ES2202469T3

ES2202469T3 - Proteina relacionada con el vegf.

Info

Publication number: ES2202469T3
Application number: ES96931450T
Authority: ES
Inventors: James Lee; William Wood
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1995-09-08
Filing date: 1996-08-30
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2016-08-30
Also published as: EP0848755B9; AU2008207460A1; US20120230992A1; AU710696B2; ES2202469T5; PT848755E; AU2004218707B2; WO1997009427A1; DE69628652T3; US20060121025A1; AU710696C; US20080213272A1; EP1382679A3; EP0848755B1; ATE242809T1; JP4763826B2; DE69628652D1; JP2010068806A; DK0848755T3; US6576608B1

Abstract

SE HA IDENTIFICADO Y AISLADO UNA PROTEINA RELACIONADA CON EL VEGF (PRV) QUE SE UNE Y ESTIMULA LA FOSFORILACION DEL RECEPTOR FLT4 DE LA TIROSINA CINASA. SE HA POSTULADO QUE LA PRV ES EL TERCER ELEMENTO DE LA FAMILIA DE PROTEINAS VEGF. SE PRESENTAN TAMBIEN LOS ANTICUERPOS QUE SE UNEN A LA PRV Y QUE NEUTRALIZAN LA ACTIVIDAD BIOLOGICA DE LA PRV, LAS COMPOSICIONES QUE CONTIENEN PRV O ANTICUERPOS, LOS METODOS DE USO, LOS POLIPEPTIDOS QUIMERICOS Y EL POLIPEPTIDO SEÑALIZADOR DE LA PRV.

Description

Proteína relacionada con el VEGF.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención pertenece generalmente a un ligando de un receptor que es proteína quinasa de tirosina. Más concretamente, la invención se refiere a un nuevo ligando, denominado proteína relacionada con VEGF (VRP) o VH1, el cual se une a, y estimula la fosforilación del receptor quinasa de tirosina Flt4 (conocido también como el receptor Sal-S1), y al aislamiento y producción recombinante del mismo.

Descripción del campo relacionado

La formación de vasos sanguíneos nuevos, bien a partir de células endoteliales diferenciándose durante el desarrollo embrionario (vasculogénesis) o a partir de vasos preexistentes durante la vida adulta (angiogénesis), es una característica esencial del desarrollo de órganos, de la reproducción, y de la cicatrización de heridas en organismos superiores. Folkman y Shing, J. Biol. Chem. 267: 10931-10934 (1992); Reynolds et al., FASEB J. 6:886-892 (1992); Risau et al., Development 102:471-478 (1988). La angiogénesis es necesaria también para ciertos procesos patológicos, incluyendo la tumorigénesis (Folkman, Nature Medicine 1:27-31 (1995)) y la retinopatía (Miller et al., Am. J. Pathol. 145:574-584 (1994)).

Mientras que varios factores de crecimiento pueden estimular la angiogénesis (Klagsbrun y D'Amore, Ann. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991); Folkman y Klagsbrun, Science 235:442-447 (1987)), el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (Ferrara et al., Endo. Rev. 13:18-32 (1992)) es un factor angiogénico potente que actúa a través del receptor quinasa de tirosina, específico de células endoteliales, de la quinasa de tirosina parecida a fms (Flt1) (Shibuya et al., Oncogene 5:519-524 (1990); de Vries et al., Science 255:989-991 (1992)) y de la quinasa de hígado fetal (Flk1) (también denominado KDR). Quinn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7533-7537 (1993); Millauer et al., Cell 72:835-846 (1993); Matthews et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9026-9030 (1991); Terman et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 187:1579-1586 (1992); Terman et al., Oncogene 6:1677-1683 (1991); Oelrichs et al., Oncogene 8:11-18 (1993). Estos dos receptores VEGF y un tercer receptor huérfano, Flt4 (Pajusola et al., Cancer Res. 52:5738-5743 (1992); Galland et al., Oncogene 8:1233-1240 (1993); Finnerty et al., Oncogene 8:2293-2298 (1993)) constituyen una subfamilia de las quinasas de tirosina de receptor de la clase III, que contiene siete dominios extracelulares similares a inmunoglobulinas y un dominio quinasa de tirosina intracelular separado. Mustonen y Alitalo, J. Cell Biol. 129:895-898 (1995). Ver también la W094/10.202, publicada el 11 de mayo de 1994, y la PCT/US93/00.586 registrada el 22 de enero de 1993 (Avraham et al.). Estos tres receptores tienen un 31-36% de identidad de aminoácidos en sus dominios extracelulares unidores de ligando.

Los ratones con Flt1 deficiente (Fong et al., Nature 376:66-70 (1995)) o Flk1 (Shalaby et al., Nature 376:62-66 (1995)) (generados mediante manipulación génica en células troncales embrionarias) tienen defectos graves en su vasculogénesis y mueren en el útero en los días embrionarios 8-9. El fenotipo de los ratones con Flt1 deficiente difiere considerablemente, sin embargo, los ratones que carecen de Flt1 tiene un endotelio vascular desorganizado que afecta a los vasos principales así como a la microvasculatura, mientras que la diferenciación de células endoteliales parece ser normal. Fong et al., ver más arriba. Los ratones que carecen de Flk1 tienen un defecto principal en el desarrollo de células endoteliales maduras, así como una importante reducción en los progenitores celulares hematopoyéticos. Shalaby et al., ver más arriba. Por tanto, el VEGF podría actuar sobre células endoteliales en más de una etapa de la vasculogénesis.

El Flt4 también se expresa específicamente en células endoteliales: se observa primero en embriones de ratón de 8,5 días en precursores de células endoteliales. Kaipainen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3566-3570 (1995); Kaipainen et al., J. Exp. Med. 178:2077-2088 (1993). Ver también Hatva et al., Am. J. Pathol. 146:368-378 (1995). A medida que progresa el desarrollo, la expresión del Flt4 aparece confinada al endotelio venoso y linfático, y finalmente se restringe a los vasos linfáticos. De forma consistente con este hallazgo, los tejidos adultos humanos presentan expresión del Flt4 en el endotelio linfático, mientras que hay una ausencia de expresión en arterias, venas y capilares. Kaipainen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ver más arriba. Se han aislado clones que codifican el Flt4 humano y de ratón, bien mediante PCR con cebadores procedentes de regiones conservadas de la quinasa de tirosina (Finnerty et al., ver más arriba; PCT/US93/00.586, ver más arriba; Aprelikova et al., Cancer Res. 52:746-748 (1992)) o mediante hibridación con baja exigencia con una sonda Flk2. Galland et al., Genomics 13:475-478 (1992). El empalme alternativo del mARN de Flt4 produce dos variantes de la proteína que difieren en 65 aminoácidos en el extremo C-terminal. Pajusola et al., Oncogene 8:2931-2937 (1993). Estas variantes migran como bandas de 170-190 kDa, que son parcialmente cortadas proteolíticamente en el dominio extracelular para producir una forma de aproximadamente 125 kDa. Pajusola et al., Oncogene 8, ver más arriba; Pajusola et al., Oncogene 9:3545-3555 (1994). La expresión de la forma empalmada más larga del Flt3 como una quimera, con el dominio extracelular del receptor CSF-1, muestra que el dominio intracelular del Flt3 puede señalizar una respuesta de crecimiento dependiente de ligando en fibroblastos de roedor. Pajusola et al., Oncogene 9, ver más arriba; Borg et al., Oncogene 10:973-984 (1995). El Flt4 ha sido localizado en el cromosoma humano 5q34-q35 (Aprelikova et al., ver más arriba; Galland et al., Genomics, ver más arriba); el Flt1 y el Flk1 están ubicados en el 13q12 (Imbert et al., Cytogenet. Cell Genet. 67:175-177 (1994)) y 4q12. Sait et al., Cytogenet. Cell Genet. 70:145-146 (1995); Spritz et al., Genomics 22:431-436 1994).

El VEGF es una proteína homodimérica, rica en cisteínas, que puede ocurrir en al menos cuatro formas debido al empalme alternativo de su mARN. Ferrara et al., ver más arriba. Aunque el VEGF es un ligando de alta afinidad por el Flt1 y el Flk1, no se une ni activa el Flt4. Pajusola et al., Oncogene 9, ver más arriba. El único otro miembro de la familia VEGF estrechamente relacionado es un factor de crecimiento placentario (PIGF), el cual tiene una identidad de aminoácidos del 47% con el VEGF. Maglione et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9267-9271 (1991). El PIGF también existe en dos formas montadas alternativamente, las cuales difieren en la presencia o ausencia de un dominio unidor de heparina básico de 21 aminoácidos. Maglione et al., Oncogene 8:925-931 (1993); Hausser y Weich, Growth Factors 9:259-268 (1993). El PIGF se une al Flt1 pero no al Flk1 (Park et al., J. Biol. Chem. 269:25.646-25.654 (1994)); se cree que su unión al Flt4 no ha sido determinada. El PIGF no consigue duplicar la mitogénesis de las células endoteliales capilares o las actividades de permeabilidad del VEGF, sugiriendo que estas actividades son mediadas por el receptor Flk1. Park et al., ver más arriba.

En la literatura de patentes se descubren moléculas que modulan el receptor Flk1 o que neutralizan la activación de un receptor VEGF. Por ejemplo, la WO 95/21.613, publicada el 17 de agosto de 1995, descubre compuestos que modulan la transducción de señal del receptor KDR/Flk1, para regular y/o modular la vasculogénesis y angiogénesis, y descubre el uso del Flk1 para evaluar y buscar drogas y análogos del VEGF implicados en la modulación del Flk1 a través de actividades agonistas o antagonistas; la WO 95/21.865 publicada el 17 de agosto de 1995 descubre moléculas inmunointeractivas con la quinasa neuroepitelial animal (NYK)/Flk1, moléculas que pueden usarse para proporcionar agentes para el tratamiento, profilaxis, y diagnóstico de un fenotipo angiogériico-dependiente; y la WO 95/21.868, publicada el 17 de agosto de 1995, descubre anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a un dominio extracelular de un receptor de VEGF y neutralizan la activación del receptor.

Resumen de la invención

Se han identificado ahora clones de cADN que codifican una proteína nueva, denominada VRP, la cual se une a y estimula la fosforilación del receptor quinasa de tirosina Flt4. La VRP está relacionada en su secuencia de aminoácidos al VEGF, pero no interacciona apreciablemente con los receptores del VEGF, el Flt1 y Flk1.

En un aspecto, la invención proporciona la VRP humana, biológicamente activa, aislada, que contiene al menos 265 aminoácidos, de la Figura 1. Preferiblemente, la proteína relacionada con el VEGF (VRP) humana, biológicamente activa, aislada, comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos los residuos +1 a 29, inclusive, de la Figura 1. En otro aspecto, la invención proporciona VRP humana, biológicamente activa, aislada, que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada como los residuos -20 a 399, inclusive, o los residuos 1 a 399, inclusive, de la Figura 1.

La invención también se refiere a quimeras que comprenden la VRP unida a otro polipéptido. Por ejemplo, la invención proporciona un polipéptido quimérico que comprende la VRP fusionada a una secuencia polipeptídica tag. Un ejemplo de una quimera tal es el VRP con epítopo marcado.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición que comprende VRP biológicamente activa y un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización más específica, la invención proporciona una composición farmacéutica, útil para la promoción del crecimiento celular endotelial vascular o linfático, que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de la VRP en un portador farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, esta composición comprende además otro factor de crecimiento celular, tal como el VEGF y/o el PDGF.

En un aspecto ulterior, la invención proporciona el uso de la proteína. de la invención en la fabricación de un medicamento para tratar traumas que afectan el endotelio vascular, comprendiendo la administración a un mamífero que padece dicho trauma de una cantidad efectiva de la composición que contiene la VRP. El trauma es, por ejemplo, úlceras diabéticas o una herida de los vasos sanguíneos o del corazón. En otra realización, la invención proporciona el uso de la proteína de la invención en la fabricación de un medicamento para tratar un estado disfuncional caracterizado por la ausencia de activación o ausencia de inhibición de un receptor por la VRP en un mamífero, comprendiendo la administración al mamífero de una cantidad efectiva de la composición que contiene la VRP.

La invención proporciona un procedimiento in vitro que implica poner en contacto el receptor Flt4 con la VRP para causar la fosforilación del dominio quinasa del mismo. Por ejemplo, la invención proporciona un procedimiento para estimular la fosforilación de un dominio de quinasa de tirosina de un receptor Flt4, que comprende poner en contacto un dominio extracelular del receptor Flt4 con la VRP.

La invención proporciona también un anticuerpo monoclonal que se une a la VRP y, preferiblemente, neutraliza también una actividad biológica de la proteína estando caracterizada una actividad biológica como promotora de la neovascularización, o de la permeabilidad vascular, o del crecimiento de las células endoteliales vasculares en un mamífero. Alternativa o conjuntamente, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal que se une a la porción N-terminal entre los residuos -20 a 137, inclusive, o entre los residuos -1 a 137, inclusive, de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1. El anticuerpo puede usarse, por ejemplo, para detectar la presencia de la VRP en una muestra biológica sospechosa de contener la proteína, o para tratar pacientes. La invención contempla una composición farmacéutica que comprende tal anticuerpo y un portador farmacéuticamente aceptable.

Además, la invención contempla un péptido consistente en una secuencia de aminoácidos mostrados como los residuos -20 a -1, inclusive, de la Figura 1.

En una realización ulterior, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la VRP o una quimera de la VRP. En un aspecto, la molécula de ácido nucleico es ARN o ADN que codifica una VRP biológicamente activa, o que es complementario a la secuencia de ácido nucleico que codifica tal VRP, y permanece unido establemente a ella en condiciones exigentes. La molécula de ácido nucleico incluye opcionalmente las regiones de las secuencias de ácido nucleico de la Figura 1, las cuales codifican secuencias señalizadoras. En una realización, la secuencia de ácido nucleico se selecciona de entre:

: (a) la región codificante de la secuencia de ácido nucleico de la Figura 1 que codifica la preproteína, desde el residuo -20 hasta el residuo 399, o que codifica la proteína madura, desde el residuo 1 hasta el residuo 399 (es decir, los nucleótidos 372 a 1628, inclusive, o los nucleótidos 432 a 1628, inclusive, de la secuencia de ácido nucleico mostrada en la Figura 1 como SEC. N° ID.: 1); o

: (b) una secuencia correspondiente a la secuencia de (a) dentro del ámbito de degeneración del código genético.

En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico puede proporcionarse en un vector replicable, que comprende la molécula de ácido nucleico operativamente unida a secuencias de control reconocidas por una célula huésped transfectada o transformada con el vector. La invención proporciona además una célula huésped que comprende el vector o la molécula de ácido nucleico. También se proporciona un procedimiento para producir la VRP, el cual comprende cultivar una célula huésped que comprende la molécula de ácido nucleico, y recuperar la proteína a partir del. cultivo de la célula huésped.

Breve descripción de las figuras

Las Figuras 1A-1D ilustran la secuencia del nucleótido codificante (SEC. N° ID.: 1), la secuencia complementaria del nucleótido (SEC. N° ID.: 2), y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC. N° ID.: 3) de la VRP humana descrita en ésta.

La Figura 2 ilustra la unión de Flt4/IgG y de Rse/IgG (una proteína de fusión no relacionada con el receptor) a la línea celular humana de glioma G61, unión que se evaluó mediante análisis FACS.

Las Figuras 3A y 3B ilustran respectivamente un mapa de los clones de cADN que codifican la VRP humana, y un alineamiento de la secuencia proteica de la VRP (SEC. N° ID.: 3) con la del VEGF_{121} (SEC. N° ID.: 4) y PIGF_{131} (SEC. N° ID.: 5). La Figura 3A muestra el alcance de cuatro clones de cADN de la VRP; las líneas discontinuas indican las porciones ausentes del VH1.1 y VH1.3. Las flechas indican sitios de enzimas de restricción; el recuadro sombreado indica la secuencia señalizadora de secreción putativa; el recuadro vacío indica la proteína madura; las denominaciones del tipo-Y dentro del recuadro vacío indican los sitios de glicosilación unidos a N potenciales; y las líneas verticales indican los residuos cisteína. Se muestra un diagrama del VEGF_{121} por comparación. La gráfica de hidropatía (Kyle y Doolittle, J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)) es para el VRP. En la Figura 3B, el "sobrerayado" indica la región codificada mediante una marca de secuencia expresada (EST) (secuencia de una porción de un clon de cADN), procedente del GeneBank, denominada HSC1WF111.

La Figura 4 ilustra un mapa del clon de cADN para la VRP humana de longitud completa en ésta, con respecto a once EST conocidas. Los once fragmentos de la secuencia de aminoácidos parcial de las EST son el H07991 y H07899 (respectivamente, extremos 5' y 3' del mismo fragmento clonado), el H05134 y H05177 (respectivamente, extremos 3' y 5' del mismo fragmento clonado), el HSC1WF112 y HSC1WF111 (respectivamente, extremos 3' y 5' del mismo fragmento clonado), el R77495 (extremo 3' de un fragmento clonado), y el T84377 y T89295 (respectivamente, extremos 5' y 3' del mismo fragmento clonado).

La Figura 5 ilustra la unión de ^{125}I-Flt4/IgG a VRP purificada. La unión se realizó en ausencia (-) o presencia (+) de proteína de fusión de receptor e IgG (FIG. 5A) o con concentraciones crecientes de Flt4/IgG (FIG. 5B).

La Figura 6 muestra una gráfica del recuento de células de células endoteliales microvasculares de pulmón humano, como una función de la concentración de VEGF o VRP en el medio de cultivo, para verificar y comparar la actividad mitogénica.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas I. Definiciones

Al describir la presente invención, se emplearán los siguientes términos, y se pretende que se definan como se indica más abajo.

"VRP humana" se define en ésta como una secuencia polipeptídica que contiene al menos los residuos -20 a 399, inclusive, o los residuos +1 a 399, inclusive, de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1, incluyendo los residuos -5 a 399, inclusive, y los residuos -4 a 399, inclusive, de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1, así como las variantes, mediante supresión, inserción o sustitución, biológicamente activas de las secuencias anteriores, que tienen al menos 265 aminoácidos, y que preferiblemente contienen al menos los residuos +1 a 29, inclusive, de la Figura 1. En una realización preferida, la secuencia de proteínas contiene al menos los residuos +1 a 107, inclusive, de la Figura 1, más preferiblemente al menos los residuos -20 a 29, inclusive, de la Figura 1, y más preferiblemente al menos los residuos -20 a 137, inclusive, de la Figura 1. En otra realización preferida, las variantes biológicamente activas tienen una longitud de 265 a aproximadamente 450 residuos aminoácidos, más preferiblemente aproximadamente 300-450, incluso más preferiblemente aproximadamente 350-450, y más preferiblemente aproximadamente 399-419 residuos aminoácidos. Otro conjunto de variantes preferido son las variantes que son variantes mediante inserción o sustitución, o variantes mediante supresión en las que la supresión está en la secuencia señal y/o no está en la región N-terminal de la molécula (es decir, en los residuos 1-29, preferiblemente en los residuos 1-137). La definición de la VRP excluye todas las secuencias EST conocidas, tales como, por ejemplo, la H07991, H05134, H05177, HSC1WF112, HSC1WF111, T81481, R77495, H07899, T84377, T81690 y T89295, así como todas las formas del VEGF y PIGF.

"Biológicamente activa", para los propósitos en ésta, significa que tiene la capacidad de unirse al, y 35 estimular la fosforilación del, receptor Flt4. Generalmente, la proteína se unirá al dominio extracelular del receptor Flt4 y, por tanto, activará o inhibirá el dominio intracelular quinasa de tirosina del mismo. En consecuencia, la unión de la proteína al receptor podría resultar en la potenciación o inhibición de la proliferación y/o diferenciación y/o activación in vivo o in vitro de células que tienen el receptor Flt4 para la VRP. La unión de la proteína al receptor Flt4 puede determinarse usando técnicas convencionales, incluyendo procedimientos de unión competitiva, tales como RIA, ELISA, y otros ensayos de unión competitiva. Los complejos ligando/receptor pueden identificarse usando procedimientos de separación tales como la filtración, centrifugación, citometría de flujo (ver, por ejemplo, Lyman et al., Cell 75:1157-1167 (1993); Urdal et al., J. Biol. Chem. 263:2870--2877 (1988); y Gearing et al., EMBO J. 8:3667-3676 (1989)), y similares. Los resultados procedentes de los estudios de unión pueden analizarse usando cualquier representación gráfica convencional de los datos de unión, tales como el análisis de Scatchard (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660-672 (1949); Goodwin et al., Cell 73:447-456 (1993)), y similares. Puesto que la VRP induce la fosforilación del receptor Flt4, también pueden usarse ensayos convencionales de fosforilación de la tirosina, tales como el ensayo descrito en el Ejemplo 5 en ésta, como una indicación de la formación del complejo receptor Flt4/VRP.

