ES2204458T3 - Agonista selectivos del receptor ep4 en el tratamiento de la osteoporisis. - Google Patents

Agonista selectivos del receptor ep4 en el tratamiento de la osteoporisis.

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ES2204458T3 ES00311034T ES00311034T ES2204458T3 ES 2204458 T3 ES2204458 T3 ES 2204458T3 ES 00311034 T ES00311034 T ES 00311034T ES 00311034 T ES00311034 T ES 00311034T ES 2204458 T3 ES2204458 T3 ES 2204458T3
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Abstract

Uso de un agonista selectivo del receptor EP4 de Fórmula I: o de una de las sales farmacéuticamente aceptables de dicho compuesto, en la que: Q es COOR3, CONHR4 o tetrazol-5-ilo; A es un enlace sencillo o cis-doble; B es un enlace sencillo o trans-doble; =U es R2 es á-tienilo, fenilo, fenoxi, fenilo monosustituido o fenoxi monosustituido, siendo dichos sustituyentes cloro, fluoro, fenilo, metoxi, trifluorometilo o alquilo C1-C3; R3 es hidrógeno, alquilo C1-C5, fenilo o p-bifenilo; R4 es COR5 o SO2R5; y R5 es fenilo o alquilo C1-C5; o de ácido 7-{2R-[3-hidroxi-4-(3-fenoxifenil)but-1-enil]-5- oxopirrolidin-1-il}-heptanoico o ácido 7-{2S-[3-hidroxi-4- (3-fenoxifenil)butil]-5-oxopirrolidin-1-il}-heptanoico; para la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno que cursa con masa ósea reducida.

Description

Agonistas selectivos del receptor EP4 en el tratamiento de la osteoporosis.
Esta invención se refiere a ciertos compuestos que son agonistas de prostaglandina para la fabricación de un medicamento que es útil para prevenir la pérdida ósea, restaurar o aumentar la masa ósea y potenciar la curación ósea, incluyendo el tratamiento de trastornos que se presentan con una masa ósea reducida y/o defectos óseos en vertebrados, y en particular en mamíferos, incluyendo seres humanos. Esta invención se refiere de forma específica al uso de ciertos agonistas de prostaglandinas selectivos para el receptor EP4.
La osteoporosis es una enfermedad esqueletal sistémica, caracterizada por una masa ósea reducida y por el deterioro del tejido óseo, con un incremento consiguiente de la fragilidad del hueso y susceptibilidad a fracturas. En los Estados Unidos, el trastorno afecta a más de 25 millones de personas y provoca más de 1,3 millones de fracturas cada año, que anualmente incluyen 500.000 fracturas vertebrales, 250.000 de cadera y 240.000 de muñeca. Las fracturas de cadera son la consecuencia más grave de la osteoporosis, muriendo un 5-20% de pacientes en un período de un año, y quedando más del 50% de los supervivientes físicamente impedidos.
Los ancianos son los sujetos con un mayor riesgo de osteoporosis y, por tanto, puede predecirse que el problema aumente significativamente con el envejecimiento de la población. La incidencia de fractura en todo el mundo se prevé que aumente tres veces durante los próximos 60 años, y un estudio ha estimado que en el año 2050 serán 4,5 millones las fracturas de cadera en todo el mundo.
Las mujeres tienen un mayor riesgo de osteoporosis que los varones. Las mujeres experimentan una brusca aceleración de la pérdida ósea durante los cinco años posteriores a la menopausia. Otros factores que incrementan el riesgo incluyen fumar, abuso de alcohol, un modo de vida sedentario y una ingesta baja de calcio.
Actualmente existen dos tipos principales de terapias farmacéuticas para el tratamiento de la osteoporosis. El primero es el uso de compuestos antiresorción para reducir la resorción del tejido óseo.
Los estrógenos son un ejemplo de un agente antiresorción. Es conocido que los estrógenos reducen las fracturas. Además, Black et al., en el documento EP 0605193A1 describen que los estrógenos, particularmente cuando se toman oralmente, disminuyen los niveles plasmáticos de LDL y elevan los de lipoproteínas de alta densidad (HDL) beneficiosas. Sin embargo, los estrógenos son incapaces de restablecer el hueso hasta los niveles de adultos jóvenes en el esqueleto ya osteoporótico. Además, la terapia de estrógenos a largo plazo se ha relacionado con una serie de trastornos que incluyen un incremento en el riesgo de cáncer de útero, cáncer endometrial y posiblemente cáncer de mama, provocando que muchas mujeres eviten este tratamiento. Los efectos secundarios significativos indeseables asociados a la terapia de estrógenos apoyan la necesidad de desarrollar terapias alternativas para la osteoporosis que tengan el efecto deseable sobre las LDL en suero pero que no provoquen efectos indeseables.
