ES2202459T3

ES2202459T3 - Uso de una proteina kda para tratar y diagnosticar infecciones por vhc.

Info

Publication number: ES2202459T3
Application number: ES96928648T
Authority: ES
Inventors: Sergio Abrignani
Original assignee: Chiron SRL
Current assignee: GSK Vaccines SRL
Priority date: 1995-09-01
Filing date: 1996-08-30
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2016-08-30
Also published as: DE69635535D1; US20040180053A1; DK0852586T3; JP2008079613A; AU712540B2; WO1997009349A1; US20060166193A1; JP2000500004A; JP2007039462A; IL123169A; AU6835196A; NZ316186A; US6737233B1; CA2227301C; US7026130B2; DE69629121T2; DE69635535T2; GB9517926D0; ATE311408T1; EP0852586A1

Abstract

SE DESCRIBE UNA PROTEINA TRANSMEMBRANA FUNCIONALMENTE NO GLUCOSILADA QUE PRESENTA UN PESO MOLECULAR DE APROXIMADAMENTE 24 KD QUE ES UBICUA EN LA CELULAS HUMANAS Y QUE MUESTRA LA MISMA ESPECIFICIDAD DE ESPECIE QUE EL VIRUS DE LA HEPATITIS C. LA PROTEINA ES CAPAZ DE UNIRSE A PROTEINAS DE LA SUPERFICIE DEL HCV Y ES UN PUTATIVO DEL RECEPTOR CELULAR DE HCV. COMO TAL PRESENTA MUCHAS APLICACIONES EN LOS CAMPOS DEL DIAGNOSTICO Y TRATAMIENTO DE LA INFECCION POR HCV Y EN EL DISEÑO DE TERAPIAS CONTRA EL HCV.

Description

Uso de una proteina kDa para tratar y diagnosticar infecciones por VHC.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a proteínas capaces de unirse a la proteína de la cubierta E2 del virus de la hepatitis C (VHC) y a procedimientos para la producción y purificación.

La invención se refiere también al uso de proteínas en terapia y diagnóstico y a composiciones farmacéuticas y kits de diagnóstico para tales usos. La invención se refiere también a un procedimiento para detectar moléculas putativas que compiten con el VHC por la unión al receptor. La invención se refiere también a un modelo animal para la infección por el VHC.

Breve descripción de la técnica anterior

El VHC (conocido anteriormente como hepatitis no A-no B-VNANB) es un virus de ARN homosentido de aproximadamente 10000 nucleótidos con un marco de lectura abierto único que codifica una poliproteína de aproximadamente 3000 aminoácidos.Aunque la estructura del virus ha sido elucidada mediante técnicas de ADN recombinante (1, 2), no se ha aislado el virus en si y las funciones de las diversas proteínas virales producidas mediante proteolisis de la poliproteína han sido deducidas únicamente por analogía con otros virus similares de organización genómica similar (3).

Las proteínas virales están todas disponibles en forma recombinante, expresadas en una diversidad de células y tipos celulares, incluyendo levaduras, bacterias, células de insectos y mamíferos (4, 5).

Se ha sugerido que dos proteínas, denominadas E1 y E2 (que corresponden a los aminoácidos 192-383 y 384-750 respectivamente) son proteínas externas de la cubierta viral que son responsables de la unión del virus a las células diana (3).

La investigación del VHC está impedida de forma muy considerable por el limitado rango de hospedadores del virus. El único modelo animal fiable para la infección por VHC es el chimpancé y no es posible propagar el VHC en cultivos titulares.

En nuestra solicitud de patente internacional en trámite con la presente PCT/IB95/00692 describimos un procedimiento que emplea la citometría de flujo para identificar células que portan el receptor del VCH. Hemos demostrado que, al marcar las células con proteína de la cubierta E2 recombinante, es posible separar las células usando citometría de flujo, aislando aquellas células que son capaces de unión específica a la E2 y que, por lo tanto, potencialmente portan el receptor del VHC. Empleando esta técnica, hemos identificado una proteína que es capaz de unirse a la proteína de la cubierta E2 del VHC que creemos que es el receptor para el VHC, permitiendo así solventar muchos problemas en la técnica.

La solicitud de patente internacional WO93/04205 describe la identificación de anticuerpos monoclonales que se unen específicamente al antígeno ES/NS1 del virus de la hepatitis C. Estos anticuerpos monoclonales permiten la identificación de antígenos del VHC, para diagnosticar y evaluar las infecciones por VHC.

La solicitud de patente internacional WO96/04376 describe un procedimiento para descubrir y aislar un receptor celular del virus de la hepatitis A. El receptor celular se clonó a partir de células de mamífero en las que estaba expresado el receptor.

Sumario de la invención

De acuerdo con la presente invención, se proporciona una proteína que tiene un peso molecular de aproximadamente 24 kDa y que es capaz de unirse específicamente a una proteína del virus de la hepatitis C, o una variante funcionalmente equivalente o fragmento del mismo.

Los expertos en la técnica entenderán que los pesos moleculares medidos como se describe anteriormente que usan electroforesis están, de forma inherente, sujetos a la interpretación dado que se miden relativos a marcadores de pesos moleculares estándar. Sin embargo, en el contexto de esta memoria descriptiva la expresión "24 kD" no es ambigua cuando se lee en contexto, dado que únicamente se obtiene una proteína así siguiendo los procedimientos descritos a continuación con la característica definida de unión al virus de la hepatitis C.

Una particularidad caracterizadora significativa de la proteína de acuerdo con la presente invención es su capacidad de unirse específicamente a una proteína del VHC, preferiblemente una proteína de la cubierta, particularmente la proteína E2.

Basándose en esta especificidad y otras características descritas a continuación, inferimos que la proteína de 24 kDa de la invención es un receptor celular para el VHC.

Hemos demostrado que la proteína está omnipresente en los humanos entre los tipos celulares que hemos analizado, siendo comparable a la situación que se observa en muchos otros virus de este tipo (tales como el virus vaccinia y el virus de la gripe).

Hemos demostrado que la proteína es específica de especie en una forma que coincide con la especificidad de especie del VHC mismo.

Nuestros experimentos han demostrado que la proteína de 24 kDa no está funcionalmente glicosilada. El tratamiento con glicosidasas no afecta la capacidad de la proteína de 24 kDa de unirse a la proteína E2 y no parece reducir significativamente el peso molecular. Por lo tanto inferimos que, si la proteína está glicosilada, la glicosilación debe estar restringida a un pequeño número de restos de azúcares y no es necesaria para la actividad funcional de la proteína.

Nuestros experimentos han demostrado también que la proteína es una proteína transmembrana, sugiriendo de nuevo que es un receptor celular.

Finalmente, los experimentos con líneas celulares que hiperexpresan la proteína indican que tales células tienen tendencia a la agregación, lo que sugiere que la proteína puede ser una molécula de adhesión de algún tipo.

La proteína de 24 kDa puede estar en su forma natural, aunque aislada de su entorno nativo, o puede estar modificada, siempre que retenga la característica funcional de, al menos, unirse a la proteína E2 del VHC. Por ejemplo la proteína de 24 kDa puede modificarse químicamente para introducir una o más modificaciones químicas en la estructura aminoacídica. Puede incluir modificaciones de la secuencia de aminoácidos que implican una o más inserciones, deleciones o aminoácidos sustituidos. Puede, por ejemplo, truncarse mediante la eliminación de una parte funcional del dominio transmembrana para facilitar una producción fácil por medio de ADN recombinante en una célula hospedadora mamífera adecuada (6).

