ES2197217T3 - Anticuerpo 3h1 monoclonal anti-id-murino. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN ANTICUERPO 3H1 ANTI-IDIOTIPO MONOCLONAL QUE ESCAPA A LA INMUNOTOLERANCIA Y PROVOCA UNA RESPUESTA INMUNITARIA ESPECIFICA AL ACE EN RATONES, CONEJOS, MONOS Y PACIENTES CON ENFERMEDAD AVANZADA ASOCIADA AL ACE. SE DESCRIBEN COMPUESTOS QUE PUEDEN UTILIZARSE PARA LA DETECCION O EL TRATAMIENTO DE TUMORES ASOCIADOS AL ACE Y QUE SON SIMILARES A UN EPITOPE ESPECIFICO EN EL ANTIGENO CARCINOEMBRIONARIO Y UN HIBRIDOMA QUE PRODUCE 3H1.

Description

Anticuerpo 3H1 monoclonal anti-Id-murino.

Declaración de derechos para las invenciones realizadas bajo investigación patrocinada federalmente

Esta invención fue realizada en parte durante un trabajo apoyado por una beca procedente del Public Health Service de los Estados Unidos (CA 47860) y de los National Institutes of Health (CA 57165). El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a anticuerpos anti-idiotipo. Más específicamente, se refiere al anticuerpo monoclonal anti-idiotipo 3H1 que produce una respuesta inmune contra un epítopo específico del antígeno carcinoembrionario (CEA).

Antecedentes de la invención

A pesar de la extensa investigación médica y de los numerosos avances, el cáncer permanece como la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos. El cáncer colorrectal es el tercer cáncer más común y la segunda causa principal de las muertes por cáncer. Aunque los modos tradicionales de terapia tales como cirugía, radioterapia y quimioterapia son ampliamente utilizados y tienen éxito en muchos casos, la elevada tasa de mortalidad todavía existente debida a cánceres tales como el cáncer colorrectal, impone la necesidad de modos alternativos de terapia.

La inmunoterapia del cáncer humano utilizando vacunas de células tumorales o vacunas derivadas del tumor ha sido decepcionante por varias razones. Ha sido sistemáticamente difícil obtener grandes cantidades de antígenos asociados al tumor purificados que están a menudo mal definidos químicamente y que son difíciles de purificar. Además, permanece el problema del potencial de la respuesta inmunobiológica contra los antígenos tumorales, o en otras palabras, la cuestión de si un paciente con cáncer puede producir eficazmente una respuesta inmune contra su tumor. Los antígenos asociados a tumores (TAA) son a menudo una parte de lo ``propio'' y producen normalmente una respuesta inmune muy pobre en un huésped portador de un tumor debido a la tolerancia a los antígenos, tal como la supresión mediada por células T. Los inmunobiólogos han aprendido que un antígeno pobre (en términos de producción de una respuesta inmune) puede ser convertido en un antígeno potente cambiando el entorno molecular. Cambios del transportador del hapteno permiten que las células T cooperadoras resulten activas, haciendo más potente la respuesta inmune total. De este modo, el cambio del transportador puede convertir también un antígeno tolerogénico en un antígeno eficaz. McBridge y col. (1986) Br. J. Cancer 53:707. A menudo el estado inmunológico de un paciente con cáncer está suprimido, de tal manera que el paciente es sólo capaz de responder a ciertos antígenos dependientes de T y no a otras formas de antígeno. A partir de estas consideraciones, tendría sentido introducir cambios moleculares en los antígenos asociados al tumor antes de utilizar los mismos como vacunas. Desgraciadamente, esto es imposible de conseguir en la mayoría de los antígenos tumorales, debido a que no están bien definidos y son muy difíciles de purificar.

La hipótesis de la red de Lindemann ((1973) Ann. Immunol. 124:171-184) y Jerne ((1974) Ann. Immunol. 125: 373-389) ofrece una aproximación elegante para transformar estructuras de epítopos en determinantes idiotípicos expresados en la superficie de los anticuerpos. De acuerdo con el concepto de red, la inmunización con un antígeno dado asociado a un tumor generará la producción de anticuerpos contra este antígeno asociado al tumor, denominados Ab1; este Ab1 es luego utilizado para generar una serie de anticuerpos anti-idiotipo contra el Ab1, denominados Ab2. Algunas de estas moléculas de Ab2 pueden remedar eficazmente la estructura tridimensional del antígeno asociado al tumor identificado por el Ab1. Estos anti-idiotipos particulares denominados Ab2\beta encajan en los paratopos de Ab1 y expresan la imagen interna del antígeno asociado al tumor. Los Ab2\beta pueden inducir respuestas inmunes específicas similares a las inducidas por el antígeno asociado al tumor original y pueden, por tanto, ser utilizados como antígenos asociados al tumor sustitutos. La inmunización con Ab2\beta puede conducir a la generación de anticuerpos anti-anti-idiotipo (Ab3) que reconocen el antígeno asociado al tumor original correspondiente identificado por Ab1. Debido a esta reactividad similar a la de Ab1, el Ab3 es denominado también Ab1' para indicar que podría diferir en sus otros idiotopos de Ab1. Se han utilizado anticuerpos monoclonales anti-Id que se asemejaban estructuralmente a los antígenos asociados al tumor como sustitutos de antígenos en pacientes con cáncer para inducir inmunidad antitumoral. Herlyn y col. (1987) PNAS 84:8055-8059; Mittleman y col. (1992) PNAS 89:466-470; Chatterjee y col. (1993) Ann. N.Y. Acad. Sci. 690:376-278.

Una aproximación potencialmente prometedora al tratamiento del cáncer es la inmunoterapia empleando anticuerpos anti-idiotipo. En esta forma de terapia, un anticuerpo que remede un epítopo de una proteína asociada a un tumor es administrado en un esfuerzo para estimular el sistema inmune del paciente contra el tumor, a través de la proteína asociada al tumor. WO 91/11465 describe métodos para estimular una respuesta inmune en un humano contra células malignas o contra un agente infeccioso utilizando anticuerpos anti-idiotipo de primate. Sin embargo, no todos los anticuerpos anti-idiotipo pueden ser utilizados en regímenes terapéuticos contra tumores. Además, como los diferentes cánceres tienen características moleculares y clínicas muy variables, se ha sugerido que la terapia anti-idiotipo debe ser evaluada caso por caso, en términos del origen del tumor y de los antígenos expresados.

Se han utilizado anticuerpos monoclonales anti-Id que se asemejaban estructuralmente a los antígenos asociados al tumor como sustitutos de antígenos en pacientes con cáncer. Herlyn y col. (1987) PNAS 84:8055-8059; Mittleman y col. (1992) PNAS 89:466-470; Chatterjee y col. (1993) Ann. N.Y. Acad. Sci. 690:376-278. Se ha propuesto que el anti-Id proporciona un análogo parcial del antígeno asociado al tumor en un contexto inmunogénico.

El antígeno carcinoembrionario (CEA) es un antígeno glicoproteico asociado a tumores de 180.000 kiloDaltons presente en neoplasias derivadas endodérmicamente del tracto gastrointestinal, tales como cáncer colorrectal y pancreático, así como en otros adenocarcinomas tales como cánceres de mama y pulmón. El CEA se encuentra también en los órganos digestivos del feto humano. Puede detectarse CEA circulante en la gran mayoría de pacientes con tumores positivos para CEA. Se han producido anticuerpos monoclonales específicos contra CEA y algunos han sido radiomarcados para estudios de diagnóstico y clínicos. Hansen y col. (1993) Cancer 71:3478-3485; Karoki y col. (1992) Hybridoma 11:391-407; Goldenberg (1993) Am. J. Med. 94:297-312. Como ocurre con la mayoría de antígenos asociados a tumores que son considerados como antígenos propios por el sistema inmune, los pacientes con cáncer son inmunológicamente ``tolerantes'' al CEA, debido posiblemente a su origen oncofetal. Los estudios hasta la fecha en pacientes con tumores positivos para CEA no han demostrado la capacidad para producir inmunidad hacia CEA. Por tanto, la inmunoterapia basada en CEA no ha sido posible hasta ahora.

El CEA es, sin embargo, un excelente antígeno asociado a tumores para inmunoterapia activa con anticuerpos anti-idiotipo. El CEA está presente típicamente a niveles elevados en la superficie de las células tumorales. El CEA es también uno de los antígenos mejor caracterizados, ya que se conoce su secuencia génica y se han identificado sus estructuras tridimensionales. El CEA es un miembro de la familia de supergenes de las inmunoglobulinas situado en el cromosoma 19 que se cree que está implicado en las interacciones célula-célula.

Puesto que algunos de los epítopos de CEA son compartidos por tejidos normales, la inmunización con la molécula intacta de CEA puede desencadenar reacciones autoinmunes potencialmente nocivas. Por otra parte, sería deseable una reacción inmune contra un epítopo asociado a un tumor. Un anticuerpo anti-idiotipo apropiado sería un excelente candidato para inducir inmunidad antitumoral en pacientes con cáncer positivo para CEA. Varios investigadores han generado anticuerpos anti-idiotipo en ratas, ratones, babuínos y humanos que remedan al CEA. Ver, por ejemplo, Hinoda y col. (1995) Tumor Biol. 16:48-55; Losman y col. (1994) Int. J. Cancer 56:580-584; Irvine y col. (1993) Cancer Immunol. Inmunother. 36:281-292. Sin embargo, dado el tamaño del CEA (y probablemente de los numerosos epítopos), y el hecho de que CEA se exprese en algunos tejidos normales, no se sabía si los anticuerpos anti-idiotipo serían eficaces para inducir una respuesta anti-CEA que produjera una inmunidad anti-tumoral.

Bhattacharya-Chatterjee y col. (J. Immunol. 145:2758, 1990) se refieren a un anticuerpo monoclonal anti-idiotipo como un antígeno potencial de la red para el antígeno carcinoembrionario (CEA) humano. Estos artículos describen la existencia del anticuerpo monoclonal 3H1 producido en ratones contra 8019.

Bhattacharya-Chatterjee y col. (Cancer Immunol. Immunother. 38:75, 1994) y Bhattacharya-Chatterjee y col. (Intern. Rev. Immunol. 7:289, 1991) se refieren a la inmunoterapia del cáncer con anticuerpos idiotípicos. Estos artículos revisan la aproximación idiotípica a la inmunoterapia de cánceres y enfermedades infecciosas. Con respecto al epítopo de CEA definido por 8019, los artículos describen solamente dos anti-idiotipos clasificados como un antígeno de imagen interna. Solamente uno de estos dos candidatos (a saber 3H1) ha sido descrito como capaz funcionalmente de remedar al CEA.

Bhattacharya-Chatterjee y col. (Vaccine Research 2:283, 1993) se refieren a la presencia de un idiotipo de un antígeno de la red en el suero de pacientes con cáncer de colon.

Bhattacharya-Chatterjee y col. (FASEB J. 8:A200, 1994) es un resumen que se refiere al ensayo del anticuerpo 3H1 en pacientes con cáncer colorrectal. Los pacientes fueron tratados con 3H1 a dosis de 1 mg, 2 mg o 4 mg en un protocolo no especificado.

Chakraborty y col. (J. Immunotherapy 18:95, 1995), publicado después de la fecha de registro de la solicitud de prioridad, se refieren a la evaluación del anticuerpo 3H1 en primates no humanos.

Foon y col. (J. Clin. Invest. 96:334, 1995) y Köhler y col. (Exp. Med. Biol. 383:117, 1995), ambos publicados después de la fecha de registro de la solicitud de prioridad, se refieren en parte a respuestas inmunes en pacientes tratados con el anticuerpo 3H1.

Ninguno de los artículos anteriormente enumerados describe la secuencia de aminoácidos o la secuencia codificadora del anticuerpo 3H1, ni tampoco proporcionan al lector un modo de producir el anticuerpo o de determinar la secuencia. En estos artículos no se describe ningún otro anti-idiotipo correspondiente al epítopo de 8019 del CEA, ni tampoco se analiza para determinar su seguridad clínica y su eficacia.

Los carcinomas del tracto gastrointestinal no son a menudo curables mediante las terapias estándar. Por tanto, se necesitan nuevas aproximaciones terapéuticas para esta enfermedad. La presente invención supera las deficiencias de la técnica anterior proporcionando un anticuerpo monoclonal anti-idiotipo (3H1) como antígeno (Ag) sustituto para inducir inmunidad antitumoral en pacientes de cáncer gastrointestinal con una enfermedad asociada al CEA avanzada, tal como cáncer colorrectal.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti-idiotipo murino, 3H1, que es capaz de producir una respuesta inmune contra el antígeno carcinoembrionario (CEA). La invención proporciona también la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de 3H1 y una secuencia polinucleotídica que codifica estas regiones variables de 3H1.

Por consiguiente, en un aspecto, la invención incluye un anticuerpo monoclonal anti-idiotipo 3H1 producido por la línea celular de hibridomas ATCC Nº HB 12003 y por la progenie de la misma.

En otro aspecto, la invención incluye una línea celular de hibridomas denominada ATCC Nº HB 12003 y la progenie de la misma.

En otro aspecto, la invención incluye una línea celular de hibridomas que produce un anticuerpo monoclonal anti-idiotipo que tiene una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera idéntica a la SEC ID Nº:2 y una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada idéntica a la SEC ID Nº:4.

En otro aspecto, la invención incluye un anticuerpo monoclonal anti-idiotipo que tiene una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera idéntica a la SEC ID Nº:2 y una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada idéntica a la SEC ID Nº:4.

Otro aspecto de la invención es un anticuerpo que tiene una región variable de la cadena ligera codificada por un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEC ID Nº:2 y una región variable de la cadena pesada codificada por un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEC ID Nº:4.

En otro aspecto, la invención incluye composiciones farmacéuticas y vacunas que contienen una cantidad eficaz del anticuerpo monoclonal anti-idiotipo 3H1.

En otro aspecto, la invención incluye también métodos para producir una respuesta inmune en un individuo con una enfermedad asociada al CEA avanzada. Estos métodos incluyen la administración al individuo de una cantidad eficaz de 3H1.

En otro aspecto, la invención proporciona métodos para detectar la presencia de un anticuerpo anti-CEA unido a una célula tumoral que comprenden las etapas de poner en contacto la célula tumoral con 3H1 durante un tiempo suficiente para permitir la unión al anticuerpo anti-CEA y detectar la presencia de cualquier 3H1 que esté unido al anticuerpo anti-CEA.

En otro aspecto, la invención proporciona un kit de diagnóstico para la detección o cuantificación de anticuerpos anti-CEA. Estos kits contienen 3H1 en un embalaje adecuado.

Otro aspecto de la invención son métodos para paliar una enfermedad asociada al CEA en un individuo que tenga una enfermedad asociada al CEA avanzada. Estos métodos incluyen la administración de una cantidad eficaz de 3H1 al individuo.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 representa la secuencia de ADN (SEC ID Nº:1) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº:2) de la región variable de la cadena ligera de 3H1.

La Figura 2 representa la secuencia de ADN (SEC ID Nº:3) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº:4) de la región variable de la cadena pesada de 3H1.

La Figura 3 representa secuencias génicas de la cadena kappa de inmunoglobulina de ratón y de rata, comparando las secuencias de la región constante de la cadena kappa para diferentes cepas y resaltando las diferencias alotípicas. Están incluidas secuencias de la región constante de la cadena kappa para BALB/c (SEC ID Nº:5), PL (SEC ID Nº:6), SJL (SEC ID Nº:7) y M. spretus (SEC ID Nº:8). Los cuatro alotipos genéticos codifican dos alotipos proteicos. Son posibles otros alotipos que existan de forma natural. La figura está extraída de Solin y col. (1993) Immunogenetics 37:401-407.

La Figura 4 representa dos alotipos de la cadena pesada de inmunoglobulina de ratón. Se muestra la secuencia de ADN de la línea germinal de ratones recién nacidos (SEC ID Nº:9) junto con la proteína codificada (SEC ID Nº:10). En la línea superior se muestra otra secuencia proteica obtenida del mieloma de ratón MOPC 21 (SEC ID Nº:11). Son posibles otros alotipos que existan de forma natural. La figura está extraída de Honjo y col. (1979) Cell 18:559-568.

La Figura 5 es una gráfica de barras que compara la reactividad de 3H1 con varios anticuerpos. Se ensayó ^{125}I-3H1 frente a un panel de mAb de varias especificidades pertenecientes a las subclases principales de Ig mediante un RIA de unión directa.

La Figura 6 es una gráfica que representa la inhibición de la unión de 8019 (Ab1) radiomarcado a CEA semipurificado por 3H1. Los círculos representan 3H1; los cuadrados representan 4EA2, un anticuerpo no relacionado. El 3H1 inhibía la unión un 100% comenzando a una concentración de 25 ng.

La Figura 7 es una gráfica que representa la inhibición de la unión de 8019 (Ab1) a 3H1 por CEA. Los círculos rellenos representan CEA semipurificado; los círculos en blanco representan una glicoproteína control que no se une a 8019. CEA semipurificado a 2,5 \mug inhibía la unión del anti-Id 3H1 a 8019 yodado un 50%, mientras que la glicoproteína no relacionada no inhibía la unión incluso a una concentración superior.

La Figura 8 es una gráfica de barras que representa la unión de sueros procedentes de ratones inmunizados con 3H1 a CEA. Primera barra, PBS-BSA; segunda barra, anti-4EA2; tercera barra, sueros preinmunes; cuarta barra, sueros procedentes de ratones inmunizados con 3H1. Muestra que la inmunización con 3H1 indujo anticuerpos que se unían a CEA insolubilizado.

Las Figuras 9-1 a 9-4 representan el análisis mediante FACS de células LS174-T reaccionadas con 8019 (Ab1) (Fig. 9-1); sueros procedentes de ratones inmunizados con 3H1 (Fig. 9-2); sueros preinmunes (Fig. 9-3). Los sueros procedentes de ratones inmunizados con 3H1 mostraron una unión distinta (Fig. 9-2) que era similar al patrón de unión obtenido con 8019 (Ab1) (Fig. 9-1). No se obtuvo unión significativa con células humanas de linfoma de células B que no expresan CEA (Fig. 9-4).

La Figura 10 es una gráfica que representa la inhibición de la unión de 8019 a células LS174-T por sueros procedentes de conejos inmunizados con 3H1. Los círculos sin rellenar representan 8019 (Ab1); los círculos rellenos representan suero procedente del conejo #730; los cuadrados sin rellenar representan suero procedente del conejo #729; los triángulos sin rellenar representan sueros preinmunes.

