＣ溶液溶液２壱ｌむ５ａｒｓｔｅｄｔ５５．５１８スナップ−キーｔ− ７１管に移した。個々の管に、２μの酢酸ナトリウム（ｐＨ４，０）３００μｌ を添加し、そしてその管を攪拌した。次に、ｄＨｚｏ飽和フ飽和フェノール３添 ｌし、そして再びその管を攪拌した。個々の管に、クロロホルム：イソアミルア ルコール（４９：１）溶液６００μＩを添加し、そして管を手により１０秒間、 振り、そして氷上に１５分間１いた。次に、管を、４℃で２０分間、８０００回 転／分（ＲＰＭ）で５Ｍ２４０−ターを用いて５ｏｒｖａｌ　ＲＣ−５Ｂ中にお いて遠心分離した。水性相を、イソプロパツール３ｍｌを含む新しい５ａｒｓＬ ｅｄｔ管に移し、そして−２０°Ｃで１時間置いた。

１時間後、管を、４℃で２０分間、８０００ｒｐｍで３Ｍ２４０−ターを用いて ５ｏｒｖａｌ　ＲＣ−５Ｂ中で回転せしめた。上清液を除去し、そしてペレット をＧＴＣ溶液５００μｌに再懸濁した。再懸濁されたＲＮＡを、１．５１のエベ ンドーフ（ｅＰＰｅｎ　ｄｏｒｆ）管に移し、それにイソプロパツール５００μ ｍを添加した。その管を、もう１度−２０°Ｃで１時間静置した。エペンドーフ 管をマイクロフユージ中で５分間回転せしめ、そして上清液を除去した。ペレッ トを７０％エタノールにより２度洗浄し、そしてエタノールが完全に蒸発するま で乾燥せしめた。ペレットを、水により処理されたジエチルピロカーボネート（ ｃｌｅｐｃ）２０μＩに再懸濁し、そして６５°Ｃで５分間加熱した。次にこの ＲＮＡを用いて、下記２種の方法の１つでｃＤＮＡを製造した。

ｃＤＮＡ反応 方よｈｔ 第１　′ｇｉｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを、１０〜２０μｌの反応体積中、合計ＲＮＡ（約 ０．５〜６μｇ）２．５〜６．０μｌから合成した。

合計ＲＮＡを、上記抽出方法により得、そして７０　’Ｃで５〜１０分間変性せ しめ、そして反応成分を添加する前、氷上ですばやく急冷せしめた。その反応条 件は、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８−３）、１０ｍＭのＭｇＣＩｚ　、 １０ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭの個々のｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴ ＴＰ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、４０ｍＭのｋｃｌ。

５００単位／＋＊ｌのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）、８５ μｇ／ｍｌのオリゴ（ｄＴ）　１２−１８　（Ｃ。

１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｉｎｃ、）及び３７℃で６０分 間インキュベートされた１５，０００〜２０．０００単位／１のＭｏ１ｏｎｙネ ズミ白血病ウィルス逆転写酵素（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）であった。反応を、４０ｍＭのＥＤＴＡを添加することに より停止し、そして核酸を、０．３Ｍの濃度の酢酸ナトリウム及び２体積のエタ ノールを添加することにより沈澱せしめた。沈澱物をＯ″Ｃで３０分間形成せし め、そして１４．０００ｒｐ１１で３０分間、ｍｉｃｒｏｒｕｇｅ中においての 遠心分離によりペレット化した。ペレットを７０％エタノールにより洗浄し、乾 燥せしめ、そして１５〜２５μｌの体積のｄｅｐｃ処理された水に再懸濁した。

方完Ｌ％ ＲＮＡからのｃＤＮＡの第１鎖の合成のための条件は、Ｃａｒｏｌ　Ａ、Ｂｒｅ ｎｎｅｒなど、Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎ±土且盈土、第７巻、第１０号、１０９６〜 １１０３ページ（１９８９）から適合せしめられた。上記方法により調製された ＲＮＡからの合計ＲＮＡＩμｍを、０．５ｍｌのエペンドーフ管中における反応 緩衝液９μＩに添加した。その反応緩衝液は、２００単位のＭｏ１ｏｎｅネズミ 白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶＲＴ　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈ　Ｌａｂｓ）及び次の試薬の最終濃度から成る＝７０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、 ｐＨ８，８，４０ｍＭのｋｃｌ。