El término "epítopo marcado" cuando se usa en ésta se refiere a un polipéptido quimérico que comprende la VRP entera, o una porción de la misma, fusionada a un "polipéptido marca". El polipéptido marca tiene suficientes residuos para proporcionar un epítopo contra el que puede prepararse un anticuerpo, aunque es lo bastante corto como para no interferir con la actividad de la VRP. El polipéptido marca preferiblemente también es bastante único, de forma que el anticuerpo contra el mismo no reaccione de forma cruzada con otros epítopos. Los polipéptidos marca apropiados generalmente tienen al menos seis residuos aminoácidos, y usualmente entre aproximadamente 8-50 residuos aminoácidos (preferiblemente entre aproximadamente 9-30 residuos).

"Aislado", cuando se usa para describir las diversas proteínas descubiertas en ésta, significa una proteína que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con los usos diagnóstico y terapéutico de la proteína, y podrían incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteicos y no proteicos. En las realizaciones preferidas, la proteína se purificará (1) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (2) hasta homogeneidad en SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras y reductoras usando azul de Coomassie, o, preferiblemente, tinción de plata. La proteína aislada incluye proteína in situ con células recombinantes, puesto que al menos un componente del entorno natural de la VRP no estará presente. No obstante, ordinariamente, la proteína aislada se preparará mediante al menos un paso de purificación.

Proteína "esencialmente pura" significa una composición que comprende al menos aproximadamente el 90% en peso de la proteína, en base al peso total de la composición, preferiblemente al menos aproximadamente el 95% en peso. Proteína "esencialmente homogénea" significa una composición que comprende al menos aproximadamente el 99% en peso de proteína, en base al peso total de la composición.

Una molécula de ácido nucleico de VRP aislada es una molécula de ácido nucleico que es identificada y separada al menos de una molécula de ácido nucleico contaminante, con la cual está ordinariamente asociada en las fuentes naturales del ácido nucleico de la VRP. Una molécula de ácido nucleico de VRP aislada es distinta de la forma y disposición en la que se halla en la naturaleza. Por tanto, las moléculas de ácido nucleico de VRP aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico de la VRP tal como ésta existe en las células naturales. No obstante, una molécula de ácido nucleico de VRP aislada incluye moléculas de ácido nucleico de VRP contenidas en células que expresan ordinariamente la VRP, en donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosómica diferente de la de las células naturales.

El polipéptido de VRP aislado, el ácido nucleico de VRP, o el anticuerpo contra la VRP podrían marcarse para propósitos diagnósticos y de sondeo usando una marca, tal como se describe y define más adelante en la discusión sobre los usos de los anticuerpos contra la VRP.

La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante operativamente unida en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son apropiadas para los procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, un sitio de unión de ribosomas, y, posiblemente, otras secuencias todavía pobremente comprendidas. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación, y pctenciadores.

Un ácido nucleico está "operativamente unido" cuando se coloca en una relación funcional con respecto otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una pre-secuencia o líder secretor está operativamente unido al ADN para un polipéptido si se expresa como una pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente unido a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión de ribosomas está operativamente unido a una secuencia codificante si está ubicado para facilitar la traducción. Generalmente, "operativamente unido" significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas, y, en el caso de un líder secretor, contiguas en la fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen porque ser contiguos. El engarce se consigue mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, se usan adaptadores o engarces de oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio, y específicamente cubre anticuerpos monoclonales anti-VRP sencillos (incluyendo anticuerpos agonistas y antagonistas) y composiciones de anticuerpos anti-VRP con especificidad poliepitópica.

El término "anticuerpo monoclonal" tal como se usa en ésta se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que forman la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones que ocurren naturalmente que podrían estar presentes en cantidades menores.

Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un único sitio antigénico. Más aún, en contraste con tan convencionales preparaciones de anticuerpos (policlonales), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante sobre el antígeno. Los anticuerpos monoclonales en ésta incluyen anticuerpos híbridos y monoclonales producidos empalmando un dominio variable (incluyendo hipervariable) de un anticuerpo anti-VRP con un dominio constante (por ejemplo, anticuerpos "humanizados"), o una cadena ligera con una cadena pesada, o una cadena procedente de una especie con una cadena de otra especie, o fusiones con proteínas heterólogas, con independencia de las especies de origen o de la denominación de la clase o subclase de inmunoglobulina, así como fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, F(ab')_{2}, y Fv), con tal que exhiban la actividad biológica deseada. Ver, por ejemplo, la patente estadounidense n° 4.816.567, y Mage y Lamoyi, en Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 79-97 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987).

Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo, que se obtiene a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe limitarse en el sentido de requerir la producción del anticuerpo mediante cualquier procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a usar de acuerdo con la presente invención podrían prepararse mediante el procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler y Milstein, Nature 256:495 (1975), o podría prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante, patente estadounidense n° 4.816.567. Los "anticuerpos monoclonales" podrían aislarse también a partir de bibliotecas de fagos generadas usando las técnicas descritas, por ejemplo, en McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990).

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de ratón) son inmunoglobulinas quiméricas específicas, cadenas de inmunoglobulinas, o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2}, u otras subsecuencias de anticuerpos unidoras de antígeno), las cuales contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en el que los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor son remplazados por residuos procedentes de un CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como un ratón, rata o conejo, que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunos casos, los residuos de la región estructural de Fv (FR) de la inmunoglobulina humana son remplazados por residuos no humanos correspondientes. Más aún, el anticuerpo humanizado podría comprender residuos que no se encuentran no en el anticuerpo receptor ni en la CDR o secuencias estructurales importadas. Estas modificaciones se hacen para refinar y optimizar aún más las prestaciones del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquéllas de la inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquéllas de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimamente comprenderá también al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana.

Tal como se usa en ésta, el término "factor de crecimiento celular endotelial vascular", o "VEGF", se refiere a un factor de crecimiento de mamíferos, derivado originalmente de células foliculares de la pituitaria bovina, que tiene la secuencia de aminoácidos de la Figura 2 de WO 90/13.649, y que tiene la secuencia de aminoácidos humana de la Figura 10 de WO 90/13.649. Ver también la patente estadounidense n° 5.194.569, la cual descubre el VEGF bovino de 120 aminoácidos, y el VEGF humano de 121 aminoácidos. La actividad biológica del VEGF nativo es capaz de promover el crecimiento selectivo de células endoteliales vasculares, pero no el de células endoteliales de córneas bovinas, células epiteliales del cristalino, células del córtex adrenal, fibroblastos BHK-21, o queratinocitos.

La expresión "trauma que afecta el endotelio vascular" se refiere a trauma, tal como lesiones, contra los vasos sanguíneos o el corazón, incluyendo la red vascular de órganos, a los cuales está sometido un animal o humano, preferiblemente un mamífero, y más preferiblemente un humano. Los ejemplos de tales traumas incluyen las heridas, incisiones, y úlceras, más preferiblemente úlceras diabéticas y heridas o laceraciones de los vasos sanguíneos del corazón. El trauma incluye condiciones causadas por sucesos internos, así como aquéllas que son impuestas por un agente extrínseco tal como un patógeno, las cuales pueden mejorarse mediante la promoción del crecimiento de células endoteliales vasculares. También se refiere al tratamiento de heridas en las que se requiera la neovascularización o re-endotelialización para la cicatrización.

"Promoción del crecimiento de células endoteliales vasculares o linfáticas" se refiere a inducir o incrementar el crecimiento de células endoteliales vasculares o linfáticas, incluyendo las células endoteliales de la microvasculatura pulmonar humana.

Las "alteraciones relacionadas con la vasculogénesis y angiogénesis" incluyen el cáncer, la diabetes, los hemangiomas, y el sarcoma de Kaposi.

"Enfermedades o alteraciones caracterizadas por una neovascularización o permeabilidad vascular excesiva y no deseable" se refiere a enfermedades o alteraciones que incluyen, a modo de ejemplo, la neovascularización excesiva: los tumores, y especialmente los tumores malignos sólidos, la artritis reumatoide, la psoriasis, la ateroesclerosis, las retinopatias diabéticas y otras, la fibroplasia retrolental, la degeneración macular relacionada con la edad, el glaucoma neovascular, los hemangiomas, las hiperplasias de tiroides (incluyendo la enfermedad de Grave), los transplantes de córnea y otros tejidos, y la inflamación crónica. Los ejemplos de enfermedades o alteraciones caracterizados por una permeabilidad vascular excesiva incluyen el edema asociado con tumores cerebrales, ascites asociados con cáncer, el síndrome de Meig, la inflamación del pulmón, el síndrome nefrótico, la efusión pericardíaca (tal como la asociada con pericarditis), y la efusión pleural.

"Estados disfuncionales caracterizados por una activación o inhibición excesiva de un receptor de la VRP" (incluyendo tal receptor el Flt4) se refiere a alteraciones o enfermedades que serían tratadas beneficiosamente proporcionando, a un mamífero que presenta tal condición patológica, un antagonista de la VRP, tal como una quimera del Flt4 o de su dominio extracelular (por ejemplo, una fusión de IgG con Flt4) o un anticuerpo contra la VRP.

"Estados disfuncionales caracterizados por una ausencia de activación o ausencia de inhibición de un receptor de la VRP" (incluyendo tal receptor el Flt4) se refiere a alteraciones o enfermedades que serían tratadas beneficiosamente proporcionando la VRP o un agonista del receptor de la VRP a un mamífero que presenta tal condición patológica.

"Tratamiento" se refiere a ambos, tratamiento terapéutico y medidas profilácticas o preventivas. Aquéllos que necesitan tratamiento incluyen aquéllos que ya padecen la alteración, así como aquéllos propensos a tener la alteración o aquéllos en los que debe prevenirse la alteración.

"Mamífero", para los propósitos de tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo los humanos, animales domésticos y de granja, y de zoo, de deportes, y animales de compañía, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferiblemente, el mamífero en ésta es humano.

"Cantidad efectiva" o "cantidad terapéuticamente efectiva" de VRP, composición de VRP, anticuerpo, o composición de anticuerpo, en una cantidad que es efectiva bien para prevenir, disminuir la gravedad, o aliviar, o curar la condición tratada. Por ejemplo, una cantidad efectiva de VRP incluye la cantidad que es suficiente para potenciar el crecimiento del endotelio vascular in vivo, o para tratar un trauma, y una "cantidad efectiva" de anticuerpo contra la VRP incluye la cantidad que es suficiente para reducir el exceso de neovascularización y angiogénesis.

II. Modos de llevar a cabo la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento de una nueva VRP, la cual se une a, y estimula la fosforilación del receptor Flt4.

Se tomaron tres estrategias para identificar la proteína que se uniría y estimularía la fosforilación del receptor Flt4. Primero, el receptor de longitud completa se expresó establemente en células 293 para establecer un ensayo de fosforilación de receptor de quinasa de tirosina de la activación del Flt4. Este ensayo se usó para examinar aproximadamente 400 sobrenadantes de células y extractos de tejidos, con resultados positivos.

Segundo, el dominio extracelular del receptor se expresó como una proteína de fusión con un dominio Fc de inmunoglobulina. Mediante el uso de esta proteína de fusión (Flt4/IgG) para examinar líneas celulares, en busca de ligando unidos a membrana, mediante análisis de FACS, se identificó una línea celular positiva. La línea de glioma humano, G61, dio aproximadamente un desplazamiento de 10 veces en la intensidad del pico de fluorescencia que era específico para la Flt4/IgG (Figura 2). Los intentos de clonar y expresar este ligando putativo unido a membrana mediante la transfección de grupos de clones cADN en células COS, seguidos por la verificación con Flt4/IgG marcado, no dieron positivos a partir de 640 grupos de 1000-5000 clones cada uno. La Flt4/IgG también se usó para generar antisuero policlonal y anticuerpos monoclonales que tenían actividad agonista, y que se usaron para desarrollar el ensayo de fosforilación de tirosina del Flt4 tal como se describe más abajo en el Ejemplo 5.

Tercero, las proteínas ligando candidatas se ensayaron por su capacidad para unir la Flt4/IgG o para activar el ensayo de fosforilación del Flt4. El VEGF marcado no consiguió unir la Flt4/IgG, aunque la unión esperada del VEGF a la Flt1/IgG o Flk1/IgG. se detectó rutinariamente. La incapacidad del VEGF de unir o estimular la fosforilación del Flt4 ha sido descrita por Pajusola et al., Oncogene 9, ver más arriba. Se halló una proteína ligando candidata adicional mediante el uso de técnicas de clonación, los detalles de la cual se proporcionan más abajo en el Ejemplo 3. La secuencia de cADN de la VRP humana se ilustra en la Figura 1A-1D. El peso molecular predicho de la proteína es de 44,8 KDa.

Sigue una descripción de cómo podría prepararse la VRP humana biológicamente activa.

1. Preparación de la VRP

La mayoría de la siguiente discusión pertenece a la producción de VRP mediante el cultivo de células transformadas con un vector que contiene el ácido nucleico de la VRP, y la recuperación del polipéptido a partir del cultivo de células. Se contempla además que la VRP de esta invención podría producirse mediante recombinación homóloga, tal como se proporcionándole en WO 91/06.667, publicada el 16 de mayo de 1991.

En resumen, este procedimiento implica transformar células humanas primarias, que contienen un gen que codifica la VRP humana, con una construcción (es decir, un vector) que comprende un gen amplificable (tal como el de la reductasa de dihidrofolato (DHFR) u otros discutidos más abajo) y al menos una región flanqueante, con una longitud de al menos aproximadamente 150 p.b., que es homóloga con una secuencia de ADN en el locus de la región codificante del gen de la VRP, para proporcionar amplificación del gen de la VRP. El gen amplificable debe estar en un sitio que no interfiera con la expresión del gen de la VRP. La transformación se lleva a cabo de tal forma que la construcción para a estar homólogamente integrada en el genoma de las células primarias para definir una región amplificable.

Las células primarias que comprenden la construcción se seleccionan a continuación mediante el gen amplificable u otro marcador presente en la construcción. La presencia del gen marcador establece la presencia e integración de la construcción en el genoma huésped. No se precisa de ninguna selección ulterior de las células primarias, puesto que la selección se hará en el segundo huésped. Si se desea, la ocurrencia del suceso de recombinación homóloga puede determinarse empleando la PCR y, bien secuenciando las secuencias de ADN amplificadas resultantes, o determinando la longitud apropiadá del fragmento de la PCR cuando el ADN procedente de integrantes homólogos correctos está presente, y expandiendo sólo aquellas células que contienen tales fragmentos. También, si se desea, las células seleccionadas podrían amplificarse en este punto estresando las células con el agente amplificador apropiado (tal como el metotrexato si el gen amplificable es el de la DHFR), de forma que se obtengan múltiples copias del gen diana de cuño. Sin embargo, preferiblemente el paso de amplificación no se lleva a cabo hasta después de la segunda transformación descrita a continuación.

Después del paso de selección, se aíslan, a partir de las células primarias seleccionadas, porciones de ADN del genoma, suficientemente grandes para incluir la región amplificable entera. A continuación se transforman células huésped de expresión mamíferas secundarias con estas porciones de ADN genómico, y se clonan, y se seleccionan los clones que contienen la región amplificable. La región amplificable se amplifica entonces mediante un gen amplificable, si no se ha amplificado ya en las células primarias. Finalmente, las células huésped de expresión secundaria, que comprenden ahora múltiples copias de la región amplificable que contiene la VRP, se hacen crecer para expresar el gen y producir la proteína.

A. Aislamiento del ADN que codifica la VRP

El ADN que codifica la VRP podría obtenerse a partir de cualquier biblioteca de cADN preparada a partir de tejido que se cree posee el mARN de la VRP y lo expresa en un nivel detectable. En consecuencia, el ADN de la VRP humana podría obtenerse convenientemente a partir de una biblioteca de cADN preparada a partir de tejido cerebral humano, por ejemplo, una línea celular glial. El gen que codifica la VPR podría obtenerse también a partir de una biblioteca genómica o mediante síntesis de oligonucleótidos.

La bibliotecas se examinan con sondas (tales como anticuerpos contra la VRP u oligonucleótidos de aproximadamente 20-80 bases) diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por él. El examen de bibliotecas de cADN o genómicas con la sonda seleccionada podría realizarse usando procedimientos estándares, tal como se describe en los capítulos 10-12 de Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nueva York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un medio alternativo de aislar el gen que codifica la VRP es usar la metodología de la PCR tal como describe en la sección 14 de Sambrook et al., ver más arriba.

Un procedimiento preferido de practicar esta invención es usar secuencias oligonucleotídicas cuidadosamente seleccionadas para examinar bibliotecas de cADN procedentes de varios tejidos humanos, preferiblemente líneas celulares de cerebro. Las secuencias oligonucleotídicas seleccionadas como sondas deberían tener una longitud suficiente y ser lo suficientemente no ambiguas como para que los falsos positivos estén minimizados.

El oligonucleótido debe marcarse de forma que pueda detectarse a partir de su hibridación con el ADN en la biblioteca que se está examinando. El procedimiento de marcado preferido es usar ATP marcado con ^{32}P con la quinasa de polinucleótidos, como es bien conocido en la técnica. No obstante, podrían usarse otros procedimientos para marcar el oligonucleótido, incluyendo, pero no limitándose a, la biotinilación o el marcado enzimático.

En algunas realizaciones preferidas, la secuencia de ácido nucleico incluye la secuencia señal de la VRP nativa. El ácido nucleico que tiene la totalidad de la secuencia que codifica la proteína se obtiene examinando bibliotecas de cADN o genómicas seleccionadas usando procedimiento como los descritos en la sección 7.79 de Sambrook et al., ver más arriba, para detectar precursores e intermediarios de procesamiento del mARN que podrían no haberse transcritos de forma inversa en cADN.

Las variantes en la secuencia de aminoácidos de la VRP se preparan introduciendo cambios en los nucleótidos apropiados en el ADN de la VRP, o mediante síntesis delpolipéptido de VRP deseado. Tales variantes presentan inserciones, sustituciones, y/o supresiones de, residuos en uno o ambos extremos de la secuencia de aminoácidos mostrada para la VRP en la Figura 1. Preferiblemente, estas variantes representan inserciones y/o sustituciones en uno o ambos extremos de la secuencia madura, y/o inserciones, sustituciones y /o supresiones en uno o ambos extremos de la secuencia de señal de la VRP mostrada en la Figura 1. Cualquier combinación de inserción, sustitución, y/o supresión se hace para llegar a la construcción final, con tal que la construcción final posea la actividad biológica deseada tal como se define en ésta. Los cambios de aminoácidos podrían alterar también los procesos posteriores a la traducción de la VRP, tales como cambiar el número o posición de los sitios de glicosilación, alterar las características de anclaje a la membrana, y/o alterar la ubicación intracelular de la VRP insertando, suprimiendo, o afectando de otro modo la secuencia líder de la VRP.

Las variaciones en la secuencia nativa, tal como se describen más arriba, pueden hacerse usando cualquiera de las técnicas e indicaciones para mutaciones conservadoras y no conservadoras descritas en la patente estadounidense n° 5.364.934. Estas incluyen la mutagénesis mediada por oligonucleótidos (dirigida contra un sitio), el barrido con alanina, y la mutagénesis con PCR. Ver también, por ejemplo, la Tabla 1 en ésta y la discusión que rodea esta tabla para una guía sobre la selección de aminoácidos a cambiar, añadir, o suprimir.

B. Inserción de ácido nucleico en el vector replicable

El ácido nucleico (por ejemplo, cADN o ADN genómico) que codifica la VRP nativa o variante se inserta en un vector replicable para su ulterior clonación (amplificación del ADN) o para su expresión. Hay muchos vectores disponibles. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción.

