JPH03277274A - 大腸菌由来物質の除去方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は例えば遺伝子操作技術により製造した蛋白水溶
液中の宿主（大腸菌）由来の物質の除去などに利用でき
るものである。

〈従来の技術〉 近年生体内の生理活性蛋白などを遺伝子操作の手法を用
いて大量に生産させ、医薬品として使用するケースか急
増しているがこの場合は従来の生体組織等から抽出して
いたのと異なり宿主として用いる微生物由来の成分、特
に菌体蛋白及び発熱性物質か蛋白中に混入してくること
か安全性の面から好ましくないとされている。よってこ
のような菌体由来の物質の混入を極めて微量に抑える必
要性か生じてきたかこれまでにこれらを効率的に除く方
法はなく種々のカラムクロマトグラフィーを組み合わせ
るなと極めて煩雑な方法しか知られてないない。

〈発明か解決しようとする課題〉 そこで遺伝子組換えの宿主として最も汎用性の高い大腸
菌を用いて生産された遺伝子組換え蛋白なとの水溶液か
ら大腸菌由来物質を効率的に除去する方法か求められて
いる。

〈課題を解決するための手段〉 本発明者らはこれらの問題を解決することを目的として
鋭意研究を行った結果、非極性ハイポーラスポリマー系
樹脂に上記の大腸菌由来物質か選択的に吸着され、極め
て効率的に目的とする蛋白質画分よりこれらを除去でき
ることを見い出し、本発明を完成した。即ち本発明は、
大腸菌由来物質特に大腸菌由来の菌体蛋白及び発熱性物
質（パイロジェン）の両者を含む水溶液を、非極性ハイ
ポーラスポリマー系樹脂に接触させ、該樹脂にこれらの
大腸菌由来物質を吸着させることを特徴とする大腸菌由
来物質除去方法に関するものである本発明で除去する大
腸菌由来物質の代表的なものとしては菌体蛋白及び発熱
性物質（パイロジエン）かあげられ、本発明によればこ
れらの両物質が同時に除かれる点で非常に画期的である
。

本発明で使用する大腸菌由来物質を含む水溶液としては
大腸菌由来物質を不純物として含む水溶液ならば制限は
ないか、通常は大腸菌を宿主として遺伝子組換えにより
生産した蛋白を含む水溶液かあげられる。このような遺
伝子組換蛋白水溶液の場合には、菌体破砕後の上清、部
分精製したものなどが挙げられるか粗精製したものをか
けるのか効率的である。

また大腸菌由来物質を含む水溶液か、上記の遺伝子組換
え蛋白水溶液のように有用物質の水溶液の場合には、含
有される有用物質は、大腸菌由来の菌体蛋白及び発熱物
質を非極性ハイポーラスポリマー樹脂に吸着させる際に
、該樹脂に吸着されにくいように樹脂の選択、該水溶液
のｐＨおよび塩濃度の調整なと必要である。

該水溶液中に含まれる遺伝子組換え蛋白としては特に制
限かないか、例えばスーパーオキシドジスムターセ（５
ＯＤ）およびカタラーゼなどかあげられる。ＳＯＤ特に
ヒ）Ｃｕ−Ｚｎ　ＳＯＤは近年虚血再潅流障害、炎症な
どに対する治療薬として期待され、遺伝子組換えにより
生産されるようになって来ており、このＳＯＤの精製に
本発明は好適である。

本発明で使用する非極性ハイポーラスポリマー系樹脂と
しては大腸菌由来物質か吸着するものであれば、特に制
限はなく、樹脂基材としては例えばポリスチレン系、ア
クリル系、メタクリル系、ベンジルシリカ系、ブチルシ
リカ系なとか挙げられるか好ましくはポリスチレン系の
樹脂であり、例としてアンバーライトＸＡＤ−２、ＸＡ
Ｄ−４、ＸＡＤ−９（［標、ローム・アジド・ハース社
製）、ダイヤイオンＨＰ−１０，ＨＰ−２０，ＨＰ−２
０ｓｓ、　ＨＰ−２１、）ＩＰ−３０，ＨＰ−４０，Ｈ
Ｐ−５０，ＭＣ４ゲル（ＣＪ（Ｐ−３０、ＣＨＰ−３ｃ
、　Ｃ）ＩＰ　−５ｃ、　　ＣＨＰ−２０Ｐ）、セパピ
ース５Ｐ８００．５Ｐ９００　、５Ｐ２０６．５Ｐ２０
７　　（三菱化成工業株式会社）シュオライドＳ　−８
６１、Ｓ　−８６２、ＥＳ−８６３、ＥＳ−８６５、ε
Ｓ−８６６（商標、ダイヤモンド・ジャムロック社製）
、レバチット０Ｃ−１０３１（商標、バイエル最多頻度
細孔径と０．４〜１．１ｍｊ／ｇの細孔容積をもつポリ
スチレン系の非極性ハイポーラスポリマーであり、例え
ばアンバーライトＸＡＤ　−２、ダイヤイオンＨＰ−１
０、ＨＰ−２０、ＨＰ−２０ｓｓ、　ＨＰ−２Ｌ　ＨＰ
　−３０、ＨＰ−４０などか収率及び精製効率の面です
ぐれている。また上記の担体をベースとしたＨＰＬＣを
用いた場合もオープンカラムと同様にして十分な効果を
得ることができる。

