ES2201128T3 - Agente terapeutico para alteraciones del metabolismo de lipidos. - Google Patents

Agente terapeutico para alteraciones del metabolismo de lipidos.

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ES2201128T3
ES2201128T3 ES95942270T ES95942270T ES2201128T3 ES 2201128 T3 ES2201128 T3 ES 2201128T3 ES 95942270 T ES95942270 T ES 95942270T ES 95942270 T ES95942270 T ES 95942270T ES 2201128 T3 ES2201128 T3 ES 2201128T3
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cholesterol
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lipid metabolism
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Akira Shiota
Nobuaki Fujise
Hiroaki Masunaga
Kanji Higashio
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION HACE REFERENCIA A UN AGENTE TERAPEUTICO PARA EL TRATAMIENTO DE LOS TRASTORNOS DEL METABOLISMO LIPIDICO QUE INCLUYE COMO INGREDIENTE EFECTIVO EL TCF-II. EL AGENTE TERAPEUTICO DE LA PRESENTE INVENCION ES UTIL PARA EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS DEL METABOLISMO LIPIDICO CAUSADOS POR LA DIABETES, ENFERMEDADES ENDOCRINAS TALES COMO LA DISFUNCION ADRENAL O TIROIDEA , TRASTORNOS METABOLICOS CRONICOS , INSUFICIENCIA RENAL CRONICA, INCLUIDA LA NEFROSIS, UREMIA, CANCER, DISCRASIA, EFECTOS ADVERSOS DE AGENTES ANTITUMORALES, TRASTORNOS GASTROINTESTINALES (INCLUYENDO LOS HEPATICOS Y PANCREATICOS), ETC. EJEMPLOS TIPICOS DE TRASTORNOS DEL METABOLISMO LIPIDICO SON LA HIPERCOLESTEROLEMIA, HIPOLIPIDEMIA O LA HIPOLIPOPROTEINEMIA DE ALTA DENSIDAD. EL AGENTE TERAPEUTICO QUE AQUI SE MENCIONA NORMALIZA TANTO LA HIPERLIPIDEMIA COMO LA HIPOLIPIDEMIA. ADEMAS MEJORA EL HIGADO GRASO.

Description

Agente terapéutico para alteraciones del metabolismo de lípidos.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la producción de un agente terapéutico para el tratamiento de alteraciones del metabolismo de lípidos que comprende TCF-II como ingrediente efectivo. El agente terapéutico de la presente invención es útil para el tratamiento de alteraciones del metabolismo de lípidos tales como hipercolesterolemia, hipolipidemia, hipo-alta-densidad-lipoproteinemia, etc., las cuales son inducidas por diabetes, enfermedades endocrinas tales como disfunción de tiroides y disfunción adrenal, alteraciones crónicas del metabolismo, fallo renal crónico incluyendo nefrosis, uremia, cáncer, discrasia, efectos adversos de agentes antitumorales, deterioros gastrointestinales (incluyendo hepáticos y pancreáticos), etcétera.
Antecedentes de la invención
Más del 60% de las causas de mortandad de los japoneses son enfermedades de adultos tales como hipertensión, arteriosclerosis, diabetes, etcétera. Generalmente, la enfermedad de adultos está causada principalmente por el deterioro de factores endógenos, tales como la función endocrina y/o la función del metabolismo de lípidos cuyo mecanismo de control es aún desconocido en muchos aspectos. La categoría de agente terapéutico para el tratamiento de hiperlipidemia en términos de mecanismo de acción se clasifica como inhibición de la absorción de colesterol o ácido coleico, inhibición de la síntesis de colesterol y acción sobre el metabolismo de proteínas de muy baja densidad (VLDL). La hiperlipidemia acompañada con la disminución de proteínas de alta densidad (HDL)-colesterol es un factor de riesgo significativo de enfermedades arterioscleróticas que comprenden enfermedad de corazón isquémico, hipertensión, encefalopatía isquémica, etcétera. Se ha encontrado que el efecto farmacológico de un agente terapéutico para el tratamiento de la hiperlipidemia no sólo es la disminución de lípidos en suero sino también el aumento del bajo HDL-colesterol, lo cual es un factor progresivo de hiperlipidemia, y/o baja lecitin-colesterol-aciltransferasa (LCAT) para prevenir así la progresión de la hiperlipidemia a enfermedades arterioscleróticas al eliminar el estancamiento del metabolismo.