０゜１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，１ｍＭの個々のｄＮＴＰ、４ｍＭのＭｇ Ｃ１，及び０．４５ＵＤ２．。単位のランダムヘキサマー（Ｐｈａ　ｒｍａ　ｃ 　ｉ　ａ）。混合の後、管を室温で１０分間インキュベートし、そして次に、４ ２°Ｃで１時間置いた。１時間後、管を９０“Ｃで１分間加熱し、ＭＭＬＶＲＴ を不活性化し、そして次に室温に冷却した。

ＧＨ，細胞からのＲＮＡのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅 次のプライマーを用いて、相同的組換えにより内因性ＴＳＨβ遺伝子を活性化す るＨＲプラスミドの結果としてＧ　Ｈ３細胞により生成されたＲＮＡ転写物から 合成されたＴＳＨβｃＤＮＡを、ＰＣＲにより増幅した。

プライマー　５′　３・ 第１４図は、個々のプライマーが応答するＴＳＨβ遺伝子の領域を示す。

ＰＣＲ反応条件 すべてのＰＣＲ反応を、Ｅｒｉｃｏｍｐ　Ｔｗｉｎｂｌ。

ｃｋ熱サイクラ−（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅａｒ）で行なった。ＰＣＲ増幅が方 法２により製造されるｃＤＮＡに対して行なわれる場合、４０μｍの追加の反応 ミックスを、ｃＤＮＡ反応物１０μｌに添加し、合計体積を５０μｌまでにした 。

その５０μｌにおける試薬の最終濃度は、７０ｍＭのトリス−ＨＣＩ　（ｐＨ８ ，８）、４０ｍＭのＫｃｌ、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，２，２５単 位のＴａｑポリマラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、０．２μＭの個々のプライマ ー、２００　ｕＭの個々のｄＮＴＰ及び０．８ｍＭのＭｇｃ１２であった。

ＰＣＲが上記方法１により製造されるｃＤＮＡに対して行なわれる場合、再懸濁 されたｃＤＮＡ５〜１０μｌを、次の最終濃度の成分を含む反応ミックス４０〜 ４５μＩに添加したニア０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８，８，４０ｍＭのＫＣ ｌ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，２，２５単位のＴａｑポリメラーゼ、０ ．２μＭの個々のプライマー、２００μＭの個々のｄＮＴＰ及び０．８ｍＭのＭ ｇｃｌ□。

次に反応を次のＰＣＲサイクルにゆだねた。

９４°Ｃで１分間、 ５５°Ｃで３０秒間、 ７２゛Ｃで２分間。

上記サイクルを３０〜４０回くり返した。１０μｍの個々の反応ミックスを、６ ％ポリアクリルアミドゲルにかけ、そしてＴＳＨβのための適切にスプライスさ れたｍＲＮＡの存在を示す２４７ｂｐのＰＣＲフラグメントの存在についてスク リーンした。

ＧＨ３細胞及びラット下垂体の合計ＲＮＡからのＴＳＨβＲＮＡの増幅のための ＰＣＲ結果 ＧＨ３細胞が通常ＴＳＨβ　ＲＮＡを合成するかどうかを決定するために、トラ ンスフェクトされていないＧＨ，細胞からのｃＤＮＡ及びラット下垂体からのｃ ＤＮＡを、上記ＰＣＲ反応条件にゆだねた。ＴＳＨβ　ｍＲＮＡの存在を示す正 しい２４７ｂｐのバンドがラット下垂体サンプルの正の対照に見出されたが、し かし６０サイクルの後でさえ、ＧＨ３細胞からの合計ＲＮＡサンプルからはバン ドは見出されなかった（データは示されていない）。

トランスフェクション結果 １０ｃｍの皿上に存在するＧ４１８耐正コロニーの数を、培地に６４１８の添加 後１４〜２１日間にわたって表化した。

トランスフェクション法　１０ｃｍの皿当た　のコロニーリン酸カルシウム１　 ４８　１３　２９リン酸カルシウム２　２１　５８ エレクトロポレーション１−　１２９５　４１５エレクトロポレーシヨン２　− 　１０５１　７２３全体のＲＮＡを、上記のようにして２４ウエルプレートに含 まれるコロニーブールから収穫した。ｃＤＮＡを、これらのＲＮＡ調製物から製 造し、そしてＰＣＲ増幅にゆだねた。

ＴＳＨβ　ｍＲＮＡを生成する正のコロニーの数を、ポリアクリルアミドゲル上 で可視化されるような２４７ｂｐのフラグメントの存在により決定した。スクリ ーンされた個々のプールから、１０〜７０個のコロニーを得た。推定されるコロ ニーの数／ブール／トランスフェクションを用いて、ＴＳＨβ遺伝子転写が活性 化されているＧ４１８耐性Ｇ　Ｈ：＋細胞クリーンの数を評価した。プールが陽 性であると試験された場合、それは、その特定のプールに存在する１つの陽性コ ロニーを表わすことが推定された。

