ES2180416B1

ES2180416B1 - Procedimiento para la preparacion de mezclas de reaccion estabilizadas, total o parcialmente desecadas, que comprenden, al menos, una enzima, mezclas de reaccion y kits que las contienen.

Info

Publication number: ES2180416B1
Application number: ES200100569A
Authority: ES
Inventors: Pedro Manuel Franco De Sarabia Rosado; Gemma Limones Lopez; Antonio Madejon Seiz; M. Dolores Marin Alberdi
Original assignee: Biotools Biotechnological and Medical Laboratories SA
Current assignee: Biotools Biotechnological and Medical Laboratories SA
Priority date: 2001-03-12
Filing date: 2001-03-12
Publication date: 2004-06-01
Anticipated expiration: 2021-03-12
Also published as: CA2408857A1; BR0204479A; US20030119042A1; JP4448280B2; ES2180416A1; WO2002072002A3; US7919294B2; IL152757A; EP1374827A2; EP1374827B1; JP2004519242A; AU2002246125B2; IL152757A0; KR20030036178A; WO2002072002A2; BR0204479B1

Abstract

Procedimiento para la preparación de mezclas de reacción estabilizadas, total o parcialmente desecadas, que comprenden, al menos, una enzima, mezclas de reacción y kits que las contienen. El procedimiento comprende poner en contacto en un mismo contenedor una solución acuosa de una mezcla de reacción que comprende, al menos, una enzima, con una solución acuosa de una mezcla estabilizante compuesta por (i) al menos, un agente protector frente a la desecación, (ii) al menos, un inhibidor de la reacción de condensación entre grupos carbonilo o carboxilo y grupos amino o fosfato, y (iii) al menos, un polímero inerte capaz de generar una estructura en forma de malla que impide la movilidad de los reactivos desecados; y retirar la totalidad o parte del agua contenida en la solución acuosa resultante. De aplicación en la realización de reacciones enzimáticas, por ejemplo, amplificación, secuenciación y caracterización de ácidos nucleicos, ensayos de hibridación y análisis de restricción.

Description

Procedimiento para la preparación de mezclas de reacción estabilizadas, total o parcialmente desecadas, que comprenden, al menos, una enzima, mezclas de reacción y kits que las contienen.

Campo de la invención

La invención se relaciona con la preparación de mezclas de reacción estabilizadas, total o parcialmente desecadas, que comprenden, al menos, una enzima, mediante la adición de una mezcla estabilizante a una solución que contiene la mezcla de reacción, y la posterior retirada de la totalidad o parte del agua presente en la solución resultante, así como a las mezclas de reacción resultantes y a kits que comprenden dichas mezclas de reacción.

Antecedentes de la invención

Los ácidos desoxirribonucleico (ADN) y ribonucleico (ARN) son largas macromoléculas lineales responsables del almacenamiento y transmisión de la información genética. Constan de unidades monoméricas denominadas nucleótidos, cada uno de los cuales está formado por una base nitrogenada, púrica o pirimidínica, un azúcar simple (desoxirribosa en el caso del ADN y ribosa en el caso de ARN), y un fosfato inorgánico. En un ácido nucleico, los nucleótidos están unidos entre sí mediante enlaces fosfodiéster a través del azúcar de nucleótidos adyacentes. Las bases nitrogenadas están unidas covalentemente al esqueleto azúcar-fosfato. Cada ácido nucleico posee principalmente cuatro bases nitrogenadas distintas, dos pirimidinas y dos purinas. Las bases purinas son iguales tanto para el ADN como para el ARN, conteniendo ambos adenina (A) y guanina (G). Con respecto a las bases pirimidínicas, ambos ácidos nucleicos contienen citosina (C), siendo la timina (T) específica del ADN y el uracilo (U) propio del ARN. La secuencia de estas bases nitrogenadas determina la información genética que portan los ácidos nucleicos, así como su conformación tridimensional. Mientras que el ARN generalmente se presenta en la Naturaleza como una cadena polinucleotídica simple, el ADN normalmente se presenta como una doble cadena polinucleotídica en las que ambas cadenas de disponen en sentido antiparalelo asociadas por puentes de hidrógeno formados entre una base púrica y una pirimidínica complementarias entre sí.

La amplificación de ácidos nucleicos es la herramienta más ampliamente utilizada para la identificación precisa de un ácido nucleico determinado, consistiendo en la multiplicación exponencial de la cantidad inicial de un segmento específico o característico del ácido nucleico. Ese segmento amplificado puede ser utilizado en aplicaciones posteriores tales como el clonaje y el análisis de restricción. La secuenciación de ácidos nucleicos consiste en la determinación de la secuencia nucleotídica de un fragmento de ácido nucleico determinado. La amplificación y secuenciación de ácidos nucleicos, así como el análisis de fragmentos de restricción, técnica que consiste en la identificación o caracterización de un ácido nucleico en base a los tamaños diferenciales que provocan en ellos unas enzimas endonucleasas denominadas enzimas de restricción, son técnicas ampliamente utilizadas en la investigación biomédica, en el diagnóstico médico y veterinario de enfermedades contagiosas y hereditarias, en el análisis genético humano y animal, en el análisis de alimentos, en el control medioambiental, y en el análisis forense y criminalístico, entre otros posibles usos.

Existen varios métodos para la síntesis y amplificación in vitro de ácidos nucleicos. El más conocido y utilizado es la reacción en cadena de la polimerasa, denominada comúnmente por sus siglas inglesas PCR (Polymerase Chain Reaction) (Saiki et al., Science, 230, 1350-1354 (1985), Mullis et al., patentes norteamericanas US 4.683.195, US 4.683.202 y US 4.800.159). En su forma más simple, la PCR consiste en un procedimiento cíclico de amplificación de ADN por el cual una o más secuencias de ADN específicas contenidas en un ácido nucleico o en una mezcla de ácidos nucleicos es amplificada exponencialmente utilizando para ello dos cebadores oligonucleotídicos que se unen de forma específica, por complementariedad de bases, a dos regiones enfrentadas del ADN problema que previamente ha sido desnaturalizado por calor. Cada una de las cadenas de ADN problema a la que se ha unido su correspondiente cebador puede ser copiada a la forma de ADN complementario mediante la acción de una actividad ADN polimerasa, utilizando el oligonucleótido como cebador de la reacción de polimerización. La repetición de ciclos sucesivos de este proceso consigue un enriquecimiento exponencial del fragmento de ADN problema comprendido entre los puntos de hibridación de los oligonucleótidos. La utilización de ADN polimerasas termoestables permite realizar ciclos sucesivos de desnaturalización, anillamiento del oligonucleótido al ADN substrato y elongación de la cadena, sin adición de nueva actividad polimerasa en cada ciclo. En caso de analizar la presencia de un ADN con una relativa abundancia este proceso es suficiente para su identificación. Sin embargo, es frecuente analizar muestras en las que la abundancia del ADN problema se encuentra por debajo de los límites de una PCR simple. Para el análisis de estas muestras se ha desarrollado la técnica de amplificación anidada o nested-PCR. En este sistema se realizan dos procesos de amplificación acoplados, el segundo de los cuales utiliza como substrato el producto amplificado de una primera PCR. Para incrementar la especificidad del proceso los oligonucleótidos utilizados en la segunda reacción de amplificación son diferentes a los utilizados en la primera e hibridan con zonas internas del producto de la primera amplificación.

Dado que la reacción de amplificación utiliza actividades ADN polimerasas que requieren como substrato moléculas de ADN, el análisis directo de moléculas de ARN precisa un paso previo de transcripción reversa (RT o reverse transcription) mediante el cual se sintetiza una molécula de ADN copia (ADNc) complementaria al ARN problema. A continuación el ADNc así obtenido puede ser utilizado como substrato de una reacción de amplificación (Mocharla et al., Gene 93:271-275 (1990)). El sistema de amplificación utilizado podrá ser una reacción simple (RT-PCR) o una amplificación anidada (RT-nested PCR), dependiendo de la abundancia relativa del ARN substrato original. El desarrollo de actividades ADN polimerasas modificadas con actividad transcriptasa en reverso permite la realización del proceso de RT-amplificación utilizando una única actividad enzimática en condiciones de alta astringencia.

Los métodos de amplificación cíclica de ácidos nucleicos antes descritos utilizan enzimas polimerasas termoestables, obtenidas a partir de diversos microorganismos termófilos tales como Thermus aquaticus (Kaledin et al., Biokhimiya 45, 644-651(1980); Chien et al., J. Bacteriol. 127:1550-1557(1976); patente US 4.889.818), y Thermus thermophilus (Ruttimann et al. Eur. J. Biochem. 149: 41-46 (1985)), entre otros. Varias de estas enzimas ADN polimerasas termoestables, por ejemplo, la procedente de T. aquaticus (Jones et al., Nucleic Acids Research 17:8387-8388(1989)), al igual que algunas enzimas ADN polimerasas mesófilas tales como la ADN polimerasa I de Escherichia coli (Karkas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70: 3834-3838 (1973); Leob et al., Nature New Biol. 242: 66-69 (1973)) presentan una doble actividad enzimática ADN polimerasa y transcriptasa en reverso, dependiendo del cofactor presente en la mezcla de reacción, de modo que en presencia de ión magnesio presenta actividad ADN polimerasa, mientras que en presencia de ión manganeso presenta actividad transcriptasa en reverso.

Las enzimas termoestables, en contraste con las proteínas mesófilas, no se desnaturalizan frente al calor, es más, requieren de altas temperaturas para llevar a cabo su actividad. Ello se debe, principalmente, a las modificaciones en su secuencia de aminoácidos, que se trasladan a su plegamiento global o estructura terciaria. Estas modificaciones no son drásticas, sino que la termoestabilidad surge como consecuencia de la suma de pequeñas interacciones de tipo entálpico y entrópico que contribuyen de forma sinérgica a obtener una estructura terciaria más rígida y resistente al calor. Entre estas modificaciones destacan los cambios de aminoácidos, que conducen a una estructura terciaria más rígida (Menéndez-Arias y Argos, J.Mol.Biol., 206:397-406 (1989)), o bien la eliminación de los residuos que son sensibles a degradación por desamidación (Asn, Gln) u oxidación (Met, Cys), especialmente en las zonas más sensibles de la proteína, tales como los bucles o loops (Watanabe y col., J.Biol.Chem., 266:2428724294 (1991)). La formación de puentes de hidrógeno y formación de redes extensas entre ellos, tanto entre aminoácidos de la proteína como con moléculas de agua del medio (Pace y col., FASEB J., 10:75-83 (1996)) es otra de las modificaciones que conducen a la termoestabilidad, al igual que la formación de puentes salinos entre residuos cargados de la superficie, o como forma de neutralizar los residuos polares que permanecen en el interior hidrofóbico de la proteína (Yip y col., Structure, 3:1147-1158 (1995)). Otras modificaciones de este tipo son la formación de estructuras secundarias, especialmente \alpha-hélices mediante la estabilización de su dipolo interno (Rentier-Delrue y col., J.Mol.Biol., 229:85-93)) y la formación de puentes de hidrógeno (Warren y Petsko, Prot.Eng., 8:905-913 (1995)), así como el aumento del empaquetamiento en el interior hidrofóbico, es decir, hacer la proteína más compacta (Matthews, FASEB J., 10:35-41 (1996)). Por todo lo anterior, resulta evidente que la preservación de la estructura terciaria de las enzimas termoestables, y en consecuencia su actividad y funcionalidad, pasa por la preservación de la integridad de las interacciones de la proteína con las moléculas acuosas que la rodean, incluso en mayor medida que las enzimas mesófilas no termoestables.

Es bien conocido que productos tales como la gelatina, la albúmina de suero bovino (BSA), el sulfato de amonio y el Thesit, entre otros, estabilizan a las enzimas polimerasas y a los dNTPs, y que surfactantes no iónicos tales como el NP40 y el Tween 20 mejoran las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos (Saiki et al., Science, 239:487-491 (1988)).

Las enzimas de restricción son enzimas endonucleasas que rompen los enlaces fosfodiéster dentro de la doble cadena del ADN. Un tipo de estas enzimas de restricción, las denominadas de tipo II, tienen la propiedad de reconocer una determinada secuencia de nucleótidos del ADN, causando la ruptura de los enlaces que unen los nucleótidos entre sí dentro de esa determinada secuencia, cortando en consecuencia un mismo ADN en fragmentos precisos y reproducibles, generando lo que se denomina un mapa de restricción. Las enzimas de tipo II son ampliamente utilizadas en diversas técnicas de biología molecular, tales como clonaje, identificación de secuencias específicas y fragmentos de ADN, y análisis de mapas de restricción, entre otras (Molecular Cloning: a Laboratory Manual, J. Sambrock et al, 2^{nd} Ed. 1989).

Muy frecuentemente, la actividad de las enzimas y de otras macromoléculas biológicas, incluyendo antígenos y anticuerpos, depende principalmente de su conformación tridimensional, denominada estructura terciaria, de manera que si esta conformación tridimensional es modificada por cualquier factor, la actividad o funcionalidad biológica de la macromolécula puede disminuir o incluso desaparecer. El agua forma una envoltura protectora alrededor de las macromoléculas biológicas, estabilizando la estructura terciaria de las macromoléculas mediante interacciones hidrofóbicas/hidrofílicas. Estas interacciones también bloquean los grupos químicos reactivos que se pueden encontrar en la superficie de las macromoléculas. Al quitar esta envoltura acuosa protectora, lo que sucede por ejemplo en cualquier proceso de desecación, se pueden producir distorsiones en la estructura terciaria de las macromoléculas, quedando modificada, y también los grupos químicos reactivos (grupos amino, fosfato, carboxilo, etc.) quedan libres para reaccionar entre sí o con otros grupos reactivos de otras macromoléculas próximas, pudiendo contribuir a la pérdida de la estructura terciaria original e incluso a formar agregados entre diversas macromoléculas iguales o diferentes entre sí, lo cual también supone generalmente la disminución o incluso la pérdida de la actividad o funcionalidad biológica de las macromoléculas, al igual que las modificaciones de sus estructuras terciarias. Estas reacciones entre grupos químicos reactivos periféricos pueden producirse incluso una vez desecadas convenientemente las macromoléculas, debido a la plasticidad de los medios en los que se encuentran, razón por la cual puede observarse una disminución en la actividad o funcionalidad biológica de las macromoléculas desecadas con el paso del tiempo. En consecuencia, es de gran importancia la sustitución de la envoltura acuosa que rodea a las macromoléculas por agentes protectores que sustituyan eficazmente a las moléculas de agua en su misión de mantenimiento de las estructuras terciarias de las macromoléculas y en su misión de estabilización y protección de los grupos reactivos superficiales.

El método habitual de conservación y transporte de las enzimas ADN polimerasas y enzimas de restricción antes mencionadas, así como de otras enzimas utilizadas en biología molecular y para los usos antes citados, comprende su congelación a -20ºC, estabilizándolas para soportar esas bajas temperaturas mediante, principalmente, la adición de glicerol a su forma acuosa. Este método preserva la actividad de las enzimas durante varios meses sin apenas pérdida de actividad siempre y cuando la temperatura de conservación no suba de -20ºC por lo que es de vital importancia preservar la cadena de frío, registrándose importantes pérdidas de actividad o inactivándose las enzimas si esta cadena de frío queda interrumpida durante algunas horas. Incluso utilizando este método de transporte y conservación mediante congelación a -20ºC, es desaconsejable la expedición y conservación de todos los componentes de la reacción en un mismo contenedor, vial o tubo, puesto que pueden darse reacciones químicas o bioquímicas indeseables entre los diversos componentes que pueden llegar a provocar su inactivación o la generación de artefactos que pueden interferir o enmascarar la interpretación de los resultados experimentales. De lo anterior se deduce que sería de gran conveniencia económica disponer de un sistema que posibilitara la conservación y transporte de las macromoléculas citadas a temperatura ambiente, pudiendo evitarse de esta manera la necesaria preservación de la cadena de frío, máxime si este sistema de conservación permitiera expedir al mercado en un único contenedor todos los elementos necesarios (enzimas, cofactores, aditivos, etc.) necesarios para realización de la reacción enzimática deseada.

