ES2318575T3 - Interferon beta desamidado. - Google Patents
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Abstract
Un análogo purificado y aislado de la proteína humana interferón a sintética, en donde, la asparagina en la posición 25, numerada de acuerdo con el interferón a nativo, está desamidada, y, dicho análogo de proteína exhibe una actividad biológica del interferón a humano nativo.
Description
Interferón \beta desamidado.
Esta invención está en el área general de la
química de proteínas biológicamente activas. Más específicamente se
relaciona con análogos de interferón \beta mutacional y
químicamente alterados que difieren d la proteína nativa por
sustituciones, supresiones o modificaciones de cisteína, asparagina
y de otros residuos.
Se ha encontrado que el interferón \beta es
útil en el tratamiento de enfermedades humanas, en particular
esclerosis múltiple. La esclerosis múltiple (MS) es una enfermedad
crónica a menudo discapacitante del sistema nervioso central que se
presenta cuando se rompen fibras nerviosas que rodean a la funda
protectora. Aproximadamente treinta porciento de los pacientes con
MS sufren de una forma de remisión - recaída de la enfermedad en la
cual los síntomas desaparecen total o parcialmente después de un
recrudecimiento y son seguidos por un período de estabilidad que
puede durar durante meses o años. Se ha demostrado que la
administración de interferón \beta (interferón - \beta o IFN -
\beta) reduce la frecuencia del recrudecimiento de la MS. Como
resultado de esto, los compuestos farmacéuticos con base en
interferón \beta se han convertido en valiosas herramientas en el
manejo y el tratamiento de la MS.
Se han desarrollado técnicas de ADN recombinante
(ADNr) para facilitar la fabricación a gran escala de compuestos
farmacéuticos con base en interferón \beta. Un problema en
particular que necesita ser manejado por estas técnicas fue que el
interferón beta humano, la secuencia de aminoácidos suministrada en
la Fig. 1 (SEQ ID NO: 1), contiene residuos de cisteína en las
posiciones 17, 31 y 141, Gene (1980) 10: 11 - 15 y Nature (1980)
285: 542 - 547), algunos de los cuales al menos son no esenciales
para su actividad pero son libres para formar enlaces
intramoleculares o intermoleculares indeseables. En el transcurso de
la preparación microbiana de IFN-\beta por medio
de técnicas de ADNr, se ha observado que se forman dímeros y
oligómeros de IFN-\beta en extractos que
contienen altas concentraciones de IFN-\beta
debido a su enlazamiento intermolecular. Esta formación multimérica
hace que la purificación y el aislamiento de
IFN-\beta sea muy laboriosa y demorada y que
necesite de varias etapas adicionales en procedimientos de
purificación y aislamiento tales como la reducción de la proteína
durante la purificación y volver a oxidarla para restablecerla a su
conformación original, incrementando así la posibilidad de la
formación incorrecta de enlaces disulfuro. Además, esta formación
multimérica ha sido asociada con baja actividad biológica
específica.
Con el propósito de resolver estos problemas, se
han desarrollado técnicas refinadas de ADNr para alterar los
análogos de la proteína IFN-\beta biológicamente
activa, producidos a través de microbios, en una forma que no
afecte adversamente su actividad, sino que reduzca o elimine su
habilidad para formar entrelazamientos intermoleculares o enlaces
intramoleculares que causen que la proteína adopte una estructura
terciaria indeseable (por ejemplo, una conformación que reduzca la
actividad de la proteína). La técnica de mutagénesis dirigida ha
sido exitosamente utilizada para formar análogos de proteína
biológicamente activa alterada por mutación (un "análogo de
proteína" se refiere aquí a una proteína sintética en la cual uno
o más aminoácidos han sido genética y/o químicamente modificados y
que retienen una actividad biológica de la proteína progenitora) que
retiene una actividad deseada de sus proteína progenitoras pero
carece de la habilidad para formar enlaces intermoleculares o
enlaces disulfuro intramoleculares indeseables. Los análogos de
proteína sintética de la proteína biológicamente activa
IFN-\beta que tienen el residuo de cisteína en la
posición 17
suprimido o reemplazado por otro aminoácido, se ha encontrado que tienen las características y actividad deseadas.
suprimido o reemplazado por otro aminoácido, se ha encontrado que tienen las características y actividad deseadas.
En particular, el interferón \beta 1b
(IFN-\beta 1b), un análogo sintético de proteína
recombinante de IFN-\beta, es una proteína
biológicamente activa que tiene el residuo de cisteína en la
posición 17 que ha sido reemplazado por un residuo de serina. Ya
que es una proteína producida a través de microbios, el
IFN-\beta 1b no está glicosilado. También tiene
una supresión de metionina N-terminal. El
IFN-\beta ha sido formulado en una composición
farmacéutica exitosa comercializada como Betaseron® que ha mostrado
ser efectiva para el tratamiento y manejo de la MS. Este análogo de
proteína, los materiales y las técnicas para su fabricación, su
formulación como composición terapéutica y su uso para tratar MS
están descritos y reivindicados en una cantidad de patentes
estadounidenses y solicitudes que incluyen a la Solicitud No.
435.154, presentada el 19 de octubre de 1982; la patente No.
4.588.585, publicada el 13 de mayo de 1986; la patente No.
4.737.462, publicada el 12 de abril de 1988; y la patente No.
4.959.314, publicada el 25 de septiembre de 1990; cada una de las
cuales se incorpora aquí como referencia por su descripción de esas
características.
La fabricación a gran escala de
IFN-\beta para composiciones farmacéuticas está
también se realizó a partir de fuentes de mamífero, en particular
de células de ovario de hámster chino (CHO). Este análogo de
IFN-\beta, denominado como
IFN-\beta 1a, carece de la mutación Ser 17 de
IFN-\beta 1b y está glicosilado.
IFN-\beta 1a está formulado en productos
terapéuticos comercializados como Avonex® y Rebith®.
WO 2004087753 describe derivados de IFN, en
donde uno o dos de los residuos de aminoácidos en las posiciones
110, 117 ó 137 están mutados por asparagina, para formar así sitios
de glicosilación adicionales dentro de la molécula. La
glicosilación parece que mejora la actividad de los derivados de
IFN, en un contexto antiviral y antiproliferativo; tales derivados
también tienen una mejor biodisponibilidad y vida media in
vivo.