La proteína de la presente invención puede purificarse a partir de células que muestran unión a una proteína del VHC, tal como la proteína E2.

De acuerdo con la presente invención se proporciona un procedimiento para la preparación de una proteína de acuerdo con la invención o una variante o fragmento de la misma funcionalmente equivalente que comprende la etapa de cultivar células que exhiben unión a una proteína del VHC y purificar a partir de una preparación celular una proteína de acuerdo con la invención.

Las células pueden ser células mamíferas transformadas o no transformadas y son, de forma adecuada, células humanas.

Las células pueden clasificarse por la unión a una proteína del VHC usando citrometría de flujo fluorescente o cualquier otro ensayo adecuado. Por ejemplo, la presente descripción proporciona la información necesaria para producir la proteína de 24 kDa o una variante o fragmento de la misma funcionalmente equivalente que después puede usarse para detectar otras células que porten la proteína.

La preparación celular puede ser una preparación de membrana celular pero es preferiblemente una preparación de membrana celular plasmática.

Preferiblemente las células se seleccionan y clonan para proporcionar la hiperexpresión de la proteína de la presente invención.

Hemos descubierto que la proteína es precipitada por sulfato de amonio entre el 33 y el 50% de saturación.

Preferiblemente, por lo tanto, la preparación celular se somete a una etapa de purificación por precipitación con sulfato de amonio empleando sulfato de amonio entre 33 y 50%. De forma adecuada se realiza una primera precipitación a menos del 33% y se desecha el material precipitado seguido de la precipitación del material deseado entre el 33 y el 50%, más preferiblemente el 50%.

Preferiblemente, la purificación implica al menos una etapa de cromatografía por interacción hidrófoba.

Hemos descubierto también que la proteína es estable a la precipitación con acetona, proporcionando de este modo una caracterización adicional más y una etapa útil del procedimiento de purificación.

Más preferiblemente en forma optimizada, el procedimiento de purificación comprende las etapas de:

i) preparar una preparación de membrana celular plasmática de células mamíferas seleccionadas por la hiperexpresión de la proteína de 24 kDa de la invención,

ii) someter la preparación a precipitación con sulfato de amonio con una saturación inferior al 33% y reservar el sobrenadante,

iii) someter el sobrenadante a precipitación con sulfato de amonio con una saturación entre el 33 y el 50% y reservar el sobrenadante, y

iv) resuspender el precipitado y someterlo a cromatografía por interacción hidrófoba.

Como alternativa a la purificación a partir de líneas celulares naturales, puede prepararse la proteína de la invención o una variante o fragmento de la misma funcionalmente equivalente mediante cualquier procedimiento sintético adecuado, incluyendo la síntesis química. De forma adecuada, la proteína o una variante o fragmento de la misma funcionalmente equivalente se prepara mediante la expresión de un gen que codifica la proteína en una célula o animal hospedador adecuado.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un procedimiento para tratar una infección por VHC que comprende la administración a un paciente de una cantidad de la proteína de la invención o una variante o fragmento de la misma funcionalmente equivalente efectiva para reducir la infectividad del virus.

Ya que el mecanismo de infección del VHC parece depender, en parte, de la disponibilidad de un receptor en la superficie celular, el hacer disponible una forma soluble de la proteína de la invención actuará como antagonista de la unión del VHC al receptor celular reduciendo así o evitando el proceso infeccioso y tratando de este modo la enfermedad.

Una forma soluble adecuada de la proteína de la invención podría comprender, por ejemplo, una forma truncada de la proteína, de la cual se ha eliminado el dominio transmembrana ya sea mediante una etapa de escisión de la proteína, o mediante diseño, en una síntesis de ADN recombinante.

De forma alternativa, una partícula híbrida que comprende al menos una proteína que forma partículas, tal como el antígeno de superficie de la hepatitis B o un fragmento del mismo que forma partículas, en combinación con la proteína de la invención o una variante o fragmento de la misma funcionalmente equivalente podría usarse como antagonista de la unión del VHC al receptor celular.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína de la invención o una variante o fragmento de la misma funcionalmente equivalente, opcionalmente en forma de una sal farmacéuticamente aceptable, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La composición farmacéutica puede estar en cualquier forma apropiada para su administración, incluyendo composiciones orales y parenterales.

Se proporciona también un procedimiento para prepara la composición farmacéutica, en la que una proteína de la presente invención o una variante o fragmento de la misma funcionalmente equivalente se asocia con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una proteína de la invención o una variante o fragmento de la misma funcionalmente equivalente para su uso como fármaco.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona el uso de una proteína de la invención o una variante o fragmento de la misma funcionalmente equivalente en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección por VHC.

La capacidad de una proteína de la invención o una variante o fragmento de la misma funcionalmente equivalente de unirse al VHC permite el uso de la proteína o una variante o fragmento de la misma funcionalmente equivalente como diagnóstico de la infección por VCH, por ejemplo en un ELISA o RIA.

Una forma soluble de la proteína podría, por ejemplo, usarse en un tipo de ensayo ELISA para medir los anticuerpos neutralizadores en el suero.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un ensayo para los anticuerpos contra VHC en una muestra de suero que comprende la etapa de permitir la unión competitiva entre los anticuerpos de la muestra y una cantidad conocida de una proteína del VHC para unirse a una proteína de la invención o una variante o fragmento de la misma funcionalmente equivalente y medir la cantidad de proteína del VHC conocida unida.

Preferiblemente, la proteína de la invención o una variante o fragmento de la misma funcionalmente equivalente se inmoviliza sobre un soporte sólido y la proteína, del VHC que puede ser de forma adecuada una proteína de la cubierta del VHC E2, opcionalmente una proteína E2 recombinante, se marca, de forma adecuada se marca con enzimas.

En un ensayo de este tipo, la unión competitiva entre los anticuerpos y la proteína del VHC para unirse a la proteína de la invención da como resultado que la proteína del VHC unida es una medición de los anticuerpos en la muestra de suero, de forma más particularmente, de los anticuerpos neutralizadores en la muestra de suero.

Una ventaja significativa del ensayo es que la medición se hace directamente sobre los anticuerpos neutralizadores (es decir, aquellos que interfieren en la unión de la proteína de la cubierta del VHC al receptor celular). Tal ensayo, particularmente en forma de una prueba ELISA tiene aplicaciones considerables en el entorno clínico y en las pruebas rutinarias de detección en sangre.

También, debido a que el ensayo mide la valoración de anticuerpos neutralizadores, el ensayo da una medición fácil de la eficacia putativa de las vacunas, estando correlacionada la valoración de anticuerpos neutralizadores con la protección al hospedador.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un kit de diagnóstico que comprende la proteína de la invención o una variante o fragmento de la misma funcionalmente equivalente. Preferiblemente, el kit contiene también al menos una proteína del VHC marcada, opcionalmente marcada con enzimas.