La Figura 11 es una reproducción a media tinta de una inmunotransferencia que muestra la unión de Ab3 en suero de conejo a CEA. Todas las reacciones fueron con extracto semipurificado de CEA separado por SDS-PAGE. Calle 1, marcadores de peso molecular; calle 2, extracto de CEA teñido con Negro Búfalo; calle 3, 8019; calle 4, sueros de conejo (después de inmunización con 3H1); calle 5, sueros de conejo preinmune; calle 6, sueros control procedentes de conejos inmunizados con el anti-Id 4EA2 no relacionado.

La Figura 12 es una reproducción a media tinta de una inmunotransferencia que muestra la unión de Ab3 en suero de ratón a CEA. Calle 1, 8019 (Ab1); calle 2, Ab3 monoclonal de ratón; calle 3, control.

La Figura 13 es una reproducción a media tinta que representa secciones de tejido normal y canceroso inmunoteñidas (inmunoperoxidasa) con Ab3. El patrón de reactividad de Ab3 en tejidos de colon normales y malignos fue casi idéntico al obtenido con Ab1.

La Figura 14 es una reproducción a media tinta que representa secciones de tejido normal y canceroso inmunoteñidas (inmunoperoxidasa) con Ab3. La reacción con 8019 (Ab1) tuvo como resultado la tinción de células tumorales así como de materiales mucinosos secretados, mientras que la reacción con el mAb Ab3 tuvo como resultado la tinción de células tumorales sin tinción de la mucina secretada.

La Figura 15 muestra un esquema de la red idiotípica para el carcinoma gastrointestinal humano.

La Figura 16 es una gráfica que representa la inhibición de la unión de 3H1 a Ab1 (8019) por sueros Ab3 de mono (PRO 667) mediante radioinmunoensayo (RIA). Los cuadrados sin rellenar representan suero preinmunización; los cuadrados rellenos representan suero después de la segunda inyección; los círculos sin rellenar representan sueros después de la tercera inyección; los triángulos sin rellenar representan suero después de la cuarta inyección.

La Figura 17 es una gráfica de barras que representa la unión de sueros Ab3 de mono a CEA purificado mediante ELISA. Las barras sin rellenar representan sueros preinmunes; las barras con líneas cruzadas diagonalmente representan sueros inmunes; las barras con líneas cruzadas horizontalmente representan sueros control. Los círculos rellenos conectados por una línea continua representan antígeno CEA no relacionado.

La Figura 18 es una gráfica que representa la cinética de la unión de sueros Ab3 de mono (PRO 667) a CEA purificado mediante ELISA. Los cuadrados sin rellenar con un punto central representan suero preinmune; los círculos sin rellenar representan suero después de la primera inyección; las cruces representan suero después de la segunda inyección; los cuadrados sin rellenar representan suero después de la cuarta inyección.

Las Figuras 19-1 y 19-2 son gráficas que representan un análisis de citometría de flujo inmune de células LS174-T con sueros Ab3 de mono. En la Figura 19-1, las células tumorales se hicieron reaccionar con sueros preinmunes y con sueros Ab3 (dilución 1:100) procedentes de monos inmunizados con 3H1. En la Figura 19-2, se hicieron reaccionar células MOLT-4 que no expresan CEA con sueros preinmunes y con sueros Ab3 de monos inmunes producidos contra 3H1.

Las Figuras 20-1 a 20-4 son reproducciones a media tinta que representan la tinción con inmunoperoxidasa de adenocarcinoma de colon y de colon normal por Ab3 de mono. Secciones seriadas de células tumorales fueron teñidas con: 20-1, Ab3 de mono (50 \mug/ml); 20-2, IgG_{1} 8019 (50 \mug/ml); 20-3, Ab3 de mono no relacionado (50 \mug/ml). La Figura 20-4 muestra la tinción de células de colon normales con Ab3 de mono (50 \mug/ml).

La Figura 21 es una reproducción a media tinta de un autorradiograma de un gel de SDS-PAGE con CEA marcado con ^{125}I después de inmunoprecipitación con el Ab3 de mono PRO 667 (calle 1), con 8019 (calle 2) y con Ab3 de mono tratado con un Ab2 no relacionado (calle 3).

La Figura 22 es una gráfica que representa la inhibición de la unión de Ab1 a células LS174-T por Ab3 de mono purificado. Los cuadrados con un punto en el centro representan Ab3 purificado de un mono inmunizado con 3H1. Los círculos sin rellenar representan Ab3 purificado de un mono inmunizado con el control 11D10.

La Figura 23 es una gráfica que representa la inhibición de la unión de Ab1 (8019) a 3H1 por sueros Ab3 humanos mediante RIA. Los cuadrados rellenos representan el paciente #1; los triángulos rellenos representan el paciente #2; los cuadrados sin rellenar representan el paciente #3; los triángulos sin rellenar representan el paciente #4; los círculos rellenos representan el paciente #5. La línea de puntos representa suero preinmune.

La Figura 24 es una gráfica de barras que representa la reactividad de Ab3 humano con CEA purificado radiomarcado. Cada barra representa una muestra, siendo las muestras 1-12 de los pacientes 1-12, la muestra 13 un control PBS-BSA y la muestra 14 era el Ab1 8019 (10 \mug).

La Figuras 25-1 a 25-3 son reproducciones de las señales que muestra el análisis de microfluorimetría de flujo de la reacción de la línea celular LS174-T de cáncer de colon positiva para CEA con sueros Ab3 de los pacientes. Las células tumorales se hicieron reaccionar con sueros Ab3 procedentes de pacientes inmunizados con 3H1 (Fig. 25-1) y con Ab1 murino (Fig. 25-2). En la Figura 25-3, células de linfoma B humano que no expresan CEA (Raji) se hicieron reaccionar con Ab3. La línea continua representa sueros Ab3; la línea discontinua representa sueros preinmunes.

La Figura 26 es una gráfica de barras que representa la inhibición de la unión de Ab1 a células LS174-T por Ab3 de pacientes. La barra rellena representa Ab3; la barra con líneas cruzadas representa Ab1.

La Figura 27 es una reproducción a media tinta de un autorradiograma de un gel de SDS-PAGE que separa CEA marcado con ^{125}I después de la inmunoprecipitación con 8019 (calle 1), Ab3 del paciente número 1 (calle 2), Ab3 del paciente número 2 (calle 3) y Ab3 de un paciente tratado con un Ab2 no relacionado (calle 4).

Las Figuras 28-1 a 28-6 son reproducciones a media tinta que representan la tinción con inmunoperoxidasa de adenocarcinomas colónicos autólogos y alogénicos y de colon normal por Ab1 y Ab3 de pacientes. Secciones seriadas fueron teñidas con: Ab3 de pacientes sobre un tumor autólogo (Fig. 28-1); Ab3 de pacientes sobre un tumor alogénico (Fig. 28-2); IgG_{1} 8019 (Fig. 28-3); Ab3 de pacientes no relacionado sobre secciones del tumor igual que en la Fig. 1 (Fig. 28-4); IgG_{1} 8019 sobre colon normal (Fig. 28-5) y Ab3 de pacientes sobre colon normal (Fig. 28-6).

Las Figuras 29-1 y 29-2 son gráficas de barras que representan ensayos de proliferación de células T de dos pacientes (29-1, número 1; 29-2, número 12). Para cada figura, cada par de barras indica el grado de proliferación de células T en presencia de: 3H1-Alugel (primer par); 4DC6 control de igual isoalotipo-Alugel (segundo par); CEA purificado (tercer par); seroalbúmina bovina (BSA) purificada (cuarto par) y fitohemaglutinina (quinto par). Para cada par, la barra oscura (primera) representa sueros preinmunes; la barra con líneas cruzadas (segunda) representa sueros post-inmunes.

Modos para llevar a cabo la invención

Hemos descubierto un anticuerpo monoclonal anti-idiotipo, 3H1, que induce una respuesta inmune específica contra un epítopo característico y específico del antígeno carcinoembrionario (CEA), un antígeno asociado a tumores. Este epítopo es exclusivo de CEA y no está presente en otros miembros de esta familia de peso molecular más bajo relacionados con CEA que se encuentran también en tejidos normales. El determinante antigénico según está definido por el anticuerpo monoclonal 8019 (Ab1) contra el que se produjo 3H1, está ausente en tejidos adultos normales según fue puesto en evidencia mediante tinción con inmunoperoxidasa y análisis hematopoyético. Un hibridoma que produce 3H1 ha sido depositado en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, EE.UU. 20852 el 15 de Diciembre de 1995 bajo las disposiciones del Tratado de Budapest para el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Fines de Procedimientos de Patentes. Se le otorgó el Número de Acceso HB12003.

Hemos encontrado también que 3H1 es eficaz para producir una respuesta inmune (humoral y/o celular) en individuos con tumores asociados a CEA avanzados. Aunque no se desea estar ligado a una teoría particular, una manera en la que esto puede ocurrir es que el sitio de combinación de 3H1 puede presentar una región que se asemeja en parte a un epítopo de CEA, en el contexto de otros epítopos que lo hacen más inmunogénico. Por tanto, el anticuerpo de esta invención es útil para el tratamiento de tumores asociados al CEA en estos individuos. Es también útil para la detección de Ab1 o Ab3.

Según se utilizan en la presente, los términos ``3H1'', ``anticuerpo 3H1'' y ``anticuerpo monoclonal anti-idiotipo 3H1'' son utilizados indistintamente para referirse a la inmunoglobulina producida por la línea celular de hibridomas 3H1 depositada en la ATCC. Están también incluidos en la definición de 3H1 fragmentos producidos por corte enzimático y/o tratamiento químico del anticuerpo intacto que comprenden las regiones variables completas de la cadena pesada y de la cadena ligera de 3H1 y que son capaces de unirse a 8019 (Ab1) en un inmunoensayo estándar, tales como Fab, F(ab')_{2} y F(ab').

En una realización, la invención incluye un anticuerpo monoclonal anti-idiotipo (referido en la presente como un ``anti-Id'') producido por la línea celular de hibridomas ATCC HB12003 o por la progenie de la misma. Está también incluida en esta invención una línea celular de hibridomas denominada ATCC Nº HB12003 y la progenie de la misma. Según se utiliza en la presente, la ``progenie'' de un hibridoma son los descendientes de un hibridoma que pueden ser o no completamente idénticos a la célula original (parental) debido a una mutación o a otra adaptación, pero que producen un anticuerpo monoclonal que mantiene la capacidad para escapar a la tolerancia inmune, esto es, la capacidad de producir una reacción inmune contra CEA.

Producción de hibridomas monoclonales anti-idiotipo y selección de 3H1

El 3H1 se obtuvo utilizando el anticuerpo 8019 como inmunógeno para obtener una respuesta anti-idiotípica. El 8019 se une a un epítopo exclusivo de CEA que no está presente en otros miembros de la familia de CEA, virtualmente sin reactividad cruzada con tejidos adultos normales o con células hematopoyéticas, incluyendo granulocitos. Koprowski y col. (1979) Somatic Cell Genet. 5:957; Mitchell (1980) Cancer Immunol. Immunother. 10:1.

Se inmunizaron ratones singénicos BALB/c cuatro veces con 8019 (Ab1) y sus células esplénicas fueron fusionadas con las células de mieloma de ratón no secretoras P3-653. El procedimiento de selección incluía cuatro etapas: (1) Selección positiva por la unión del anticuerpo a 8019; (2) Selección negativa frente a anticuerpos que reconocían determinantes isotípicos o alotípicos; (3) Selección positiva por la capacidad para inhibir la unión de 8019 a CEA; (4) Selección positiva por la capacidad para inducir una respuesta inmune humoral contra el antígeno asociado al tumor original (CEA) en ratones y conejos.

Se obtuvieron varios hibridomas Ab2 que eran específicos para el Id inmunizante de 8019 y que no reaccionaban con ningún determinante isotípico o alotípico. Para determinar si los anti-8019 estaban dirigidos contra el paratopo del 8019, se estudió la unión de 8019 radiomarcado a CEA unido a una placa o a la línea celular LS174-T positiva para CEA en presencia de cantidades variables de sobrenadantes del cultivo de los hibridomas Ab2. Con tan sólo 5 \mul de sobrenadante del cultivo, varios de los anti-Ids analizados inhibían la unión más de un 90%. Las líneas productoras de Ab2 capaces de inhibir la unión de 8019 a CEA fueron cultivadas y purificadas a partir de fluido ascítico para estudios posteriores.

Se prepararon diferentes Ab2 purificados como vacunas y se inyectaron a ratones y conejos no tratados. Después de 3 o más inyecciones, se valoraron muestras de suero para determinar la presencia de Ab3 que se uniera no sólo al Ab2 inmunizante sino también al CEA. El Ab2 que inducía de manera reproducible el título más elevado de Ab3 con la especificidad deseada fue denominado 3H1. En el Ejemplo 1 se proporcionan detalles adicionales del método utilizado para obtener 3H1.

El Ab3 producido en animales inmunizados con 3H1 ha sido caracterizado posteriormente.

Los sueros inmunes procedentes de ratones y conejos competían con Ab1 para unirse a la línea celular LS174-T asociada al CEA e inhibían la unión de Ab1 radioyodado a Ab2. Esto indica que el anti-anti-Id (Ab3) en ratones y conejos puede compartir idiotopos con Ab1 (8019) y que probablemente se unen al mismo epítopo que Ab1.

Se ha obtenido también Ab3 monoclonal que se une al antígeno positivo CEA de ratones inmunizados con 3H1. El Ab3 (policlonal y monoclonal) reaccionaba con el Ag CEA semipurificado mediante análisis de transferencia de manchas y teñía las células LS174-T por el método de la inmunoperoxidasa. La administración de 3H1 a primates no humanos (monos cinomolgus) generaba también una respuesta inmune (Ejemplo 3). El Ab3 producido en respuesta a 3H1 era específico para CEA.

Y lo que es significativo, aunque los humanos con tumores asociados al CEA son tolerantes al antígeno CEA, nosotros hemos descubierto que el 3H1 induce una respuesta inmune en pacientes con una enfermedad asociada al CEA avanzada. Se administró 3H1 a doce pacientes con carcinoma colorrectal avanzado positivo para CEA y en los que habían fracasado las terapias estándar. Nueve de los doce pacientes desarrollaron anticuerpos que eran anti-CEA (Figs. 23-27). Además, siete de los doce pacientes mostraban una respuesta inmune celular según fue puesto en evidencia por un ensayo de proliferación de células T (Fig. 29). Estos siete pacientes habían desarrollado todos también una respuesta de Ab3. Ésta es la primera demostración de la ruptura de la tolerancia inmune a CEA en pacientes con enfermedad avanzada. Una descripción más detallada de este estudio se encuentra en el Ejemplo 3.

Hemos encontrado también la secuencia de ácido nucleico que codifica las regiones variables de la cadena ligera y de la cadena pesada de 3H1 y las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena ligera y de la cadena pesada de 3H1. Por tanto, la presente invención incluye un anticuerpo anti-idiotipo que tiene una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera idéntica a la representada en la Figura 1 (SEC ID Nº:2) y una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada idéntica a la representada en la Figura 2 (SEC ID Nº:4). La invención incluye también un anticuerpo que tiene una región variable de la cadena ligera codificada por una secuencia polinucleotídica idéntica a la representada en la Figura 1 (SEC ID Nº:1) y una región variable de la cadena pesada codificada por una secuencia polinucleotídica idéntica a la representada en la Figura 2 (SEC ID Nº:3).

Una secuencia de polinucleótidos o de aminoácidos ``idéntica'' significa que, cuando las secuencias son alineadas, existe una coincidencia exacta entre las bases (polinucleótido) o entre los aminoácidos.

El Ejemplo 2 describe el clonaje de ADNc de 3H1, a partir del cual se dedujo la secuencia de aminoácidos. Con el fin de confirmar nuestra secuencia de aminoácidos, secuenciamos las cadenas ligera y pesada de 3H1 durante 10-15 ciclos de degradación. Las secuencias de aminoácidos obtenidas fueron idénticas a las deducidas a partir de la secuencia del ADNc.

La invención incluye también un anticuerpo anti-idiotipo que tiene una región variable de la cadena ligera codificada por un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos idéntica a la representada en la Figura 1 (SEC ID Nº:2) y una región variable de la cadena pesada codificada por un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos idéntica a la representada en la Figura 2 (SEC ID Nº:4). Está dentro de la experiencia en la técnica, dada una secuencia de aminoácidos, el deducir un polinucleótido que codifique la secuencia de aminoácidos.

Está también incluida en esta invención una línea celular de hibridomas, muestras de la cual están depositadas en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, EE.UU. 20852, y a la que se ha dado el número de depósito HB12003, y la progenie de la misma. La invención incluye también una línea celular de hibridomas que produce un anticuerpo monoclonal anti-idiotipo que tiene una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera idéntica a la representada en la Figura 1 (SEC ID Nº:2) y una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada idéntica a la representada en la Figura 2 (SEC ID Nº:4). Plásmidos que codifican las secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera y de la cadena pesada (junto con una porción de la región constante) han sido depositados en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, EE.UU. 20852 bajo las disposiciones del Tratado de Budapest para el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Fines de Procedimientos de Patente.

La invención incluye también 3H1 conjugado a una marca capaz de producir una señal detectable. Estos anticuerpos conjugados son útiles, por ejemplo, en sistemas de detección tales como la cuantificación de Ab1 (y/o Ab3) o para la obtención de imágenes. Tales marcas son conocidas en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, radioisótopos, enzimas, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes y compuestos bioluminiscentes. Las marcas pueden estar unidas covalentemente a 3H1 o bien conjugadas a 3H1 mediante un reactivo secundario, tal como un segundo anticuerpo, proteína A, o un complejo biotina-avidina. Los métodos de marcaje de anticuerpos son conocidos en la técnica y no necesitan ser descritos con detalle en la presente.

