ES2181608T5

ES2181608T5 - Procedimiento para la producción de derivados de ácido hialurónico reticulados de forma múltiple

Info

Publication number: ES2181608T5
Application number: ES00901776.5T
Authority: ES
Inventors: Xiaobin Zhao
Original assignee: Mentor Worldwide LLC
Current assignee: Mentor Worldwide LLC
Priority date: 1999-02-03
Filing date: 2000-02-03
Publication date: 2016-07-22
Anticipated expiration: 2020-02-03
Also published as: CN1200951C; DK1149116T4; MXPA01007876A; ES2181608T1; ATE315050T2; GB9902412D0; WO2000046253A1; EP1149116B1; US20090247741A1; AU773518B2; DE60025328T2; CA2361981A1; ES2181608T3; AU2307500A; DK1149116T3; DE1149116T1; ES2181608T9; EP1149116B9; DE60025328D1; EP1149116A1

Description

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Procedimiento para la produccion de derivados de acido hialuronico reticulados de forma multiple. Descripcion

La presente invencion se refiere a un procedimiento para la produccion de derivados de acido hialuronico (HA), en particular derivados de acido hialuronico.

El HA es un miembro de una clase de pollmeros conocidos como glicosaminoglicanos. El HA es un polisacarido lineal de cadena larga y normalmente esta presente como la sal sodica que tiene la forma molecular (C14 H20 NNaO11 )n en donde n puede variar de acuerdo con el origen, procedimiento de aislamiento y metodo de determinacion. Sin embargo, se han indicado pesos moleculares de hasta 14 x 106.

El HA y sus sales se pueden aislar de muchas fuentes incluyendo cordon umbilical humano, crestas de gallos y casi todas las matrices conectivas de organismos vertebrados. El HA es tambien un componente capsular de bacterias tales como Streptococci como ha sido demostrado por Kendall et al, (1937), Biochem. Biophys. Acta, 279, 401-405; por tanto, tambien se puede obtener mediante metodos de fermentacion. Por ejemplo, la Patente US No. 5.411.874 de la presente entidad solicitante describe un metodo para la produccion de acido hialuronico por fermentacion continua de Streptococcus equi.

El HA es no inmunogeno y, por tanto, presenta un gran potencial en medicina. Debido a sus propiedades visco-elas- ticas, se ha comprobado que el HA que tiene un alto peso molecular (por encima de 1 millon) resulta particularmente util en una variedad de campos cllnicos, incluyendo tratamiento de heridas, cirugla oftalmica y cirugla ortopedica. El HA es tambien potencialmente util en un variedad de campos no medicos, tales como aplicaciones cosmeticas.

Sin embargo, el uso de HA en alguna de estas aplicaciones queda limitado por el hecho de que despues de su administracion a seres humanos, el HA es degradado facilmente por enzimas tales como hialuronidasas y por radicales libres. Ademas, el HA es soluble en agua a temperatura ambiente, lo cual puede hacer que resulte menos adecuado para ciertas aplicaciones. Por tanto, se han realizado varios intentos para preparar formas mas estables de HA, en particular por reticulacion de las moleculas de HA.

Asl, la USP 4.582.865 (Biomatrix Inc.) describe la preparacion de geles reticulados de acido hialuronico que se forman por reticulacion de HA bien por si mismo o mezclado con otros pollmeros hidrofilos empleando divinilsulfona como agente reticulante. Parece ser que en este caso la reticulacion surge por via de los grupos hidroxilo del HA.

La USP 5.550.187 (Collagen Corporation) describe un metodo para la preparacion de composiciones de bioma- teriales reticulados que comprende mezclar un pollmero biocompatible, que preferentemente es colageno pero que puede ser seleccionado entre otros pollmeros incluyendo acido hialuronico, con un agente reticulante seco esteril, tal como un pollmero hidrofilo sintetico.

La USP 5.578. 661 (Nepara Inc.) describe un sistema formador de gel para utilizarse como un vendaje para heridas y que esta formado a partir de tres componentes principales, siendo el primero un pollmero soluble en agua, siendo el segundo un pollmero que contiene acido y siendo el tercero un polisacarido o pollmero que contiene grupos amino, tal como acido hialuronico. En este caso, la reticulacion parece surgir por via de enlace ionico.

La USP 5.644.049 (Italian Ministry for Universities and Scientific and Technology Research) describe un bioma- terial que comprende una red polimerica inter-penetrante (IPN) en donde uno de los componentes polimericos es un polisacarido acido tal como acido hialuronico y el segundo componente polimerico puede ser un pollmero qulmico sintetico. Los dos componentes pueden estar reticulados (pero no necesariamente).

Tomihata e Ikada han informado sobre la reticulacion de HA empleando una carbodiimida soluble en agua como agente reticulante. Se postulo que la reticulacion tenia lugar por via de grupos ester. Tambien se efectuo la reaccion de reticulacion en presencia de ester metllico de L-lisina, lo cual proporciono al parecer una reticulacion adicional por via de enlaces amida al ester de lisina (J. Biomed. Mater. Res., 37, 243-251, 1997).