La proteína de la invención o una variante o fragmento de la misma funcionalmente equivalente puede usarse para detectar compuestos químicos que imitan la estructura de la superficie del VHC que es responsable de la unión al receptor del VHC.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un procedimiento para detectar compuestos químicos por su capacidad de unirse a la región del VHC responsable de la unión a una célula hospedadora, que comprende la medición de la unión de un compuesto químico a analizar a una proteína de la invención o una variante o fragmento de la misma funcionalmente equivalente.

Este aspecto de la invención comprende los productos del procedimiento de detección ya sean solos, en forma de una sal farmacéuticamente aceptable, en combinación con uno o más compuestos activos diferentes y/o en combinación con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Se proporcionan también los procedimientos para preparar una composición farmacéutica en la que se asocia un compuesto químico identificado mediante el procedimiento de la invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

El compuesto químico puede ser un compuesto químico orgánico y puede contener aminoácidos o análogos de aminoácidos. Preferiblemente, sin embargo, el compuesto químico es un polipéptido o un polipéptido que ha sido modificado químicamente para alterar sus propiedades específicas, tales como la afinidad de unión a la proteína de la invención o una variante o fragmento de la misma funcionalmente equivalente o su estabilidad in vivo.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama esquemático que describe un ensayo en el que los ligandos de unión al receptor del VHC se unen a receptores en las células diana receptoras del VHC y se miden primero uniéndose al anticuerpo de conejo contra VHC y después uniendo un fragmento F(ab') contra la IgG-FITC de conejo antes de la separación celular mediante análisis FACScan.

La Figura 2 es un histograma generado por ordenador que representa los resultados de un análisis FACScan de la unión de la proteína del VHC a células hematopoyéticas (MOLT-4, Jurkat, K562, Daudi, EBV-B) y células epiteliales (Hela, Adenocarcinoma y Huh 7) que resultan de la unión con proteínas del VHC (curva sombreada control sin marcar, curva blanca marcado). La gráfica es de la población celular comparada con la intensidad de la fluorescencia.

La Figura 3 es un histograma generado por ordenador que representa los resultados de un análisis FACScan de RA purificado, RO purificado, RA purificado de sangre del cordón, RA purificado de sangre del cordón estim. con pha, clon KC3 de linfocitos T (TCC) y TCC SAG S9, que se analizaron para determinar la unión a la proteína recombinante E2 del VHC que se expresa en células CHO (curva sombreada control sin marcar, curva blanca marcado). La gráfica es de la población celular comparada con la intensidad de la fluorescencia.

La Figura 4 es un conjunto de histogramas generados por ordenador que representan los resultados de un análisis FACScan de la unión de E2 de CHO a células MOLT-4 con y sin tratamiento con \beta-mercaptoetanol (BSH) y un agente reductor del enlace S-S (curva sombreada control sin marcar, curva blanca marcado). La gráfica es de la población celular comparada con la intensidad de la fluorescencia.

La Figura 5 es un conjunto de histogramas generados por ordenador que representan los resultados de un análisis FACScan de la unión de E2 de CHO a células MOLT-4 con y sin tratamiento con Endo-H, una enzima de desglicosilación (curva sombreada control sin marcar, curva blanca marcado). La gráfica es de la población celular comparada con la intensidad de la fluorescencia.

La Figura 6 es una transferencia western de membranas preparadas a partir de células MOLT-4 y disueltas en tampones diferentes (véase página 22 para las descripciones de las líneas).

La Figura 7 es una transferencia western de membrana plasmática de células MOLT-4 (véase página 23 para las descripciones de las líneas).

\newpage

La Figura 8 es una transferencia western de proteínas de membrana de MOLT- 4 y PBMC (véase página 23 para las descripciones de las líneas).

La Figura 9 es una transferencia western de proteínas de membrana de células MOLT-4 tratadas con N-Glicosidasa F (véase página 26 para las descripciones de las líneas).

La Figura 10 es una transferencia western de membranas de MOLT-4 y COS-7 sometidas a electroforesis en condiciones reductoras y no reductoras (véase página 27 para las descripciones de las líneas).

La Figura 11 es una transferencia western de un experimento que demuestra la inmunoprecipitación de un complejo E2-CHO/receptor putativo (véase página 29 para las descripciones de las líneas).

La Figura 12 es una transferencia western de fracciones de sulfato de amonio de membranas de células MOLT-4 (véase página 31 para las líneas).

La Figura 13 es una transferencia western de muestras de un experimento de cromatografía de interacción hidrófoba con una etapa de precipitación con acetona (véase página 32 para las líneas).

Descripción detallada de la invención

La ordenación de la descripción detallada es la siguiente:

1.: Descripción general

2.: Ensayo celular

2.1.: Análisis FACS de células que se unen a E2

2.2.: Efecto de la modificación de E2 sobre la unión

2.2.1.: Reducción de E2

2.2.2.: Desglicosilación de E2

2.3.: Producción de anticuerpos monoclonales

3.: Preparación de receptor putativo de 24 kD

3.1.: Preparación de la proteína de 24 kDa a partir de células MOLT-4

3.1.1.: Purificación de membranas

3.1.2.: Purificación de membranas plasmáticas

3.2.: Células MOLT-4 que sufren hiperexpresión

4.: Caracterización del receptor

4.1.: Protocolo de transferencia western

4.1.1.: Proteínas de membrana

4.1.2.: Proteínas de membranas plasmáticas

4.1.3.: Transferencia western de células PBMC

4.2.: Expresión del receptor en la superficie celular

4.3.: Efecto de las enzimas en la unión de la proteína de 24 kD

4.3.1.: Citometría de flujo

4.3.2.: Transferencia western de MOLT-4/N-glicosidasa F

4.4.: Efecto de la condición reductora sobre la unión

5.: Optimización de la purificación

5.1.: Inmunoprecipitación

5.2.: Fraccionamiento con sulfato de amonio

5.3.: Cromatografía de interacción hidrófoba

5.4.: Precipitación con acetona

6.: Secuenciación y clonado

6.1.: Secuencia de aminoácidos

6.2.: Clonado y secuenciación de la secuencia de ADN

1. Descripción general

La práctica de la presente invención empleará, a no ser que se indique lo contrario, técnicas convencionales de inmunología, citofluorometría y biología molecular, que están dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas se explican de forma completa en la bibliografía (7).

Los expertos en la técnica entenderán y estarán familiarizados con los procedimientos y técnicas generales del diseño y práctica de los ensayos. La invención se describe en la presente memoria en detalle suficiente para que los expertos en la técnica entiendan y repitan los experimentos descritos.

En esta memoria descriptiva se usan abreviaturas estándar para virus y proteínas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente memoria se incorporan como referencia. Cubierta 1 (E1) y Cubierta 2 (E2) del VHC se refieren a las proteínas, y fragmentos de las mismas, cuyas secuencias de nucleótidos están publicadas (documentos EP-A-0318216 y EP-A-0388232 citados anteriormente). Los nucleótidos de los genes E1 y E2 y de las proteínas codificadas varían en los diferentes VHC aislados. Por lo tanto, se identifican las E1 y E2 para cualquier VHC aislado porque están incluidos en las secuencias de aminoácidos 192-383 y 384-750 respectivamente.

