ES2197265T3 - Conjugado que comprende un anatagonista de aacido folico y un portador. - Google Patents

Conjugado que comprende un anatagonista de aacido folico y un portador.

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Abstract

LA INVENCION TRATA DE UNOS CONJUGADOS QUE CONTIENEN UN D ENANTIOMERO DE UN ANTAGONISTA DE ACIDO FOLICO Y UN PORTADOR. LA INVENCION TRATA ADEMAS DE LA PRODUCCION DE DICHOS CONJUGADOS, ASI COMO DE SU EMPLEO.

Description

Conjugado que comprende un antagonista de ácido fólico y un portador.
La invención se refiere a un conjugado que comprende un antagonista de ácido fólico y un portador, a un procedimiento para la producción de un conjugado de este tipo y a la utilización del mismo.
El ácido fólico es un compuesto existente en la naturaleza, que es importante en las células para la transferencia de grupos metilo y, por consiguiente, para el crecimiento celular. El ácido fólico presenta la siguiente fórmula:
1
El grupo CH del ácido glutámico representa un átomo de C. Por consiguiente, el ácido fólico existe en dos formas enantiómeras, a saber: como enantiómero D y como enantiómero L.
Sin embargo, de estas formas enantiómeras sólo el enantiómero L se encuentra en las células, por lo que sólo esta forma, y no el enantiómero D, es responsable del efecto del ácido fólico. La causa de ello radica en que el ácido fólico es absorbido en las células a través del receptor de folato, pero éste sólo absorbe el enantiómero L y no el enantiómero D del ácido fólico.
Los antagonistas de ácido fólico son compuestos que se derivan del ácido fólico, pero que contrarrestan el efecto de éste en el lugar de destino, es decir, en las células. Por consiguiente, los antagonistas de ácido fólico se encuentran en forma de enantiómero L y no en forma de enantiómero D. Como ejemplos de antagonistas de ácido fólico se mencionan la aminopterina y la ametopterina, también denominada metotrexato.
El metotrexato, es decir, el enantiómero L de la ametopterina, se utiliza con frecuencia para el tratamiento de tumores e inflamaciones. Sin embargo, se han observado importantes efectos secundarios, dado que el metotrexato también es absorbido por tejido sano y es tóxico para éste. Únicamente el documento DE-A-41 22 210.5 describe conjugados de metotrexato y albúmina que son absorbidos en mayor medida por los tumores que por el tejido sano y, por consiguiente, son menos tóxicos. No obstante, existe una gran necesidad de productos que presenten menos efectos secundarios.
De acuerdo con Lee et al., J. Med. Chem. (1974), 17(3), pp. 326-330, el D-MTX es menos activo en el tratamiento de la leucemia que el L-MTX.
De acuerdo con Jackman, et al., Adv. Exp. Med. Biol. (1993), 338, pp. 579-584, los enantiómeros D de determinados compuestos, aunque se caracterizan por una mayor estabilidad y una mejor inhibición de timidilato-sinteasa, ello no conduce a una mejor inhibición del crecimiento de células tumorales.
El documento EP-A-0 251 455 se refiere a conjugados de anticuerpos de derivados amínicos de análogos de ácido fólico.
Por consiguiente, la presente invención tiene por objetivo poner a disposición un producto para el tratamiento de tejido enfermo, en particular tumores, que presente efectos secundarios mínimos.
Esto se logra según la invención mediante los objetos de las reivindicaciones.
Por consiguiente, un objeto de la presente invención consiste en un conjugado que comprende el enantiómero D de un antagonista de ácido fólico y un portador.
La presente invención se basa en el conocimiento del solicitante de que el enantiómero D de un antagonista de ácido fólico en un conjugado que presenta un portador es absorbido preferentemente por tejidos enfermos, en particular células tumorales, y desarrolla en éstos un efecto contra la enfermedad. El solicitante también sabe que el enantiómero D de un antagonista de ácido fólico solo, es decir, no incluido en un conjugado según la invención, no tiene ningún efecto secundario en el tejido sano.