La Patente US No. 5.800.541 describe matrices de colageno-pollmero sintetico preparadas empleando una reaccion en multiples etapas. La primera etapa comprende hacer reaccionar colageno con un pollmero hidrofilo sintetico; la matriz resultante puede ser modificada entonces en una segunda etapa de reaccion que puede implicar la reticulacion o conjugacion de la matriz con un pollmero sintetico, el acoplamiento en la matriz de moleculas biologicamente activas o glicosaminoglicanos, la reticulacion de la matriz empleando agentes reticulantes qulmicos convencionales o la modificacion del colageno en la matriz por medio de reaccion qulmica. En este proceso, la matriz inicial de colageno-pollmero sintetico parece ser reticulada solo por via de un tipo de enlace y las etapas adicionales del proceso sirven para introducir otras sustancias qulmicas que pueden formar diferentes tipos de enlaces. Sin embargo, no parece que cualquiera de las dos sustancias que forman el producto se enlacen entre si por mas de un tipo de enlace.

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La solicitud internacional WO 98/02204 (Hercules Incorporated) se refiere a dispositivos medicos que comprenden hidrogeles polimericos que tienen propiedades mecanicas mejoradas. Esto se consigue sometiendo una composicion de pollmero ionicamente reticulable (que puede ser HA) a condiciones de reticulacion, de manera que se establecen condiciones de reticulacion tanto ionica como no ionica. Como agentes reticulantes adecuados se citan los diepoxidos o glutaraldehldo ya que los mismos son compuestos polifuncionales que tienen al menos dos grupos funcionales reactivos con uno o mas grupos funcionales del pollmero.

La EP 161 887 (Seikagaku Kogyo Co. Ltd) describe un procedimiento para reticular HA haciendolo reaccionar con un compuesto epoxi polifuncional en una solucion alcalina. Este HA reticulado era resistente a hialuronidasa y tenia un efecto curativo de las heridas.

La solicitud de patente internacional WO 97/04012 (Agerup) describe composiciones en gel de polisacaridos (que pueden consistir, inter alia, en acido hialuronico) que se preparan formando una solucion acuosa del polisacarido, iniciando la reticulacion en presencia de un agente reticulante polifuncional, impidiendo estericamente que la reaccion de reticulacion se termine antes de que se presente la gelificacion (por ejemplo por dilucion de la solucion) e intro- duciendo entonces de nuevo condiciones no estericamente impedidas (por ejemplo por evaporacion de la solucion), con el fin de continuar la reticulacion a un gel visco-elastico. En esta solicitud no se dice nada sobre la formacion de diferentes tipos de enlaces en las dos etapas de reticulacion.

Ninguno de los documentos antes mencionados describe productos en donde la moleculas de HA esten enlazadas entre si por medio de dos tipos diferentes de enlaces de reticulacion covalentes.

El acido hialuronico puede ser reticulado por dos tipos diferentes de enlaces de reticulacion, para efectuar una “reticulacion doble”. La formacion de diferentes tipos de enlaces se consigue efectuando la reticulacion por via de diferentes grupos funcionales. Los enlaces as! formados pueden ser descritos, por tanto, como enlaces funcionales. De este modo, por ejemplo, se puede formar un tipo de enlace por reticulacion por via de grupos hidroxilo y se puede formar un enlace funcional diferente por reticulacion por via, por ejemplo, de grupos carboxilo.

Se ha comprobado que dicha reticulacion multiple se traduce en un alto grado de reticulacion con una bioestabilidad mejorada del HA.

La presente invencion proporciona un procedimiento para la preparation de derivados de acido hialuronico reticulados de forma multiple acido fujaluronico (HA) como se define en la revindication 1. Caracterlsticas preferentes del proceso reivindicado se exponen en las reivindicaciones dependientes 2 a 11.

En esta description, la expresion “HA reticulado de forma multiple” se refiere a un derivado de acido hialuronico en donde una molecula de hA esta reticulada a otra molecula de hA por medio de dos o mas tipos diferentes de enlaces funcionales. Similarmente, la expresion “HA reticulado de forma doble” se refiere a un derivado de acido hialuronico en donde una molecula de HA esta reticulada a otra molecula de HA por medio de dos tipos diferentes de enlace funcional y la expresion “HA reticulado de forma simple” se refiere a un derivado de acido hialuronico en donde una molecula de HA esta reticulada a otra molecula de HA por medio de solo un tipo de enlace funcional.

Los grupos funcionales que fundamentalmente son responsables de la reticulacion de las moleculas de HA son los grupos hidroxilo y carboxilo. Los grupos hidroxilo pueden ser reticulados por via de un enlace eter y los grupos carboxilo por via de un enlace ester. Si se desea, el HA puede ser modificado qulmicamente antes de la reticulacion para formar otros grupos qulmicamente reactivos. Asi, por ejemplo, el HA puede ser tratado con acido o base, de forma que experimental una desacetilacion al menos parcial, dando ello lugar a la presencia de grupos amino libre. Dichos grupos amino pueden ser reticulados por via de un enlace amida (-C(O)-NH-); imino (-N=CH-) o amina (-NH- CH-). Un enlace imino es un precursor de un enlace amina y un enlace imino puede ser convertido a un grupo amina en presencia de un agente reductor.

Para formar un enlace eter, el agente reticulante se elige preferentemente entre formaldehido, glutaraldehldo, di- vinilsulfona y, en condiciones alcalinas, bis- y poli-epoxidos. Con preferencia, el reticulante contiene un segmento hidrocarbonado hidrofobo, por ejemplo 1,2,3,4-diepoxibutano o con suma preferencia 1,2,7,8-diepoxioctano.