Preparación de 3H1

El anticuerpo de esta invención puede ser obtenido de varias formas. El 3H1 puede ser producido a partir del hibridoma ATCC Nº HB12003 descrito en la presente. Los métodos de aislamiento de anticuerpos son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York y Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory. El anticuerpo puede ser obtenido a partir del hibridoma mediante cultivo de tejidos o de líquido ascítico de ratón. Estas técnicas son conocidas en el oficio. Por ejemplo, las células pueden ser cultivadas en un medio adecuado y el medio consumido puede ser utilizado como fuente de anticuerpos. Opcionalmente, pueden incluirse canales o esferas revestidos con una matriz y cocultivos celulares para intensificar el crecimiento de las células productoras de anticuerpos. Para la producción de grandes cantidades de anticuerpo, es generalmente más conveniente obtener un fluido ascítico. Tales métodos son conocidos en la técnica y comprenden generalmente la inyección de las células de hibridoma en un mamífero sin tratar inmunológicamente histocompatible o inmunotolerante, especialmente un ratón. El mamífero es opcionalmente estimulado para que produzca líquido ascítico mediante la administración previa de una composición adecuada, por ejemplo, Pristano. Preferiblemente, el 3H1 es purificado a partir del líquido ascítico de BALB/c utilizando cromatografía en proteína G recombinante-agarosa seguido por cromatografía en Proteína A-CL-sefarosa 4B.

Alternativamente, el 3H1 puede ser sintetizado químicamente utilizando técnicas conocidas en el oficio, por ejemplo, utilizando un sintetizador de péptidos automatizado disponible comercialmente tal como los fabricados por Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA).

El 3H1 puede ser obtenido también empleando métodos recombinantes rutinarios tales como los descritos en Sambrook y col. (1989). Por ejemplo, un polinucleótido que codifique la cadena pesada o la cadena ligera de 3H1 puede ser clonado en un vector de expresión adecuado (que contenga secuencias para el control de la transcripción, tal como un promotor). El vector de expresión es a su vez introducido en una célula huésped. La célula huésped es cultivada bajo condiciones adecuadas de tal manera que el polinucleótido se transcriba y se traduzca en una proteína. Las cadenas pesada y ligera de 3H1 pueden ser producidas separadamente y combinadas posteriormente mediante reordenación de los enlaces disulfuro. Alternativamente, vectores con polinucleótidos separados que codifiquen cada cadena de 3H1, o un vector con un único polinucleótido que codifique ambas cadenas como transcritos separados, pueden ser transfectados a una única célula huésped que puede posteriormente producir y ensamblar la molécula completa. Preferiblemente, la célula huésped es una célula eucariótica superior que puede proporcionar el complemento carbohidratado normal de la molécula. El 3H1 así producido en la célula huésped puede ser purificado utilizando técnicas estándar en el oficio. Un polinucleótido que codifique 3H1 para ser utilizado en la producción de 3H1 mediante cualquiera de estos métodos, puede ser obtenido a su vez del hibridoma que produce 3H1, o puede ser producido sintéticamente o recombinantemente a partir de la secuencia de ADN proporcionada en la presente.

El anticuerpo 3H1 es de la subclase IgG1 de ratón y puede ser aislado mediante cualquier técnica adecuada para las inmunoglobulinas de este isotipo. Los métodos de purificación pueden incluir precipitación con una sal (por ejemplo, con sulfato de amonio), cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo, en una columna de intercambio catiónico o aniónico procesada a pH neutro y eluida con gradientes graduales de fuerza iónica creciente), cromatografía de filtración en gel (incluyendo HPLC de filtración en gel) y cromatografía en resinas de afinidad tales como proteína A, proteína G, hidroxiapatita y anti-inmunoglobulina. El 3H1 puede ser también purificado en columnas de afinidad que contengan el paratopo de 8019; por ejemplo, en forma de Ab1 o Ab3 purificado.

Si ha de administrarse 3H1 a un individuo, el 3H1 es preferiblemente al menos un 80% puro, más preferiblemente al menos un 90% puro, incluso más preferiblemente al menos un 95% puro además de estar libre de pirógenos y otros contaminantes. En este contexto, el porcentaje de pureza se calcula como porcentaje en peso del contenido total de proteína de la preparación.

Usos y métodos de utilización de 3H1

El 3H1 tiene varios usos. Puede ser utilizado para inducir una respuesta inmune en un individuo que tenga una enfermedad asociada al CEA avanzada y tratar de este modo a esos individuos de la enfermedad asociada al CEA. Preferiblemente, la respuesta inmune es anti-CEA. Además, el 3H1 puede ser utilizado para detectar anticuerpos que se unan a CEA o a 3H1. El 3H1 puede ser utilizado también para eliminar el exceso no deseado de Ab1 marcado de la circulación de pacientes previamente tratados con anticuerpos monoclonales anti-CEA marcados. La marca puede ser cualquier marca unida al anticuerpo adecuada para su uso deseado, incluyendo, por ejemplo, radioisótopos, restos tóxicos tales como toxinas y fármacos. El 3H1 es también útil para intensificar la detección de tumores en estudios de producción de imágenes.

Por tanto, la presente invención incluye métodos para producir una respuesta inmune en un individuo con una enfermedad asociada al CEA avanzada, tal como tumores asociados al CEA, que incluyen la administración al individuo de una cantidad eficaz de 3H1. Preferiblemente, la respuesta es la producción de anticuerpos anti-CEA. Según se utiliza en la presente, un ``individuo'' es un vertebrado, preferiblemente un mamífero y más preferiblemente un humano. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales de granja, animales para deporte y animales domésticos. Un ``tumor asociado al CEA'' es uno que contiene un antígeno CEA, especialmente expresado en la superficie de las células tumorales. Según se utiliza en la presente, tumores asociados al CEA ``avanzados'' indica que existe metástasis detectable, esto es, masas tumorales detectables en lugares distintos del sitio primario del tumor. Las masas son detectadas preferiblemente por técnicas de imagen conocidas en el oficio tales como rayos-X o explotación por CT. Una ``cantidad eficaz'' es una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmune, ya sea humoral y/o celular. Una cantidad eficaz puede ser administrada en una o más administraciones. Preferiblemente, la respuesta inmune es la producción de anti-CEA.

Los sujetos adecuados para la administración del anticuerpo 3H1 pueden ser identificados mediante varios criterios diferentes. Puede administrarse 3H1 a animales experimentales, por ejemplo, para estudiar el efecto de 3H1 sobre la respuesta inmune, o bien para obtener reactivos útiles tales como anticuerpos específicos anti-CEA y líneas celulares.

En una realización preferida, el 3H1 puede ser utilizado para el tratamiento de una enfermedad asociada al CEA avanzada, tal como tumores asociados al CEA. Para el tratamiento, se administra a un individuo con tumor(es) asociado(s) al CEA avanzado(s) una cantidad eficaz de 3H1. Según se utiliza en la presente, una ``cantidad eficaz'' para tratamiento es una cantidad suficiente para paliar el estado de enfermedad. Una cantidad eficaz puede ser administrada en una o en más de una administración. El tratamiento de individuos con una enfermedad asociada al CEA avanzada con una cantidad eficaz de 3H1 puede tener cualquiera de los efectos siguientes, en comparación con otros individuos que no son tratados de este modo: disminución de la velocidad de desarrollo de la enfermedad, estabilización del estado de enfermedad, prevención de la propagación y/o producción de remisión. Según se utiliza en la presente, tumores asociados al CEA ``avanzados'' indica que existe metástasis detectable, esto es, masas tumorales detectables en lugares distintos del sitio primario del tumor. Las masas son detectadas preferiblemente mediante técnicas de imagen conocidas en el oficio tales como rayos-X o exploración por CT.

Para producir una respuesta inmune o para tratar a un individuo de un tumor asociado al CEA avanzado, se administra parenteralmente al individuo 3H1, preferiblemente intracutáneamente. Otras vías de administración incluyen, pero no se limitan a, intramuscular e intradérmica. El 3H1 puede ser administrado también indirectamente, mediante tratamiento de células cultivadas seguido por la introducción de estas células cultivadas en un individuo.

La cantidad de 3H1 administrada depende de varios factores, tales como la condición del individuo y la vía de administración. Típicamente, la dosis por administración variará desde 0,1 mg aproximadamente hasta 20 mg aproximadamente. Más preferiblemente, la dosis variará desde 0,5 mg aproximadamente hasta 10 mg aproximadamente; más preferiblemente, desde 1 mg aproximadamente hasta 8 mg aproximadamente. Preferiblemente, la dosis es de 1 mg aproximadamente a 4 mg aproximadamente. El 3H1 es administrado típicamente bisemanalmente en un total de cuatro inyecciones, seguido por inyecciones mensuales según se requiera. La cadencia de las inyecciones posteriores (esto es, una dosis de mantenimiento) dependerá, inter alia, de la condición y de la respuesta del individuo que esté siendo tratado. Los niveles de Ab3 pueden ser monitorizados, preferiblemente mediante los métodos de diagnóstico descritos en la presente, para determinar cuándo deben aplicarse las administraciones de mantenimiento (de refuerzo), las cuales podrían ser típicamente cada tres meses aproximadamente.

Preferiblemente, el 3H1 es administrado con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Un excipiente farmacéuticamente aceptable es una sustancia relativamente inerte que facilita la administración de una sustancia farmacológicamente eficaz. Por ejemplo, un excipiente puede dar forma o consistencia a la composición para vacuna, o actuar como un diluyente. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, agentes estabilizantes, agentes humectantes y emulsionantes, sales para variar la osmolaridad, agentes encapsulantes, tampones e intensificadores de la penetración cutánea. Ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables están descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences (Alfonso R. Gennaro, ed., 18ª edición, 1990).

Preferiblemente, el 3H1 se utiliza con un adyuvante que incrementa la presentación de 3H1 o intensifica de otro modo la respuesta inmune contra 3H1. Adyuvantes adecuados incluyen hidróxido de aluminio (alumbre), QS-21 (Patente de EE.UU. Nº 5.057.540), DHEA (Patentes de EE.UU. N^{os} 5.407.684 y 5.077.284) y sus derivados (incluyendo sales) y precursores (por ejemplo, DHEA-S), beta-2-microglobulina (WO 91-16924), muramil dipéptidos, muramil tripéptidos (Patente de EE.UU. Nº 5.171.568) y monofosforil lípido A (Patente de EE.UU. Nº 4.436.728; WO 92/16231) y sus derivados (por ejemplo, Detox™ y BCG (Patente de EE.UU. Nº 4.726.947). Otros adyuvantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, sales de aluminio, mezclas de escualeno (SAF-1), muramil péptido, derivados de saponina, preparaciones de la pared de micobacterias, derivados del ácido micólico, surfactantes copoliméricos de bloque no iónicos, Quil A, subunidad B de la toxina colérica, polifosfaceno y derivados y complejos inmunoestimulantes (ISCOMs) tales como los descritos por Takahashi y col. (1990) Nature 344:873-875. Para uso veterinario y para la producción de anticuerpos en animales, pueden utilizarse los componentes mitogénicos del adyuvante de Freund. La elección de un adyuvante dependerá en parte de la estabilidad de la vacuna en presencia del adyuvante, de la vía de administración y de la aceptabilidad regulatoria del adyuvante, particularmente cuando esté destinado a uso humano. Por ejemplo, el alumbre está aprobado por la Food and Drug Administration (FDA) de los Estados Unidos para uso como adyuvante en humanos. Preferiblemente, se utiliza 3H1 precipitado con alumbre. La preparación de 3H1 precipitado con hidróxido de aluminio se describe en el Ejemplo 3.

Alternativamente, el 3H1 puede ser encapsulado en liposomas. Los liposomas adecuados para empaquetar polipéptidos para su administración a células son conocidos en la técnica.

El 3H1 puede ser tratado con calor antes de la administración y el tratamiento con calor puede ser en presencia de un adyuvante, por ejemplo alumbre. El tratamiento con calor se realiza preferiblemente a 45ºC durante 30 minutos en un vial estéril en un baño de agua. Por ejemplo, el 3H1 puede ser calentado a 40-80ºC aproximadamente, preferiblemente de 45ºC a 60ºC, durante un periodo de 5 minutos a 2 horas aproximadamente, preferiblemente de 15 minutos a 1 hora. El tratamiento con calor puede tener lugar en cualquier momento antes de la administración. Preferiblemente, el tratamiento con calor se realiza dentro de los 7 días anteriores a la administración. Pueden utilizarse otros procedimientos de tratamiento con calor, siempre que no se comprometa significativamente la actividad deseada de 3H1.

Para la finalidad de producir una respuesta inmune, el 3H1 puede ser administrado en una forma no modificada. A veces puede ser preferible modificar el 3H1 para mejorar su inmunogenicidad. Según se utiliza en la presente, ``inmunogenicidad'' se refiere a la capacidad para inducir una respuesta inmune de anticuerpos específicos o una respuesta inmune celular, o ambas. Los métodos para mejorar la inmunogenicidad incluyen, inter alia, el entrecruzamiento con agentes tales como glutaraldehído o acopladores bifuncionales, o la unión a una molécula marco polivalente. La inmunogenicidad puede ser también mejorada mediante acoplamiento a una proteína transportadora, particularmente a una que contenga epítopos de células T.

Con el fin de determinar el efecto de la administración de 3H1, el sujeto puede ser monitorizado para determinar una respuesta inmune de anticuerpos (humoral) o celular contra CEA, o una combinación de las mismas.

Para determinar el nivel de anticuerpos hacia CEA (Ab3) en una muestra biológica, se obtiene del sujeto, por ejemplo, suero o plasma. La muestra puede ser opcionalmente enriquecida en inmunoglobulina antes de la realización del ensayo, aunque esto no se requiere normalmente. Si va a utilizarse una inmunoglobulina de ratón (tal como 3H1) como un reactivo de ensayo, la muestra es pretratada preferiblemente para eliminar la actividad anti-inmunoglobulina de ratón. Esto puede realizarse, por ejemplo, mediante reducción en una columna de inmunoglobulina de ratón, o mezclando inmunoglobulina de ratón no específica en la muestra y extrayendo cualquier inmunoprecipitado que se forme.

Para llevar a cabo el ensayo, el anti-CEA que pueda estar en la muestra es puesto en contacto con una cantidad no limitante de un equivalente antigénico de CEA. Éste puede ser CEA aislado, nitrocelulosa con CEA fijado mediante transferencia directa o mediante transferencia desde un gel de poliacrilamida, células que expresen CEA (tal como las células LS174-T), preparaciones de membrana de tales células o secciones de tejido fijadas que contengan CEA. Alternativamente, puede utilizarse un anti-idiotipo, particularmente 3H1.

Una vez que se ha formado el complejo inmune, es separado generalmente del análogo de CEA no acomplejado, y se determina la cantidad de complejo presente. El complejo puede ser separado, por ejemplo, por centrifugación para recoger las células o un inmunoprecipitado, o bien mediante captura por una fase sólida. La cantidad de complejo presente puede ser medida proporcionando al análogo de CEA una marca, bien directamente o bien mediante incubación con un reactivo secundario. Alternativamente, puede realizarse un ensayo de competición en el que la muestra es incubada primeramente con el análogo de CEA, y posteriormente se añade una cantidad no limitante de un reactivo anti-CEA marcado que compite con el anti-CEA que pueda estar presente en la muestra. Marcas adecuadas incluyen radiomarcas, marcas enzimáticas, marcas fluorescentes y marcas quimioluminiscentes. Se construye una curva estándar utilizando soluciones que se sabe que no contienen anti-CEA, y soluciones con varias concentraciones relativas de anti-CEA, en lugar de la muestra. La muestra que contiene la cantidad desconocida de anti-CEA se ensaya generalmente en paralelo, y se determina la cantidad relativa de anti-CEA contenida en la misma mediante comparación con la curva estándar. Los ensayos preferidos para determinar los niveles de anti-CEA utilizando el anticuerpo 3H1, están descritos con más detalle en una sección posterior.

El isotipo del anticuerpo anti-CEA puede ser determinado mediante la inclusión en el inmunoensayo de reactivos específicos del isotipo, ya sea en la etapa de separación o en la etapa de marcaje. Por ejemplo, puede utilizarse anti-IgG humana para separar o detectar anticuerpos de la clase IgG presentes en una muestra clínica de origen humano. La presencia de anti-CEA específicos de la clase IgG indica generalmente una respuesta de memoria. La presencia de anti-CEA de la clase IgM indica generalmente una inmunoestimulación en curso, tal como la que puede ser debida a la presencia de un tumor que exprese CEA, o un tratamiento en curso con 3H1.

Si se desea, el anticuerpo anti-CEA detectado en una muestra biológica puede ser caracterizado posteriormente, por ejemplo, mediante competición con anti-8019 (Ab1) para determinar si es específico para epítopos relacionados en CEA. En la sección de Ejemplos se describen con detalle ensayos de competición entre Ab1 y Ab3.

El anticuerpo anti-CEA puede ser también analizado para determinar si es citotóxico. Se determina la citotoxicidad mediada por complemento (CMC), por ejemplo, utilizando células diana que expresen CEA (tales como LS174-T) marcadas con ^{51}Cr. El marcaje puede llevarse a cabo mediante incubación de 10^{6} células aproximadamente con \sim200 \muCi de Na_{2}^{51}CrO_{4} durante 60 minutos a 37ºC, seguido por lavado. El ensayo se realiza incubando el anticuerpo (o la muestra clínica que contenga el anticuerpo) con las células diana. Las células opsonizadas son luego lavadas e incubadas con una fuente de complemento, por ejemplo, suero de cobayo preadsorbido para eliminar la actividad de los anticuerpos intrínsecos. Después de un periodo de incubación adecuado a 37ºC, se determina la liberación al medio de ^{51}Cr y se compara con la de células control no opsonizadas. La liberación de ^{51}Cr se correlaciona con la actividad CMC.

Otra manera de caracterizar el anticuerpo anti-CEA es analizando su capacidad para participar en una respuesta ADCC (Cheresh y col. (1986), Cancer Res. 46:5112). Células diana que expresen CEA radiomarcadas son incubadas con el anti-CEA (en forma de suero inactivado por calor) y con células efectoras. Células mononucleares de sangre periférica humana normal (PBMC) son células efectoras adecuadas y se utilizan preferiblemente en una proporción de efectora:diana de 100 aproximadamente. Después de 4 horas aproximadamente a 37ºC, se determina la proporción de ^{51}Cr liberado como una medida de la actividad ADCC.

La respuesta inmune celular en un sujeto al que se está administrando 3H1 puede ser cuantificada llevando a cabo ensayos funcionales estándar para determinar la actividad de células T específicas.

Un tipo de ensayo mide la proliferación de células T. En este ensayo, se obtienen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de una muestra de sangre completa recogida del sujeto tratado. En animales experimentales pueden utilizarse también células esplénicas. Las células T pueden ser enriquecidas, por ejemplo, mediante centrifugación en un gradiente tal como Ficoll™. Las células son luego cultivadas en presencia de CEA o de (más habitualmente) células que expresen CEA irradiadas a varias concentraciones. Preferiblemente, las células estimuladoras son autólogas con respecto a las células respondedoras, particularmente en términos de antígenos de histocompatibilidad de Clase II.