La expresión ``conjugado'' indica que el antagonista de ácido fólico y el portador están unidos de forma covalente, por ejemplo mediante enlaces de amida y/o éster o a través de un engarce.
La expresión ``enantiómero D de un antagonista de ácido fólico'' abarca compuestos que se derivan de ácido fólico, actúan como antagonista de ácido fólico y se encuentran en forma de enantiómero D. De acuerdo con la invención, el enantiómero D de un antagonista de ácido fólico incluye como componentes pteridina, principalmente pterina, ácido p-amino-benzoico y un aminoácido D, principalmente ácido glutámico D, que están modificados químicamente con respecto a los componentes presentes en el ácido fólico. Estas modificaciones consisten por ejemplo en sustituciones, como la sustitución de átomos de H por grupos (C_{1}-C_{4})-alquilo, principalmente grupos metilo, átomos halógenos, como F, Cl, Br, I, grupos OH y NH_{2}, la sustitución de grupos OH por los grupos alquilo arriba mencionados, grupos NH_{2}, átomos de H y átomos halógenos, y la sustitución de grupos NH_{2} por los grupos alquilo arriba mencionados, grupos OH, átomos de H y átomos halógenos. Además, uno o los dos grupos ácidos del ácido glutámico pueden encontrarse en forma de derivado de ácido, por ejemplo en forma de éster o amida. Los antagonistas de ácido fólico utilizados según la invención pueden presentar una o más de las modificaciones arriba mencionadas.
Preferentemente, los antagonistas de ácido fólico son ametopterina D (denominada en lo sucesivo metotrexato D)
2
y D-e,t-FMTX (un análogo de metotrexato en el que el ácido glutámico (Glu) ha sido sustituido por D-eritro,treo-4-fluoro-glu).
El conjugado según la invención puede presentar uno o más de estos antagonistas de ácido fólico. Si presenta varios, éstos pueden ser iguales o diferentes entre sí.
La expresión ``portador'' abarca proteínas no consideradas como exógenas y poliéteres.
Las proteínas están presentes preferentemente en forma nativa. En la forma nativa, las proteínas no presentan ningún entrecruzamiento intermolecular y/o intramolecular. Favorablemente, las proteínas presentan un peso molecular hasta 100.000 dalton, en particular entre 30.000 y 100.000 dalton. También resulta ventajoso que las proteínas sean proteínas humanas. Como ejemplos de proteínas se mencionan: albúmina, fibrinógeno, transferrina, inmunoglobulina y lipoproteínas, siendo preferente la albúmina humana. También se pueden utilizar fragmentos de las proteínas arriba mencionadas. Además, la secuencia de las proteínas o de los fragmentos de éstas puede presentar modificaciones de uno o más aminoácidos en comparación con la secuencia conocida de las proteínas o los fragmentos de éstas.
Los poliéteres son, por ejemplo, polietilén-glicoles, principalmente aquellos que presentan un peso molecular entre 100 y 20.000 dalton. Preferentemente, los polietilén-glicoles están esterificados o eterificados en el grupo hidroxilo terminal con un grupo (C_{1}-C_{12})-alquilo, principalmente con un grupo metilo.
Los conjugados según la invención pueden presentar uno o más, principalmente dos, de los portadores arriba mencionados. Si presenta varios portadores, éstos pueden ser iguales o diferentes entre sí. Si presenta varios poliéteres, éstos se eligen ventajosamente de tal modo que el peso molecular de todos los poliéteres sea de aproximadamente 20.000 dalton o más.
En el conjugado según la invención, el antagonista de ácido fólico puede estar unido con el portador directamente de forma covalente o a través de un engarce, es decir, que entre el portador y el antagonista de ácido fólico se encuentra un engarce. Como engarces son adecuados todos los compuestos que puedan unir el antagonista de ácido fólico y el portador.
Preferentemente, el engarce es disociable en una célula. La expresión ``célula'' comprende células individuales y complejos celulares. Las primeras son por ejemplo células endógenas que no se encuentran integradas en un complejo. Los complejos celulares incluyen tejido, órganos y tumores.