(i) Componente secuencia de señal

Las VRP de esta invención podrían producirse de forma recombinante no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, el cual preferiblemente es una secuencia de señal u otro polipéptido que tenga un sitio de corte específico en el extremo N-terminal de la proteína o polipéptido maduro. En general, la secuencia de señal podría ser un componente del vector, o podría ser parte del ADN de la VRP que se inserta en el vector. La secuencia de señal heteróloga seleccionada es preferiblemente una que es reconocida y procesada (es decir, cortada por una peptidasa señal) por la célula huésped. Para células procariotas que no reconocen y procesan la secuencia señal de la VRP nativa, la secuencia señal se sustituye con una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, a partir del grupo de líderes de la fosfatasa alcalina, la penicilinasa, la lpp, o la enterotoxina II estable al calor. Para la secreción en levaduras, la secuencia señal nativa se sustituye por, por ejemplo, el líder de la invertasa de la levadura, el líder del factor alfa (incluyendo los líderes de los factores-\alpha de Saccharomyces y Kluyveromyces, éste último descrito en la patente estadounidense n° 5.010.182, concedida el 4 de abril de 1991), o el líder de la fosfatasa ácida, el líder de la glucoamilasa de C. albicans (EP 362. 179, publicada el 4 de abril de 1990), o la señal descrita en WO 90/13.646, publicada el 15 de noviembre de 1990. En la expresión en células de mamífero, la secuencia señal nativa (por ejemplo, la pre-secuencia de la VRP que normalmente dirige la secreción de la VRP en células humanas in vivo) es satisfactoria, aunque podrían ser apropiadas otras secuencias de señal de polipéptidos secretados, tales como secuencias de señal procedentes de VRP de otros animales, y secuencias de señal procedentes de polipéptidos secretados de la misma especie o especies relacionadas, así como líderes secretores vírales, por ejemplo, la señal gD del herpes simplex.

El ADN para tal región precursora está ligado al marco de lectura del ADN que codifica la VRP mutante.

(ii) Componente origen de replicación

Ambos, los vectores de expresión y clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicarse en una o más células huésped seleccionadas. Generalmente, en los vectores de clonación de esta secuencia hay uno que permite al vector replicarse independientemente del ADN cromosómico del huésped, e incluye orígenes de replicación o secuencias que se replican autónomamente. Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es apropiado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2\mu es apropiado para levaduras, y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamífero. Generalmente, el componente origen de replicación no es necesario para vectores de expresión en mamíferos (el origen del SV40 podría usarse típicamente sólo porque contiene el promotor temprano).

La mayoría de vectores de expresión son vectores "lanzadera", es decir, son capaces de replicación en al menos una clase de organismos pero pueden ser transfectados en otro organismo para su expresión. Por ejemplo, un vector se clona en E. coli, y a continuación el mismo vector se transfecta en células de levadura o de mamífero para su expresión, aunque no es capaz de replicarse independientemente del cromosoma de la célula huésped.

El ADN podría amplificarse también mediante inserción en el genoma del huésped. Esto se consigue fácilmente usando especies de Bacillus como huéspedes, por ejemplo, incluyendo en el vector una secuencia de ADN que es complementaria a una secuencia hallada en el ADN genómico de Bacillus. La transfección de Bacillus con este vector resulta en su recombinación homóloga con el genoma y en la inserción del AND de la VRP. No obstante, la recuperación de ADN genómico que codifica la VRP es más compleja que la de un vector replicado exógenamente, puesto que se requiere la digestión con enzimas de restricción para cortar el ADN de la VRP.

(iii) Componente selección del gen

Los vectores de clonación y expresión deberían contener un gen de selección, también denominado gen seleccionable. Este gen codifica un proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de las células huésped transformadas cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Las células huésped no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia frente a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) aportan nutrientes críticos no disponibles en medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la racemasa de D-alanina para Bacilli.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza una droga para detener el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que son transformadas exitosamente con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia frente a la droga, y por tanto sobreviven el régimen de selección. Los ejemplos de tal selección dominante usan las drogas neomicina (Southern et al., J. Molec. Appl. Genet. 1:327 (1982)), el ácido micofenólico (Mulligan et al., Science 209:1422 (1980)) o la higromicina (Sugden et al., Mol. Cell Biol. 5:410 (1985)). Los tres ejemplos citados más arriba emplean genes bacterianos bajo control eucariota para conferir resistencia frente a la droga apropiada, respectivamente: G418 o neomicina (geneocina), xgpt (ácido micofenólico), o higromicina.

Otro ejemplo de marcadores seleccionables apropiados para células de mamífero son aquéllos que permiten la identificación de células competentes para tomar el ácido nucleico de la VRP, tales como el de la DHFR o de la quinasa de timidina. Las células de mamífero transformantes se someten a presión de selección que sólo los transformantes están únicamente adaptados a sobrevivir gracias a haber ingerido el marcador. La presión de selección se impone cultivando los transformantes en condiciones en las que la concentración de agente de selección en el medio se cambia sucesivamente, conduciendo por tanto a la amplificación de ambos, el gen de selección y el ADN que codifica la VRP. La amplificación es el proceso mediante el cual los genes más solicitados para la producción de una proteína crítica para el crecimiento son reiterados en tándem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes. Se sintetizan cantidades crecientes de VRP a partir del ADN amplificado. Otros ejemplos de genes amplificables incluyen los de la metalotioneína I y II, preferiblemente los genes de la metalotioneína de primates, los de la deaminasa de adenosina, los de la decarboxilada de ornitina, etc.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección de la DHFR se identifican primero cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un agonista competitivo de la HFR. Una célula huésped apropiada, cuando se emplea el tipo salvaje de la DHFR, es la línea celular de ovarios de hámster chino (CHO) deficiente en su actividad DHFR, preparada y propagada según se describieron Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980). Las células transformadas se exponen entonces a niveles incrementados de metotrexato. Esto conduce a la síntesis de múltiples copias del gen de la DHFR, y, concomitantemente, de múltiples copias de otros ADN comprendidos en los vectores de expresión, tales como el ADN que codifica la VPR. Esta técnica de amplificación puede usarse con cualquier otro huésped de otro modo apropiado, por ejemplo, la CHO-K1 con N° ATCC CCL61, a pesar de la presencia de DHFR endógena si, por ejemplo, se emplea un gen mutante de la DHFR que es altamente resistente al Mtx (EP 117.060).

Alternativamente, las células huésped (particularmente los huéspedes del tipo salvaje que contienen DHFR endógena) se transforman o co-transforman con secuencias de ADN que codifican la VRP, la proteína DHFR del tipo salvaje, y otro marcador seleccionable, tal como la aminoglicósido 3'-fosfotransferasa (APH), puede seleccionarse mediante el cultivo de las células en medio que contenga un agente de selección para el marcador seleccionable, tal como un antibiótico aminoglicósido, por ejemplo, kanamicina, neomicina, o el G418. Ver la patente estadounidense n° 4.965.199.

Un gen de selección apropiado para su uso en levaduras es el gen trpl presente en el plásmido YRp7 de levaduras (Stinchcomb et al., Nature 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene 10:157 (1980)). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, la ATCC con n° 44.076 o la PEP4-1 (Jones, Genetics 85:12 (1977)). La presencia de la lesión de trp1 en el genoma de la célula de levadura huésped proporciona entonces un entorno efectivo para detectar la transformación mediante cultivo en ausencia de triptófano. De forma similar, las cepas de levadura deficientes en leu2 (ATCC 20.622 ó 38.626) se complementan mediante plásmidos conocidos portadores del gen Leu2.

Además, los vectores daivcd del plásmido circular pKD1 de 1,6 \mum pueden usarse para la transformación de levaduras Kluyveromyces (Bianchi et al., Curr. Genet. 12:185 (1987)). Más recientemente, se ha informado sobre un sistema de expresión para la producción a gran escala de quimosina de ternera recombinante en K. lactis (Van den Berg, Bio/Technology 8:135 (1990)). También se han descubierto vectores de expresión multicopia estables para la secreción de albúmina de suero humana recombinante y madura mediante cepas industriales de Kluyveromyces (Fleer et al., Bio/Technology 9:968-975 (1991)).

(iv) Componente promotor

Los vectores de expresión y clonación contienen usualmente un promotor que es reconocido por el organismo huésped y está operativamente unido al ácido nucleico de la VRP. Los promotores son secuencias no traducidas ubicadas cadena arriba (5') respecto el codón de inicio de un gen estructural (generalmente dentro de aproximadamente 100 a 1000 p.b.) que controla la transcripción y traducción de una secuencia de ácido nucleico particular, tal como la secuencia de ácido nucleico de la VRP, a la cual están operativamente unidos. Tales promotores, típicamente se agrupan en dos clases: inducibles y constitutivos. Los promotores inducibles son promotores que inician niveles incrementados de transcripción del ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. En este momento, se conocen bien un gran número de promotores reconocidos por una variedad de células huéspedes potenciales. Estos promotores se unen operativamente al ADN que codifica la VRP, retirando el promotor del ADN fuente mediante digestión con enzimas de restricción e insertando la secuencia del promotor aislado en el vector. Ambos, la secuencia promotor de la VRP nativa y muchos promotores heterólogos podrían usarse para dirigir la amplificación y/o la expresión del ADN de la VRP. No obstante, se prefieren los promotores heterólogos, puesto que generalmente permiten una mayor transcripción y rendimientos mayores de VRP en comparación con el promotor nativo de la VRP.

Los promotores apropiados para su uso con huéspedes procariotas incluyen los sistemas promotores de la
\beta-lactamasa y de la lactosa (Chang et al., Nature 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature 281:544 (1979)), el de la fosfatasa alcalina, el del sistema promotor del triptófano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res 8:4057 (1980); EP 36.776), y promotores híbridos tales como el promotor tac (dBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983)). No obstante, otros promotores bacterianos conocidos son apropiados. Sus secuencias nucleotídicas han sido publicadas, permitiendo por tanto, a un trabajador especialista, ligarlos operativamente al ADN que codifica la VPR (Siebenlist et al., Cell 20:269 (1980)) usando engarces o adaptadores para proporcionar cualquier sitio de restricción requerido. Los promotores para su uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente al ADN que codifica la VRP.

Se conocen secuencias promotoras para eucariotas. Virtualmente todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT ubicada aproximadamente 25 a 30 bases cadena arriba respecto el sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia hallada 70 a 80 bases cadena arriba respecto el inicio de transcripción de muchos genes es la región CXCAAT, en donde X puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de genes eucariotas hay una secuencia AATAAA que podría ser la señal para la adición de la cola poli-A al extremo 3' de la secuencia codificante. La totalidad de estas secuencias se insertan apropiadamente en vectores de expresión de eucariotas.

Los ejemplos de secuencias promotoras apropiadas para su uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores para la quinasa de 3-fosfoglicerato (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073 (1980)) u otros enzimas glicolíticos (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149 (1968); Holland, Biochemistry 17:4900 (1978)), tales como la enolasa, la deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato, la hexoquinasa, la decarboxilasa de piruvato, la fosfofructoquinasa, la isomerasa de glucosa-6-fosfato, la mutasa de 3-fosfoglicerato, la quinasa de piruvato, la isomerasa de triosafosfato, la isomerasa de fosfoglucosa, y la glucoquinasa.

Otros promotores de levaduras, los cuales son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de tener transcripción controlada por las condiciones de cultivo, son las regiones promotoras de la deshidrogenasa de alcohol, del isocitocromo C, de la fosfatasa ácida, de los enzimas degradadores asociados con el metabolismo del nitrógeno, de la metalotioneína, de la deshidrogenasa del gliceraldehído-3-fosfato, y los enzimas responsables de la utilización de la glucosa y maltosa. Los vectores y promotores apropiados para su uso en la expresión en levadura se describen aún más en EP 73.657. Los potenciadores de levadura también se usan ventajosamente con los promotores de levaduras.

La transcripción de la VRP a partir de vectores en células huéspedes se controla, por ejemplo, mediante promotores obtenidos a partir de genomas de virus tales como el virus del polioma, el virus de la viruela de las gallinas (UK-2.221.504, publicada el 5 de julio de 1989), el adenovirus (tal como el Adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma de las aves, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B, y más preferiblemente el virus 40 de los simios (SV40), a partir de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor de la actina o un promotor de inmunoglobulina, a partir de promotores de choque térmico, y a partir del promotor asociado normalmente con la secuencia de la VRP, siempre y cuando tales promotores sean compatibles con los sistemas de células huéspedes.

Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción del SV40 que también contiene el origen de replicación del SV40 (Fiers et al., Nature 273:113 (1978); Mulligan y Berg, Science 209:1422-1427 (1980); Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:7398-7402 (1981)). El promotor temprano intermedio del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción HindIIIE (Greenaway et al., Gene 18:355-360 (1982)). Un sistema para la expresión de ADN en huéspedes mamíferos usando el virus del papiloma bovino como un vector se descubre en la patente estadounidense n° 4.419.446. En la patente estadounidense n° 4.601.978 se describe una modificación de este sistema. Ver también Gray et al., Nature 295:503-508 (1982) sobre la expresión de cADN que codifica el interferón inmune en células de mono; Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982) sobre la expresión del cADN del interferón \beta humano en células de ratón bajo el control de un promotor de la quinasa de timidina del virus herpes simplex; Canaani y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5166-5170 (1982) sobre la expresión del gen del interferón \beta1 humano en células cultivadas de ratón y conejo; y German et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777-6781 (1982) sobre la expresión de secuencias CAT bacterianas en células renales CV-1 de mono, en fibroblastos embrionarios de pollos, en células ováricas de hámster chino, en células HeLa, y en células NIH-3T3 de ratón, usando como promotor la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous.

(v) Componente elemento potenciador

La transcripción de un ADN que codifica la VRP de esta invención en eucariotas superiores se incrementa a menudo insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos del ADN que actúan en cis, usualmente aproximadamente desde 10 a 300 p.b., que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Los potenciadores son relativamente independientes de su orientación y posición, habiéndose hallado en posición 5' (Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:993 (1981)) y 3' (Lusky et al., Mol. Cell Biol. 3:1108 (1983)) respecto la unidad de transcripción, dentro de un intrón (Banerji et al., Cell 33:729 (1983)), así como dentro de la propia secuencia codificante (Osborne et al., Mol. Cell Biol. 4:1293 (1984)). Actualmente se conocen muchas secuencias potenciadoras procedentes de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína, e insulina). Sin embargo, típicamente se usará un potenciador procedente de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador del SV40 en el lado tardío del origen de replicación (p.b. 100-270), el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador del polioma en el lado tardío del origen de replicación, y los potenciadores de adenovirus. Ver también Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) sobre elementos potenciadores para la activación de promotores eucariotas. El potenciador podría empalmarse en el vector en una posición 5' o 3' respecto la secuencia que codifica la VRP, pero preferiblemente se ubica en un sitio 5' respecto el promotor.

(vi) Componente terminación de la transcripción

Los vectores de expresión usados en células huésped eucariotas (de levadura, hongos, insectos, plantas, animales, humanas, o células nucleadas procedentes de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y/o para estabilizar el mARN. Tales secuencias están comúnmente disponibles a partir de las regiones 5', y ocasionalmente 3', no traducidas de sADN o cADN eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del mARN que codifica la VRP.

(vii) Construcción y análisis de vectores

La construcción de vectores apropiados que contengan uno o más ce los componentes listados más arriba emplea técnicas de ligación. Los plásmidos o fragmentos de ADN aislados se cortan, manipulan, y religan en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos.

Para los análisis destinados a confirmar las secuencias correctas en los plásmidos construidos, se usan las mezclas de ligación para transformar la cepa 294 de E. coli K12 (ATCC 31.446), y los transformantes exitosos se seleccionan mediante resistencia a la ampicilina y tetraciclina según sea apropiado. Los plásmidos procedentes de los transformantes se preparan, se analizan mediante digestión con endonucleasas de restricción, y/o se secuencian mediante el procedimiento de Messing et al., Nucleic Acids Res. 9:309 (1981) o mediante el procedimiento de Maxam et al., Methods in Enzymology 65:499 (1980).

(viii) Vectores de expresión transitoria

Son particularmente útiles en la práctica de esta invención los vectores de expresión que proporcionan medios para la expresión transitoria en células de mamíferos de ADN que codifica la VRP. En general, la expresión transitoria implica el uso de un vector de expresión que es capaz de replicarse eficientemente en una célula huésped, de tal forma que la célula huésped acumula muchas copias del vector de expresión, y, a su vez, sintetiza niveles elevados de un polipéptido deseado codificado por el vector de expresión (Sambrook et al., ver más arriba, pp. 16.17-16.22). Los sistemas de expresión transitoria, que comprenden un vector de expresión apropiado y una célula huésped, permiten la identificación positiva y conveniente de polipéptidos codificados por los ADN clonados, así como la verificación rápida de tales polipéptido en busca de propiedades biológicas o fisiológicas deseadas. Por tanto, los sistemas de expresión transitoria son particularmente útiles en la invención para los propósitos de identificar análogos y variantes de la VRP que son VRP biológicamente activa.

(ix) Ejemplos de vectores de células de vertebrados apropiados

Otros procedimientos, vectores y células huésped apropiados para su adaptación a la síntesis de la VRP en un cultivo de células de vertebrado recombinantes se describen en Gething et al., Nature 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature 281:40-46 (1979); EP 111.060; y EP 117.058. El pRK5 (EP 307.247) o pSV16B (WO 91/08.291, publicada el 13 de junio de 1991) es un plásmido particularmente útil para la expresión de la VRP en cultivos de células de mamíferos.

C. Selección y transformación de células huésped

Las células apropiadas para clonar y expresar el ADN en vectores en ésta son las células procariotas, de levadura, o eucariotas superiores descritas más arriba. Las procariotas apropiadas para este propósito incluyen las eubacterias, tales como los organismos Gram-negativos y Gram-positivos, por ejemplo, enterobacterias tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Kleibsella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescens, y Shigella, asó como Bacilli tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P, descubierto en DD 266.710, publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Un huésped de clonación E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque son apropiadas otras cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537), y E. coli W3110 (ATCC 27.325). Estos ejemplos son ilustrativos en vez de limitantes. La cepa W3110 es un huésped o un huésped progenitor particularmente preferido porque es un cepa huésped común en las fermentaciones de productos de ADN recombinante. Preferiblemente, la célula huésped debería secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticos. Por ejemplo, la cepa W3110 podría modificarse para efectuar una mutación genética en los genes que codifican proteínas, los ejemplos de tales huéspedes incluyen la cepa 27C7 de E. coli W3110. El genotipo completo de la 27C7 es tonA \Delta prt3 phoA \DeltaE15 \Delta (argF-lac) 169 ompT \Delta degP41kan^{r}. La cepa 27C7 se depositó el 30 de octubre de 1991 en la American Type Culture Collection como ATCC n° 55.244. Alternativamente, podría emplearse la cepa de E. coli que tiene una proteasa periplasmática mutante descubierta en la patente estadounidense n° 4.946.783, concedida el 7 de agosto de 1990. Todavía alternativamente, son apropiados los procedimientos para donar, por ejemplo, la PCR u otras reacciones de la polimerasa de ácido nucleico.

Además de los procariotas, los microbios eucariotas, tales como los hongos filamentosos o las levaduras, son huéspedes de donación o expresión apropiados para vectores que codifican la VRP. Saccháromyces cerevisiae, o levadura común de panadería, es el más comúnmente usado entre los microorganismos huéspedes eucariotas inferiores. No obstante, un cierto número de otros géneros, especies y cepas están comúnmente disponibles y son útiles en esta, tales como Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature 290:140 (1981); EP 139.383, publicada el 2 de mayo de 1995); huéspedes Kuyveromyces (patente estadounidense n° 4.943.529; Fleer et al., ver más arriba) tales como, por ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol. 737 (1983)), K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 39.906; Van den Berg et al., ver más arriba), K. thermotolerans, K. marxianus: yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28:265-278 (1988)); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:5259-5263 (1979)); Schanniomyces tales como Schanniomyces occidentalis (EP 394.538, publicada el 31 de octubre de 1990); y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00.357, publicada el 10 de enero de 1991), y huéspedes Aspergillus tales como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112:284-289 (1983); Tilburn et al., Gene 26:205-221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 81:1470-1474 (1984)) y A. niger (Kelly y Hynes, EMBO J. 4:475-479 (1985)).

Las células huéspedes apropiadas para la expresión de VRP glicosilada se derivan de organismos multicelulares. Tales células huéspedes son capaces de procesamiento complejo y actividades de glicosilación. En principio, sirve cualquier cultivo de células eucariotas superiores, tanto si procede de cultivo de vertebrados como de invertebrados. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plantas e insectos. Se han identificado numerosas cepas y variantes de baculovirus, y las correspondientes células huéspedes de insecto permisivas, procedentes de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca del vinagre), y Bombyx morí. Ver, por ejemplo, Luckow et al., Bio/Technology 6:47-55 (1988); Miller et al. en Genetic Engineering, editores Setlow et al., Vol. 8, (Plenum Publishing, 1986), pp. 277-279; y Maeda et al., Nature 315:592-594 (:L985). Están disponibles públicamente una variedad de cepas virales para la transfección, por ejemplo, la variante L-1 del NPV de Autographa californica y la cepa Bm-5 del NPV de Bombyx mori, y tales virus podrían usarse como los virus en ésta de acuerdo con la presente invención, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

Los cultivos de células vegetales de algodón, trigo, patata, soja, petunia, tomate y tabaco pueden utilizarse como huéspedes. Típicamente, las células vegetales se transfectan mediante incubación con ciertas cepas de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, la cual se ha manipulado previamente para contener el ADN que codifica la VRP. Durante la incubación del cultivo de células vegetales con. A. tumefaciens, el ADN que codifica la VRP se transfiere a la células vegetal huésped de tal forma que ésta es transfectada, y, en condiciones apropiadas, expresará el ADN que codifica la VRP. Además, hay disponibles secuencias reguladoras y señalizadoras compatibles con células vegetales, tales como el promotor de la sintasa de nopalina y la secuencias señalizadoras de poliadenilación (Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen. 1:561 (1982). Además, los segmentos de ADN aislados a partir de la región situada cadena arriba respecto el gen 780 del T-ADN son capaces de activar o incrementar los niveles de transcripción de los genes expresables en plantas en tejidos vegetales que contienen ADN recombinantes (EP 321.196, publicada el 21 de junio de 1989).