Por supuesto, no se ha desarrollado todavía un agente farmacéutico para mejorar el metabolismo de lípidos que mejore el metabolismo de lípidos de modo pertinente. Como agentes terapéuticos para el tratamiento del metabolismo anormal de lípidos que se usan clínicamente en el momento actual, Pravastatina sal sódica, que inhibe la enzima reductora de la 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA o clofibrato, que tiene acción clarificadora sobre los lípidos del suero, se ejemplifican para hiperlipidemia y la alimentación que incluye alta infusión calórica se ejemplifica para la hipolipidemia.
Varios agentes terapéuticos se usan dependiendo de los síntomas sin atender a la enfermedad primaria. De este modo, no se ha dado ningún agente farmacéutico para mejorar y/o tratar el metabolismo anormal de lípidos causado por desequilibrio de disfunción endocrina asociada con el metabolismo de lípidos e hidratos de carbono. Como resultado de varias causas, la diabetes muestra características patológicas que son inducidas por el desequilibrio de insulina y glucagon y disfunción endocrina incluyendo disfunción pancreática, que conduce a la alteración metabólica del hígado, lípidos, músculos, piel, riñones etcétera. Un papel del tejido adiposo es almacenarse en forma de lípidos en caso de exceso de energía y descomponer lípidos y suministrarlos al organismo vivo como fuente de energía cuando se requiera. En el caso de la diabetes la síntesis está inhibida en el tejido adiposo y la descomposición está estimulada a causa de la deficiencia de insulina y el exceso de glucagón. Esto es, por la disminución de la actividad de la insulina disminuye la entrada de glucosa en el tejido adiposo, dando por resultado una disminución de la producción de ácido \alpha-glicerofosfórico, NADH y NADPH y disminución de la síntesis de ácidos grasos y reesterificación. Por otra parte, la deficiencia de insulina y exceso de glucagón activan lipasas sensibles a hormonas para descomponer lípidos. Se piensa que el mecanismo de desarrollo del hígado graso es que el deterioro tiene lugar en cualquiera de los procesos de síntesis de triglicéridos o síntesis y secreción de VLDL en el hígado.
Se piensa que la estimulación de la síntesis de ácidos grasos en el hígado, incremento de la movilización de ácidos grasos del tejido adiposo periférico al hígado, disminución de la capacidad para oxidar ácidos grasos y disminución de la síntesis y secreción de lipoproteínas en el hígado son ejemplos del mecanismo precedente. Por ejemplo, en el ácido graso asociado con obesidad, se incrementa la movilización de ácidos grasos del tejido adiposo periférico a causa del incremento del contenido del tejido adiposo periférico. Recientemente, se centra la atención en la relación entre el desarrollo del hígado graso y el incremento de ácidos grasos en la vena portal debido a la acumulación de lípido visceral. Además, la acidez de la acetilCoA-carboxilasa que es una enzima determinante de la velocidad en la síntesis de novo de ácidos grasos en el hígado está aumentada en la obesidad, sugiriendo aumento de la síntesis de ácidos grasos en el hígado. Por otra parte, en la obesidad se induce hiperinsulinemia para compensar el incremento de la resistencia a insulina en el tejido adiposo periférico.
Es sabido que el hígado graso está acompañado de obesidad con hiperinsulinemia en una alta proporción en comparación con la obesidad con secreción de insulina normal. De este modo, con respecto al metabolismo hidratos de carbono y lípidos acoplado anormalmente de no se ha dado ningún agente farmacéutico para aumentar estratégicamente el metabolismo de lípidos al estimular la síntesis de lipoproteínas del suero transportadoras de lípidos en la sangre, mejorando la movilización de las mismas para la composición de lípidos y metabolismo de los mismos, aumentando la actividad de LCAT asociada con la esterificación, disminuyendo el nivel de colesterol libre, incrementando el nivel de HDL-colesterol, estimulando la excreción coleica, disminuyendo el nivel de lípidos en suero, efluyendo triglicéridos acumulados en las células hepáticas y mejorando el hígado graso.