En la amplificación de ácidos nucleicos mediante las técnicas antes descritas, cada uno de los componentes que intervienen en la reacción, es decir, la enzima ADN polimerasa, el tampón de reacción conteniendo aditivos mejorantes de la reacción o estabilizantes, el cloruro de magnesio, o cloruro de manganeso en caso de RT, los oligonucleótidos utilizados como cebadores de la reacción, los desoxirribonucleótidos (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), y la muestra conteniendo el ácido nucleico a amplificar, se encuentran por separado, conservados mediante congelación como se ha explicado anteriormente, y deben ser mezclados previamente a la realización de la reacción, siendo necesario añadir y mezclar cantidades muy pequeñas (microlitros) de cada uno de ellos, produciéndose frecuentes errores en la administración y pipeteo de cada uno de los reactivos citados, lo que acaba generando una incertidumbre acerca de la reproducibilidad de los resultados obtenidos mediante la aplicación de estas técnicas, incertidumbre especialmente preocupante en el caso del diagnóstico humano. Esta variabilidad por la posibilidad de error en el pipeteo de los diversos reactivos a añadir a la reacción de amplificación también afecta a la sensibilidad de la técnica, lo cual genera una nueva incertidumbre acerca de la aplicación de estas técnicas en el diagnóstico humano de enfermedades, y especialmente en la determinación de niveles de infección y de niveles de expresión génica.

Además, durante el pipeteo y adición a la mezcla de reacción de la muestra a analizar, se producen aerosoles que frecuentemente producen contaminaciones cruzadas entre muestras a analizar (Kwok, S. et al., Nature, 339:237 238 (1989)), generándose resultados falsos positivos, de gran transcendencia también en el caso del diagnóstico humano.

Diversas técnicas han sido descritas y utilizadas para la preservación mediante desecación de macromoléculas biológicas, y su utilidad y aplicabilidad vienen condicionadas por su capacidad de preservación de las características funcionales del producto sobre el que se aplica.

La liofilización es la principal de estas técnicas de preservación mediante desecación descritas, y es un método en el que se consigue la eliminación del agua mediante la congelación del producto húmedo y la posterior sublimación del hielo en condiciones de baja presión. Sublimación es el proceso por el cual un sólido se evapora sin pasar por el estado líquido, por lo que el término baja presión indicado anteriormente hace referencia a un valor de presión de vapor inferior al punto triple del agua, presión de vapor en el que el agua coexiste en los estados sólido, líquido y vapor. Para la realización de la liofilización debe procederse a la congelación completa de la disolución o del producto a liofilizar, a una temperatura y velocidad que dependen del tipo de material a liofilizar. Los equipamientos necesarios para liofilizar son costosos, y el proceso de liofilización es relativamente lento, por lo que muy a menudo estos factores económicos desaconsejan su utilización. Otros sistemas de desecación son bien conocidos, tales como desecado en lecho fluido, desecado a temperatura ambiente y presión atmosférica, desecado a temperatura ambiente y presión disminuida, desecado a alta temperatura y presión atmosférica, desecado a alta temperatura y presión disminuida. La elección del método de desecación a utilizar depende de su grado de eficiencia, de su mayor o menor agresividad frente a la composición a preservar mediante desecación, y de factores económicos.

Diversas soluciones se han propuesto para preservar la integridad de las macromoléculas biológicas durante el proceso de desecación, así como para estabilizar y preservar la funcionalidad de los desecados durante el proceso de conservación y almacenamiento.

Clegg et al. describen en Criobiology 19:306-316 (1982) el efecto protector del glicerol y de la trehalosa sobre la respuesta celular a la desecación.

Crowe et al. describen en Cryobiology 20:346-356 (1983), en Archives Biochem. Biophysies 232:400-497 (1984) y en Biochimia & Biophysica Acta 769:141-150 (1984), la acción de diversos carbohidratos sobre la estabilización de membranas celulares, indicando el efecto protector significativamente superior del disacárido no reductor conocido como trehalosa (\alpha-D-glucopiranosil-\alpha-D-glucopiranósido) en la desecación de los organelos celulares.

Carpenter et al. (Cryobiology 24:455-464 (1987)) indican que los disacáridos maltosa, sacarosa, lactosa y trehalosa incrementan la estabilidad de la actividad de una preparación purificada de la enzima fosfofructoquinasa tras su desecación.

La solicitud de patente europea EP 140489 de Wako Pure Chemichal Industries describe un procedimiento para proteger una proteína inmunoactiva (un anticuerpo) sobre un transportador (por ejemplo, una perla de cristal) frente a la desecación a temperatura ambiente mediante su inmersión en una solución azucarada, opcionalmente junto a una proteína tal como albúmina de suero bovino. Se menciona un considerable número de azúcares (ribosa, glucosa, fructosa, manosa, galactosa, maltosa, sacarosa (sucrosa), lactosa, así como otros oligosacáridos y polisacáridos), siendo los preferidos en base a su mayor efecto protector la lactosa, la sacarosa y las soluciones de dextrinas.

La patente norteamericana US 4.891.319, asignada a Quadrant Bioresources Limited, describe el empleo de trehalosa como agente protector frente a la desecación de proteínas, anticuerpos, y otras macromoléculas biológicas.

O. Tooru et al. describen en Chemical Abstracts 95:517 (1981) el efecto protector de los azúcares y de los azúcares alcohoxílicos frente a la desnaturalización y la desecación de fibras musculares de los peces.

La solicitud de patente EP 91258 revela un método de estabilización del factor de necrosis tumoral (TNF) mediante almacenamiento o liofilización de la proteína TNF purificada en presencia de una proteína estabilizante tal como la albúmina de suero bovina o la gelatina.

La solicitud de patente WO 91/18091, de Quadrant Holdings Cambridge Limited, describe un método de preservar sustancias biológicas en un estado desecado mediante la utilización de glicósidos no reductores procedentes de compuestos polihidroxilados (preferentemente sorbitol o manitol), tales como el maltitol, el lactitol y ambos isómeros del palatinitol, y un oligosacárido no reductor tal como la rafinosa, la estaquiosa y la melezitosa.

Igaki et al. en J. JPN. Diabetes Soc, 34:403-407 (1991) señala a la L-lisina como un inhibidor de las reacciones de condensación entre grupos amino y carbonilo situados en la periferia de las macromoléculas biológicas.

La patente US 5.955.448, asignada a Quadrant Holdings Cambridge Limited, reivindica un método de estabilización de muestras y macromoléculas biológicas, incluyendo enzimas endonucleasas de restricción, desecadas mediante la adición de carbohidratos no reductores y un inhibidor de las reacciones de condensación entre grupos amino y carbonilo periféricos. Se conoce, además, la estabilización del \beta-interferón recombinante mediante la utilización de un agente estabilizante tal como un detergente o glicerol, pudiendo además contener otras proteínas, sacarosa, trehalosa, y otros derivados polihidroxilados de los carbohidratos, como agentes estabilizantes adicionales, especialmente dextrosa.

Otras referencias acerca de métodos de desecación y de preservación frente a la desecación de macromoléculas biológicas pueden encontrarse en Pikal M.J., BioPharm 3:18-20, 22-23, 26-27 (1990), Carpenter et al., Cryobiology 25:459-470 (1988), Roser B., Biopharm 4: 47-53 (1991), Colaco et al, Bio/Technol. 10: 1007-1011 (1992), y Carpenter et al., Cryobiology 25:244-255 (1988).

Por otra parte, la patente US 5.861.251, asignada a Bioneer Corporation, reivindica un proceso de preparación de un reactivo listo para usar desecado mediante liofilización para la amplificación de ADN mediante la adición como preservantes de glucosa o sorbitol a una mezcla de reacción que contiene todos los componentes necesarios para llevar a cabo la reacción, es decir, una enzima ADN polimerasa termoestable, un tampón de reacción conteniendo todos los componentes necesarios para llevar a cabo la reacción, y los desoxinucleótidos trifosfato o didesoxinucleótidos trifosfato necesarios como sustratos de la reacción de polimerización, más un colorante soluble en agua, no citando la adición de sondas ni cebadores oligonucleotídicos al reactivo listo para usar.

La patente US 5. 614. 387, asignada a Gen-Probe Incorporated, describe un reactivo listo para usar desecado mediante liofilización para la amplificación de ARN mediante la adición como preservantes de un disacárido no reductor, preferentemente trehalosa o sacarosa, y/o polivinilpirrolidona (PVP), a una mezcla de reacción que contiene todos los reactivos necesarios para realizar la amplificación del ácido nucleico, incluyendo una ARN polimerasa y/o una transcriptasa en reverso, no citando en sus ejemplos ninguna enzima termoestable, junto a un tampón de reacción conteniendo todos los componentes necesarios para llevar a cabo la reacción, y los desoxinucleótidos trifosfato o didesoxinucleótidos trifosfato necesarios como sustratos de la reacción de polimerización, más un colorante soluble en agua.

La patente US 5.935.834, asignada a Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha, reivindica un reactivo listo para usar obtenible por desecación y preservación en presencia de trehalosa y que contiene todos los elementos necesarios para realizar una transcripción reversa del ARN procedente de un virus.

Aunque se han propuesto diversas soluciones para preservar la integridad de las macromoléculas biológicas durante el proceso de desecación, así como para estabilizar y preservar la funcionalidad de los desecados durante el proceso de conservación y almacenamiento, sigue existiendo la necesidad de desarrollar soluciones alternativas que incrementen el potencial de medios para satisfacer tales fines. La presente invención proporciona una solución a dicha necesidad.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona un procedimiento para preparar una mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, comprendiendo dicha mezcla, al menos, una enzima, en adelante procedimiento de la invención, que comprende:

a) poner en contacto en un único contenedor:

: i) una solución acuosa de una mezcla de reacción que comprende, al menos, una enzima; y

: ii) una solución acuosa de una mezcla estabilizante compuesta por

-: al menos, un agente protector frente a la desecación;

-: al menos, un inhibidor de la reacción de condensación entre grupos carbonilo o carboxilo y grupos amino o fosfato; y

-: al menos, un polímero inerte capaz de generar una estructura en forma de malla que impide la movilidad de los reactivos desecados;

para obtener una solución acuosa que comprende dicha mezcla de reacción junto con dicha mezcla estabilizante; y

b) retirar la totalidad o parte del agua contenida en dicha solución acuosa obtenida en la etapa a), hasta obtener una mezcla total o parcialmente desecada que comprende dicha enzima y dicha mezcla estabilizante y tiene un grado de humedad igual o inferior al 30%, para obtener una mezcla de reacción estabilizada, total o parcialmente desecada, que comprende, al menos, una enzima.

La mezcla de reacción comprende una o más enzimas que intervienen en una o varias reacciones enzimáticas junto con la totalidad o parte de los reactivos necesarios para la realización de las reacciones enzimáticas en las que intervienen dichas enzimas. En una realización particular, la mezcla de reacción contiene todos los reactivos necesarios para la realización de la reacción o reacciones en las que intervienen la(s) enzima(s) presentes en la mezcla de reacción, mezclados en las cantidades convenientes en dicho contenedor, tal como un tubo de reacción o un pocillo de una placa multipocillo, en el que posteriormente, tras rehidratación y adición del sustrato o muestra problema se llevará a cabo la reacción enzimática a realizar.

La enzima o enzimas presentes en la mezcla de reacción pueden ser cualquier enzima. En una realización particular, dicha enzima se selecciona del grupo formado por enzimas de amplificación de ácidos nucleicos, tanto termoestables como termolábiles, de ácidos nucleicos, tanto ARN como ADN, enzimas de restricción, enzimas que intervienen en las reacciones de amplificación, secuenciación o caracterización de ácidos nucleicos, y sus mezclas. Por tanto, en una realización particular, la mezcla de reacción comprende una enzima seleccionada entre enzimas de amplificación de ácidos nucleicos, enzimas de restricción, enzimas que intervienen en las reacciones de amplificación, secuenciación y caracterización de ácidos nucleicos, y sus mezclas, junto con todos los reactivos necesarios para la realización de las reacciones en las que intervienen las enzimas anteriores, y que incluyen cofactores, sustratos de las enzimas y otros aditivos que mejoran las reacciones enzimáticas, pudiendo asimismo incluir, opcionalmente, sondas y cebadores oligonucleotídicos, marcados o sin marcar, para la realización de una amplificación específica, por ejemplo, la detección de un determinado patógeno o mutación genética en una muestra.

La solución acuosa de la mezcla de reacción puede prepararse fuera del contenedor y añadirse posteriormente al mismo tal cual o bien puede formarse directamente en el contenedor mediante la adición y mezcla de los distintos componentes de la mezcla de reacción en el propio contenedor.

La mezcla estabilizante está compuesta por (i) al menos, un agente protector frente a la desecación, (ii) al menos, un inhibidor de la reacción de condensación entre grupos carbonilo o carboxilo y grupos amino o fosfato; y (iii) al menos, un polímero inerte que, al desecarse, genera una estructura en forma de malla que impide la movilidad de los reactivos desecados.

El agente protector frente a la desecación tiene por misión principalmente estabilizar la estructura terciaria de las enzimas y de los nucleótidos opcionalmente presentes en la mezcla de reacción, durante el proceso de desecación, sustituyendo en esta misión a las moléculas de agua que en solución acuosa forman la envoltura protectora que ayuda a mantener la estructura tridimensional de las macromoléculas, bloqueando además las reacciones que pudieran producirse entre los grupos químicos reactivos que pudieran encontrarse en la superficie de las macromoléculas, con lo cual presentan también un efecto de estabilización en la conservación a largo plazo de las mezclas desecadas. El agente protector frente a la desecación puede ser un carbohidrato no reductor adecuado, en particular, un disacárido o trisacárido no reductor, o una mezcla de dichos compuestos. En una realización particular, el agente protector frente a la desecación se selecciona entre los disacáridos no reductores palatinitol (6-\alpha-D-glucopiranosil-manitol) y trehalosa, los trisacáridos no reductores rafinosa y melezitosa, y sus mezclas. Otros carbohidratos no reductores, tales como la sacarosa (sucrosa), se han mostrado efectivos en la desecación de enzimas, pero no así en la desecación conjunta de las enzimas y oligonucleótidos.

Se han ensayado diversos compuestos no reductores, del grupo de los polialcoholes, como agentes protectores frente a la desecación y estabilizantes de las mezclas desecadas durante su almacenamiento, tales como el sorbitol y el glicerol. Ambos se muestran relativamente efectivos en su utilización independiente como agentes protectores de las enzimas durante el proceso de desecación y en su posterior conservación, especialmente el sorbitol. En el proceso de desecación conjunta de mezclas de reacción conteniendo enzimas y oligonucleótidos junto con la mezcla estabilizante conteniendo carbohidratos no reductores, inhibidores de las reacciones de condensación y polímeros inertes, se aprecia que mientras que el glicerol presenta un efecto protector beneficioso en todos los casos en conjunción con los componentes de la mezcla estabilizante, especialmente en conjunción con los carbohidratos no reductores melezitosa, palatinitol, trehalosa y sacarosa, el sorbitol no presenta ningún efecto beneficioso, sino que, al contrario, llega a inhibir el efecto protector de los elementos citados. La utilización de sorbitol como agente protector frente a la desecación y estabilizante durante la conservación de las mezclas de reacción es efectiva cuando en esas mezclas de reacción no están presentes oligonucleótidos, no presentando ninguna acción protectora ni estabilizante cuando en esas mezclas están presentes cadenas oligonucleotídicas. Por tanto, además de uno o varios carbohidratos no reductores, la mezcla estabilizante puede contener, opcionalmente, glicerol como agente protector frente a la desecación.

El inhibidor de las reacciones de condensación tiene por misión inhibir las reacciones de condensación que pueden producirse entre los grupos reactivos carboxilo, carbonilo, amino y fosfato que se encuentran en la superficie de las macromoléculas presentes en la mezcla de reacción a desecar, por lo que debe estar presente en una cantidad suficiente como para ejercer este efecto inhibidor. Los inhibidores de reacción a utilizar pueden ser competitivos o no competitivos. Entre los inhibidores competitivos, diversos aminoácidos se han mostrado como los más efectivos, destacando la lisina, la arginina y el triptófano, y, entre ellos, la lisina. Entre los no competitivos, la betaína y los derivados de la aminoguanidina se han mostrado como los más eficaces. La elección del inhibidor no competitivo depende del carbohidrato no reductor utilizado, de modo que en presencia de rafinosa el inhibidor no competitivo más efectivo es la betaína, mientras que en presencia de otros carbohidratos son los derivados de la aminoguanidina los más efectivos. Por tanto, en una realización particular, la mezcla estabilizante contiene un inhibidor de la reacción de condensación entre grupos carbonilo o carboxilo y grupos amino o fosfato seleccionado del grupo formado por lisina, arginina, triptófano, betaína, derivados de aminoguanidina, y sus mezclas.