Como con la mayoría de los compuestos
terapéuticos, existe un deseo continuo por identificar y fabricar
agentes activos biológicamente más potentes. En el caso de los
compuestos farmacéuticos con base en IFN-\beta,
sería deseable un análogo de IFN-\beta con mayor
actividad biológica.
Además, algunas formulaciones farmacéuticas de
IFN-\beta, incluido el Betaseron®, contienen
albúmina humana (HA o HSA), un estabilizador común de proteína. HA
es un producto de la sangre humana y se lo suministra cada vez
menos. Por lo tanto, más recientemente ha existido el deseo por
formulaciones de medicamento libres de HA, y sería deseable una
formulación estable y efectiva de IFN-\beta libre
de HA.
La presente invención aborda estas necesidades
mediante el suministro de interferón-\beta
desamidado. El IFN-\beta desamidado es un análogo
de la proteína humana interferón-\beta en la cual
la asparagina en la posición 25, numerada de acuerdo con el
interferón-\beta, está desamidado. El producto
desamidado exhibe una actividad biológica de
interferón-\beta humano nativo en un mayor nivel y
no requiere de HA para estabilización de la proteína.
En una modalidad específica, el
IFN-\beta desamidado es un análogo de la proteína
interferón-\beta 1b humana sintética en la cual
la cisteína en la posición 17, numerada de acuerdo con el
interferón-\beta nativo, está suprimida o
reemplazada por un aminoácido neutro, en particular serina, y la
asparagina en la posición 25, está desamidada de tal manera que se
convierte en una imida cíclica, un residuo de aspartato o de
isoaspartato. El producto desamidado exhibe la actividad biológica
deseada del interferón-\beta humano nativo (por
ejemplo, efectos citopáticos celulares o actividad
antiproliferativa, como se ha demostrado que se correlaciona con la
reducción de la frecuencia de los recrudecimientos de la esclerosis
múltiple) en un mayor nivel con relación a su proteína progenitora
IFN-\beta. Además, se observa una mayor actividad
biológica en una formulación libre de HA del análogo de la
proteína.
Se proveen también formulaciones de los
compuestos análogos de la proteína activa en composiciones
terapéuticas y métodos para su elaboración y utilización.
Además, se provee una técnica de mapa del
péptido endoproteinasa-C que produce un perfil de
huella para la proteína IFN-\beta utilizando una
digestión enzimática de una muestra reducida de proteína a un pH
relativamente bajo, seguido por la resolución cromatográfica de
fragmentos de péptido, útil en control de calidad como una prueba
de ID para los productos desamidados.
Estos y otros objetivos y características de la
invención se harán más evidentes cuando se lea la siguiente
descripción detallada de la invención junto con los dibujos
acompañantes.
La Fig. 1 es un diagrama de la secuencia de
aminoácidos de IFN-\beta.
La Fig. 2 es un diagrama de la secuencia de
aminoácidos de IFN-\beta 1b indicando el sitio y
la naturaleza de la desamidación de acuerdo con la presente
invención.
La Fig. 3 es un diagrama que ilustra la ruta
para la desamidación de Asn con referencia a la desamidación de
Asn25 de IFN-\beta de acuerdo con la presente
invención.
Las Figs. 4 - 11 muestran esquemas de la
potencia versus la cantidad de IFN-\beta 1b
desamidado en diferentes medicamentos y lotes de producto para la
estabilidad de IFN-\beta libre de HA de acuerdo
con un aspecto de la invención.
La Fig. 12A muestra mapas del péptido
Glu-C de muestras para la estabilidad de
IFN-\beta libre de HA de acuerdo con un aspecto
de la invención.
La Fig. 12B muestra una vista expandida de una
porción del mapa de la Fig. 12A.
La Fig. 13 muestra el perfil por
RP-HPLC de una muestra de control de
IFN-\beta libre de HA (tiempo (min) versus
respuesta (mV)).
La Fig. 14 muestra el perfil por
RP-HPLC de la muestra de estabilidad de un lote de
medicamento con IFN-\beta 1b libre de HA de
acuerdo con un aspecto de la invención.
La Fig. 15 muestra una gráfica de la Actividad
de CPE para fracciones de RP-HPLC de una muestra
para la estabilidad de IFN-\beta libre de HA de
acuerdo con un aspecto de la invención.
La Fig. 16A muestra una gráfica de resultados de
una actividad antiproliferativa contra Hs294T para fracciones de
RP-HPLC de una muestra de estabilidad de
IFN-\beta libre de HA de acuerdo con un aspecto de
la invención.
La Fig. 16B muestra una gráfica de resultados de
una actividad antiproliferativa contra Daudi para fracciones de
RP-HPLC de una muestra de estabilidad de
IFN-\beta libre de HA de acuerdo con un aspecto de
la invención.
Los compuestos, composiciones, materiales y
técnicas asociadas y usos de la presente invención serán descritos
ahora con referencia a diferentes modalidades. Las propiedades
importantes y características de las modalidades descritas están
ilustradas en las estructuras en el texto. Aunque la invención será
descrita junto con estas modalidades, se debe entender que la
invención no pretende quedar limitada a estas modalidades. Por el
contrario, la invención está definida por las reivindicaciones
adjuntas. En la siguiente descripción, se exponen numerosos
detalles específicos con el propósito de permitir una comprensión
profunda de la presente invención. La presente invención puede ser
practicada sin algunos o todos estos detalles específicos. En otros
casos, no se han descrito en detalle operaciones con procesos
conocidos con el propósito de no hacer innecesariamente confusa la
presente invención.
La presente invención provee interferón \beta
desamidado. El IFN-\beta desamidado es un análogo
de la proteína humana interferón-\beta en la cual
la asparagina en la posición 25, numerada de acuerdo con el
interferón-\beta nativo, está desamidada. Asn se
desamina hasta Asp o iso-Asp a través de un
intermediario de imida cíclica. El producto desamidado exhibe una
actividad biológica de interferón-\beta humano
nativo en un mayor nivel y no requiere de HA para estabilización de
la proteína. Se proveen también las formulaciones de los compuestos
análogos de la proteína activa en composiciones terapéuticas y los
métodos para su elaboración y uso.
