ES2197241T3 - Procedimiento de purificacion de virus por cromatografia. - Google Patents

Procedimiento de purificacion de virus por cromatografia.

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Abstract

LA INVENCION TIENE POR OBJETO UN METODO DE PURIFICACION CROMATOGRAFICA DE VIRUS OBTENIDOS MEDIANTE CULTIVO SOBRE LINEAS CELULARES. EL METODO CONSISTE EN EFECTUAR UNA ETAPA DE CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO ANIONICO SEGUIDA DE OTRA DE CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO CATIONICO Y, POR ULTIMO, DE OTRA DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD POR QUELACION METALICA. EL METODO SE PRESTA ESPECIALMENTE BIEN A LA OBTENCION DE VIRUS PARA LA FABRICACION DE VACUNAS.

Description

Procedimiento de purificación de virus por cromatografía.
La invención se refiere al campo de la purificación de virus, y más particularmente de la purificación de virus obtenidos por cultivos en líneas celulares.
Las producciones de virus obtenidos a partir de cultivos sobre líneas celulares, tales como las células Vero, contienen no solamente los virus deseados sino también proteínas y ADN procedentes de las células de cultivo. Ahora bien, cuando los virus se destinan a ciertos usos, tales como la fabricación de vacunas, es indispensable que sean lo más puros posible. En efecto, existen normas que limitan a 100 10^{-12} g/dosis de vacuna la cantidad máxima autorizada de ADN celular en las vacunas que comprenden productos obtenidos a partir de líneas celulares continuas y heteroploides.
En la técnica anterior se conocen procedimientos de purificación de virus. Así, la patente US 4.664.912 divulga principalmente un procedimiento de purificación de virus de la rabia por centrifugación de zona en un gradiente de sacarosa. Dicho procedimiento presenta sin embargo el inconveniente de ser difícilmente automatizable; además, necesita una etapa de inactivación previa que puede producir interacciones entre el virus y el ADN celular que hagan después más difícil la etapa de eliminación de este ADN.
Esta referencia divulga igualmente un procedimiento de purificación que asocia una etapa de filtración sobre gel y una etapa de cromatografía de intercambio iónico. Dicho procedimiento de purificación no permite sin embargo obtener una eliminación máxima del ADN celular.
Un objetivo de la invención es por lo tanto proponer un nuevo procedimiento de purificación de virus con muy alto rendimiento y fácilmente automatizable.
Otro objetivo de la invención es el de proponer un procedimiento de purificación que permita obtener virus enteros, no degradados.
Para alcanzar estos objetivos, la invención tiene como objetivo un procedimiento de purificación de virus obtenidos a partir de un cultivo en línea celular, que consiste en separar por cromatografía de intercambio iónico los virus de las proteínas y ADN celulares que proceden del cultivo, caracterizado porque comprende al menos una etapa de cromatografía de intercambio aniónico y una etapa de cromatografía de intercambio catiónico.
Según una característica particular del procedimiento según la invención, la etapa de cromatografía de intercambio catiónico se efectúa después de la etapa de cromatografía de intercambio aniónico. Se obtienen así rendimientos de depuración optimizados en relación con la inversión del orden de las etapas.
Según un modo de realización particular, el procedimiento según la invención comprende además una etapa de cromatografía de afinidad por quelación metálica. Así, las cantidades de ADN residual se reducen realmente al máximo.
Según otro modo de realización preferido, el procedimiento según la invención consiste además en efectuar todas las etapas de cromatografía con el mismo valor de pH. Siendo así posible automatizar fácilmente el procedimiento y reducir de forma notable los costes, manteniendo su eficacia.
La invención se comprenderá mejor con la lectura de la descripción detallada que sigue.
Los virus que se van a purificar según el procedimiento de la invención son virus obtenidos mediante líneas celulares, principalmente líneas celulares continuas y heteroploides y que son por lo tanto susceptibles de estar asociadas a ADN celulares. Se pueden tratar principalmente de virus de la rabia, virus de la encefalitis japonesa o también virus de la gripe. Estos virus que se van a purificar pueden haber sido obtenidos por cultivo en células Vero sobre microsoportes. Se trata por ejemplo del virus de la rabia obtenido por cultivo como se describe en la patente US 4.664.912.
La producción de virus se filtra y luego se trata, según la invención, por cromatografía de intercambio aniónico y por cromatografía de intercambio catiónico.
La cromatografía de intercambio aniónico puede ser cromatografía de intercambio de aniones débiles realizada por ejemplo por medio de un gel que comprende el radical dietilaminoetil: gel DEAE Spherodex comercializado por SEPRACOR, gel DEAE Sepharose comercializado por PHARMACIA, gel EMD DEAE comercializado por E. MERCK. Se prefiere utilizar, aunque esto no sea habitual para la eliminación de ácidos nucléicos, un intercambiador de aniones fuertes, tal como alguno de los siguientes geles: gel High Q comercializado por BIO-RAD, gel Q Sepharose comercializado por PHARMACIA, gel EMD TMAE comercializado por E. MERCK.
Todos estos geles pueden utilizarse en tampón TRIS o en tampón fosfato. De forma ventajosa se utiliza un gel que permita una gran disponibilidad del grupo catiónico, tal como es el caso del EMD TMAE de E. MERCK que posee cadenas de 15 a 25 unidades del monómero siguiente:
CH_{2}=CHCONH(CH_{2})_{2}N^{+}(CH_{3})_{3}
Del mismo modo, según el procedimiento de la invención, la etapa de cromatografía de intercambio catiónico se realiza preferentemente por medio de un gel que permita una gran accesibilidad del grupo aniónico, tal como es el caso del EMD SO_{3} comercializado por E. MERCK, que posee cadenas de 15 a 25 unidades del monómero siguiente:
CH_{2}=CHCONH-C(CH_{3})_{2}CH_{2}SO_{3} ^{-}
Este gel puede igualmente equilibrarse por medio de tampón TRIS o de tampón fosfato.
Según un modo preferido de la invención, se procede a la cromatografía de intercambio aniónico previa a la cromatografía de intercambio catiónico, introduciéndose el eluato de la primera cromatografía, después de dilución eventual, directamente en la segunda columna cromatográfica. Este orden de operación permite obtener una optimización de la eliminación del ADN celular.
La suspensión de virus obtenida por elución de la columna de cromatografía de intercambio catiónico presenta un grado de pureza ya satisfactorio con respecto a las normas establecidas para la utilización de los virus en la fabricación de vacunas.