El polímero inerte capaz de generar una estructura en forma de malla que impida la movilidad de los reactivos desecados al desecarse la solución acuosa en donde se encuentra, tiene por misión principal el mejorar la estabilidad frente al almacenamiento de la mezcla de reacción desecada al generar una malla que impide la movilidad de los diferentes reactivos que componen la mezcla de reacción, de manera que quedan inmovilizados en mayor o menor medida en las celdillas que forma el polímero y, en consecuencia, estos reactivos no pueden aproximarse entre sí, evitándose la reacción química de sus grupos reactivos superficiales. El polímero debe, por un lado, no reaccionar con ninguno de los reactivos que componen la mezcla de reacción, y, por otro lado, debe crear un entramado lo suficientemente fino y moldeable como para atrapar en su malla macromoléculas individualizadas sin distorsionar su estructura terciaria o cuaternaria al desecarse. En una realización particular, dicho polímero inerte se selecciona del grupo formado por polivinilpirrolidona (PVP), polietilenglicol (PEG) de diversos grados de polimerización, dextrano, almidón, el compuesto denominado FICOLL (polímero no iónico sintetizado a partir de la sacarosa, de Pharmacia), glucógeno, goma arábiga y sus mezclas. En general, el glucógeno y la goma arábiga son los polímeros inertes que se han mostrado más efectivos en su función protectora. Una misión adicional de este polímero inerte es su utilización como crioprotector de las macromoléculas presentes en la mezcla de reacción a desecar mediante liofilización, al generar una malla amorfa que impide la cristalización del agua durante el proceso inicial de congelación característico de ese proceso de desecado. La cantidad de polímero inerte a añadir a la mezcla de desecación debe ser la suficiente como para asegurar la generación de una malla lo suficientemente tupida que impida la movilidad de las macromoléculas, sin que luego interfiera en la reacción enzimática a producirse tras la rehidratación de la mezcla de reacción desecada.

La actuación conjunta de los tres componentes de la mezcla estabilizante (agente protector, inhibidor de las reacciones de condensación y polímero inerte), provoca que las mezclas de reacción citadas antes sean completamente funcionales tras su desecación y almacenamiento prolongado. La adición de uno o dos de los componentes citados, sin la presencia de los otros dos o del restante componente, genera mezclas de reacción que o bien no son activas tras la desecación o bien su actividad desaparece a los pocos días de su desecación, presentando, en consecuencia, una estabilidad muy reducida durante el almacenamiento. Los carbohidratos no reductores (agentes protectores), en conjunción o no con el inhibidor de las reacciones de condensación, pueden proteger eficazmente frente a la desecación y estabilizar durante el almacenamiento a las enzimas y a las mezclas de reacción que contienen todos los reactivos necesarios para su realización excepto las sondas o los cebadores oligonucleotídicos, pero no así a las mezclas de reacción que contienen esos oligonucleótidos. Igualmente sucede con el polialcohol no reductor sorbitol, el cual se muestra por separado como un buen protector y estabilizante de la mezcla de reacción que contiene todos los reactivos necesarios excepto los oligonucleótidos, pero que deja de ejercer ese efecto protector cuando en la mezcla de reacción están presentes oligonucleótidos. El inhibidor de las reacciones de condensación, utilizado de manera exclusiva en la desecación o en presencia del polímero inerte, es capaz de proteger la mezcla de reacción sin oligonucleótidos durante el proceso de desecación, apreciándose una caída en el rendimiento de la reacción cuando la mezcla de reacción contiene oligonucleótidos.

La solución acuosa de la mezcla estabilizante puede preparase fuera del contenedor y añadirse posteriormente al mismo tal cual o bien puede formarse directamente en el contenedor mediante la adición y mezcla de los distintos componentes de la mezcla estabilizante en el propio contenedor.

Tras la mezcla en el contenedor de la solución acuosa de la mezcla de reacción con la mezcla estabilizante se forma una solución acuosa que comprende la mezcla de reacción que comprende, al menos, una enzima, junto con dicha mezcla estabilizante. A continuación, se retira la totalidad o parte del agua contenida en la solución acuosa resultante de la mezcla de reacción con la mezcla estabilizante, hasta obtener una mezcla total o parcialmente desecada que comprende la enzima o enzimas en cuestión junto con dicha mezcla estabilizante y tiene un grado de humedad igual o inferior al 30%, obteniéndose una mezcla de reacción estabilizada, total o parcialmente desecada, que comprende, al menos, una enzima.

La retirada de la totalidad o parte del agua presente en la solución acuosa obtenida en el contenedor tras la mezcla de la mezcla de reacción con la mezcla estabilizante puede realizarse por cualquier método de desecación convencional, incluyendo, por ejemplo, liofilización, desecado en lecho fluido, desecado a temperatura ambiente y presión atmosférica, desecado a temperatura ambiente y presión disminuida, desecado a alta temperatura y presión atmosférica, desecado a alta temperatura y presión disminuida. El método de desecación preferido es el desecado a una temperatura comprendida entre 15ºC y 60ºC, y presión disminuida inferior a la atmosférica. Otros métodos, como los anteriormente nombrados, pueden ser aplicados en la desecación, aunque su mayor coste o menor eficiencia o mayor agresividad frente a los componentes de la mezcla de reacción a desecar desaconsejan su utilización.

Las mezclas de reacción estabilizadas, desecadas, proporcionadas por esta invención, tienen un grado de humedad igual o inferior al 30%, preferentemente igual o inferior al 20%.

Las mezclas de reacción completamente desecadas, es decir, con una presencia de agua residual igual o inferior al 1%, tienden a tener una estabilidad durante el almacenamiento inferior a aquellas que contienen un mayor porcentaje de agua, apreciándose en las completamente desecadas una significativa disminución en los rendimientos de la reacción tras rehidratación y adición del sustrato de reacción. Por otra parte, en las mezclas desecadas que contienen porcentajes de agua residual comprendidos entre el 1% y el 20%, las macromoléculas presentan una movilidad que puede provocar reacciones químicas o enzimáticas indeseables, a pesar de la presencia del polímero inerte que impide su movilidad completa, por lo que si bien presentan una estabilidad de varias semanas a temperatura ambiente (25ºC), deben almacenarse preferentemente a temperaturas comprendidas entre 4ºC y 10ºC para asegurar su correcta funcionalidad a lo largo del tiempo. El grado de desecación elegido depende principalmente de factores económicos (coste del proceso, tiempo necesario para alcanzar un determinado grado de desecación, etc.) y de la relación existente entre el grado de desecación y la estabilidad de la mezcla de reacción. Por ello, en una realización particular, el porcentaje de humedad relativa remanente en la mezcla de reacción estabilizada y desecada está comprendido entre el 1% y el 20%.

Mediante el procedimiento de la invención se obtienen mezclas de reacción estabilizadas, total o parcialmente desecadas, que en un único tubo o pocillo de una placa contienen todos los elementos necesarios (por ejemplo, enzimas, cofactores, sustratos, cebadores oligonucleotídicos de reacción y otros aditivos que mejoran o modulan la reacción enzimática) para que se pueda llevar a cabo la reacción enzimática deseada tras su rehidratación y adición del sustrato o muestra problema, evitándose de esta manera la necesidad de preservar la cadena de frío en el transporte y manipulación de estas mezclas de reacción desecadas, simplificando la manipulación habitual necesaria para realizar la reacción enzimática, por ejemplo, la amplificación de ácidos nucleicos, al no ser necesario conservar y añadir cada componente de la reacción por separado, previniéndose contaminaciones cruzadas y evitándose errores de pipeteo, aumentándose, en consecuencia, la repetibilidad y fiabilidad de los análisis. Las mezclas de reacción estabilizadas, total o parcialmente desecadas mantienen su actividad, sin pérdidas significativas de la misma, tras su transporte y conservación a temperatura ambiente.

La invención también proporciona una mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, con un grado de humedad igual o inferior al 30%, preferentemente comprendido entre 1% y 20%, que comprende al menos, una enzima, y una mezcla estabilizante tal como la definida previamente que comprende (i) al menos, un agente protector frente a la desecación, (ii) al menos, un inhibidor de la reacción de condensación entre grupos carbonilo o carboxilo y grupos amino o fosfato, y (iii) al menos, un polímero inerte capaz de generar una estructura en forma de malla que impide la movilidad de los reactivos desecados.

En una realización particular, dicha mezcla de reacción estabilizada y total o parcialmente desecada contiene una enzima seleccionada del grupo formado por enzimas de amplificación de ácidos nucleicos, enzimas de restricción, enzimas que intervienen en las reacciones de amplificación, secuenciación o caracterización de ácidos nucleicos, y sus mezclas, junto con la totalidad o parte de los reactivos necesarios para la realización de las reacciones enzimáticas en las que intervienen dichas enzimas, preferentemente con la totalidad de dichos reactivos, que incluyen cofactores, sustratos de las enzimas y otros aditivos que mejoran las reacciones enzimáticas, pudiendo asimismo incluir, opcionalmente, sondas y cebadores oligonucleotídicos, marcados o sin marcar, para la realización de una amplificación específica, por ejemplo, la detección de un determinado patógeno o mutación genética en una muestra. De este modo se obtienen mezclas de reacción estabilizadas, total o parcialmente desecadas, que en un único tubo o pocillo de una placa contienen todos los elementos necesarios (es decir, enzimas, cofactores, sustratos, cebadores oligonucleotídicos de reacción y otros aditivos que mejoran o modulan la reacción enzimática) para que se pueda llevar a cabo la reacción deseada tras su rehidratación y adición del sustrato o muestra problema.

En una realización particular, la invención proporciona una mezcla de reacción estabilizada, total o parcialmente desecada, útil para la amplificación de una o más secuencias específicas de uno o varios ácidos nucleicos, ARN o ADN, presentes en una muestra. Dicha mezcla de reacción comprende una enzima ADN polimerasa o una enzima transcriptasa en reverso, termoestable o no, desoxinucleótidos trifosfato, marcados o no por cualquiera de los métodos conocidos, todos los cofactores necesarios para la actividad enzimática y cualquier otro aditivo que mejora o modula dicha actividad enzimática. La mezcla de reacción estabilizada y desecada puede también contener los cebadores oligonucleotídicos de reacción, marcados o sin marcar mediante cualquiera de los métodos conocidos, necesarios para la amplificación específica de la secuencia nucleotídica objetivo, y/o las sondas oligonucleotídicas, marcadas o sin marcar por cualquiera de los métodos conocidos, necesarias para la realización de un ensayo de hibridación, así como cualquier aditivo o coadyuvante de la reacción de hibridación. Esta mezcla de reacción estabilizada y desecada se encuentra en un único contenedor, tal como un tubo de reacción o un pocillo de una placa multipocillos, y para la realización de la reacción deseada únicamente es necesaria la rehidratación de la mezcla de reacción mediante la adición de agua destilada y de la muestra a analizar. Preferiblemente, el método de desecación es el anteriormente expuesto y contiene la mezcla estabilizante descrita.

En otra realización particular, la invención proporciona una mezcla de reacción estabilizada y total o parcialmente desecada útil para la secuenciación de ácidos nucleicos, en la que a la mezcla de reacción estabilizada y desecada antes descrita se le añaden también didesoxirribonucleótidos (ddNTPs), eliminándose el colorante soluble en agua. Preferiblemente, el método de desecación es el anteriormente expuesto y contiene la mezcla estabilizante descrita.

En otra realización particular, la invención proporciona una mezcla de reacción estabilizada y total o parcialmente desecada útil para la realización de análisis de restricción en placa multipocillo, de manera que la muestra a analizar se deposita sobre el pocillo que contiene desecados una mezcla de reacción que contiene una determinada enzima de restricción con la cual se desea tratar la muestra, así como todos los cofactores y aditivos necesarios para la realización del análisis de restricción, procediéndose posteriormente a la incubación de la muestra junto a la mezcla de reacción rehidratada. Preferiblemente, el método de desecación es el anteriormente expuesto y contiene la mezcla estabilizante descrita.

En otra realización particular, la invención proporciona una mezcla de reacción estabilizada y total o parcialmente desecada para la realización de hibridaciones en placa multipocillo, de manera que la muestra a hibridar es depositada sobre el contenedor que contiene desecadas las sondas oligonucleotídicas, marcadas o sin marcar por cualquiera de los métodos conocidos, necesarias para la realización del ensayo de hibridación, así como cualquier aditivo o coadyuvante de la reacción de hibridación, procediéndose posteriormente a la realización de la reacción de hibridación. Preferiblemente, el método de desecación es el anteriormente expuesto y contiene la mezcla estabilizante descrita.

Las mezclas de reacción estabilizadas, total o parcialmente desecadas, proporcionadas por esta invención, son del tipo ``listas para usar'' (ready-to-use) y presentan numerosas aplicaciones, entre las que se encuentran el diagnóstico de enfermedades, la determinación de la secuencia de ADN, o el análisis de restricción de ácidos nucleicos, de acuerdo con los métodos que se indican más adelante y se ilustran en los ejemplos que acompañan a esta descripción.

La invención también proporciona un kit que comprende una mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, con un grado de humedad igual o inferior al 30%, preferentemente comprendido entre 1% y 20%, proporcionada por esta invención. En una realización particular, dicho kit es un kit adecuado para la amplificación de una o más secuencias específicas de uno o varios ácidos nucleicos, ARN o ADN, presentes en una muestra, o para la realización de un ensayo de hibridación de ácidos nucleicos, o para la secuenciación de ácidos nucleicos, o para la realización de análisis de restricción en placa multipocillo, o para la realización de hibridaciones en placa multipocillo. El kit de la invención contiene, además de la mezcla de reacción estabilizada, total o parcialmente desecada, que comprende al menos una enzima implicada en una reacción enzimática, la totalidad o parte, preferentemente, la totalidad de los reactivos, factores, aditivos y/o secuencias oligonucleotídicas necesarios para la realización de la reacción enzimática en cuestión.

Los siguientes ejemplos explican en mayor medida la presente invención, y no deben ser interpretados como un límite en el alcance de la invención.

Ejemplo I Desecación de la mezcla de reacción para amplificación de ADN

La enzima ADN polimerasa termoestable usada en este y en los siguientes ejemplos, salvo indicación en caso contrario, es una ADN polimerasa recombinante de Thermus thermophilus expresada en Escherichia coli, propiedad de Biotools B&M Labs S.A., España, y purificada mediante un método no cromatográfico desarrollado por la misma empresa (BIOTOOLS DNA Polymerase). Tras su purificación, la enzima fue guardada a -20ºC en un tampón de almacenamiento conteniendo Tris HCl 30 mM, pH 8, glucosa 25 mM, KCl 25 mM, PMSF 0,5 mM, Tween 20 0,25% y NP40 0,25%. Se preparó un tampón de reacción conteniendo Tris HCl, pH 8, 750 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 200 mM, Tween 20 0,1% y MgCl_{2} 20 mM.

A cada tubo de reacción de 0,2 ml utilizado en el experimento se le añadió 1 microlitro de dicha enzima ADN polimerasa (1 U/\mul) conservada en su tampón de almacenamiento, 5 microlitros del tampón de reacción, y 1 microlitro de una disolución que contiene en proporción equimolar los cuatro desoxirribonucleótidos (dNTPs) que intervienen en la reacción de amplificación de ADN (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). Se prepararon diversos tubos de la forma antes descrita, y a cada uno de ellos se le añadieron los volúmenes adecuados de cada una de las mezclas estabilizantes que se recogen en la Tabla 1. Los tubos así preparados se desecaron en un evaporador centrífugo marca Eppendorf modelo 5301, a temperaturas comprendidas entre 10ºC y 60ºC, durante un tiempo comprendido entre 30 y 120 minutos. Las temperaturas y los tiempos antes citados varían según el volumen final de mezcla a desecar.

Tras su desecación, los tubos fueron conservados a las temperaturas y tiempos indicados en la Tabla 1. Al cumplirse los tiempos indicados en la Tabla 1, fue ensayada su actividad mediante la reacción de amplificación de una región específica del citocromo b, de un tamaño de 359 pares de bases (pb), rehidratando la mezcla desecada con 43 microlitos de agua bidestilada, añadiendo 1 microlitro de cada uno de los cebadores de reacción

I-1: 5'-CCATCCATCTCAGCATGATGAAA-3' (SEC. ID. Nº: 1); y

I-2: 5'-GCCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3' (SEC. ID. Nº: 2), y

500 ng de ADN hasta un volumen final de 50 microlitros. Se realizaron 35 ciclos de desnaturalización (94ºC, 10 segundos), anillamiento (55ºC, 30 segundos), y extensión (72ºC, 40 segundos), utilizando un termociclador marca Eppendorf modelo Mastercycler. En paralelo, y para comprobar la evolución de la actividad de los tubos desecados, se amplificaron muestras de ADN utilizando una mezcla fresca, en las mismas condiciones de amplificación.