No obstante, ha sido mayor el interés en células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) a devenido un procedimiento rutinario. Ver, por ejemplo, Tissue Culture, Academic Press, editores Kruse y Paterson (1973). Los ejemplos de líneas celulares de mamíferos útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada mediante el SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea renal embrionaria humana (células 293 ó 293 subclonadas para su crecimiento en cultivos en suspensión, Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1977)); las células renales de crías de hámster (BHK, ATCC CCL 10); las células/-DHFR ováricas de hámster chino (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); las células sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); las células renales de mono (CV1, ATCC CCL 70); las células renales de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); la células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2); las células renales caninas (MDCK, ATCC CCL 34); las células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); las células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); las células de hígado humanas (Heo G2, HB 8065); el tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); las células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); las células MRC 5; las células FS4; y una línea de hepatoma humana (Hep G2).

Las células huéspedes se transfectan y transforman preferiblemente con los vectores de expresión o clonación descritos más arriba para la producción de la VRP, y se cultivan en medios nutrientes convencionales según sean apropiados para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

La transfección se refiere a la ingestión de un vector de expresión por parte de una célula huésped, tanto si las secuencias codificantes se expresan de hecho o no. Numerosos procedimientos de transfección son conocidos por el especialista ordinariamente capacitado, por ejemplo, el CaPO_{4} y la electroporación. La transfección exitosa se reconoce generalmente cuando ocurre cualquier indicación de la operación de este vector en el interior de la célula huésped.

Transformación significa introducir ADN en un organismo de forma que el ADN sea replicable, bien como un elemento extracromosómico o como integrante del cromosoma. Dependiendo de las célula huésped usada, la transformación se realiza usando técnicas estándares apropiadas para tales células. El tratamiento con calcio empleando cloruro cálcico, tal como se describe en la sección 1.82 de Sambrook et al., ver más arriba, o la electroporación, se usan generalmente para procariotas u otras células que contienen barreras sustanciales en forma de pared celular. La infección con Agrobacterium tumefaciens se usa para la transformación de ciertas células vegetales, tal como se describe en Shaw et al., Gene 23:315 (1983) y en WO 89/05.859, publicada el 29 de junio de 1989. Además, ciertas plantas podrían transfectarse usando tratamiento con ultrasonidos tal como se describe en WO 91/00.358, publicada el 10 de enero de 1991.

Para células de mamíferos, sin tales paredes celulares, se prefiere el procedimiento de precipitación con cloruro cálcico de Graham y van der Eb, Virology 52:456-457 (1978). Los aspectos generales de las transformaciones de sistemas de células huéspedes de mamíferos se han descrito en la patente estadounidense n° 4.399.216, concedida el 16 de agosto de 1983. Las transformaciones en levaduras se realizan típicamente de acuerdo con el procedimiento de Van Solingen et al., J. Bact. 130:946 (1977) y Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:3829 (1979). No obstante, también podrían utilizarse otros procedimientos para introducir ADN en células, tales como la microinyección nuclear, la electroporación, la fusión de protoplastos bacterianos con células intactas, o los policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina, etc. Para varias técnicas para transformar células de mamíferos, ver Keown et al., Methods in Enzymology 185:527-537 (1990) y Mansour et al., Nature 336:348-35 (1988).

D. Cultivando las células huéspedes

Las células procariotas usadas para producir el polipéptido de la VRP de esta invención se cultivan en medios apropiados tal como se describe de forma general en Sambrook et al., ver más arriba.

Las células huéspedes de mamíferos usadas para producir la VRP de esta invención podrían cultivarse en una diversidad de medios. Los medios disponibles comercialmente tales como el F10 de Ham (Sigma), el Medio Esencial Mínimo (MEM, Sigma), el RPMI-1640 (Sigma), y el Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma) son apropiados para cultivar las células huéspedes. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham y Wallace, Meth. Enz. 58:44 (1979); en Barnes y Sato, Anal. Biochem. 102:255 (1980); en las patentes estadounidenses n° 4.767.704, 4.657.866, 4.927.762, 4.560.655, o 5.122.469; en WO 90/03.430, WO 87/00.195; o en la patente estadounidense Re. 30.985, podrían usarse como medios de cultivo para las células huéspedes. Cualquiera de estos medios podría suplementarse según fuera necesario con hormonas y/o factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), con sales (tales como cloruro sódico, cálcico, magnésico, y fosfatos), tampones (tales como HEPES), nucleósidos (tales como la adenosina y timidina), antibióticos (tales como la droga Gentamicina^{TM}), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes en concentraciones finales en el rango micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquiera otros suplementos necesarios podrían incluirse también en las concentraciones apropiadas que serían conocidas por aquellos especialistas en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, pH, y similares, son aquéllas previamente usadas con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes para los especialistas ordinariamente formados.

En general, los principios, protocolos, y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos de células de mamíferos pueden encontrarse en Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, editor M. Butler (IRL Press, 1991).

Las células huésped mencionadas en este descubrimiento abarcan las células en cultivo así como las células que están dentro de un animal huésped.

E. Detectando la amplificación/expresión de genes

La amplificación y/o expresión de genes podría medirse directamente en una muestra, por ejemplo, mediante transferencia Southern convencional, transferencia Northern para cuantificar la transcripción de mARN (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5201-5205 (1980)), transferencia en punto (análisis de ADN), o hibridación in situ, usando una sonda apropiadamente marcada, basada en las secuencias proporcionadas en ésta. Podrían emplearse varias marcas, más comúnmente radioisótopos, particularmente el ^{32}P. No obstante, también podrían emplearse otras técnicas, tales como usar nucleótidos modificados con biotina para su introducción en un polinucleótido. A continuación la biotina sirve como el sitio de unión para la avidina o anticuerpos, los cuales podrían marcarse con una amplia variedad de marcas, tales como radionúcleos, compuestos fluorescentes, enzimas, o similares. Alternativamente, podrían emplearse anticuerpos que reconozcan dúplexes específicos, incluyendo dúplexes de ADN, dúplexes de ARN, y dúplexes híbridos de ADN-ARN o dúplexes de ADN-proteína. A su vez, los anticuerpos podrían estar marcados, y podría realizarse el ensayo en el que el dúplex se une a una superficie, de forma que, a partir de la formación del dúplex sobre la superficie, podría detectarse la presencia de un anticuerpo unido al dúplex.

La expresión de genes, alternativamente, podría medirse mediante procedimientos inmunológicos, tales como la tinción inmunohistoquímica de secciones de tejidos y el ensayo de cultivos celulares o fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto de los genes. Con las técnicas de tinción inmunohistoquímica, se prepara una muestra de células, típicamente mediante deshidratación y fijación, seguida por reacción con anticuerpos marcados, específicos para el producto de los genes, acoplados, en donde las marcas son usualmente detectables visualmente, tales como marcas enzimáticas, marcas fluorescentes, marcas luminiscentes, y similares. Una tinción particularmente sensible para su uso en la presente invención es descrita por Hsu et al., Am. J. Clin. Path. 75:734-738 (1980).

Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o ensayo de muestras fluidas podrían ser monoclonales o policlonales, y podrían prepararse en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos podrían prepararse contra un polipéptido de la VRP nativa o contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN proporcionadas en ésta, tal como se describe más en la Sección 4 más abajo.

F. Purificación del polipéptido de la VRP

La VRP se recupera preferiblemente a partir del medio de cultivo como un polipéptido secretado, aunque también podría recuperarse a partir de lisados de células huésped cuando se produce directamente sin una señal secretora. Si la VRP está unida a la membrana, podría liberarse de la membrana usando una solución de detergente apropiada (por ejemplo, Triton-X 100).

Cuando la VRP se produce en un célula recombinante distinta de una de origen humano, la VRP está completamente libre de proteínas o polipéptidos de origen humano. Sin embargo, es necesario purificar la VRP de proteínas o polipéptidos de la célula recombinante para obtener preparaciones que sean sustancialmente homogéneas como VRP 10. Como un primer paso, el medio de cultivo o lisado se centrifuga para suprimir restos celulares fragmentados. A continuación se purifica la VRP de proteínas y polipéptidos solubles contaminantes, siendo los siguientes procedimientos ejemplos de procedimientos de purificación apropiados: mediante fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio catiónico tal como la DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato amónico; filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75; y columnas de Sepharose-Proteína A para suprimir contaminantes tales como la IgG.

En la realización más preferida, la fusión receptor Flt4-IgG se inmoviliza sobre una columna de cromatografía de afinidad, y la VRP puede aislarse mediarte purificación por afinidad usando esta columna. Alternativamente, la VRP se une en su extremo N-terminal a una secuencia de glicoproteína D, y se pasa a través de una columna de cromatografía de afinidad sobre la cual está inmovilizado un anticuerpo monoclonal anti-gD tal como el 5B6, el cual es específico para una secuencia de la glicoproteína D.

Las variantes de la VRP en las que se han suprimido, insertado, o sustituido residuos, se recuperan de la misma forma que la VRP nativa, tomando en consideración cualesquiera cambios sustanciales en las propiedades ocasionados por la variación. Por ejemplo, la preparación de una fusión de la VRP con otra proteína o polipéptido, por ejemplo, un antígeno bacteriano o viral, facilita la purificación; puede usarse una columna de inmunoafinidad que contenga anticuerpo contra el antígeno para adsorber el polipéptido de fusión. Pueden emplearse columnas de inmunoafinidad tales como una columna de anti-VRP policlonal de conejo para adsorber la variante de la VRP mediante la unión de al menos un epítopo inmune restante.

Un inhibidor de proteasa, tal como el fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), también podría ser útil para inhibir la degradación proteolítica durante la purificación, y podrían incluirse antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes adventicios. Un especialista en la técnica apreciará que los procedimientos de purificación apropiados para la VRP nativa podrían requerir modificaciones para tomar en consideración los cambios en el carácter de la VRP o de sus variantes a partir de su expresión en cultivos de células recombinantes.

C. Modificación covalente de polipéptidos de la VRP

Las modificaciones covalentes de los polipéptidos de la VRP se incluyen dentro del ámbito de esta invención. Podrían modificarse covalentemente tanto la VRP nativa y las variantes de la secuencia de aminoácidos de la VRP. Un tipo de modificación covalente de la VRP se introduce en la molécula haciendo reaccionar los residuos aminoácidos deseados de la VRP con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas, o con los residuos N- o C-terminales de la VRP.

Los residuos cisteinilo más comúnmente se hacen reaccionar con \alpha-haloacetatos (y las aminas correspondientes), tales como el ácido cloroacético o la cloroacetamida, para rendir derivados carboximetilos o carboxiamidometilos. Los residuos cisteinilo también se derivan mediante reacción con bromotrifluoroacetona, ácido \alpha-bromo-\beta-(5-imidozoil)propiónico cloroacetil fosfato, N-alquilmaleimidas, 3-nitro-2-piridil disulfuro, metil-2-piridil disulfuro, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazola.

Los residuos histidilo se derivan mediante reacción con dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0 puesto que este agente es relativamente específico para la cadena lateral histidila. El para-bromofenacilo es útil también; la reacción se realiza preferiblemente en cacodilato sódico 0,1 M a pH 6,0.

Los residuos lisinilo y amino-terminal se hacen reaccionar con succínico u otros ácidos carboxílicos anhídridos. La derivación con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los residuos lisinilo. Otros reactivos apropiados para derivar residuos que contienen \alpha-aminos incluyen los imidoésteres, tales como el metil picolinimidato, el piridoxal fosfato, el piridoxal, el cloroborohidruro, el ácido trinitrobencenosulfónico, la O-metilisourea, el 2,4-pentanediona, y la reacción con glioxilato catalizada por transaminasa. Los residuos arginilo se modifican mediante reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos, el feniglioxal, la 2,3-butenediona, la 1,2-ciclohexanediona, y la ninhidrina. La derivación de residuos arginina requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas a causa del pK_{a} elevado del grupo funcional guanidino. Más aún, estos reactivos podrían reaccionar con los grupos de lisina así como con el grupo épsilon-amino de la arginina.

La modificación específica de los residuos tirosilo podría hacerse, con interés particular en introducir marcadores espectrales en los residuos tirosilo, mediante reacción con compuestos de diazonio aromáticos o con tetranitrometano. Más comúnmente, se usan la N-acetilimidazolia y el tetranitrometano para formar respectivamente especies 0-acetil-tirosilo y derivados 3-nitro. Los residuos tirosilo se iodinan usando ^{125}I o ^{131}I para preparar proteínas marcadas para su uso en radioinmunoensayos, siendo apropiado el procedimiento de la cloramina T.

Los grupos carboxilo laterales (aspartilo y glutamilo) se modifican selectivamente mediante reacción con carbodiimidas (R-N = C = N-R'), en donde R y R' son grupos alquilo diferentes, tales como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etilo)carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Más aún, los residuos aspartilo y glutamilo se convierten en residuos asparaginilo y glutaminilo mediante reacción con iones amonio.

La derivación con agentes bifuncionales es útil para entrecruzar la VRP con una matriz o superficie de un soporte insoluble en agua, para su uso en el procedimiento para purificar anticuerpos anti-VRP, y viceversa. Los agentes entrecruzadores comúnmente usados incluyen, por ejemplo, el 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, el glutaraldehído, los ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con el ácido 4-acidosalicílico, imidoésteres bifuncionales, incluyendo ésteres disuccinimidilo tales como el 3,3'-ditiobis (succinimidilpropionato), y maleimidas bifuncionales tales como la bis-N-maleimido-1,8-octano. Los agentes derivadores tales como el metil-3-[(p-azidofenil) ditio]propioimidato rinden intermediarios fotoactivables que son capaces de formar entrecruzamientos en presencia de luz. Alternativamente, las matrices reactivas insolubles en agua, tales como los carbohidratos activados con bromuro de cianógeno y los sustratos reactivos descritos en las patentes estadounidenses n° 3.969.287, 3.691.016, 4.195.128, 4.247.642, 4.229.337, y 4.330.440 se emplean para la inmovilización de proteínas.

Los residuos glutaminilo y asparaginilo son frecuentemente deamiados respectivamente a sus correspondientes residuos glutamilo y aspartilo. Estos residuos de deamidan bajo condiciones neutras o básicas. La forma deamidada de estos residuos se halla bajo el ámbito de esta invención.

Otras modificaciones incluyen la hidroxilación de la prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo o de residuos serilo o treonilo, la metilación de los grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), la acetilación de la amina N-terminal, y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

Otro tipo de modificación covalente del polipéptido de la VRP incluida dentro del ámbito de esta invención comprende alterar el patrón de glicosilación nativo del polipéptido. Por alterar se quiere decir suprimir uno o más grupos carbohidratos hallados en la VRP nativa, y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no están presenten en la VRP nativa.

La glicosilación de polipéptidos está típicamente unida a N o unida a O. Unida a N se refiere a la unión del grupo carbohidrato a la cadena lateral de un residuo asparagina. Las secuencias de tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del grupo carbohidrato a la cadena lateral de la asparagina. Por tanto, la presencia de uno de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación unida a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxilaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también podrían usarse la 5-hidroxiprolina o la 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilación al polipéptido de la VRP se consigue convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de forma que contenga uno o más de las secuencias de tripéptido descritas más arriba (para los sitios de glicosilación unidos a N). La alteración también podría hacerse mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos serina o treonina a la secuencia de VRP nativa (para sitios de glicosilación unidos a 0). Por simplicidad, la secuencia de aminoácidos de la VRP se altera preferiblemente a través de cambios a nivel de ADN, particularmente mutando el ADN que codifica el polipéptido de la VRP en bases preseleccionadas, tales como codones que son generados y que se traducirán en los aminoácidos deseados. La(s) mutación(ones) del ADN podrían hacerse usando procedimientos descritos en la patente estadounidense n° 5.364.9334, ver más arriba.

Otros medios para incrementar el número de grupos carbohidratos sobre el polipéptido de la VRP es mediante el acoplamiento químico o enzimático de glicósidos al polipéptido. Estos procedimientos son ventajosos en que no requieren la producción del polipéptido en una célula huésped que tiene capacidad de glicosilar para la glicosilación unida a N u O. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, el(los) azúcar(es) podría(n) unirse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina, o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como los de la fenilalanina, tirosina, o triptófano, o (f) el grupo amino de la glutamina. Estos procedimientos se describen en WO 87/05.330, publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem. pp. 259-306 (1981).

La supresión de grupos carbohidratos presentes 10 sobre el polipéptido de la VRP podría conseguirse química o enzimáticamente. La deglicosilación química requiere la exposición del polipéptido al compuesto ácido trifluorometanesulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento resulta en el corte de la mayoría o totalidad de los azúcares, excepto el azúcar unidor (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), mientras que deja el polipéptido intacto. La deglicosilación química es descrita por Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259:52 (1987) y por Edge et al., Anal. Biochem. 118:131 (1981). El corte enzimático de carbohidratos sobre polipéptidos puede conseguirse mediante el uso de una diversidad de endo- y exo-glicosidasas, tal como describe Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138:350 (1987).

La glicosilación en sitio de glicosilación potenciales podría impedirse mediante el uso del compuesto tunicamicina según describen Duskin et al., J. Biol. Chem. 257:3105 (1982). La tunicamicina bloquea la formación de enlaces proteína-N-glicósido.

Otro tipo de modificación covalente de la VRP comprende la unión del polipéptido de la VRP a uno de una variedad de polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, o polioxialquilenos, en la forma establecida en las patentes estadounidenses n° 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ó 4.179.337.

Puesto que a menudo es difícil predecir por anticipado las características de una variante de la VRP, se apreciará que será necesario cierto examen de la variante recuperada para seleccionar la variante óptima. Un cambio en el carácter inmunológico de la molécula de VRP, tal como la afinidad por un anticuerpo determinado, puede medirse también mediante un inmunoensayo de tipo competitivo. La variante se ensaya en busca de cambios en la supresión o potenciación de su actividad mitogénica por comparación con la actividad observada con la VRP nativa en el mismo ensayo. Por ejemplo, se puede examinar la capacidad de la variante de la VRP para estimular la actividad quinasa de proteínas del receptor Flt4 tal como se describe en el Ejemplo 5 en ésta. Otras modificaciones potenciales de la proteína o de las propiedades del polipéptido, tales como la estabilidad redox o térmica, la hidrofobicidad, la susceptibilidad a la degradación proteolítica, o la tendencia a agregarse con portadores o en multímeros, se ensayan mediante procedimientos bien conocidos en la técnica.

H. VRP marcada con epítopo

Esta invención abarca los polipéptidos quiméricos que comprenden la VRP unida a otro polipéptido. En una realización preferida, el polipéptido quimérico comprende una fusión de la VRP con un polipéptido etiqueta, el cual proporciona un epítopo al que puede unirse selectivamente un anticuerpo anti-etiqueta. El epítopo etiqueta se coloca generalmente en los extremos amino- o carboxi-terminal de la VRP. Tales formas de la VRP etiquetadas con un epítopo son deseables, puesto que la presencia de las mismas puede detectarse usando un anticuerpo marcado contra el polipéptido etiqueta. También, la provisión del epítopo etiqueta permite que la VRP sea fácilmente purificada mediante purificación por afinidad usando el anticuerpo anti-etiqueta. Las técnicas de purificación por afinidad y los ensayos de diagnóstico que implican anticuerpos se describen más tarde en ésta.