Un segundo tipo de terapia farmacéutica para el tratamiento de la osteoporosis es el uso de agentes anabólicos para promover la formación de hueso e incrementar la masa ósea. Se espera que esta clase de agentes restablezca el hueso en el esqueleto ya osteoporótico.
En los documentos de Gran Bretaña 1478281, 1479156 y en las patentes de Estados Unidos n^{os}. 4.175.203, 4.055.596, 4,175.203, 3.987.091 y 3.991.106 se describen ciertos agonistas de prostaglandinas por ser útiles como, por ejemplo, vasodilatadores renales.
La patente de Estados Unidos nº 4.033.996 describe ciertas 8-aza-9-oxo(y dioxo)-tia-11,12-secoprostaglandinas que son útiles como vasodilatadores renales, para la prevención de la formación de trombos, para inducir la liberación de hormona del crecimiento y como reguladores de la respuesta inmune.
La patente francesa nº 897.566 describe ciertos derivados de aminoácidos para el tratamiento de enfermedades neurológicas, mentales o cardiovasculares.
J. Org. Chem. 26; 1961; 1437 describe el ácido N-acetil-N-bencil-p-aminofenilmercaptoacético.
La patente de Estados Unidos nº 4.761.430 describe ciertos compuestos de arilbencenosulfonamida como agentes hipolipidemiantes.
La patente de Estados Unidos nº 4.443.477 describe ciertos ácidos sulfonamidofenilcarboxílicos como agentes hipolipidemiantes.
La patente de Estados Unidos nº 3.528.961 describe ciertos derivados de \varepsilon -caprolactama como colorantes.
La patente de Estados Unidos nº 3.780.095 describe ciertos ácidos anilinocarboxílicos acilados como coleréticos.
\newpage
La patente de Estados Unidos nº 4.243.678 describe ciertos ácidos acilhidrocarbilaminoalcanoicos por tener utilidad en el tratamiento de úlceras gástricas, como inhibidores de la excreción de las glándulas sebáceas y para combatir la inflamación cutánea.
La patente de Estados Unidos nº 4.386.031 describe ciertos ácidos N-benzoil-\omega-anilinoalcanocarboxílicos como agentes antialérgicos, inhibidores de la agregación trombótica, agentes antiinflamatorios y agentes hipolipidemiantes.
Además de osteoporosis, aproximadamente 20-25 millones de mujeres y un número en aumento de hombres sufren fracturas vertebrales detectables como consecuencia de una masa ósea reducida, con unas 250.000 fracturas de cadera adicionales anuales descritas solamente en los Estados Unidos. El caso anterior está asociado a una tasa de mortalidad del 12% en los dos primeros años y a una tasa del 30% de pacientes que requieren cuidados asistenciales a domicilio después de la fractura. Aunque esto es ya significativo, es de esperar que aumenten las consecuencias económicas y médicas de la convalecencia debida a una curación lenta o imperfecta de estas fracturas de hueso, a causa del envejecimiento de la población general.
Los estrógenos han demostrado (Bolander et al., 38th Annual Meeting Orthopedic Research Society, 1992) que mejoran la calidad de la curación de fracturas apendiculares. Por tanto, la terapia de sustitución de estrógenos podría ser procedimiento eficaz para el tratamiento de reparación de fracturas. Sin embargo, el cumplimiento farmacéutico del paciente con la terapia de estrógenos es relativamente malo debido a sus efectos secundarios, que incluyen la reaparición de la menstruación, mastodinia y un mayor riesgo de cáncer de útero, un mayor riesgo percibido de cáncer de mama, y el uso concomitante de progestinas. Además, los hombres son propensos a objetar el uso del tratamiento con estrógenos. Existe la necesidad de una terapia que sea beneficiosa para pacientes que han sufrido fracturas óseas debilitantes y que aumente el cumplimiento farmacéutico del paciente.