Otro tipo de ensayo mide la citotoxicidad de células T. En este ensayo, una población de células T enriquecida es utilizada para efectuar la lisis de células diana que expresan CEA marcadas con ^{51}Cr, preparadas según se describió anteriormente. Preferiblemente, las células efectoras son autólogas con respecto a las células diana, particularmente en términos de los antígenos de histocompatibilidad de Clase I. La población de células T puede ser opcionalmente pre-estimulada con CEA o con una línea celular relevante. Las células T son posteriormente combinadas en varias proporciones con 10^{4} células diana marcadas aproximadamente, por ejemplo, en los pocillos de una placa de microvaloración. La placa es centrifugada opcionalmente para iniciar el contacto celular y las células son cultivadas juntas durante 4-16 horas a 37ºC. Se mide el porcentaje de liberación específica de ^{51}Cr al medio en comparación con dianas marcadas cultivadas solas (control negativo) y con dianas lisadas por un detergente tal como Triton™ X-100 al 0,1% (control positivo).

Otras medidas relevantes para determinar el efecto de la administración de 3H1 incluyen ensayos clínicos que puedan ser apropiados para determinar el desarrollo del cáncer del tipo sospechado. Tales ensayos pueden incluir indicadores inflamatorios, mamografía y radioescintigrafía, tal como se describe en otro lugar de esta exposición.

Utilización de 3H1 para realizar inmunoensayos

Otra manera en la que puede utilizarse 3H1 es en ensayos para detectar la presencia de un anticuerpo o de otro componente inmune que se una a 3H1 o a CEA. Tales componentes pueden estar presentes después de una administración terapéutica de 3H1, o pueden producirse espontáneamente debido a la presencia de un tumor que exprese CEA en un huésped inmunocompetente. Los ensayos pueden ser realizados en muestras biológicas, normalmente muestras clínicas. Según se utiliza en la presente, el término ``muestra biológica'' incluye células en cultivo, lisados celulares, sobrenadantes de células, suero, plasma, fluidos biológicos y muestras de tejidos.

En una realización de esta invención, se utiliza 3H1 para detectar la presencia de un anti-CEA, particularmente un anti-idiotipo de 3H1, que pueda estar presente en una muestra biológica. La muestra es preparada adecuadamente antes de realizar el ensayo, enriqueciendo opcionalmente la actividad del anticuerpo. Si la muestra biológica es sospechosa de contener actividad de anticuerpos contra regiones no idiotípicas de 3H1 (particularmente anti-inmunoglobulina de ratón), es preferible eliminar los mismos o realizar el ensayo de tal manera que se evite su detección. El anticuerpo anti-inmunoglobulina de ratón puede ser eliminado de una muestra mediante, por ejemplo, precipitación con IgG de ratón normal o adsorción con un adsorbente de Ig de ratón. La unión del anticuerpo anti-inmunoglobulina de ratón, particularmente el específico para la región Fc, puede ser minimizada por la elección juiciosa de los reactivos del ensayo. Son especialmente apropiados los fragmentos F(ab')_{2} o Fab de 3H1 y otros reactivos de inmunoglobulina de ratón.

Una vez que la muestra ha sido preparada adecuadamente, es mezclada con un equivalente funcional de 3H1 en exceso bajo condiciones que permitan la formación de un complejo entre 3H1 y cualquier anti-CEA que pueda estar presente. Se determina entonces la cantidad de complejo y se compara con los complejos formados con muestras estándar que contienen cantidades conocidas de anti-CEA en el rango esperado. La formación de complejos puede ser observada mediante inmunoprecipitación o nefelometría, pero es generalmente más sensible el empleo de un reactivo marcado con marcas tales como radioisótopos como ^{125}I, enzimas como peroxidasa y \beta-galactosidasa o fluorocromos como fluoresceína.

Los ensayos de anticuerpos pueden ser realizados en fase fluida. Por ejemplo, puede mezclarse anti-CEA con 3H1 marcado. Alternativamente, el anti-CEA de la muestra puede ser utilizado para competir con un anti-CEA marcado por los sitios de unión en 3H1. Generalmente, la marca unida y no unida es separada para cuantificar el porcentaje unido. Los métodos de separación adecuados incluyen cromatografía de filtración en gel y precipitación con un anticuerpo contra la inmunoglobulina de la especie de la que se obtiene la muestra, opcionalmente en presencia de polietilén glicol. Alternativamente, la proporción de marca unida y no unida puede ser determinada in situ utilizando, por ejemplo, pares de marcaje fluorescencia/amortiguador o pares de marcaje enzima/inhibidor. Ver, por ejemplo, la Patente de EE.UU. 3.996.345 (Ullman y col.).

Es generalmente más conveniente realizar un ensayo de captura utilizando un reactivo unido a una fase sólida, tal como un tubo de ensayo de polietileno, el pocillo de una placa de microvaloración o una esfera magnética. En un ensayo de captura de tipo competición, el anti-CEA no marcado de la muestra compite con un reactivo anti-CEA marcado para unirse a 3H1. El 3H1 puede ser unido directamente al soporte sólido o capturado posteriormente utilizando, por ejemplo, un anti-3H1. En este ensayo, la cantidad de marca asociada con la fase sólida está inversamente relacionada con la cantidad de anti-CEA de la muestra.

En el ensayo de captura de tipo sándwich, el anti-CEA es capturado por 3H1 unido directamente o a través de un reactivo secundario a una fase sólida. Después de lavar, el anti-CEA es detectado utilizando una anti-inmunoglobulina de la especie apropiada, o un segundo anticuerpo 3H1 al que está unida directa o indirectamente una marca. Alternativamente, la anti-inmunoglobulina puede estar unida a la fase sólida y se utiliza 3H1 marcado para completar el sándwich. Si la anti-inmunoglobulina utilizada es específica de un isotipo, puede determinarse también entonces la clase del anticuerpo. En este tipo de ensayo, la cantidad de marca asociada con la fase sólida se correlaciona positivamente con la cantidad de anti-CEA de la muestra.

Se conocen en la técnica otros métodos para medir anticuerpos específicos, y pueden ser adaptados para medir anti-CEA utilizando 3H1 como antígeno diana. Tales métodos adaptados están todos incluidos en esta invención. En la sección de Ejemplos se proporcionan descripciones adicionales de realizaciones particulares.

El 3H1 puede ser utilizado también para medir el nivel de actividad anti-CEA celular, particularmente anti-idiotipo de 3H1. En un ejemplo preferido, se utiliza 3H1 para identificar células T anti-CEA, definidas para este fin como linfocitos que expresan un receptor de células T que se une al idiotipo de 3H1. El 3H1 puede ser marcado y puesto en contacto con una población de células sospechosa de contener células T anti-CEA. Alternativamente, 3H1 no marcado puede ser mezclado con las células, seguido por un reactivo secundario marcado tal como anti-inmunoglobulina de ratón o proteína A marcados. Las marcas adecuadas para este fin incluyen radiomarcas y marcas fluorescentes. La utilización de marcas fluorescentes permitiría también que las células anti-CEA fueran separadas de las células no específicas en un separador de células activadas por fluorescencia.

Utilización de 3H1 para eliminar Ab1 marcado

La invención incluye también métodos de utilización de 3H1 para eliminar una toxina y/o una marca, por ejemplo radioactividad, de un individuo que haya recibido un anticuerpo anti-CEA (Ab1) marcado para, por ejemplo, radioescintigrafía o radioterapia. Un problema común de la utilización de radionúclidos dirigidos con un anticuerpo (esto es, radioinmunoterapia) ha sido la presencia de un exceso de Ab1 en el sistema que limita la dosis del anticuerpo radiomarcado para tratamiento. Además, la obtención de imágenes eficaces utilizando anticuerpos radiomarcados está dificultada debido al exceso de anticuerpo radiomarcado circulante, que a menudo tarda varios días en ser eliminado de la circulación y de los tejidos. En estos métodos de la presente invención, se administra 3H1 al individuo a un tiempo especificado después de la administración del anti-CEA marcado. La intención es que el 3H1 forme complejos con el anti-CEA en lugares distintos del tumor, tal como en la circulación y en los espacios intersticiales, y estimule de este modo su eliminación. Como resultado, el nivel del resto marcado (tal como un radioisótopo) en los tejidos no afectados se reduce y se intensifica la imagen del tumor (en comparación con los tejidos vecinos). De manera similar, cuando se administran radionúclidos a sujetos para irradiar un sitio tumoral, es deseable reducir la exposición colateral del tejido no afectado. Esta invención incluye por tanto métodos de tratamiento en los que un anticuerpo anti-CEA radiomarcado es administrado en una dosis terapéutica, seguido por un exceso molar de 3H1.

En cualquiera de estas aplicaciones, se elige una cantidad de 3H1 que esté en exceso molar suficiente sobre el anti-CEA marcado para localizar y unirse a cualquier anti-CEA que no esté situado en el lugar del tumor. La cadencia de la administración y la cantidad de 3H1 dependerán de la naturaleza del anticuerpo radiomarcado, del tipo de radioisótopo utilizado y de la condición del individuo. Preferiblemente, la relación molar de 3H1 respecto al anticuerpo anti-CEA es de al menos 5:1 aproximadamente, más preferiblemente de 25:1 a 200:1 aproximadamente. Preferiblemente, el 3H1 es administrado de 5 a 24 horas después de que el individuo haya recibido el anticuerpo anti-CEA.

La invención incluye también métodos para detectar la presencia de un anticuerpo anti-CEA unido a una célula tumoral, que comprenden las etapas de tratamiento de la célula tumoral con 3H1 durante un tiempo suficiente para permitir la unión al anticuerpo anti-CEA y la detección de la presencia de cualquier complejo formado. La intención es que el 3H1 detecte el anti-CEA que se haya prefijado a la célula tumoral o, alternativamente, que estimule la unión del anti-CEA a la célula tumoral mediante la formación de un complejo inmune anti-CEA/3H1 polivalente. En el primer caso, el 3H1 se proporciona con una marca detectable o con un medio medianteel cual pueda unirse una marca. En el último caso, se proporciona el anti-CEA o el 3H1 con una marca.

Esta estrategia puede ser utilizada, por ejemplo, para identificar una célula portadora de CEA en una suspensión de células aisladas. Las células son incubadas secuencialmente o simultáneamente con anti-CEA y 3H1, se lavan y se detectan posteriormente las células marcadas. Las marcas preferidas para esta realización incluyen marcas fluorescentes tales como fluoresceína, rhodamina y Rojo Texas. Opcionalmente, las células marcadas pueden ser separadas de las células no marcadas mediante, por ejemplo, separación en un clasificador de células activadas por fluorescencia o mediante separación por afinidad utilizando cualquiera de las técnicas de inmunoselección positiva o negativa en fase sólida conocidas en el oficio.

La estrategia puede ser utilizada también, por ejemplo, para detectar u obtener imágenes de tumores en un sujeto afectado. El anti-CEA y el 3H1 son administrados (normalmente de forma secuencial) al sujeto y se deja que se acumulen en el sitio del tumor. Las marcas adecuadas incluyen radiomarcas tales como ^{111}In, ^{131}I y ^{99m}Tc. El tumor es posteriormente detectado o visualizado utilizando técnicas estándar de radioescintigrafía.

Composiciones farmacéuticas y vacunas que contienen 3H1

La presente invención incluye composiciones farmacéuticas y vacunas que contienen 3H1. Tales composiciones farmacéuticas y vacunas son útiles para producir una respuesta inmune, preferiblemente una respuesta anti-CEA, y/o para tratar una enfermedad asociada al CEA. Estas composiciones farmacéuticas, que contienen una cantidad eficaz de 3H1 en un excipiente farmacéuticamente aceptable, son adecuadas para la administración sistémica a individuos en formas de dosificación unidad, soluciones o suspensiones parenterales estériles, soluciones no parenterales estériles o soluciones o suspensiones orales, emulsiones aceite en agua o agua en aceite y similares. Las formulaciones para administración parenteral y no parenteral de fármacos son conocidas en la técnica y están descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª Ed. Mack Publishing (1990).

Un tipo de composición farmacéutica es una vacuna. Por consiguiente, la presente invención incluye también vacunas que contienen una cantidad eficaz de 3H1. Según se utiliza en la presente, una ``vacuna'' es una composición farmacéutica para uso humano o animal que se administra con la intención de conferir al receptor un grado de reactividad inmunológica específica contra una diana particular o contra un grupo de dianas. La reactividad inmunológica puede consistir en anticuerpos o células (particularmente células B, células plasmáticas, células T cooperadoras o linfocitos T citotóxicos y sus precursores, o cualquier combinación de los mismos) que sean inmunológicamente reactivos contra la diana. Para los fines de esta invención, la diana es el antígeno CEA asociado a un tumor o cualquier antígeno tumoral relacionado que se una a 3H1. La actividad inmunológica puede ser deseada para fines experimentales, para el tratamiento de una enfermedad asociada al CEA avanzada o para la eliminación de una sustancia particular. Las vacunas pueden ser utilizadas, inter alia, para producir una respuesta inmune en un individuo con una enfermedad asociada al CEA avanzada. Preferiblemente, la respuesta inmune es la producción de anti-CEA.

Preferiblemente, una vacuna de esta invención incluirá un adyuvante. Ejemplos de adyuvantes han sido discutidos anteriormente.

Las vacunas de la presente invención son administradas típicamente por vía parenteral, por ejemplo mediante inyección, subcutáneamente, intramuscularmente, intraperitonealmente o intradérmicamente. La administración puede ser también intranasal, intrapulmonar (esto es, mediante aerosol), oral e intravenosa. Formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos, formulaciones orales. La vía de administración dependerá de la condición del individuo y del efecto clínico deseado.

Las administraciones pueden comenzar semanalmente o bisemanalmente hasta que se detecte un parámetro medible deseado, tal como la producción de una respuesta inmune (humoral y/o celular). La administración puede entonces continuar sobre una base menos frecuente, tal como bisemanalmente o mensualmente. Preferiblemente, las administraciones se dan inicialmente bisemanalmente durante las cuatro primeras administraciones, seguido por administraciones mensuales.

Las vacunas son administradas de una manera compatible con la formulación de la dosificación, y en una cantidad tal que sean terapéuticamente eficaces. La cantidad a administrar depende del individuo que va a ser tratado, de la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos, de la vía de administración y del grado de protección deseado. Las cantidades precisas de ingrediente activo requeridas para ser administradas pueden depender de la opinión del médico responsable del tratamiento y pueden ser particulares para el individuo. Los rangos generales de dosificación de 3H1 se dieron anteriormente.

Kits que contienen 3H1

La presente invención incluye también kits que contienen 3H1, preferiblemente kits de diagnóstico. Los procedimientos de diagnóstico utilizando 3H1 pueden ser realizados por laboratorios de diagnóstico, laboratorios experimentales, médicos o individuos privados. Los kits abarcados por esta invención incluyen aquéllos que permiten a cualquier individuo realizar un ensayo para determinar la actividad anti-CEA o anti-3H1, tal como cualquiera de los descritos en la presente, detectando o cuantificando de este modo estas actividades.

Los kits de esta invención contienen 3H1 en un embalaje adecuado. El kit puede proporcionar opcionalmente componentes adicionales que son útiles en el procedimiento, incluyendo, pero no limitándose a, tampones, reactivos de captura, reactivos de revelado, marcas, superficies reactivas, medios de detección, muestras control, instrucciones e información interpretativa.

Los ejemplos siguientes se proporcionan con el fin de ilustrar, pero no de limitar, la presente invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Generación y caracterización de anticuerpos anti-idiotipo 3H1

La línea celular de hibridomas productora del anticuerpo monoclonal anti-idiotipo 3H1 fue creada e identificada de acuerdo con la descripción siguiente. Los aspectos del procedimiento de inmunización y del procedimiento de selección fueron importantes para obtener un anticuerpo con la especificidad y funcionalidad deseadas. El 3H1 fue uno de varios Ab2 que se produjeron inicialmente, y fue identificado como el candidato con las características más deseables.

El anticuerpo inmunizante (Ab1) fue el anticuerpo monoclonal anti-CEA de ratón 8019. Como el animal respondedor era también un ratón, se esperaba que el Ab2 generado estuviera dirigido contra características idiotípicas de 8019. Sin embargo, solamente una fracción de los mismos estaría dirigida contra el paratopo de 8019, una proporción incluso más pequeña sería inmunogénica y capaz de inducir un Ab3, y una proporción todavía más pequeña induciría un Ab3 que reaccionaría de manera cruzada con el antígeno asociado al tumor.

Para hacer que 8019 fuera suficientemente inmunogénico en una especie autóloga, fue conjugado al transportador KLH y emulsionado en adyuvante de Freund. Fue administrado repetitivamente a los animales receptores en una programación inusual, con solamente 2 semanas entre las dosis. Se inmunizaron 5 ratones de acuerdo con esta programación. Se produjeron respuestas sustanciales en 3 ratones aproximadamente solamente después de la cuarta inmunización. Los animales respondedores fueron reforzados con una quinta dosis de 8019 i.v., se aislaron células esplénicas y se prepararon hibridomas separadamente de cada animal. El clonaje se realizó según técnicas estándar.

La selección inicial se llevó a cabo mediante inmunoensayo para identificar los clones que reaccionaban con 8019, pero no con otros anticuerpos monoclonales diana que compartían los mismos determinantes alotípicos o isotípicos. Un ensayo crítico fue un RIA de sándwich en el que 8019 fue fijado a una fase sólida, cubierto con sobrenadante de cultivo y revelado con 8019 radioyodado. Este ensayo requiere que el anticuerpo presente en el sobrenadante de los hibridomas sea funcionalmente bivalente y sea capaz de extenderse entre el 8019 de captura y el 8019 de revelado. Varios clones que eran específicos para el idiotipo y produjeron una señal potente en este ensayo fueron seleccionados para un estudio posterior.

La selección posterior se llevó a cabo mediante ensayos de competición en los que se requería que el Ab2 bloqueara la unión de 8019 a CEA. Esto establecía que Ab2 reconocía el paratopo de 8019. El CEA se proporcionó en forma de células MCF-7, una línea celular de tumor de mama humano que expresa CEA en la superficie celular. La naturaleza del ensayo requiere que Ab2 bloquee la interacción entre 8019 y el antígeno tumoral en su manera particular de presentación en las células tumorales. Como mínimo, se requería que el Ab2 candidato que había pasado los ensayos de selección anteriores inhibiera la unión de 8019 a las células en al menos un 85%. Hubo alrededor de tres Ab2 que superaban sustancialmente el mínimo, proporcionando 3H1 el nivel más elevado de inhibición aproximadamente.