Sin embargo, según un modo preferido de la invención, se agrega al procedimiento de purificación descrito anteriormente una etapa suplementaria de cromatografía de afinidad por quelación metálica, utilizando por ejemplo el ión Ca^{2+} como ión metálico. Esta cromatografía puede realizarse utilizando como soporte de quelación un gel de agarosa, tal como el gel quelante Sepharose® FF comercializado por PHARMACIA, que posee la siguiente estructura:
1
Según el procedimiento de la invención, esta etapa de quelación se realiza en línea con las dos etapas precedentes de cromatografía de intercambio iónico, introduciéndose el eluato del intercambiador de cationes directamente en la columna de cromatografía de quelación.
Durante esta etapa, el ADN celular se queda fijado mientras que el virus atraviesa el gel sin ser retenido.
Esta etapa adicional permite fijar aún al menos la mitad del ADN residual que ciertamente ya está en muy pequeña cantidad pero que en cambio, en esta fase, es muy difícil de eliminar.
La suspensión de virus así purificada se diluye con un estabilizante, y después se inactiva según cualquier método conocido en la técnica anterior, por ejemplo, con \beta-propiolactona, antes de ser concentrada y liofilizada, para ser a continuación mezclada con las otras producciones resultantes del mismo cultivo de células VERO y que van a constituir un mismo lote de fabricación.
Las vacunas fabricadas a partir de dichos virus han sido inyectadas en humanos y han sido muy bien toleradas. Además, se ha verificado su actividad protectora en animales mediante un ensayo efectuado en ratones cuyos resultados han sido positivos.
De manera sorprendente y muy ventajosa, según la invención, es posible realizar el conjunto de la purificación a temperatura ambiente en línea y siempre al mismo pH, lo que hace que el procedimiento sea simple, fácilmente automatizable y seguro; principalmente es posible realizar el conjunto del procedimiento en buenas condiciones de esterilidad.
Gracias a este procedimiento de purificación, se obtienen virus enteros, no degradados cuyas espículas son visibles en el microscopio electrónico, con un grado de pureza muy alto.
Ejemplo 1
Se prepara una columna de cromatografía de intercambio aniónico introduciendo en una columna gel EMD TMAE comercializado por E. MERCK por la que se hace pasar en primer lugar sosa NaOH 1M con el objetivo de desinfectar. La columna se equilibra a continuación con tampón TRIS 20 mM a pH 7,5.
Se prepara una columna de cromatografía de intercambio catiónico introduciendo en una columna gel EMS SO_{3} comercializado por E. MERCK, por la cual se hace igualmente pasar sosa 1M y luego tampón TRIS 20 mM a pH 7,5.
Se prepara una columna de cromatografía de afinidad por quelación metálica introduciendo en una columna gel quelante Sepharose® FF comercializado por PHARMACIA, por la cual se hace pasar sosa 1M y luego agua, antes de cargarla con CaCl_{2} de una concentración de 3g/l; se lava a continuación con agua y después se hace pasar tampón TRIS 20 mM NaCl 0,5M a pH 7,5.
Ejemplo 2
Se filtra una producción de virus de la rabia cultivados sobre células VERO mediante una membrana cuyo umbral de filtración es de 0,65 \mum y después una membrana cuyo umbral de filtración es de 0,45 \mum.
Esta producción está formada por una suspensión de virus en un medio de cultivo que comprende tanto ADN celular como proteínas que proceden a la vez de las células VERO y del medio de cultivo. La producción bruta filtrada se pasa a través de la columna de cromatografía de intercambio aniónico preparada según se ha descrito en el ejemplo 1. La parte no fijada, que contiene proteínas y ADN se recoge a la salida de la columna con fines de dosificación. Se enjuaga la columna con tampón TRIS 20 mM NaCl 0,1M a pH 7,5 y luego se eluyen los virus que se han fijado haciendo pasar por la columna tampón TRIS 20 mM NaCl 0,4M a pH 7,5 hasta que el pico característico de los virus haya pasado. El eluato de la primera columna se diluye a ¼ en línea con tampón TRIS 20 mM a pH 7,5 antes de ser introducido en la columna de cromatografía de intercambio catiónico preparada según el ejemplo 1.
La parte no fijada de esta segunda columna se recoge con fines de dosificación. Cuando todo el eluato de la primera columna que contiene virus ha pasado a través de la segunda columna, se la enjuaga con tampón TRIS 20 mM NaCl 0,1M a pH 7,5 y luego se procede a la elución de los virus fijados haciendo pasar tampón TRIS 20 mM NaCl 0,5M a pH 7,5 hasta que el pico característico de los virus haya pasado.
El eluato de esta segunda columna se introduce directamente, sin dilución, en la columna de cromatografía de afinidad por quelación metálica preparada según el ejemplo 1: esta vez, el ADN se compleja con los iones Ca^{++} presentes en la columna mientras que el virus atraviesa la columna y se recoge a la salida para asociarlo a un estabilizante e inactivarlo. El ADN complejado con los iones Ca^{++} se eluye pasando por la columna una solución de EDTA 50 mM.
Las columnas de cromatografía de intercambio iónico se regeneran pasando tampón TRIS 20 mM NaCl 1M a pH 7,5 y se desinfectan con sosa 1M, antes de ser utilizadas para la depuración de otras producciones que proceden del mismo cultivo que se juntan todas para constituir un solo lote de fabricación.
Ejemplo 3
Se dosifican para cada producción, después de cada etapa de cromatografía, las cantidades de proteínas y de ADN celulares depuradas.
Las proteínas totales se dosifican mediante el método de Lowry y el ADN total por medio del aparato de THRESHOLD de MOLECULAR DEVICE.
Los resultados obtenidos haciendo una media de los rendimientos por etapas para cada recogida del cultivo, expresados en porcentaje residual para cada una de las etapas del procedimiento de depuración, son los siguientes:
\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|c|c|}\hline\multicolumn{1}{|c|}{Rendimiento
(%) }\+ ADN total  \+ Proteínas totales \\\hline  Columna de
intercambio aniónico  \+ 0,02  \+ 0,056 \\\hline  Columna de
intercambio catiónico  \+ 27  \+ 25 \\\hline  Columna de afinidad
por quelación  \+ 80 \+ \\  metálica \+ \+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Globalmente, gracias al procedimiento de depuración según la invención, no queda más que 0,004% del ADN celular y 1,4% de las proteínas presentes en las producciones brutas.
La depuración realizada es por lo tanto completamente satisfactoria.
Se verifica además la falta de efectividad de los virus obtenidos en cada etapa, mediante medida de su grado infeccioso por DICC 50 y observación en el microscopio electrónico.
Se observa que la integridad del virus se conserva bien a todo lo largo del procedimiento.
Cuando los virus así producidos se utilizan en la fabricación de vacunas contra la rabia, es posible preparar dosis que no contengan más de 30 a 40 10^{-12}g de ADN celular por dosis, es decir una cantidad netamente inferior a la norma que es de 100 10^{-12}g.