Se ha demostrado que la prostaglandina E2 (PGE2) puede restaurar el hueso en un modelo de rata ovariectomizada (OVX), un modelo de osteoporosis postmenopáusica. Ke, H.Z., et al., Bone, 23:249-255, 1998. Sin embargo, existen graves efectos secundarios asociados con la PGE2. Jee., W.S.S. and Ma, Y.F. Bone 21:297-304, 1997.
Aunque existen una serie de terapias para la osteoporosis, existe una continua necesidad y una búsqueda continua en este campo de la técnica de terapias alternativas para la osteoporosis. Por otro lado, existe una necesidad de terapias para la curación de las fracturas óseas. Además, existe una necesidad de terapias que puedan promover un nuevo crecimiento en áreas esqueletales en las que existan defectos tales como defectos provocados o producidos por, por ejemplo, tumores en el hueso. Además, existe una necesidad de terapias que puedan promover un nuevo crecimiento en las áreas esqueletales en las que están indicados injertos óseos.
Sumario de la invención
Esta invención se refiere al uso de un agonista selectivo del receptor EP4 de Fórmula I:
1
o las sales farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos, en la que:
Q es COOR^{3}, CONHR^{4} o tetrazol-5-ilo;
A es un enlace sencillo o cis-doble;
B es un enlace sencillo o trans-doble;
=U es
2
R^{2} es \alpha-tienilo, fenilo, fenoxi, fenilo monosustituido y fenoxi monosustituido, siendo dichos sustituyentes cloro, fluoro, fenilo, metoxi, trifluorometilo o alquilo C_{1}-C_{3};
R^{3} es hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, fenilo o p-bifenilo;
R^{4} es COR^{5} o SO_{2}R^{5}; y
R^{5} es fenilo o alquilo C_{1}-C_{5};
o de ácido 7-{2R-[3-hidroxi-4-(3-fenoxifenil)but-1-enil]-5-oxopirrolidin-1-il}-heptanoico o ácido 7-{2S-[3-hidroxi-4-(3-fenoxifenil)butil]-5-oxopirrolidin-1-il}-heptanoico;
para la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno que cursa con una masa ósea reducida.
Esta invención se refiere en particular a dicho uso en el que dicho trastorno es osteoporosis, fragilidad, una fractura osteoporótica, un defecto óseo, pérdida ósea idiopática de la infancia, pérdida ósea alveolar, pérdida ósea mandibular, fractura ósea, osteotomía, pérdida ósea asociada con periodontitis o recrecimiento protésico. Con preferencia, el agonista selectivo del receptor EP4 se administra por vía sistémica, por ejemplo, por vía oral, subcutánea, intramuscular o por aerosol. En otro aspecto preferido, el agonista de EP4 se administra localmente.
El uso de esta invención es especialmente útil cuando dicho trastorno es fragilidad.
El uso de esta invención es también especialmente útil cuando dicho trastorno es osteoporosis.
El uso de esta invención es también especialmente útil cuando dicho trastorno es fractura ósea o fractura osteoporótica.
Un grupo preferido de agonistas selectivos del receptor EP4 de Fórmula I es aquel en el que Q es 5-tetrazolilo y =U es
3
que forman compuestos que tienen la fórmula I^{A},
4
Los compuestos particularmente preferidos dentro de este grupo incluyen 5S-(4-(3-(cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil)-1-(6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil-pirrolidin-2-ona; 5S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-1-(6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil)-pirrolidin-2-ona; 5R-(3S-hidroxi-4-fenil-but-1-enil)-1-[6-(1H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona; y 5S-(3R-hidroxi-4-fenil-butil)-1-[6-(1H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona.
Otro grupo preferido de agonistas selectivos del receptor EP4 de Fórmula I para usar en los procedimientos de esta invención son los compuestos de Fórmula I en los que Q es COOH. Los compuestos particularmente preferidos dentro de este grupo incluyen el ácido 7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico; el ácido 7-(2S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico; el ácido 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico; el ácido 7-(2S-(3R-hidroxi-4-fenil-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico; y el ácido 7-[2R-(3S-hidroxi-4-fenil-but-1-enil)-5-oxo-pirrolidin-1-il]-heptanoico.
La invención también incluye un compuesto seleccionado de ácido 7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-fenoxifenil)butil]-5-oxopirrolidin-1-il}-heptanoico; ácido 7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometilfenil)butil]-5-oxopirrolidin-1-il}-hepta-
noico; ácido 7-{2S-[4-(3-clorofenil)-3R-hidroxibutil]-5-oxopirrolidin-1-il}-heptanoico; 5S-[4-(3-clorofenil)-3R-hi-
droxibutil]-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)hexil]-pirrolidin-2-ona; y 5S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometilfenil)-butil)-1-(6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil)-pirrolidin-2-ona; composiciones farmacéuticas que contienen dicho compuesto; y dicho compuesto para uso como medicamento.