Los especialistas conocen engarces del tipo arriba mencionado. También conocen factores, por ejemplo enzimas, que provocan la disociación de determinados enlaces químicos en células, Por consiguiente, pueden construir engarces disociables en una célula. De forma especialmente preferente, los engarces incluyen un grupo azo. Resulta especialmente ventajoso que el engarce presente la siguiente estructura:
-Y-R-N=N-
en la que
R es un grupo orgánico, preferentemente un grupo aromático y de forma especialmente preferente fenileno o un derivado de éste, e
Y es un grupo seleccionado entre C(O), S(O)_{2}, P(O)OH y As(O)OH.
La estructura arriba mostrada de un engarce preferente corresponde a la estructura que presenta el engarce en un conjugado según la invención. Como mínimo cuando R es fenileno o un derivado de éste, la estructura también incluye un compuesto activo especialmente adecuado para la terapia de enfermedades tumorales, inflamatorias o autoinmunes. Después de la disociación del engarce y en caso dado la descomposición de la proteína todavía unida al engarce, el compuesto puede desplegar toda su actividad. Los conjugados según la invención se pueden producir uniendo de forma covalente el antagonista de ácido fólico con el portador y en caso dado el engarce. Los especialistas conocen los procedimientos adecuados y los materiales necesarios para ello.
Cuando el antagonista de ácido fólico presenta como mínimo un grupo carboxilo, por ejemplo el presente a través del ácido glutámico, los conjugados se pueden producir sometiendo a reacción el antagonista de ácido fólico con carbodiimida e hidroxi-succinimida para obtener ésteres succinimidílicos reactivos, y sometiendo éstos a su vez a reacción con el portador. En caso de conjugados con varios antagonistas de ácido fólico, la producción de los ésteres succinimidílicos puede tener lugar conjuntamente o por separado.
La reacción de los antagonistas de ácido fólico con carbodiimida e hidroxi-succinimida tiene lugar en un disolvente aprótico polar, preferentemente dimetil-formamida (DMF). La relación molar de antagonista de ácido fólico : carbodiimida : hidroxi-succinimida es de aproximadamente 1 : 1,5 : 10. Después, el éster succinimidílico formado se somete a reacción en una solución acuosa tampón, preferentemente NaHCO_{3}, con el portador, por ejemplo albúmina. La concentración de portador es de aproximadamente 10 a 70 mg/ml. El grupo carboxilo así activado puede reaccionar entonces con grupos OH o NH del portador formando enlaces de amida ácida o éster ácido, con lo que se obtienen conjugados según la invención. Los conjugados se pueden purificar repetidas veces, por ejemplo mediante ultrafiltración, y finalmente filtrar de forma estéril, después de lo cual quedan listos para la administración.
Los conjugados según la invención se caracterizan por permanecer durante un tiempo prolongado en el sistema circulatorio del paciente. Además se acumulan en tejidos enfermos, principalmente tumores y focos inflamatorios. También se caracterizan por presentar efectos secundarios inferiores incluso a los de los conjugados con antagonistas de ácido fólico L, tales como dados a conocer en el documento DE-A-41 22 210.5, manteniendo al mismo tiempo su efecto contra el tejido enfermo, principalmente tumores y focos inflamatorios.
Por consiguiente, los conjugados según la invención son sumamente adecuados para el tratamiento de tumores, como tumores hematológicos y sólidos, inflamaciones, por ejemplo enfermedades de tipo reumático, como poliartritis crónica, o psoriasis, y enfermedades autoinmunes.
La presente invención se explica adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1 Producción de un conjugado según la invención a partir de metotrexato D y albúmina sérica humana
El metotrexato D (D-MTX) se diluyó en DMF en una concentración de 20 mg/ml. A la solución amarilla transparente se le añadió una cantidad molar 1,5 veces mayor de diciclohexil-carbodiimida y una cantidad molar aproximadamente 10 veces mayor de hidroxi-succinimida. Después de un tiempo de reacción de aproximadamente 12 horas finalizó la reacción de producción de éster succinimidílico (D-MTX-HSIE), lo que se podía reconocer por la cantidad cristalizada de diciclohexil-urea (DCH). El control analítico de la reacción se llevó a cabo mediante DC.