プラスミド　Ｇ４１８耐性コロニー　旦Ｂ　ＲＮＡ　ｔ’ＩＰＲＳνＣＡＴＮＥ Ｏ６００ ＰＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＩ（８３−５ＸＢＡ１　４９４２　３（Ａａｔ２消化 された） ＰＲ３ＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３−５ＸＢＡ１　８５８０　６（Ａｐａｌ消化さ れた） これらの結果は、本発明の方法による通常転写的に不活性なＴＳＨβ遺伝子の好 都合な活性化を示す。ＴＳＨβ転写のために陽性であるコロニーの数は、Ｇ４１ ８耐性であるコロニーの数に比較して少数であるが（１０’個のＧ４１８耐性コ ロニー当たり約１個）、この結果は一般的に、他の相同的組換え実験のために報 告される速度と一致する（Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｋｒ相同的組換え速度は、標的決定 された遺伝子の転写の割合に比例すると思われることが一般的に観察された（Ｍ 、Ｆｒｏｈｍａｎ伝子に対して生じるランダム変異のために予測される速度より も３倍程度早いことが注目されるべきである。

個々のコロニープールについての結果が再生可能であり、そしてＲＮＡ転写の活 性化が安定していることを確かめるために、第１回のスクリーニングで陽である と試験されたプールに対応する前もって凍結されたコロニーブールを融解し、そ して培養により拡張した。新しく融解されたＧＨ，陽性プールを、Ｔ２５組織培 養フラスコに接種し、そして細胞が７０％〜８０％の集密性に達するまで拡張し た。次に、８０゜０００個の細胞を、個々のフラスコからの２４ウエルプレート にプレートし、そしてそれらが５０〜７０％の集密性に達するまで増殖せしめた 。ＲＮＡを、細胞から抽出し、ｃＤＮＡに転換し、そして６％ポリアクリルアミ ドゲル上に個々のＰＣＲ反応物ｌＯμｌを負荷することによってＴＳＨＢ　ＲＮ Ａの存在についてもう１度スクリーンした。第１５図は、エチジウムプロミド染 色及び蛍光によりポリアクリルアミドゲル上で可視化される場合の第２スクリー ンからの代表的なＰＣＲ反応の結果を示す。レーン１．２及び３は、ｐＲ３ＶＣ ＡＴＮＥＯによりトランスフェクトされたＯＨ３細胞からのｃＤＮＡに対して行 なわれたＰＣＲ反応物を含む。ｐＲ３ＶＣＡＴＮＥＯはＴＳＨＢに相同の領域を 含まず、そして従って、相同的組換えによりＴＳＨβ遺伝子を活性化することは できない。第１５図におけるゲル上に見出されるように、ＴＳＨβ遺伝子が活性 化されないことを示すそれらのレーンにおける２４７ｂｐに対応するバンドは存 在しない。レーン６はまた、負の対照を含む。そのレーンにおいては、３種のプ ールが、ｐＲ３ＶｃＡＴＮＥＯＴｓＨＢ３−５Ｘｂａ　Ｉ　（ＡｐａＩ切断）に よりトランスフェクトされているが、しかし第１スクリーニングに基づ＜ＴＳＨ β遺伝子の転写のためには陰性であるＧＨ，細胞のサンプルから組合された。レ ーン６における２４１ｂｐのフラグメントの不在は、ゲノム中にランダムに組込 まれたトランスフェクトされたｐＲ３ＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３−５Ｘｂａ　Ｔ 　（Ａｐａ　Ｉ切断）プラスミドの存在が２４７ｂｐのＴＳＨＢ　ＰＣＲフラグ メントを生成することができないことを示す。レーン７．８．９及び１０は、う ７）下垂体から収穫された合計ＲＮＡから製造されたｃＤＮＡに対して行なわれ たＰＣＲ反応物を、それぞれ反応当たり２５ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ及び ４００　ｎｇ（７１量で含む。通常ＴＳＨβを発現するラット組織から調製され たｃＤＮＡから生成された、予測される２４７ｂρのバンドのこれらのレーンに おける存在は、ＰＣＲ反応条件が正しく最適化され、そして相同的組換えＴＳＨ β陽性を含むレーン４及び５に得られるＰＣＲバンドが正しい大きさのものであ ることを示した。