Para formar un enlace ester, el agente reticulante se elige preferentemente entre alcoholes polihidricos, carbodiimidas, polianhidridos, cloruros de acido carboxilico y, en condiciones acidas, bis- y poli-epoxidos. Con preferencia, el reticulante contiene un segmento hidrocarbonado hidrofobo, por ejemplo 1,2,3,4-diepoxibutano o con suma preferencia 1,2,7,8-diepoxioctano.

Un enlace amida se forma preferentemente empleando un agente reticulante elegido entre carbodiimidas en presencia de aminas, anhidridos y cloruros de acido carboxilico (con HA desacetilado), y diisocianatos.

Un enlace amina se forma preferentemente empleando un agente reticulante elegido entre un epoxido o glutaraldehldo con un agente reductor, en presencia de grupos amino en el HA desacilado.

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Un enlace imino (enlace de base de Schiff) se puede formar empleando glutaraldehldo en presencia de grupos amino en el HA desacilado.

Un enlace sulfona se forma preferentemente empleando un cloruro de sulfonilo.

Los diferentes enlaces funcionales se pueden formar de manera secuen- cial, en un proceso de multiples etapas, lo cual se puede conseguir empleando un agente reticulante diferente en cada etapa o empleando el mismo agente reticulante en cada etapa y ajustando las condiciones de reaccion para controlar la reaccion de reticulacion especlfica requerida.

Asl, para conseguir una reticulacion multiple, por ejemplo doble, por etapas de acuerdo con la presente invencion, se efectua una primera reaccion de reticulacion, por ejemplo empleando uno de los metodos a continuacion descritos. Finalizada esta etapa o una vez que ha progresado en el grado requerido, se anade otra agente reticulante a la mezcla de reaccion para efectuar la segunda reticulacion. El otro agente reticulante puede ser el mismo o distinto del primero.Cuando se emplea un agente reticulante diferente, el mismo se elegira generalmente de manera que, sin cambiar las condiciones de reaccion, se formara un tipo diferente de enlace funcional. Sin embargo, cuando se emplea el mismo agente reticulante para formar ambas reticulaciones, las condiciones de reaccion deberan ajustarse consecuentemente con el fin de formar un tipo diferente de enlace. Los expertos en la materia podran seleccionar facilmente un agente reticulante adecuado y las condiciones de reaccion apropiadas para formar el enlace deseado.

Para evitar dudas, ha de apreciarse que si se emplea el mismo agente reticulante bajo las mismas condiciones de reaccion en cada etapa, esto dara lugar solo a un tipo de enlace, es decir, se obtendra un producto reticulado una sola vez, aunque producido en dos o mas etapas.

Podra apreciarse que cuando los dos o mas enlaces funcionales de acuerdo con la invencion se forman de manera secuencial, es decir, en una reaccion en multiples etapas, la reticulacion formada en la primera etapa de la reaccion debera ser lo suficientemente fuerte para soportar las condiciones de reaccion necesarias para formar la segunda o posteriores reticulaciones. De este modo, en primer lugar debera formarse el mas fuerte de los dos (o mas) enlaces. Esto resultara facilmente evidente para el experto en la materia y, si es necesario, se puede determinar por medio de experimentacion rutinaria.

De este modo, cuando las reticulaciones han de formarse por via de grupos hidroxilo y carboxilo, se reconocera que la reticulacion de la primera etapa debera efectuarse por via de los grupos hidroxilo para proporcionar un enlace eter y la reticulacion de la segunda etapa se efectuara entonces por via de los grupos carboxilo, para proporcionar un enlace ester.

Un enlace eter se puede formar empleando un epoxido reticulante bajo condiciones alcalinas, preferentemente a un pH de 10 o mas o, siempre que el HA no contenga grupos amino libres, empleando glutaraldehldo como el agente reticulante bajo condiciones acidas, por ejemplo un pH de 4 o menos. Un enlace ester se puede formar con epoxido reticulante bajo condiciones acidas, por ejemplo un pH de 4 o menos.

Asl, por ejemplo, se puede efectuar una primera reaccion de reticulacion para formar un enlace eter empleando un epoxido tal como 1,2,7,8-diepoxioctano bajo condiciones alcalinas, preferentemente a un pH de 10 o mas, por ejemplo a un pH de 10 a 12. A continuacion se puede efectuar una segunda reaccion de reticulacion para formar un enlace ester empleando el mismo agente reticulante y ajustando el pH del medio de reaccion a un pH de 4 o menos, por ejemplo a un pH de 4 a 2. Alternativamente, se pueden emplear en cada etapa distintos agentes reticulantes, en cuyo caso puede no ser necesario ajustar las condiciones de reaccion. Asl, por ejemplo, se puede efectuar una primera reaccion de reticulacion empleando glutaraldehldo bajo condiciones acidas para formar un enlace eter, seguido por reaccion con un epoxido reticulante tambien bajo condiciones acidas, para formar un enlace ester.

La relacion de agente reticulante a HA empleada en cada etapa de este procedimiento sera generalmente del orden de 1:10 a 10:1 en peso.

Las reacciones de reticulacion individuales se pueden efectuar de acuerdo con metodos conocidos generalmente en la tecnica.

Asl, el HA empleado como material de partida puede encontrarse en forma de una pellcula o en solucion.

Cuando se emplea una pellcula de HA, esta se puede suspender en un disolvente adecuado junto con agente reticulante. El medio de reaccion comprende preferentemente un disolvente organico tal como acetona, cloroformo o un alcohol, por ejemplo etanol o isopropanol, en mezcla con una solucion acuosa acida o alcalina. Una solucion acida tiene preferentemente un pH de 4 o menos y una solucion alcalina tiene preferentemente un pH de 10 o mayor.