本発明の方法は非極性ハイポーラスポリマー系樹脂と接
触させる試料に０゜２ｍＭ−０，５Ｍの塩類及び０−５
０％の水溶性有機溶媒を加え、ｐＨを２〜９好ましくは
６〜８に調製することにより菌体由来物質を吸着し、遺
伝子組換え蛋白を吸着しないような至適な条件を設定す
ることかできる。この様に調製した試料溶液を該担体に
接触させて処理した後、同組成の溶媒で洗浄することに
よって行うことかできる。塩類としては中性塩や緩衝作
用のある塩類か含まれるか中性塩としては塩化ナトリウ
ム、塩化カリウム、アンモニウム塩なとか使用でき、緩
衝液としては酢酸系、クエン酸系、リン酸系なとか使用
できる。またここで用いる水溶性有機溶媒としてはメタ
ノール、エタノール、アセトニトリル、イソプロピルア
ルコール、アセトンなとか含まれる。

操作は例えば非極性ハイポーラスポリマー系樹脂を０．
２ｍＭ〜０．５Ｍの中性塩及び０〜５０％の水溶性有機
溶媒を含むｐＨ２〜９好ましくは６〜８の緩衝液で平衡
化した後、同一組成の緩衝液に遺伝子組換え蛋白を溶解
したものを通し、続いて平衡化に用いたのと同一の緩衝
液を樹脂量３〜５倍量流して洗浄する。この素通り画分
に遺伝子組換え蛋白は高収率で回収されてくる。また続
いて水溶性有機溶媒の濃度を上げることによって大腸菌
由来物質（菌体蛋白及び発熱性物質）か溶出されてくる
ので再使用は可能である。

本発明によって得られる遺伝子組換え蛋白は高純度であ
り、大腸菌由来物質は極めて効率的に除去されている。

また弱酸性〜塩基性の有用蛋白例えばＳＯＤなどの精製
に本発明方法を使用する場合、単独で使用してもよいか
、本発明方法により処理した液を必要に応じｌ）Ｈを２
〜６程度に調製した後、強塩基性陰イオン交換樹脂など
で更に精製してもよい。

〈実施例〉 本発明を実施例により更に詳細に説明するが本発明の範
囲はこれらの例に限定されるものではない。

（実施例１） ＨＰ−２０ｓｓの樹脂１０（Ｗに０．８％塩化ナトリウ
ム、２０％エタノールを含む５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
６，５）を５００１Ｌｌ流してカラムを平衡化した。大
腸菌で生産させたヒト型銅・亜鉛スーパーオキシドディ
ムスターゼ（以下ｒ−ｈＯｓＤと略す）４０万単位を含
む粗精製液１００７ｎＩを同上の緩衝液に透析した後、
カラムにかけ続いて５００−の同緩衝液で洗浄した。

この素通り画分に回収されたｒ　−ｈｓＯＤの活性回収
率はほぼ１００％であり、比活性は４０００Ｕ／■蛋白
であった。また、還元条件下のＳＤＳ電気泳動て精製ｒ
−ｈｓＯＤは１６にダルトンの単一バンドを示した。

さらに表１に示したように大腸菌由来蛋白は本カラム精
製前の０．０３％、発熱性物質は０．１％に減少してい
た。

なお本実施例においてＳＯＤ活性はＭｃＣｏｒｄとＦｒ
１ｄｏ−ｒｉｃｈの方法（ＪＢＣ２４４６０４９（１９
６９）　ニより、蛋白定量はＬｏｗｒｙらの方法（ＪＢ
Ｃ１９３２６５（１９５１）により行った。大腸菌由来
蛋白の測定は大腸菌成分を免疫して得られたポリクロー
ナル抗体を用いて酵素免疫測定法により、発熱性物質の
測定はパイロデイック（生化学工業株式会社）により行
った。

表１ （実施例２） ＨＰ−２０の樹脂１００イに０．８％塩化ナトリウム、
１０％メタノールを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）を５００−流してカラム平衡化した。ヒト赤血球
より単一に精製したカタラーゼ４００万単位を含む溶液
２０ｍ１に大腸菌の破砕抽出液１０ｍ１を加えて混合し
た後同上の緩衝液に透析し、カラムにかけた。続いて５
００１ｎｌの同緩衝液で洗浄したところこの素通り画分
にカタラーゼか溶出し、活性回収率は９５％であった。

このとき大腸菌由来蛋白はカラム精製前の０．０１％に
、発熱性物質は０．０５％に減少していた。

なお本実施例においてカタラーセ活性はＢｅｅｒｓと５
ｉｚｅｒの方法（ＪＢＣ１９５１３３（１９５２））に
より測定した。他の蛋白定量等は実施例１に記載した方
法により行った。結果については表２にまとめた通りで
ある。

表２ 〈発明の効果〉 実施例１て用いた組換えＣｕ−ＺｎｈＳＯＤおよび実施
例２て用いたカタラーゼの場合も共に菌体蛋白及び発熱
物質の両者か１回の処理で著しく減少し、良好な結果か
得られた。この例からも種々の蛋白に対して普遍的に適
用できることか示された。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、大腸菌由来物質を含む水溶液を、非極性ハイポーラ
   スポリマー系樹脂に接触させ、該樹脂に大腸菌由来物質
   を吸着させることを特徴とする大腸菌由来物質の除去方
   法