Considerando estas situaciones, los presentes inventores han investigado vehementemente sobre un agente terapéutico para el tratamiento del metabolismo de hidratos de carbono y lípidos acoplado anormalmente y han encontrado que el TCF-II se relaciona específicamente con la movilización de lipoproteínas del suero transportadoras de lípidos en la sangre con la composición de los lípidos y el metabolismo de los mismos. La inhibición de la síntesis del mismo, disminución de la actividad LCAT asociada con la esterificación y disminución de HDL con ella acompañadas, se contemplan como serios factores de riesgo de enfermedades de adultos acompañadas de alteraciones del metabolismo de lípidos tales como hiperlipidemia, arteriosclerosis, etcétera. Los presentes inventores encontraron que el TCF-II aumentaba significativamente la actividad de LCAT in vivo, aumentaba la hipolipoproteinemia de alta densidad, además, estimulaba la movilización por el incremento de lipoproteínas del suero y normalizaba el nivel de lípidos en suero. Un objeto de la presente invención es proporcionar un agente terapéutico que sea eficaz para normalizar el metabolismo anormal de lípidos que contenga como ingrediente efectivo el TCF-II.
Resumen de la invención
Un objeto de la presente invención es producir un agente terapéutico para el tratamiento de alteraciones del metabolismo de lípidos que contenga TCF-II como un ingrediente efectivo.
Otro objeto es proporcionar un agente terapéutico para tratamiento que tenga una acción depresora de los altos niveles de lípidos en suero y normalizadora de la hipolipidemia y que tenga eficiencia para mejorar el hígado graso.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra el método de fraccionamiento de las fracciones VLDL del suero en el Ejemplo 4.
La Figura 2 muestra el método de fraccionamiento de la fracción HDL y de la fracción HDL_{3} del suero en el Ejemplo 4.
La Figura 3 muestra la concentración de triacilglicerol en suero en el Ejemplo 4.
La Figura 4 muestra la concentración de colesterol tipo éster en suero y colesterol libre en suero y actividad LCAT en sangre en el Ejemplo 4.
La Figura 5 muestra el protocolo de administración en el Ejemplo 5.
La Figura 6 muestra el contenido de triacilglicerol en tejido y concentración de fosfolípidos en suero y colesterol total en suero en el Ejemplo 5.
La Figura 7 muestra la concentración de albúmina en suero, HDL-colesterol en suero, colesterol libre en suero y colesterol total en suero en el Ejemplo 6.
La Figura 8 muestra el protocolo de administración en el Ejemplo 7.
La Figura 9 muestra la actividad de LCAT en el Ejemplo 7.
La Figura 10 muestra el protocolo de administración en el Ejemplo 8.
La Figura 11 muestra la concentración de HDL-colesterol en suero, colesterol en suero y colesterol total en suero.
Descripción detallada de la invención y realizaciones preferidas
Un agente terapéutico para el tratamiento de alteraciones del metabolismo de lípidos que contenga TCF-II como ingrediente efectivo de la presente invención es útil para un agente terapéutico para el tratamiento de alteraciones del metabolismo de lípidos causadas por diabetes, enfermedades endocrinas tales como disfunción de tiroides y disfunción adrenal, alteraciones crónicas del metabolismo, fallo renal crónico incluyendo nefrosis, uremia, cáncer, discrasia, efectos adversos de agentes antitumorales, deterioros gastrointestinales (incluyendo hepáticos y pancreáticos), etcétera. Como alteraciones del metabolismo de lípidos descritas anteriormente se pueden poner como ejemplos hipercolesterolemia, hipolipidemia o hipolipoproteinemia de alta densidad.