Los polipéptidos etiqueta y sus respectivos anticuerpos son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos incluyen el polipéptido etiqueta flu HA y su anticuerpo 12CA5 (Field et al., Mol. Cell Biol. 8:2159-2165 (1988)); la etiqueta c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 Y 9E10 contra la misma (Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5:3610-3616 (1985)); y la etiqueta glicoproteína D (gD) del virus Herpes Simplex y su anticuerpo (Paborsky et al., Protein Engineering 3(6):547-553 (1990). Se han descubierto otros polipéptidos etiqueta. Los ejemplos incluyen el péptido Flag (Hopp et al., Bio/Technology 6:1204-1210 (1988)); el péptido del epítopo KT3 (Martin et al., Science 255:192-194 (1992)); un péptido del epítopo de la \alpha-tubulina (Skinner et al., J. Biol. Chem. 266:15163-15166 (1991)); y el péptido etiqueta de la proteína 10 del gen T7 (Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6393-6397 (1990)). Una vez se ha seleccionado el polipéptido etiqueta, puede generarse un anticuerpo contra el mismo usando las técnicas descubiertas en ésta.

Los procedimientos generales apropiados para la construcción y producción de VRP marcada con epítopo son los mismos que los descubiertos en ésta más arriba en relación a la VRP (nativa o variante). Las fusiones VRP-polipéptido etiqueta se construyen de la forma más conveniente fusionando, en pauta, la secuencia de cADN que codifica la porción VRP con la secuencia de ADN del polipéptido etiqueta, y expresando la construcción de fusión del ADN resultante en células huésped apropiadas. Ordinariamente, cuando se preparan las quimeras de VRP-polipéptido etiqueta de la presente invención, el ácido nucleico que codifica la VRP se habrá fusionado en su extremo 3' al ácido nucleico que codifica el extremo N-terminal del polipéptido etiqueta, no obstante, las fusiones 5' también son posibles.

La VRP marcada con epítopo puede purificarse convenientemente mediante cromatografía de afinidad usando el anticuerpo anti-etiqueta. La matriz a la cual se une el anticuerpo de afinidad es más frecuentemente agarosa, pero otras matrices están disponibles (por ejemplo, vidrio con poro controlado o poli(estirendivinil)benceno). La VRP marcada con epítopo puede eluirse de la columna de afinidad, por ejemplo, variando el pH o la fuerza iónica del tampón, o añadiendo agentes caotrópicos.

2. Usos terapéuticos, composiciones y administración de la VRP

Se cree que la VRP hallará uso terapéutico en el tratamiento de mamíferos a través de la estimulación o inhibición del crecimiento y/o diferenciación y/o activación de células que tienen el receptor Flt4 o uno o más de otros receptores de la VRP. La VRP exógena podría administrársele a un paciente en estas condiciones. La VRP humana es claramente útil en tanto que puede administrársele a un humano que tiene niveles deprimidos de VRP endógena, preferiblemente en la situación en la que tales niveles deprimidos conducen a una alteración patológica, o cuando hay ausencia de activación o inhibición del receptor Flt4 o uno o más de los otros receptores de la VRP.

Los diversos usos terapéuticos potenciales de la VRP incluyen aquéllos en los que el VEGF es útil. Los ejemplos de estos incluyen los usos asociados con el endotelio vascular, tales como el tratamiento de traumas de la red vascular, en vista de la probada rápida promoción, por parte del VEGF, de la proliferación de células endoteliales vasculares que rodearían el trauma, y en vista de la relación entre el VEGF y la VRP establecida en ésta. Los ejemplos de tales traumas que podrían tratarse de este modo incluyen, pero no se limitan a, las incisiones quirúrgicas, particularmente aquéllas que implican el corazón, las heridas, incluyendo las laceraciones, incisiones, y penetraciones de vasos sanguíneos, y las úlceras de superficie que implican el endotelio vascular, tales como las úlceras diabéticas, hemofílicas y varicosas. También se incluyen en ésta otras condiciones fisiológicas que podrían mejorarse en base al carácter selectivamente mitogénico de la VRP.

Para las indicaciones traumáticas mencionadas más arriba, la molécula de VRP se formularía y dosificaría de forma consistente con la buena práctica médica, tomando en cuenta la alteración específica a tratar, la condición del paciente individual, el sitio de suministro de la VRP, el procedimiento de administración, y otros factores 20 conocidos por los practicantes.

Las indicaciones adicionales para la VRP se hallan en el tratamiento de heridas profundas, tales como las úlceras dérmicas, incluyendo las categorías de llagas por presión, úlceras venosas, y úlceras diabéticas, así como las quemaduras y lesiones profundas en las que se requiere la angiogénesis para preparar la quemadura o sitio lesionado para un injerto o pliegue de piel. En este caso, la VRP se aplica directamente sobre el sitio o se usa para empapar la piel o pliegue que se transplantará antes del injerto. De forma similar, la VRP puede usarse en cirugía plástica cuando se requiere la reconstrucción después de una quemadura u otro trauma, o con propósitos cosméticos.

La angiogénesis es también importante para mantener las heridas limpias y no infectadas. Por tanto, la VRP puede usarse en asociación con la cirugía general y a continuación de la reparación de cortes y laceraciones. Es particularmente útil en el tratamiento de heridas abdominales con un elevado riesgo de infección. La neovascularización es también clave para la reparación de fracturas, puesto que los vasos sanguíneos se desarrollan en el sitio de la lesión ósea. La administración de VRP en el sitio de una fractura es por tanto otra utilidad.

En los casos en los que la VRP se usa para la cicatrización de heridas tópicas, tal como se describe más arriba, podría administrarse mediante cualesquiera de las rutas descritas más abajo para la re-endotelización del tejido vascular, o más preferiblemente mediante medios tópicos. En estos casos, se administrará como una solución, aerosol, gel, crema, ungüento, o polvo seco, directamente sobre el sitio de la lesión. También se usarán los aparatos de liberación lenta que dirigen la VRP al sitio lesionado. En las aplicaciones tópicas, la VRP se aplicará en una concentración que oscilará desde aproximadamente 50 hasta 1000 \mug/ml, bien en una única aplicación, o en regímenes de dosis que son diarios o cada pocos días durante un período de una semana a varias semanas. Generalmente, la cantidad de formulación tópica administrada es aquélla que es suficiente para aplicar desde aproximadamente 0,1 hasta 100 \mug/cm^{2} de la VRP, en base al área de la superficie de la herida.

La VRP puede usarse como un agente cicatrizante posterior a la operación en la angioplastia con globo, un procedimiento en el que se suprimen o lesionan las células endoteliales vasculares, junto con la compresión de placas ateroescleróticas. La VRP puede aplicarse también a superficies vasculares interiores mediante aplicación intravenosa sistémica o local, tanto como inyecciones o infusiones de bolos intravenosos. Si se desea, la VRP puede administrarse a lo largo del tiempo usando una bomba micrométrica. Las composiciones apropiadas para la administración intravenosa comprenden la VRP en una cantidad efectiva para promover el crecimiento de las células endoteliales y un material portador parenteral. La VRP puede estar presente en la composición a lo largo de un amplio rango de concentraciones, por ejemplo, desde aproximadamente 50 \mum/ml hasta aproximadamente 1000 \mug/ml, usando inyecciones de 3 a 10 ml por paciente, administradas una vez o en regímenes de dosis que permiten múltiples aplicaciones. Puede usarse cualquiera de los 0 vehículos portadores parenterales conocidos, tales como la solución salina normal o dextrosa al 5-10%.

La VRP puede usarse también para promover la endotelización en la cirugía de injertos vasculares. En el caso de injertos vasculares usando vasos transplantados o material sintético, por ejemplo, la VRP puede aplicarse a las superficies del injerto y/o en la uniones del injerto y la vasculatura existente para promover el crecimiento de las células endoteliales vasculares. Para tales aplicaciones, la VRP puede aplicarse intravenosamente, tal como se ha descrito más arriba para la angioplastia con globo, o puede aplicarse directamente a las superficies del injerto y/o de la vasculatura existente, bien antes o durante la operación. En tales casos, podría ser deseable aplicar la VRP en un material portador engrosado, de forma que se pegara a la superficie afectada. Los materiales portadores apropiados incluyen, por ejemplo, el carbopol al 1-5%. La VRP puede estar presente en el portador en un amplio rango de concentraciones, por ejemplo, desde aproximadamente 50 µg/mg hasta aproximadamente 1000 \mug/mg. Alternativamente, la VRP podría suministrarse en el sitio mediante una bomba micrométrica como una solución parenteral.

La VRP puede emplearse también para reparar el daño vascular que sigue al infarto de miocardio, y para salvar la necesidad de cirugía de bypass coronario mediante la estimulación del crecimiento de una circulación colateral. Para este propósito, la VRP se administra intravenosamente, bien en inyecciones individuales o mediante una bomba micrométrica a lo largo de un período de tiempo, tal como se ha descrito más arriba, o mediante infusión o inyección directa en el sitio del músculo cardíaco lesionado.

Las formulaciones terapéuticas de la VRP se preparan para su almacenamiento mezclando VRP que tiene el grado de pureza deseado con portadores, excipientes, o estabilizadores opcionales fisiológicamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, editor A. Osol, 1980), en forma de pastel liofilizado o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como el fosfato, citrato, y otras sales orgánicas; antioxidantes, incluyendo el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como la albúmina de suero, la gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofóbicos tales como la polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como la glicina, glutamina, asparagina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo la glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como el EDTA; azúcares alcohol tales como el manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como el sodio; y/o tensioactivos no fónicos tales como el Tween, Pluronics o polietilenglicol (PEG).

La VRP también podría atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, respectivamente, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina, y microcápsulas de poli-[metilnetacilato]), en sistemas coloidales de suministro de drogas (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas, y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, ver más arriba.

La VRP a ser usada para la administración in vivo debe ser estéril. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, antes o después de su liofilización y reconstitución. La VRP se almacenará ordinariamente en forma liofilizada o en solución.

Las composiciones terapéuticas de la VRP generalmente se colocan en un contenedor que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o una vial que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica.

La ruta de administración de la VRP está de acuerdo con los procedimientos conocidos, por ejemplo, aquellas rutas establecidas más arriba para indicaciones específicas, así como las rutas generales de inyección o infusión mediante medios intravenosos, intraperitoneales, intracerebrales, intramusculares, intraoculares, intraarteriales, o intralesionales, o sistemas de liberación continuada tal como se ha mencionado más arriba. La VRP se administra continuamente mediante infusión o mediante inyección de bolo. Generalmente, cuando la alteración lo permita, se debería formular y dosificar la VRP para su suministro específico en un sitio. Esto es conveniente en el caso de heridas y úlceras.

Los ejemplos apropiados de preparaciones de liberación continuada incluyen las matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen la proteína, matrices que están en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación continuada incluyen los poliésteres, los hidrogeles (por ejemplo, el poli(2-hidroxietilmetacrilato), tal como describen Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981) y Longer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982), o el poli(vinilalcohol)), los polilácticos (patente estadounidense n° 3.773.919, EP 58.481), los copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glinamato (Sidman et al., Biopolymers 22:547-556 (1983)), el acetato de etilenvinil no degradable (Langer et al., ver más arriba), los copolímeros degradables de 10 ácido láctico-ácido glicólico tales como el Lupron Depot^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido), y el poli-D-(-)-3-hidroxibutírato (EP 133.988).

Los polímeros blancos tales como el etilenvinil acetato y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando las proteínas encapsuladas permanecen en el cuerpo durante un período largo, se pueden desnaturalizar o agregar a resultas de la exposición a temperatura a 37°C, resultando en una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en su inmunogenicidad. Pueden desarrollarse estrategias racionales para la estabilización de la proteína dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través del intercambio tio-disulfuro, la estabilización podría conseguirse modificando los residuos sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido en humedad, usando aditivos apropiados, y desarrollando composiciones específicas de matriz de polímeros.

Las composiciones de VRP de liberación continuadatambién incluyen la VRP atrapada liposomalmente. Los liposomas que contienen la VRP se preparan mediante procedimientos conocidos por sí mismos: DE 3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034 (1980); EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949; EP 142.641; la solicitud de patente japonesa 83-118.008; las patentes estadounidenses n° 4.485.045 y 4.544.545; y la EP 102.324. Ordinariamente, los liposomas son del tipo unilamelar pequeño (aproximadamente 200-800 Angstroms), en los que el contenido de lípidos es mayor de aproximadamente el 30% molar en colesterol, ajustándose la proporción seleccionada para la terapia óptima con VRP.

Cuando se aplica tópicamente, la VRP se combina apropiadamente con otros ingredientes, tales como portadores y/o adyuvantes. No ha limitaciones sobre la naturaleza de tales otros ingredientes, excepto que deben ser farmacéuticamente aceptables y eficaces para su pretendida administración, y que no pueden degradar la actividad de los ingredientes activos de la composición. Los ejemplos de vehículos apropiados incluyen los ungüentos, las cremas, los geles, o suspensiones, con o sin colágeno purificado. Las composiciones también podrían impregnarse en parches transdérmicos, emplastos, y vendas, preferiblemente en forma líquida o semi-líquida.

Para obtener una formulación en gel, la VRP formulada en una composición líquida podría mezclarse con una cantidad efectiva de un polisacárido soluble en agua, o de un polímero sintético tal como el PEG, para formar un gel con la viscosidad apropiada para ser aplicado tópicamente. Los polisacáridos que podrían usarse incluyen, por ejemplo, los derivados de la celulosa tales como los derivados eterificados de la celulosa, incluyendo las alquilcelulosas, las hidroxialquilcelulosas, y las alquihidroxialquicelulosas, por ejemplo, la metilcelulosa, la hidroxietilcelulosa, la carboximetilcelulosa, la hidroxipropil metilcelulosa, y la hidroxipropilcelulosa; el almidón y el almidón fraccionado; el agar; el ácido algínico y los alginatos; la goma arábica; el pululan; la agarosa; el carragenato; los dextranos; las dextrinas; los fructanos; la inulina; los mananos; los xilanos; los arabinanos; los quitosanos; los glicógenos; los glucanos; y los biopolímeros sintéticos; así como gomas como la goma de xantano, la goma de guar, la goma del haba de locust, la goma arábica, la goma de tragacanto, y la goma de karaya; y derivados y mezclas de los mismos. El agente gelificante preferido en ésta es uno que es inerte en sistemas biológicos, no tóxico, sencillo de preparar, y no demasiado fluido o viscoso, y que no desestabilizará la VRP contenida en el mismo.

Preferiblemente, el polisacárido es un derivado eterificado de la celulosa, más preferiblemente uno que esté bien definido, purificado, y listado en la USP, por ejemplo, la metilcelulosa y los derivados hidroxialquilcelulosa, tales como lahidroxipropilcelulosa, la hidroxietilcelulosa, y la hidroxipropil metilcelulosa. El más preferido en ésta es la metilcelulosa.

El polietilenglicol útil para gelificar es típicamente una mezcla de PEG de bajo y elevado peso molecular para obtener una viscosidad apropiada. Por ejemplo, una mezcla de un PEG con peso molecular de 400-600 con uno con peso molecular de 1500 sería efectiva para este propósito cuando se mezcla en la proporción apropiada para obtener una pasta.

El término "soluble en agua", tal como se aplica a los polisacáridos y PEG, se pretende que incluya las soluciones coloidales y las dispersiones. En general, la solubilidad de los derivados de celulosa se determina por el grado de sustitución de grupos éter, y los derivados estabilizantes útiles en ésta deberían tener una cantidad suficiente de tales grupos éter, por unidad de anhidroglucosa en la cadena de celulosa, como para hacer a los derivados solubles en agua. Un grado de sustitución éter de al menos 0,35 grupos éter por unidad de anhidroglucosa es generalmente suficiente. Adicionalmente, los derivados de celulosa podrían estar en la forma de sales de metales alcalinos, por ejemplo, sales de Li, Na, K o Cs.

Si la metilcelulosa se emplea en el gel, preferiblemente comprende aproximadamente el 2-5%, más preferiblemente aproximadamente el 3%, de el gel, y la VRP está presente en una cantidad de aproximadamente 300-1000 mg por ml de gel.

Una cantidad efectiva de VRP a emplearse terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la ruta de administración, y la condición del paciente. En consecuencia, será necesario para el terapeuta valorar la dosis y modificar la ruta de administración según se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Típicamente, el clínico administrará la VRP hasta que se alcance una dosis que consiga el efecto deseado. Una dosis diaria típica para tratamiento sistémico podría oscilar desde aproximadamente 1 \mug/kg hasta 10 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados más arriba. Como una proposición general alternativa, la VRP se formula y suministra al sitio o tejidos diana en una dosis capaz de establecer en el tejido un nivel de VRP superior a aproximadamente 0,1 ng/cc, y hasta una dosis máxima que es eficaz pero no indebidamente tóxica. Esta concentración intra-tejido debería mantenerse si es posible mediante infusión continuada, liberación sostenida, aplicación tópica, o inyección con frecuencias determinadas empíricamente. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante ensayos convencionales.

Está dentro del ámbito de ésta el combinar la terapia con VRP con otras terapias nuevas o convencionales (por ejemplo, factores de crecimiento tales como el VEGF, el factor de crecimiento de fibroblastos ácido o básico (aFGF o bFGF, respectivamente), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento parecido a la insulina (IGF-I o IGF-II), el factor de crecimiento del nervio (NGF), los esteroides anabólicos, el EGF o el TGF-\alpha, para potenciar la actividad de cualquiera de los factores de crecimiento, incluyendo la VRP, en la promoción de la proliferación celular y de la reparación. No es necesario que tales drogas de co-tratamiento se incluyan por sí mismas en las composiciones de la invención, aunque esto podría ser conveniente cuando tales drogas son proteicas. Tales mezclas se administran convenientemente de la misma forma y para los mismos propósitos que la VRP usada sola. La proporción molar útil de VRP respecto los factores de crecimiento secundarios es típicamente 1:0,1-101, siendo preferida con cantidades aproximadamente equimolares.

3. Usos diagnósticos, no terapéuticos, para la VRP

El ácido nucleico que codifica la VRP podría utilizarse como un diagnóstico para la clasificación especifico de tejido. Por ejemplo, procedimientos tales como la hibridación in situ, la transferencia Northern y Southern, y el análisis con PCR, podrían usarse para determinar si el ADN y/o ARN que codifica la VRP están presentes en el(los) tipo(s) de célula(s) que se está(n) evaluando. El ácido nucleico o polipéptido de la VRP podrían usarse también como marcadores diagnósticos. Por ejemplo, podría marcarse la VRP, usando las técnicas descritas en ésta, y, usando la VRP marcada podría cuantificarse la expresión de las moléculas de ácido nucleico que codifican un receptor Flt4 u otro receptor de la VRP.

Si el ácido nucleico que codifica la VRP humana se ubica en un cromosoma humano, el ácido nucleico para la VRP humana podría usarse como un marcador de este cromosoma humano.

El ácido nucleico de la VRP también es útil para la preparación de un polipéptido de la VRP mediante técnicas recombinantes ejemplificadas en ésta.

El polipéptido de la VRP aislado podría usarse en ensayos de diagnóstico cuantitativo como un estándar o control contra el que podrían prepararse muestras conteniendo cantidades desconocidas de VRP.

Las preparaciones de VRP son también útiles para generar anticuerpos, como estándares en ensayos para la VRP (por ejemplo, marcando la VRP para su uso como un estándar en un radioinmunoensayos, ensayo de radioreceptor, o inmunoensayo unido a enzima), para detectar la presencia del receptor Flt4, o uno o más receptores distintos de la VRP en una muestra biológica (por ejemplo, usando una VRP marcada), en técnicas de purificación por afinidad, y en ensayos de unión a receptor del tipo competitivos cuando se marcan con yodo radiactivo, enzimas, fluoróforos, marcadores de espín, o similares.

La VRP es útil también como una herramienta diagnóstica. Por ejemplo, la VRP puede producirse en células procariotas usando las técnicas elaboradas en ésta, y la proteína no glicosilada así producida puede usarse como un marcador de peso molecular. El peso molecular (pm) deducido de la VRP es de aproximadamente 44,8 kDa. Para usar la VRP como un marcador de peso molecular, se usará por ejemplo cromatografía de filtración en gel o SDS-PAGE para separar proteínas, de las que se desea determinar sus pesos moleculares, sustancialmente de la forma normal. La VRP y otros marcadores de peso molecular se usarán como estándares para proporcionar un rango de pesos moleculares. Por ejemplo, pueden usarse como marcadores la fosforilasa b (pm = 97.400), la albúmina de suero bovina (pm = 68.000), la ovoalbúmina (pm = 46.000), la VRP (pm = 44.800), el inhibidor de la tripsina (pm = 20.100), y el lisozima (pm = 14.400). Los otros marcadores de peso molecular mencionados aquí se pueden comprar comercialmente a Amersham Corporation, Arlington Heights, 1L, por ejemplo. A menudo, los marcadores de peso molecular se marcarán para permitir su detección fácil a continuación de su separación. Las técnicas para marcar anticuerpos y proteínas se discuten en ésta y son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, los marcadores de peso molecular podrían biotinilarse y, a continuación de su separación, por ejemplo sobre SDS-PAGE, la transferencia puede incubarse con estreptoavidina-peroxidasa de rábano silvestre. Las bandas pueden detectarse entonces mediante detección con luz.