E1 y E2 han sido producidas mediante técnicas de ADN recombinante usando diferentes sistemas de expresión (Spaete y col. y Chien y col. citados anteriormente).

2. Ensayo celular 2.1. Análisis FACS de células que se unen a E2

Se realizó un experimento con el objetivo de medir la capacidad de la proteína del VHC de unirse a diversos tipos celulares que deberían tener el receptor del VHC putativo.

Se precipitaron células (10^{5}/pocillo) del linfoma de linfocitos T humano, Molt-4 (disponible en el mercado y que puede obtenerse de American Type Culture Collection), en microplacas con fondo de U de 96 (Costar) mediante centrifugación a 200 x g durante 5 minutos a 4ºC. Se mezclaron 20 microlitros de proteínas del VHC (proteína E2 recombinante expresada en CHO) diluidas en PBS en concentraciones diferentes (de 10 \mug/ml a 0,001 \mug/ml) con el precipitado de células Molt-4 y se incubaron a 4ºC durante 60 minutos. Las proteínas del VHC no unidas se eliminaron mediante dos centrifugaciones en PBS a 200 x g durante 5 minutos a 4ºC.

Las células se incubaron subsiguientemente durante 30 minutos a 4ºC con diversas diluciones (de 1/10 a 1/300000) de suero de humanos, chimpancés, conejos o ratones que estaban infectados con el VHC o habían sido inmunizados con proteínas del VHC recombinantes o el suero preinmunitario correspondiente como control.

Se lavaron las células dos veces en PBS y se incubaron durante 30 minutos con las diluciones apropiadas de antisuero conjugado con fluoresceína-isotiocianato (contra IgG humana, o IgG de conejo, o IgG de ratón).

Las células se lavaron subsiguientemente en PBS a 4ºC, se resuspendieron en 100 \mul de PBS y se analizó la fluorescencia unida a las células con un citómetro de flujo FCScan (Becton & Dickinson). Mediante el uso de una visualización matricial de diseminación frontal y lateral, se dirige a la máquina para que incluya células únicas viables y a excluir detritus celulares y las aglomeraciones de células. Se recogieron un total de 5000 eventos y se realizaron los análisis de datos usando el programa de software Lysis II de Becton & Dickinson. Este programa produce histogramas de cada muestra de células y calcula la fluorescencia media de los canales de la población de células, que se relaciona directamente con la densidad en superficie de las proteínas del VHC marcadas con fluorescencia unidas a las células.

Se compararon los valores de fluorescencia media (número medio de canales) de las células incubadas con o sin proteínas del VHC y con suero inmunitario o preinmunitario. El umbral de positividad se ajusta para cada experimento mediante análisis citométrico de flujo de las células sin proteínas del VHC unidas que han sido incubadas con antisuero contra proteínas del VHC y el segundo anticuerpo marcado con FITC. En la Figura 1 se muestra un experimento de unión representativo, que muestra la separación lograda mediante análisis citométrico de flujo.

El experimento se realiza también con varias líneas celulares (por ejemplo células hematopoyéticas distintas de MOLT-4, tales como Jurkat, K562, Daudi, EBV-B (línea de linfocitos B transformados con el virus de Epstein-Barr y células epiteliales tales como Hela, Adenocarcinoma y Huh 7) para identificar células capaces de unirse a proteínas del VHC y por lo tanto, células que tienen el(los) receptor(es) putativo(s) para el VHC siguiendo el protocolo descrito anteriormente. Se apreciará que no es necesario repetir este experimento para el funcionamiento de la presente invención, pero sirve para probar la naturaleza omnipresente del receptor putativo (la mayoría de las células están, en cualquier caso, disponibles de forma común y, de hecho, se obtuvieron de ATCC). Los resultados se muestran en la Figura 2, junto con aquellos para MOLT-4 y demuestran que la unión específica de E2 a las células es generalizada, lo que sugiere que el receptor del VHC está omnipresente.

En una serie similar de experimentos, se analizaron RA purificado, RO purificado, RA purificado de sangre del cordón, RA purificado de sangre del cordón estim. con pha, TCC KC3 y TCC SAG S9 para determinar la unión a la proteína E2 del VHC expresada en células CHO (E2-CHO) y se observó que se unen, lo que confirma que la unión ocurre en líneas celulares no transformadas. Los resultados se muestran en la Figura 3.

2.2. Efecto de la modificación de E2 sobre la unión

Se investigaron los efectos de la modificación de la proteína E2 del VHC recombinante, expresada en células CHO (E2-CHO) sobre la unión a las células MOLT-4 usando un agente reductor y enzima de desglicosilación.

2.2.1. Reducción de E2

Se tamponaron a pH 8,0 25 \mul de SMC-PC de E2-CHO (130 \mug/ml) en fosfato potásico 20 mM, NaCl 0,1 M, a pH 6,0 con base Tris 1 M (total 1 \mul) y después se añadió BSH (\beta-mercaptoetanol) hasta una concentración final de 500 mM; se enjuagaron los tubos con nitrógeno y la reacción se dejó proseguir durante 100 minutos a 37ºC.

Se diluyeron las muestras anteriores 1:20 con medio RPMI y se usaron para un ensayo de unión FACS con células MOLT-4 como se describe anteriormente. La concentración final de BSH en el ensayo de FACS era de 12,5 mM y en estas condiciones, se verificó que las células estaban vivas en experimentos preliminares previos (más del 90% de las células estaban todavía vivas con BSH 50 mM).

Los resultados de la Figura 4 muestran que la unión de las células MOLT-4 a E2 recombinante se reduce sustancialmente al reducir con \beta-mercaptoetanol, lo que indica que se requiere una conformación correcta de E2 que se mantiene mediante puentes S- S.

2.2.2. Desglicosilación de E2

Se añadieron 25 \mul de SMC-PC de E2-CHO (130 \mug/ml) en fosfato potásico 20 mM, NaCl 0,1 M, a pH 6,0 con

\hbox{30  \mu l}

de NaH_{2}PH_{4} 0,2 M hasta un pH final de 5,5 más SDS hasta una concentración final de 0,01%. Después se añadieron 10 \mul de solución madre de Endo-H hasta una concentración final de 200 mU/ml manteniendo el pH constante y la muestra resultante se mantuvo a 37ºC durante 20 horas. Después se diluyó la muestra 1:20 con RPMI y se usó para un ensayo de unión FACS como se describe anteriormente.

Los resultados en la Figura 5 muestran que la unión de las células MOLT-4 a E2 recombinante se reduce sustancialmente al desglicosilar con Endo-H, lo que indica que es necesaria la glicosilación de E2 para la unión.

2.3. Producción de anticuerpos monoclonales

Se prepararon los anticuerpos monoclonales usando procedimientos estándar e inmunizando ratones con E2 del VHC recombinante producida en células CHO (E2-CHO). Se establecieron varias líneas celulares que eran capaces de unirse a E2-CHO, al igual que las líneas celulares capaces de unirse a E2 unido a las células MOLT-4 y líneas celulares capaces de neutralizar la unión de E2-CHO a las células MOLT-4.

3. Preparación de receptor putativo de 24 kD 3.1. Preparación de la proteína de 24 kDa a partir de células MOLT-4

La proteína de 24 kDa se purificó a partir de células MOLT-4 mediante purificación de las membranas y mediante purificación de las membranas plasmáticas, dando la última el mejor rendimiento de proteína.