第１スクリーンにおいて陽性であるｐＲ３ＶｃＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３−５Ｘｂａ 　Ｉ　（Ａｐａ　Ｉ切断）によりトランスフェクトされた２種のプール、すなわ ちレーン４におけるＡｐａＩ−１０７及びレーン５におけるＡｐａＩ−１３６は 、ＴＳＨβ遺伝子の転写が安定して活性化されたことを示すそれらのプールから の合計のＲＮＡ抽出物から製造されたｃ　Ｄ　Ｎ　Ａから増幅された正しいＴＳ ＨＢ　ＰＣＲバンドの存在により示されるように、ＴＳＨβ遺伝子活性化のため に陽性であることを再び示した。前の陽性Ａｐａｌ−１０７及びＡｐａＩ−１３ ６からのＲＮＡを含むレーン４及び５における２４７ｂρでのバンドの存在及び レーン１〜３におけるｐＲ５ＶＣＡＴＮＥＯＩ−ランスフェクトされたＧＨ，細 胞の負の対照及びレーア６におけるｐＲ５ＶｃＡＴＮＥＯＴｓＨＢ−３−５Ｘｂ ａｒ（ＡｐａＩ切断）トランスフェクトされた負の対照におけるバンドの不在は 、前記ＲＮＡを通常生成しない細胞系におけるＴＳＨＢ　ＲＮＡの生成が相同的 組換えにより安定して開始されたことを示した。

本発明は、本明細書に記載される細胞系に限定されない。

すべての細胞系は、通常不活性である遺伝子情報を有する。

はとんどは、一定の遺伝子のみを発現することができる。しかしながら、そのう よないづれかの細胞系の通常転写的に不活性な遺伝子は本発明に従って遺伝子生 成物を発現するために活性化され得、そしてゲノム中のいづれかの遺伝子は、本 発明に従って変性されたその発現特徴を有する。前の形質転換が対象の遺伝子を 破壊しない限り、前もって形質転換された細胞系が使用され得る。細胞系の源は 重要でない。その細胞系は、動物又は植物系であり得、連続的又は不滅的であり 得る。もちろん、そのような細胞系は、本発明の技法による処理の後、発現が商 業化され得るように安定し且つ不滅的であることが所望される。クローンされた 微生物は、真核又は原核生物のいづれであっても、また本発明の技法により処理 され得る。

本発明は好ましくは、通常転写的に不活性な遺伝子の発現に関して記載されて来 たが、本発明の技法はまた、宿主細胞系に天然において発現される遺伝子の発現 特徴の変性に適用できる。たとえば、発現が意志により開始され、そして停止さ れるように、遺伝子の発現を培養条件又は同様のものに対して依存性にすること が所望される場合、抑制能力又は誘発能力のような特徴を付与する適切なりＮＡ 調節セグメント、たとえば調節可能プロモーターが挿入され得る。たとえば、細 胞型が核ステロイド受容体、たとえばエストロゲン、テストステロン又はグルコ コルチコイド、又はチロキシン受容体を含むことが知られている場合、領域Ｆと してステロイド又はチロキシン応答要素を使用することができる。そのような応 答要素は、転写に対する正の応答を誘発するためにそのような受容体に結合する いづれかのＤＮＡである。たとえ細胞がグルココルチコイドに天然において応答 しない場合でさえ、グルココルチコイド受容体をコードするＤＮＡの断片が、グ ルココルチコイドに対して応答性の細胞を製造するために、構造体に付加され、 又はゲノムのどこかに挿入され得る。調節可能なプロモーターの使用が、対象の 遺伝子が通常転写的に不活性であろうとなかろうと所望される。他の種類の調節 がまた、本発明の方法により対象の正確な位置に適切なりＮＡ調節セグメントを 標的決定することによって得られる。

従って、通常転写的に不活性な遺伝子の発現の刺激は本発明の好ましい適用であ るが、その広い意味において、それは宿主細胞系に対して内因性のいづれかの遺 伝子の発現特徴の変性に適用できる。

相同的組換えの特定技法は、それ自体、本発明の新規部分ではない。そのような 技法は知られており、そして当業者は、そのような技法が、対象の遺伝子に関し て所望する位置にＤＮＡ調節配列の標的決定を可能にする限り、本発明に使用さ れ得ることを理解するであろう。好ましい技法が、挿入されるべき配列のいづれ かの末端上に２つの相同領域を有する線状化された構造体を用いて開示されてい るが、たとえば環状構造体を用いることによって、この機能を達成するであろう いづれか他の技法もまた、本発明により包含される。本発明の臨界特徴は、細胞 系のゲノムにおける遺伝子、好ましくは通常転写的に不活性な遺伝子により操作 的に結合された、使用される細胞系又は微生物における発現特徴の変性を引き起 こすＤＮＡｍ節配列を挿入するために、又は増幅可能な配列の変性に基づいてそ のような遺伝子の増幅を引き起こすためにすでに転写している細胞系のゲノムに おける遺伝子の十分に近くに、調節配列を伴わないで、増幅可能な配列を挿入す るためへの相同的組換え技法の使用である。選択可能マーカーがまた包含される ことは絶対的に必要なものではない。選択は、ＤＮＡ構造体の挿入に続く培地又 は細胞における対象の遺伝子生成物又はｍＲＮＡの検出のみに基づかれている。