El TCF-II como ingrediente efectivo de la presente invención es una proteína conocida, derivada de fibroblastos humanos y las características de la misma se muestran del modo siguiente:
\newpage
i) Peso molecular (electroforesis en SDS)
Bajo condiciones
no reductoras: 78.000\pm2.000, ó
74.000\pm2.000
Bajo condiciones
reductoras: 52.000\pm2.000(banda común)
30.000\pm2.000 (banda B)
26.000\pm2.000 (banda C)
ii) Punto isoeléctrico: 7.4-8.6
iii) Longitud en aminoácidos: 723
El TCF-II descrito anteriormente se puede obtener concentrando caldo de cultivo de fibroblastos humanos, adsorbiéndolo en un intercambiador de iones y purificando la sustancia eluida por cromatografía de afinidad (WO90/10651) o por manipulación genética (WO92/01053).
Como TCF-II de un ingrediente efectivo de la presente invención se puede usar TCF-II derivado de fibroblastos humanos o TCF-II producido por manipulación genética basada en la secuencia genética descrita en la patente WO90/10651 usando células microbianas u otras. Además, se puede usar también TCF-II obtenido por manipulación genética descrito en la patente WO92/01053. En el caso anterior, también se puede usar TCF-II con cadena de hidrato de carbono distinta o sin cadena de hidrato de carbono debido a la diferencia de célula hospedadora u organismo microbiano.
Por supuesto, el TCF-II con cadena de hidrato de carbono se puede usar preferiblemente porque la cadena de hidrato de carbono se relaciona con la tasa metabólica en un organismo vivo. El TCF-II obtenido por estos métodos se puede concentrar y purificar por métodos usuales de aislamiento y purificación. Se relacionan como ejemplos, método de precipitación usando disolvente orgánico, desalinización, filtración en gel, cromatografía de afinidad usando anticuerpos monoclonales y electroforesis, etcétera. La purificación por cromatografía de afinidad usando anticuerpos monoclonales se puede llevar a cabo usando anticuerpos monoclonales descritos en la publicación para información de la solicitud de patente japonesa 97(1993). El TCF-II obtenido se puede liofilizar o preservar en un congelador. Un agente terapéutico para el tratamiento de alteraciones del metabolismo conexionado de lípidos e hidratos de carbono se puede administrar por vía intravenosa, intramuscular o subcutánea, en forma de inyecciones. Estos preparados farmacéuticos pueden ser producidos conforme a métodos farmacéuticos de preparación conocidos. Si es necesario, se pueden añadir al mismo agente controlador del pH, tampones, estabilizantes, etcétera. La dosis de administración del preparado farmacéutico de la presente invención a un paciente puede variar dependiendo de los síntomas, condición de salud, edad o peso corporal, etcétera, del mismo. Si está purificado, se pueden administrar sin limitaciones específicas 0,6 mg-600 mg/humano adulto/día de TCF-II. Preferiblemente, un preparado farmacéutico que contiene 6 mg-60 mg de TCF-II se puede administrar una vez o más al día.
La presente invención se describirá en detalle exponiendo ejemplos pero la extensión de la presente invención no está limitada a estos ejemplos.
Ejemplo 1 Purificación de TCF-II
Se obtuvo TCF-II purificado por cultivo celular conforme al método descrito en la patente WO90/10651 y el método según Higashio et al. (Higashio, K. et al., B.B.R.C., vol. 170, págs. 397-404 (1990)). Se inocularon células de fibroblastos humanos IMR-90 (ATCC CCL 186) 3 x 10^{6} en una botella giratoria que contenía 100 ml de medio DMEM con 5% de suero de ternera y se cultivaron haciéndola girar a una velocidad de rotación de 0,5-2 rpm durante 7 días. Cuando el número total de células llegó a 1 x 10^{7}, se recolectaron las mismas en la superficie del fondo por tratamiento con tripsina, se añadieron 100 g de cerámica esterilizada de 5-9 mallas a las mismas y se mantuvo el cultivo estacionario de las mismas durante 24 horas. Después, se añadieron a las mismas 500 ml del caldo de cultivo anterior y se continuó el cultivo. Cada 7-10 días se recolectó todo el medio de cultivo y se suplementó con medio fresco. Se mantuvo la producción de este modo durante 2 meses y se recolectaron 4 l de caldo de cultivo por cada botella. La actividad específica del caldo de cultivo obtenido de la forma descrita anteriormente fue de 32 \mu/ml.