También podría ser útil cultivar ciertas células que tienen el receptor Flt4, o uno o más receptores distintos de la VRP, ex vivo usando la VRP como un factor angiogénico o factor de crecimiento. Así pues, por ejemplo, la VRP puede usarse como un factor de crecimiento en el cultivo in vitro de células endoteliales. Para tales usos, la VRP puede añadirse al medio de cultivo de células a una concentración de desde aproximadamente 10 pg/ml hasta aproximadamente 10 ng/ml.

Estas células que se han de cultivar ex vivo podrían exponerse simultáneamente a otros factores de crecimiento conocidos o citoquinas. Las citoquinas de ejemplo incluyen las interleucinas (por ejemplo, la IL-3), el factor estimulante de las colonias de granulocito-macrófagos (GM-CSF), el VEGF, el factor estimulante de las colonias de macrófagos (M-CSF), el factor estimulante de las colonias de granulocitos (G-CSF), el factor estimulante de las colonias de granulocito-macrófagos (GM-CSF), la eritropoietina (Epo), la linfotoxina, el factor "steel" (SLF), el factor de la necrosis tumoral (TNF), y el interferón gamma. Esto resulta en la proliferación y/o diferenciación de las células que tienen el receptor Flt4 o uno o más de los otros receptores de la VRP.

En todavía otro aspecto de la invención, la VRP podría usarse para la purificación mediante afinidad del receptor Flt4, o de uno o más de los otros receptores de la VRP. En resumen, esta técnica implica la unión covalente de la VRP a una matriz inerte y porosa (por ejemplo, agarosa que ha reaccionado con bromuro de cianógeno). A continuación puede pasarse una solución que contiene el receptor Flt4, u otro(s) receptor(es) de la VRP, a través del material cromatográfico y puede liberarse subsiguientemente cambiando las condiciones de elución (por ejemplo, cambiando el pH o la fuerza iónica).

El VRP purificado, y el ácido nucleico que lo codifica, podrían venderse también como reactivos para estudios de mecanismos de la VRP y sus receptores afines, para estudiar el papel de la VRP y del receptor Flt4, u otros receptores de la VRP, en el crecimiento normal y desarrollo, así como en el crecimiento y desarrollo anormal, por ejemplo, en cánceres.

La VRP podría usarse para el examen competitivo de agonistas y antagonistas potenciales para la unión al receptor Flt4 u otros receptores de la VRP. Las variantes de la VRP son útiles como estándares o controles en ensayos para la VRP, siempre y cuando sean reconocidos por el sistema analítico empleado, por ejemplo, un anticuerpo anti-VRP.

4. Preparación del anticuerpo para la VRP

A continuación sigue una descripción de anticuerpos de ejemplo tal como se definen en ésta. Estos anticuerpos de ejemplo incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos, o heteroconjugados.

A. Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos policlonales contra la VRP generalmente se generan en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) de la VRP y de un adyuvante. Podría ser útil conjugar la VRP a una proteína que es inmunogénica en las especies a inmunizar, por ejemplo, la hemocianina de lapa con forma de ojo de cerradura, la albúmina de suero, la tiroglobulina bovina, o el inhibidor de la tripsina de soja, usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, el éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos cisteína), la N-hidroxisuccinimida (a través de residuos lisina), el glutaraldehído, el anhídrido succínico, el SOCl_{2}, o el R^{1}N = C = NR, en donde R y R' son grupos alquilo diferentes.

Los animales se inmunizan contra los conjugados o derivados inmunogénicos mediante la combinación de 1 mg o 1 \mug de conjugado (respectivamente para conejos o ratones) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freud, e inyectando la solución intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes más tarde, los animales se impulsan con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de conjugado en el adyuvante completo de Freud, mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. De siete a 14 días más tarde, se sangran los animales y se ensaya el suero por su valoración de anticuerpo anti-VRP. Los animales se impulsan hasta que la valoración se estabiliza. Preferiblemente, el animal se impulsa con un conjugado de la misma VRP con una proteína diferente, y/o la conjugación tiene lugar a través de diferentes reactivos entrecruzadores. Los conjugados se pueden preparar también en cultivos de células recombinantes como fusiones de proteínas. También se usan agentes agregadores como el alum para potenciar la respuesta inmune.

B. Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales se obtienen a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones que ocurren de forma natural que podrían estar en cantidades menores. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que no es una mezcla de anticuerpos individuales.

Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales anti-VRP de la invención podrían prepararse usando el procedimiento del hibridoma descrito primero por Kohler y Milstein, Nature 256:495 (1975), o podrían prepararse mediante procedimientos recombinantes (patente estadounidense n° 4.816.567).

En el procedimiento del hibridoma, se inmuniza un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como el hámster, como en ésta más arriba para elicitar linfocitos que producen, o son capaces de producir, anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos podrían inmunizarse in vitro. Los linfocitos se fusionan a continuación con células de mieloma, usando un agente apropiado, tal como el PEG, para formar una célula hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986).

Las células hibridoma así preparadas se siembran y cultivan en un medio de cultivo apropiado que preferiblemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma progenitoras no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma progenitoras carecen del enzima fosforibosiltransferasa de hipoxantina guanina (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT), sustancias que impiden el crecimiento de células con HGPRT deficiente.

Las células de mieloma preferidas son aquéllas que se fusionan eficientemente, soportan un nivel elevado y 5 estable de expresión de anticuerpo por parte de las células productoras de anticuerpo seleccionadas, y no son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre éstas, las líneas celulares de mieloma preferidas son las líneas de mieloma de ratón, tales como aquéllas derivadas de los tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11, disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, EE.UU., y las células SP-2 disponibles en el American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EE.UU. También se han descrito las líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humana para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987). Ver también, Boerner et al., J. Immunol. 147:86-95 (1991) y WO 91/17.769, publicada el 28 de noviembre de 1991, para técnicas para la producción de anticuerpos monoclonales humanos.

El medio de cultivo en que se hacen crecer las células de hibridoma se ensaya en busca de la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra la VRP. Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos mediante células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA).

La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, mediante el análisis Schatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem. 107:220 (1980).

Después de que se hayan identificado las células de hibridoma que producen anticuerpos con la especificidad, afinidad, y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimiento de dilución limitada, y cultivarse mediante procedimientos estándares (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-104 (Academic Press, 1986). Los medios de cultivo apropiados para este propósito incluyen, por ejemplo, el medio de Eagle modificado por Dulbecco o el medio RPMI-1640. Además, las células de hibridoma podrían cultivarse in vivo es tumores ascites en un animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan apropiadamente del medio de cultivo, del fluido ascítico, o del suero, mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas, tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, la cromatografía con hidroxilapatito, la electroforesis en gel, la diálisis, o la cromatografía de afinidad.

Alternativamente, es actualmente posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, a partir de su inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homocigótica del gen de la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo (J_{H}) en ratones quiméricos y mutantes de la línea germinal resulta en la completa inhibición de la producción de anticuerpo endógeno. La transferencia del conjunto de genes de inmunoglobulinas de la línea germinal humana en tales ratones mutantes en su línea germinal, resultará en la producción de anticuerpos humanos a partir del desafío con antígeno. Ver, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1983); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993).

En una realización ulterior, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos pueden aislarse a partir de bibliotecas de fagos de anticuerpos generadas usando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990), usando la VRP para seleccionar un anticuerpo o fragmento de anticuerpo apropiado. Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), describen respectivamente el aislamiento de anticuerpos de ratón y humanos, usando bibliotecas de fagos. Las publicaciones subsiguientes describen la producción de anticuerpos humanos de elevada afinidad (rango nM) mediante reordenación de la cadena (Mark et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)), así como mediante infección combinatoria y recombinación in vivo como estrategia para construir bibliotecas de fagos muy extensas (Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21:2265-2266 (1993). Por tanto, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales de hibridoma de anticuerpo monoclonal para el aislamiento de anticuerpos "monoclonales" (especialmente anticuerpos humanos) que son abarcados por la presente invención.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención se aísla fácilmente y se secuencia usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos de ratón). Las células de hibridomas de la invención sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN podría colocarse en vectores de expresión, los cuales de transfectan entonces en células huéspedes tales como las células COS de mono, las células ováricas de hámster chino (CHO), o las células de mieloma que de otro modo no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huéspedes recombinantes. El ADN también podría modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante por dominios constantes de cadena pesada y ligera humana en lugar de las secuencias homólogas de ratón (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851 (1984)), o uniendo covalentemente a la secuencia que codifica la inmunoglobulina la totalidad o parte de la secuencia que codifica un polipéptido que no es de inmunoglobulina. De esta manera, se preparan anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" que tienen la especificidad de unión de un anticuerpo monoclonal anti-VRP de ésta.

Típicamente, tales polipéptidos que no son de inmunoglobulina sustituyen los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o sustituyen los dominios variables de un sitio de combinación con antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico, el cual comprende un sitio de combinación con antígeno que tiene especificidad por una VRP y otro sitio de combinación con antígeno que tiene especificidad por un antígeno diferente.

Los anticuerpos quimérico o híbrido se podrían preparar también in vitro usando procedimientos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluyendo aquéllos que implican agentes entrecruzadores. Por ejemplo, podrían construirse inmunotoxinas usando una reacción de intercambio de disulfuro, o formando un enlace tioéter. Los ejemplos de reactivos apropiados para este propósito incluyen el iminotiolato y el metil-4-mercaptobutirimidato.

Para aplicaciones diagnósticas, los anticuerpos de la invención típicamente se marcarán con un grupo detectable. El grupo detectable puede ser uno cualquiera que sea capaz de producir, bien directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la porción detectable podría ser un radioisótopo, tal como ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S o ^{125}I; un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como el isotiocianato de fluoresceína, la rodamina, o luciferina; o un enzma, tal como la fosfatasa alcalina, la beta-galactosidasa, o la peroxidasa de rábano silvestre.

Podría emplearse cualquier procedimiento conocido en la técnica para conjugar separadamente el anticuerpo a la porción detectable, incluyendo aquéllos procedimientos descritos por Hunter et al., Nature 144:945 (1962); David et al., Biochemistry 13:1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40:219 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982).

Los anticuerpos de la presente invención podrían emplearse en cualquier procedimiento de ensayo conocido, tales como ensayos de unión competitivos, ensayos en sándwich directos e indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press Inc., 1987).

Los ensayos de unión competitivos se basan en la capacidad de un estándar marcado (el cual podría ser una VRP, o una porción inmunológicamente reactiva de la misma) para competir con el analito (VRP) de la muestra de ensayo por la unión con un número limitado de anticuerpo. La cantidad de VRP en la muestra de ensayo es inversamente proporcional a la cantidad de estándar que se une a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de estándar que se une, los anticuerpos generalmente se insolubilizan antes o después de la competición, de forma que el estándar y el analito que están unidos a los anticuerpos podrían separarse convenientemente del estándar y analito que permanecen sin unir.

Los ensayos en sándwich implican el uso de dos anticuerpos, cada uno capaz de unirse a una porción, o epítopo, inmunogénicamente diferente de la proteína a detectar (VRP). En un ensayo en sándwich, el analito de la muestra de ensayo se une mediante un primer anticuerpo, el cual está inmovilizado sobre un soporte sólido, y a continuación un segundo anticuerpo se une al analito, formando por tanto un complejo insoluble a tres bandas. Ver, por ejemplo, la patente estadounidense n° 4.376.110. El segundo anticuerpo podría estar marcado con un grupo detectable (ensayo en sándwich directo), o podría medirse usando un anticuerpo anti-inmunoglobulina que está marcado con un grupo detectable (ensayo en sándwich indirecto). Por ejemplo, un tipo de ensayo en sándwich es un ensayo ELISA, caso en el cual el grupo detectable es un enzima.

C. Anticuerpos humanizados

Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoácidos introducidos en él a partir de una fuente que no es humana. Estos residuos aminoácidos no humanos a menudo se denominan residuos "importados", los cuales se toman típicamente de un dominio variable "importado". La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colegas (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo CDR o secuencias de CDR de roedores por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, los anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente estadounidense n° 4.816.567, ver más arriba), en donde sustancialmente menos de un dominio variables humano intacto ha sido sustituido por la correspondiente secuencia de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos CDR, y posiblemente algunos residuos FR, son sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

Es importante que los anticuerpos sean humanizados reteniendo la elevada afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, de acuerdo con un procedimiento preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias progenitoras y de varios productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias progenitoras y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulinas son familiares a aquéllos formados en la técnica. Hay disponibles programas de ordenador que ilustran y muestran les estructural conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas visualizaciones permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unir su antígeno. De esta forma, pueden seleccionarse residuos FR, y combinarse a partir de la secuencia consenso y importada, de forma que se consiga la característica deseada del anticuerpo, tal como una afinidad incrementada por el(los) antígeno(s) diana(s). En general, los residuos CDR están directamente y mayoritariamente sustancialmente implicados en influenciar la unión de antígeno. Para más detalles consultar WO 92/22.653, publicada el 23 de diciembre de 1992.

D. Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados, que tiene especificidades de unión por al menos dos antígenos diferentes. En el caso presente, una de las especificidades de unión es por la VRP, la otra es por cualquier otro antígeno, y preferiblemente por un receptor o subunidad de receptor. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos que específicamente unen el receptor Flt4 y la VRP se hallan dentro del ámbito de la presente invención.

Los procedimientos para preparar anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la co-expresión dedos pares de cadena- pesada/cadena-ligera de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas pesadas tienen especificidades diferentes (Millstein y Cuello, Nature 305:537-539 (1983)). A causa del conjunto aleatorio de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (quadromas) producen una mezcla potencial, a menudo moléculas anticuerpos diferentes, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecifica correcta. La purificación de la molécula correcta, la cual se realiza usualmente mediante pasos de cromatografia de afinidad, es bastante complicada, y los rendimientos de producto son bajos. Se descubren procedimientos similares en WO 93/08.329, publicada el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991).

De acuerdo con una estrategia diferente y más preferida, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan a secuencias de dominios constantes de inmunoglobulinas. La fusión preferiblemente es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, comprendiendo al menos parte del gozne, regiones CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de la cadena pesada (CH1), que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera, presente en la menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se co-transfectan en un organismo huésped apropiado. Esto proporciona una gran flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptidos en las realizaciones cuando pueden usarse proporciones diferentes, de las tres cadenas polipeptídicas usadas en la construcción, para proporcionar los rendimientos óptimos. No obstante, es posible insertar las secuencias codificantes de dos o la totalidad de las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión, cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales resulta en rendimientos mayores, o cuando las proporciones no tienen un importancia particular. En una realización preferida de esta estrategia, los anticuerpos biespecíficos se componen de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida, con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par cadena-pesada/cadena-ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se encuentra que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones no deseadas de cadenas de inmunoglobulina, puesto que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina sólo en una mitad de la molécula biespecífica proporciona una forma fácil de separación. Esta estrategia se descubre en WO 94/04.690, publicada el 3 de marzo de 1994. Para más detalles sobre generar anticuerpos biespecífico consultar, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986).

E. Anticuerpos heteroconjugados

Los anticuerpos heteroconjugados están también dentro del ámbito de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados se componen de dos anticuerpos covalentemente unidos. Tales anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para apuntar células del sistema inmune contra células no deseadas (patente estadounidense n° 4.676.980), y para el tratamiento de la infección con VIH (WO 91/00.360; WO 92/20.373; EP 03.089). Los anticuerpos heteroconjugados podrían prepararse usando cualesquier procedimientos de entrecruzamiento conveniente. Los agentes entrecruzadores apropiados son bien conocidos en la técnica, y se descubren, por ejemplo, en la patente estadounidense n° 4.676.980, junto con un cierto número de técnicas de entrecruzamiento.

6. Usos de los anticuerpos contra la VRP i. Usos terapéuticos

Los anticuerpos contra la VRP podrían ser útiles en ciertas indicaciones terapéuticas para bloquear la actividad de la VRP (por ejemplo, para bloquear el exceso de activación o inhibición del receptor Flt4 u otro receptor que una la VRP, y para bloquear la neovascularización, la re-endotelización, y la angiogénesis). Específicamente, los anticuerpos contra la VRP son útiles en el tratamiento de varias enfermedades y alteraciones neoplásicas y no neoplásicas. Los neoplasmas y las condiciones relacionadas que son susceptibles de tratamiento incluyen los carcinomas de mama, los carcinomas de pulmón, los carcinomas gástricos, los carcinomas esofágicos, los carcinomas colorectales, los carcinomas de hígado, los carcinomas ováricos, los tecomas, los arrenoblastomas, los carcinomas cervicales, los carcinomas endometriales, la hiperplasia endometrial, la endometriosis, los fibrosarcomas, los coriocarcinomas, los cánceres de cabeza y cuello, los carcinomas nasofaríngeos, los carcinomas de la laringe, los hepatoblastomas, el sarcoma de Karposi, los melanoma, los carcinomas de la piel, los hemangiomas, el hemangioma cavernoso, los hemangioblastomas, los carcinomas de páncreas, los retinoblastomas, los astrocitomas, los glioblastomas, los Schwannomas, los oligodendrogliomas, los meduloblastomas, los neuroblastomas, los rabdomiosarcomas, el sarcoma osteogénico, los leiomiosarcomas, los carcinomas del tracto urinario, los carcinomas de tiroides, el tumor de Wilm, el carcinoma de células renales, el carcinoma de próstata, la proliferación vascular anormal asociada con facomatosas, edema (tal como el que está asociado con tumores cerebrales), y el síndrome de Meig.

Las condiciones no neoplásicas que son susceptibles de tratamiento incluyen la artritis reumatoide, la psoriasis, la ateroesclerosis, la retinopatía asociada a diabetes y otras, la fibroplasia retrolental, el glaucoma neovascular, la degeneración macular relacionad con la edad, las hiperplasias de tiroides (incluyendo la enfermedad de Grave), los transplantes de córnea y otros tejidos, la inflamación crónica, la inflamación de pulmón, el síndrome nefrótico, la preeclampsia, los ascites, la efusión pericardial (tal como la asociada con la pericarditis), y la efusión pleural.

La degeneración macular relacionada con la edad (AMD) es una causa líder de pérdida visual severa en la población anciana. La forma exudativa de la AMD se caracteriza por una neovascularización coroidal y el desprendimiento de las células del epitelio retinal pigmentado. Puesto que la neovascularización coroidal está asociada con un empeoramiento dramático en la prognosis, los anticuerpos contra la VRP de la presente invención se espera que sean especialmente útiles para reducir la gravedad de la AMD.

Para aplicaciones terapéuticas, los anticuerpos contra la VRP de esta invención se administran a un mamífero, preferiblemente un humano, en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable, incluyendo aquéllas que podrían administrarse a un humano intravenosamente como un bolo o mediante infusión continua a lo largo de un período de tiempo, mediante vías intramusculares, intraperitoneales, intracerebroespinales, subcutáneas, intra-articulares, intrasinoviales, intratecales, orales, tópicas, o de inhalación. Los anticuerpos contra la VRP se administran convenientemente mediante rutas intratumorales, peritumorales, intralesionales, o perilesionales, o a la linfa, para ejercer efectos terapéuticos locales así como sistémicos. Se espera que la ruta intraperitoneal sea particularmente útil, por ejemplo, en el tratamiento de tumores de ovarios.

Tales formas de dosificación abarcan portadores farmacéuticamente aceptables que son inherentemente no tóxicos y no terapéuticos. Los ejemplos de tales portadores incluyen los intercambiadores de iones, la alúmina, el estearato de aluminio, la lecitina, las proteínas del suero, tales como la albúmina de suero humana, sustancias tamponantes tales como los fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato potásico, mezclas parciales de glicéridos de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales, o electrolitos tales como el sulfato de protamina, el fosfato hidrógeno disódico, el fosfato hidrógeno potásico, el cloruro sódico, las sales de zinc, el sílice coloidal, el trisilicato de magnesio, la polivinilpirrolidona, las sustancias basadas en celulosa, y el PEG. Los portadores para formas tópicas o basadas en gel de los anticuerpos contra la VRP incluyen los polisacáridos tales como la carboximetilcelulosa sódica o metilcelulosa, la polivinilpirrolidona, los poliacrilatos, los polímeros con bloque polioxietilenopolioxipropileno, el PEG, y los alcoholes de ceras de madera. Para todas las administraciones, se usan de forma apropiada las formas de depósito. Tales formas incluyen, por ejemplo, las microcápsulas, las nanocápsulas, los liposomas, los emplastos, las formas para inhalación, los nebulizadores nasales, las tabletas sublinguales, y las preparaciones de liberación sostenida. El anticuerpo contra la VRP se formulará típicamente en tales vehículos en una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml hasta 100 mg/ml.