Un "análogo de proteína" se refiere aquí a
una proteína sintética en la cual uno o más aminoácidos han sido
genética y/o químicamente modificados y que retiene una actividad
biológica d la proteína progenitora, tal como efectos citopáticos
celulares o actividad antiproliferativa. Tal actividad biológica ha
mostrado estar correlacionada con otras actividades biológicas
específicas, tales como la reducción de la frecuencia de los
recrudecimientos de la esclerosis múltiple.
En una modalidad específica, el
IFN-\beta desminado es un análogo de la proteína
humana interferón-\beta 1b sintética en la cual
la cisteína en la posición 17, numerada de acuerdo con el
interferón-\beta nativo, está suprimida o
reemplazada por un aminoácidos neutro, en particular serina, y la
asparagina en posición 25, está desamidada. En modalidades
específicas, la Asn25 es desamidada hasta un aspartato, isoaspartato
o residuo de imida cíclica (por ejemplo,
IFN-\beta_{ser17, \ asp25},
IFN-\beta_{ser17, \ iso-asp25} o
IFN-\beta_{ser17, \ imida c \text{í}clica25},
respectivamente). El producto desamidado exhibe una actividad
biológica de interferón-\beta humano nativo en un
nivel creciente con relación a IFN-\beta 1b.
Además, la actividad biológica mejorada es observada en una
formulación libre de HA del análogo de la proteína de la invención,
permitiendo un IFN-\beta libre de HA
terapéutico.
En el análogo de la proteína sintética de la
invención, el residuo 17 de cisteína puede ser reemplazado por una
serina, treonina, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina,
histidina, tirosina, fenilalanina, triptófano o metionina. En una
modalidad específica, la sustitución es serina 17. El residuo 25 de
asparagina ha sido reemplazado por un aspartato, isoaspartato o una
imida cíclica. Con referencia a la Fig. 2, se ilustra la estructura
primaria (secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2)) y la secundaria
(plegada, entrecruzada) del análogo de la proteína
IFN-\beta 1b de acuerdo con la presente invención.
En la posición 25, el residuo de Asn nativa está desamidado. La
desamidación de la asparagina se presenta a través de un
intermediario de imida cíclica. Esta ruta está ilustrada en la Fig.
3. Como se describe con más detalle más adelante, los resultados
del mapa del péptido Glu-C indican que las formas
principales de desamidación son iso-Asp
(IFN-\beta_{ser17, \ iso-asp25})
e imida cíclica (IFN-\beta_{ser17, \ imida \ c
\text{í}clica25}).
El análogo de la proteína puede ser elaborado
por medio de una combinación de técnicas recombinantes de
modificación química y sintética. Inicialmente, el análogo de la
proteína sintética IFN-\beta se elabora
típicamente por medio de técnicas recombinantes de mutagénesis
dirigidas al ADN, como se describe en las patentes referenciadas
anteriormente en la sección de Antecedentes de la solicitud. Las
técnicas de mutagénesis dirigida son bien conocidas y han sido
revisadas por Lather, R. F. y Lecoq, J. P. en Genetic Engineering
Academic Press (1983) páginas 31 - 50. La mutagénesis dirigida de
Oligonucleótidos es específicamente revisada por Smith, M. y Gillam,
S. en Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press
(1981) 3: 1 - 32.
El análogo de la proteína
IFN-\beta es luego sometido a un tratamiento
químico que desamina el residuo de asparagina en la posición 25.
Existen una cantidad de técnicas posibles de desamidación que pueden
ser efectivas y adecuadas para adopción en la fabricación
farmacéutica a gran escala y cualquier técnica que logre la
desamidación mientras retiene una actividad biológica nativa,
preferiblemente una mayor actividad biológica, puede ser utilizada.
Generalmente hablando, la desamidación de proteínas
IFN-\beta se puede lograr por medio de incubación
a una temperatura entre moderada y alta (por ejemplo,
aproximadamente 25 - 60ºC) y una variedad de pH, desde bajo (por
ejemplo, aproximadamente 0 - 4) moderado (por ejemplo,
aproximadamente 4 - 10) hasta alto (por ejemplo, aproximadamente 10
- 14) con tiempos de reacción aproximadamente desde 1 minuto hasta
aproximadamente 90 días o más, dependiendo de las condiciones. Por
ejemplo, se puede lograr la desamidación por medio de incubación de
IFN-\beta (por ejemplo,
IFN-\beta 1a o IFN-\beta 1b) de
hasta 60ºC; o aproximadamente entre 25 y 40ºC, por ejemplo
aproximadamente 40ºC, a un pH aproximadamente de 4 al menos durante
24 horas, por ejemplo hasta 40 días. Se puede disminuir el tiempo
de reacción y/o disminuir la temperatura de reacción elevando el
pH, por ejemplo hasta un pH neutro o básico aproximadamente desde 7
hasta 14, por ejemplo aproximadamente de 8 a 12, por ejemplo,
aproximadamente 8,5. En un ejemplo, la actividad biológica (CPE) de
una muestra de IFN-\beta 1b se incrementa casi
dos veces después de un tratamiento a un pH de 8,4 a 2 - 8ºC durante
14 días aproximadamente hasta 4,5 IU/mg. Se han observado también
incrementos sustanciales de actividad para tratamientos con
temperatura moderada (por ejemplo, temperatura ambiente) a alta (por
ejemplo, 37 - 40ºC) durante 14 - 40 días.
Las técnicas para preparar el análogo de la
proteína IFN-\beta desamidada pueden producir un
producto que sea parcial o sustancialmente puro. Por ejemplo, al
menos 25%, al menos 50%, al menos 75% o sustancialmente todo el
análogo de la proteína sintética en el producto puede ser desamidado
en la posición 25, numerada de acuerdo con el interferón \beta
nativo. Donde menos de la casi totalidad del producto está
desamidado, el producto puede mostrar sin embargo mayor actividad
biológica y estabilidad libre de HA. En algunos casos, puede ser
deseable purificar y aislar el(los) análogo(s) de la
proteína desamidada en el producto. Esta purificación y aislamiento
se pueden lograr por medio de HPLC de intercambio catiónico
utilizando por ejemplo las siguientes condiciones:
Cromatografía de Fase Estacionaria: Pharmacia
Mono S HR 5/5, o equivalente;
Búfer de Elución: Tris-HCl 20
mM, pH 7,0 con Empigen al 0,5%;
Gradiente: gradiente lineal de NaCl hasta 200 mM
o superior en el búfer de elución.