El último ensayo de selección fue una determinación de si el Ab2 candidato era capaz de producir un Ab3 de la especificidad deseada cuando se inyectaba a un receptor. Se prepararon cantidades suficientes de Ab2 a partir de líquido ascítico de ratón, y se ensayaron en ratones y conejos. Los sueros de los animales de ensayo fueron analizados primeramente para determinar la presencia de Ab3 en un inmunoensayo de sándwich utilizando el mismo Ab2 marcado empleado para la inmunización. Los sueros que dieron positivo en el análisis fueron luego analizados para determinar la capacidad del Ab3 para reaccionar contra el antígeno asociado al tumor; a saber CEA. Se utilizó una preparación semipura de CEA para revestir placas de microvaloración, se cubrió con el suero de ensayo en diluciones seriadas y se detectó el Ab3 que se unía utilizando anti-inmunoglobulina marcado. El título de la unión de Ab3 a CEA definía la ``calidad'' de Ab2, como reflejo de su capacidad como inductor de anti-CEA.

El anticuerpo monoclonal 3H1 apareció como el anti-idiotipo con la máxima calidad y es la base original para varios compuestos, composiciones y procedimientos incluidos en esta invención.

Materiales

Antígeno carcinoembrionario (CEA): El CEA purificado fue obtenido comercialmente de Rougler Biotech, Montreal, Canadá (nº de catálogo 70015). Alternativamente, el CEA fue aislado de metástasis hepáticas humanas de adenocarcinoma de colon mediante extracción con ácido perclórico y purificado dos veces mediante cromatografía de intercambio iónico, seguido por filtración en gel y varias etapas de cromatografía HPLC. El CEA obtenido por este método era un 100% puro, producía una sola banda a 180.000 de peso molecular por HPLC y SDS-PAGE y fue inmunoprecipitado como una única banda por anticuerpo anti-CEA de caballo así como de conejo. Dos bandas que migraban muy próximas, de 180.000 y 200.000 de peso molecular, fueron puestas de manifiesto mediante análisis de transferencia Western utilizando el anticuerpo 8019 y otro mAb anti-CEA murino. El CEA purificado fue utilizado para experimentos de ELISA con sueros Ab3 policlonales de ratón y conejo, descritos supra.

Otros experimentos fueron llevados a cabo generalmente utilizando un extracto semipurificado de células de adenocarcinoma humano. Éste fue preparado mediante extracción perclórica seguido por extensa diálisis. La presencia de CEA en el extracto fue confirmada por SDS-PAGE, seguido por inmunoprecipitación con el mAb 8019.

Anticuerpo: La línea celular de hibridomas productora del anticuerpo monoclonal 8019 fue obtenida de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). El anticuerpo fue descrito originalmente como una IgM \kappa, pero durante el reclonaje apareció un mutante por cambio espontáneo, y nuestro 8019 es una IgG1 \kappa. La especificidad de 8019 fue reconfirmada mediante tinción con inmunoperoxidasa y análisis de microfluorimetría de flujo utilizando células que expresaban CEA. El anticuerpo monoclonal mAb 1E3 (IgG1 \kappa; específico para carcinoma de ovario mucinoso humano) y otras inmunoglobulinas de ratón monoclonales y de mieloma fueron utilizados como controles en varios experimentos descritos en la presente.

Los líquidos ascíticos de hibridomas de 8019 y de otras líneas celulares se prepararon inyectando a ratones individuales estimulados con pristano i.p. 2-10 x 10^{6} células viables. La fracción de IgG fue aislada del líquido ascítico mediante precipitación con sulfato de amonio saturado al 45% y la cromatografía posterior en Proteína A Sepharose™ CL-4B (Ey y col. (1978) Immunochemistry 15:429). La pureza de la IgG aislada fue comprobada por inmunodifusión, inmunoelectroforesis y fraccionamiento por cromatografía líquida de alta presión (HPLC).

Preparación de fragmentos F(ab')_{2} de 8019: Los fragmentos F(ab')_{2} fueron preparados mediante digestión con pepsina estándar (Parham (1983) J. Immunol. 131:2895). Brevemente, la fracción de IgG procedente del líquido ascítico de 8019 fue dializada frente a tampón citrato 0,1 M, pH 3,5, y digerida con pepsina (25 \mug/mg de IgG) a 37ºC durante 8 horas. Después del corte, el pH fue ajustado a 7,0 con tampón Tris 3,0 M, pH 8,6, y la solución fue dializada frente a solución salina tamponada con fosfato (PBS) en frío. El digesto fue separado por HPLC utilizando una columna de Sepharose 6. La pureza del F(ab')_{2} aislado fue determinada por inmunodifusión y por reacción con reactivos anti-isotipo en un ELISA estándar.

Acoplamiento del anticuerpo con KLH: El 8019 fue acoplado a hemocianina de la lapa ojo de cerradura (KLH) de acuerdo con un método descrito por Maloney y col. (1985; Hybridoma 4:191). La solución madre de anticuerpo (1 mg/ml) fue mezclada con KLH (1 mg/ml) en PBS en presencia de una solución de glutaraldehído recién diluido (concentración final 0,05%). La mezcla fue rotada extremo sobre extremo durante 1 hora a temperatura ambiente y posteriormente dializada exhaustivamente frente a PBS a 4ºC.

Inmunización de ratones singénicos BALB/c: Se inmunizaron hembras BALB/c cuatro veces a lo largo de un periodo de 2 meses. La primera inyección se administró i.p. utilizando 100 \mug de 8019 emulsionado en adyuvante completo de Freund. Las dos inyecciones siguientes se administraron con 100 \mug de 8019 acoplado a KLH en adyuvante incompleto de Freund, s.c. o i.p. Se extrajo sangre a los ratones de vez en cuando y los sueros fueron analizados para determinar actividad anti-Id mediante ELISA en un ensayo de unión utilizando fragmentos F(ab')_{2} de 8019 e IgG de sueros de ratones BALB/c normales agrupados como control. Tres días antes de la fusión, los ratones fueron reforzados i.v. con 8019 en PBS.

Producción de hibridomas anti-idiotipo

La pareja de fusión utilizada para producir las líneas de hibridomas fue la línea celular de mieloma no secretora de ratón P3-653, relacionada ancestralmente con P3X63Ag8.653, disponible en la ATCC como Nº CRL-1580. Las líneas celulares humanas establecidas fueron cultivadas en RPMI 1640 suplementado con un 5% de suero de ternera fetal según está descrito en otro lugar (Seon y col. (1984) J. Immunol. 132:2089).

Los hibridomas fueron producidos siguiendo esencialmente el método de Oi y Herzenberg ((1980) ``Selected Methods of Cellular Immunology'', Mishell & Shiigi eds., Freeman Publs., 351-372). Células esplénicas de ratones inmunizados fueron mezcladas con células P3-653 en una proporción de 1:1 a 1:10, en presencia de polietilén glicol al 50% (PEG, peso molecular \sim4500). Las células fusionadas fueron luego lavadas y cultivadas. Los híbridos fueron seleccionados utilizando un medio con hipoxantina-aminopterina-timidina.

Selección inicial de los clones de hibridomas que secretaban anticuerpo anti-idiotipo (Ab2)

La selección inicial de los clones de hibridomas se realizó mediante RIA y ELISA. El ELISA se llevó cabo revistiendo los pocillos de placas de microvaloración con anticuerpo 8019 (o control) a 500 ng/pocillo. Después de incubar durante una noche a 4ºC las placas fueron bloqueadas con seroalbúmina bovina (BSA) al 1% en PBS. Se incubaron en los pocillos 100 \mul de los sobrenadantes del cultivo de hibridomas o de un concentrado 20 x durante 4 horas a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS, las placas fueron incubadas adicionalmente durante 4 horas a temperatura ambiente, o durante una noche a 4ºC, con reactivos anti-isotipo marcados con fosfatasa alcalina y reveladas con el sustrato. Debido a que los reactivos de detección del ELISA eran anti-inmunoglobulina de ratón, el 8019 utilizando para revestir las placas era un fragmento F(ab')_{2}. El ensayo de ELISA es útil para identificar la clase y la subclase de un anticuerpo específico. Generalmente, se desea un anticuerpo de ciertas subclases de IgG debido a que es estable, fácilmente purificado mediante cromatografía con proteína A y puede tener funciones efectoras útiles.

Los sobrenadantes de los hibridomas fueron también analizados en un RIA de sándwich. El 8019 purificado fue radioyodado mediante el método de cloramina T (Hunter (1970) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 133:989). El 8019, o el anticuerpo control (anticuerpos monoclonales de varios isotipos y especificidades no relacionadas e IgG normal de BALB/c) fue revestido sobre placas de PVC a 500 ng/pocillo. Generalmente, se utilizó anticuerpo intacto. Después de incubar durante una noche a 4ºC, las placas fueron bloqueadas con BSA al 1% en PBS. Las placas revestidas fueron incubadas con diluciones seriadas del sobrenadante de los hibridomas durante 4 horas y reveladas utilizando \sim50.000 cpm de ^{125}I-8019. El ensayo de RIA es un ensayo de especificidad más riguroso para analizar el anticuerpo y requiere también que el anticuerpo sea capaz de extenderse entre dos moléculas de 8019.

Varias líneas celulares que secretaban Ab2 monoclonales emergieron de estos ensayos de selección con las propiedades deseadas. Entre ellos estaba el anticuerpo monoclonal 3H1.

Confirmación de que los Ab2 son específicos para el idiotipo de 8019

La especificidad idiotípica de Ab2 fue confirmada mediante la unión directa a Ab1. Varios Ab2 purificados fueron marcados con ^{125}I y analizados para determinar su unión a placas revestidas con un panel de Ab1 anti-TAA monoclonales. Los resultados de un experimento que utilizó ^{125}I-3H1 están mostrados en la Figura 5. Los resultados están presentados en cpm medias (n=3, D.E. <10%). El 3H1 se unía casi exclusivamente a 8019; no había virtualmente reactividad cruzada con ninguno de los demás Ab1 analizados, con una sola excepción: Una pequeña reacción cruzada con el anticuerpo anti-CEA RWP 1.1 (IgG2b, \kappa) que reconoce un epítopo relacionado (posiblemente solapante) en CEA.

La especificidad para el idiotipo de 8019 fue establecida adicionalmente en experimentos de competición. Se mezclaron \sim25.000 cpm de varios Ab2 marcados con diferentes miembros de un panel de competidores no marcados que comprendía Ab2, Ab1 y otras inmunoglobulinas de ratón. El Ab2 fue analizado posteriormente para determinar su unión a placas revestidas con 8019. Los resultados se muestran en la Tabla 1 (cpm medias, n=3, D.E. <10%). Se obtuvo más de un 90% de inhibición utilizando 250 ng de 3H1 no marcado o de 8019 no marcado como competidor. Virtualmente no se obtuvo inhibición, hasta una concentración de 5 \mug, utilizando las demás inmunoglobulinas como competidores potenciales, excepto con el anticuerpo Ab1 relacionado RWP 1.1.

\newpage

TABLA 1 Inhibición de la unión Id-anti-Id*

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{lrr}\hline 
Inhibidor  \+ cpm  \+ \quad Porcentaje de \\   \+ unidas  \+ \quad
inhibición \\\hline  Ninguno  \+ 11.995  \+ 0 \\  3H1 (Ab2), 0,125
 \mu g  \+ 439  \+ 97 \\  8019 (Ab1), 0,200  \mu g  \+ 861  \+ 95 \\
 RWP 1.1, 5  \mu g (anti-CEA)  \+ 1.842  \+ 85 \\ 
1E3, 5  \mu g (anti-iso, alotipo)  \+ 11.755  \+ 2
\\  Mc-10, 5  \mu g (anti-iso,
alotipo)  \+ 12.085  \+ 0 \\  F36/22, 5  \mu g
(anti-iso, alotipo)  \+ 11.558  \+ 4 \\  3F3, 5
 \mu g (anti-CEA)  \+ 10.955  \+ 8 \\  ZCE, 5  \mu g
(anti-CEA)  \+ 12.033  \+ 0 \\  31C5A4, 5  \mu g
(anti-CEA)  \+ 11.800  \+ 1 \\ 
D-14, 5  \mu g (anti-CEA)  \+ 12.075
 \+ 0
\\\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Selección para obtener anti-idiotipos dirigidos contra el paratopo de 8019

Con el fin de determinar si los Ab2 estaban dirigidos contra el paratopo de 8019, los Ab2 fueron utilizados para competir con la unión de 8019 radiomarcado a CEA. Esto se realizó de dos maneras: (1) se llevaron cabo ensayos de unión a placas utilizando el extracto de CEA semipurificado; (2) se llevaron a cabo ensayos de unión a células utilizando células LS174-T, una línea celular de cáncer de colon humano que expresa CEA como constituyente de la membrana.

Las placas para los ensayos de unión en placa fueron revestidas mediante incubación de las mismas con 100 \mul del extracto del Ag CEA semipurificado solubilizado en ácido perclórico (0,1 mg de proteína/ml) durante una noche a 4ºC. Células LS174-T fueron cultivadas como una monocapa confluente en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Varias diluciones del Ab2 de ensayo (sobrenadante del cultivo o anticuerpo purificado) fueron mezcladas con el 8019 marcado y posteriormente añadidas a la placa revestida o a las células cultivadas. Se calculó el porcentaje de inhibición del ensayo de acuerdo con la fórmula:

\text{% de inhibición} = 1 - \left(\frac{R_{T} - R_{C}}{R_{MÁX} - R_{C}}\right) \times 100 en la que R_{T} son las cpm medias del pocillo experimental con inhibidores; R_{C} son las cpm medias del fondo y R_{MÁX} es la unión máxima media sin inhibidores.

La Figura 6 muestra los resultados de este tipo de experimento, realizado utilizando 3H1 como competidor modelo en el ensayo de unión en placa. El 3H1 inhibía la unión de 8019 marcado a CEA en cantidades tan bajas como 25 ng. El anticuerpo 4EA2 purificado (una IgG1, \kappa de especificidad no relacionada) fue utilizado como control negativo y no presentó inhibición. En un experimento relacionado, 3H1 no fue capaz de inhibir la unión de otro anticuerpo anti-CEA (D14) a las placas revestidas con CEA.

Confirmación de la especificidad de unión

Para el Ab2 más prometedor, se llevaron a cabo experimentos de confirmación con el fin de confirmar la especificidad de unión a 8019, en los cuales se invirtieron los papeles en el ensayo de competición.

Se coincubaron 40.000 cpm aproximadamente de ^{125}I-8019 con una preparación semipurificada del Ag CEA, o bien con un Ag glicoproteico no relacionado que no reacciona con 8019 (Bhattacharya y col. (1982) Cancer Res. 42:1560). La mezcla anticuerpo-Ag fue añadida a placas revestidas con Ab2 (500 ng/pocillo) y se determinó la capacidad de CEA para inhibir la unión. La cantidad de Ab2 no era limitante con respecto a la cantidad de 8019 que podía unirse, y era por tanto un indicador sensible para pequeñas cantidades de CEA competidor.

La Figura 7 muestra los resultados de un experimento típico. 2,5 \mug de CEA semipurificado inhibían la unión de 3H1 a 8019 yodado en un 50%. La glicoproteína no relacionada, incluso a una concentración más elevada, no inhibía la unión. Esto sugiere que 3H1 es un anti-Id específico de un sitio de unión.

Los clones productores de anticuerpos que resultaron positivos en los ensayos de selección descritos hasta ahora, fueron utilizados para preparar líquido ascítico de ratón como fuente de Ab2. Los Ab2 fueron purificados por cromatografía utilizando las resinas de afinidad con Proteína A y Proteína G mediante técnicas estándar.

Selección de anti-idiotipos capaces de inducir una respuesta inmune específica de un tumor

Si el Ab2 se comportara como un antígeno de la red, debería entonces inducir la producción de Ab3 específico del Ag en ausencia de exposición al Ag de una manera no restringida genéticamente y a través de las barreras de especie. Por consiguiente, los Ab2 que habían pasado los ensayos de selección previos fueron sometidos a selección posteriormente en experimentos de inmunización. El objetivo es identificar los candidatos que pueden producir Ab3 que compartan idiotipos con Ab1 y presenten una especificidad de unión similar para el antígeno asociado al tumor.

Para cada Ab2 a analizar, se inmunizaron un mínimo de 5 ratones BALB/c y dos conejos blancos New Zealand. Para la inmunización de ratones, el Ab2 fue conjugado a KLH. Se inyectaron 50 \mug y se extrajo sangre a los ratones periódicamente para analizar la respuesta. Se inyectaron 500 \mug por conejo emulsionados en adyuvante completo de Freund el día 0, en adyuvante incompleto de Freund el día 14 y en solución salina (i.m.) durante los 2 meses siguientes. Se extrajo sangre a los conejos 14 días después de la ultima inyección.

La actividad anti-CEA fue medida mediante ELISA (ver, de manera general, Engvall y col. (1972) J. Immunol. 109:129). Varias diluciones de los sueros de ensayo fueron incubadas en pocillos revestidos con CEA y el anticuerpo unido fue detectado con un anti-inmunoglobulina unido a un enzima apropiado para la especie. Este ensayo requiere que el anticuerpo se una al antígeno asociado al tumor original, y establece que al menos una porción del Ab3 inducido mediante la inmunización con el anti-idiotipo es específica para el antígeno del tumor. El nivel de Ab3 específico de CEA fue cuantificado mediante dilución seriada, y definía la ``calidad'' del Ab2 inmunizante. Sueros de los ratones y conejos inmunizados con un anticuerpo monoclonal no relacionado (4EA2) fue utilizado como control negativo de especificidad.

El anticuerpo monoclonal 3H1 apareció como el que tenía la calidad más elevada entre los candidatos analizados.

Según se muestra en la Figura 8, el Ab3 presente en los sueros de los ratones inmunizados con 3H1 era específico para CEA no solubilizado. Todos los ratones inmunizados (seis en dos grupos) desarrollaron anticuerpos anti-CEA según se midió mediante ELISA. Los sueros control procedentes de ratones preinmunes o de ratones inmunizados con un Ab2-KLH no relacionado (4EA2) no mostraron unión a CEA puro. En un experimento paralelo, la unión del mismo antisuero fue comparada en una placa revestida con una glicoproteína de tumor de ovario no relacionada. La unión máxima obtenida en cada caso estuvo entre 0,3 a 0,4 de DO, la misma que la obtenida con PBS-BSA control.