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|l|}\hline 
Placas  \+ Kieselgel 60 (gel de sílice) con indicador \\   \+
fluorescente \\  Eluyente  \+ Acetato de etilo / MeOH : 75/25 \\ 
Valores  \+ D-MTX  0,0 \\  R _{f}   \+
D-MTX-HSIE 0,35-0,38
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
La solución amarilla transparente de D-MTX-HSIE en DMF se añadió lentamente bajo agitación continua a la solución proteínica (50-70 mg de albúmina sérica humana en 0,17 M NaHCO_{3}, pH 8,5) y, después de un tiempo, se formó un enturbiamiento consistente en diciclohexil-carbodiimida no reaccionada y DCH todavía disuelto en DMF. Después de un tiempo de reacción de como mínimo 30 minutos, el enturbiamiento se separó a través de un filtro estéril (0,22 \mum) y el DMF mediante ultrafiltración con un filtro de membrana adecuado (YM30; Amicon).
El control de pureza se llevó a cabo mediante HPLC:
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|l|}\hline 
Precolumna  \+ 50 x 4 mm Zorbax Diol \\  Columnas  \+ 1. Zorbax GF
450 \\   \+ 2. Zorbax GF 250 \\  Eluyente  \+ Tampón de fosfato 0,2
M, pH 7,4 \\  Caudal  \+ 1,0 ml/min \\  Presión  \+ Aproximadamente
65 bar
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Se obtuvo un conjugado según la invención de metotrexato D y albúmina sérica humana.
Ejemplo 2 Comparación de la toxicidad de un conjugado según la invención de metotrexato D y albúmina sérica humana y la toxicidad un conjugado de metotrexato y albúmina sérica humana
Para este ensayo se utilizó el conjugado según la invención de metotrexato D y albúmina sérica humana (D-MTX-HSA) del Ejemplo 1. También se utilizó el conjugado de metotrexato y albúmina sérica humana (MTX-HSA) dado a conocer en el documento DE-A-41 22 210.5.
El D-MTX-HSA y el MTX-HSA se administraron en cada caso a 5 ratas Sprague-Dawley sanas. En cada caso se inyectaron 4 mg de conjugado (con respecto a la proporción de MTX o D-MTX de los conjugados) por kg de peso corporal a intervalos de 2 días.
Los resultados se muestran en la Tabla 1.
TABLA 1 
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|l|c|c|c|c|c|}\hline\multicolumn{7}{|l|}{Resultados
del cálculo de la toxicidad de MTX-HSA y
D-MTX-}\\\multicolumn{7}{|l|}{HSA después del
3 ^{er}  día}\\\hline   \+ Dosis/kg  \+ IM  \+ DI  \+ PE  \+ PP  \+
Muertes \\\hline  MTX-HSA  \+ 2 x 4 mg  \+ 5  \+ 5 
\+ 5  \+ 5  \+ 5 \\\hline  D-MTX-HSA
 \+ 2 x 4 mg  \+ 0  \+ 0  \+ 0  \+ 0  \+ 0
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Abreviaturas
IM: infecciones de mucosas; DI: diarrea; PE: pelo erizado; PP: pérdida de peso.
Tal como se puede observar en la Tabla 1, en el caso de la administración de MTX-HSA, las ratas sufrieron fuertes efectos secundarios ya a partir del 3^{er} día. El 4º día se encontraron 2 ratas muertas en su jaula. Las otras 3 ratas tuvieron que ser sacrificadas, dado que sufrían efectos secundarios muy fuertes. En cambio, ninguna de las ratas tratadas con el conjugado D-MTX-HSA según la invención mostró efectos secundarios.
Por consiguiente, los conjugados según la invención tienen pocos efectos secundarios.