Para la fabricación, esta técnica se puede
realizar a gran escala.
En una modalidad preferida, cuando se produce a
través de microbios el análogo de la proteína sintética, no está
glicosilada. También el análogo de la proteína tiene una supresión
de metionina N-terminal. En otras modalidades, el
análogo de la proteína se puede ser producido en células de mamífero
y por lo tanto estar glicosilada.
Como se describe con más detalle más adelante,
diferentes ensayos de actividad demuestran que los análogos de la
proteína IFN-\beta desamidada tienen una mayor
bioactividad con relación a sus proteínas progenitoras
IFN-\beta. Y los resultados de estabilidad han
sido obtenidos con muestras libres de HA indicando que los análogos
de la proteína IFN-\beta desamidada de la presente
invención son adecuados para una formulación libre de HA como
compuestos terapéuticos. Para formar una composición terapéutica, el
análogo de la proteína, parcial o sustancialmente puro como se
describió anteriormente, puede ser mezclado con un medio portador
farmacéuticamente aceptable, como se conoce bien para este tipo de
producto terapéutico.
Además de ser una propiedad ventajosa de las
composiciones de la presente invención que ellas exhiban estabilidad
libre de HA, también se puede llevar a cabo la desamidación para
formulaciones que contienen HA y estas no están excluidas del
alcance de la presente invención. Además, aunque la invención está
principalmente descrita aquí con referencia a los análogos de la
proteína IFN-\beta 1b, la invención también es
aplicable a otros análogos de IFN-\beta,
incluyendo los análogos de IFN-\beta 1a.
Los análogos de la proteína
IFN-\beta y las composiciones de la presente
invención exhiben actividad biológica que sugiere utilidad
terapéutica en una cantidad de aplicaciones incluyendo la regulación
del crecimiento celular en una paciente, el tratamiento de un
paciente por una enfermedad viral y la estimulación de la actividad
natural asesina de células en una paciente. Un uso particular es
para el tratamiento de la esclerosis múltiple en un paciente, en
particular la recaída - remisión de la MS. En este sentido, los
compuestos terapéuticos de acuerdo con la presente invención son
útiles en el tratamiento para reducir la frecuencia de los
recrudecimientos de la esclerosis múltiple. El mayor nivel de
actividad biológica de los análogos de la proteína
IFN-\beta desamidada indica mejores efectos como
compuestos terapéuticos, pro ejemplo en el tratamiento y el manejo
de la MS.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se provee una técnica del mapa del péptido
endoproteinasa-C (Glu-C). El mapa
del péptido produce un perfil de la huella para proteína utilizando
una digestión enzimática de una muestra reducida de proteína a un
pH relativamente bajo, seguido por resolución cromatográfica líquida
(por ejemplo, RP-HPLC) de los fragmentos de la
digestión. El mapeo del péptido puede ser utilizado en control de
calidad como un ensayo de ID para el producto análogo de la proteína
IFN-\beta desamidada de acuerdo con la invención.
También es una herramienta poderosa monitorear las modificaciones
menores de la estructura primaria en una proteína de eventos tales
como recorte, mutación y degradación debidos a oxidación o a
desamidación.
Se sabe que una variante del
IFN-\beta desamidado contiene imida cíclica, una
forma intermedia de la desamidación. Esta forma de la imida cíclica
se encuentra en cantidades crecientes en muestras para estabilidad.
La mayoría de las enzimas incluyendo la Lys-C, que
es utilizada en un mapa convencional del péptido para
IFN-\beta, digiere proteínas en forma óptima con
un pH entre neutro y alto. Con un pH entre neutro y alto, la imida
cíclica es inestable y además se induce artificialmente
desamidación adicional. Por lo tanto, es necesario el mantenimiento
de la muestra en un ambiente de pH bajo durante la reducción y la
digestión para monitorear el nivel nativo tanto de la imida cíclica
como de otras formas de desamidación (Asp, iso-Asp)
en la muestra.
El mapa del péptido
endoproteinasa-C (Glu-C) se acopla
con un agente de reducción que es funcional a un pH por debajo de
8, por ejemplo en el rango aproximado de 3 - 8, por ejemplo
aproximadamente de 3, 4, 5, 6, 7 u 8 o aquellos pH intermedios. Un
agente de reducción adecuado es la
tris-(2-carboxietil) fosfina (TCEP). Se pueden
utilizar otros agentes funcionales de reducción a un pH
aproximadamente de 3 - 8, tales como ditiotreitol (DTT),
2-mercaptoetanol, cisteína, glutationa reducida,
2-mercaptoetilamina y ácido tioglicólico. El mapa
del péptido Glu-C tiene dos pH óptimos, pH 7,8 y pH
4,0, para su actividad enzimática. Como se observó anteriormente,
se sabe que la TCEP es funcional a un pH por debajo de 8,0. En una
modalidad, el nuevo mapa del péptido Glu-C utiliza
la preparación de la muestra que incluye tanto la reducción por TCEP
como la digestión a pH bajo, 4,0, que es el rango óptimo de pH para
preservar el nivel nativo de las formas desamidadas, por ejemplo,
imida cíclica, en la muestra. Esta nueva técnica de mapa puede ser
utilizada para caracterizar al fragmento de la digestión que
contiene formas desamidadas, incluyendo imida cíclica, en las
muestras de IFN-\beta.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Se pueden analizar las muestras de
IFN-\beta por medio del mapa del péptido
Glu-C para identificar el sitio de desamidación y
su forma (por ejemplo, Asp, Iso-Asp, imida cíclica).