En un experimento relacionado, se analizó la unión de Ab3 a células LS174-T de carcinoma de colon humano cultivadas, en un ensayo de inmunofluorescencia indirecto y por citometría de flujo. Según se muestra en la Figura 9, los sueros que contenían Ab3 procedentes de ratones inmunizados con 3H1 mostraban una unión distinta (B) que era similar al patrón de unión obtenido con 8019 (Ab1) (A). No se obtuvo unión significativa con células de linfoma de células B humanas que no expresan CEA (Figura 9D).

Confirmación de que el Ab3 inducido por 3H1 tenía la especificidad deseada

Debido a que el objetivo terapéutico de 3H1 radica en su capacidad para producir una respuesta reactiva contra el antígeno asociado a un tumor, la especificidad del Ab3 obtenido fue confirmada en varios experimentos posteriores.

Los antisueros Ab3 de conejo y ratón fueron disminuidos de actividad anti-isotípica y anti-alotípica para ser utilizados en los experimentos de especificidad mediante el pase de los mismos sobre un adsorbente producido por el acoplamiento de fracciones de inmunoglobulinas de suero de ratones BALB/c a 4B. La adsorción fue repetida hasta que no pudo detectarse por inmunodifusión actividad anti-isotípica o anti-alotípica. Los sueros que contenían Ab3 adsorbido fueron diluidos con PBS que contenía BSA 1%, Tween 20 0,05% y se utilizaron en la determinación de la especificidad sin ninguna purificación posterior.

Se utilizaron células esplénicas de ratones inmunizados con 3H1 para generar líneas celulares productoras del monoclonal Ab3, utilizando la tecnología de hibridomas similar a la descrita anteriormente.

Ensayos de inhibición: Para determinar si los sueros con Ab3 competían con Ab1 por la unión a células de carcinoma de colon humano, se analizó la unión de 8019 radioyodado a monocapas confluentes de células LS174-T para determinar la inhibición en presencia de diferentes sueros con Ab3 y de Ab1.

Para el ensayo de unión directa entre Ab1 y 3H1, se utilizó 3H1 purificado para revestir las placas (155 ng/pocillo), y se analizó la unión de 8019 radiomarcado a 3H1 en presencia de diferentes Ab3 y de Ab1. El porcentaje de inhibición de los ensayos se calculó de acuerdo con la fórmula descrita anteriormente.

Los sueros procedentes de ratones singénicos inmunizados con 3H1, a una dilución 1/10, inhibían la unión de 3H1 yodado (Ab2) a Ab1 en un 90%. No se observó inhibición por sueros preinmunes o por sueros de ratones inmunizados con un Ab2 no relacionado, 4EA2-KLH. Aunque no puede excluirse en estos ensayos el impedimento estérico por la unión de Ab3, los resultados sugieren la presencia de anticuerpos Ab3 que comparten idiotipos con Ab1 (8019). Los antisueros de los conejos 729 y 730, inmunizados con 3H1, a una dilución 1/10, inhibían la unión de 8019 yodado a Ab2 en un 88% y en un 57%, respectivamente. No se obtuvo inhibición significativa con sueros de conejos preinmunes.

Si Ab3 tiene un sitio de unión similar al de Ab1, debería competir con Ab1 por la unión a CEA según es expresado por la línea celular de carcinoma humano LS174-T. Una cantidad fija de 8019 radiomarcado fue coincubada con diferentes diluciones de sueros Ab3 de conejo o de la preparación de Ab1 y células LS174-T (Figura 10). Veinte ng de 8019-IgG1 (Ab1) purificado inhibían la unión un 50%, mientras que los sueros de conejo a una dilución 1/10 producían un 47% y un 49% de inhibición para el conejo 729 y para el conejo 730, respectivamente. Esto indicaba que los sueros Ab3 de conejo policlonales se unen al mismo Ag que Ab1 y contienen, por tanto, algunas moléculas de anticuerpo con propiedades de Ab1.

Análisis de transferencia Western: El extracto de CEA semipurificado fue separado mediante SDS-PAGE estándar en gel al 7,5% bajo condiciones no reductoras sin \beta-mercaptoetanol. Después de la electroforesis el gel fue transferido a filtros de nitrocelulosa de acuerdo con los procedimientos de Towbin y col. ((1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350). Las tiras del filtro fueron bloqueadas con PBS-BSA 1% y luego incubadas separadamente con 8019, suero Ab3 policlonal de conejo, suero Ab3 de conejo control contra Ab2 no relacionado, así como con el sobrenadante del cultivo del Ab3 monoclonal. Después de la incubación, las tiras del filtro fueron lavadas con PBS e incubadas con los reactivos anti-Ig de ratón producido en cabra o anti-Ig de conejo producido en cabra marcados con fosfatasa alcalina. Las tiras del filtro fueron lavadas de nuevo y la reacción fue revelada con los reactivos BCIP y NBT suministrados para un kit de inmunotransferencia (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA).

Se ha demostrado que el mAb 8019 inmunoprecipita específicamente el CEA de 180.000 de peso molecular mediante análisis por SDS-PAGE (Mitchell (1980) Cancer Immunol. Immunother. 10:1). Con el fin de confirmar que el Ab3 inducido por 3H1 era específico para la molécula de CEA, un extracto semipurificado de CEA fue separado por SDS-PAGE y transferido a filtros de nitrocelulosa. Una tira del filtro (Figura 11, calle 2) fue teñida con Negro Búfalo. Había dos bandas solapantes en la región de peso molecular 180.000 (CEA) y una banda principal en la región de peso molecular 50.000 (Ag reaccionando de manera cruzada normal) y unas cuantas bandas secundarias de bajo peso molecular. Las tiras restantes del filtro fueron incubadas posteriormente con el mAb 8019, con suero Ab3 de conejo y con suero de conejo inmunizado con el Ab2\beta 4EA2 del mismo isotipo no relacionado (un control negativo). La reacción fue revelada mediante el ensayo de ELISA según se describió anteriormente. El anticuerpo 8019 (Figura 11, calle 3) y el Ab3 de conejo (calle 4) inmunoprecipitaban solamente moléculas con una masa molecular de 180.000 Da de esta mezcla compleja. Los materiales que no fueron precipitados por el mAb 8019 ni por el suero Ab3 de conejo contenían un amplio rango de Ag relacionados con CEA de menor peso molecular. No hubo reactividad con suero preinmune (Figura 11, calle 5) ni con suero control (calle 6). El análisis de transferencia Western confirmó la especificidad del mAb 8019 y la reactividad del Ab3 de conejo con CEA de peso molecular 180.000.

La Figura 12 es un experimento similar realizado con suero de ratón. El Ab3 producido en ratones inmunizados con 3H1, identificó la misma forma de CEA de peso molecular 180.000 en la transferencia Western.

Tinción con inmunoperoxidasa de secciones de tejido con Ab1 y Ab3: Las reactividades de Ab1 monoclonal y de Ab3 (policlonal y monoclonal) fueron comparadas en especímenes quirúrgicos de colon normal y de adenocarcinomas de colon mediante un método de tinción muy sensible (reactivos biotina-estreptavidina, Vector, Burlingame, CA) según fue descrito con detalle por Viale y col. ((1989) J. Immunol. 143:4338). Todas las secciones fueron contrateñidas con hematoxilina de Meyer. Se realizaron los ensayos de especificidad pertinentes, incluyendo el bloqueo de la peroxidasa endógena, la omisión de la primera capa o la sustitución del antisuero específico por suero homólogo no inmune y del sobrenadante del cultivo de Ab3 por el sobrenadante del cultivo del mieloma P3-653.

La reactividad de 8019 fue comparada con la de Ab3 (policlonal y monoclonal) en especímenes de colon normal y de tumores de colon. El patrón de reactividad de Ab3 en tejidos colónicos normales y malignos fue casi idéntico al obtenido con Ab1 (Figura 13). No hubo reacción con mucosa colónica normal, pero 8019 y todos los Ab3 reaccionaban intensamente con los tumores colónicos. La tinción fue apical en las estructuras similares a glándulas y granular (citoplásmica) en áreas menos diferenciadas. Había sutiles diferencias entre los patrones de tinción obtenidos con 8019 (una IgG1, \kappa) y el Ab3 monoclonal (una IgM, \kappa). La reacción con 8019 tuvo como resultado la tinción de las células tumorales así como de los materiales mucinosos secretados, mientras que la reacción con el Ab3 monoclonal tuvo como resultado la tinción de las células tumorales sin teñirse la mucina secretada (Figura 14).

Ensayos de inmunidad celular: Pueden realizarse también experimentos adicionales con el fin de demostrar que los animales inmunizados con 3H1 tienen también una respuesta inmune celular dirigida contra CEA. Pueden utilizarse células esplénicas de ratones inmunizados con 3H1 en un ensayo de proliferación de células T. Las células esplénicas son cultivadas durante 5 días en presencia de CEA semipurificado y posteriormente son sometidas a un pulso de [^{3}H]timidina. Una mayor captación en células procedentes de los animales inmunizados con 3H1 que en los controles, es consistente con la presencia de una respuesta inmune celular específica de idiotipo. Pueden analizarse también conejos inmunizados para determinar reacciones cutáneas de DTH contra preparaciones semipurificadas de CEA o de CEA purificado. Pueden llevarse a cabo también ensayos de citotoxicidad de células T según está descrito en otro lugar de esta descripción.

En la Figura 15 se muestra un esquema que presenta una red de anti-idiotipos basada en 3H1.

Ejemplo 2 Clonaje y secuenciación de ADNc de 3H1

A no ser que se especifique de otro modo, todas lastécnicas de clonaje fueron esencialmente según está descrito por Sambrook y col. (1989) y todos los reactivos fueron utilizados de acuerdo con las direcciones del fabricante.

Clonaje de ADNc y determinación de la secuencia de las regiones variables de 3H1

Para secuenciar la región V_{H}, se aisló el ARN total de 1 x 10^{7} células de hibridoma de 3H1. El rendimiento de ARN total fue de 100 \mug aproximadamente. El ARNm fue preparado mediante el pase a través de dos ciclos de cromatografía en columnas de oligotimidilato-celulosa. El rendimiento de ARNm fue de 10 \mug aproximadamente. Se sintetizó la primera hebra de ADNc utilizando el kit de Preamplificación SuperScript (GIBCO/BRL). El fragmento de ADN que codificaba la V_{H} de 3H1 fue amplificado posteriormente por PCR utilizando el cebador 5' GGGAATTCATGRAATGSASCTGGGTYWTYCTCTT y el cebador 3' CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG (I=inosina, R=A o G, Y=C o T, K=G o T, S=C o G, W=A o T) correspondientes a la secuencia de aminoácidos -20 a -13 de la región líder (péptido señal), y a la secuencia de aminoácidos 126 a 119 de la región constante gamma. Además, el sitio 5'-III proporcionaba una estrategia de clonaje alternativa (Novagen, Madison, Wisconsin). El fragmento de ADNc amplificado fue subclonado en el plásmido pT7 y se transformaron células competentes NovaBlue utilizando un protocolo suministrado por el proveedor (Novagen). Las colonias recombinantes fueron recogidas mediante selección por color y se preparó ADN plasmídico. La secuencia de ADN del plásmido de doble hebra fue determinada con el kit Sequenase Versión 2,0 (USB, Cleveland, Ohio). La secuencia del inserto de ADN en el plásmido fue determinada a partir de ambas orientaciones utilizando el cebador del promotor de T7 (TAATACGACTCACTATAGGG) y el cebador de U-19 (CTTTTCCCAGTCACGACGT). Se recogieron al menos 8 clones para la determinación de la secuencia. La secuencia de la cadena ligera de 3H1 fue determinada de manera similar. El cebador directo para la cadena ligera fue 5'-ACTAGTCGACATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG y el cebador inverso fue 5'-CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA, correspondientes a los aminoácidos –20 a -12 de la secuencia líder y 122 a 116 de la región constante de la cadena kappa de ratón.

Con el fin de minimizar las tasas de error en la amplificación por PCR, se utilizó ADN polimerasa pfu (Stratagene, San Diego) para la amplificación en todos los experimentos posteriores. La frecuencia de mutantes con esta ADN polimerasa termoestable es 1/10 en comparación con la ADN polimerasa Taq.

Verificación del clon de ADNc por la secuencia de aminoácidos

Aunque los 3 clones que recogimos tenían todos la misma secuencia, consideramos necesario confirmar que el ADNc aislado era en efecto el de 3H1. Se diluyeron 50 \mug de anticuerpo 3H1 purificado con tampón de carga de muestra (Tris-HCl 50 mM, pH 6,8, SDS 1%, glicerol 1%, \beta-mercaptoetanol 0,1%) y se calentaron a 100ºC durante 3 minutos. La proteína desnaturalizada fue cargada en un gel de poliacrilamida al 7,5% (BioRad Miniprotean II Dual Slab Cell) que contenía SDS y sometida a electroforesis a 200 V durante 1 hora. Las proteínas de los geles fueron transferidas a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) mediante el procedimiento descrito por Towbin y col. ((1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:4350-4354) a 150 mA durante una noche. El tampón de transferencia contenía Tris 25 mM, glicina 192 mM, metanol 20% (v/v). Las membranas fueron teñidas mediante inmersión rápida en Azul Brillante de Coomassie al 0,1% en metanol 50%-ácido acético 50%, seguido por lavado en una solución que contenía metanol 40% más ácido acético 10%. Después de secar la membrana a temperatura ambiente, las bandas teñidas de la cadena pesada y de la cadena ligera fueron escindidas con una cuchilla de afeitar limpia. Las proteínas de las porciones de la membrana fueron sometidas a microsecuenciación N-terminal mediante degradación de Edman automatizada utilizando un secuenciador de proteínas Applied Biosystem Modelo 477A que utiliza química líquida de impulsos e identificación de aminoácidos por fenil-etiohidantoína en línea. Cada proteína fue sometida a 10-15 ciclos degradativos y los productos de corte convertidos de cada ciclo fueron analizados por HPLC de fase reversa. La secuenciación fue realizada por la Macromolecular Structural Facility de la University of Kentucky. La secuencia del péptido fue (Glu) ValGlnLeuGlnGlnSerGlyProGluLeuValLysProGly. Excepto por el primer Glu cuya identidad era incierta, los 14 residuos de aminoácidos del péptido coincidían exactamente con los aminoácidos 2-15 de la cadena pesada de 3H1. Esto confirmaba que el clon de ADNc recogido era el de la cadena pesada de 3H1.

El ADNc (SEC ID Nº:1) y la secuencia de aminoácidos derivada (SEC ID Nº:2) de la región variable de la cadena ligera de 3H1 se muestran en la Figura 1. El ADNc (SEC ID Nº:3) y la secuencia de aminoácidos derivada (SEC ID Nº:4) de la región variable de la cadena pesada de 3H1 se muestran en la Figura 2.

Ejemplo 3 Análisis de la respuesta inmune producida por 3H1 en primates no humanos Líneas celulares

La línea celular de carcinoma de colon humano LS174-T, que expresa CEA a elevada densidad, fue cultivada en medio RPMI 1640 suplementado con un 10% de suero de ternera fetal, un 1% de L-glutamina y penicilina y estreptomicina y utilizada para la detección de respuestas antitumorales. La línea celular de melanoma humano M21/P6 (proporcionada amablemente por el Dr. Ralph Reisfeld, Scripps Research Institute, La Jolla, California) y la línea de células T MOLT-4, ambas de las cuales son negativas para CEA, fueron cultivadas en el mismo medio y se utilizaron como controles negativos.

Anticuerpos

El 3H1 se obtuvo según se describió en el Ejemplo 1. El mAb2, 11D10 (IgG1,\kappa) es un mAb anti-Id murino que remeda al glóbulo de grasa de la leche humana (CEA) (Mukerjee y col. (1992) FASEB J. 6:A2059) y fue utilizado como control.

Preparación de 3H1 para inmunización

Inmunizamos monos con 3H1 precipitado con alumbre preparado según sigue. Herlyn y col. (1987) PNAS 84:8055-8059.

A alícuotas de 5 mg de mAb anti-Id (3H1) purificado, se añadió 1 ml de Alu-Gel S (Serva Fine Biochem, Inc., Garden City, Long Island, NY) al 2%. El volumen fue ajustado posteriormente a 10,0 ml con D-PBS y la mezcla fue incubada en un vórtex durante una hora a temperatura ambiente. La mezcla fue luego centrifugada a 2000 rpm a 24ºC durante 10 minutos. La cantidad de mAb unido a la capa de gel fue determinada midiendo espectrofotométricamente la cantidad de anticuerpo no unido en el sobrenadante. El anticuerpo precipitado con Alu-Gel fue almacenado a 4ºC hasta su utilización. Estos procedimientos fueron realizados asépticamente en una campana de flujo laminar y el producto final era estéril y fue marcado claramente como anti-Id 3H1 Alu-Gel y alicuotado en viales de vidrio estériles libres de pirógenos.

Inmunización de los monos

Monos cinomolgus fueron inmunizados con 3H1 anti-Id precipitado con alumbre así como con anti-Id 11D10 control precipitado con alumbre (específico para CEA). Los monos estaban estabulados en los White Sands Research Institutes, Alamogordo, New Mexico. Se inmunizó un par de monos macho y hembra, que pesaban 3-4 kg, con 2 mg de 3H1 o de 11D10 intracutáneamente en cuatro sitios diferentes los días 0, 14, 28 y 42 respectivamente. Solamente se utilizaron dos monos para cada anti-Id (Ab2) a una sola dosis por razones financieras. La dosis de 2 mg fue seleccionada sobre la base de estudios preclínicos (Chattopadhyaya y col. (1992) PNAS 89:2684-2688) y clínicos (Herlyn y col. (1987) PNAS 84:8055-8059; Mittelman y col. (1992) PNAS 89}:466-470) previos con diferentes vacunas anti-Id. Se recogieron muestras de sangre antes de la inmunización y 10 días después de cada inmunización.

Toxicidad

La inducción de respuestas Ab3 en los monos no causó efectos colaterales aparentes en los animales. Solamente se observó inflamación e irritación local leve en el sitio de inyección como resultado de las múltiples inmunizaciones. Los monos fueron chequeados rutinariamente mediante exámenes físicos y medidas del peso.