さらに、調節配列が挿入されるＨ様においては、所望には、増幅は操作能力のた めに臨界ではない。同じことが、スクリーニング工程を容易にする負の選択遺伝 子のために真であるが、しかし本発明の成功のためには臨界でない。従って、基 本的な態様は、所望する特定の位置にＤＮＡ調節セグメント又は増幅可能なセグ メントの挿入のみを必要とする。しかしながら、調節セグメントが付加されてい る態様での増幅可能な遺伝子の付加のように、選択技法に使用するために正及び ／又は負の選択可能マーカー遺伝子の付加が好ましい。

本明細書及び請求の範囲を通して使用される用語パ発現の変性”とは、対象の生 成物の発現を阻止するために、相同的組換えにより、対象の遺伝子中に変異、欠 失、停止コドン又は他のヌクレオチド配列、たとえば全体の遺伝子を挿入するこ とによって発現の終結を除外するように定義される。従来の技術は、特異的変異 を導入するために相同的組換えの使用を教授し、そして細胞生成物の発現は、そ の手段により本質的に停止せしめられ得る（たとえばＳｃｈｗａｒｔｚｂｅｒｇ など、ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）、８７：３２１０〜３２１４　（１９９０）を参照 のこと）。本発明は、そのような方法を包含しない。本発明においては、“′発 現の変性”は、相同的組換えにより特定の所望する位置で調節及び／又は増幅領 域を挿入することによって達成される。好ましい変性は、対象の生成物の発現を 活性化し、そして／又は増強する変性である。

本明細書は、ＤＮＡ調節セグメントが遺伝子“°により操作的に結合される”と いう句を使用する場合、そのような用語は、ＤＮＡ調節セグメントが、そのよう な遺伝子の転写がそのＤＮＡｆｉ節セグメントにより調節されるように対象の遺 伝子に関して配置されることを意味する。調節セグメントは好ましくは、遺伝子 の上流に存在するが、しかしその遺伝子の下流又はその遺伝子内に存在すること ができるが、但し、それはある手段において遺伝子の発現を調節するために作用 する。ＤＮＡｆｉ節セグメントは、プロモーター、ターミネータ−、オペレータ ー、エンハンサ−、サイレンサー、アテニュエーター又は同様のもの、又はそれ らのいづれかの組合せであり得る。

用語“′上流”又は“下流”が本明細書及び請求の範囲に使用される場合、これ は対象の遺伝子のコード鎖に対して、それぞれ５′一方向又は３′一方向を意味 する。

前述の発明は、明確に理解するために例示的及び測的にいくらか詳細に記載され ているけれども、特許請求の範囲内で修飾及び変更を行なうことができる。本明 細書に使用される４法及び用語法は、記載の目的であって、限定的ではないこＦ ＩＧ、２Ａ ランダム組込み 相同的組換え ＣＩＤ’Ｃ’ＣＦ　・対象の遺伝子 Ｆ／Ｇ、３ ラットＴＳＨβのための相同的組換え構造体ＦＩ６．　５ Ｈｉｎｄ３　（５０２５） 矢印はセンス方向を示す ＦＩＧ、６ 中部位はもはや存在しない 矢印はセンス方向を示す ＦＩＧ、？ 矢印はセンス方向を示す ＦＩＧ、８ 中部位はもはや存在しない 矢印はセンス方向を示す ＦＩＧ、９ 本部位はもはや存在しない 矢印はセンス方向を示す ＦＩＧ、ｌｏ Ｈｉｎｄ３（６６６０１ 本部位はもはや存在しない 矢印はセンス方向を示す ＦＩＧ、／／ ラットＴＳＨβ ２５５ｂｐ ＦＩＧ、ｌ２ ＸｂＯ＋”／Ｈｉｒｄ３（８９１６１ 傘部位はもはや存在しない 矢印はセンス方向を示す ＦＩＧ、／３ Ｘｂａｌ”／ｌ−１ｉｎｄ３（１９５３５に℃） 市部位はもはや存在しない 矢印はセンス方向を示す ＦＩＧ、１４ ＴＧＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＴ　ＧＣＧＣｒＧＧＧＴＡ ＴｒＧＴＡＴＧＡＣＡＣＧＧ　ｇｔａ）ｇｔ　ｆ　ｑｇｊｃａｃ１ｇｃｇ＋１ｔ ｃＨ目ｏｇｃ＋ｇ雷ａａｏｌ　↑ｇ　＋ｏｃａｇｇ會ｃｊａｏａｇＨｇ會ｃｔｇ ｔｌａａｊａＨＴ↑ａ９ｏａａｇｇｏａｇ＋ｇｇｇａ＋ｏｏａ＋ｃａ言ａ　ｇ　 ｔ　ｃ　＋　ｃｃ＋ｃＨｔｇｇｇａａｇｃｃａａｇｃｏｃａｃｌｇｃｌＨｃｏｇ 。