Las muestras de proteína en formulaciones amortiguadas (por
ejemplo, una muestra de proteína de 0,5 ml con una concentración de
0,1 hasta 10, por ejemplo, 0,5 mg/ml en búfer de formulación de un
búfer de 2 a 500 mM, o en algunos casos 50 a 100 mM, de una sal tal
como aspartato, bicarbonato (por ejemplo, bicarbonato de amonio),
carbonato (por ejemplo, carbonato de amonio), acetato (por ejemplo,
acetato de amonio), fosfato (por ejemplo, fosfato de sodio),
citrato, formato, succinato, MES, PIPES, ACES, MOPS, MOPSO, HEPES,
TES, TRIS-HCl, BIS-TRIS,
BIS-TRIS Propano, ADA, BES, DIPSO, TAPSO, HEPPSO,
POPSO, EPPS, TEA, etc., la selección apropiada y el uso de los
cuales será conocido por aquellos capacitados en el arte para el pH
deseado (por ejemplo, ácido aspártico 2 mM, pH 4)) se pueden reducir
utilizando TCEP, por ejemplo utilizando una proporción molar de 1:2
hasta 1:30, por ejemplo, 1:3, 1:4, 1:5, 1:10 ó 1:20 de proteína
para TCEP, tal como 1:10. Se incuba la muestra, por ejemplo,
aproximadamente entre 30 - 40ºC (por ejemplo, 37ºC), hasta que se
reduce el material de la muestra. Los tiempos de incubación
adecuados pueden ser aproximadamente de 5 minutos hasta 24 horas
dependiendo de la inestabilidad de la muestra, por ejemplo 3 horas.
Se digiere posteriormente el material reducido con
Glu-C, por ejemplo 1 a 10, por ejemplo, 4 mg/ml, en
una relación 1:1 hasta 20:1 (o cualquier proporción intermedia
adecuada incluyendo 2:1, 3:1, 4:1, 10:1, etc.), por ejemplo, una
proporción en masa de 5:1, de proteína con respecto a
Glu-C y se incuba, por ejemplo aproximadamente
entre 30 - 40ºC (por ejemplo, 37ºC), hasta que se digiere el
material de la muestra. Los tiempos de digestión adecuados pueden
ser aproximadamente de 5 minutos hasta 24 horas dependiendo de la
inestabilidad de la muestra, por ejemplo 4 horas. Los fragmentos
del péptido se pueden resolver por medio de cromatografía líquida,
por ejemplo, RP-HPLC.
Un experimento específico del mapa del péptido y
sus resultados son descritos en la sección de Ejemplos más
adelante.
Los siguientes ejemplos ilustran aspectos de la
presente invención, pero no pretenden de ninguna manera limitar la
invención. En varios de estos ejemplos, se hace una distinción entre
la imida cíclica y otras formas desamidadas (Asp e
iso-Asp), las dos especies más distinguibles que
mostraron un incremento de potencia. Todas son formas desamidadas,
pero donde se hace una distinción entre la imida cíclica y otras
formas desamidadas (Asp e iso-Asp), la anterior se
denomina algunas veces como una "imida cíclica" mientras que la
última es denominada algunas veces como "desamidada" o
"desamidación", particularmente en los rótulos de la
figura.
Se ha observado un incremento de potencia en las
muestras de estabilidad de IFN-\beta libre de HA.
Los bioensayos de los efectos citopáticos (CPE) mostraron un
incremento de potencia en las muestras de estabilidad de
IFN-\beta libre de HA a 25ºC en el transcurso del
tiempo (T = 0 - 6 meses). Se ha observado también que el producto
final de la desamidación y su intermediario, la imida cíclica, han
incrementado la estabilidad de las muestras a 25ºC.
El mapeo del péptido Glu-C
identificó el sitio de desamidación en Asn25 y reveló que las formas
principales de desamidación en las muestras de estabilidad de
IFN-\beta 1b libre de HA fueron los análogos de
iso-Asp y de la imida cíclica, mientras que la
forma Asp se incrementó ligeramente.
Los resultados obtenidos a partir del método de
RP-HPLC indicaron que las formas desamidadas (imida
cíclica, Asp e iso-Asp) se incrementaron
significativamente en la muestra de estabilidad de
IFN-\beta libre de HA.
Las formas desamidadas en la muestra de
estabilidad de IFN-\beta libre de HA mostraron
mayor actividad biológica que la IFN-\beta
progenitora (amidada) por medio de ensayos de CPE y
antiproliferativos.
Con base en estos hallazgos, se considera que la
desamidación (que forma análogos de Asp, iso-Asp e
imida cíclica) mejora la actividad biológica del
IFN-\beta libre de HA. Por lo tanto, se pude
preparar una forma desamidada de IFN-\beta con el
propósito de mejorar la actividad biológica de los compuestos
terapéuticos con base en IFN-\beta, ya sea libres
de HA o conteniendo HA. Los análogos desamidados se pueden preparar
por medio de incubación de una solución de
IFN-\beta (ya sea libre de HA o conteniendo HA) a
una temperatura entre moderada y alta, y/o a un pH bajo, moderado o
alto. Los productos desamidados de esta invención reducirán la
dosis clínica requerida e incrementarán la estabilidad de las
formulaciones líquidas de IFN-\beta a temperatura
ambiente. Disminuyendo la dosis clínica, la proporción de pacientes
que experimentan una reacción inmune adversa (por ejemplo,
anticuerpos de neutralización), se reduce. Los datos que respaldan
la invención, obtenidos a partir de diferentes estudios de
estabilidad y de análisis de las preparaciones de
IFN-\beta 1b se presentan a continuación.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Como se muestra más abajo en la Tabla 1
(Sustancia del Medicamento: en ácido aspártico 2 mM, pH 4,0,
Trehalosa al 0,9%), el bioensayo de los efectos citopáticos (CPE)
mostró un incremento en la potencia en las muestras para
estabilidad del IFN-\beta 1b libre de HA a 25ºC
con el transcurso del tiempo (T = 0 - 6 meses):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como se observa en las Tablas 3 y 4, más abajo,
la (CEX)-HPLC de intercambio catiónico demuestra que
los datos de estabilidad para las muestras a 25ºC de la sustancia
del medicamento y del producto del medicamento, respectivamente,
también mostraron un incremento en la desaminación
(D-IFN-\beta):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las Tablas 5 y 6, más abajo, muestran que un
incremento en el Pico D, que representa a la forma intermediaria de
la imida cíclica de la desamidación, fue también observada en el
transcurso del tiempo por medio del uso de una técnica de
(RP)-HPLC en fase reversa en muestras a 25ºC de
sustancia de medicamento y de producto de medicamento,
respectivamente:
\newpage
Las Figs. 4 - 11 muestran gráficas de la
potencia versus la cantidad de IFN-\beta 1b
desamidado ("% de D-IFN" o "% de Pico D")
en diferentes sustancias del medicamento para estabilidad de la
IFN-\beta libre de HA y de lotes d producto de
acuerdo con un aspecto de la invención. Estos datos demuestran que
existe una correlación entre el incremento de la potencia y el
nivel de desamidación del IFN-\beta libre de
HA.