3.1.1. Purificación de membranas

Se cultivaron células MOLT-4 a 37ºC, CO_{2} al 5% en RPMI tamponado con Hepes 25 mM en un medio de crecimiento que contiene suero de ternero fetal (FCS-concentración final del 5%), glutamina 1 mM, 100 \mug/ml de kanamicina, vitaminas MEM (Gibco), piruvato sódico 1 mM, aminoácidos no esenciales MEM (Gibco), \beta-mercaptoetanol 5 x 10^{-5} M.

Se recogieron las células tras alcanzar una densidad de 750.000- 1.000.000 de células por ml.

El medio de crecimiento que contenía las células se centrifugó a 300 g durante 10 minutos para precipitar las células. Las células precipitadas se lavaron tres veces en tampón de PBS (resuspendidas y vueltas a centrifugar):

El precipitado celular se resuspendió en solución hipotónica con 1 ml de solución hipotónica por 100 x 10^{6} células.

La solución hipotónica contenía Tris (10 mM), NaCl (10 mM), CaCl_{2}(0,2 mM), MgCl_{2} (1,5 mM), PMSF (1,0 mM), aprotinina (2,0 \mug/ml), pepstatina (0,7\mug/ml) y leupeptina (0,5 \mug/ml).

Se dejaron las células a 4ºC con agitación lenta durante 20 minutos y después se lisaron con 25 pulsos de un homogeneizador manual Potter.

Las membranas se recuperaron después de la centrifugación secuencial del sobrenadante a 100 g durante 7 minutos, 3500 g durante 10 minutos y 40.000 g durante 60 minutos. El sedimento obtenido en el procedimiento anterior se disolvió en tampón adecuado.

El tampón usado para la disolución del sedimento de membranas a 40.000 g contenía Triton X-100 al 1% en tampón de PBS a pH 7,4, Chaps 8 mM en tampón de PBS a pH 7,4 y Urea 4 M en tampón de fosfato sódico a pH 7,4.

Todos los tampones usados para la solubilización de las membranas contenían inhibidores de proteasas en las concentraciones descritas anteriormente para la solución hipotónica y se usaron con una relación de 200 \mul de tampón por cada 5 x 10^{8} células.

El material solubilizado se centrifugó a 100.000 g durante 60 minutos y se reservó el sobrenadante para uso posterior después de estimar el contenido en proteína por el procedimiento de BCA.

El material obtenido se sometió a análisis como se describe a continuación.

3.1.2. Purificación de membranas plasmáticas

El procedimiento para la purificación de membranas plasmáticas se basó en Morre' D.J. y col. (8).

Se cultivaron células MOLT-4- a 37ºC, CO_{2} al 5% en RPMI tamponado con Hepes 25 mM en un medio de crecimiento que contiene suero de ternero fetal (FCS - concentración final del 5%), glutamina 1 mM, 100 \mug/ml de kanamicina, vitaminas MEM (Gibco), piruvato sódico 1 mM, aminoácidos no esenciales MEM (Gibco), \beta- mercaptoetanol 5 x 10^{-5} M.

Se sedimentaron las células del medio de cultivo y se lavaron tres veces con PBS.

Las células sedimentadas se resuspendieron en EDTA 0,2 mM, NaHCO_{3} 1 Mm que contenía los siguientes inhibidores de proteasas: PMSF (1,0 mM), aprotinina (2,0 \mug/ml), pepstatina (0,7 \mug/ml), leupeptina (0,5 \mug/ml) con una relación entre tampón y células de 2 ml por cada 10^{8} células.

Las células resuspendidas se lisaron con un homogeneizador Polytron usando una sonda S25 N10 G durante 40 segundos a 9500 rpm. Se verificó la lisis celular por microscopía óptica. El homogenado se centrifugó a 300 g y el sobrenadante resultante se centrifugó adicionalmente a 23.500 g durante 60 minutos. El sedimento resultante se resuspendió en fosfato potásico 0,2 M a pH 7,2 que contenía inhibidores de proteasas en las relaciones descritas anteriormente. El volumen de tampón era de 1 ml por cada 5 x 10^{8} células.

La suspensión de membranas se fraccionó en el siguiente sistema de dos fases:

T500 Dextran al 20% (p/p)	13,2 g
PEG 3350 al 40% (p/p)	6,6 g
KP 0.2, pH 7,2	0,8 ml
Suspensión de membrana	5,0 g
Agua destilada	hasta 35 g

La muestra se enfrió a 4ºC y los tubos se invirtieron de 30 a 40 veces manteniendo la temperatura constante. Después se centrifugó la muestra en un rotor de cubeta oscilante a 150-200 g durante 5 minutos a 4ºC. La fase superior se eliminó y se diluyó por un factor de cinco con bicarbonato sódico 1 mM que contenía inhibidores de proteasas. Se recogieron las membranas por centrifugación a 30.000 g durante 30 minutos.

El sedimento se disolvió en un tampón adecuado y se centrifugó a 100.000 g durante 60 minutos para eliminar el material sin disolver.

El material obtenido se sometió a análisis como se describe a continuación.

3.2. Células MOLT-4 que sufren hiperexpresión

Se preparó una línea celular adicional capaz de hiperexpresar la capacidad de unión característica a E2 mediante selección y reclonado de células MOLT-4 que se unen a E2 con intensidad. La línea celular resultante mostró una afinidad de unión marcadamente superior a E2 que la cepa natural.

4. Caracterización del receptor 4.1. Protocolo de transferencia western

Los siguientes procedimientos demuestran la unión de E2 a la proteína de 24 kDa purificada en una transferencia western de proteínas de células MOLT-4 purificadas a partir de membranas y de membranas plasmáticas y a partir de monocitos de sangre periférica (PBMC).

A no ser que se indique lo contrario, todos los experimentos de SDS-PAGE se realizaron de acuerdo con Laemmli y col. (9), se procesaron las muestras de membranas solubilizadas en condiciones no reductoras y sin hervir antes de cada procesamiento electroforético.

Después de la transferencia electroforética (transferencia western) en tampón que contenía Tris 25 mM, glicina 192 mM, metanol al 20% con un campo eléctrico constante de 10 voltios/cm, los soportes de transferencia transferidos se saturaron durante 2 horas en tampón de PBS a pH 7,4 que contenía Tween 20 al 0,05% y leche desnatada en polvo al 10% a temperatura ambiente. Después de 1 x 15 minutos y 2 x 15 minutos lavados en PBS, Tween 20 al 0,05% que contenía leche desnatada en polvo al 1%, los soportes de transferencia se incubaron hasta la mañana siguiente con proteína recombinante E2-CHO con una concentración de 1-2 mug/ml disueltas en tampón de PBS que contenía Tween 20 al 0,05%, leche al 1%, ázida sódica al 0,02%. Los soportes de transferencia de control negativo (transferidos con las mismas muestras) se incubaron durante el mismo tiempo en el mismo tampón sin la proteína E2-CHO.