El resultado de la reacción de amplificación se analizó en todos los casos en gel de agarosa 2% (peso/volumen), y se encontró en todos los casos en los que la amplificación fue positiva una única banda de 359 pb. La actividad de las mezclas de reacción desecadas y de las mezclas frescas fue medida mediante densiometría de la banda resultante de la amplificación, utilizando para ello un analizador de imágenes marca TDI modelo Gelprinter, usando el programa informático Gelsuper desarrollado también por TDI. Los resultados de la actividad de cada tubo desecado se expresan de forma semicuantitativa en relación a los resultados obtenidos con las mezclas frescas. Se consideró que las mezclas desecadas tenían:

actividad máxima (+++ en la Tabla 1) cuando la intensidad de la banda era un 90% \pm 10% con respecto a la mezcla fresca;

actividad óptima (++ en la Tabla 1) cuando la actividad oscilaba entre el 90% y el 50%,

actividad baja (+ en la Tabla 1) cuando era inferior al 50%, y

ausencia de actividad (- en la Tabla 1) cuando el resultado de la reacción de amplificación era negativo.

Los resultados de actividad obtenidos se pueden observar en la columna ``actividad ejemplo I'' de la Tabla 1. Como conclusión, si bien varias mezclas estabilizantes pueden considerarse correctas al conservar una buena actividad tras la desecación y posterior almacenamiento de la mezcla de reacción, son aquellas que contienen melezitosa o palatinitol, en conjunción con lisina y glucógeno o goma arábiga, o bien rafinosa con betaína y glucógeno, las que conservan una mayor actividad.

Ejemplo II Desecación de la mezcla de reacción para transcripción reversa de ARN y posterior amplificación del ADNc

La enzima transcriptasa en reverso termoestable usada en este ejemplo fue una ADN polimerasa recombinante de Thermus thermophilus con actividad transcriptasa en reverso mejorada respecto a la enzima indicada en el Ejemplo I, expresada en Escherichia coli, propiedad de Biotools B&M Labs S.A. (España), y purificada mediante un método no cromatográfico desarrollado por la misma empresa (RETROTOOLS cDNA/DNA Polymerase). Tras su purificación, la enzima se guardó a -20ºC en un tampón de almacenamiento conteniendo Tris ClH, 30 mM, pH 8, glucosa 25 mM, PMSF 0,5 mM, Tween 20 0,25% y NP40 0,25%. Se preparó un tampón de reacción para realizar la transcripción reversa conteniendo Tris HCl 75 mM, pH 8, (NH_{4})_{2}SO_{4} 200 mM, Tween 20 0,01%, MnCl_{2} 1,5 mM, y 0,125 mM de cada dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP).

A cada tubo de reacción de 0,2 mililitros utilizado en este experimento se añadieron 1,5 microlitros de dicha enzima (5 U/\mul) conservada en tampón de almacenamiento, 4 microlitros del tampón de reacción para la transcripción reversa, y 1 microlitro de una disolución conteniendo en proporción equimolar dATP, dCTP, dGTP y dTTP. En otro tubo de 0,2 ml se añaden 6 microlitros del tampón de reacción que consta de Tris HCl 75 mM, pH 8, (NH_{4})_{2}SO_{4} 20 mM, Tween 20 0,01%, EGTA 0,75 mM y MgCl_{2} 2 mM. Se prepararon diversos tubos de la forma antes descrita, y a cada uno de ellos se les añadió una de las mezclas estabilizantes que se recogen en la Tabla 1. Los tubos así preparados se desecaron en un evaporador centrífugo marca Eppendorf modelo 5301, a temperaturas comprendidas entre 10ºC y 60ºC, durante un periodo de tiempo comprendido entre 30 y 120 minutos. Las temperaturas y los tiempos antes citados varían según la mezcla estabilizante utilizada. Tras su desecación, los tubos fueron conservados a las temperaturas y tiempos indicados en la Tabla 1.

La actividad de las mezclas de reacción, y las de las mezclas frescas no desecadas fue ensayada mediante la reacción de amplificación de una región específica del gen CD8\alpha de ratón, de un tamaño de 1.122 pb, rehidratando la mezcla desecada con 15 microlitos de agua bidestilada, añadiendo 1,25 microlitros de los cebadores de reacción:

\newpage

II-1: 5'-CAAGGATGCTCTTGGCTCTT-3' (SEC. ID. Nº: 3); y

II-2: 5'-GTGGTAGCAGATGAGAGTGA-3' SEC. ID. Nº: 4), y

100 ng de ARN mensajero extraído de ratón hasta un volumen final de 20 microlitros. La mezcla de transcripción reversa así reconstituida se incubó a 60ºC durante 30 minutos para sintetizar el ADNc. A continuación, los tubos desecados con la mezcla de amplificación de ADN se rehidrataron con 30 \mul de H_{2}O. El volumen completo de tampón de reacción rehidratado se añadió a los tubos en los que se había realizado la reacción de transcripción reversa. A continuación, se realizaron 40 ciclos de desnaturalización (94ºC, 45 segundos), anillamiento (55ºC, 30 segundos) y extensión (72ºC, 1 minuto), utilizando un termociclador marca Eppendorf modelo Mastercycler. El experimento se diseñó de forma que los tubos utilizados para la reacción de transcripción reversa y los tubos utilizados en la reacción de amplificación de ADN subsiguiente hubieran sido desecados y almacenados en las mismas condiciones. Los productos de amplificación se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa 1% (peso/volumen), encontrándose en todos los casos en que la amplificación fue positiva una única banda de 1.122 pb. La intensidad de las bandas de amplificación de todas las muestras fue medida mediante densiometría de la banda resultante de la amplificación, utilizando para ello un analizador de imágenes marca TDI modelo Gelprinter, usando el programa informático Gelsuper desarrollado también por TDI. Los resultados de actividad de cada tubo desecado se expresan de forma semicuantitativa en relación a los resultados obtenidos con las mezclas frescas. Se consideró que las mezclas desecadas tenían:

actividad máxima (+++ en la Tabla 1) cuando la intensidad de la banda era un 90% \pm 10% con respecto a la mezcla fresca,

actividad baja (+ en la Tabla 1) cuando era inferior al 50%, y

Los resultados de actividad obtenidos se pueden observar en la columna ``actividad ejemplo II'' de la Tabla 1. Como conclusión, si bien varias mezclas estabilizantes pueden considerarse correctas al conservar una buena actividad tras la desecación y posterior almacenamiento de la mezcla de reacción, nuevamente son aquellas que contienen melezitosa o palatinitol, en conjunción con lisina y glucógeno o goma arábiga, o bien rafinosa con betaína y glucógeno, las que conservan una mayor actividad.

Ejemplo III Desecación de enzimas de restricción en conjunción con su tampón de corte

Se colocaron en los tubos eppendorf de 1,5 ml utilizados en este experimento 1 microlitro de la enzima de restricción HindIII (1 U/\mul) comercializada por MBI Fermentas, Lituania, junto con 1 microlitro del tampón 10X de corte suministrado por el fabricante junto a la enzima. Se prepararon diversos tubos de la forma antes descrita y, a cada uno de ellos, se le añadió el volumen adecuado de cada una de las distintas mezclas estabilizantes recogidas en la Tabla 1. Los tubos así preparados se desecaron en un evaporador centrífugo marca Eppendorf modelo 5301, a temperaturas comprendidas entre 10ºC y 60ºC, durante un periodo de tiempo comprendido entre 30 y 120 minutos. Las temperaturas y los tiempos antes citados varían según la mezcla estabilizante utilizada.

Tras su desecación, los tubos fueron conservados a las temperaturas indicadas en la Tabla 1. Su actividad fue ensayada una vez transcurrido el periodo de tiempo correspondiente indicado en dicha Tabla 1 mediante la digestión a 37ºC durante 2 horas de 0,3 microgramos de ADN (150 ng/\mul) del fago lambda, tras su rehidratación con 8 microlitros de agua bidestilada. Se realizó una electroforesis del resultado de la reacción de digestión en gel de agarosa 1% (peso/volumen), en paralelo con una digestión con una preparación fresca de enzima realizada en las mismas condiciones de tiempo y temperatura. La actividad de las enzimas desecadas se dividió en tres categorías:

A) actividad óptima (``digestión'' en la Tabla 1) cuando se obtenía la digestión completa del ADN, con un patrón de restricción idéntico al obtenido al digerir con la enzima fresca;

B) actividad media (``parcial'' en la Tabla 1) cuando se obtuvo un patrón de restricción diferente al obtenido con la enzima fresca, debido a la existencia de digestiones parciales; y

C) inactiva (``no corte'' en la Tabla 1) cuando se observó la ausencia completa de digestión.

Los resultados de la comparación de la actividad de la enzima de restricción desecada junto a su tampón de corte respecto a la actividad que presenta una digestión de iguales características producida por una enzima fresca no desecada se pueden observar en la columna ``actividad ejemplo III'' de la Tabla 1. Como conclusión, nuevamente son aquellas mezclas estabilizantes que contienen melezitosa o palatinitol, en conjunción con lisina y glucógeno o goma arábiga, o bien rafinosa con betaína y glucógeno, las que generan digestiones completas en tiempos de conservación más largos mientras que las otras mezclas ensayadas generan digestiones parciales o bien no cortan.

Otras enzimas de restricción tales como Mbo, Bgl II, Rsa I, Ava I, Ava II, y Acc I fueron igualmente ensayadas con idénticos resultados.

Ejemplo IV Desecación en tubo y sobre placa multipocillo de una mezcla de reacción que incluye cebadores oligonucleotídicos para la amplificación específica de una secuencia determinada de ADN

Se preparó una mezcla de reacción conteniendo además de todos los componentes especificados en el Ejemplo I, los cebadores de reacción descritos en la solicitud de patente española de invención co-pendiente nº ___ y que sirven para la identificación en una única reacción de amplificación multiplexada mediante un mecanismo de reacción semianidada en un solo paso, de las 4 especies de Plasmodium causantes del desarrollo de malaria en humanos, así como del ADN humano, el cual sirve de control positivo de reacción. En este método se analizan muestras de ADN humano extraído de sangre total mediante métodos habituales.

La reacción de amplificación simultánea del ADN de cada una de las 4 especies de Plasmodium y del control de amplificación de ADN humano se realiza incluyendo en un tubo de reacción separado (de 0,2 ml ó 0,5 ml) 25 \mul de una mezcla de reacción con la siguiente composición: Trizma base 75 mM, sulfato amónico 20 mM, 0,01% Tween 20, MgCl_{2} 5 mM, dATP 0,5 mM, dCTP 0,5 mM, dGTP 0,5 mM, dTTP 0,5 mM, cebador H1 (SEC. ID. Nº: 5) 0,04 \muM, cebador H_{2} (SEC. ID. Nº: 6) 0,04 \muM, cebador P1 (SEC. ID. Nº: 7) 2,25 \muM, cebador P2 (SEC. ID. Nº: 8) 0,01 \muM, cebador F (SEC. ID. Nº: 9) 0,6 mM, cebador M (SEC. ID. Nº: 10) 0,15 \muM, cebador O (SEC. ID. Nº: 11) 0,375 \muM, cebador V (SEC. ID. Nº: 12) 0,15 \muM y 2 unidades de la ADN polimerasa (BIOTOOLS DNA polymerase).

Se prepararon diversos tubos de la forma antes descrita, y a cada uno de ellos se les añadió una de las mezclas estabilizantes que se recogen en la Tabla 1, a diferentes concentraciones de cada uno de los elementos integrantes de las mezclas. Los tubos así preparados se desecaron en un evaporador centrífugo marca Eppendorf modelo 5301, a temperaturas comprendidas entre 10ºC y 60ºC, durante un periodo de tiempo comprendido entre 30 y 120 minutos. Las temperaturas y los tiempos antes citados varían según la mezcla estabilizante utilizada.

Tras su desecación, los tubos fueron conservados a las temperaturas indicadas en la Tabla 1. Tras los periodos de conservación indicados en dicha Tabla 1, se ensayó su actividad tras rehidratación de la mezcla desecada con 20 microlitos de agua bidestilada y 50 ng de ADN procedente de pacientes infectados con distintas especies de Plasmodium, hasta un volumen final de 25 microlitros. Asimismo, y como referencia de la actividad, se incluyeron tubos con mezcla fresca no desecada en todos los experimentos. Los ciclos de amplificación utilizados incluyen un ciclo inicial de calentamiento a 85ºC durante 3 minutos seguido de un paso de desnaturalización a 94ºC durante 7 minutos. A continuación, se realiza la ronda de amplificación propiamente dicha consistente en 40 ciclos repetidos cada uno de los cuales consta de un paso de desnaturalización a 94ºC durante 45 segundos, un paso de hibridación a 62ºC durante 45 segundos y un paso de elongación a 72ºC durante 1 minuto. Una vez finalizados los 40 ciclos de amplificación se realiza un último paso de elongación a 72ºC durante 10 minutos. La reacción de amplificación se realizó en un termociclador marca Eppendorf modelo Mastercycler. Se realizó una electroforesis del resultado de la reacción de amplificación en gel de agarosa 2% (peso/volumen), y se encontró en todos los casos en los que la amplificación fue positiva 2 bandas de 395 pb y 231 pb correspondientes a los productos de amplificación de P. falciparum y ADN humano respectivamente. La actividad de la mezcla de reacción desecada fue medida mediante densiometría de la banda resultante de la amplificación, utilizando para ello un analizador de imágenes marca TDI modelo Gelprinter, usando el programa informático Gelsuper desarrollado también por TDI. Los resultados de la actividad de cada tubo desecado se expresan de forma semicuantitativa en relación a los resultados obtenidos con las mezclas frescas. Se consideró que las mezclas desecadas tenían:

actividad baja (+ en la Tabla 1) cuando era inferior al 50%, y

Los resultados de actividad obtenidos se pueden observar en la columna ``actividad ejemplo IV'' de la Tabla 1. Como conclusión, si bien varias mezclas estabilizantes pueden considerarse correctas al conservar una buena actividad tras la desecación y posterior almacenamiento de la mezcla de reacción, son aquellas que contienen melezitosa o palatinitol, en conjunción con lisina y glucógeno o goma arábiga, o bien rafinosa con betaína y glucógeno, las que conservan una mayor actividad.

Igual procedimiento analítico se siguió depositando sobre cada pocillo de una placa multipocillo de poliestireno marca Nunc la mezcla de reacción citada previamente conteniendo los cebadores oligonucleotídicos, desecando la placa mediante su introducción en un desecador y haciendo vacío mediante una bomba. Se preparó una placa para cada punto de temperatura y tiempo analizados posteriormente. Asimismo, se prepararon en cada experimento pocillos frescos no desecados como referencia de actividad. Los condiciones de amplificación y análisis de resultados fueron iguales a los descritos anteriormente. Los resultados de la medición de la actividad de la muestra desecada coinciden plenamente con los obtenidos para el caso de los tubos antes citados.

Ejemplo V Desecación en tubo y sobre placa multipocillo de una mezcla de reacción que incluye cebadores oligonucleotídicos para la amplificación específica de una secuencia determinada de ARN

Se preparó una mezcla de reacción conteniendo además de todos los componentes especificados en el Ejemplo II, los cebadores de reacción descritos en la solicitud de patente española de invención co-pendiente nº ___ y que sirven para la detección genérica del genoma de enterovirus mediante un sistema acoplado de transcripción reversa seguido de una reacción de amplificación semi-anidada en un único tubo o pocillo.

Para la realización de la reacción de transcripción reversa se preparan por cada reacción 20 microlitros de una mezcla que contiene Tris HCl 75 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 20 mM, Tween 20 0,01%, MnCl_{2} 1,5 mM, 0,125 mM de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) y 10 picomoles del cebador EV1M: 5'-ACCCAAAGTAGTCGGTTCCGC-3' (SEC. ID. Nº: 13) y 7,5 unidades de la enzima ADN polimerasa indicada en el Ejemplo II.

Para la realización de la reacción de amplificación de ADN se preparan por cada reacción 30 microlitros de una mezcla que contiene Tris HCl 75 mM, pH 8, (NH_{4})_{2}SO_{4} 20 mM, Tween 20 0,01%, EGTA 0,75 mM, MgCl_{2} 2 mM, 10 picomoles del cebador EV2P: 5'-CAAGCATTCTGTTTCCCC-3' (SEC. ID. Nº: 14) y 0,5 picomoles del cebador EV1P: 5'-CGGTACCTTTGTRCGCCTGTT-3' (SEC. ID. Nº: 15).

Se prepararon diversos tubos de la forma antes descrita, y a cada uno de ellos se les añadió volúmenes distintos de cada una de las mezclas estabilizantes que aparecen en la Tabla 1. Los tubos así preparados se desecaron en un evaporador centrífugo marca Eppendorf modelo 5301, a temperaturas comprendidas entre 10ºC y 60ºC, durante un periodo de tiempo comprendido entre 30 y 120 minutos. Las temperaturas y los tiempos antes citados varían según la mezcla estabilizante utilizada.