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La reaccion de reticulacion tiene lugar adecuadamente a una temperatura del orden de 15 a 30°C, por ejemplo a temperatura ambiente.

Con preferencia, cuando se emplea una pellcula de HA como material de partida, se forma primero un enlace ester bien con un epoxido bajo condiciones alcalinas o bien, siempre que no esten presentes grupos amino libres, con glutaraldehldo bajo condiciones acidas, seguido por la formacion de un enlace ester empleando epoxido bajo condiciones acidas. Si el HA ha sido desacetilado para proporcionar grupos amino libres, se pude formar una base de Schiff con un enlace imino mediante reaccion con glutaraldehldo bajo condiciones acidas. Un enlace imino se puede convertir a un enlace amina empleando un agente reductor.

El HA se puede emplear tambien como una solucion acuosa acida o alcalina a la cual se anade el reticulante. Bajo condiciones acidas, el pH de la solucion de partida es con preferencia de 4 o menos y, para una solucion alcalina, el pH es con preferencia de 10 o mas. La concentration de HA es convenientemente del orden de 1 a 10% p/p. La reaccion se puede efectuar a una temperatura de 15 a 50°C. El tiempo para completar la reaccion de reticulacion puede variar en general entre una hora y varios dlas aproximadamente.

Con preferencia, cuando se emplea una solucion de HA se forma primero un enlace eter con un epoxido bajo condiciones alcalinas, seguido por la formacion de una reticulacion ester empleando un epoxido (preferentemente el mismo epoxido que en la primera etapa) bajo condiciones acidas.

Alternativamente, se puede someter una solucion de HA a una primera reaccion de reticulacion, tras lo cual el producto intermedio se seca para formar una pellcula la cual se somete a otra reaccion de reticulacion como se ha descrito anteriormente, para proporcionar un producto doblemente reticulado en forma de una pellcula. Con preferencia, para obtener un HA doblemente reticulado de acuerdo con este procedimiento, se forma primero una reticulacion eter con un epoxido bajo condiciones alcalinas, seguido por la formacion de una reticulacion ester empleando un epoxido(preferentemente el mismo epoxido que en la primera etapa) bajo condiciones acidas.

La naturaleza precisa del producto se puede variar mediante la selection adecuada de las condiciones de reaccion con el fin de controlar el grado de reticulacion y por tanto las propiedades del producto. Los factores que influencian el grado de reticulacion y por tanto la naturaleza del producto final incluyen la forma del HA empleado como material de partida, la relation de alimentation de agente reticulante a HA, el tiempo de reaccion, la temperatura y el pH. El producto se puede obtener en forma de un gel o pellcula y puede ser transparente u opaco. La capacidad de absorcion de agua y la bioestabilidad variaran en funcion de la naturaleza precisa del producto.

El producto producido por el proceso de la invention en forma de pellcula o lamina empleando material de partida de HA en forma de una solucion, pellcula o lamina y efectuando el procedimiento sin agitation. Podra apreciarse que cuando se emplea el HA en forma de pellcula o lamina, esta absorbera agua cuando se ponga en solucion acuosa, tal como tampon PBS, y se hinchara para formar un gel. Si se desea, se puede formar opcionalmente un pellcula intermedia despues de la primera etapa de reticulacion, como se ha descrito anteriormente. El producton puede ser transparente u opaco, dependiendo del grado de reticulacion que ocurra. Los productos de HA altamente reticulados son en general opacos y pueden incluso ser de color blanco.

El producto producido por el proceso de la invencion en forma de un gel por hidratacion de una pellcula, la cual, por ejemplo, puede prepararse como anteriormente se ha descrito. Si es necesario, la pellcula puede subdividirse en pequenas piezas para facilitar la absorcion de agua.

El producto producido por el proceso de la invencion puede ser obtenido en forma de un gel opaco usando el material de partida de HA en forma de una solucion, pellcula o lamina y todo el procedimiento se efectua con agitacion y sin formacion de una pellcula en cualquier etapa.

Cualquiera que sea el metodo de reticulacion que se utilice, el termino de la reaccion se puede controlar de forma usual por metodos bien conocidos en la tecnica, por ejemplo, la reaccion se puede terminar por neutralization de la mezcla de reaccion y precipitation en disolvente para obtener un producto con el grado deseado de reticulacion.

El producto final puede ser aislado del medio de reaccion por procedimientos convencionales.

Podra entenderse que cuando se requiera un producto que contenga mas de dos reticulaciones diferentes, este se puede preparar mediante una combination adecuada de reacciones de reticulacion en secuencia, como anteriormente se ha descrito.

El HA reticulado preparado de acuerdo con el proceso de la presente invencion contiene al menos dos tipos diferentes de enlaces de reticulacion, por ejemplo ambos enlaces eter y ester.

El HA doblemente reticulado preparado por el proceso de la presente invencion puede tener un grado de reticulacion

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del orden de 10 a 50%, por ejemplo 15 a 30%, con preferencia 20 a 25% (en donde 100% esta representado por la reticulacion de todos los grupos Oh en la posicion C6 y de todos los grupos COOH en la posicion C5). El grado de reticulacion se puede medir por analisis elemental o analisis NMR en estado solido.