En la Fig. 3 se muestra la secuencia primaria de
IFN-\beta 1b. Se ha encontrado que la desamidación
se presenta en Asn25. La naturaleza de esa desamidación y las
propiedades de los productos desamidados fueron exploradas en los
ensayos descritos a continuación:
Un mapa del péptido produce un perfil de huella
para las proteínas utilizando una digestión enzimática seguida por
RP-HPLC. El mapeo del péptido es comúnmente
utilizado en control de calidad como un ensayo de ID. Es también
una herramienta poderosa para monitorear modificaciones menores de
la estructura primaria en una proteína a partir de eventos tales
como recorte, mutación y degradación debidos a oxidación o a
desamidación. Se sabe que el IFN-\beta libre de
HA contiene imida cíclica, un intermediario de la desamidación. Esta
imida cíclica es una variante degradada clave en el
IFN-\beta libre de HA y se encuentra en cantidades
crecientes en muestras para estabilidad. La mayoría de las enzimas
incluyendo a la Lys-C, que es utilizada en el mapa
actual del péptido para IFN-\beta libre de HA,
digiere proteínas en forma óptima a pH entre neutro y alto. A un pH
entre neutro y alto, la imida cíclica es inestable y se induce
artificialmente la desamidación. Por lo tanto, se hace necesario
mantener la muestra en un ambiente de pH bajo durante la reducción y
la digestión para monitorear el nivel nativo de imida cíclica y de
desamidación en la
muestra.
muestra.
Se ha desarrollado un nuevo mapa del péptido
endoproteinasa-C (Glu-C) acoplado
con tris-(2-carboxietil) fosfina (TCEP) como agente
reductor para caracterizar el fragmento que contiene formas
desamidadas, incluyendo la imida cíclica, en
IFN-\beta libre de HA. Se sabe que el mapa del
péptido Glu-C tiene dos pH óptimos, pH 7,8 y pH
4,0, para su actividad enzimática. Se sabe que la TCEP es funcional
a pH por debajo de 8,0. Se desarrolló el nuevo mapa del péptido
Glu-C utilizando la preparación de la muestra que
incluye tanto reducción como digestión a pH bajo, 4,0, que está en
el rango óptimo de pH para preservar el nivel nativo de formas
desamidadas, por ejemplo, imida cíclica, en la muestra. Ya que el
mapa del péptido desarrollado aquí emplea preparaciones de la
muestra a pH bajo, se logra exitosamente el monitoreo preciso del
nivel nativo de formas desamidadas en IFN-\beta
libre de HA.
Las muestras para estabilidad del lote del
producto del medicamento con IFN-\beta 1b libre de
HA, TA2451 (3, 6 y 9 meses a 25ºC) fueron analizadas por medio del
mapa del péptido Glu-C para identificar el sitio de
desamidación y su forma (por ejemplo, Asp, Iso-Asp,
imida cíclica). Cada 0,5 ml de muestra de proteína con una
concentración de 0,5 mg/ml en búfer de formulación de ácido
aspártico 2 mM, pH 4,0 fueron reducidos utilizando TCEP. Utilizando
una proporción molar de 1:10 de proteína para TCEP, se incubó la
muestra a 37ºC durante 3 horas. Se digirió posteriormente el
material reducido con 4 mg/ml de Glu-C con una
proporción de masa de 5:1 de proteína con respecto a
Glu-C y se incubó a 37ºC durante 4 horas. Se
resolvieron los fragmentos del péptido por medio de cromatografía
RP-HPLC (ThermoHypersil BioBasic C18, 150 x 4,6 mm,
5 \mum), utilizando un gradiente de acetonitrilo en ácido
trifluoroacético al 0,1% como búfer de elusión, con una velocidad de
flujo de 1,0 ml/min y una temperatura de columna a 38ºC.
La Fig. 12A muestra mapas del péptido
Glu-C de muestras para estabilidad de
IFN-\beta libre de HA de acuerdo con un aspecto
de la invención. La Fig. 12B muestra una vista expandida de la
porción a RT en 22 - 26 minutos del mapa de la Fig. 12A.
Como se muestra en las figuras, el pico del
fragmento E1 disminuye con el transcurso del tiempo, mientras que
los picos que representan a Iso-Asp, a la imida
cíclica, y a Asp se incrementan. Aquellos picos son formas
desamidadas de Asn en la posición 25 en el fragmento E1. Esta
caracterización del pico fue llevada a cabo por medio de
espectrometría de masas y secuenciación de Edman de los
subfragmentos E1 obtenidos por digestión con Lisil endopeptidasa de
fragmentos relacionados con E1. El residuo Asn25 tiene una secuencia
de aminoácidos seguida por glicina. Esta secuencia de
Asn-Gly es conocido por tener una tasa rápida de
desamidación.
Con base en este resultado del mapa del péptido
Glu-C, se identificaron las formas principales de
desamidación en las muestras para estabilidad del
IFN-\beta libre de HA como iso-Asp
e imida cíclica. Hubo también un ligero incremento en el nivel de
la forma Asp.
La RP-HPLC separa los compuestos
con base en su hidrofobicidad. Las muestras de
IFN-\beta 1b libre de HA fueron analizadas por
medio del método RP-HPLC para caracterizar las
variantes de IFN-\beta (por ejemplo, Asp,
iso-Asp, imida cíclica). Las muestras del ensayo
fueron inyectadas sobre una columna cromatográfica Zorbax
300SB-CN, 150 x 4,6 mm, 3,5 \mum de tamaño de
partícula, y se separaron las variantes de
IFN-\beta 1b utilizando un gradiente de
acetonitrilo en búfer de elución de ácido trifluoroacético al 0,1%.