Preferiblemente, se tratan mujeres postmenopáusicas y hombres mayores de 60 años. También se prefieren individuos, independientemente de su edad, que tienen una masa ósea significativamente reducida, es decir, una desviación típica mayor o igual a 1,5 por debajo de los niveles de jóvenes normales.
En esta invención, los trastornos que cursan con una masa ósea reducida incluyen trastornos tales como, por ejemplo, osteoporosis, pérdida ósea idiopática de la infancia, pérdida ósea alveolar, pérdida ósea mandibular, fractura ósea, osteotomía, pérdida ósea asociada a periodontitis y crecimiento interno protésico.
También se incluyen procedimientos para tratar la "osteoporosis secundaria", dentro de los procedimientos de esta invención. "Osteoporosis secundaria" incluye osteoporosis inducida por glucocorticoides, osteoporosis inducida por hipertiroidismo, osteoporosis inducida por inmovilización, osteoporosis inducida por heparina u osteoporosis inducida por inmunosupresores en un vertebrado, por ejemplo un mamífero (incluyendo a un ser humano). Estos procedimientos se llevan a cabo administrando a dicho vertebrado, por ejemplo un mamífero, una cantidad para tratar la "osteoporosis secundaria" de un agonista de prostaglandina selectivo para el receptor EP4, uno de sus profármacos o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho agonista de prostaglandina selectivo para el receptor EP4 o de dicho profármaco.
Otro aspecto más de la presente invención se refiere a procedimientos para reforzar un injerto óseo, inducir sinóstosis vertebral, potenciar la extensión de los huesos largos, potenciar la curación ósea después de una reconstrucción facial, una reconstrucción maxilar y/o una reconstrucción mandibular en un vertebrado, por ejemplo un mamífero, (incluyendo a un ser humano) que comprende administrar a dicho vertebrado, por ejemplo un mamífero que se somete a reconstrucción maxilar, a reconstrucción facial o a reconstrucción mandibular, una cantidad potenciadora del hueso de un agonista de prostaglandina selectivo para el receptor EP4, uno de sus profármacos, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho agonista de prostaglandina selectivo para el receptor EP4 o de dicho profármaco. Los agonistas de prostaglandina selectivos para el receptor EP4 activos de esta invención se pueden aplicar de forma local en el lugar de la reconstrucción ósea o se pueden administrar por vía sistémica.
Una dosis preferida varía de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 100 mg/kg/día de un agonista selectivo del receptor EP4, de uno de sus profármacos o de una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto o de dicho profármaco. Una dosis especialmente preferida varía de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 mg/kg/día de un agonista selectivo del receptor EP4, de uno de sus profármacos o de una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto o de dicho profármaco.
La frase "trastorno(s) que cursa(n) con masa ósea reducida" se refiere a un trastorno en el que el nivel de masa ósea es inferior al normal específico para la edad, como se define en las normas de la Organización Mundial de la Salud "Assessment of Fracture Risk and its Application to Screening for Postmenopausal Osteoporosis (1994). Report of a World Health Organization Study Group. World Health Organization Technical Series 843". En "trastorno(s) que cursa(n) con masa ósea reducida" se encuentra incluida la osteoporosis primaria y secundaria, tal y como se han descrito antes. Además, se incluye enfermedad periodontal, pérdida ósea alveolar, pérdida ósea por osteotomía y pérdida ósea idiopática de la infancia. La frase "trastorno(s) que cursa(n) con masa ósea reducida" también incluye las complicaciones a largo plazo de la osteoporosis como curvatura de la columna vertebral, pérdida de peso y cirugía protésica.
La frase "trastorno(s) que cursa(n) con masa ósea reducida" se refiere también a un vertebrado, por ejemplo un mamífero, conocido por tener una posibilidad significativamente mayor que la media de desarrollar las enfermedades que se describen anteriormente, incluyendo osteoporosis (por ejemplo, mujeres postmenopáusicas, hombres mayores de 50 años). Otros usos que aumenten o potencien la masa ósea incluyen la restauración ósea, incrementar la velocidad de curación de fracturas óseas, reemplazar la cirugía de injertos óseos totalmente, potenciar el índice de éxitos de los injertos óseos, la curación ósea después de una reconstrucción facial o una reconstrucción maxilar o una reconstrucción mandibular, el crecimiento interno protésico, la sinóstosis vertebral o la extensión de huesos largos.