Ejemplo 3 Terapia tumoral con un conjugado según la invención de metotrexato D y albúmina sérica humana en comparación con un conjugado de metotrexato y albúmina sérica humana
Para este ensayo se utilizaron los conjugados indicados en el Ejemplo 2. Como animales de ensayo se utilizaron ratas portadoras del carcinosarcoma Walker 256. La terapia comenzó el 6º día después del trasplante del tumor con volúmenes de tumor entre 1.000 y 2.500 mm^{3} (diámetro del tumor 1 x 1 a 1 x 2 cm). A cinco ratas se les administró MTX-HSA (3 inyecciones a intervalos de 2 días con una dosis de 2 mg MTX-HSA (con respecto a la proporción de MTX) por kg de peso corporal). El conjugado D-MTX-HSA según la invención se administró en la dosis doble según el protocolo arriba indicado. Con esta dosis ya se produjeron considerables efectos secundarios en el caso del MTX-HSA, pero no en el caso del conjugado D-MTX-HSA según la invención (véase el Ejemplo 2).
Los resultados se muestran en la Tabla 2.
TABLA 2 
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|l|c|c|c|c|}\hline\multicolumn{6}{|l|}{Resultados
de la terapia tumoral con el conjugado MTX-HSA
y}\\\multicolumn{6}{|l|}{el conjugado
D-MTX-HSA según la
invención}\\\hline   \+ Dosis/kg  \+ Remisión  \+  \+ ES  \+ Muertes
\\\hline  MTX-HSA  \+ 3 x 2 mg  \+ 3  \+ 2  \+ 3  \+
2 \\\hline  D-MTX-HSA  \+ 3 x 2 mg 
\+ 5  \+ 0  \+ 0  \+ 0 \\\hline\multicolumn{6}{|l|}{Abreviaturas:
ES: efectos
secundarios;}\\\multicolumn{6}{|l|}{\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;Muertes:
Muerte por recidiva
tumoral}\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Los resultados mostrados en la Tabla 2 muestran que en el grupo de MTX-HSA el tumor fue reabsorbido en 3 ratas (remisión). En este grupo, 2 ratas sufrieron una recidiva y hubieron de ser sacrificadas. En 3 ratas se produjeron efectos secundarios. En cambio, en el caso de las ratas tratadas con el conjugado D-MTX-HSA según la invención, todas las ratas fueron curadas del tumor sin que se observara ningún efecto secundario, aunque se empleó una dosis doble en comparación con el MTX-HSA.
Por consiguiente, los conjugados según la invención presentan efectos secundarios mínimos y con estos conjugados se puede lograr una excelente terapia tumoral.

Claims (12)

1. Conjugado que comprende un enantiómero D de un antagonista de ácido fólico y un portador, caracterizado porque el portador es una proteína nativa no considerada como exógena o un poliéter y el antagonista de ácido fólico comprende uno o más derivados de pteridina, ácido p-amino-benzoico y un aminoácido D.
2. Conjugado según la reivindicación 1, caracterizado porque el aminoácido D es un ácido glutámico.
3. Conjugado según la reivindicación 1, caracterizado porque el antagonista de ácido fólico es ametopterina D o aminopterina D.
4. Conjugado según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el conjugado presenta varios antagonistas de ácido fólico.
5. Conjugado según la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína es albúmina sérica.
6. Conjugado según la reivindicación 1, caracterizado porque el poliéter es un polietilén-glicol.
7. Conjugado según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque presenta varios portadores.
8. Conjugado según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque entre el antagonista de ácido fólico y el portador se encuentra un engarce.
9. Conjugado según la reivindicación 8, caracterizado porque el engarce es disociable en una célula.
10. Conjugado según la reivindicación 9, caracterizado porque el engarce comprende un grupo azo.
11. Procedimiento para producir los conjugados según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el antagonista de ácido fólico, el soporte y en caso dado el engarce se unen de forma covalente.
12. Utilización de los conjugados según una de las reivindicaciones 1 a 10 para la producción de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades tumorales, inflamaciones y/o enfermedades autoinmunes.
ES97107657T 1997-05-09 1997-05-09 Conjugado que comprende un anatagonista de aacido folico y un portador. Expired - Lifetime ES2197265T3 (es)

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