０１１（ｌｌｏ０＋ｔｏＩＱｔｃａｕｃｔＯＣＯＣｏｇａｏａｏｏｇ會ＯＣＯｇ ａｔＯＣＯ＋＋Ｑ會ａａｃｏｇ言ｔｔｏｃｃｃｔａｏｏｑｊｇ電嘗１ｇ１ｔＣＩ ＱＣＩＣ００１９ＱｔＯ９０會ｇｏｇａ０９ａａｏｇ＋ｇｔｃｃｔｍｔｔｇ會ｃ ｔｃ１ｇ０９９９９ｆ　↑００９會ｇｔｏｇｏ＋　ｇ　Ｔ　ｇｔ　ｇｇｇ　＋　 ａ　ａ　ｃ　ａ　ｇｏｇｃｔ　ｃａｇｇｏｇｊｃｃｔｔ　ｌｏａｇａｔｃａ＋モ ≠■■盾盾＝Fａ ａａｑｇｇａ書Ｏｆ　ｊｏｇ＋ｃｏ會ｔｅｔＯ１ｔＯＣＯＣｊＯｏｇｔｔ９ＣＯ ｊ９Ｃｏｇ…ｏｔｃｏｔｇｌ　ｊｏｏｇａｌｃｊｃ目目ｃ　ｌ　＋　ｃｃｏｃｏ 　ｇ　ＧＡＴＡＴＣＡＡ　ＴＧ　ＧＣＡＡＡＣＴＧＴＴＴＣＴＴＣＣＣＭＧＴに ）Ｃロスに異義１１１＠１１１１１帆ＩＩＩ職彊質彊真肴愼愼賛愼情弧肴愼糞領 嘆＊＊ＵＵＶ賀費費−Ｈ諷賢慎賛１１１１１員−ＩＩ翼賛儒阪貝真賢ＣＣＡＴＧ ＴＴＧＣＴＣＣＴＴΔ丁口’ＣＴＣＣＴＡＣＣＣＣＧＴＴＣＣＣＣＴΔＴＧＴＧ ＴＴＴ八へＣＴＧＧＡＡＴＡＧＡＡＣＴＡＡＴＡＡＡＡＴＡＴＣＡＴＴＧＡＴ　 ａ　Ｉｇ　ｔｃ言電ｇｃｃ言ｑｃｃｏｔｔｔａ　ａ　ｌ　ｃ　ｃａ　ｔａｇｇｃ ａｃｏ　ｊ　ｃ　ｃｏ　ｃａａｇｇｃｏｌ　ｔ　ａｇａｇａｇｃ　ｔ　ｔ　ｏｃ ｏｃｏｏｅ＋目ｏｇａａ■モ≠■盾曹■モ■ 傘により下に示された２４７８Ｐの増幅されたフラグメントＦ／Ｇ、１５ 合計ＲＮＡのＰＣＲ増幅によるＴＳＨβ　ＲＮＡの検出要　約　書 細胞系又は微生物における通常転写的に不活性な遺伝子は、細胞において通常発 現された遺伝子生成物の発現を促進することができ、又は複雑であるＤＮＡ調節 要素を挿入することによって、発現のために活性化され得、ここで前記調節要素 は、問題の通常不活性な遺伝子により操作的に結合されるように挿入される。そ の挿入は、通常不活性な遺伝子のＤＮＡセグメント（標的決定ＤＮＡ）及び遺伝 子転写を誘発するためのＤＮＡ調節要素を有するセグメントを含むＤＮＡ構造体 を創造することにより相同的組換えにより達成される。その技法はまた、与えら れた細胞系又は微生物のいづれか内因性遺伝子の発現特徴を変性するためにも使 用される。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成４年り月＾工日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．通常転写的に不活性な遺伝子を、その遺伝子の遺伝子生成物の細胞系又は微 生物内での発現を可能にするためにその細胞系又は微生物のゲノム内で活性化す るための方法であって、相同的組換えにより前記ゲノム中にＤＮＡ構造体を挿入 することを含んで成り、前記ＤＮＡ構造体は、それに操作的に結合される場合、 前記遺伝子の発現を刺激することができるＤＮＡ調節セグメント及び前記遺伝子 内の又はそれに最つとも近い前記ゲノムの領域に相同のＤＮＡ標的決定セグメン トを含んで成り、ここで前記調節セグメントが対象の前記遺伝子に操作的に結合 されるように前記構造体が挿入されることを特徴とする方法。 ２．前記ＤＮＡ構造体が、前記遺伝子内の又はそれに最っとも近い前記ゲノムの 領域にそれぞれ相同の２種のＤＮＡ標的決定セグメントを含んで成り、前記標的 決定セグメントの１つは前記調節セグメントの上流に存在し、そして他は前記調 節セグメントの下流に存在する請求の範囲第１，２１又は２２項記載の方法。 ３．前記ＤＮＡ構造体が、前記調節セグメントと共に挿入されるように配置され た少なくとも１種の発現可能な選択可能マーカー遺伝子をさらに含んで成る請求 の範囲第１，２又は２１項記載の方法。 ４．前記ＤＮＡ構造体が、前記構造体が相同的組換えにより正しく挿入される場 合、挿入されないように前記標的決定セグメントに関して配置される負の選択可 能マーカー遺伝子をさらに含んで成り、それによって前記負の選択可能マーカー は、前記ＤＮＡ構造体が正しく挿入される細胞において発現されない請求の範囲 第１，２，３，２１，２２又は２３項記載の方法。 ５．前記ＤＮＡ構造体が、前記調節セグメントと共に挿入されるように配置され た発現可能な増幅可能遺伝子をさらに含んで成る請求の範囲第１，２，３，４又 は２１項記載の方法。 ６．前記細胞系又は微生物が真核細胞系である請求の範囲第１，２，３，４，５ ，２１，２２又は２３項記載の方法。 ７．前記細胞系又は微生物が動物細胞系である請求の範囲第６項記載の方法。 ８．前記細胞系又は微生物が哺乳類細胞系である請求の範囲第６項記載の方法。 ９．前記細胞系又は微生物が植物細胞系である請求の範囲第６項記載の方法。 １０．さらに前記遺伝子生成物の発現を引き起こすために、前記挿入段階に続い て下記段階； 前記選択可能マーカー遺伝子の生成物を発現する前記細胞系又は微生物のクロー ンを選択し； 前記遺伝子生成物の発現を可能にするのに十分な条件下で前記選択されたクロー ンを培養し；そして前記遺伝子生成物を集める段階をさらに含む請求の範囲第３ 項記載の方法。 １１．前記選択可能マーカー遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子であり、そして前 記選択段階がネオマイシン耐性を有するそれらのクローンを選択することを含ん で成る請求の範囲第１０項記載の方法。 １２．前記ＤＮＡ構造体が、前記構造体が相同的組換えにより正しく挿入される 場合、挿入されないように前記標的決定セグメントに関して配置される負の選択 可能マーカー遺伝子をさらに含んで成り、それによって前記負の選択可能マーカ ーは、前記ＤＮＡ構造体が正しく挿入される細胞において発現されない請求の範 囲第１０又は１１項記載の方法。 １３．前記負の選択可能マーカー遺伝子がヘルペス単純ウィルスのチミジンキナ ーゼ遺伝子であり、そして前記選択段階が前記遺伝子を発現する細胞を殺害する 培地への暴露に対して生存するそれらのクローンを選択することを包含する請求 の範囲第１２項記載の方法。 １４．予定されたＤＮＡ配列により特徴づけられる挿入部位で天然に存在する遺 伝子により操作的に結合されるＤＮＡ調節セグメントを有するゲノムであって、 前記ＤＮＡ調節セグメントがゲノムにおける前記位置で天然に存在しないことを 特徴とするゲノム。 １５．細胞系又は微生物のゲノム内で通常転写的に不活性な遺伝子により遺伝子 生成物を発現することができる細胞系又は微生物であって、前記ゲノムが前記の 通常転写的に不活性な遺伝子により操作的に結合されるＤＮＡ調節セグメントを そこに挿入しており、前記ＤＮＡ調節セグメントが前記細胞系又は微生物により 遺伝子生成物の発現を促進することができることを特徴とする細胞系又は微生物 。 １６．前記ＤＮＡ調節セグメントが、前記細胞系又は微生物により通常発現され る遺伝子生成物の発現を促進することができるものである請求の範囲第１５又は ２５項記載の細胞系又は微生物。 １７．前記挿入されたＤＮＡ調節セグメントが、前記ＤＮＡ調節セグメント及び 少なくとも１つの選択可能マーカー遺伝子を含んで成るＤＮＡ構造体の一部であ る請求の範囲第１６項記載の細胞系又は微生物。 １８．