Los procedimientos de esta invención también pueden usarse combinados con dispositivos ortopédicos como estructuras de fusión espinal, equipo de fusión espinal, dispositivos de fijación ósea internos y externos, tornillos y clavos.
Los expertos en la técnica reconocerán que el término masa ósea se refiere realmente a la masa ósea por unidad de superficie, que en algunas ocasiones (aunque no de forma estrictamente correcta) se denomina densidad mineral del hueso.
El término "tratar", "trato" o "tratamiento", tal como se usa en la presente, incluye el tratamiento preventivo (por ejemplo, profiláctico) y paliativo y curativo.
El término "farmacéuticamente aceptable" significa que el portador, vehículo, diluyente, excipientes y/o sal deben ser compatibles con el resto de ingredientes de la formulación, y no perjudicar al receptor de las mismas.
La expresión "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a sales aniónicas no tóxicas que contienen aniones tales como (pero no limitados a los mismos) cloruro, bromuro, yoduro, sulfato, bisulfato, fosfato, acetato, maleato, fumarato, oxalato, lactato, tartrato, citrato, gluconato, metanosulfonato y 4-toluenosulfonato. La expresión se refiere también a sales catiónicas no tóxicas tales como (pero no limitadas a las mismas) sales de sodio, potasio, calcio, magnesio, amonio o benzatina protonada (N,N'-dibenciletilendiamina), colina, etanolamina, dietanolamina, etilendiamina, meglumina (N-metil-glucamina), benetamina (N-bencilfenetilamina), piperazina o trometamina (2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol).
Los procedimientos de la presente invención dan lugar a la formación de hueso, dando lugar a una disminución del número de fracturas. Esta invención hace una contribución significativa a la técnica proporcionando procedimientos que aumentan la formación de hueso, dando como resultado la prevención, retraso y/o reversión de la osteoporosis y de los trastornos óseos relacionados.
Esta invención se refiere también a compuestos seleccionados de ácido 7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico; 5S-(4-(3-(cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil)-1-(6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil-pirrolidin-2-ona; ácido 7-(2S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico; ácido 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico; y 5S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-1-(6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil)-pirrolidin-2-ona.
Esta invención se refiere también particularmente al ácido 7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico.
Esta invención se refiere también particularmente a 5S-(4-(3-(cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil)-1-(6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil-pirrolidin-2-ona.
Esta invención se refiere también particularmente al ácido 7-(2S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico.
Esta invención se refiere también particularmente al ácido 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico.
Esta invención se refiere también particularmente a 5S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-1-(6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil)-pirrolidin-2-ona.
A partir de la memoria descriptiva y las reivindicaciones que describen la invención serán evidentes otras características y ventajas.
Descripción detallada de la invención
Como agonista selectivo del receptor EP4 de esta invención se puede usar cualquier agonista selectivo del receptor EP4. Los agonistas selectivos de EP4 son compuestos que tienen una CI_{50} en el receptor EP1, EP2 y EP3 que es al menos 10 veces mayor que la CI_{50} en el subtipo de receptor EP4. Por ejemplo, el ácido 7-(2-(3-hidroxi-4-fenil-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico es un agonista de PGE_{2} selectivo para el receptor EP4 con una CI_{50} de unión al receptor EP4 de 16 nM. En todos los demás subtipos de receptor EP, incluyendo los subtipos de receptor EP1, EP2 y EP3, la CI_{50} para el ácido 7-(2-(3-hidroxi-4-fenil-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico es mayor de 3200 nM.
Los compuestos de Fórmula I se pueden preparar como se describe en el documento de Estados Unidos 4.177.346, de cesión común y que se incorpora en la presente memoria como referencia.
Todos los agonistas selectivos del receptor EP4 usados en los procedimientos de esta invención están adaptados al uso terapéutico como agentes que estimulan la formación ósea y aumentan la masa ósea en vertebrados, por ejemplo mamíferos y en particular en seres humanos. Puesto que la formación ósea está muy relacionada con el desarrollo de osteoporosis y trastornos relacionados con los huesos, los agonistas usados en los procedimientos de esta invención, en virtud de su acción ósea, previenen, detienen y/o revierten la osteoporosis.