El resultado de la muestra de control se muestra en la Fig. 13.
\newpage
La identificación del pico mostrado en la figura
se realizó por medio del análisis espectrométrico de masas/LC en
línea
(RP-HPLC/Q-TOF/ESI-MS).
Se dividió el flujo de HPLC aproximadamente en una proporción de
1:20, y se dirigieron aproximadamente 50 uL/m a la fuente de iones
del espectrómetro de masas. El espectrómetro de masas era un
instrumento Micromass Q-TOF2, con una fuente de
ionización por electrospray. El voltaje de los iones se programó en
3200, con el voltaje de cono programado en 50. Se recogieron los
datos con el analizador de tiempo de vuelo (TOF) entre m/z 300 y
2500. Los datos de LC/masa en línea revelan que existe más de una
variante de proteína que eluye conjuntamente bajo algunos de los
picos de RP-HPLC.
La Fig. 14 muestra el perfil de
RP-HPLC de la muestra de estabilidad del lote de
producto del medicamento con IFN-\beta 1b
(aproximadamente 10 meses a 25ºC). Como se muestra en la figura, el
perfil es diferente de aquel de la muestra de control (Fig. 13) y
de la imida cíclica (Pico D) y se incrementa significativamente la
desamidación (Asp y/o iso-Asp) (Pico Medio) en
IFN-\beta 1b libre de HA. Se observan otras
variantes múltiples menores desamidadas y de imida cíclica. Estas
son variantes desamidadas y de imida cíclica con modificaciones
estructurales y químicas adicionales que se separan debido a sus
diferentes propiedades hidrófobas.
El IFN-\beta induce un estado
antiviral en células de mamífero en las cuales se inhibe la
replicación de algunos tipos de virus y provocan efectos
citopáticos celulares (CPE). Se utilizaron células de carcinoma de
pulmón humano A549 y virus de encefalomiocarditis de múrido (EMC)
para evaluar la actividad biológica de las fracciones de
RP-HPLC obtenidas a partir de la muestra de
estabilidad del lote de producto del medicamento con
IFN-\beta 1b libre de HA (aproximadamente 10 meses
a 25ºC).
Se cultivaron las células en placas de 96 pozos
y se las trató con diluciones seriales de
IFN-\beta 1b durante la noche antes de la adición
del virus. Se incubaron luego los cultivos durante un período
adecuado de tiempo para permitir la replicación del virus. Las
células tratadas con suficiente IFN-\beta 1b
fueron protegidas del reto virus y permanecieron viables. Las
células no protegidas sufrieron cambios citopáticos y murieron. Se
cuantificó la dosis de interferón dependiente del CPE utilizando
técnicas de coloración y se preparó una curva de respuesta a la
dosis a partir de una gráfica de viabilidad celular (medición de la
Densidad Óptica) versus la concentración de
IFN-\beta. Se calculó la actividad de
IFN-\beta como la concentración requerida para la
protección celular máxima media (concentración ED_{50}).
Como se muestra en la Fig. 15, la actividad de
CPE en la fracción desamidada (Pico Medio, Fracción 16) es
significativamente mayor que aquella en la fracción progenitora de
IFN-\beta 1b (Pico B, Fracción 18). La fracción
de imida cíclica (Pico D, Fracción 15) también muestra mayor
actividad de CPE que la fracción progenitora de
IFN-\beta 1b.
El INF-\beta muestra actividad
antiproliferativa contra una cantidad de líneas de células
establecidas de tumores humanos. Se utilizaron dos líneas de
células, la línea de células de melanoma humano
Hs294T-a y la línea de linfoblastos B humana
Daudi-a derivada del linfoma de Burkitt, para
evaluar la actividad biológica de las fracciones de
RP-HPLC obtenidas de la muestra de estabilidad del
lote de producto del medicamento con IFN-\beta 1b
libre de HA (aproximadamente 10 meses a 25ºC).
Se llevaron a cabo varias diluciones de las
muestras de prueba con IFN-\beta en placas de 96
pozos. Se prepararon células respondedoras en medio de cultivo de
tejido y se las añadió a las placas del ensayo. Después de 3 días
de incubación, se tiñeron las células con Alamar Blue y se utilizó
un contador Coulter para medir la respuesta de crecimiento. Se
inhibió el crecimiento de las células en respuesta al
IFN-\beta en una forma que depende de la dosis.
Se preparó una curva de respuesta a la dosis a partir de una gráfica
del número de células (medición de la Densidad Óptica) versus la
concentración de IFN-\beta. Se calculó la
actividad del IFN-\beta como la concentración
requerida para el crecimiento celular máximo medio (concentración
ED_{50}).
Como se muestra en las Figs. 16A (Hs294T) y 16B
(Daudi), la actividad antiproliferativa en la fracción de
desamidación (Pico Medio, Fracción 16) y en la fracción de imida
cíclica (Pico D, Fracción 15) es significativamente superior que
aquella en la fracción progenitora de IFN-\beta
(Pico B, Fracción 18).
Con base en los datos de estabilidad y en
resultados obtenidos a partir de los estudios descritos
anteriormente, la desamidación (Asp, iso-Asp e
imida cíclica que reemplazan a Asn en la posición 25) mejora una
actividad biológica de IFN-\beta. Por lo tanto,
se puede preparar intencionalmente una forma desamidada de un
IFN-\beta, por ejemplo,
IFN-\beta 1b con el propósito de mejorar la
actividad biológica del compuesto. La forma desamidada se puede
preparar incubando IFN-\beta a una temperatura
entre moderada y alta, o en un ambiente de pH bajo, moderado o
alto. Los productos desamidados de esta invención reducirán la dosis
clínica requerida e incrementarán la estabilidad de las
formulaciones líquidas de IFN-\beta, incluidas las
formulaciones del IFN-\beta que contiene HA, a
temperatura ambiente. Disminuyendo la dosis clínica, la proporción
de pacientes que experimentan una reacción inmune adversa (por
ejemplo, anticuerpos de neutralización), se reduce.