Los ejemplos apropiados de preparaciones de liberación sostenida incluyen las matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo contra la VRP, matrices que están en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen los poliésteres, los hidrogeles (por ejemplo, el poli(2-hidroxietil-metacrilato) tal como se describen en Langer et al., ver más arriba, y en Langer, ver más arriba, o los poli (vinil alcoholes), los oliláctidos (patente estadounidense
n° 3.773.919), los copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutatamo (Sidman et al., ver más arriba), el acetato de etilenvinilo no degradable (Langer et al., ver más arriba), los copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico tales como el Lupron Depot^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico con acetato de leuprólido), y poli-D-(-)- 3-hidroxibutirato. Mientras que los polímeros tales como el acetato de etilenvinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos contra la VRP permanecen encapsulados en el cuerpo durante un período largo, podrían desnaturalizarse o agregarse a resultas de su exposición a la humedad a 37°C, resultando en una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en su inmunogenicidad. Pueden desarrollarse estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el 20 mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través del intercambio tio-disulfuro, la estabilización podría conseguirse modificando los residuos sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido en humedad, usando aditivos apropiados, y desarrollando composiciones específicas de matriz de polímeros.

Las composiciones de VRP de liberación continuada también incluyen los anticuerpos atrapados liposomalmente. Los liposomas que contienen los anticuerpos contra la VRP se preparan mediante procedimientos conocidos por sí mismos en la técnica, tales como los descritos en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); y en las patentes estadounidenses n° 4.485.045 y 4.544.545. Ordinariamente, los liposomas son del tipo unilamelar pequeño (aproximadamente 200-800 Angstroms), en los que el contenido de lípidos es superior a aproximadamente el 30% molar en colesterol, ajustándose la proporción seleccionada para la terapia óptima con VRP. En la patente estadounidense n° 5.013.556 se descubren liposomas con tiempo en circulación mejorado.

Otro uso de la presente invención comprende incorporar los anticuerpos contra la VRP en artículos moldeados. Tales artículos pueden usarse para modular el crecimiento de células endoteliales y la angiogénesis. Además, la invasión del tumor y la metástasis podrían modularse con estos artículos.

Para la prevención o tratamiento de enfermedades, la dosificación apropiada del anticuerpo contra la VRP dependerá del tipo de enfermedad a tratar, tal como se ha definido más arriba, de la gravedad y evolución de la enfermedad, tanto si los anticuerpos se administran con propósitos preventivos o terapéuticos, de la terapia previa, del historial clínico del paciente, y de la respuesta al anticuerpo contra la VRP, y del criterio del médico responsable. El anticuerpo contra la VRP se administra convenientemente al paciente de una vez o a lo largo de series de tratamientos.

Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente 1 \mug/kg hasta 15 \mug/kg de anticuerpo contra la VRP es un dosis candidata inicial para la administración al paciente, sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. Una dosis diaria típica podría oscilar desde aproximadamente 1 \mug/kg hasta 100 \mug/kg o más, dependiendo de los factores mencionados más arriba. Para administraciones repetidas a lo largo de varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento se mantiene hasta que ocurre una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, otros regímenes de dosis podrían ser útiles. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante técnicas convencionales y ensayos, incluyendo, por ejemplo, la visualización radiográfica del tumor.

De acuerdo con otras realizaciones de la invención, la efectividad del anticuerpo contra la VRP para prevenir o tratar enfermedades podría mejorarse administrando el anticuerpo contra la VRP en serie o en combinación con otro agente proteico que es eficaz para estos propósitos, tales como los enumerados más abajo, o uno o más agentes terapéuticos convencionales tales como, por ejemplo, agentes alquilantes, antagonistas del ácido fólico, anti-metabolitos del metabolismo del ácido nucleico, antibióticos, análogos de pirimidina, 5-fluorouracilo, cisplatino, nucleósidos de purina, aminas, aminoácidos, nucleósidos de triazol, o corticoesteroides. Tales otros agentes podrían estar presentes en la composición que se está administrando o podrían administrarse separadamente. También, el anticuerpo contra la VRP se administra convenientemente en serie o en combinación con tratamientos radiológicos, tanto si implican irradiación como administración de sustancias radiactivas.

En una realización, la vascularización de tumores se ataca mediante terapia de combinación. Se administran uno o más anticuerpos contra la VRP a pacientes portadores de tumor, en dosis terapéuticamente efectivas según se determina, por ejemplo, observando la necrosis del tumor o de sus focos metastáticos, si hay alguno. Esta terapia se continua hasta el momento en que no se observan más beneficios, o hasta que el examen clínico no muestra traza alguna del tumor o de cualquier foco metastático. A continuación se administra el agente proteico auxiliar, sólo o en combinación con otro agente auxiliar. Tales agentes incluyen, por ejemplo, el TNF, un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar la actividad angiogénica del aFGF o bFGF o del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), un antagonista contra el rhVEGF tal como se describe en WO 94/10.202, ver más arriba, el interferón alfa, beta, o gamma, un anticuerpo anti-HER2, la heregulina, un anticuerpo anti-heregulina, el factor D, la interleucina-1 (IL-1), la interleucina-2 (IL-2), el GM-CSF, o agentes que promueven la coagulación microvascular en tumores, tales como el anticuerpo anti-proteína C, el anticuerpo anti-proteína S, o la proteína unidora C4b (WO 91/01.753, publicada el 21 de febrero de 1991), o el calor o la radiación.

Puesto que los agentes auxiliares variarán en su efectividad, es deseable comparar su impacto sobre el tumor mediante verificación en matriz de la forma convencional. La administración de anticuerpo contra la VRP y de TNF, y/o otro agente auxiliar, se repite hasta que se consigue el efecto clínico deseado. Alternativamente, el anticuerpo o anticuerpos contra la VRP se administran junto con el TNF y, opcionalmente, otro(s) agente(s) auxiliar(es). En casos en los que el tumor sólido se halla en las extremidades, o en otras ubicaciones susceptibles de aislamiento de la circulación general, los agentes terapéuticos descritos en ésta se administran al tumor u órgano aislado. En otras realizaciones se administra un antagonista del FGF o del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), tal como un anticuerpo neutralizante anti-FGF o anti-PDGF, al paciente en conjunción con el anticuerpo contra la VRP. El tratamiento con anticuerpos contra la VRP podría suspenderse óptimamente durante períodos de cicatrización de heridas o de neovascularización deseable.

ii. Otros usos

Los anticuerpos contra la VRP de la invención también son útiles como agentes de purificación por afinidad. En este proceso, los anticuerpos contra la VRP se inmovilizan sobre un soporte apropiado, tal como una resina Sephadex o papel de filtro, usando procedimientos bien conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado se pone a continuación en contacto con una muestra que contiene la VRP a purificar, y a continuación se lava el soporte con un solvente apropiado que retirará sustancialmente todo el material en la muestra excepto la VRP, la cual está unida al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, se lava el soporte con otro solvente apropiado, tal como tampón glicina, pH 5,0, que liberará la VRP del anticuerpo.

Los anticuerpos contra la VRP también podrían ser útiles en ensayos diagnósticos para la VRP, por ejemplo, detectando su expresión en células específicas, tejidos, o suero. Los anticuerpos contra la VRP son también útiles para la purificación por afinidad de la VRP a partir de cultivos de células recombinantes o fuentes naturales. Los anticuerpos contra la VRP que no reaccionan detectablemente de forma cruzada con otras proteínas pueden usarse para purificar la VRP libre de estas otras proteínas conocidas. Más arriba de describen ensayos diagnósticos apropiados para la VRP y sus anticuerpos.

iii. Experimental

Más abajo hay ejemplos de realizaciones específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen sólo con propósitos ilustrativos, y no se pretende que limiten el ámbito de la presente invención en modo alguno.

Todas las publicaciones, patentes, y solicitudes de patentes citadas en ésta, tanto más arriba como más abajo, se incorporan en ésta por referencia en su totalidad.

Ejemplo 1 Aislamiento de clones de cADN que codifican el receptor Flt4 humano

El cADN, sintetizado a partir de mARN purificado a a partir de la línea celular de leucemia megacariocítica humana CMK11-5, se purificó con cebadores de la PCR redundantes sobre las regiones conservadas de los receptores quinasa de tirosina (Wilks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1603-1607 (1989)). Un fragmento amplificado de aproximadamente 180 p.b., con una secuencia de ADN única (denominado SAL-S1 o tk1; PCT/US93/00.586, ver más arriba) se usó para examinar (Janssen et al., ver más arriba) bibliotecas de cADN procedentes de células CMK11-5 y DAM1, para obtener clones solapados que codificaran la totalidad de la longitud de la forma corta del receptor Flt4 (1298 aminoácidos). La secuencia de los clones codificando el Flt4 ensamblados era igual a la descrita a la partir de una línea celular de aneritroleucemia (Pajusola et al., Cancer Res, ver más arriba); codifica 8 diferencias de aminoácidos respecto otras secuencias Flt4 descritas (Galland et al., Oncogene, ver más arriba). Los clones que codificaban la forma larga del Flt4 (1363 aminoácidos) se construyeron sintetizando la secuencia de ADN 3' diferente, de aproximadamente 200 p.b., en base a la secuencia publicada (Pajusola et al., Oncogene 8, ver más arriba).

Ejemplo 2 Proteínas de fusión IgG receptor, antisuero contra Flt4/IgG, y análisis FACS de G61

Se produjeron Flt1/IgG (Park et al., ver más arriba), Flk1/IgG (Park et al., ver más arriba), Rse/IgG (Godowski et al., Cell 82:355-358 (1995)), y Htk/IgG (Bennett et al., J. Biol. Chem. 269:14211-14218 (1994)) tal como se describe en estas referencias. Para la Flt4/IgG, el ADN que codificaba el dominio extracelular del receptor Flt4 (aminoácidos 1-775) se empalmó a la región Fc de una cadena pesada de IgG humana en el único sitio BstEII en el plásmido pBSSK-Fc (pBSSK-CH2CH3) (Bennett et al., J. Biol. Chem. 266:23060-23067 (1991)). El marco de lectura abierto que codificaba la Flt4/IgG se clonó en el vector de expresión en mamíferos pRK5 (Suva et al., Science 237:893--896 (1987)) para rendir el plásmido pRK5.tk1ig1.1. Este plásmido se transfectó mediante electroporación (Janssen et al., ver más arriba) en células 293 (ATCC CR.L 1651), y después de 3-4 días, se purificó la Flt4/IgG a partir del medio condicionado libre de suero con agarosa-Proteína A (Calbiochem). El antisuero contra la Flt4/IgG se generó mediante la inyección de Flt4/IgG purificada en conejos.

Usando esta proteína de fusión para examinar líneas celulares, en busca de VRP unida a membrana, mediante análisis FACS, se identificó una línea celular positiva, la G61, descrita más abajo.

La línea celular de glioma humana, G61 (Hamel et al., J. Neurosci. Res. 34:147-157 (1993)) se cultivó en F12:
DMEM (50:50) (glucosa elevada) que contenía un 10% de suero fetal bovino, L-glutamina 2 mM, y antibióticos. Para el análisis FACS de la unión de Flt4/IgG a células G61, se incubaron 1 millón de células con proteína de fusión receptor-IgG 70 nM, en solución salina tamponada con fosfato (PBS), 5% de suero de cabra, 2% de suero de conejo, durante 60 minutos, a 4°C, y a continuación se tiñeron con 10 \mug/ml de anticuerpo de cabra anti-Fc humana conjugado con biotina-SP, y 10 \mug/ml de estreptoavidina conjugada con R-ficoeritrina (Jackson Immuno Research). La G61 causó aproximadamente un desplazamiento de 10 veces en la intensidad del pico de fluorescencia, que era específica para la Flt4/IgG en comparación con Rse/JgG, un complejo no relacionado con el receptor quinasa de tirosina (Figura 2). Los intentos para clonar la expresión de esta VRP putativa unida a membrana mediante la transfección de conjuntos de clones de cADN en células COS, seguida por examen con Flt4/IgG marcada, no rindió positivos a partir de 640 conjuntos de 1000-5000 clones cada uno.

Ejemplo 3 Aislamiento de clones de cADN que codifican la VRP humana

Se preparó una biblioteca de cADN a partir de poliA+ARN aislado, tal como se describe en Cathala et al., ADN 2:329-335 (1983) y Aviv y Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408-1412 (1972), procedente de la línea celular de glioma humano, G61 (Hamel et al., ver más arriba). El cADN se preparó a partir de este ARN con reactivos de GIBCO/BRL (Superscript) y se clonó en el plásmido pRK5B (Holmes et al., Science 253:1278-1280 (1991)) digerido con XhoI y NotI. Los clones que codificaban la VRP se aislaron examinando la biblioteca de cADN con sondas de oligonucleótidos sintéticas basadas en una secuencia de EST (GeneBank, locus HSC1WF111), la cual mostraba un parecido razonable con el VEGF. La secuencia EST del HSC1WF111 tiene 296 p.b. y es un 36% idéntica al VEGF a los largo de 50 residuos, incluyendo una identidad de 11 de 13 residuos que empieza en el aminoácido 56 del VEGF. La secuencia es como sigue:

1

Las secuencias de las sondas de oligonucleótidos ovh 1.4 y ovh 1.5 empleadas se indican a continuación.

2

Estas dos sonda se marcaron con ^{32}P y se hibridaron en 20% de formamida a 42°C, con una lavado final en NaCl 30 mM/citrato trisódico 3 mM a 55°C (Janssen, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1995)). Se identificaron y caracterizaron siete positivos a partir de 650.000 clones examinados. Los positivos se agrupaban en tres grupos mediante mapado de restricción y secuenciación del ADN.

Los clones VH1.4 (pRK.vhl.4.1) y VH1.6 incluían la región codificante completa (Figura 3A) y se secuenciaron completamente. Diferían sólo en longitud y en la ausencia de dos T precediendo la secuencia poli A 3' en el clon VH1.6. El VH1.2 es colineal con el VH1.4. Los clones VR1.3, VH1.5 y VH1.7 son idénticos, y tienen una supresión de 557 p.b. cuando se comparan con el VH1.4 (una supresión. de los p.b. 519-1075), y el clon VH1.1 tiene una supresión de 152 p.b. cuando se compara con el VH1.4 (una supresión de los p.b. 924-1075). Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos deducida del VH1.4 se muestran en la Figura 1.

La secuencia contenía un marco de lectura abierto de 419 aminoácidos, empezando con un codón ATG precedido por un residuo purina en posición 3', tal como se esperaba para un sitio de inicio de la traducción (Kozak, Nucl. Acids Res. 12:857-872 (1984). Aproximadamente a 250 p.b. 5' respecto este ATG, hay dos codones ATG en pauta seguidos poco después (4 a 10 aminoácidos) por un codón de detención. Ambos de estos ATG tienen una pirimidina en posición 3', y no se esperaría que funcionaran como un sitio de inicio fuerte de la traducción (Kozak, ver más arriba). La secuencia de aminoácidos codificada que sigue inmediatamente al inicio del marco de lectura de 419 aminoácidos es hidrofóbica, indicativa de una secuencia señal de secreción amino-terminal (Perlman y Halvorson, J. Mol. Biol. 167:391-409 (1983)). Ver la Figura 3A. El sitio de corte más probable para esta secuencia sería después del aminoácido 20, aunque no puede excluirse el corte a continuación de los residuos 15 ó 16 (von Heijne, Nucl. Acids Res. 14:4683-4690 (1986)). El marco de lectura abierto está precedido por una región 5' no traducida, rica en GC, de aproximadamente 380 p.b., y seguida por un región 3' no traducida de aproximadamente 400 p.b.

La secuencia madura predicha de la VRP humana contiene 399 residuos aminoácidos (M_{T} traducida = 44,8 kDa), de los cuales 37 (9,3%) son residuos cisteína; hay tres potenciales sitios de glicosilación unidos a N (Figura 3A). Un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la VRP con las seis formas del VEGF y PIGF muestra que es más similar al VEGF_{121} (32% idéntica) y al PIGF_{131} (27% idéntica) (Figura 3B); las ubicaciones de 8 de los 9 residuos cisteína se conservan. Mientras que la VRP no contiene las regiones de aminoácidos básicos halladas en algunas formas del VEGF y PIGF, es considerablemente mayor que el VEGF, y contiene un mitad C-terminal de la molécula rica en cisteínas que no se halla en el VEGF. Este dominio rico en cisteínas tiene cuatro copias del patrón: Cys seguida por diez residuos no-Cys, seguidos por Cys-X, seguidos por Cys-X, y a continuación por Cys (Figura 3B), una repetición hallada más de 50 veces en una proteína 3 anular diptran Balbiani (Paulsson et al., J. Mol. Biol. 211:331-349 (1990)). Sin estar limitados por teoría alguna, la VRP podría interaccionar con otros 10 proteínas unidas a membrana sobre estas células a través de los residuos cisteína; una interacción molecular tal ha sido propuesta para la proteína Balbiani (Paulsson et al., ver más arriba).

Dos de los clones de cADN (VH1.1 y VH1.3) contenían una supresión de 152 ó 557 p.b. cuando se comparaban con el VH1.4 (Figura 3A). Ambas de estas supresiones acaban en el mismo nucleótido, y se presume que son el resultado de un empalme alternativo. Se esperaría que ambas supresiones codificaran la misma proteína desplazada en su pauta 3' respecto de la supresión, la cual termina en un codón de detención en 15 aminoácidos. La proteína codificada por el VH1.3 no incluiría ninguna de la región núcleo de cisteínas similar al VEGF. El VH1.1 contiene mucha de la región que es similar al VEGF; su supresión, no obstante, no es análogo a las diversas formas conocidas del VEGF o PIGF (Ferrara et al., ver más arriba; Maglione et al., ver más arriba; Hauser y Weich, ver más arriba).

La Figura 4 descubre un alineamiento del VH1.4 (arriba) con 11 secuencias de cADN de EST procedentes del GeneBank. Se destaca que los EST 3' están en el extremo poli-A, y que los EST cubren sólo un poco más de la mitad de la secuencia de longitud completa del VH1.4.

Ejemplo 4 Precipitación con receptor IgG de VRP marcada con ^{35}S

Para determinar si la VRP es un ligando para el Flt4, se transfectaron plásmidos de expresión que contenían el clon de cAND VH1.4, así como plásmidos control (el vector de expresión solo o con ADN de VEGF o PIGF), en células COS7, y la proteína se marcó con ^{35}S-aminoácidos. El medio condicionado procedente de estas células se precipitó con Flt4/IgG y Flk1/IgG. Específicamente, el plásmido de expresión de la VRP, pRK.vh1.4.2, se construyó suprimiendo aproximadamente 360 p.b. de la secuencia 5' no traducida (5' respecto el sitio AgeI (Figura 3A) del VH1.4). Este ADN y los plásmidos control que codificaban el VEGF_{165} (Houck et al., Mol. Endocrinol. 5:1806-1814 (1991)), el PIGF_{152} (Park et al., ver más arriba), o el vector solo (pRK5, Suva et al., ver más arriba), se transfectaron en células COS7 con DEAE-dextrano (Janssen et al., ver más arriba). Dos días después de la transfección, se marcaron las células con un pulso en placas de 10 cm, durante 5 horas, con 5 ml de medio DMEM libre de metionina y cisteína, suplementado con 100 \muCi/ml de ^{35}S-aminoácidos (Pro-Mix^{TM}, marca Amersham #SJQ0079), a 37°C, y a continuación se cazaron con DMEM durante 7 horas. El medio condicionado marcado se concentró 10 veces mediante concentración por rotación (Centricon-10^{TM}, marca Amicon #4203). Cincuenta \mul del medio concentrado se incubaron con 3 \mug de receptor IgG, y 80 \mul de una papilla al 50% de proteína A-agarosa (Calbiochem), durante la noche, a 4°C. Los precipitados se lavaron con PBS/0,1% de Triton X-100, se hirvieron en tampón de muestras SDS, y se electroforaron en geles de poliacrilamida con 12% de SDS (Novex #EC60052). Los geles se trataron con potenciador autoradiográfico (duPont #NEF974) y se expusieron durante la noche a -70°C.