La utilidad de los agonistas selectivos de EP4 usados en los procedimientos de la presente invención como agentes medicinales en el tratamiento de trastornos que cursan con una masa ósea reducida (por ejemplo, osteoporosis) en vertebrados, por ejemplo mamíferos (por ejemplo, seres humanos, particularmente en la mujer) se demuestra por la actividad de estos agonistas en ensayos convencionales, incluyendo un ensayo de unión al receptor, un ensayo de AMP cíclico, un ensayo in vivo y el ensayo de curación de la fractura, todos los cuales se describen más adelante. Tales ensayos proporcionan también un medio mediante el cual comparar las actividades de los agonistas selectivos de EP4 entre sí y con las actividades de otros compuestos y composiciones conocidos. Los resultados de estas comparaciones son útiles para determinar los niveles de dosificación en vertebrados, por ejemplo mamíferos, incluyendo seres humanos, para el tratamiento de tales enfermedades.
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Ensayo in vivo
La actividad de los agentes anabólicos óseos en la estimulación de la formación ósea y el aumento de la masa ósea se puede ensayar en ratas intactas macho o hembra, o ratas macho (orquidectomizadas) o hembra (ovariectomizadas) con deficiencias en hormonas sexuales.
Se pueden utilizar en el estudio ratas macho o hembra de diferentes edades (tal como de tres meses de edad). Las ratas pueden estar intactas o bien castradas (ovariectomizadas u orquidectomizadas), y se inyectan subcutáneamente o se dosifican por sonda gástrica con agonistas de prostaglandina en diferentes dosis (tal como 1, 3 ó 10 mg/kg/día) durante 30 días. En las ratas castradas, el tratamiento se comienza en el día posterior a la cirugía (con el propósito de prevenir la pérdida ósea) o en el momento en el que ya se ha producido la pérdida ósea (con el propósito de recuperar la masa ósea). Durante el estudio, se permite el libre acceso de todas las ratas a agua y una dieta comercial en gránulos (Teklad Rodent Diet Nº8064, Harlan Teklad, Madison, WI) que contiene 1,46% de calcio, 0,99% de fósforo y 4,96 UI/g de Vitamina D_{3}. Todas las ratas reciben inyecciones subcutáneas de 10 mg/kg de calceína en los días 12 y 2 antes del sacrificio. Se sacrifican las ratas. Se determinan los siguientes parámetros:
Medidas minerales en el hueso femoral
Se extirpa el fémur derecho de cada rata en autopsia y se explora utilizando absorciometría de rayos X de doble haz (DXA, QDR 1000/W, Hologic Inc., Waltham, MA) equipado con el programa informático "WRegional High Resolution Scan" (Hologic Inc., Waltham, MA). El tamaño del campo de exploración es de 5,08 x 1,902 cm, la resolución es de 0,0254 x 0,0127 cm y la velocidad de exploración es de 7,25 mm/seg. Se analizan las imágenes de la exploración femoral y se determina el área ósea, contenido mineral óseo (BMC) y densidad mineral ósea (BMD) del fémur completo (WF), metáfisis femoral distal (DFM), diáfisis femoral (FS) y fémur proximal (PF).
Análisis histomorfométrico del hueso tibial
Se extirpa la tibia derecha en la autopsia, se disecciona todo el músculo y se corta en tres partes. Se fijan la tibia proximal y la diáfisis tibial en etanol al 70%, se deshidrata en concentraciones graduadas de etanol, se desengrasa en acetona y después se introduce en metacrilato de metilo (Eastman Organic Chemicals, Rochester, NY).
Se cortan las secciones frontales de la metáfisis tibial proximal con un espesor de 4 y 10 \mum, utilizando un microtomo Reichert-Jung Polycut S. Las secciones de 4 \mum se tiñen con tinte modificado Trichrome de Masson, mientras que las secciones de 10 \mum permanecen sin teñir. Se utilizan una sección de 4 \mum y una de 10 \mum de cada rata para histomorfometría de hueso canceloso.
Se cortan las secciones transversales de la diáfisis tibial de 10 \mum de espesor utilizando un microtomo Reichert-Jung Polycut S. Estas secciones se utilizan para análisis histomorfométrico del hueso cortical.