Para detectar la proteína E2-CHO recombinante unida a los soportes de transferencia, estos se incubaron con el sobrenadante del cultivo de un hibridoma denominado 291A2 (un anticuerpo monoclonal que reconoce epítopos expuestos en E2 cuando se une a su receptor putativo) con una dilución de 1:500 en PBS, Tween al 0,05%, leche al 1% durante 2 horas.

Después de esta etapa, los soportes de transferencia se lavaron 1 x 15 minutos y 2 x 5 minutos con solución de PBS, Tween al 0,05%, leche al 1%. Después, los soportes de transferencia se incubaron durante 1 hora con anticuerpo policlonal de cabra específico contra inmunoglobulina de ratón conjugado con biotina /PharMingen, San Diego, CA, EE.UU.) con una dilución de 1:2000 en la solución de PBS/Tween/Leche mencionada anteriormente. Después de esta etapa, los soportes de transferencia se lavaron 1 x 15 minutos y 2 x 5 minutos con PBS/Tween/Leche. Finalmente se incubaron los soportes de transferencia durante 1 hora con Extravidin®-Peroxidasa (Sigma Immunochemicals Co., St. Louis, MO, EE.UU.) con una dilución de 1:2500 en PBS/Tween/Leche. Después los soportes de transferencia se lavaron 1 x 15 minutos y 4 x 5 minutos con tampón de PBS a pH 7,4 que contenía Tween 20 al 0,05%. Se realizó una tinción quimoluminiscente usando reactivos de detección de transferencia western ECL^{TM} (Amersham, Reino Unido).

4.1.1. Proteínas de membrana

Se preparó una preparación de membranas como se describe anteriormente.

Se disolvieron los sedimentos de membranas resultantes de la centrifugación a 40.000 g en los tampones que se describen a continuación y se centrifugaron a 100.000 g para eliminar el material sin disolver. Los sedimentos se volvieron a extraer con Triton X-100 al 1% en PBS a pH 7,4.

Después de la SDS-PAGE (15 \mug/línea) y transferencia, se incubaron los soportes de transferencia con proteína recombinante E2-CHO como se describe anteriormente.

Los resultados se muestran en la Figura 6.

Línea	Descripción
1A	Urea 4 M en fosfato sódico 50 mM a pH 7,2
2A	Precipitado de la muestra de la línea 1A solubilizado en Triton X-100 al 1% en PBS a pH 7,4
3A	Triton X-100 al 1% en PBS a pH 7,4
4A	Precipitado de la muestra de la línea 3A solubilizado en Triton X-100 al 1% en PBS a pH 7,4
5A	Triton X-100 al 0,01% en PBS a pH 7,4
6A	Precipitado de la muestra de la línea 5A solubilizado en Triton X-100 al 1% en PBS a pH 7,4

1B a 6B son controles negativos para las muestras correspondientes de las líneas 1A a 6A.

La banda de proteína en 24 kDa es claramente visible.

4.1.2. Proteínas de membranas plasmáticas

Se preparó una preparación de membranas plasmáticas como se describe anteriormente.

Se disolvieron las membranas plasmáticas en PBS a pH 7,4 que contenía Triton X-100 al 1% y se sometieron a SDS-PAGE de Laemmli. El soporte de transferencia se incubó con proteína recombinante E2-CHO.

Los resultados se muestran en la Figura 7.

Línea	Descripción
1A	Membranas plasmáticas, 10 \mug de contenido total de proteínas
2A	Membranas plasmáticas, 5 \mug de contenido total de proteínas

Las líneas 1B y 2B son los controles negativos para las muestras correspondientes de las líneas 1A y 2A.

La banda de proteína en 24 kDa es claramente visible.

4.1.3. Transferencia western de células PBMC

Para evaluar si la proteína de 24 kDa podía identificarse en células normales, se purificó una muestra de monocitos de sangre periférica usando el procedimiento descrito anteriormente y se sometió a transferencia western como se describe anteriormente.

Los resultados se describen en la Figura 8.

Línea	Descripción
1/2	Proteínas de membrana de MOLT-4
3	Proteínas de membrana de PBMC (22 \mu/ml)
4	Proteínas de membrana de PBMC (44 \mu/ml)

Las líneas de control negativo se marcan "-E2-CHO".

4.2. Expresión del receptor en la superficie celular

Empleando los protocolos descritos anteriormente, se analizaron diversos tipos celulares usando FACscan y transferencia western para determinar la presencia del receptor del VHC putativo de la proteína de 24 kD.

Los resultados se representan a continuación:

		FACS	WB	VHC
Linfocitos T y B	humano	+++	+++	+++
Monocitos	humano	+++		+++
HeLa	humano	++		+++
Carcinoma gástrico	humano	++		+++
Células de hepatoma	humano	+++	+++	+++
Mioblastoma	humano	+		-
Células de hígado de extracción	monos	-	-	-
reciente	verdes
Linfomonocitos	conejo	-		-
Células de hígado de extracción	conejo		-	-
reciente
Cualquier célula	ratón	-		-

Estos resultados demuestran que la distribución entre las especies de la proteína de 24 kDa se corresponde con la de la susceptibilidad a la infección por VHC.

4.3. Efecto de las enzimas sobre la unión de la proteína de 24 kD 4.3.1. Citometría de flujo

Se investigó la naturaleza bioquímica del componente de la superficie celular (receptor) que media la unión de la proteína de cubierta E2-CHO a las células MOLT-4. El tratamiento previo de las células MOLT-4 con neuraminidasa de V. cholerae, que tiene una especificidad \alpha-2,3 no reduce la unión de E2-CHO.

Se demostró la naturaleza proteínica del receptor cuando las células tratadas previamente con proteasas evitaron la capacidad de unión de E2-CHO, mientras que el tratamiento con fosfolipasa de las células no afecto a la unión, lo que sugiere que las proteínas de unión celular no estaban ligadas por un anclaje de glicosilfosfatililinositol. El sitio de unión E2 en las células MOLT-4 era sensible a todas las proteasas usadas, lo que incluía tanto serinaproteasas, tales como tripsina, como una tiolproteasa, tal como papaína.

Los resultados del tratamiento proteolítico demostraron la implicación de las proteínas de membrana en la unión de la proteína de la cubierta y fueron los siguientes:

Tratamiento	Concentración	Intensidad de la fluorescencia (% del control)
Control		100
Pronasa E	10 \mug/ml	36
Pronasa E	100 \mug/ml	34
Tripsina	100 \mug/ml	33
Papaína	100 \mug/ml	42
Fosfolipasa C (del Bacillus cereus)	3 U/ml	100
Fosfolipasa C	25 U/ml	96
Neuraminidasa	50 mU/ml	100

Se incubaron células (10^{6} ml^{-1}) durante 60 minutos a 37ºC en RPMI 1640/medio Hepes más las enzimas indicadas anteriormente. Las células se centrifugaron, se resuspendieron en medio reciente y se incubaron con proteína E2-CHO (3 \mug/ml). Se usó anticuerpo monoclonal contra E2-CHO purificado (1,5 \mug/ml) como segunda etapa. Se usó anticuerpo de conejo contra ratón marcado con ficoeritrina purificado (5 \mug/ml) como reactivo en una tercera etapa. Se evaluó un total de 5000 células por muestra con un citómetro de flujo FACScan.

Se usaron las enzimas con una concentración que no afectó la viabilidad celular medida por exclusión con yoduro de propidio durante el análisis FACS.