Tras su desecación, los tubos fueron conservados a las temperaturas y tiempos indicados en la Tabla 1. Su actividad fue ensayada en los tiempos indicados también en la Tabla 1, tras rehidratación de la mezcla de transcripción reversa desecada con 15 microlitos de agua bidestilada, añadiendo 100 ng de ARN hasta un volumen final de 20 microlitros. Se realizaron 4 ciclos de 48ºC/5 minutos y 60ºC/15 minutos. Se resuspendió en 30 microlitros de agua bidestilada el tubo de 0,2 ml que se utilizó en la posterior reacción de amplificación del ADN, el cual contiene la misma mezcla estabilizante que su homólogo utilizado para la transcripción reversa, y su volumen se añadió sobre el tubo de 0,2 ml que contiene el producto de la transcripción reversa. Se realizaron 35 ciclos de desnaturalización (94ºC, 1 minuto), anillamiento (48ºC, 1 minuto) y extensión (72ºC, 1 minuto), utilizando un termociclador marca Eppendorf modelo Mastercycler. Se realizó una electroforesis del resultado de la reacción de amplificación en gel de agarosa 2% (peso/volumen), y se encontró en todos los casos que la amplificación fue positiva mostrando dos bandas de 390 y 489 pb. En todos los experimentos se incluyeron tubos con mezcla fresca que fueron utilizados como referencia de la actividad. La actividad de las mezclas de reacción desecadas y frescas fue medida mediante densiometría de la banda resultante de la amplificación, utilizando para ello un analizador de imágenes marca TDI modelo Gelprinter, usando el programa informático Gelsuper desarrollado también por TDI. Se consideró que las mezclas desecadas tenían:

máxima actividad (+++ en la Tabla 1) cuando la intensidad de la banda era un 90% \pm 10% con respecto a la mezcla fresca,

actividad baja (+ en la Tabla 1) cuando era inferior al 50%, y

Los resultados de la actividad obtenidos se pueden observar en la columna ``actividad ejemplo V'' de la Tabla 1. Como conclusión, si bien varias mezclas estabilizantes pueden considerarse correctas al conservar una buena actividad tras la desecación y posterior almacenamiento de la mezcla de reacción, son aquellas que contienen melezitosa o palatinitol, en conjunción con lisina y glucógeno o goma arábiga, o bien rafinosa con betaína y glucógeno, las que conservan una mayor actividad.

Igual procedimiento analítico se siguió depositando sobre cada pocillo de una placa multipocillo de poliestireno marca Nunc la mezcla de reacción citada conteniendo los cebadores oligonucleotídicos, desecando la placa mediante su introducción en un desecador y haciendo vacío mediante una bomba. Se preparó una placa para cada punto de temperatura y tiempo analizados posteriormente. Asimismo, se prepararon en cada experimento pocillos frescos no desecados como referencia de la actividad. Los condiciones de amplificación y análisis de resultados fueron iguales a los descritos anteriormente. Los resultados de la medición de la actividad de la muestra desecada coinciden plenamente con los obtenidos para el caso de los tubos antes citados.

Ejemplo VI Desecación en tubo y sobre placa multipocillo de una mezcla de reacción que incluye cebadores oligonucleotídicos para la amplificación específica de una secuencia determinada de ADN que posteriormente es sometida a análisis de restricción en una placa multipocillo que contiene desecadas en cada uno de los pocillos las enzimas de restricción necesarias para la realización de dicho análisis

Este sistema fue ensayado utilizando un método de identificación y tipado de papilomavirus. Dicho método consiste en un primer paso de co-amplificación de dos regiones del genoma viral: un fragmento de 450 pb de la región L1 conservada en el genoma de todos los papilomavirus, y un fragmento de 250 pb de la región E6-E7 que se encuentra presente únicamente en los papilomavirus oncogénicos. La mezcla de amplificación contiene Trizma base 75 mM, sulfato amónico 20 mM, 0,01% Tween 20, MgCl_{2} 2 mM, dATP 0,2 mM, dCTP 0,2 mM, dGTP 0,2 mM, dTTP 0,2 mM, 2,5 pmol de los cebadores:

VI-1: 5'-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3' (SEC. ID. Nº: 16), y

VI-2: 5'-CGTCCMARRGGAWACTGATC-3' (SEC. ID. Nº: 17), 1,25 pmol de los cebadores:

VI-3: 5'-TGTCAAAAACCGTTGTGTCC-3' (SEC. ID. Nº: 18), y

VI-4: 5'-GAGCTGTCGCTTAATTGCTC-3' (SEC. ID. Nº: 19), y

1 unidad de la enzima ADN polimerasa indicada en el Ejemplo I. El análisis de los productos de esta amplificación permite identificar la presencia de papilomavirus (banda de 450 pb) así como determinar si existe alguna especie oncogénica (250 pb). A continuación, la digestión con 5 enzimas de restricción (Rsa I, Acc I, Ava I, Ava II y Bgl II) permite caracterizar la especie de papiloma presente en cada muestra. Así, la banda amplificada de 250 pb (correspondiente a genoma oncogénico) de HPV 16, HPV 18 y HPV 33 es digerida únicamente por Ava II, rindiendo en cada caso un patrón de restricción diferente fácilmente diferenciable en geles de agarosa, la de HPV 31 es digerida por Rsa I, la de HPV 35 por Ava I, la de HPV 52b por Bgl II y la de HPV 58 por Acc I. Asimismo es posible tipificar los genotipos no oncogénicos por el patrón de digestión de la banda de 450 pb con la actividad Rsa I.

Se prepararon diversos tubos de la forma antes descrita, y a cada uno de ellos se les añadieron distintos volúmenes de las mezclas estabilizantes indicadas en Tabla 1. Asimismo se prepararon tubos con cada una de las enzimas de restricción anteriormente señaladas (1 unidad de cada enzima por tubo) y 1 microlitro de los tampones 10X de reacción respectivos. Todos los tubos así preparados se desecaron en un evaporador centrífugo marca Eppendorf modelo 5301, a temperaturas comprendidas entre 10ºC y 60ºC, durante un periodo de tiempo comprendido entre 30 y 120 minutos. Las temperaturas y los tiempos antes citados varían según la mezcla estabilizante utilizada.

Tras su desecación, los tubos fueron conservados a las temperaturas y tiempos indicados en la Tabla 1. Una vez transcurridos los periodos de conservación indicados en dicha Tabla 1, se ensayó su actividad tras rehidratación de la mezcla desecada con 45 microlitos de agua bidestilada y 25 ng de ADN extraído de un paciente infectado con HPV 18, hasta un volumen final de 50 microlitros. Se realizaron 30 ciclos de desnaturalización (94ºC, 30 segundos), anillamiento (50ºC, 1 minuto) y extensión (72ºC, 1 minuto), usando un termociclador marca Eppendorf modelo Mastercycler. Se realizó una electroforesis del resultado de la reacción de amplificación en gel de agarosa 2% (peso/volumen), y se encontró en todos los casos en los que la amplificación fue positiva 2 bandas de 250 y 450 pb respectivamente. La actividad de la mezcla de reacción desecada fue medida mediante densiometría de la banda resultante de la amplificación, utilizando para ello un analizador de imágenes marca TDI modelo Gelprinter, usando el programa informático Gelsuper desarrollado también por TDI. Se consideró que las mezclas desecadas tenían:

actividad baja (+ en la Tabla 1) cuando era inferior al 50%, y

A continuación, los tubos y pocillos desecados con las enzimas de restricción fueron resuspendidos con 10 microlitros de las amplificaciones realizadas con la mezcla fresca. Tras incubar las mezclas a 37ºC durante 30 minutos, los productos de digestión se analizaron en agarosa al 1,5%. Se considera:

actividad óptima (``digestión'' en la Tabla 1) la digestión completa de las bandas de 250 pares de bases (pb),

actividad media (``parcial'' en la Tabla 1) la digestión parcial de las bandas, e

inactiva (``no corte'' en la Tabla 1) la ausencia completa de digestión.

Los resultados densiométricos obtenidos tras la realización de las reacciones de amplificación se pueden observar en la columna ``actividad ejemplo VI'' de la Tabla 1. Como conclusión, si bien varias mezclas estabilizantes pueden considerarse correctas al conservar una buena actividad tras la desecación y posterior almacenamiento de la mezcla de reacción, son aquellas que contienen melezitosa o palatinitol, en conjunción con lisina y glucógeno o goma arábiga, o bien rafinosa con betaína y glucógeno, las que conservan una mayor actividad.

Con respecto a la actividad de las enzimas de restricción se obtuvieron resultados óptimos con las cinco enzimas utilizadas, en los casos en los que la mezcla utilizada en la desecación de la enzima de restricción contiene melezitosa o palatinitol, en conjunción con lisina y glucógeno o goma arábiga, o bien rafinosa con betaína y glucógeno.

Igual procedimiento analítico se siguió depositando sobre cada pocillo de una placa multipocillo de poliestireno marca Nunc la mezcla de reacción citada conteniendo los cebadores oligonucleotídicos, desecando la placa mediante su introducción en un desecador y haciendo vacío mediante una bomba. Se preparó una placa para cada punto de temperatura y tiempo analizados posteriormente. Asimismo, se prepararon en cada experimento pocillos frescos no desecados como referencia de actividad. Los condiciones de amplificación y análisis de resultados fueron iguales a los descritos anteriormente. Los resultados de la medición de la actividad de la muestra desecada coinciden plenamente con los obtenidos para el caso de los tubos antes citados.

Ejemplo VII Amplificación sobre placa multipocillo con oligonucleótidos unidos covalentemente y mezcla de reacción desecada de una secuencia determinada de ADN que posteriormente es analizada ante hibridación con una sonda biotinilida

Se utilizó este sistema para la amplificación e identificación del ADN de Plasmodium de muestras clínicas. Para ello se utilizaron placas multipocillo de poliestireno (Covalink NH Microwells, Nunc). A cada uno de los pocillos de la placa previamente se le había unido covalentemente el cebador genérico de Plasmodium P1 indicado en el Ejemplo IV, a través de su extremo 5', y que servirá como cebador en la reacción posterior de amplificación. A cada pocillo de las placas se le añadió la mezcla de reacción descrita en el Ejemplo IV así como los diferentes mezclas estabilizantes según se describen el Ejemplo IV y en la Tabla 1. Se prepararon tantas placas como puntos de temperatura y tiempos de almacenamiento se iban posteriormente a ensayar (Tabla 1). Una vez preparadas las placas, éstas se desecaron mediante su introducción en un desecador y haciendo vacío mediante una bomba.

Las muestras desecadas se rehidrataron con 20 microlitros de agua estéril, y se les añadió 5 microlitros de ADN procedente de pacientes infectados con Plasmodium a una concentración de 10 ng/\mul. Se procedió, a continuación, a realizar la reacción de amplificación en las condiciones descritas en el Ejemplo IV, utilizando un termociclador Eppendorf Gradient para placas multipocillo. En todos los casos se realizó una amplificación en las mismas condiciones utilizando una placa no desecada, para ser utilizada como referencia de actividad.

Una vez finalizada la reacción se retiró de cada pocillo la mezcla de reacción, de forma que en el pocillo quedó únicamente unido el producto de amplificación de doble banda. Dado que una de las bandas se ha sintetizado por elongación a partir del cebador genérico P1, esta banda quedó unida covalentemente al pocillo. Por el contrario la otra banda de ADN se encuentra unida a la primera mediante apareamiento de bases complementarias. Dado que para la subsiguiente reacción de hibridación es necesario utilizar como substrato ADN de banda simple, se procedió a lavar las placas con el objeto de eliminar la banda de ADN que no se encuentra covalentemente unida al pocillo y dejar únicamente la banda sintetizada a partir del oligonucleótido P1. Para ello se preparó un tampón de reacción cuya composición era 50% formamida, 5X SSC y 0,1% SDS. Se añadieron 50 microlitros de esta mezcla a cada pocillo y se incubó durante 10 minutos a 80ºC. A continuación, se retiró la mezcla y se repitió el proceso de lavado tres veces.

Las reacciones de hibridación se realizaron utilizando un oligonucleótido biotinilado. Para ello se incubó cada pocillo con 100 fmol de la sonda en tampón de reacción de hibridación que contenía 4X SSC, 10X Denhart y 200 \mug/ml de ADN de esperma de salmón, durante 2 horas a 60ºC. A continuación, se retiró la mezcla de hibridación y cada pocillo se lavó 2 veces con 200 \mul de una dilución 0,1X SSC, seguido de un lavado en un tampón de reacción ácido maleico 100 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM y 0,3% de Tween 20, y un último lavado en un tampón de reacción de bloqueo ácido maleico 100 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM y 0,1% BSA. Una vez finalizados los bloqueos se añadió a cada pocillo 1:2000 en el tampón de reacción de bloqueo anteriormente descrito, de estreptoavidina conjugada con peroxidasa, y se incubó a 23ºC durante 45 minutos. Finalmente los pocillos se lavaron tres veces con 200 microlitros de tampón de reacción ácido maleico 100 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM y 0,3% de Tween 20 y una vez con 200 microlitros de tampón de reacción ácido maleico 100 mM, pH 7,5 y NaCl 150 mM. Finalmente se añadió a cada pocillo 100 microlitros de TMB y se incubó 10 minutos en la oscuridad. Tras parar la reacción, se determinó la absorbancia a 450 nm, corrigiéndose todos los valores con el valor de absorbancia del plástico a 655 nm.

Se consideró que las mezclas desecadas tenían:

actividad máxima (+++ en la Tabla 1) cuando la medida de absorbancia era un 90% \pm 10% con respecto a la mezcla fresca,

actividad óptima (++ en la Tabla 1) cuando oscilaba entre el 90% y el 50%,

actividad baja (+ en la Tabla 1) cuando era inferior al 50%, y

ausencia de actividad (- en la Tabla 1) cuando la medida de absorbancia era similar a la obtenida en pocillos que no habían contenido ninguna mezcla de reacción.

Los resultados de actividad obtenidos se pueden observar en la columna ``actividad ejemplo VII'' de la Tabla 1. Como conclusión, si bien varias mezclas estabilizantes pueden considerarse correctas al conservar una buena actividad tras la desecación y posterior almacenamiento de la mezcla de reacción, nuevamente son aquellas que contienen melezitosa o palatinitol, en conjunción con lisina y glucógeno o goma arábiga, o bien rafinosa con betaína y glucógeno, las que conservan una mayor actividad.