Histomorfometría de hueso canceloso
Se utiliza un sistema de histomorfometría Bioquant OS/2 (R&M Biometrics, Inc., Nashville, TN) para las medidas histomorfométricas estáticas y dinámicas de la parte esponjosa secundaria de la metáfisis tibial proximal entre 1,2 y 3,6 mm distal a la unión de crecimiento placa-epifiseal. Los primeros 1,2 mm de la región metafiseal tibial necesitan ser omitidos para limitar las medidas a la parte esponjosa secundaria. Se utilizan las secciones de 4 \mum para determinar los índices relacionados con el volumen óseo, estructura ósea y resorción ósea, mientras que las secciones de 10 mm se utilizan para determinar los índices relacionados con la formación y regeneración del hueso.
I) Medidas y cálculos relacionados con el volumen y estructura óseo trabecular
(1) Área total metafiseal (TV, mm^{2}): Área metafiseal entre 1,2 y 3,6 mm distal a la unión placa-epifiseal de crecimiento. (2) Área ósea trabecular (BV, mm^{2}): Área total de trabécula en TV. (3) Perímetro óseo trabecular (BS, mm): La longitud del perímetro total de la trabécula. (4) Volumen óseo trabecular (BV/TV,%): BV/TV x 100. (5) Número óseo trabecular (TBN, Nº/mm): 1,199/2 x BS/TV. (6) Espesor óseo trabecular (TBT, \mum): (2.000/1,199) x (BV/BS). (7) Separación ósea trabecular (TBS, \mum): (2.000 x 1,199) x (TV- BV).
II) Medidas y cálculos relacionados con la resorción ósea
(1) Número de osteoclastos (OCN, Nº): Nº total de osteoclastos en el área metafiseal total. (2) Perímetro de osteoclasto (OCP mm): longitud del perímetro trabecular cubierto por osteoclastos. (3) Nº/mm de osteoclastos (OCN/mm, Nº/mm): OCN/BS. (4) Perímetro porcentual cubierto por osteoclastos (%OCP, %): OCP/BS x 100.
III) Medidas y cálculos relacionados con la regeneración y formación ósea
(1) Perímetro con una marca de calceína (SLS, mm): longitud total del perímetro trabecular con una marca de calceína. (2) Perímetro con dos marcas de calceína (DLS, mm): Longitud total del perímetro trabecular con dos marcas de calceína. (3) Anchura entre marcas (ILW, \mum): Distancia promedio entre dos marcas de calceína. (4) Perímetro porcentual de mineralización (PMS, %): (SLS/2 + DLS)/BS% x 100. (5) Velocidad de depósito mineral (MAR, \mum/día): ILW/intervalo entre marcas. (6) Velocidad de formación de hueso/superficie de ref. (BFR/BS, \mum^{2}/d/\mum): (SLS/2 + DLS) x MAR /BS. (7) Velocidad de regeneración ósea (BTR,%/y): (SLS/2 + DLS) x MAR /BV x 100.
Histomorfometría del hueso cortical
Se utiliza un sistema histomorfométrico Bioquant OS/2 (R&M Biometrics, Inc., Nashville, TN) para las medidas histomorfométricas estáticas y dinámicas de la diáfisis tibial en las medidas del hueso cortical en la diáfisis tibial. Se mide el área tisular total, área de la cavidad de la médula, perímetro periosteal, perímetro endocortical, perímetro con una marca, perímetro con dos marcas y anchura entre marcas en ambas superficies periosteales y endocorticales, y se calculan el área ósea cortical (área tisular total - área de cavidad de la médula), área porcentual cortical ósea (área cortical/área del tejido total x 100), área porcentual de médula (área de cavidad de la médula/área del tejido total x 100), perímetro porcentual periosteal y endocortical marcado [(perímetro con una marca/2 + perímetro con 2 marcas)/perímetro total x 100] velocidad de depósito mineral (anchura entre marcas/intervalos) y velocidad de formación de hueso [velocidad de depósito mineral x [(perímetro con una marca/2 + perímetro con dos marcas)/perímetro total].
Estadísticas
Se pueden calcular los datos estadísticos utilizando paquetes Stat View 4.0 (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA). Se utiliza la prueba de análisis de varianza (ANOVA) seguida de PLSD de Fisher (Stat View, Abacus Concepts Inc., 1918 Bonita Ave, Berkeley, CA 94704-1014) para comparar las diferencias entre grupos.