Se registró la fluorescencia en forma de unidades arbitrarias (números de canales) en una escala logarítmica y se determinaron las intensidades medianas. Se normalizaron los datos de los experimentos individuales con respecto a la fluorescencia de las muestras de control sin tinción y los valores se expresan como porcentajes de las intensidades de fluorescencia en las muestras de control teñidas.

4.3.2. Transferencia western en MOLT-4/N-glicosidasa F

Se realizó un tratamiento con péptido-N-glicosidasa F incubando proteínas de membrana (50 \mug) hasta la mañana siguiente a 37ºC en tampón de fosfato a pH 7,4 EDTA 25 mM más enzima (50 U/ml) y se cargaron sucesivamente en SDS PAGE al 12%.

Para mostrar la actividad de la enzima N-glicosidasa F (PNGasa F), como control, se uso el polipéptido gp 120 en el mismo experimento (no se muestran los datos).

Los resultados se muestran en la Figura 9.

Línea	Descripción
1	control +
2	membrana tratada y hervida
3	membrana sin tratar y hervida
4	membrana tratada
5	membrana sin tratar

Estos resultados muestran que el tratamiento de una preparación de membranas de MOLT 4 con péptido-N-glicosidasa F, que hidroliza todos los glicanos unidos en N, no evita la unión de E2-CHO.

4.4. Efecto de la condición reductora de la unión

Se sometió a electroforesis una transferencia western de membranas de MOLT-4 y COS-7, preparadas como se describe anteriormente, en condiciones reductoras y no reductoras para establecer el requisito o no de puentes disulfuro en la proteína de 24 kD, midiendo la unión de E2-CHO al soporte de transferencia.

Los soportes de transferencia se incubaron con proteína recombinante E2- CHO como se describe anteriormente.

Los resultados se muestran en la Figura 10.

Línea	Descripción
1A	Membranas de COS-7 en tampón de Laemmli para SDS no reductor
2A	Membranas de MOLT-4 en tampón de Laemmli para SDS no reductor
3A	Membranas de COS-7 en tampón de Laemmli para SDS que contiene \beta-SH al 5%
4A	Membranas de MOLT-4 en tampón de Laemmli para SDS que contiene \beta-SH al 5%

1B a 4B son controles negativos para las líneas correspondientes 1A a 4A.

5. Optimización de la purificación 5.1. Inmunoprecipitación Solubilización de las proteínas de membrana

Se trató una preparación de membranas de 400 millones de células MOLT-4 (subclón A2A6) con 200 \mul de tampón de PBS, a pH 7,4, que contenía CHAPS 7,5 mM y los siguientes inhibidores de proteasas en \mul/ml: PMSF 35, aprotinina 2, pepstatina 0,7, leupeptina 0,5. Después del tratamiento con el tampón anterior, la suspensión resultante se centrifugó a 100.000 g durante 1 hora y el sobrenadante transparente se sometió a experimentos de inmunoprecipitación. La concentración de proteína final, basándose en el ensayo de proteínas BCA (Pierce, EE.UU.) era 2,7 mg/ml.

Incubación con proteína de cubierta E2 recombinante

Se añadieron 200 \mul de solución de proteína de membrana (2,7 mg/ml) en PBS-CHAPS a 15 \mul de solución de E2 producida por CHO (Lote P4). La concentración de la solución madre de proteína E2-P4 era 130 \mul/ml y su concentración final en la solución de proteínas de membrana era de 9,75 \mug/ml.

La mezcla se mantuvo en agitación hasta la mañana siguiente a 4ºC.

Incubación con antisuero de conejo contra E2

La solución resultante se dividió en dos alícuotas de 100 \mul y cada una se mezcló con 5 \mul de antisuero preinmunitario y postinmunitario de un conejo (R#1) previamente inmunizado con proteína E2. La dilución final de antisuero era de 1:20. La incubación se realizó durante 1 hora a 4ºC.

Adición de Proteína-A Sepharose CL-4B

Se lavó de abundantemente resina de proteína A-Sepharose CL-4B (Pharmacia, Suecia) con PBS que contenía CHAPS 7,5 mM a pH 7,4, y se añadieron 30 \mul de mezcla espesa compacta (la capacidad de la matriz es de 20 mg de Ig humana por ml de mezcla espesa) a cada 100 \mu1 de muestra resultante de la etapa anterior. Se realizó la incubación con agitación durante 1 hora a 4ºC.

Se centrifugaron las muestras para sedimentar la resina y se eliminó el sobrenadante, se mezcló con tampón de Laemmli (sin agente reductor) y se reservó para la - PAGE. El sedimento de resina se lavó dos veces con 500 \mul de PBS-CHAPS (10 minutos cada lavado a 4ºC) y después se trató el sedimento con 50 \mul de tampón de Laemmli que contenía urea 5 M. El sobrenadante resultante se sometió a SDS-PAGE.

SDS-PAGE e Inmunotransferencia

Las muestras de las etapas anteriores, es decir, el material que contenía el sobrenadante no absorbido en la matriz de Proteína-A (SN) y el material desorbido de la matriz de Proteína-A (ProtA) tanto de los antisueros preinmunitario como postinmunitario, se cargaron en gel de SDS-PAGE en tampón no reductor y sin calentar. Después del procesamiento, se electrotransfirieron los geles sobre papel de nitrocelulosa en tampón de Tris-Glicina metanol al 20% y se sometieron a inmunotinción como se describe anteriormente. La incubación con la proteína E2 se realizó hasta la mañana siguiente usando SMC-PC de E2 a 1,73 \mug/ml en PBS con Tween al 0,05% y leche al 20,1%.

Las muestras cargadas en el SDS-PAGE fueron:

A): Sobrenadante (material no retenido por la Prot-A) del antisuero preinmunitario,

B): Material desorbido de la Prot-A del antisuero preinmunitario,

C): Sobrenadante del antisuero postinmunitario, y

D): Material desorbido de Prot-A del antisuero postinmunitario,

Se cargaron en el gel tres grupos de estas muestras, uno se tiñó directamente sobre el gel, los otros dos se sometieron a inmunotinción, uno incubado con E2 y el otro como control negativo.

El soporte transferido de nitrocelulosa se incubó con proteína SMC-PC de E2-CHO recombinante a 1,73 \mug/ml seguido de sobrenadante del cultivo del hibridoma 291A2 (que contenía un anticuerpo monoclonal que reconoce los epítopos expuestos en E2 cuando se une a su receptor putativo), anticuerpos contra Ig de ratón policlonales biotinilados y Extravidina ^{TM} (Sigma Immunochemicals, EE.UU.) marcada con peroxidasa. La tinción quimioluminiscente se obtuvo con ECL-Luminol (Amersham, Reino Unido), exposición 1 minuto.

Los resultados se muestran en la Figura 11.

Línea	Descripción
1A	patrón de peso molecular
2A	vacío
3A	muestra incubada con suero de conejo preinmunitario-sobrenadante
4A	muestra incubada con suero de conejo preinmunitario-unido a proteína-A
5A	muestra incubada con suero de conejo postinmunitario-sobrenadante
6A	muestra incubada con suero de conejo postinmunitario-unido a proteína-A

Los controles negativos emplearon la membrana de nitrocelulosa incubada con sobrenadante del cultivo del hibridoma 291A2 seguido de anticuerpos contra Ig de ratón policlonales biotinilados y estreptavidina marcada con peroxidasa. 1B a 4B corresponden de 3A a 6A respectivamente.