Se llevaron a cabo experimentos para demostrar
diferentes técnicas de desamidación, como se describió
anteriormente. Los datos obtenidos a partir del bioensayo del CPE
evidencian que se prepara fácilmente el IFN-\beta
desamidado por medio de procesos adecuados para producción
farmacéutica a gran escala. En particular, se observaron incrementos
significativos de bioactividad en diferentes muestras fabricadas
bajo Buenas Prácticas de Manufactura (GMP) incubadas a temperaturas
entre moderadas (por ejemplo, temperatura ambiente) hasta altas (por
ejemplo, 37 - 40ºC) durante 14 - 40 días, y se obtuvieron
incrementos de bioactividad de casi dos veces por incubación de una
muestra bajo GMP a temperatura ambiente y pH 8,8 aproximadamente
durante 1 hora, y a 2 - 8ºC a pH 8,4 aproximadamente durante 14
días.
Ensayo
1
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo
2
Aunque la invención anterior ha sido descrita
con algún detalle para propósitos de claridad en su comprensión,
será claro que se pueden practicar algunos cambios y modificaciones
dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Debe observarse
que existen muchas formas alternativas de implementación tanto de
los procesos como de las composiciones de la presente invención.
Por lo tanto, las presente modalidades se deben considerar como
ilustrativas y no restrictivas, y que la invención no se limita a
los detalles dados aquí, sino que se pueden modificar dentro del
alcance de las reivindicaciones anexas.
\vskip1.000000\baselineskip
Este listado de referencias citado por el
solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma
parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran
cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las
omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.
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1981, vol. 3, 1 - 32 [0021].
Claims (27)
1. Un análogo purificado y aislado de la
proteína humana interferón \beta sintética, en donde,
la asparagina en la posición 25, numerada de
acuerdo con el interferón \beta nativo, está desamidada, y,
dicho análogo de proteína exhibe una actividad
biológica del interferón \beta humano nativo.
2. El análogo de la proteína sintética de la
reivindicación 1, en donde la cisteína en la posición 17, numerada
de acuerdo con el interferón \beta nativo, está suprimido o
reemplazado por un aminoácido neutro.
3. El análogo de la proteína sintética de la
reivindicación 2, en donde dicho residuo de cisteína ha sido
reemplazado por un residuo de serina.
4. El análogo de la proteína sintética de la
reivindicación 3, en donde dicho residuo de asparagina ha sido
reemplazado por un residuo seleccionado del grupo que consiste de
aspartato, isoaspartato e imida cíclica.
5. El análogo de la proteína sintética de la
reivindicación 4, en donde el análogo de la proteína no está
glicosilado.
6. El análogo de la proteína sintética de la
reivindicación 5, en donde el análogo de la proteína tiene una
supresión de metionina N-terminal.
7. El análogo de la proteína sintética de la
reivindicación 4, en donde el análogo de la proteína tiene una
actividad biológica mayor a la del
IFN-\beta_{ser17}.
8. Una composición terapéutica que tiene una
actividad de IFN-\beta que comprende una cantidad
terapéuticamente efectiva del análogo de la proteína sintética de
la reivindicación 4 mezclada con un medio portador farmacéuticamente
aceptable.
9. La composición de la reivindicación 8, en
donde al menos 50% del análogo d la proteína sintética está
desamidado en la posición 25, numerado de acuerdo con el interferón
\beta nativo.
10. La composición de la reivindicación 8, en
donde sustancialmente todo el análogo de la proteína sintética está
desamidado en la posición 25, numerado de acuerdo con el interferón
\beta nativo.
11. La composición de la reivindicación 8, en
donde la composición está libre de HA.
12. Un método de elaboración del análogo
desamidado de IFN-\beta, que comprende:
- incubar una proteína IFN-\beta bajo condiciones adecuadas a una temperatura entre moderada y alta de aproximadamente 25 - 60ºC;
- purificar y aislar el análogo de la proteína desamidada.
13. El método de la reivindicación 12, que
comprende:
- la incubación a una temperatura de aproximadamente 40ºC aproximadamente durante 14 días.
14. El método de la reivindicación 13, que
comprende además que la incubación se lleva a cabo a un pH de al
menos 4.
15. El método de la reivindicación 14, que
comprende: incubación a un pH de 7 - 14.
16. El método de la reivindicación 15, en donde
la incubación es a pH 8 - 9 aproximadamente durante 14 días.
17. La composición de la reivindicación 8 para
uso en terapia.
18. La composición de la reivindicación 17, en
donde la terapia es para regular el crecimiento celular en el
paciente y la composición se utiliza en una cantidad que regula el
crecimiento celular.
19. La composición de la reivindicación 17, en
donde la terapia es para una enfermedad viral del paciente y la
composición se utiliza en una cantidad que inhibe la enfermedad
viral.
20. La composición de la reivindicación 17, en
donde la terapia es para estimular la actividad celular asesina
natural en el paciente y la composición se utiliza en una cantidad
que estimula a la célula asesina natural.
\newpage
21. La composición de la reivindicación 17, en
donde la terapia es para esclerosis múltiple en el paciente y la
composición se utiliza en una cantidad terapéuticamente
efectiva.
22. La composición de la reivindicación 21, en
donde la terapia comprende la reducción de la frecuencia de los
recrudecimientos de la esclerosis múltiple.
23. La composición de la reivindicación 22, en
donde ducha esclerosis múltiple es del tipo de remisión -
recaída.
24. Un método de mapeo de un péptido, que
comprende:
- la incubación de una muestra de proteína en una solución amortiguada por debajo de pH 8 que contiene un agente reductor;
- la digestión de la muestra incuba con endoproteinasa-C; y
- resolver los fragmentos del péptido de la digestión por medio de cromatografía líquida.
- en donde la muestra de proteína es un IFN-\beta desamidado.
25. El método de la reivindicación 24, en donde
el agente reductor es tris-(2-carboxietil) fosfina
(TCEP).
26. El método de la reivindicación 25, en donde
la incubación se realiza con un pH aproximadamente de 4.
27. El método de la reivindicación 26, en donde
la cromatografía líquida es RP-HPLC.
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