Las relaciones de los diferentes enlaces funcionales en el producto variaran en funcion de los tipos de enlaces funcionales presentes y de las condiciones de reaccion empleadas para su formacion. Para un producto reticulado de forma doble que contiene enlaces eter y ester, la relacion de dichos enlaces puede variar de 50:50 a 95:5, por ejemplo de 60:40 a 80:20 de enlaces eter:ester.

En general, un producto preparado por el proceso de la presente invencion tiene un mayor grado de reticulacion, es decir, una red de reticulaciones mas densas que el HA reticulado de forma simple. Se ha comprobado que un mayor grado de reticu- lacion reduce la capacidad de absorcion de agua del HA reticulado, traduciendose ello en una mayor estabilidad en solucion acuosa. Ademas, se ha comprobado que el HA doblemente reticulado exhibe una mayor estabilidad con- tra la degradacion por hialuronidasa y contra la degradacion debida a radicales libres, indicativo ello de una mayor bioestabilidad.

Un producto opaco preparado por el proceso de con la presente invencion tiene en general un mayor grado de reticulacion y, por tanto, una menor capacidad de absorcion de agua y una mayor estabilidad, en comparacion con un producto transparente. Dichos productos son adecuados para su implantacion a largo plazo.

Un producto transparente, por ejemplo una pellcula transparente, preparado por el proceso la presente invencion tiene una mayor capacidad de absorcion de agua que un producto opaco y dichos productos resultan particularmente adecuados para implantes dermicos, curacion de heridas (absorcion de exudado) e implantacion resorbible a corto plazo.

El procedimiento en multiples etapas descrito anteriormente proporciona un producto altamente reticulado con una baja capacidad de absorcion de agua. La reticulacion simultanea se traduce generalmente en un producto insoluble en agua, pero con una mayor capacidad de absorcion de agua que un producto preparado empleando un procedimiento en multiples etapas (por ejemplo, dos etapas) bajo condiciones similares.

Por otro lado, se ha comprobado que empleando una pellcula de HA reticulado una sola vez para la segunda etapa de reticulacion se obtiene un producto (que puede estar en forma de pellcula o que puede convertirse a un gel) con una capacidad de absorcion de agua mas baja que el HA reticulado doblemente y preparado a partir de solucion de HA bajo condiciones de reticulacion similares (es decir, sin formacion intermedia de pellcula). En realidad, se ha comprobado que la capacidad de absorcion de agua de los productos resultantes puede variar desde 400% a 1000% para materiales de partida en forma de pellcula y de gel, respectivamente.

Los derivados de HA reticulados preparado por el proceso de con la presente invencion se pueden emplear en una variedad de aplicaciones farmaceuticas, medicas (incluyendo quirurgicas) y cosmeticas.

Asl, pueden ser utiles, por ejemplo, a la hora de promover la curacion de heridas, por ejemplo como un vendaje para heridas dermicas.

Tambien pueden ser utiles a la hora de prevenir la adherencia, por ejemplo prevenir el crecimiento de tejido entre organos despues de la cirugla.

Los derivados de HA reticulados preparado por el proceso de la presente invencion pueden encontrar tambien aplicacion en el campo oftalmico, por ejemplo para sustituir el fluido vltreo, como pantallas corneales para el suministro de farmacos al ojo o como lentlculas.

Los derivados de HA reticulados preparado por el proceso de la presente invencion pueden ser tambien utiles en cirugla, por ejemplo como implantes solidos para el aumento de tejido duro, por ejemplo preparacion o sustitucion de cartllago o hueso, o para el aumento de tejido blando, como implantes de mama, o bien como revestimiento para implantes destinados para su uso a largo plazo en el cuerpo, tales como implantes de mama, cateteres, canulas, protesis oseas, sustituciones de cartllagos, mini-bombas y otros dispositivos de administracion de farmacos, organos artificiales y vasos sangulneos, mallas para el refuerzo de tejidos, etc. Tambien se pueden emplear como lubricantes de articulaciones en el tratamiento de artritis.

Otro uso de los derivados preparados por el proceso de la presente invencion reside en la administracion de agentes terapeuticamente activos, incluyendo cualquiera de las aplicaciones antes mencionadas. Los agentes terapeuticamente activos pueden ser agentes quimioterapeuticos o factores biologicamente activos (por ejemplo, citoquinas) e incluyen agentes anti-inflamatorios, antibioticos, analgesicos, anestesicos, promotores de la curacion de heridas, agentes citostaticos, inmunoestimulantes, inmunosupresores y antivlricos.

Los factores terapeuticamente activos se pueden unir al derivado de HA reticulado por metodos bien conocidos en la

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tecnica.

Los derivados de HA reticulados se pueden emplear en diversas formas, incluyendo membranas, perlas, esponjas, tubos, laminas e implantes conformados.

La invencion sera ilustrada ahora adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos no limitativos.

Se emplearon los siguientes procedimientos para medir la estabilidad de los productos.