Se precipitaron dos bandas específicas de 53 kDa y 33 kDa procedentes de la transfección con VRP con la Flt4/IgG; estas bandas estaban ausentes en el vector de transfección. Se halló poca o ninguna precipitación específica de estas dos bandas con Flt1/IgG o Flk1/IgG. A veces se detectó cierta precipitación de VRP con Flk1/IgG, lo que sugiere que la VRP podría tener una interacción de baja afinidad con el Flk1. La transfección con un plásmido expresando el VEGF mostró la esperada precipitación de una banda intensa, de aproximadamente 22 kDa, con Flt1/IgG y Flk1/IgG (DeVries et al., ver más arriba; Quinn et al., ver más arriba; Millauer et al., ver más arriba; Terman et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., ver más arriba), pero no hubo precipitación con Flt4/IgG. Experimentos similares con PIGF marcado no mostraron precipitación por Flt4/IgG, aunque sí rindieron la esperada precipitación con Flt1/IgG pero no con Flk1/IgG (Park et al., ver más arriba). Estos datos indican que la VRP es une al dominio extracelular del receptor Flt4, pero que no interacciona (o lo hace mucho más débilmente) con los receptores Flt1 y Flk1 del VEGF. También confirma la ausencia de interacción del VEGF con el Flt4 (Pajusola et al., Oncogene 9, ver más arriba), e indica que el PIGF no es tampoco un ligando para este receptor.

Ejemplo 5 Fosforilación de tirosina del receptor Flt4

Para ensayar la fosforilación de tirosina del Flt4 (también descrito en PCT/US93/00.568, ver más arriba), se expresó Flt4 en células 293 y la fosforilación del Ftll4 se monitorizó mediante inmunotransferencia de fosfotirosina. Específicamente, el ADN codificando la forma larga del Flt4 humano se clonó en el vector de expresión en mamíferos pRK5 (Suva et al., ver más arriba) para dar lugar al plásmido pRK.tk1-3.1. Este plásmido se cotransfectó, con un plásmido que contenía una unidad de transcripción de fosfotransferasa de miroglicósido (neo) en células 293, mediante precipitación con fosfato cálcico (Janssen et al., ver más arriba), y se seleccionaron las líneas transfectadas establemente mediante cultivo sobre G418 (Gibco). Una línea celular clonal que expresaba el Flt4 (clon 31), según. se determinó mediante análisis FACS con antisuero contra la Flt4/IgG, y células 293 no transfectadas, se usaron en los ensayos de fosforilación de tirosina del Flt4. Un millón de células en 100 \mul de PBS/0,1% albúmina de suero bovino (BSA) se mezclaron con 100 \mul de muestra, y es incubaron a 37°C durante 15 minutos. A continuación se recolectaron las células mediante centrifugación, y se lisaron en 250 \mul de NaCl 0,15 M, 10% de glicerol, 1% de Triton X-100, HEPES 50 mM pH 7,3, 4 \mug/ml de PMSF, 0,02 u/ml de aprotinina (Sigma A6279), y ortovanadato de sodio 20 mM. El Flt4 se inmunoprecipitó mediante la adición de 8 \mul de antisuero de conejo contra la Flt4/IgG, y 30 \mul de proteína A-agarosa. Los precipitados lavados se hirvieron en tampón de muestra SDS, se electroforaron en geles de poliacrilamida (Novex), se transfirieron a nitrocelulosa (Janssen et al., ver más arriba), y se sondearon con un anticuerpo monoclonal anti-fosfotirosina (Upstate Biotechnology) y un sistema de detección con fosfatasa alcalina (Promega).

Las muestras conteniendo VRP y VEGF se prepararon mediante la electroporación de plásmidos de expresión que codificaban el VH1.4 (pRK.vh1.4.2) o VEGF (Houck et al., ver más arriba), en células 293, y concentrando 20 veces (Centricon-10, Amicon) el medio condicionado, libre de precipitados, de 3 días. En los experimentos de competición receptor-IgG, los medios condicionados concentrados se preincubaron durante 1 hora, a 4°C, con receptor-IgG.

Sin estimulación, las células 293 que expresaban o no el Flt4 mostraron poca o ninguna fosforilación de tirosina del Flt4. La estimulación de las células expresando el Flt4 mediante antisuero contra la Flt4/IgG mostró la fosforilación de tirosina de dos bandas de 180 y 120 kDa. No se observó incremento por encima de la fosforilación basal con suero preinmune, y no se hallaron bandas con la estimulación con Flt4/IgG de células que no expresaban. Se han descrito dos bandas de Flt4 con aproximadamente este tamaño que son expresadas por células DAM1 y HEL (Pajusola et al., Oncogene 8, ver más arriba). Además, el análisis en gel con SDS de la Flt4/IgG purificada muestra que está compuesta por péptidos de 150, 80 y 70 kDa. La secuencia N-terminal de los péptidos de Flt4/IgG muestra que las bandas de 150 y 70 kDa tienen la secuencia de aminoácidos YSMTPPTL (SEC. N° ID.: 9) (que corresponde a la secuencia del Flt4 que empieza en el residuo 25), y que la banda de 80 kDa tiene la secuencia SLRRRQQQD (SEC. N° ID.: 10) (que corresponde a la secuencia del Flt4 que empieza en el residuo 473). Por tanto, ambos, la Flt4/IgG y el Flt4 de longitud completa parecen estar parcialmente cortados en el dominio extracelular, y las bandas fosforiladas en tirosina de 180 y 120 kDa observadas en los ensayos de fosforilación del Flt4 corresponderían a los péptidos de 150 y 80 kDa de la Flt4/IgG. La adición de antisuero policlonal a las células expresando el Flt4 mostró la fosforilación de tirosina de dos bandas de Flt4 de 180 y 120 kDa; no se observaron bandas en células que no expresaban. Estos datos muestran que los anticuerpos policlonales generados contra el dominio extracelular del receptor Flt4 son capaces de activar la fosforilación de tirosinas del Flt4.

Para determinar si la VRP podría activar la fosforilación de tirosinas del Flt4, se ensayó medio condicionado procedente de células de mamífero transfectadas con el plásmido de expresión de la VRP. Este medio condicionado estimuló la fosforilación de tirosinas de las mismas bandas de 180 y 120 kDa halladas con los anticuerpos policlonales agonistas, demostrando que la VRP es capaz de estimular la fosforilación de, así como unirse a, el Flt4. El medio condicionado procedente de células expresando el VEGF no consiguió activar la fosforilación de tirosinas del Flt4.

Para confirmar la especificidad de la unión de la VRP a los receptores de la familia VEGF, se ensayaron la Flt4/IgG, Flt1/IgG, Flk1/IgG, y Htk/IgG por su capacidad para competir con la fosforilación del Flt4 estimulada por la VRP. Tal como se esperaba, si la VRP es un ligando para el Flt4, la Flt4/IgG impidió la fosforilación estimulada por VRP, mientras que la Flt1/IgG, Flk1/IgG, y Htk/IgG, una proteína de fusión de un receptor quinasa de tirosina no relacionado, tenían poco o ningún efecto. Estos datos muestran que la VRP es capaz de inducir la fosforilación de tirosinas del Flt4.

Ejemplo 6 Purificación de la VRP y unión de Flt4/IgG marcada

El marco de lectura que codifica la secuencia N-terminal señalizadora de secreción, y aproximadamente 30 aminoácidos procedentes de la glicoproteína D del herpes (Lasky y Dowbenko, DNA 3:23-29 (1984); Pennica et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1142-1146 (1995)) se fusionaron con una secuencia engarce corta a la secuencia madura putativa de la VRP. Se espera que esta construcción, a continuación de su secreción a partir de células de mamífero, tenga la secuencia N-terminal de la glicoproteína D: KYALADASLKMADPNRFRGKDLPVLDQLLEGGAAHYALLP (SEC. N° ID.: 11) seguida por la secuencia de la VRP madura GPREAPAAAAAFE (SEC. N° ID.: 12). El ADN codificando esta proteína de fusión se clonó en el vector pRK5 para rendir el plásmido pRK. vh 1.4.5. Este plásmido se transfectó en células 293 mediante electroporación (Janssen et al., ver más arriba), y la VRP se purificó a partir de medio condicionado libre de suero de 3-4 días mediante cromatografía de afinidad con anticuerpo monoclonal (5B6), y se cuantificó mediante ensayó colorimétrico (Bio-Rad). Este anticuerpo es específico para la secuencia de la glicoproteína D fusionada al extremo N-terminal de la VRP.

La Flt4/IgG se yodó hasta una actividad específica de 1000-1500 Ci/mmol. con cuentas yodadas de la marca Iodobeads^{TM} (Pierce). La unión se realizó con ^{125}I-Flt4/IgG de \sim20.000 cpm, y 12 ng de proteína de fusión VH1.4 gD en PBS, 0,5% de BSA, 0,02% del tensioactivo Tween-20^{TM}, 1 \mug/ml de heparina (tampón de unión) conteniendo 20 \mul de una papilla al 50% de cuentas de vidrio conjugadas con \sim30 \mug de anticuerpo monoclonal anti-gD (5B6), en un volumen final de 100 \mul, durante 4-6 horas, a 22°C. Las cuentas se recogieron mediante filtración (Millipore Multiscreen-HV), se lavaron cinco veces con 200 \mul de tampón de unión, y se contaron. Para uniones a concentraciones mayores de Flt4/IgG (Figura 5B), el tampón de unión fue DMEM (bajo en glucosa):F12 (50:50), HEPES sódico 20 mM, pH 7,2, 10% de suero fetal bovino, 0,2% de gelatina, y 1 \mug/ml de heparina.

La VRP purificada se unión específicamente a la ^{125}I-Flt4/IgG, y la unión no fue disputada por la Flt1/IgG o Flk1/IgG (Figura 5A). La competición de unión con concentraciones crecientes de Flt4/IgG sin marcar (Figura 5B) dio una EC_{50} para esta interacción de \sim0,7 nM, sugiriendo que la unión de la VRP al Flt4 es de elevada afinidad, tal como se esperaría si la VRP es un ligando biológicamente relevante del Flt4.

Transferencias de ARN

Las transferencias conteniendo ARN humano poli(A)^{+} procedían de Clontech. Para la línea celular de glioma G61, se electroforaron 5 \mug de ARN poli(A)^{+} y poli(A)- en un gel de agarosa al 1% /formaldehído 2,2 M, y se transfirieron a nitrocelulosa (Janssen et al., ver más arriba). Las transferencias se hibridaron con las sondas ovhl.4 y ovhl.5 marcadas con ^{32}P, y se lavaron con NaCl 30 mM/citrato trisódico 3 mM, a 55°C.

La línea celular de glioma G61 usada en la clonación de la VRP expresa una banda principal de ARN de VRP de aproximadamente 2,4 kb. También podría estar presente una banda menor de aproximadamente 2,2 kb. Una banda de 2,4 kb se expresó en tejidos humanos adultos procedentes del corazón, placenta, ovarios, e intestino delgado; se halló una banda más débil en pulmón, músculo esquelético, bazo, próstata, testículos, y colon. La expresión de un mARN de 2,4 kb también se halló en pulmón y riñón fetal.

Ejemplo 7 Actividad mitogénica de la VRP

Para ensayar si la VRP tiene una actividad mitogénica similar a la hallada para el VEGF, se determinó el crecimiento de células endoteliales de pulmón humano a concentraciones crecientes de VRP o VEGF (Figura 6). Específicamente, las células endoteliales de pulmón humano (HMVEC-L, Clonetics, San Diego, CA) se mantuvieron en el medio de cultivo recomendado (EGM-MV con un 5% de suero fetal bovino). Para el ensayo de mitogénesis, se sembraron células con un número bajo de pasajes (< 6) a 6500 células/pocillo en placas de 48 pocillos (Costar), y se mantuvieron durante la noche en el medio de cultivo recomendado. Se retiró el medio, y se mantuvieron las células en el medio de cultivo (2% de suero fetal bovino) sin extracto de cerebro bovino, y suplementadas con VEGF o VRP. Transcurridos cuatro días, se retiraron las células con tripsina y se contaron con un contador Coulter (Hialeah, FL).

La VRP promovió el crecimiento de estas células endoteliales (ver Figura 6), y por tanto comparte esta actividad mitogénica con el VEGF. Esto contrasta con el 15 PIGF, el cual se ha descrito carece de tal actividad mitogénica
(< = 35 nM) (Park et al., ver más arriba). Aunque es un agente mitogénico efectivo, la VRP fue aproximadamente 100 veces menos potente que el VEGF en este ensayo.

En conclusión, se ha identificado una nueva proteína secretada, la VRP, que es un ligando del Flt4, u que estimula la fosforilación de tirosina del receptor con quinasa de tirosina, Flt4. La VRP es un tercer miembro de la familia de proteínas del VEGF, y tiene aproximadamente un 30% de identidad en aminoácidos con el VEGF y PIGF. Además del dominio similar al VEGF, la VRP contiene un dominio C-terminal de \sim180 aminoácidos, rico en cisteínas, que no se halla en otros miembros de la familia VEGF. La VRP no consigue interaccionar apreciablemente con los 30 receptores Flt1 y Flk1 del VEGF.

Depósito de material

El plásmido siguiente ha sido depositado en el 35 Americal Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, EE.UU. (ATCC):

Plásmido	N° de depósito de la ATCC	Fecha de depósito
pRK.vh1.4.1	97249	6 de septiembre de 1995

Este depósito se realizó bajo las provisiones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con el Propósito de Procedimiento de Patente y las Regulaciones bajo el mismo (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años a partir de la fecha de depósito. E = L depósito será hecho disponible por parte de la ATCC rajo los términos del Tratado de Budapest, y sometido a un acuerdo entre Genentech, Inc. y la ATCC, el cual asegura una disponibilidad permanente y no restringida de la progenie del cultivo del depósito al público, a partir de la concesión de la pertinente patente estadounidense, o a partir de declarar abierta al público cualquier patente estadounidense o extranjera, cualquiera que sea la primera, y asegura la disponibilidad de la progenie a alguien, determinado por el Comisionado de los Estados Unidos de Patentes y Marcas Registradas, que esté cualificado para ello de acuerdo con 35 USC #122, y la reglas del Comisionado que se derivan de la misma (incluyendo 37 CFR #1,14, con particular referencia a 886 OG 638).

El asignatario de la presente solicitud ha aceptado que, si un cultivo del plásmido en depósito muriese, o se perdiera, o destruyera, al cultivarlo en condiciones apropiadas, el plásmido será rápidamente remplazado, a partir de la notificación, con otro del mismo plásmido. La disponibilidad del plásmido depositado no debe entenderse como una licencia para practicar la invención en contravención de los derechos garantizados bajo la autoridad de cualquier gobierno en acuerdo con sus leyes sobre patentes.

La especificación escrita anterior se considera que es suficiente para permitir a un especialista en la técnica practicar la invención. La presente invención no está limitada en su ámbito por la construcción depositada, puesto que la realización depositada se pretende como una única ilustración de ciertos aspectos de la invención, y cualesquiera construcciones que son funcionalmente equivalentes se hallan dentro del ámbito de esta invención. El depósito de material en ésta no constituye una admisión de que la descripción escrita contenida en ésta es inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de la misma, no debe considerarse como limitante del ámbito de las reivindicaciones a las ilustraciones específicas que representa. Más aún, varias modificaciones de la invención, además de aquéllas mostradas y descritas en ésta, serán evidentes a los especialista en la técnica a partir de la descripción precedente, y cae dentro del ámbito de las reivindicaciones anexas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: Genentech, Inc.

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteína relacionada con el VEGF.

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 12

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: Genentech, Inc.

\vskip0.333000\baselineskip

(B): DIRECCIÓN: 460 Point San Bruno Blvd

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CIUDAD: South San Francisco

\vskip0.333000\baselineskip

(D): ESTADO: California

\vskip0.333000\baselineskip

(E): PAÍS: Estados Unidos de América

\vskip0.333000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 94080

\vskip0.666000\baselineskip

(v): FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disquete de 3,5 pulgadas, 1,44 Mb

\vskip0.333000\baselineskip

(B): ORDENADOR: Compatible con PC de IBM

\vskip0.333000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D): PROGRAMA: WinPatin (Genentech)

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): FECHA DE REGISTRO:

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.666000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN SOBRE AGENTE/REPRESENTANTE:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE: Lee, Wendy M.

\vskip0.333000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: P-40.378

\vskip0.333000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA: P0963PCT

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TELÉFONO: 415/225-1994

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TELEFAX: 415/952-9881

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TELEX: 910/371-7168

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. N° ID: 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2031 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. N° ID: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

3

30

4

\vskip1.000000\baselineskip

2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. N° ID: 2:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2031 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. N° ID: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

5

6

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. N° ID: 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 419 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. N° ID: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

7

8

9

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. N° ID: 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 147 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. N° ID: 4:

10

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. N° ID: 5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 149 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. N° ID: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

11

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. N° ID: 6:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 299 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. N° ID: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. N° ID: 7:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 50 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. N° ID: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CTGGTGTTCA TGCACTGCAG CCCCTCACTA TTGCAGCAAC

\hfill

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCCCACATCT

\hfill

50

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. N° ID: 8:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 50 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. N° ID: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GCATCTGCAG ATGTGATTAT TCCACATGTA ATTGGTGGGG

\hfill

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CAGGTCTTGT

\hfill

50

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. N° ID: 9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. N° ID: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Ser Met Thr Pro Pro Thr Leu}

\vskip-4.8mm\hskip45.1mm 8

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. N° ID: 10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. N° ID: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Leu Arg Arg Arg Gln Gln Gln Asp}

\vskip-4.8mm\hskip53.7mm 9

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. N° ID: 11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 40 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. N° ID: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. N° ID: 12:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. N° ID: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Pro Arg Glu Ala Pro Ala Ala Ala Ala}

\sac{Ala Phe Glu}

\vskip-4.8mm\hskip13.1mm 13

Claims

1. Proteína relacionada con el VEGF (VRP) humana, activa, aislada biológicamente, la cual contiene al menos 265 aminoácidos de la figura 1, y la cual se une al receptor de tirosina quinasa Flt4.

2. Proteína de la reivindicación 1, la cual tiene una longitud de 265 a aproximadamente 450 aminoácidos, preferiblemente aproximadamente 300-450 aminoácidos, más preferiblemente aproximadamente 350-450 aminoácidos, incluso más preferiblemente aproximadamente 399-419 aminoácidos.

3. Proteína de la reivindicación 1 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene (a) al menos los residuos +1 a 29, inclusive, de la figura 1, (b) al menos los residuos +1 a 137, inclusive, de la figura 1, (c) al menos los residuos -20 a 29, inclusive, de la figura 1, (d) al menos los residuos -20 a 137, inclusive, de la figura 1.

4. Proteína relacionada con el VEGF (VRP) humana, activa, aislada biológicamente, que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada como los residuos -20 a 399, inclusive, o los residuos 1 a 399, inclusive, de la figura 1.

5. Composición que comprende la proteína de una de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

6. Composición farmacéutica útil para la promoción del crecimiento de células endoteliales vasculares, que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína de una de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

7. Composición de la reivindicación 6 que además comprende un factor de crecimiento celular distinto de dicha proteína.

8. Utilización de la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o de la composición de la reivindicación 5 o reivindicación 6, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trauma que afecta el endotelio vascular, o para el tratamiento de un estado disfuncional caracterizado por la ausencia de activación o ausencia de inhibición de un receptor para la VRP en un mamífero.

9. Utilización de la reivindicación 8, en donde el medicamento además comprende un factor de crecimiento celular distinto de dicha proteína.

10. Utilización de la reivindicación 8, en donde el receptor de la VRP es un receptor Flt4.

11. Procedimiento in vitro para estimular la fosforilación de un dominio de tirosina quinasa de un receptor Flt4, que comprende poner en contacto un dominio extracelular del receptor Flt4 con la proteína de una de 30 cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

12. Polipéptido quimérico que comprende la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 fusionado con una secuencia de polipéptido etiqueta.

13. Anticuerpo monoclonal que se une específicamente la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

14. Anticuerpo monoclonal de la reivindicación 13 que se une específicamente a los aminoácidos 1 a 137 de la figura 1.

15. Anticuerpo monoclonal de la reivindicación 13 que se une específicamente a los aminoácidos -20 a 137 de la figura 1.

16. Composición que comprende el anticuerpo de una de las reivindicaciones 13 a 15, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

17. Péptido consistente en una secuencia de aminoácidos mostrada como los residuos -20 a -1, inclusive, de la figura 1.

18. Molécula de ácido nucleico aislado que codifica la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

19. Molécula de ácido nucleico de la reivindicación 18 que además comprende un promotor unido operativamente a la molécula de ácido nucleico.

20. Vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 19.

21. Vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 18 unida operativamente a secuencias de control reconocidas por un célula hospedadora transformada con el vector.

22. Célula hospedadora que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 18.

23. Procedimiento para producir la VRP que comprende, cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 22, y recuperar la VRP a partir del cultivo de la célula hospedadora.