\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\small\begin{tabular}{|l|c|c|c|c|c|c|c|c|c|}\hline
 Mezcla  \+ temperatu-  \+ tiempo de  \+ actividad  \+ actividad  \+
actividad  \+    actividad  \+ actividad  \+ actividad  \+ actividad
\\  de  \+ ra de con-  \+ conserva-  \+ ejemplo  \+ ejemplo  \+
ejemplo  \+ ejemplo  \+    ejemplo  \+ ejemplo  \+ ejemplo \\ 
reacción  \+ servación  \+ ción (días)  \+ I  \+ II  \+ III  \+ IV 
\+ V  \+ VI  \+ VII \\\hline  Sucrosa  \+ 37ºC  \+ 1  \+ +  \+ +  \+
Parciales  \+ +  \+  +  \+  +  \+  + \\\hline   \+ 50ºC  \+ 1  \+ - 
\+ -  \+ No corta  \+ -  \+   -   \+  -   \+ - \\\hline   \+ 25ºC 
\+ 8  \+ -  \+ -  \+ No corta  \+ -  \+   -   \+  -   \+  - \\\hline
  \+ 37ºC  \+ 8  \+ -  \+ -  \+ No corta  \+ -  \+   -   \+  -   \+ 
- \\\hline   \+ 50ºC  \+ 8  \+ -  \+ -  \+ No corta  \+ -  \+   -  
\+  -   \+  - \\\hline   \+ 4ºC  \+ 15  \+ -  \+ -  \+ No corta  \+
-  \+   -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 25ºC  \+ 15  \+ -  \+ -  \+
No corta  \+  -  \+   -  \+   -  \+   - \\\hline   \+ 37ºC  \+ 15 
\+ -  \+ -  \+ No corta  \+  -   \+  -  \+   -  \+   - \\\hline   \+
4ºC  \+ 30  \+ -  \+ -  \+ No corta  \+  -   \+  -   \+  -   \+   -
\\\hline   \+ 25ºC  \+ 30  \+ -  \+ -  \+ No corta  \+  -   \+  -  
\+  -   \+   - \\\hline   \+ 4ºC  \+ 60  \+ -  \+ -  \+ No corta  \+
 -   \+  -   \+  -   \+  - \\\hline  Rafinosa  \+ 37ºC  \+ 1  \+ + 
\+ +  \+ Parciales  \+  +  \+  +  \+ +  \+ + \\\hline   \+ 50ºC  \+ 
1  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -  \+   -  \+   -   \+  -
\\\hline   \+ 25ºC  \+  8  \+   +   \+  +     \+ Parciales  \+   + 
\+   -  \+   +  \+   + \\\hline   \+ 37ºC  \+  8  \+   -   \+  -    
\+ No corta  \+    -  \+   -  \+   -  \+   - \\\hline   \+ 50ºC  \+ 
8  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -  \+   -  \+   -  \+   -
\\\hline   \+ 4ºC  \+  15  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    - 
\+   -  \+   -  \+   - \\\hline   \+ 25ºC  \+ 15  \+   -   \+  -    
\+ No corta  \+    -  \+   -  \+   -  \+   - \\\hline   \+ 37ºC  \+
15  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -  \+   -  \+   -  \+   -
\\\hline   \+ 4ºC  \+  30  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    - 
\+   -  \+   -  \+   - \\\hline   \+ 25ºC  \+ 30  \+   -   \+  -    
\+ No corta  \+    -  \+   -  \+   -  \+   - \\\hline   \+ 4ºC  \+ 
60  \+ -      \+  -     \+ No corta  \+   -  \+   -  \+   -  \+   -
\\\hline  Palatinitol  \+ 37ºC  \+ 1  \+ +  \+ +  \+ Corta  \+ +  \+
+  \+ +  \+ + \\\hline   \+ 50ºC  \+    1  \+   +  \+   +     \+
Parciales  \+    +  \+   +  \+   +  \+   + \\\hline   \+ 25ºC  \+   
8  \+   -  \+   -     \+ No corta  \+    -   \+  -  \+   -   \+  -
\\\hline   \+ 37ºC  \+    8  \+   -  \+   -     \+ No corta  \+    -
  \+  -  \+   -   \+  - \\\hline   \+ 50ºC  \+    8  \+   -  \+   - 
   \+ No corta  \+    -   \+  -  \+   -   \+  - \\\hline   \+ 4ºC 
\+    15  \+   -  \+   -     \+ Parciales  \+    -  \+   -  \+   -  
\+  - \\\hline   \+ 25ºC  \+    15  \+   -  \+   -     \+ No corta 
\+    -  \+   -  \+   -   \+  - \\\hline   \+ 37ºC  \+    15  \+   -
 \+   -     \+ No corta  \+    -  \+   -  \+   -   \+  - \\\hline  
\+ 4ºC  \+    30  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  - 
\+   -   \+  - \\\hline   \+ 25ºC  \+    30  \+   -   \+  -     \+
No corta  \+    -  \+   -  \+   -   \+  - \\\hline   \+ 4ºC  \+   
60   \+  -   \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  -
\\\hline  Melezitosa  \+ 37ºC  \+ 1   \+  +   \+  +  \+ Corta  \+ 
++  \+ +  \+ +  \+ + \\\hline   \+ 50ºC  \+    1  \+   +   \+  +    
\+ Corta  \+    +   \+  +  \+   +   \+  + \\\hline   \+ 25ºC  \+   
8  \+   -   \+  -     \+ Parciales  \+    -  \+   -   \+  -  \+   -
\\\hline   \+ 37ºC  \+    8  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -
  \+  -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 50ºC  \+    8  \+   -   \+  - 
   \+ No corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 4ºC 
\+    15  \+   -   \+  -     \+ Parciales  \+    -  \+   -  \+   - 
\+   - \\\hline   \+ 25ºC  \+    15  \+   -   \+  -     \+ No corta 
\+    -  \+   -  \+   -   \+  - \\\hline   \+ 37ºC  \+    15  \+   -
 \+   -     \+ No corta  \+    -  \+   -   \+  -  \+   - \\\hline  
\+ 4ºC  \+    30  \+   -  \+   -     \+ No corta  \+    -   \+  -  
\+  -   \+  - \\\hline   \+ 25ºC  \+    30  \+   -  \+   -     \+ No
corta  \+    -   \+  -   \+  -  \+   - \\\hline   \+ 4ºC  \+    60 
\+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -   \+   -   \+  -   \+  -
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

(Continuación)

\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\small\begin{tabular}{|l|c|c|c|c|c|c|c|c|c|}\hline
 Mezcla  \+ temperatu-  \+ tiempo de  \+ actividad  \+ actividad  \+
actividad  \+    actividad  \+ actividad  \+ actividad  \+ actividad
\\  de  \+ ra de con-  \+ conserva-  \+ ejemplo  \+ ejemplo  \+
ejemplo  \+ ejemplo  \+    ejemplo  \+ ejemplo  \+ ejemplo \\ 
reacción  \+ servación  \+ ción (días)  \+ I  \+ II  \+ III  \+ IV 
\+ V  \+ VI  \+ VII \\\hline  Glicerol  \+   37ºC  \+  1  \+ ++  \+
++   \+ Corta  \+ ++  \+ ++  \+ ++   \+  ++ \\\hline   \+ 50ºC  \+  
 1  \+   +   \+  +     \+ Corta  \+    +   +  \+   +   \+  + \+
\\\hline   \+ 25ºC  \+    8  \+   +   \+  +     \+ Parciales  \+   
+   \+  +   \+  +   \+  + \\\hline   \+ 37ºC  \+    8  \+   +   \+ 
-     \+ Parciales  \+    +   \+  +   \+  +   \+  + \\\hline   \+
50ºC  \+    8  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -   \+ 
-   \+  - \\\hline   \+ 4ºC  \+    15  \+   +   \+  +     \+
Parciales  \+    +   \+  +  \+   +   \+  + \\\hline   \+ 25ºC  \+   
15  \+   -  \+   -     \+ No corta  \+    -   \+  -  \+   -   \+  -
\\\hline   \+ 37ºC  \+    15  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+   
-   \+  -  \+   -   \+  - \\\hline   \+ 4ºC  \+    30  \+   -   \+ 
-     \+ No corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  - \\\hline   \+
25ºC  \+    30  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -  \+ 
 -   \+  - \\\hline   \+ 4ºC  \+    60  \+   -  \+   -     \+ No
corta  \+    -   \+  -  \+   -   \+  - \\\hline  Lisina   \+ 37ºC 
\+    1  \+   ++   \+  ++     \+ Corta  \+  ++  \+   +   \+  ++  \+ 
 + \\\hline   \+ 50ºC  \+    1  \+  -  \+   -     \+ No corta  \+   
-   \+  -  \+   -   \+  - \\\hline   \+ 25ºC  \+    8  \+   -   \+ 
-     \+ No corta  \+    -  \+   -   \+  -  \+   - \\\hline   \+
37ºC  \+    8  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -  \+   -   \+ 
-  \+   - \\\hline   \+ 50ºC  \+    8  \+   -   \+  -     \+ No
corta  \+    -  \+   -   \+  -  \+   - \\\hline   \+ 4ºC  \+    15 
\+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -  \+   -   \+  -  \+   -
\\\hline   \+ 25ºC  \+    15  \+   -  \+   -     \+ No corta  \+   
-  \+   -  \+   -  \+   - \\\hline   \+ 37ºC  \+    15  \+   -  \+  
-     \+ No corta  \+    -  \+   -  \+   -  \+   - \\\hline   \+ 4ºC
 \+    30  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -  \+   -   \+  - 
\+   - \\\hline   \+ 25ºC  \+    30  \+   -  \+   -     \+ No corta 
\+    -  \+   -   \+  -  \+   - \\\hline   \+ 4ºC  \+    60  \+   - 
 \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -   \+  -  \+   - \\\hline 
Glucógeno  \+ 37ºC  \+    1   \+  ++  \+   ++     \+ Corta  \+    ++
  \+  ++  \+   ++  \+   ++ \\\hline   \+ 50ºC  \+    1  \+   +  \+  
+     \+ Parciales  \+    +  \+   +   \+  +  \+   + \\\hline   \+
25ºC  \+    8  \+   +   \+  +     \+ Parciales  \+    +  \+   +   \+
 +  \+   + \\\hline   \+ 37ºC  \+    8  \+   -   \+  -     \+ No
corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 50ºC  \+    8 
\+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -  \+   -   \+  -
\\\hline   \+ 4ºC  \+    15  \+   -   \+  -     \+ Parciales  \+   
-  \+   -   \+  -  \+   - \\\hline   \+  25ºC  \+    15  \+   -   \+
 -     \+ No corta  \+    -   \+  -   \+  -  \+   - \\\hline   \+ 
37ºC  \+    15  \+    -   \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -  
\+  -   \+  - \\\hline   \+ 4ºC  \+    30  \+   -   \+  -     \+ No
corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 25ºC  \+    30 
\+   -  \+   -     \+ No corta  \+    -   \+  -   \+  -  \+   -
\\\hline   \+ 4ºC  \+    60  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -
  \+  -   \+  -   \+  - \\\hline  Trehalosa+Lisina  \+ 37ºC  \+ 1 
\+ +++  \+ +++   \+ Corta  \+ +++  \+ +++  \+ +++  \+ +++ \\\hline  
\+ 50ºC  \+    1  \+   ++   \+  ++     \+ Corta  \+    ++   \+  ++ 
\+   ++  \+   ++ \\\hline   \+ 25ºC  \+    8  \+   ++   \+  ++    
\+ Corta  \+    ++   \+  ++  \+   ++  \+   ++ \\\hline   \+ 37ºC  \+
   8  \+   +   \+  +     \+ Parciales  \+    +  \+   +  \+   +   \+ 
+ \\\hline   \+ 50ºC  \+    8  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+   
-   \+  -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 4ºC  \+    15  \+   +   \+ 
++     \+ Parciales  \+    +  \+   +  \+   +  \+   + \\\hline   \+
25ºC  \+    15  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -  \+   -   \+
 -  \+   - \\\hline   \+ 37ºC  \+    15  \+   -  \+   -     \+ No
corta  \+    -  \+   -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 4ºC  \+    30 
\+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -  \+   -   \+  -   \+  -
\\\hline   \+ 25ºC  \+    30  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+   
-  \+   -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 4ºC  \+    60   \+  -  \+  
-     \+ No corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  -
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

(Continuación)

\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\small\begin{tabular}{|l|c|c|c|c|c|c|c|c|c|}\hline
 Mezcla  \+ temperatu-  \+ tiempo de  \+ actividad  \+ actividad  \+
actividad  \+    actividad  \+ actividad  \+ actividad  \+ actividad
\\  de  \+ ra de con-  \+ conserva-  \+ ejemplo  \+ ejemplo  \+
ejemplo  \+ ejemplo  \+    ejemplo  \+ ejemplo  \+ ejemplo \\ 
reacción  \+ servación  \+ ción (días)  \+ I  \+ II  \+ III  \+ IV 
\+ V  \+ VI  \+ VII \\\hline  Trehalosa+PVP  \+ 37ºC  \+    1   \+ 
+  \+   +   \+ Corta  \+ +  \+ +  \+ +  \+ + \\\hline   \+ 50ºC  \+ 
  1  \+   -   \+  -    \+ Parciales  \+    -  \+  -   \+  -   \+  -
\\\hline   \+ 25ºC  \+    3  \+   -   \+  -    \+ No corta  \+    - 
 \+  -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 37ºC  \+    8  \+   -   \+  -  
  \+ No corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 50ºC 
\+    8  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -   \+  -  
\+  - \\\hline   \+ 4ºC  \+    15  \+   -   \+  -     \+ No corta 
\+    -   \+  -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 25ºC  \+    15  \+   -
 \+   -     \+ No corta  \+    -  \+   -  \+   -  \+   - \\\hline  
\+ 37ºC  \+    15  \+   -  \+   -     \+ No corta  \+    -  \+   - 
\+   -  \+   - \\\hline   \+ 4ºC  \+    30  \+   -   \+  -     \+ No
corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 25ºC  \+    30 
\+   -  \+   -     \+ No corta  \+    -  \+   -  \+   -   \+  -
\\\hline   \+ 4ºC  \+    60  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -
  \+  -  \+   -   \+  - \\\hline  Sorbitol+PEG   \+ 37ºC  \+ 1  \+
++  \+ ++  \+ Corta  \+  +   \+  +   \+  +  \+   + \\\hline   \+
50ºC  \+    1  \+   +  \+   +     \+ Parciales  \+    +   \+  +   \+
 +  \+   + \\\hline   \+ 25ºC  \+    8  \+   -   \+  -     \+ No
corta  \+    -   \+  -  \+   -   \+  - \\\hline   \+ 37ºC  \+    8 
\+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -  \+   -   \+  -
\\\hline   \+ 50ºC  \+    8  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -
  \+  -  \+   -   \+  - \\\hline   \+ 4ºC  \+    15  \+   -   \+  - 
   \+ No corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 25ºC 
\+    15  \+   -  \+   -     \+ No corta  \+    -  \+   -  \+   - 
\+   - \\\hline   \+ 37ºC  \+    15  \+   -   \+  -     \+ No corta 
\+    -  \+   -  \+   -   \+  - \\\hline   \+ 4ºC  \+    30  \+   - 
 \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  - \\\hline  
\+ 25ºC  \+    30  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -  \+   - 
\+   -  \+   - \\\hline   \+ 4ºC  \+    60  \+   -   \+  -     \+ No
corta  \+    -   \+  -  \+   -   \+  - \\\hline  Rafinosa+betaína 
\+ 37ºC  \+ 1  \+ ++  \+ ++   \+ Corta  \+  ++  \+  ++  \+ ++  \+ 
++ \\\hline   \+ 50ºC  \+    1  \+   +   \+  +     \+ Parciales  \+ 
  +   \+  +   \+  +  \+   + \\\hline   \+ 25ºC  \+    8  \+  +   \+ 
+     \+ Parciales  \+    +    \+ +   \+  +   \+  + \\\hline   \+
37ºC  \+    8   \+  +   \+  -     \+ No corta  \+    +   \+  -   \+ 
+   \+  + \\\hline   \+ 50ºC  \+    8   \+  -   \+  -     \+ No
corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 4ºC  \+    15  
\+  +   \+  +     \+ Parciales  \+    -  \+   -   \+  -   \+  -
\\\hline   \+ 25ºC  \+    15   \+  -  \+   -     \+ No corta  \+   
-  \+   -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 37ºC  \+    15   \+  -   \+ 
-     \+ No corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 4ºC
 \+    30   \+  -   \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -   \+  -  
\+  - \\\hline   \+ 25ºC  \+    30   \+  -   \+  -     \+ No corta 
\+    -   \+  -  \+   -   \+  - \\\hline   \+ 4ºC  \+    60   \+  - 
 \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -  \+   -   \+  - \\\hline 
Melezitosa+Lisina  \+ 37ºC  \+ 1  \+ ++  \+ ++  \+ Corta  \+ ++  \+
++  \+ ++  \+ ++ \\\hline   \+ 50ºC  \+    1  \+   +   \+  +     \+
Parciales  \+    +   \+  +  \+   +  \+   + \\\hline   \+ 25ºC  \+   
8  \+   +   \+  +     \+ Parciales  \+    +  \+   +  \+   +  \+   +
\\\hline   \+ 37ºC  \+    8  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -
  \+  -  \+   -   \+  - \\\hline   \+ 50ºC  \+    8  \+   -   \+  - 
   \+ No corta  \+    -   \+  -  \+   -   \+  - \\\hline   \+ 4ºC 
\+    15  \+   +   \+  -     \+ Parciales  \+    +  \+   -  \+   - 
\+   - \\\hline   \+ 25ºC  \+    15  \+   -   \+  -     \+ No corta 
\+    -  \+   -  \+   -  \+   - \\\hline   \+ 37ºC  \+    15  \+   -
  \+  -     \+ No corta  \+    -  \+   -  \+   -   \+  - \\\hline  
\+ 4ºC  \+    30   \+  -  \+   -     \+ No corta  \+    -   \+  - 
\+   -   \+  - \\\hline   \+ 25ºC  \+    30  \+   -  \+   -     \+
No corta  \+    -  \+   -  \+   -   \+  - \\\hline   \+ 4ºC  \+   
60   \+  -   \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -  \+   -   \+  -
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

(Continuación)