Metodoloaia

Evaluacion de la capacidad de absorcion de agua

Se sumergieron 20 mg (Wd) de cada una de las muestras reticuladas secas en solucion de tampon PBS para formulacion durante 24 horas, para obtener un gel totalmente hinchado. El gel humedo fue separado por filtracion y el agua residual en la superficie se retiro empleando papel de seda. El gel humedo se peso para obtener Ws. De este modo, la capacidad de absorcion de agua (WAC) (%) se puede calcular de acuerdo con la siguiente formula:

WAC(%) = (Ws - Wd)/Wd x 100

Resistencia a la digestion por hialuronidasa

Se suspendieron 200 mg de HA reticulado en 6 ml de solucion tampon de PBS (pH=7,2) conteniendo 1000 U de hialuronidasa y se incubo a 37°C durante 24 horas. A continuacion, la pellcula se retiro y se enjuago empleando tampon PBS y se recogio toda la solucion de enjuagado para obtener un total de 10 ml de solucion. Esta solucion se hirvio durante 30 minutos para efectuar la precipitacion de hialuronidasa. La solucion se centrifugo entonces a 4000 rpm/10 minutos. La solucion sobrenadante se completo a 25 ml empleando solucion de PBS en un matraz volumetrico. La concentracion de HA se midio empleado el ensayo de Carbazol.

La perdida de peso de HA debido a la digestion con hialuronidasa se puede calcular empleando la siguiente formula:

Perdida peso HA (%) = [HA] x 25/[HA]o x 100

en donde [HA] es la concentracion de HA, [HA]o es el contenido original en HA (mg). Resistencia a radicales libres

Se emplearon agentes Ferton para crear radicales libres, los cuales se forman mediante 25 microlitros de acido ascorbico 0,1 y 0,25 microlitros de 0,1M H2 O2 en 5 ml de solucion de PBS. A esta solucion se anadieron 20 mg de muestra seca para la digestion. El tiempo de digestion es de 24 horas a 37°C. A continuacion, la pellcula se retiro y se enjuago empleando tampon PBS y toda la solucion de enjuagado se recogio y se completo a 25 ml empleando tampon PBS en un matraz volumetrico. La concentracion de HA se medio empleando el ensayo de Carbazol. La perdida de peso de HA se puede calcular empleando la misma formula que en la digestion con hialuronidasa.

Ejemplo 1

Formacion de pellcula de HA doblemente reticulado a parti r de pellcula de HA

Se moldearon 5 ml de HA (1%) durante 4 dlas a temperatura ambiente para obtener una pellcula de HA. La pellcula resultante se suspendio en una mezcla de CHCl3 disolvente/solucion acida o alcalina/reticulante de 1,2,7,8- diepoxioctano o glutaraldehldo. La reaccion de reticulacion se efectuo a temperatura ambiente durante un tiempo fijo (24 horas). Se anadio otra cantidad de agente reticulante y, si es necesario, se ajusto el pH, y la mezcla se dejo en reposo a temperatura ambiente durante 24 horas mas, para efectuar la segunda reaccion de reticulacion. En la Tabla 1 se muestran las condiciones detalladas de la reticulacion. Despues de la reticulacion, las muestras se lavaron con IPA y acetona durante tres veces, se sumergieron en IPA/agua desionizada (60/40) durante la noche y luego se lavaron con acetona y se secaron en un horno a 37°C hasta conseguir un peso constante.

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: Primer reticulante Segundo reticulante Tiempo (horas) Temperatura (°C) pH Capacidad absorcion agua(%)

Nombre: Relation alimentation Nombre Relation alimentation

CHA-2: G 2,5/1 E 0,75/1 24h/24h TA H+ 414,4

CHA-8: E 0,75/1 E 0,75/1 24h/24h TA OH-/H+ 403,0

CHA-3: G 2,5/1 E 0,75/1 24h/24h TA H+/OH- 4430,0

CHA-5: E 0,75/1 G 2,5/1 24h/24h TA H+ 1017,2

CHA-9: E 0,75/1 G 2,5/1 24h/24h TA OH-/H+ 4400,0

Ejemplos de Referencia

CHA-1: G 2,5/1 G 2,5/1 24h/24h TA H+ 11132,5

CHA-4: E 0,75/1 E 0,75/1 24h/24h TA H+ 781,9

CHA-6: E 0,75/1 E 0,75/1 24h/24h TA H+/OH- Disuelto

CHA-7: E 0,75/1 E 0,75/1 24h/24h TA OH- 11989,1

* Relation de alimentation : relation en peso de HA a reticulante E: = 1,2,7,8-diepoxioctano; G: = glutaraldehldo

H+ representa un pH de alrededor de 4; OH- representa un pH de alrededor de 10

CHA-1, CHA-4 y CHA-7 fueron preparados cada uno de ellos empleando las mismas condiciones para cada etapa de reticulation, proporcionando solo enlaces eter (reticulation simple).

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Ejemplo 2

Se disolvieron 0,1 g de HA en solucion de 0,25N NaOH o solucion de 0,25N de HCl para obtener soluciones HA con una concentration de 10% o 2,5%. Se anadio el agente reticulante y la mezcla se sometio a agitation mecanica. La primera reaction de reticulation se efectuo a 40°C durante un perlodo de 2 horas aproximadamente. Se efectuo una segunda reaccion de reticulacion empleando una cantidad adicional del mismo reticulante, con ajuste de las condiciones de reaccion. En la Tabla 2 se ofrecen las condiciones detalladas de la reaccion. Despues de la reticulacion, el gel formado se lavo con IPA, acetona y se extrajo con IPA/agua durante la noche y luego se lavo tres veces con IPA y acetona respectivamente. Las muestras se secaron en un horno a 37°C hasta conseguir un peso constante. El producto se obtuvo como un gel opaco.