前記ＤＮＡ構造体が増幅可能な遺伝子をさらに含んで成る請求の範囲第１ ７項記載の細胞系又は微生物。 １９．細胞系又は微生物から遺伝子生成物を得るための方法であって、前記遺伝 子生成物の発現を可能にする条件下で請求の範囲第１５〜１８項又は第２４〜２ ６項の分化された細胞系又は微生物を培養し、そして前記遺伝子生成物を集める ことを含んで成る方法。 ２０．予定された宿主細胞系又は微生物中への挿入のためのＤＮＡ構造体であっ て、それに操作的に結合される場合、宿主細胞系又は微生物中における遺伝子の 発現特徴を変性することができるＤＮＡ調節セグメント及び宿主細胞系又は微生 物内の予備選択された遺伝子のゲノムの領域に相同のＤＮＡ標的決定セグメント を含んで成るＤＮＡ構造体。 ２１．細胞系又は微生物のゲノム内での遺伝子の発現特徴を変性するための方法 であって、 相同的組換えにより前記ゲノム中にＤＮＡ構造体を挿入することを含んで成り、 前記ＤＮＡ構造体は、その存在するＤＮＡ調節セグメントに比較して、それに操 作的に結合される場合、前記遺伝子の発現特徴を変性することができるＤＮＡ調 節セグメント、及び前記遺伝子内の又はそれに最っとも近い前記ゲノムの領域に 相同のＤＮＡ標的決定セグメントを含んで成り、ここで前記調節セグメントが対 象の前記遺伝子に操作的に結合されるように前記構造体が挿入されることを特徴 とする方法。 ２２．細胞系又は微生物のゲノム内での遺伝子の発現特徴を変性するための方法 であって、 相同的組換えにより前記ゲノム中にＤＮＡ構造体を挿入することを含んで成り、 前記構造体は、それに十分に接近して挿入される場合、前記遺伝子を変性するこ とができる発現可能な増幅可能遺伝子、及び前記遺伝子内の又はそれに最つとも 近い前記ゲノムの領域に相同のＤＮＡ標的決定セグメントを含んで成り、ここで 前記増幅可能遺伝子が、その増幅可能な遺伝子が増幅される場合、増幅を引き起 こすために対象の前記遺伝子に十分に接近して存在するように前記構造体が挿入 されることを特徴とする方法。 ２３．前記ＤＮＡ構造体が、前記発現可能な増幅可能遺伝子により挿入されるよ うに配置された少なくとも１つの発現可能な選択可能マーカー遺伝子をさらに含 んで成る請求の範囲第２２項記載の方法。 ２４．それが由来する細胞系又は微生物に比較して遺伝子生成物の発現を増強す ることができる細胞系又は微生物であって、前記遺伝子生成物が前記細胞のゲノ ム内の内因性遺伝子の発現生成物であり、前記ゲノムが、前記内因性遺伝子点で 又はその近くに、操作的態様で、前記細胞系又は微生物により前記遺伝子生成物 の発現を増強することができる外因性ＤＮＡ調節セグメント及び／又は増幅可能 遺伝子をそこに挿入していることを特徴とする細胞系又は微生物。 ２５．前記外因性ＤＮＡ調節セグメント及び／又は増幅可能遺伝子が外因性ＤＮ Ａ調節セグメントである請求の範囲第２４項記載の細胞系又は微生物。 ２６．前記外因性ＤＮＡ調節セグメント及び／又は増幅可能遺伝子が外因性増幅 可能遺伝子である請求の範囲第２４項記載の細胞系又は微生物。 ２７．予定された宿主細胞系又は微生物中への挿入のためのＤＮＡ構造体であっ て、それに十分に接近して挿入される場合、宿主細胞系又は微生物における遺伝 子を増幅することができる発現可能な増幅可能遺伝子、及び宿主細胞系又は微生 物内の予備選択された遺伝子のゲノムの領域に相同のＤＮＡ標的決定セグメント を含んで成るＤＮＡ構造体。 ２８．前記細胞系又は微生物が微生物である請求の範囲第１，２，３，４，５， ２１．２２又は２３項記載の方法。