Purificación de anticuerpo anti-anti-Id (Ab3) a partir de sueros de monos hiperinmunizados

Se pasaron 20 mililitros de suero hiperinmune sobre una columna inmunoabsorbente que constaba de inmunoglobulina anti-Id inmunizante (3H1-IgG1) acoplada a Sefarosa 4B. Los anticuerpos anti-anti-Id (Ab3) fueron eluidos con tampón glicina 0,1 M-ácido clorhídrico (pH 2,4) y neutralizados a pH 7,0 con Tris 3 M. El anticuerpo eluido fue pasado luego sobre una columna inmunoabsorbente que constaba de inmunoglobulina murina de igual isotipo-alotipo acoplada a Sefarosa 4B para eliminar las reactividades anti-isotípicas y anti-alotípicas. El anticuerpo que pasó a través de la columna fue concentrado y utilizado como Ab3 purificado. El isotipo de Ab3 fue determinado mediante ELISA utilizando reactivos específicos anti-isotipo humanos (Tago Inc., Burlingame, CA).

Desarrollo de inmunidad humoral inducida por la inmunización con 3H1 precipitado con alumbre (a) Respuesta de Ab3 específicos a 3H1

Los sueros obtenidos de los monos inmunizados 10 días después de la cuarta inmunización fueron analizados para determinar la presencia de anticuerpos anti-anti-Id (Ab3). Para estos ensayos, los sueros fueron pretratados con inmunoglobulina de ratón normal (500 \mug/ml) para bloquear las reactividades anti-isotípicas y anti-alotípicas y posteriormente fueron analizados para detectar la presencia de (Ab3) mediante reacción con el anti-Id (3H1) inmunizante revestido sobre placas de microvaloración, por radioinmunoensayo (RIA). El Ab3 a una dilución 1:40 fue incubado con el mAb anti-Id 3H1 o con 11D10, revestidos sobre la placa de microvaloración, y posteriormente fue reaccionado con 3H1 ó 11D10 marcados con ^{125}I (50.000 cpm) en un ensayo de sándwich. Los resultados están expresados como cpm unidas en un ensayo de sándwich (A). Los resultados se presentan como cpm medias (n=3). La DE de los datos fue <10%. Para el ensayo de inhibición de la unión entre Ab2 y Ab1, se utilizó el Ab1 8019 purificado para revestir la placa (250 ng/pocillo) y se analizó la unión de Ab2 radiomarcado a Ab1 en presencia de diferentes diluciones de los sueros Ab3. Los sueros fueron preincubados con IgG de ratón normal antes del ensayo. Los resultados están expresados como porcentaje de inhibición a una dilución de 1:40. El Ab2 11D10 no relacionado fue utilizado como control. Después de lavar, la reacción anti-anticuerpo fue marcada utilizando un reactivo anti-Id marcado con ^{125}I en un RIA de sándwich homogéneo. En estos ensayos se utilizaron también sueros preinmunes y sueros de monos inmunizados con el Ab2 control 11D10. Además, se utilizó como control el Ab2 monoclonal 11D10 marcado con ^{125}I. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

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Diluciones seriadas de sueros Ab3 procedentes de monos (PRO 541 y PRO 667) inmunizados con 3H1 se unían específicamente al Ab2 inmunizante, 3H1, con una reactividad mínima con el Ab2 no relacionado, 11D10. Los sueros Ab3 de los monos inhibían también la unión de Ab2 radiomarcado a Ab1 más de un 80%, incluso a una dilución de 1:40 (Tabla 2). No hubo inhibición con sueros preinmunes o con sueros obtenidos de los monos (PRO 723 y PRO 872) inmunizados con el Ab2 no relacionado, 11D10.

La cinética de la respuesta de Ab3 se muestra en la Figura 16 utilizando suero procedente del mono PRO 667, demostrando la inhibición de la unión de Ab2 radiomarcado a Ab1. Se observó una reactividad similar con el suero del mono PRO 541. Estos resultados indican que los sueros Ab3 de mono comparten idiotipos con Ab1 (8019).

(b) Análisis de los idiotopos de Ab3

Si se obtenía una reacción positiva en el punto (a) anterior, los sueros Ab3 de esos monos eran analizados para determinar su capacidad para inhibir la unión de 3H1 marcado con ^{125}I a 8019 (Ab1) unido a placas de microvaloración o viceversa (inhibición de la unión de 8019 radiomarcado al 3H1 sobre la placa). Se utilizó como control un sistema Ab1-Ab2 no relacionado (BrE1-11D10) (Mukerjee y col. (1992) FASEB J. 6:A2059). Para este experimento, se utilizó 8019 (Ab1) purificado para revestir la placa (250 ng/pocillo) y se analizó la unión de 3H1 radiomarcado (\sim50.000 cpm) a 8019 para determinar la inhibición en presencia de diferentes diluciones de los sueros Ab3. En un experimento control paralelo, se utilizó como control un sistema Ab1-Ab2 no relacionado (mAb BrE1-11D10).

Esto demostraba que el Ab3 de los sueros de mono comparte idiotopos con 8019 (Ab1). Este ensayo de inhibición de la unión Ab1-Ab2 por sueros Ab3 demostraba también que Ab3 es un anti-anti-Id auténtico.

(c) Inducción de una respuesta de anticuerpos anti-CEA

Placas de microvaloración fueron revestidas con CEA puro (Rougier Biotech, Montreal, Canadá) y se hicieron reaccionar con los sueros Ab3 obtenidos después de la cuarta inmunización a diferentes diluciones mediante ELISA. Una placa de microvaloración de 96 pocillos fue revestida con 100 \mul de la preparación purificada de CEA (2 \mug de proteína por ml) por pocillo e incubada durante una noche a 4ºC. La solución fue retirada de la placa mediante succión y la placa fue bloqueada con BSA al 1% en PBS para saturar los sitios de unión de proteínas. Después de incubar durante 1 hora a temperatura ambiente, la solución fue retirada y los pocillos fueron lavados tres veces con PBS. Se añadieron por duplicado muestras de suero diluido (50 \mul), mezcladas con 50 \mul de Tween 20 0,05%/BSA 1% en PBS, y se incubaron durante una noche a 4ºC. Después de lavar la placa, se añadieron luego 0,1 ml de anticuerpos marcados con enzima diluidos 1/1000 en Tween 20 0,05%/BSA 1% en PBS y se incubaron a temperatura ambiente durante 4 horas. Las placas fueron lavadas de nuevo y reveladas con 0,1 ml de sustrato de fosfatasa disuelto en tampón dietanolamina (50 mg de sustrato por 50 ml de tampón). La absorbancia a 405 nm fue leída en un lector de ELISA. La sensibilidad del ensayo era superior a 0,1 ng de anticuerpo detectado por pocillo. Sueros preinmunes y sueros obtenidos de monos inmunizados con el Ab2 no relacionado 11D10 fueron utilizados como control. El antígeno no relacionado HMFG fue utilizado también como control en este ensayo.

El suero Ab3 del mono PRO 541 se unía específicamente a CEA purificado (Figura 17), mientras que los sueros control procedentes de monos preinmunes o de monos inmunizados con el Ab2 no relacionado, 11D10, no mostraban una unión apreciable al CEA. En experimentos paralelos, el mismo Ab3 procedente del mono PRO 541 fue comparado en una placa revestida con el antígeno CEA control y fue negativo. La cinética de la respuesta anti-CEA del mono PRO 667 está mostrada en la Figura 19.

Para determinar la reactividad con el CEA de la superficie celular, se analizaron células LS174-T mediante inmunocitometría de flujo. Células LS174-T positivas para CEA (1 x 10^{6} por pocillo) se hicieron reaccionar con Ab1 (8019) y Ab3 a 100 \mul, a 4ºC durante 60 minutos. Después de lavar, las células fueron incubadas con anticuerpo IgG anti-F(ab')_{2} de ratón producido en cabra o humano producido en cabra marcado con FITC (Tago Inc., Burlingame, CA) durante 30 minutos a 4ºC. Posteriormente fueron lavadas dos veces, fijadas en paraformaldehído al 2 por ciento y analizadas mediante inmunocitometría de flujo (FACS STAR, Becton Dickinson, San José, CA). Se utilizaron como controles en este ensayo células MOLT-4 y células de melanoma M21/P6 (no mostrado) negativas para el antígeno.

Según se muestra en la Figura 28, el Ab3 de monos inmunizados con 3H1 mostraba una unión característica (Figura 20-1) que era similar al patrón de unión obtenido con Ab1. No se obtuvo unión significativa con las células MOLT-4 que no expresan CEA (Figura 20-2). Tampoco hubo unión con las células de melanoma.

Comparamos entonces las reactividades de Ab1 (8019) con las de Ab3 purificado de mono (50 \mug/ml) mediante un ensayo con inmunoperoxidasa sensible en especímenes de tumor de colon humano y de colon normal humano. Los anticuerpos Ab3 fueron purificados de los sueros según se describió anteriormente. El método (reactivos biotina-estreptavidina, Vector, Burlingame, CA) ha sido descrito con detalle en otro lugar (Battacharya-Chatterjee (1990) y (1991)). Todas las secciones fueron contrateñidas con hematoxilina de Meyer. Se realizaron los ensayos de especificidad pertinentes, incluyendo el bloqueo de la peroxidasa endógena, la omisión de la primera capa o la sustitución del antisuero específico por suero homólogo no inmune y el sobrenadante del cultivo del mieloma P3-653 como control.

El patrón de reactividad de Ab3 (Figura 20-1) sobre el espécimen de cáncer de colon fue idéntico al obtenido con el Ab1 8019 (Figura 20-2), mientras que no hubo reactividad con el Ab3 de mono no relacionado (Figura 20-3). Tampoco hubo reactividad de Ab3 (Figura 20-4) ni de Ab1 con la sección de colon normal control. Las reacciones con Ab1 o con Ab3 purificado (Figuras 20-1, 20-2) tuvieron como resultado la tinción de las células tumorales así como de los materiales mucinosos secretados. La tinción fue apical en las estructuras similares a glándulas y granular (citoplásmica) en áreas menos diferenciadas. El Ab3 de mono fue ensayado posteriormente en tejidos normales de estómago, duodeno, ciego, músculo liso y estriado y se encontró que era negativo.

Para excluir adicionalmente la posibilidad de que los anticuerpos Ab3 reaccionen con un contaminante secundario de la preparación de CEA purificado, o de que estos anticuerpos tiñan una proteína de membrana distinta de CEA en las células tumorales, identificamos la especie molecular precipitada por el Ab3 purificado de mono. El CEA purificado fue marcado con ^{125}I mediante el método de la Cloramina T y se hizo reaccionar con Ab3 purificado (10 \mug) o con Ab1 (10 \mug) o con un Ab3 control no relacionado de un mono inmunizado con el Ab2 11D10 (10 \mug) o con PBS-BSA control, previamente adsorbidos sobre esferas de proteína G-Sefarosa. Después de los lavados, las esferas revestidas con antígeno-anticuerpo fueron analizadas mediante SDS-PAGE de acuerdo con el método de Laemmli ((1970) Nature 227:680-685) y autorradiografiadas. Según se muestra en la Figura 21, el material radiomarcado fue precipitado por el 8019 monoclonal (Ab1) y por el Ab3 de mono. Los pesos moleculares por SDS-PAGE fueron idénticos.

(d) Análisis de los epítopos de Ab3 utilizando células LS174-T

Para demostrar que los Ab3 generados en monos y Ab1 (8019) se unen al mismo determinante antigénico, se analizó la inhibición de la unión de 8019 a células LS174-T de la línea celular tumoral positiva para el antígeno o a CEA por Ab3 purificado mediante RIA según está descrito (Bhattacharya-Chatterjee y col. (1990) y (1991)). Este ensayo fue realizado en microplacas de 96 pocillos desechables revestidas con un microfiltro. La placa fue tratada primeramente con FCS al 10% y BSA al 1% en PBS. En un ensayo típico, alícuotas triplicadas de 50 \mul de varias diluciones de Ab1 purificado o de la preparación de Ab3 y 5 x 10^{5} células viables en 50 \mul de PBS fueron coincubadas con una cantidad fijada de Ab1 radiomarcado (\sim50.000 cpm) en pocillos individuales durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación continua.

Después de la incubación, la placa fue lavada tres veces con PBS/BSA 1% mediante succión. La radioactividad del papel de filtro lavado fue determinada en un espectrómetro de rayos-\gamma.

El porcentaje de inhibición del ensayo fue calculado de acuerdo con la fórmula:

\text{% de inhibición} = 1 - \left(\frac{R_{T} - R_{C}}{R_{MÁX} - R_{C}}\right) \times 100 en la cual R_{T} son las cpm medias del pocillo experimental con inhibidores. R_{C} son las cpm medias del fondo y R_{MÁX} es la unión máxima media sin inhibidores.

Si Ab3 tuviera un sitio de unión similar al de Ab1, competiría con Ab1 para unirse al CEA en las células LS174-T. Una cantidad fijada de Ab1 radiomarcado fue coincubada con diferentes cantidades de Ab3 purificado o de preparaciones de Ab3 control y células LS174-T (Figura 23). Ciento cincuenta nanogramos de Ab3 purificado inhibían la unión un 50% y 1 \mug de Ab3 purificado producía más de un 80% de inhibición, mientras que el Ab3 control utilizado a una concentración de 5 \mug no producía inhibición. De manera similar, se obtuvo un 50% de inhibición de la unión con 93 ng de Ab1. Estos resultados indican que el anticuerpo del mono inmunizado con Ab2 se une al mismo antígeno que Ab1 y, por tanto, la preparación de Ab3 contiene moléculas de anticuerpo con propiedades de Ab1.

Ejemplo 4 Análisis de la respuesta inmune producida por 3H1 en humanos con una enfermedad asociada al CEA avanzada Selección de pacientes

En el estudio participaron doce pacientes (Tabla 3). Todos los pacientes tenían carcinoma colorrectal avanzado positivo para CEA y habían fracasado las terapias estándar (Tabla 3).

1

Los estudios basales incluían un examen físico completo, radiografía de tórax, examen del abdomen mediante tomografía axial computerizada, nivel sérico de CEA, recuentos y química sanguínea de rutina. Todos los pacientes habían abandonado la terapia anterior durante al menos cuatro semanas y la graduación fue repetida al final de la terapia.

Programa de tratamiento

Los pacientes fueron tratados intracutáneamente con 1 mg, 2 mg o 4 mg de 3H1 precipitado con hidróxido de aluminio (Ejemplo 2) una semana sí y otra no en un total de cuatro inyecciones. Si los pacientes estaban estables al final de las cuatro inyecciones, continuaron las inyecciones una vez al mes y se evaluaron cada tres meses. Los pacientes eran retirados del estudio si mostraban crecimiento de sus tumores.

Preparación de Ab2

El 3H1 fue obtenido según se describió en el Ejemplo 1 y fue precipitado con alumbre según se describió en el Ejemplo 2. El producto final fue analizado antes de su utilización para determinar su esterilidad, su pirogenicidad y su seguridad general en cobayas. Se aprobó una Solicitud de Nuevo Fármaco para Investigación por la Food and Drug Administration de Estados Unidos (BB-IND 5055). Antes de la administración, el 3H1 fue tratado con calor en presencia de adyuvante a 45ºC durante 30 minutos en un baño de agua.

CEA purificado

El CEA purificado fue obtenido comercialmente de Rougier Bio-tech, Montreal, Canadá (nº de catálogo 70015). El CEA fue aislado de metástasis hepáticas humanas de tumores de colon mediante extracción con ácido perclórico y purificado dos veces mediante cromatografía de intercambio iónico, seguido por filtración en gel y varias etapas de cromatografía (HPLC). El CEA era un 100% puro, producía una única banda a peso molecular 180.000 mediante cromatografía líquida de alta resolución y SDS-PAGE y fue inmunoprecipitado como una única banda por anticuerpo anti-CEA de caballo así como de conejo. La preparación de CEA fue resuelta en dos bandas que migraban contiguas a peso molecular 180.000 y 200.000 mediante análisis de transferencia Western utilizando un anticuerpo monoclonal murino anti-CEA. Nosotros volvimos a examinar el material mediante análisis de transferencia Western utilizando el anticuerpo monoclonal 8019.

Toxicidad y respuestas clínicas

La toxicidad fue mínima, solamente con reacciones locales en el sitio de inyección con eritema e induración leves y fiebre y escalofríos leves aliviados por acetaminofeno. El tratamiento anti-idiotípico no tuvo ningún efecto nocivo sobre las células hematopoyéticas ni sobre la función renal o hepática. Los pacientes fueron monitorizados muy estrechamente para detectar actividad de la enfermedad. Once pacientes habían tenido enfermedad progresiva (Tabla 3). El paciente restante estaba estable a los diez meses de estar sometido a la terapia.

Monitorización seriada de CEA circulante

Se registró una medida indirecta del grado de enfermedad (nivel de CEA) antes de la inmunización y se determinó después de cada inmunización y posteriormente una vez al mes después de la finalización del programa de inmunización. Para esto, los sueros de los pacientes fueron inactivados por calor para precipitar las inmunoglobulinas que interferirían con los ensayos de monitorización de CEA que implicaban al Ab1 monoclonal murino. El CEA es estable con calor y fue medido en el sobrenadante centrifugado claro mediante un ensayo de rutina. La monitorización seriada de CEA se correlacionaba con la progresión de la enfermedad y todos los pacientes que progresaron clínicamente tuvieron una elevación de sus niveles séricos de CEA, excepto los pacientes cinco y diez que no secretaron CEA.

Para la cuantificación de CEA en suero extraído con calor, 1 ml de tampón acetato de sodio 0,2 M, pH 5,0, fue añadido a 0,5 ml de suero, mezclado en vórtex, incubado durante 15 minutos a 90ºC y centrifugado (1200 x g, 10 minutos). Los sobrenadantes fueron analizados el mismo día o se almacenaron congelados a -20ºC hasta el ensayo. Posteriormente se analizaron 100 \mul de sobrenadante mediante el inmunoensayo enzimático para determinar CEA según está descrito (Hansen y col. (1989) Clin. Chem. 35(1):146-151).

Ensayos para determinar la inmunidad humoral (a) Respuesta anti-3H1 total

El desarrollo de inmunidad humoral inducida mediante la inmunización con 3H1 precipitado con alumbre fue determinado analizando los sueros obtenidos de los pacientes antes de la terapia y después de cada tratamiento con la vacuna. Los sueros fueron analizados inicialmente para determinar las respuestas anti-anticuerpo murino humano total, incluyendo los anticuerpos anti-iso/alo y anti-anti-idiotipo mediante radioinmunoensayo de sándwich según está descrito por Hansen y col. (1994) Clin. Chem. 35(1):146-151. Brevemente, placas de microvaloración fueron revestidas con 3H1 e incubadas con diferentes diluciones de los sueros de los pacientes. Después de los lavados, la reacción antígeno-anticuerpo fue marcada utilizando 3H1 anti-Id marcado con ^{125}I en un radioinmunoensayo de sándwich homogéneo. Como el 3H1 es inyectado como IgG1 intacta, se espera que los pacientes produzcan respuestas de anti-anticuerpos de ratón humanos.