TABLA 2 Formacion de HA reticulado (CHA) a partir solucion de HA

Nombre: Relacion alimentacion* Nombre Relacion alimentacion*

CHA-11: E 1/1 E 1/1 2h/2h 40 OH-/H+ 390,0

CHA-10: E 1/1 E 1/1 2h/2h 40 OH-/OH- 620,0

CHA-12: E 1/1 E 1/1 2h/2h 40 H+/OH- 1830,0

CHA-13: E 1/1 E 1/1 2h/2h 40 H+/H+ disuelto

E: = 1,2,7,8-diepoxioctano

H+ representa un pH de alrededor de 4; OH- representa un pH de alrededor de 10

Ejemplo 3

Formacion de HA doblemente reticulado (CHA) a partir de solucion de HA por via de pelicula de HA

Se disolvieron 0,1 g de HA en solucion de 0,25N NaOH o solucion de 0,25N de HCl para obtener soluciones de HA con una concentracion de 10% o 2,5%. Se anadio el agente reticulante. La reaccion se efectuo en un plato Petri con poco o ninguna agitacion mecanica. La primera reaccion de reticulacion se efectuo a temperatura ambiente durante un perlodo de 48 o 72 horas aproximadamente. El producto intermedio se seco para proporcionar una pelicula o lamina (dependiendo del espesor). Se efectuo una segunda reaccion de reticulacion empleando la metodologla descrita en el Ejemplo 1. En la siguiente Tabla 3 se ofrecen las condiciones detalladas de la reaccion. Despues de la reticulacion, el producto se lavo (x3) con IPA y acetona y se extrajo con IPA/agua durante la noche y luego se lavo acetona. Las muestras se secaron en un horno a 37°C hasta conseguir un peso constante y el producto se obtuvo en forma de pelicula o lamina.

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Nombre: Relacion alimentacion Nombre Relacion alimentacion*

CHA-17: E 0,375/1 E 0,5/1 72/24 TA OH-/H+ 403,2

CHA-19: E-1 0,375/1 E 0,5/1 72/24 TA OH-/H+ 1030,0

EJEMPLOS DE REFE: RENCIA

CHA-14: E 0,375/1 / / 72 TA Neutro 2419,1

CHA-15: E 0,375/1 / / 72 TA H+ 2128,3

CHA-16: E 0,375/1 / / 72 TA OH- 1318,6

CHA-18: E-1 0,375/1 / / 72 TA OH- 2600,4

E: = 1,2,7,8-diepoxioctano; E-1: epiclorhidrina H+ representa un pH de alrededor de 4 OH- representa un pH de alrededor de 10

TABLA 4 Bioestabilidad de HA reticulado contra hialuronidasa y radicales libres

NO: Perdida de peso (%)

Digestion con hialuronidasa: Digestion Ferton (radiales libres)

CHA-16: 10,45 ± 0,21 7,89 ± 1,92

CHA-17: 1,45 ± 0,92 5,63 ± 2,73

Ejemplo 4

Se disolvieron 0,1 g de HA en 2 ml en solucion de 1N NaOH durante la noche para proporcionar una solucion alcalina de HA al 5%. A esta solucion se anadieron 0,2 ml de 1,2,7,8-diepoxioctano. Se anadieron luego 0,2 ml de cloroformo mientras se agitaba a 40°C durante 30 minutos. Despues de formar la reticulacion eter se anadieron 2,2 ml de 1N HCl para cambiar el pH de la solucion a un valor entre 3 y 4. Se anadieron otros 0,2 ml de 1,2,7,8- diepoxioctano y luego se anadieron 2,2 ml de cloroformo mientras se agitaba a 40°C durante 30 minutos. Despues de la reticulacion ester, el gel formado fue precipitado con 20 ml de acetona y purificado de acuerdo con el mismo procedimiento detallado en el Ejemplo 2.

Ejemplo 5

A 5 ml de solucion de HA/NaOH (1N) se anadieron 0,5 ml de epiclorhidrina y 0,2 ml de cloroformo y se mezclo a temperatura ambiente durante 10 minutos. La solucion fue colada en un plato Petri y se dejo secar como una pellcula de HA reticulado (CHA-18). Despues de la neutralizacion con 1N HCl, la muestra de cHA-18 se suspendio en 20 ml de cloroformo/solucion acuosa acida 0,1N (3/1 v/v) y se anadieron 0,2 ml de 1,2,7,8-diepoxioctano y se dejo reaccionar a temperatura ambiente durante 24 horas. La muestra resultante, CHA-19, fue purificada de acuerdo con el mismo procedimiento detallado en el Ejemplo 1.

Ejemplo 6

Se mezclaron 20 ml de una solucion al 25% de HA/NaOH (1,0N) con volumenes variables de 1,2,7,8-diepoxioc- tano durante 5 minutos con agitacion. La solucion mezclada se esparcio entonces sobre un plato Petri revestido con

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poliestireno, sin colageno, de 7 cm de dimension y se tapo con una cubierta. Despues de 24 horas a temperatura am- biente, se retiro la cubierta y el gel reticulado se seco durante 48 horas. La pellcula seca y con un espesor controlable fue neutralizada con acetona/solucion de HCl y purificada con acetona/agua, acetona e IPA. El material de tipo lamina reticulado en primer lugar se puso en una solucion de acetona/HCl a pH 5 y 0,4 ml de 1,2,7,8- diepoxioctano durante otras 24 horas de reticulacion a temperatura ambiente. La lamina obtenida fue purificada con acetona/agua, acetona e IPA/agua, IPA varias veces.