5.2. Fraccionamiento con sulfato de amonio

Las membranas se prepararon como se describe en el protocolo de preparación de membranas de células MOLT-4 y se disolvieron en tampón de PBS a pH 7,4 que contenía CHAPS 8 mM. La concentración de proteína estimada basándose en ensayos BCA varía de 1,8 a 2,5 mg/ml.

Las membranas solubilizadas se mezclaron con solución saturada de sulfato de amonio (AS) en un volumen suficiente para obtener el 25% de saturación de sulfato de amonio (es decir la concentración final de AS es el 25% de la solución saturada inicial). Se dejó reposar la mezcla sobre hielo fundente durante 2 horas y después se centrifugó a 15800 g durante 30 minutos.

Se mezcló el sobrenadante con solución saturada de AS hasta una concentración final del 50%. Se dejó reposar la mezcla sobre hielo fundente durante 2 horas y después se filtró en una centrifugadora filtradora Spin-X^{TM} (Costar, Cambridge, MA, EE.UU.) durante 15 minutos a 4ºC.

Se disolvieron los precipitados obtenidos anteriormente en tampones adecuados y se sometieron a tratamiento adicional.

Se redisolvieron los precipitados en PBS a pH 7,4 que contenía urea 10 M y se sometieron a SDS-PAGE de Laemmli. Los volúmenes de las fracciones de AS se cargaron de tal forma que la cantidad de receptor putativo debe ser comparable en las diferentes muestras.

El soporte de transferencia se incubó con proteína recombinante E2-CHO como se describe anteriormente.

Los resultados se muestran en la Figura 12 y muestran que la precipitación de p24 ocurre en el intervalo del 33 al 50% de saturación.

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Línea	Descripción
1A	membranas iniciales
2A	fracción de AS al 20%
3A	fracción de AS al 33%
4A	fracción de AS al 43%
5A	fracción de AS al 50%
6A	fracción de AS al 60%

5.3. Cromatografía de interacción hidrófoba

Se fraccionaron previamente 1,5 ml de membranas solubilizadas de células MOLT-4 (concentración de proteína de 2,5 mg/ml) al 25% de saturación de sulfato de amonio y el sobrenadante de esta etapa se llevó a una saturación de AS del 50%. El precipitado obtenido se resuspendió en 200 \mul de PBS que contenía sulfato de amonio al 25% de saturación. El material sin disolver se sedimentó por centrifugación a 15800 g durante 30 minutos. El sobrenadante obtenido se incubó con 200\mul de matriz de Fenil-Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Suecia), previamente equilibrada en PBS a pH 7,2 que contenía AS al 25% de saturación, durante 2 horas a temperatura ambiente.

El material no retenido se recuperó por filtración en una centrifugadora filtradora Spin-X^{TM} (Costar, EE.UU.).

La matriz de Fenil-Sepharose se lavó dos veces con 100 \mul de PBS, saturación de AS al 25% y una vez con 300 ml del mismo tampón. Después se eluyó la matriz con PBS a pH 7,4 (200 \mul) y después con PBS, a pH 7,4 que contenía MeOH al 20%. Finalmente, se trató la matriz con 40 \mul de tampón de Laemmli no reductor.

Las muestras que contenían sulfato de amonio (es decir, el material no retenido y de lavado) se dializaron con urea 8 M en PBS a pH 7,4.

Todas las muestras se sometieron a análisis por SDS-PAGE y transferencia western.

5.4. Precipitación con acetona

Se mezclaron 50 \mul de membranas de las células MOLT-4 solubilizadas en CHAPS 8 mM en PBS, a pH 7,4 con 200 \mul de acetona.

Se centrifugó la muestra a 15800 g durante 15 minutos y se desechó el sobrenadante. El precipitado obtenido se disolvió en tampón de muestra de Laemmli no reductor y se sometió a SDS-PAGE y transferencia western. Los soportes de transferencia se incubaron con la proteína recombinante E2-CHO como se describe anteriormente.

Los resultados del experimento de HIC y precitación con acetona combinados se muestran en la Figura 13.

Línea	Descripción
1A	membranas iniciales (16 \mul de contenido total de proteína)
2A	material no retenido en la matriz
3A	lavado
4A	material eluido con PBS, a pH 7,4
5A	material eluido con PBS, a pH 7,4 que contiene metanol al 20%
6A	material eluido con tampón de Laemmli
7A	membranas solubilizadas en Triton al 1%, PBS a pH 7,4 (26 \mug de proteína total)
8A	precipitado en acetona de la muestra 7A

Las muestras de 1B a 8B corresponden a las muestras 1A a 8A.

Estos experimentos muestran que el material precipitado con sulfato de amonio puede volver a disolverse en condiciones adecuadas y someterse a cromatografía de interacción hidrófoba. La proteína de 24 kDa del receptor putativo del VHC se une a Fenil-Sepharose y puede recuperarse de esta matriz.

El extracto de membrana puede precipitarse con acetona sin perder la capacidad de unión del receptor putativo del VHC.

Se entenderá que la invención se describe anteriormente a modo de ejemplo y pueden realizarse modificaciones dentro del alcance y espíritu de la invención sin necesidad de experimentación indebida ni el ejercicio de ingenio inventivo.

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Referencias

1.: Solicitud de patente europea EP-A-0318216.

2.: Solicitud de patente europea EP-A-0388232.

3.: Choo y col. PNAS USA (1991) 88 2451-2455.

4.: Chien, D. Y. y col. PNAS USA (1992) 89 10011-10015.

5.: Spaete, R.R. y col. Virology (1992) 188 819-830.

6.: Gething y col Nature [necesita referencia completa].

7.: "Flow Cytometry" en Methods of Cell Biology, 1990 vol. 33 Academic Press San Diego.

8.: Morre' D.J. y col., Methods Enzymol. (1994) 228, 448-450.

9.: Laemmli y col. Nature (1970) 27 680.

Claims

1. Uso de una proteína transmembrana que tiene un peso molecular de aproximadamente 24 kD, determinada usando electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico y poliacrilamida en un gel de acrilamida al 12%, que es capaz de unirse específicamente a la proteína E2 del virus de la hepatitis C, o una variante o fragmento de dicha proteína que es capaz de unirse específicamente a la proteína E2 del virus de la hepatitis C, siendo posible obtener dicha proteína mediante un procedimiento que comprende las etapas de:

a) preparar una preparación de membrana celular plasmática de células de mamífero seleccionadas por su hiperexpresión de la proteína de 24 kDa de la invención;

b) someter la preparación a precipitación con sulfato de amonio con una saturación inferior al 33% y reservar el sobrenadante;

c) someter el sobrenadante a precipitación con sulfato de amonio con una saturación entre el 33 y el 50% y reservar la proteína; y

d) resuspender el precipitado y someterlo a cromatografía por interacción hidrófoba;

en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o diagnóstico de una infección por VHC.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha proteína está funcionalmente no glicosilada.