\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\small\begin{tabular}{|l|c|c|c|c|c|c|c|c|c|}\hline
 Mezcla  \+ temperatu-  \+ tiempo de  \+ actividad  \+ actividad  \+
actividad  \+    actividad  \+ actividad  \+ actividad  \+ actividad
\\  de  \+ ra de con-  \+ conserva-  \+ ejemplo  \+ ejemplo  \+
ejemplo  \+ ejemplo  \+    ejemplo  \+ ejemplo  \+ ejemplo \\ 
reacción  \+ servación  \+ ción (días)  \+ I  \+ II  \+ III  \+ IV 
\+ V  \+ VI  \+ VII \\\hline  Melezitosa+  \+ 37ºC  \+  1  \+ +  \+
+   \+ Parciales  \+  +  \+ +  \+ +  \+ + \\  glucógeno \+ \+ \+ \+
\+ \+ \+ \+ \+ \\\hline   \+ 50ºC  \+    1  \+   -  \+   -    \+ No
corta  \+    -   \+  -   \+  -  \+   - \\\hline   \+ 25ºC  \+    8 
\+   -   \+  -    \+ No corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  -
\\\hline   \+ 37ºC  \+    8  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -
  \+  -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 50ºC  \+    8  \+   -   \+  - 
   \+ No corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 4ºC 
\+    15  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -   \+  -  
\+  - \\\hline   \+ 25ºC  \+    15  \+   -   \+  -     \+ No corta 
\+    -  \+   -   \+  -  \+   - \\\hline   \+ 37ºC  \+    15  \+   -
  \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  - \\\hline  
\+ 4ºC  \+    30  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -  
\+  -   \+  - \\\hline   \+ 25ºC  \+    30  \+   -   \+  -     \+ No
corta  \+    -   \+  -  \+   -   \+  - \\\hline   \+ 4ºC  \+    60 
\+   -  \+   -     \+ No corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  -
\\\hline  Lisina+glucógeno   \+  37ºC  \+ 1  \+ ++  \+ ++  \+ Corta 
\+  ++  \+ ++  \+ ++  \+ ++ \\\hline   \+ 50ºC  \+    1   \+  +   \+
 +     \+ Parciales  \+    +   \+  +   \+  +  \+   + \\\hline   \+
25ºC  \+    8   \+  +   \+  +     \+ Parciales  \+    +   \+  +   \+
 +  \+   + \\\hline   \+ 37ºC  \+    8   \+  -   \+  -     \+ No
corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 50ºC  \+    8  
\+  -   \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  -
\\\hline   \+ 4ºC  \+    15   \+  -   \+  -     \+ No corta  \+    -
  \+  -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 25ºC  \+    15  \+   -  \+   -
    \+ No corta  \+    -  \+   -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 37ºC 
\+    15  \+   -  \+   -     \+ No corta  \+    -   \+  -  \+   -  
\+  - \\\hline   \+ 4ºC  \+    30  \+   -   \+  -     \+ No corta 
\+    -  \+   -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 25ºC  \+    30  \+   -
 \+   -     \+ No corta  \+    -  \+   -   \+  -   \+  - \\\hline  
\+ 4ºC  \+    60   \+  -   \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -  
\+  -   \+  - \\\hline  Melezitosa+lisina  \+ 37ºC  \+ 1  \+ ++  \+
++  \+ Corta  \+ ++  \+ ++  \+ ++  \+ ++ \\  +PEG \+ \+ \+ \+ \+ \+
\+ \+ \+ \\\hline   \+ 50ºC  \+    1  \+   +   \+  +     \+
Parciales  \+    +   \+  +   \+  +  \+   + \\\hline   \+ 25ºC  \+   
8  \+   +   \+  +     \+ Parciales  \+    +   \+  +   \+  +  \+   +
\\\hline   \+ 37ºC  \+    8  \+   -   \+  -     \+ Parciales  \+   
-   \+  -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 50ºC  \+    8   \+  -   \+ 
-     \+ No corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 4ºC
 \+    15   \+  +   \+  +     \+ Parciales  \+    +   \+  +   \+  - 
 \+  - \\\hline   \+ 25ºC  \+    15   \+  -   \+  -     \+ No corta 
\+    -  \+   -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 37ºC  \+    15  \+   -
  \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  - \\\hline  
\+ 4ºC  \+    30   \+  -   \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -  
\+  -   \+  - \\\hline   \+ 25ºC  \+    30   \+  -   \+  -     \+ No
corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 4ºC  \+    60  
\+  -   \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  -
\\\hline  Melezitosa+lisina  \+ 37ºC  \+ 1  \+ +  \+ +  \+ Corta  \+
 +  \+ +  \+ +  \+ + \\  +PVP \+ \+ \+ \+ \+ \+ \+ \+ \+ \\\hline  
\+ 50ºC  \+    1   \+  -  \+   -     \+ No corta  \+    -   \+  - 
\+   -   \+  - \\\hline   \+ 25ºC  \+    8   \+  -  \+   -     \+ No
corta  \+    -   \+  -  \+   -   \+  - \\\hline   \+ 37ºC  \+    8  
\+  -  \+   -     \+ No corta  \+    -   \+  -  \+   -   \+  -
\\\hline   \+ 50ºC  \+    8   \+  -  \+   -     \+ No corta  \+    -
  \+  -  \+   -   \+  - \\\hline   \+ 4ºC  \+    15   \+  +   \+  + 
   \+ Parciales  \+    +  \+   +  \+   -  \+   - \\\hline   \+ 25ºC 
\+    15  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -  \+   -  \+   - 
\+   - \\\hline   \+ 37ºC  \+    15  \+   -   \+  -     \+ No corta 
\+    -  \+   -   \+  -  \+   - \\\hline   \+ 4ºC  \+    30  \+   - 
 \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  - \\\hline  
\+ 25ºC  \+    30  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -  \+   -  
\+  -  \+   - \\\hline   \+ 4ºC  \+    60   \+  -  \+   -     \+ No
corta  \+    -   \+   -   \+  -  \+   -
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

(Continuación)

\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\small\begin{tabular}{|l|c|c|c|c|c|c|c|c|c|}\hline
 Mezcla  \+ temperatu-  \+ tiempo de  \+ actividad  \+ actividad  \+
actividad  \+    actividad  \+ actividad  \+ actividad  \+ actividad
\\  de  \+ ra de con-  \+ conserva-  \+ ejemplo  \+ ejemplo  \+
ejemplo  \+ ejemplo  \+    ejemplo  \+ ejemplo  \+ ejemplo \\ 
reacción  \+ servación  \+ ción (días)  \+ I  \+ II  \+ III  \+ IV 
\+ V  \+ VI  \+ VII \\\hline  Melezitosa+lisina  \+ 37ºC  \+ 1  \+ -
 \+ -  \+ No corta  \+  -  \+ -   \+  -  \+   - \\  +dextrano \+ \+
\+ \+ \+ \+ \+ \+ \+ \\\hline   \+ 50ºC  \+    1  \+   -   \+  -    
\+ No corta  \+    -  \+  -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 25ºC  \+  
 8  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -  \+   -   \+  -  \+   -
\\\hline   \+ 37ºC  \+    8  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -
 \+   -   \+  -  \+   - \\\hline   \+ 50ºC  \+    8  \+   -   \+  - 
   \+ No corta  \+    -  \+   -   \+  -  \+   - \\\hline   \+ 4ºC 
\+    15  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -  \+   -   \+  -  
\+  - \\\hline   \+ 25ºC  \+    15  \+   -   \+  -     \+ No corta 
\+    -  \+   -  \+   -  \+   - \\\hline   \+ 37ºC  \+    15  \+   -
  \+  -     \+ No corta  \+    -  \+   -   \+  -   \+  - \\\hline  
\+ 4ºC  \+    30  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -  
\+  -   \+  - \\\hline   \+ 25ºC  \+    30  \+   -   \+  -     \+ No
corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 4ºC  \+    60 
\+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  -
\\\hline  Melezitosa+lisina  \+ 37ºC  \+ 1  \+ +++  \+ +++  \+ Corta
 \+  +++  \+ +++   \+ +++  \+ +++ \\  +glucógeno \+ \+ \+ \+ \+ \+
\+ \+ \+ \\\hline   \+ 50ºC  \+    1  \+   ++   \+  ++     \+ Corta 
\+    ++   \+  ++   \+  +++   \+  +++ \\\hline   \+ 25ºC  \+    8 
\+   ++  \+   ++     \+ Corta  \+    ++   \+  ++   \+  ++   \+  ++
\\\hline   \+ 37ºC  \+    8  \+   +   \+  +     \+ Parciales  \+   
+   \+  +   \+  +   \+  + \\\hline   \+ 50ºC  \+    8  \+   -   \+ 
-     \+ No corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 4ºC
 \+    15  \+   ++   \+  ++     \+ Corta  \+    ++   \+  ++   \+ 
+++  \+   +++ \\\hline   \+ 25ºC  \+    15  \+   +   \+  +     \+
Parciales  \+    +  \+   +  \+   +   \+  + \\\hline   \+ 37ºC  \+   
15  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  -
\\\hline   \+ 4ºC  \+    30  \+   ++   \+  ++     \+ Corta  \+    ++
  \+  ++   \+  ++   \+  ++ \\\hline   \+ 25ºC  \+    30  \+   -   \+
 -     \+ No corta  \+    -  \+   -   \+  -   \+  - \\\hline   \+
4ºC  \+    60  \+   ++   \+  ++     \+ Corta  \+    ++   \+  ++   \+
 ++   \+  ++ \\\hline  Melezitosa+lisina  \+ 37ºC  \+ 1  \+ +++  \+
+++   \+ Corta  \+ +++  \+ +++  \+ +++  \+ +++ \\  +goma arábiga \+
\+ \+ \+ \+ \+ \+ \+ \+ \\\hline   \+ 50ºC  \+    1  \+   ++  \+  
++     \+ Corta  \+    ++   \+  ++   \+  ++   \+  ++ \\\hline   \+
25ºC  \+    8  \+   ++   \+  ++     \+ Corta  \+    ++   \+  ++   \+
 ++   \+  ++ \\\hline   \+ 37ºC  \+    8  \+   +   \+  +     \+
Parciales  \+    +  \+   +   \+  +   \+  + \\\hline   \+ 50ºC  \+   
8  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  -
\\\hline   \+ 4ºC  \+    15  \+   ++   \+  ++     \+ Corta  \+    ++
  \+  ++   \+  +   \+  + \\\hline   \+ 25ºC  \+    15  \+   -   \+ 
-     \+ No corta  \+    -  \+   -   \+  -   \+  - \\\hline   \+
37ºC  \+    15  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -  \+ 
 -   \+  - \\\hline   \+ 4ºC  \+    30  \+   +   \+  +     \+
Parciales  \+    +   \+  +  \+   +   \+  + \\\hline   \+ 25ºC  \+   
30  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -  \+   -   \+  -
\\\hline   \+ 4ºC  \+    60  \+  +   \+  +     \+ Parciales  \+    +
  \+  +   \+  +   \+  + \\\hline  Melezitosa+betaína  \+ 37ºC  \+ 1 
\+ +++  \+ +++   \+ Corta  \+ +++   \+ +++  \+ +++  \+ +++ \\ 
+glucógeno \+ \+ \+ \+ \+ \+ \+ \+ \+ \\\hline   \+ 50ºC  \+    1 
\+   +   \+  +     \+ Parciales  \+    ++   \+  ++  \+   +   \+  +
\\\hline   \+ 25ºC  \+    8  \+   +   \+  +     \+ Parciales  \+   
+  \+   +  \+   +   \+  + \\\hline   \+ 37ºC  \+    8  \+   -   \+ 
-     \+ No corta  \+    -   \+  -  \+   -   \+  - \\\hline   \+
50ºC  \+    8  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -  \+  
-   \+  - \\\hline   \+ 4ºC  \+    15  \+   +   \+  +     \+
Parciales  \+    +  \+   +  \+   +   \+  + \\\hline   \+ 25ºC  \+   
15  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -  \+   -  \+   -   \+  -
\\\hline   \+ 37ºC  \+    15  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+   
-  \+   -  \+   -   \+  - \\\hline   \+ 4ºC  \+    30   \+  +   \+ 
+     \+ Parciales  \+    +  \+   +  \+   +   \+  + \\\hline   \+
25ºC  \+    30   \+  -   \+  -     \+ No corta  \+    -  \+   -  \+ 
 -   \+  - \\\hline   \+ 4ºC  \+    60   \+  -   \+  -     \+ No
corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  -
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

(Continuación)

\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\small\begin{tabular}{|l|c|c|c|c|c|c|c|c|c|}\hline
 Mezcla  \+ temperatu-  \+ tiempo de  \+ actividad  \+ actividad  \+
actividad  \+    actividad  \+ actividad  \+ actividad  \+ actividad
\\  de  \+ ra de con-  \+ conserva-  \+ ejemplo  \+ ejemplo  \+
ejemplo  \+ ejemplo  \+    ejemplo  \+ ejemplo  \+ ejemplo \\ 
reacción  \+ servación  \+ ción (días)  \+ I  \+ II  \+ III  \+ IV 
\+ V  \+ VI  \+ VII \\\hline  Rafinosa+betaína  \+ 37ºC  \+ 1  \+
+++  \+ +++  \+ Corta  \+  +++  \+ +++  \+ +++  \+ +++ \\ 
+glucógeno \+ \+ \+ \+ \+ \+ \+ \+ \+ \\\hline   \+ 50ºC  \+    1  
\+  +  \+   +     \+ Parciales  \+    +   \+  +   \+  +  \+   +
\\\hline   \+ 25ºC  \+    8   \+  ++  \+   ++     \+ Corta  \+    ++
  \+  ++   \+  +  \+   ++ \\\hline   \+ 37ºC  \+    8   \+  -   \+ 
-     \+ No corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  - \\\hline   \+
50ºC  \+    8   \+  -   \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -   \+ 
-   \+  - \\\hline   \+ 4ºC  \+    15   \+  +   \+  +     \+
Parciales  \+    +  \+   +   \+  +   \+  + \\\hline   \+ 25ºC  \+   
15  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  -
\\\hline   \+ 37ºC  \+    15  \+   -  \+   -     \+ No corta  \+   
-   \+  -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 4ºC  \+    30  \+   +   \+ 
+     \+ Parciales  \+    -   \+  -   \+  +   \+  + \\\hline   \+
25ºC  \+    30  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -   \+
 -   \+  - \\\hline   \+ 4ºC  \+    60  \+   -   \+  -     \+ No
corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  - \\\hline  Trehalosa  \+ 37ºC 
\+  1  \+ +++  \+ +++  \+ Corta  \+ +++   \+  +++  \+   +++  \+  
+++ \\\hline   \+ 50ºC  \+    1   \+  ++   \+  ++     \+ Corta  \+  
 +  \+   ++   \+  ++   \+  ++ \\\hline   \+ 25ºC  \+    8   \+  +  
\+  +     \+ Parciales  \+    +   \+  +   \+  +  \+   + \\\hline  
\+ 37ºC  \+    8   \+  -   \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -  
\+  -   \+  - \\\hline   \+ 50ºC  \+    8   \+  -   \+  -     \+ No
corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 4ºC  \+    15  
\+  ++   \+  ++     \+ Corta  \+    ++   \+  ++   \+  +   \+  +
\\\hline   \+ 25ºC  \+    15   \+  +   \+  +     \+ Parciales  \+   
+  \+   +   \+  +   \+  + \\\hline   \+ 37ºC  \+    15   \+  -   \+ 
-     \+ No corta  \+    -  \+   -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 4ºC
 \+    30   \+  +   \+  +     \+ Parciales  \+    +  \+   +   \+  + 
\+   + \\\hline   \+ 25ºC  \+    30   \+  -   \+  -     \+ No corta 
\+    -  \+   -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 4ºC  \+    60   \+  + 
 \+  +     \+ Parciales  \+    -  \+   -   \+  -   \+  - \\\hline 
Sorbitol  \+ 37ºC  \+ 1  \+ ++  \+ ++  \+ Corta  \+  ++  \+ +  \+ ++
 \+ ++ \\\hline   \+ 50ºC  \+    1   \+  ++  \+   ++     \+
Parciales  \+    +  \+   +  \+   ++   \+  ++ \\\hline   \+ 25ºC  \+ 
  8   \+  +   \+  +     \+ Parciales  \+    +   \+  +   \+  +   \+ 
+ \\\hline   \+ 37ºC  \+    8   \+  +   \+  +     \+ Parciales  \+  
 +   \+  +   \+  +   \+  + \\\hline   \+ 50ºC  \+    8   \+  -   \+ 
-     \+ No corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 4ºC
 \+    15   \+  +   \+  +     \+ Parciales  \+    +   \+  +   \+  + 
 \+  + \\\hline   \+ 25ºC  \+    15  \+   -  \+   -     \+ No corta 
\+    -   \+  -   \+  -   \+  - \\\hline   \+ 37ºC  \+    15  \+   -
  \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  - \\\hline  
\+ 4ºC  \+    30  \+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -  
\+  -   \+  - \\\hline   \+ 25ºC  \+    30  \+   -   \+  -     \+ No
corta  \+    -  \+   -   \+  -  \+   - \\\hline   \+ 4ºC  \+    60 
\+   -   \+  -     \+ No corta  \+    -   \+  -   \+  -   \+  -
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): SOLICITANTE:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE: BIOTOOLS BIOTECHNOLOGICAL & MEDICAL LABORATORIES, S.A.