La lamina de HA doblemente reticulado, as! obtenida, es insoluble en agua y se comprobo que absorbla una cantidad de 10 veces de agua para formar un gel transparente. Tambien mostro una resistencia mecanica muy buena, lo cual constituye una caracterlstica importante para su aplicacion tecnica en tejidos.

Analisis 13 C NMR en estado solido de muestras de HA

El analisis 13 C NMR en estado solido del hialuroano y de dos muestras doblemente reticuladas se realizo a 50 MHz empleando un espectrometro Advance 200. Los espectros obtenidos empleando un tiempo de contacto de 1 ms en la secuencia de impulsos de polarizacion transversal (CP) estandar se muestran en las figuras 1-3. Se obtuvo tambien un espectro de la muestra numero 3 que contiene la referencia interna, tetrakis(trimetil)silano (TKS, desplazamiento qulmico de 3,2 ppm), empleando un tiempo de contacto de 5 ms. (Figura 4). Las asignaciones de picos con referencia a TKS son como sigue.

Desplazamiento qulmico, ppm

C=O en carboxilo y acetilo: 170-180

C=O en ester para muestras modificadas: 165-170 (hombro)

Ci: 95-110

C2 -C5 mas OCH y OCH2 en modificador: 65-90

C6: 60-65

C-N: 53-60

CH2 en modificador no enlazado a O: 20-40

CH3 en acetilo: 20-25

La muestra 1 (Figura 1) es acido hialuronico puro sin modificaciones. Las formulaciones reales para muestra 2 y muestra 3 se ofrecen en la siguiente tabla:

: Primer reticulante Segundo reticulante

: Relacion alimentacion pH Temperatura reaccion (°C) Tiempo reaccion (horas) Relacion alimentacion pH Temperatura reaccion (°C) Tiempo reaccion (horas)

Muestra 2: 3/1 10 TA 72

Muestra 3: 1/2 10 TA 2 horas 1/2 4 TA 2 horas

Muestra 2 (Figura 2): preparada de acuerdo con el metodo del Ejemplo 3 pero sin la segunda reticulacion. La relacion de alimentacion es la cantidad de HA con respecto a 1,2,7,8-diepoxioctano. La pellcula formada fue cortada en mallas finas para analisis NMR.

Muestra 3 (Figuras 3 y 4): preparada de acuerdo con el metodo del Ejemplo 2 para formar un gel, el cual se molio a un polvo fino para analisis NMR.

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Reivindicaciones

1. Un procedimiento para la preparacion de acido hialuronico reticulado multiple (HA), cuyo procedimiento comprende la reticulacion de HA a traves de dos o mas grupos funcionales diferentes, en donde dicha reticulacion se efectua poniendo en contacto HA con uno o mas agentes de reticulacion con el fin de formar dos o mas tipos diferentes de enlaces funcionales, entre las moleculas de HA, en el que dichos dos o mas tipos diferentes de enlaces funcionales se seleccionan de entre eter, ester, sulfona, amina, imino y enlaces de amida, en el que, en dicho proceso, una primera reaccion de reticulacion se lleva a cabo y una reticulacion adicional agente, que puede ser la misma o diferente de la primera, se anade a la mezcla de reaccion para efectuar la segunda reticulacion y en el que el agente de reticulacion se selecciona de entre formaldehldo, glutaraldehldo, divinilsulfona, un polianhldrido, un polialdehldo, un alcohol polihldrico, carbodiimida, epiclorhidrina, diglicidileter de etilenglicol, butanodiol diglicidileter, poliglicidileter de poliglicerol, polietilenglicol diglicidil eter, polipropilenglicol diglicidil eter, o un bis-o poli-epoxi reticulante.
2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, en donde los grupos funcionales se eligen entre hidroxilo, carboxilo y amino.
3. Procedimiento segun la reivindicacion 1 o 2, en el que un enlace eter se forma usando un agente de reticulacion seleccionado de bis y poli-epoxidos bajo condiciones alcalinas.
4. Procedimiento segun la reivindicacion 1 o 2, en el que un enlace ester se forma usando un agente de reticulacion seleccionado de bis y poli-epoxidos bajo condiciones acidas.
5. Procedimiento segun la reivindicacion 3 o 4, en donde el reticulante se elige entre 1,2,3,4-diepoxibutano y 1,2,7,8- diepoxioctano.
6. Procedimiento segun la reivindicacion 1 o 2, en donde se forma un enlace eter empleando glutaraldehldo como agente reticulante bajo condiciones acidas.
7. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la reticulacion de cada tipo de grupo funcional se efectua de manera secuencial.
8. Procedimiento segun la reivindicacion 7, que comprende reticular HA por via de un primer grupo funcional y a continuacion reticular adicionalmente el producto por via de un segundo grupo funcional, en donde dichos primero

y segundo grupos funcionales representan entidades qulmicas diferentes.
9. Procedimiento segun la reivindicacion 7 u 8, en donde el HA se reticula primeramente por via de los grupos hidroxilo mediante formation de enlaces eter y a continuacion se reticula por via de los grupos carboxilo mediante la formation de enlaces ester.
10. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicha reticulacion multiple HA se reticula con uno o mas agentes de reticulacion a fin de formar dos tipos diferentes de enlaces funcionales.
11. Procedimiento segun la reivindicacion 10,que comprende:

(a) reticular HA por via de un primer grupo funcional y

(b) reticular luego adicionalmente el producto de (a) por via de un segundo grupo funcional, en donde dichos primero y segundo grupos funcionales representan entidades qulmicas diferentes.