Claims (15)

1. Procedimiento de purificación de virus obtenidos a partir de un cultivo celular, que consiste en separar los virus de las proteínas y el ADN celulares que proceden del cultivo por cromatografía de intercambio iónico, caracterizado porque comprende al menos una etapa de cromatografía de intercambio aniónico así como una etapa de cromatografía de intercambio catiónico.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque los aniones son aniones fuertes.
3. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los cationes son cationes fuertes.
4. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el intercambio catiónico se realiza después del intercambio aniónico.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende además una etapa de cromatografía de afinidad por quelación metálica.
6. Procedimiento según la reivindicación precedente, caracterizado porque la quelación metálica se realiza por medio de iones calcio.
7. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los virus que deben purificarse se obtienen por cultivos en líneas celulares continuas y heteroploides.
8. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los virus que deben purificarse se obtienen por cultivos en células VERO.
9. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los virus que deben purificarse son virus de la rabia.
10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque los virus que deben purificarse son virus de la encefalitis japonesa.
11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque los virus que deben purificarse son virus de la gripe.
12. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque consiste en efectuar todas las etapas de cromatografía con el mismo valor de pH.
13. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se trata de un procedimiento en línea.
14. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se realiza a temperatura ambiente.
15. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se realiza en condiciones estériles.
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