El caldo de cultivo (750 l) se concentró por ultrafiltración usando una membrana filtrante (corte a PM 6.000; Amicon) y se llevó a cabo purificación por cromatografía en columna en serie usando CM-Sephadex C-50 (Pharmacia), ConA-Sepharose (Pharmacia), columna Mono S (Pharmacia) y Heparin-Sepharose (Pharmacia) para proporcionar TCF-II purificado.
Ejemplo 2 Producción de TCF-II recombinante
Conforme al método descrito en la publicación de la patente WO92/01053, se cultivaron células transformadas con el gen de TCF-II y se obtuvo TCF-II purificado. Se cultivaron células Namalwa transformadas y se obtuvieron 20 l de caldo de cultivo. Este caldo de cultivo se purificó por cromatografía con CM-Sephadex C-50 (Pharmacia), cromatografía con ConA-Sepharose CL-6B (Pharmacia) y HPLC empaquetada con Mono S (Pharmacia) y se obtuvieron aproximadamente 11 mg de TCF-II activo.
Ejemplo 3 Producción de preparados farmacéuticos
A continuación se muestran ejemplos de producción de inyecciones de TCF-II recombinante obtenida en el anterior Ejemplo 2.
1 TCF-II 20 \mug
albúmina de suero humano 100 mg
la composición anterior se disolvió en solución de tampón fosfato 0,01M con pH de 7,0 y el volumen completo de la misma se llevó hasta 20 ml. Después de la esterilización se dividió la muestra en viales de 2 ml, liofilizándose cada uno, seguido del sellado de los mismos.
2 TCF-II 40 \mug
Tween 80® 1 mg
albúmina de suero humano 100 mg
la composición anterior se disolvió en una solución salina fisiológica para inyecciones y el volumen completo de la misma se llevó hasta 20 ml. Después de la esterilización se dividió la muestra en viales de 2 ml, liofilizándose cada uno, seguido del sellado de los mismos.
3 TCF-II 20 \mug
Tween 80® 2 mg
sorbitol 4 g
la composición anterior se disolvió en PBS 0,01M con pH de 7.0 y el volumen completo de la misma se llevó hasta 20 ml. Después de la esterilización se dividió la muestra en viales de 2 ml, liofilizándose cada uno, seguido del sellado de los mismos.
4 TCF-II 40 \mug
Tween 80® 1 mg
glicina 2 g
la composición anterior se disolvió en una solución salina fisiológica para inyecciones y el volumen completo de la misma se llevó hasta 20 ml. Después de la esterilización se dividió la muestra en viales de 2 ml, liofilizándose cada uno, seguido del sellado de los mismos.
5 TCF-II 40 \mug
Tween 80® 1 mg
sorbitol 2 g
glicina 1 g
la composición anterior se disolvió en una solución salina fisiológica para inyecciones y el volumen completo de la misma se llevó hasta 20 ml. Después de la esterilización se dividió la muestra en viales de 2 ml, liofilizándose cada uno, seguido del sellado de los mismos.
6 TCF-II 20 \mug
Tween 80® 4 g
albúmina de suero humano 50 mg 
\newpage
la composición anterior se disolvió en PBS 0,01M con pH de 7,0 y el volumen completo de la misma se llevó hasta 20 ml. Después de la esterilización se dividió la muestra en viales de 2 ml, liofilizándose cada uno, seguido del sellado de los mismos.
7 TCF-II 40 \mug
glicina 2 g
albúmina de suero humano 50 mg
la composición anterior se disolvió en una solución salina fisiológica para inyecciones y el volumen completo de la misma se llevó hasta 20 ml. Después de la esterilización se dividió la muestra en viales de 2 ml, liofilizándose cada uno, seguido del sellado de los mismos.
8 TCF-II 40 \mug
albúmina de suero humano 50 mg
la composición anterior se disolvió en PBS 0,01M y el volumen completo de la misma se llevó hasta 20 ml. Después de la esterilización se dividió la muestra en viales de 2 ml, liofilizándose cada uno, seguido del sellado de los mismos.