Sueros hiperinmunes (después de la cuarta inyección de 3H1) de nueve de los doce pacientes mostraron niveles significativos de respuestas de anti-anticuerpos de ratón humanos totales, incluyendo anticuerpos anti-iso/alo y anti-anti-idiotípicos contra el Ab2 inmunizante, 3H1, según se determinó mediante radioinmunoensayo de sándwich homogéneo.

(b) Respuesta de Ab3 específicos hacia Ab2

A continuación los sueros de estos pacientes inmunizados fueron analizados con el fin de determinar su capacidad para inhibir la unión de Ab1 marcado con ^{125}I, 8019, al Ab2 3H1 en la placa mediante radioinmunoensayo, o viceversa (inhibición de la unión de Ab2 radiomarcado a Ab1 en la placa). Estas reacciones se llevaron a cabo en presencia de un exceso de inmunoglobulina murina normal para bloquear los anticuerpos humanos contra los determinantes isotípicos y alotípicos.

Sueros brutos obtenidos de los pacientes después del cuarto tratamiento fueron preincubados con inmunoglobulina murina normal para bloquear los anticuerpos humanos contra los determinantes isotípicos y alotípicos. Utilizamos rutinariamente los sueros obtenidos después de la cuarta inmunización porque éste fue el número de inyecciones que recibieron los 12 pacientes. Para los pacientes que recibieron más de cuatro inyecciones, las respuestas inmunes permanecieron comparables o continuaron aumentando su título. Posteriormente se analizaron diluciones seriadas de los sueros para determinar la inhibición en el ensayo de unión de Ab1-Ab2. Todos los ensayos fueron realizados por triplicado. Para el ensayo de inhibición de la unión directa entre Ab1 y Ab2, se utilizó 3H1 purificado (Ab2) para revestir las placas (500 mg/pocillo) y se analizó la unión de 8019 (Ab1) radiomarcado a Ab2 para determinar la inhibición en presencia de diferentes sueros Ab3 hiperinmunes de los pacientes y de Ab1. Esto demostraría si los Ab3 de los sueros de los pacientes compartían idiotopos con 8019 (Ab1). Además, este ensayo de inhibición de la unión Ab1-Ab2 por sueros Ab3 indicaría si el Ab3 era un anti-anti-idiotipo auténtico. Se utilizó como control Ab2 no relacionado. Después de los lavados, la reacción antígeno-anticuerpo fue marcada utilizando un reactivo anti-idiotipo marcado con ^{125}I en un radioinmunoensayo de sándwich homogéneo igual que anteriormente. Se utilizaron como controles sueros pretratamiento, no inmunes, y sueros procedentes de donantes normales.

La Figura 23 muestra datos representativos de los primeros cinco pacientes. Los sueros de los pacientes N^{os} 1, 2, 3 y 5 a una dilución 1/10, inhibían la unión de 8019 yodado a 3H1 en un 62 - 100 por ciento y la inhibición de la unión disminuía al incrementar la dilución de los sueros. El suero del paciente Nº 4 mostró una inhibición no específica mínima a todas las diluciones utilizadas y los sueros preinmunes no mostraron inhibición. Aunque no puede excluirse en estos ensayos el impedimento estérico por la unión de Ab3, los resultados sugieren la presencia de anticuerpos anti-anti-idiotípicos verdaderos que comparten idiotipos con Ab1. Una vez más, nueve de los doce pacientes fueron positivos para respuestas de Ab3 mediante este ensayo.

(c) Inducción de anticuerpos anti-CEA por 3H1

Este ensayo fue realizado con el fin de determinar si algunos de los Ab3 inducidos en los pacientes por el Ab2 3H1 eran del tipo Ab1 y se unirían al CEA. Se utilizó una preparación pura de CEA obtenida de Rougier Biotech (según se describió anteriormente) para reducir el riesgo de obtener resultados falsos positivos debido a la unión no específica. El CEA purificado fue radioyodado con ^{125}I mediante el método de la Cloramina T. El CEA radiomarcado (1 x 10^{6} cpm) se hizo reaccionar con 0,5 ml de suero de los pacientes preadsorbido en esferas de proteína G-Sefarosa. Después de las reacciones, las esferas fueron lavadas y contadas en un espectrofotómetro de rayos-gamma. Cada muestra fue realizada por duplicado y se muestra la media de las cpm unidas. En estos ensayos se utilizaron como controles sueros preinmunes, solución salina tamponada con fosfato-seroalbúmina bovina, así como suero Ab3 obtenido de un paciente tratado con un anticuerpo monoclonal murino no relacionado para linfoma de células T.

Según se muestra en la Figura 25, la inmunización con 3H1 inducía anticuerpos que se unían al CEA radiomarcado. Nueve de doce pacientes desarrollaron anticuerpos anti-CEA medibles por este ensayo. Los pacientes N^{os} 4, 8 y 10 fueron anérgicos para la respuesta de anti-anticuerpos de ratón humanos y no produjeron anticuerpos contra CEA, mientras que los pacientes N^{os} 1, 2, 3, 5 y 12 mostraron una elevada unión, y los pacientes N^{os} 6, 7, 9 y 11 mostraron una unión mayor que el contaje de fondo obtenido con PBS-BSA (Muestra Nº 13) o con sueros preinmunes (datos no mostrados). La Muestra Nº 14 fue utilizada como control anti-CEA (8019) positivo. Se utilizaron como controles en estos ensayos sueros pretratamiento, no inmunes, y sueros procedentes de donantes normales.

(d) Análisis de citometría de flujo (FACS) con Ab1 y Ab3 de los pacientes

Para determinar la reactividad con CEA de la superficie de células cultivadas, células LS174-T derivadas de cáncer colorrectal positivas para CEA (1 x 10^{6} por pocillo) y células Raji de linfoma de células B negativas para CEA (1 x 10^{6} por pocillo) se hicieron reaccionar con Ab1 (8019) y con suero inmune de los pacientes (Ab3) a una dilución 1:100 a 4ºC durante 60 minutos. Después de lavar, las células fueron incubadas con anticuerpo IgG anti-F(ab')_{2} humano producido en cabra o de ratón producido en cabra marcado con FITC (Tago) durante 30 minutos a 40ºC. Fueron lavadas posteriormente dos veces, fijadas en paraformadehído al 2 por ciento y analizadas mediante citometría de flujo (FACS Star, Becton Dickinson). Se utilizaron como control sueros preinmunes de los pacientes.

Según se muestra en la Figura 26, el suero bruto de un paciente representativo inmunizado con 3H1 se unía a las células LS174-T (A) de manera similar al patrón de unión obtenido con 8019 (B) y no se unía a las células de linfoma de células B humanas que no expresan CEA (Fig. 3C). Se encontraron resultados similares con todos los pacientes positivos.

(e) Competición de Ab1 y Ab3 de los pacientes por la unión a células LS174-T

Si Ab3 tiene un sitio de unión similar al de Ab1, debería competir con Ab1 para unirse al CEA de células LS174-T. Una cantidad fijada de 8019 radiomarcado (\sim90.000 cpm) fue coincubada con diferentes concentraciones de Ab3 purificado de los pacientes o de preparaciones de Ab1 y células LS174-T.

El Ab3 fue purificado de los sueros de los pacientes según sigue. Se pasaron 50 ml de suero hiperinmune sobre una columna inmunoadsorbente que constaba de la inmunoglobulina anti-idiotipo inmunizante (3H1) acoplada a Sefarosa 4B. Los anticuerpos anti-anti-idiotípicos (Ab3) unidos a la columna fueron eluidos con tampón glicina 0,1 M-ácido clorhídrico (pH 2,4). El anticuerpo eluido fue neutralizado con Tris 3 M, dializado frente a PBS, pH 7,2 y pasado posteriormente sobre una columna inmunoadsorbente que constaba de inmunoglobulina de ratón normal del mismo alotipo acoplada a Sefarosa 4B para eliminar las reactividades anti-isotípica y anti- alotípica. El anticuerpo que pasó a través de la columna fue concentrado y utilizado como Ab3 purificado. El isotipo de Ab3 fue determinado mediante ELISA utilizando reactivos específicos anti-isotipo humanos (Tago).

Según muestra la Figura 27, el 8019-IgG1 purificado (Ab1) inhibía la unión un 80% a 0,75 \mug, mientras que el Ab3 purificado del paciente (procedente del paciente Nº 1) producía un 60 por ciento de inhibición a la misma concentración. Globalmente, las curvas de inhibición obtenidas con Ab1 y Ab3 eran muy similares a diluciones diferentes. Esto indicaba que el Ab3 del paciente se unía al mismo epítopo antigénico que Ab1 y contenía por tanto moléculas de anticuerpo con propiedades de Ab1.

(f) Inmunoprecipitación de CEA por Ab1 y Ab3

CEA purificado fue marcado con ^{125}I mediante el método de la Cloramina T y se hizo reaccionar con Ab3 purificado (10 \mug) o con Ab1 (10 \mug) o con un Ab3 control no relacionado procedente de un paciente con linfoma (10 \mug) o con control PBS-BSA, adsorbidos previamente sobre esferas de proteína G-Sefarosa. Después de los lavados, las esferas revestidas con antígeno-anticuerpo fueron analizadas mediante SDS-PAGE de acuerdo con el método de Lamella ((1970) Nature 227:680-685) y autorradiografiadas.

Se había demostrado previamente que el Ab1 8019 inmunoprecipitaba específicamente el CEA de peso molecular 180.000 mediante análisis por SDS-PAGE (Bhattacharya-Chatterjee (1990)). Con el fin de confirmar que el Ab3 inducido por 3H1 era específico para la molécula de CEA, la preparación de CEA purificado yodado fue inmunoprecipitada por preparaciones de Ab3 purificado obtenido de dos pacientes así como por Ab1 y analizada mediante SDS-PAGE. Los resultados de la Figura 27 indican que los Ab3 de ambos pacientes (Calles 2 y 3) precipitaban la misma banda de CEA de peso molecular 180.000 que el Ab1 8019 murino (Calle 1). No hubo reactividad cruzada (Calle 4) cuando se hizo reaccionar el CEA yodado con Ab3 purificado obtenido de un paciente tratado con un Ab2 no relacionado (4DC6). Cuando el antígeno CEA yodado, pretratado con cualquiera de las preparaciones de Ab3 de los dos pacientes positivos, se hizo reaccionar con 8019, no hubo inmunoprecipitación significativa, sugiriendo que la preparación yodada estaba desprovista del antígeno CEA (datos no mostrados).

(g) Inmunorreactividad de Ab3 con secciones de tumores

Las reactividades del monoclonal Ab1 (8019) y de Ab3 purificado en una solución de 10 \mug/ml fueron comparadas en especímenes quirúrgicos autólogos y alogénicos de adenocarcinomas de colon de pacientes mediante el ensayo de la inmunoperoxidasa, un método de tinción muy sensible (reactivos biotina-estreptavidina, Vector, Burlingame, CA) según está descrito con detalle en otro lugar (Bhattacharya-Chatterjee (1990)). Todas las secciones fueron contrateñidas con hematoxilina de Meyer. Se realizaron los análisis de especificidad pertinentes, incluyendo el bloqueo de la peroxidasa endógena, la omisión de la primera capa o la sustitución del antisuero específico por suero homólogo no inmune y el sobrenadante del cultivo del mieloma P3-653 como control.

El patrón de reactividad del Ab3 de los pacientes sobre tejidos de colon malignos autólogos fue idéntico al obtenido con especímenes de tumores alogénicos (Figuras 28-1 y 28-2, respectivamente). El Ab1 8019 mostró patrones de tinción idénticos (Fig. 28-3), mientras que no hubo reactividad con el Ab3 control obtenido de un paciente tratado con un Ab2 no relacionado (4DC6) (Fig. 28-4). Las reacciones con Ab1 o con Ab3 purificado (Figs. 28-1, 28-2, 28-3) tuvieron como resultado la tinción de las células tumorales así como de los materiales mucinosos secretados. La tinción fue apical en las estructuras similares a glándulas y granular (citoplásmica) en áreas menos diferenciadas. No hubo reactividad de Ab1 ni de Ab3 purificado en tejidos normales de colon (Figuras 28-5 y 28-6), ciego, duodeno, estómago, músculo estriado o músculo liso.

Ensayo para determinar la respuesta proliferativa de células T

Las respuestas inmunes celulares fueron medidas por la proliferación de células mononucleares de sangre periférica incubadas con el anticuerpo anti-idiotipo 3H1 precipitado con hidróxido de aluminio y con el anticuerpo anti-idiotipo 4DC6 control del mismo isotipo precipitado con hidróxido de aluminio.

Las células mononucleares de sangre periférica fueron aisladas de sangre obtenida después de cuatro inmunizaciones mediante el método estándar de centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque y se incubaron 5 x 10^{6} células por pocillo con diferentes concentraciones de 3H1-Alugel y 4DC6 control-Alugel control (de 10 \mug a 2 \mug) en medio RPMI con un 5 por ciento de suero de ternera fetal inactivado por calor y penicilina y estreptomicina. Se utilizó como control positivo el mitógeno no específico fitohemaglutinina-P a 2 \mug y 1 \mug por pocillo. Después de que las células fueran incubadas durante cinco días a 37ºC en una atmósfera que contenía un 5 por ciento de dióxido de carbono, fueron sometidas a un pulso de ^{3}H-timidina (1 \muCi por pocillo) durante 20 horas. La incorporación de ^{3}H-timidina fue medida en muestras pre y post-terapia. Los datos fueron expresados como cuentas por minuto medias (pocillos triplicados) de la incorporación de ^{3}H-timidina. La Desviación Estándar de los datos fue <10% para cada determinación.

Células mononucleares de sangre periférica aisladas de algunos pacientes seleccionados fueron incubadas también con diferentes concentraciones de CEA purificado (10 ng a 250 ng) de acuerdo con el protocolo anterior.

Se observaron respuestas proliferativas positivas en siete de doce pacientes. Los siete pacientes desarrollaron todos una respuesta de anticuerpos Ab3 (Tabla 3). En la Figura 30 se muestran datos representativos de dos pacientes (N^{os} 1 y 12). Las células preinmunes no tuvieron respuesta proliferativa al anticuerpo anti-idiotipo, mientras que las células hiperinmunes tuvieron una respuesta significativa. Cuatro de los siete pacientes respondedores (dos tratados con una dosis de 2 mg y dos con una dosis de 4 mg) mostraron también proliferación de células T en presencia de CEA purificado, sugiriendo una respuesta de células T específica para el antígeno. Hubo también respuesta al anticuerpo anti-idiotipo 4DC6 del mismo isotipo precipitado con hidróxido de aluminio; esta respuesta fue significativamente menor que la respuesta a 3H1, representando probablemente una respuesta a los componentes no idiotípicos de la molécula de inmunoglobulina. La diferencia de la respuesta a 3H1-Alugel comparada con la respuesta a 4DC6 control-Alugel fue significativa (p<0,003) igual que lo fue la respuesta a CEA en comparación con la respuesta a BSA (p<0,005). No hubo respuesta al propio alugel (datos no mostrados). El análisis citométrico de flujo de los cultivos demostró que más de un 90% de las células que proliferaban eran linfocitos T CD4 positivos. Los tres pacientes que fueron anérgicos para la respuesta de anti-anticuerpos de ratón humanos tampoco mostraron ninguna respuesta proliferativa de células T. De los cinco no respondedores, tres fueron tratados con 1 mg, uno con 2 mg y uno con 4 mg de dosis de 3H1-Alugel.

Claims (17)

1. Un anticuerpo monoclonal anti-idiotipo 3H1 producido por la línea celular de hibridomas ATCC Nº HB12003 o por la progenie de la misma.

2. Un anticuerpo anti-idiotipo que:

(a)

tiene una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera idéntica a la SEC ID Nº 2 y una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada idéntica a la SEC ID Nº 4; o que

(b)

tiene una región variable de la cadena ligera codificada por un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEC ID Nº 2 y una región variable de la cadena pesada codificada por un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEC ID Nº 4.

3. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 que contiene además una marca capaz de producir una señal detectable.

4. Una línea celular de hibridomas denominada ATCC Nº HB12003 o la progenie de la misma.

5. Una línea celular de hibridomas que produce un anticuerpo monoclonal anti-idiotipo que tiene una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera idéntica a la SEC ID Nº 2 y una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada idéntica a la SEC ID Nº 4.

6. Una composición farmacéutica que contiene una cantidad eficaz de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en un excipiente farmacéuticamente aceptable.

7. Una vacuna que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, y opcionalmente un adyuvante.

8. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 7, en la que el adyuvante es hidróxido de aluminio.

9. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, para ser utilizado en la producción de una respuesta inmune en un individuo.

10. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 9, para ser utilizado en la producción de una respuesta inmune anti-antígeno carcinoembrionario (CEA) en un individuo.

11. Un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 9 ó 10, para ser utilizado en el tratamiento o paliación de una enfermedad asociada al CEA.

12. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 10, para ser utilizado en el tratamiento de una enfermedad asociada al CEA avanzada.

13. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12, donde la enfermedad asociada al CEA es un tumor.

14. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9, 10, 11 ó 12, donde la respuesta inmune es la producción de un anticuerpo anti-CEA o la producción de células T específicas anti-CEA.

15. Un método para detectar la presencia de un anticuerpo anti-CEA unido a una célula tumoral, comprendiendo el método la puesta en contacto de una célula tumoral in vitro con un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, 2 ó 3 durante un tiempo suficiente para permitir la unión al anticuerpo anti-CEA, y la detección de la presencia de cualquier anticuerpo que esté unido al anticuerpo anti-CEA.

16. Un kit de diagnóstico para la detección o cuantificación de un anticuerpo anti-carcinoembrionario que contiene un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, 2 ó 3 en un embalaje adecuado.

17. Un método para detectar una respuesta inmune anti-antígeno carcinoembrionario en un individuo, comprendiendo el método la puesta en contacto de una muestra biológica procedente del individuo in vitro con un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, 2 ó 3 y la determinación de este modo de si está teniendo lugar una respuesta inmune anti-CEA.