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CALLE: Valle de Tobalina, 52; nave 43

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CIUDAD: Madrid

\vskip0.333000\baselineskip

(D): PROVINCIA: Madrid

\vskip0.333000\baselineskip

(E): PAÍS: España

\vskip0.333000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 28021

\vskip0.333000\baselineskip

(G): TELÉFONO: 91 796 13 00

\vskip0.333000\baselineskip

(H): TELEFAX: 91 505 31 18

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DE MEZCLAS DE REACCIÓN ESTABILIZADAS, TOTAL O PARCIALMENTE DESECADAS, QUE COMPRENDEN, AL MENOS, UNA ENZIMA, MEZCLAS DE REACCIÓN Y KITS QUE LAS CONTIENEN

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 19

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TIPO DE SOPORTE: Floppy disk

\vskip0.333000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.333000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEP)

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. N°: 1

: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

: LONGITUD: 23 bases

: TIPO: Nucleótido

: NÚMERO DE HEBRAS: Hebra sencilla

: TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (oligo-desoxinucleótido)

: HIPOTÉTICA: No

: ANTI-SENTIDO: No

: FUENTE DE ORIGEN: De no aplicación

SEC. ID. N°: 1:

CCATCCATCT CAGCATGATG AAA

hfill

23

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. N°: 2

: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

: LONGITUD: 26 bases

: TIPO: Nucleótido

: NÚMERO DE HEBRAS: Hebra sencilla

: TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (oligo-desoxinucleótido)

: HIPOTÉTICA: No

: ANTI-SENTIDO: No

: FUENTE DE ORIGEN: De no aplicación

SEC. ID. N°: 2:

GCCCCTCAGA ATGATATTTG TCCTCA

\hfill

26

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. N°: 3

: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

: LONGITUD: 20 bases

: TIPO: Nucleótido

: NÚMERO DE HEBRAS: Hebra sencilla

: TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (oligo-desoxinucleótido)

: HIPOTÉTICA: No

: ANTI-SENTIDO: No

: FUENTE DE ORIGEN: De no aplicación

SEC. ID. N°: 3:

CAAGGATGCT CTTGGCTCTT

\hfill

20

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. N°: 4

: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

: LONGITUD: 20 bases

: TIPO: Nucleótido

: NÚMERO DE HEBRAS: Hebra sencilla

: TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (oligo-desoxinucleótido)

: HIPOTÉTICA: No

: ANTI-SENTIDO: No

: FUENTE DE ORIGEN: De no aplicación

SEC. ID. N°: 4:

GTGGTAGCAG ATGAGAGTGA

\hfill

20

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. N°: 5

: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

: LONGITUD: 22 bases

: TIPO: Nucleótido

: NÚMERO DE HEBRAS: Hebra sencilla

: TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (oligo-desoxinucleótido)

: HIPOTÉTICA: No

: ANTI-SENTIDO: No

: FUENTE DE ORIGEN: De no aplicación

SEC. ID. N°: 5:

GCATAAGGAA TGCAAAGAAC AG

\hfill

22

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. N°: 6

: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

: LONGITUD: 19 bases

: TIPO: Nucleótido

: NÚMERO DE HEBRAS: Hebra sencilla

: TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (oligo-desoxinucleótido)

: HIPOTÉTICA: No

: ANTI-SENTIDO: No

: FUENTE DE ORIGEN: De no aplicación

SEC. ID. N°: 6:

AGGACTTCCA AGCCGAAGC

\hfill

19

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. N°: 7

: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

: LONGITUD: 22 bases

: TIPO: Nucleótido

: NÚMERO DE HEBRAS: Hebra sencilla

: TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (oligo-desoxinucleótido)

: HIPOTÉTICA: No

: ANTI-SENTIDO: No

: FUENTE DE ORIGEN: De no aplicación

SEC. ID. N°: 7:

AGTGTGTATC CAATCGAGTT TC

\hfill

22

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. N°: 8

: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

: LONGITUD: 21 bases

: TIPO: Nucleótido

: NÚMERO DE HEBRAS: Hebra sencilla

: TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (oligo-desoxinucleótido)

: HIPOTÉTICA: No

: ANTI-SENTIDO: No

: FUENTE DE ORIGEN: De no aplicación

SEC. ID. N°: 8:

CGCAGTTGCT TGTCTCCAGA A

\hfill

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. N°: 9

: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

: LONGITUD: 18 bases

: TIPO: Nucleótido

: NÚMERO DE HEBRAS: Hebra sencilla

: TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (oligo-desoxinucleótido)

: HIPOTÉTICA: No

: ANTI-SENTIDO: No

: FUENTE DE ORIGEN: De no aplicación

SEC. ID. N°: 9:

GAGCCGCCTG GATACCGC

\hfill

18

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. N°: 10

: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

: LONGITUD: 21 bases

: TIPO: Nucleótido

: NÚMERO DE HEBRAS: Hebra sencilla

: TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (oligo-desoxinucleótido)

: HIPOTÉTICA: No

: ANTI-SENTIDO: No

: FUENTE DE ORIGEN: De no aplicación

SEC. ID. N°: 10:

CGCTCTGGTC CGTCTTGCGC C

\hfill

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. N°: 11

: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

: LONGITUD: 21 bases

: TIPO: Nucleótido

: NÚMERO DE HEBRAS: Hebra sencilla

: TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (oligo-desoxinucleótido)

: HIPOTÉTICA: No

: ANTI-SENTIDO: No

: FUENTE DE ORIGEN: De no aplicación

SEC. ID. N°: 11:

AGTTCCCCTA GAATAGTTAC A

\hfill

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. N°: 12

: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

: LONGITUD: 19 bases

: TIPO: Nucleótido

: NÚMERO DE HEBRAS: Hebra sencilla

: TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (oligo-desoxinucleótido)

: HIPOTÉTICA: No

: ANTI-SENTIDO: No

: FUENTE DE ORIGEN: De no aplicación

SEC. ID. N°: 12:

GCCCTCCAAT TGCCTTCTG

\hfill

19

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. N°: 13

: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

: LONGITUD: 21 bases

: TIPO: Nucleótido

: NÚMERO DE HEBRAS: Hebra sencilla

: TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (oligo-desoxinucleótido)

: HIPOTÉTICA: No

: ANTI-SENTIDO: No

: FUENTE DE ORIGEN: De no aplicación

SEC. ID. N°: 13:

ACCCAAAGTA GTCGGTTCCG C

\hfill

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. N°: 14

: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

: LONGITUD: 19 bases

: TIPO: Nucleótido

: NÚMERO DE HEBRAS: Hebra sencilla

: TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (oligo-desoxinucleótido)

: HIPOTÉTICA: No

: ANTI-SENTIDO: No

: FUENTE DE ORIGEN: De no aplicación

SEC. ID. N°: 14:

CAAGCACTTC TGTTTCCCC

\hfill

19

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. N°: 15

: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

: LONGITUD: 21 bases

: TIPO: Nucleótido

: NÚMERO DE HEBRAS: Hebra sencilla

: TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (oligo-desoxinucleótido)

: HIPOTÉTICA: No

: ANTI-SENTIDO: No

: FUENTE DE ORIGEN: De no aplicación

SEC. ID. N°: 15:

CGGTACCTTT GTRCGCCTGT T

\hfill

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. N°: 16

: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

: LONGITUD: 20 bases

: TIPO: Nucleótido

: NÚMERO DE HEBRAS: Hebra sencilla

: TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (oligo-desoxinucleótido)

: HIPOTÉTICA: No

: ANTI-SENTIDO: No

: FUENTE DE ORIGEN: De no aplicación

SEC. ID. N°: 16:

GCMCAGGGWC ATAAYAATGG

\hfill

20

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. N°: 17

: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

: LONGITUD: 20 bases

: TIPO: Nucleótido

: NÚMERO DE HEBRAS: Hebra sencilla

: TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (oligo-desoxinucleótido)

: HIPOTÉTICA: No

: ANTI-SENTIDO: No

: FUENTE DE ORIGEN: De no aplicación

SEC. ID. N°: 17:

CGTCCMARRG GAWACTGATC

\hfill

20

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. N°: 18

: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

: LONGITUD: 20 bases

: TIPO: Nucleótido

: NÚMERO DE HEBRAS: Hebra sencilla

: TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (oligo-desoxinucleótido)

: HIPOTÉTICA: No

: ANTI-SENTIDO: No

: FUENTE DE ORIGEN: De no aplicación

SEC. ID. N°: 18:

TGTCAAAAAC CGTTGTGTCC

\hfill

20

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. N°: 19

: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

: LONGITUD: 20 bases

: TIPO: Nucleótido

: NÚMERO DE HEBRAS: Hebra sencilla

: TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (oligo-desoxinucleótido)

: HIPOTÉTICA: No

: ANTI-SENTIDO: No

: FUENTE DE ORIGEN: De no aplicación

SEC. ID. N°: 19:

GAGCTGTCGC TTAATTGCTC

\hfill

20

Claims

1. Un procedimiento para preparar una mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, comprendiendo dicha mezcla, al menos, una enzima, que comprende:

a) poner en contacto en un único contenedor:

: ii) una solución acuosa de una mezcla estabilizante compuesta por

-: al menos, un agente protector frente a la desecación;

-: al menos, un inhibidor de la reacción del condensación entre grupos carbonilo o carboxilo y grupos amino o fosfato; y

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha mezcla de reacción comprende, al menos, una enzima que interviene en una reacción enzimática, junto con la totalidad o parte de los reactivos necesarios para la realización de dicha reacción enzimática en la que interviene dicha enzima.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicha mezcla de reacción comprende, al menos, una enzima que interviene en una reacción enzimática, junto con la totalidad de los reactivos necesarios para la realización de dicha reacción enzimática en la que interviene dicha enzima.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha enzima se selecciona del grupo formado por enzimas de amplificación de ácidos nucleicos, tanto termoestables como termolábiles, de ácidos nucleicos, tanto ARN como ADN, enzimas de restricción, enzimas que intervienen en las reacciones de amplificación, secuenciación o caracterización de ácidos nucleicos, y sus mezclas.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha mezcla de reacción comprende una enzima seleccionada del grupo formado por enzimas de amplificación de ácidos nucleicos, tanto termoestables como termolábiles, de ácidos nucleicos, tanto ARN como ADN, enzimas de restricción, enzimas que intervienen en las reacciones de amplificación, secuenciación o caracterización de ácidos nucleicos, y sus mezclas, junto con todos los reactivos necesarios para la realización de la reacción enzimática en la que interviene dicha enzima.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho contenedor es un tubo de reacción o un pocillo de una placa multipocillos.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho agente protector frente a la desecación es un carbohidrato no reductor.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicho agente protector frente a la desecación se selecciona del grupo formado por un disacárido no reductor, un trisacárido no reductor, y sus mezclas.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicho agente protector frente a la desecación se selecciona del grupo formado por palatinitol (6-\alpha-D-glucopiranosil-manitol), trehalosa, rafinosa, melezitosa, y sus mezclas.

10. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicha mezcla estabilizante comprende, además, de un carbohidrato no reductor como agente protector frente a la desecación, glicerol.

11. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho inhibidor de las reacciones de condensación entre grupos carbonilo o carboxilo y grupos amino o fosfato es un inhibidor competitivo o un inhibidor no competitivo.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que dicho inhibidor de las reacciones de condensación entre grupos carbonilo o carboxilo y grupos amino o fosfato se selecciona del grupo formado por lisina, arginina, triptófano, betaína, derivados de aminoguanidina y sus mezclas.

\newpage

13. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho polímero inerte capaz de generar una estructura en forma de malla que impida la movilidad de los reactivos desecados se selecciona del grupo formado por polivinilpirrolidona (PVP), polietilenglicol (PEG), dextrano, almidón, el compuesto denominado FICOLL, glucógeno, goma arábiga y sus mezclas.

14. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la retirada de la totalidad o parte del agua presente en la solución acuosa obtenida en la etapa a) se realiza por cualquier método de desecación convencional.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que dicho método de desecación se selecciona entre liofilización, desecado en lecho fluido, desecado a temperatura ambiente y presión atmosférica, desecado a temperatura ambiente y presión disminuida, desecado a alta temperatura y presión atmosférica, y desecado a alta temperatura y presión disminuida.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que dicho método de desecación es el método de desecado a una temperatura comprendida entre 15ºC y 60ºC, y presión disminuida inferior a la atmosférica.

17. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la mezcla de reacción estabilizada, total o parcialmente desecada, obtenida tiene un grado de humedad igual o inferior al 30%.

18. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la mezcla de reacción estabilizada, total o parcialmente desecada, obtenida tiene un grado de humedad comprendido entre el 1% y el 20%.

19. Una mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, que comprende al menos, una enzima, y una mezcla estabilizante que comprende (i) al menos, un agente protector frente a la desecación, (ii) al menos, un inhibidor de la reacción de condensación entre grupos carbonilo o carboxilo y grupos amino o fosfato, y (iii) al menos, un polímero inerte capaz de generar una estructura en forma de malla que impide la movilidad de los reactivos desecados.

20. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente según la reivindicación 19, que tiene un grado de humedad igual o inferior al 30%.

21. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, según la reivindicación 19, que tiene un grado de humedad comprendido entre 1% y 20%.

22. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, según la reivindicación 19, en el que dicha enzima se selecciona del grupo formado por enzimas de amplificación de ácidos nucleicos, enzimas de restricción, enzimas que intervienen en las reacciones de amplificación, secuenciación o caracterización de ácidos nucleicos, y sus mezclas.

23. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, según la reivindicación 19, que comprende una enzima seleccionada del grupo formado por enzimas de amplificación de ácidos nucleicos, enzimas de restricción, enzimas que intervienen en las reacciones de amplificación, secuenciación o caracterización de ácidos nucleicos, y sus mezclas, junto con la totalidad o parte de los reactivos necesarios para la realización de la reacción enzimática en la que interviene dicha enzima.

24. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, según la reivindicación 23, en la que dichos reactivos necesarios para la realización de la reacción enzimática en la que interviene dicha enzima se seleccionan del grupo formado por cofactores; sustratos de las enzimas; aditivos que mejoran o modulan las reacciones enzimáticas; dNTPs; ddNTPS; sondas y cebadores oligonucleotidicos, opcionalmente marcados; y sus mezclas.

25. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, según la reivindicación 19, que comprende una enzima ADN polimerasa o una enzima transcriptasa en reverso, termoestable o no, desoxinucleótidos trifosfato, opcionalmente marcados, los cofactores necesarios para la actividad enzimática y, opcionalmente, aditivos que mejoran o modulan dicha actividad enzimática.

26. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, según la reivindicación 25, que comprende, además, los cebadores oligonucleotídicos de reacción, opcionalmente marcados, necesarios para la amplificación específica de una secuencia nucleotídica objetivo, y/o sondas oligonucleotidicas, opcionalmente marcadas, necesarias para la realización de un ensayo de hibridación, junto con, opcionalmente, cualquier aditivo o coadyuvante de la reacción de hibridación.

27. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, según la reivindicación 19, que comprende, además, didesoxirribonucleótidos (ddNTPs).

28. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, según la reivindicación 19', que comprende una enzima de restricción, junto con, opcionalmente, todos los cofactores y aditivos necesarios para la realización de un análisis de restricción.

29. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, según la reivindicación 19, presentada en una forma de presentación "lista para usar" (ready-to-use).

30. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, según la reivindicación 19, en la que dicho agente protector frente a la desecación es un carbohidrato no reductor.

31. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, según la reivindicación 30, en la que dicho agente protector frente a la desecación se selecciona del grupo formado por un disacárido no reductor, un trisacárido no reductor, y sus mezclas.

32. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, según la reivindicación 30, en el que dicho agente protector frente a la desecación se selecciona del grupo formado por palatinitol (6-\alpha-D-glucopiranosil-manitol), trehalosa, rafinosa, melezitosa, y sus mezclas.

33. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, según la reivindicación 19, en la que dicha mezcla estabilizante comprende, además, de un carbohidrato no reductor como agente protector frente a la desecación, glicerol.

34. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total. o parcialmente, según la reivindicación 19, en la que dicho inhibidor de las reacciones de condensación entre grupos carbonilo o carboxilo y grupos amino o fosfato es un inhibidor competitivo o un inhibidor no competitivo.

35. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, según la reivindicación 34, en la que dicho inhibidor de las reacciones de condensación entre grupos carbonilo o carboxilo y grupos amino o fosfato se selecciona del grupo formado por lisina, arginina, triptófano, betaína, derivados de aminoguanidina y sus mezclas.

36. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, según la reivindicación 19, en la que dicho polímero inerte capaz de generar una estructura en forma de malla que impida la movilidad de los reactivos desecados se selecciona del grupo formado por polivinilpirroldona (PVP), polietilenglicol (PEG), dextrano, almidón, el compuesto denominado FICOLL, glucógeno, goma arábiga y sus mezclas.

37. Un kit que comprende una mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 36.