Ejemplo 4 Estimulación de la secreción de lipoproteína y actividad de LCAT en plasma en ratas normales por TCF-II
A ratas Wistar machos (8 semanas de edad, 300 g, 5 ratas/grupo) se les inyectaron por vía intravenosa 500 \mug/kg de TCF-II dos veces al día (1.000 \mug/kg/día) durante 4 días. A las ratas del grupo de control se les inyectó solamente vehículo. Doce horas después de la última inyección se extrajo sangre de la cava posterior bajo anestesia con éter. Se recolectaron suero y plasma para los siguientes análisis de lípidos en lipoproteínas y actividad LCAT respectivamente. Para el análisis de lipoproteínas se separaron las VLDL conforme a los métodos de Wilson et al. (Clin. Chem., vol. 20, 394-395, 1974) y se separaron las HDL_{2} y HDL_{3} conforme a los métodos de Gidez et al. (J. Lipid Res., vol. 23, 1206-1223, 1982). Las representaciones esquemáticas de los procedimientos anteriores están ilustradas en las Figuras 1 y 2. Las concentraciones de triacilglicerol, colesterol total y colesterol libre se determinaron enzimáticamente con los equipos disponibles comercialmente (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japón). La concentración de colesterol esterificado se calculó conforme a la siguiente relación:{[concentración de colesterol total]-[concentración de colesterol libre]}. La actividad de LCAT en plasma se determinó conforme a los métodos de Glomset-Wright (Methods in Enzymology, vol. 15, 543, 1969).
La concentración de triacilglicerol en las VLDL era significativamente más alta en ratas a las que se inyectó TCF-II que en las ratas de control (Figura 3). Este resultado sugería que el TCF-II estimula la secreción de VLDL y liberación de triacilglicerol del tejido hepático a la sangre. Además, la actividad de LCAT en plasma estaba significativamente aumentada y la concentración de HDL-colesterol, especialmente colesterol esterificado, acusadamente aumentada en ratas a las que se inyectó TCF-II (Figura 4), lo que demostró que el TCF-II estimulaba la secreción de LCAT por el hígado para producir así HDL.
Ejemplo 5 Reducción por TCF-II del triacilglicerol hepático altamente acumulado en ratas con hígado graso inducido por alcohol
Se preparó dieta líquida conforme al método de Liber et al. (Trans. Assoc. Am. Physician. Vol. 76, 289-301, 1963). Con la dieta líquida que contenía 5% de alcohol se alimentaron ratas Wistar machos (7 semanas de edad, 280 g, 10-13 ratas/grupo) durante 5 semanas y se indujo en ellas hígado graso. Las ratas de control se alimentaron con la dieta líquida de control de las mismas calorías. A las ratas de hígado graso se les inyectaron por vía intravenosa 50 y 500 \mug/kg de TCF-II dos veces al día (100 y 1.000 \mug/kg/día, respectivamente) durante los últimos 7 días de la alimentación con alcohol. A las ratas del grupo de control se les inyectó solamente vehículo.
Doce horas después de la última inyección de TCF-II se sacrificaron los animales y se extirparon los hígados. Se extrajeron los lípidos del hígado con 30 volúmenes de cloroformo y metanol (2:1) y se determinaron los contenidos de triacilglicerol, fosfolípidos y colesterol total con los equipos disponibles comercialmente (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japón). El protocolo de administración se muestra en la Figura 5.
El triacilglicerol hepático altamente acumulado en ratas con hígado graso disminuyó por la inyección de TCF-II dependiendo de la dosis. Los niveles hepáticos de fosfolípidos y colesterol, por supuesto, permanecieron inalterados (Figura 6). Estos resultados también sugieren que el TCF-II incrementa la secreción de triacilglicerol por el hígado y mejora el hígado graso.
Ejemplo 6 Reducción por TCF-II de la alta concentración de colesterol en suero en ratas con colestasis inducida por \alpha-naftilisotiocianato (ANIT)
A ratas Wistar machos (7 semanas de edad, 280 g, 10 ratas/grupo) se les administraron por vía oral 100 mg/kg de ANIT durante 5 semanas y se las indujo a colestasis. A las ratas con colestasis se les inyectaron por vía intravenosa 50, 150, 500 y 1.500 \mug/kg de TCF-II dos veces al día (100, 300, 1.000 y 3.000 \mug/kg/día, respectivamente) durante 3 días inmediatamente después de la administración de ANIT. Doce horas después de la última inyección se extrajo sangre de la cava posterior bajo anestesia con éter. Se recolectaron los sueros para la siguiente medida de concentración de lípidos y de albúmina en suero. Se determinaron las concentraciones en suero de triacilglicerol, colesterol libre, colesterol total y albúmina con el analizador Hitachi 7150 Autoanalyzer.
Las concentraciones en suero de triacilglicerol, colesterol libre, colesterol total de las ratas colestásicas eran significativamente más altas que las de ratas normales. La inyección de TCF-II redujo las concentraciones de lípidos en suero e incrementó la concentración de albúmina en suero de una forma dependiente de la dosis (Figura 7). Por estos resultados, TCF-II mejora la hiperlipidemia acompañada de colestasis.
Ejemplo 7 Estimulación por TCF-II de la actividad de LCAT en plasma de perros
A Beagles hembras y machos (1-5 años de edad, aproximadamente 10 kg, 5 perros/grupo) se les inyectaron por vía intravenosa 50, 150 y 500 \mug/kg de TCF-II dos veces al día (100, 300 y 1.000 \mug/kg/día, respectivamente) durante 7 días. A los perros del grupo de control se les inyectó solamente vehículo. Antes y durante la inyección de TCF-II se extrajo sangre de la vena del miembro anterior y se recolectaron los plasmas para los siguientes análisis de actividad de LCAT. El protocolo de administración se muestra en la Figura 8.
La actividad de LCAT en plasma se determinó conforme a los métodos de Glomset-Wright (Methods in Enzymology, vol. 15, 543, 1969). Las actividades en plasma de LCAT de los animales a los que se inyectó TCF-II se incrementaron considerablemente (Figura 9) lo que demostró que el TCF-II estimula la secreción de LCAT por el hígado y el metabolismo del hígado en perros normales.
Ejemplo 8 Elevación por TCF-II del bajo colesterol en suero, concentración de glucosa y bajo contenido de glucógeno en hígado en ratas con cirrosis inducida por dimetilnitrosamina (DEM)
A ratas Wistar machos (8 semanas de edad, 300 g, 8-10 ratas/grupo) se les administraron por vía intraperitoneal 10 \mug/kg de DEM 3 veces por semana durante 4 semanas y se indujo cirrosis.
A las ratas con cirrosis se les inyectaron por vía intravenosa 5, 50 y 100 \mug/kg de TCF-II dos veces al día (10, 100 y 1.000 \mug/kg/día, respectivamente) por 4 semanas, durante la administración de DEM. El protocolo de administración se muestra en la Figura 10. Doce horas después de la última inyección se extrajo sangre de la cava posterior bajo anestesia con éter. Se recolectaron los sueros para las siguientes medidas de concentración de colesterol en suero. Se determinaron las concentraciones en suero de HDL-colesterol, colesterol libre y colesterol total con el analizador Hitachi 7150 Autoanalyzer. Las concentraciones en suero de colesterol esterificado se calcularon conforme a la relación descrita en el Ejemplo 4.
Las concentraciones en suero de HDL-colesterol y colesterol esterificado de las ratas con cirrosis eran significativamente más bajas que las de ratas normales, pero la concentración de colesterol libre más alta. La inyección de TCF-II elevó las concentraciones de HDL-colesterol y colesterol esterificado en suero y redujo significativamente la concentración de colesterol libre en suero (Figura 11). Por estos resultados, la TCF-II mejora la hipolipoproteinemia de alta densidad acompañada de cirrosis.
Aplicabilidad industrial
La presente invención es para proporcionar un agente terapéutico para el tratamiento de alteraciones del metabolismo de lípidos que contiene TCF-II como un ingrediente efectivo. El agente terapéutico de la presente invención normaliza hiperlipidemia e hipolipidemia. También mejora el hígado graso.

Claims (2)

1. Uso de TCF-II para la preparación de un agente terapéutico para el tratamiento de hipercolesterolemia.
2. Uso de TCF-II para la preparación de un agente terapéutico para mejorar la lecitin-colesterol-acil-transferasa para prevenir la progresión de la hipolipoproteinemia de alta densidad.
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