Determinación de la elevación del cAMP en líneas de células 293-S que sobreexpresan de forma estable los receptores humanos recombinantes EP_{4}
Los cDNA, que representan los marcos de lectura abierta completa de los receptores humanos EP_{4}, se generan por reacción en cadena con polimerasa de la transcriptasa inversa utilizando cebadores oligonucleótidos basados en secuencias publicadas (1) y RNA de células de pulmón humano primarias (EP_{4}) como moldes. El cDNA se clona en el sitio de clonación múltiple de pcDNA3 (Invitrogen Corporation, 3985B Sorrento Valley Blvd., San Diego, CA 92121) y se usa para transfectar células de riñón de embrión humano 293-S por la vía de coprecipitación con fosfato de calcio. Las colonias resistentes a G418 se expanden y se analizan las uniones específicas [^{3}H]PGE_{2}. Las células transfectadas que muestran niveles altos de uniones específicas a [^{3}H]PGE_{2} se caracterizan adicionalmente mediante análisis de Scatchard para determinar Bmax y Kds para PGE_{2}. Las líneas seleccionadas para el rastreo de compuestos tienen aproximadamente 256.400 receptores por célula y un Kd = 2,9 nM para PGE_{2} (EP_{4}). La expresión constitutiva del receptor en las células madre 293-S es insignificante. Las células se mantienen en RPMI suplementado con suero bovino fetal (10% final) y G418 (700 ug/ml final).
Las respuestas de cAMP en las líneas 293-S/EP_{4} se determinan por separación de células de los matraces de cultivo en 1 ml de PBS deficiente en Ca^{++} y Mg^{++} por agitación vigorosa, añadiendo RPMI exento de suero hasta una concentración final de 1 x 10^{6} células/ml y añadiendo 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) hasta una concentración final de 1 mM. Se toman inmediatamente alícuotas de 1 ml de la suspensión de células en tubos de microcentrífuga con tapón de rosca de 2 ml y se incuban durante 10 minutos, destapados, a 37ºC, con una humedad relativa del 95% y 5% de CO_{2}. El compuesto a analizar se añade a las células en diluciones 1:100 de forma que las concentraciones finales de DMSO o etanol sean del 1%. Inmediatamente después de añadir el compuesto, se tapan los tubos, se mezclan invirtiéndolos 2 veces y se incuban a 37º durante 12 minutos. Las muestras son entonces lisadas por incubación a 100ºC durante 10 minutos e inmediatamente enfriadas sobre hielo durante 5 minutos. Los restos celulares se sedimentan por centrifugación a 1.000 g durante 5 minutos, y los lisados aclarados se transfieren a tubos limpios. Las concentraciones de cAMP se determinan utilizando un estuche de radioinmunoensayo de cAMP disponible comercialmente (NEK-033, DuPont/NEN Research Products, 549 Albany St., Boston, MA 02118) después de diluir los lisados aclarados 1:10 en solución tampón de análisis cAMP RIA (incluida en el estuche). Normalmente, se tratan las células con 6 a 8 concentraciones del compuesto a analizar en incrementos logarítmicos. Los cálculos de CE_{50} se realizan mediante una calculadora utilizando análisis de regresión lineal en la porción lineal de las curvas de respuesta a la dosis.
Referencias
1. Regan, J.W. Bailey, T.J. Pepperl, D.J. Pierce, K.L. Bogardus, A.M. Donello, J.E. Fairbairn, C.E. Kedzie, K.M. Woodward, D.F. y Gil, D.W. 1994 Cloning of a Novel Human Prostaglandin Receptor with Characteristics of the Pharmacogically Defined EP_{2} Subtype. Mol. Pharmacology 46:213-220.
Ensayo de la unión a los receptores E_{2} de las prostaglandinas Preparación de la membrana
Todas las preparaciones se realizan a 4ºC. Las células transfectadas que expresan receptores tipo 1 de prostaglandina E_{2} (EP_{1}), tipo 2 (EP_{2}), tipo 3 (EP_{3}) o tipo 4 (EP_{4}) se recogen y suspenden hasta 2 millones de células por ml en solución tampón A [Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgCl_{2} 10 mM, EDTA 1 mM, péptido Pefabloc 1 mM, (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN), péptido Phosporamidon 10 uM (Sigma, St. Luis, MO), péptido Pepstatina A 1 uM (Sigma, St. Luis, MO), péptido Elastatinal 10 uM (Sigma, St. Luis, MO), péptido Antipaína 100 uM (Sigma, St. Luis, MO)]. Las células se lisan por sonicación con un aparato de ultrasonidos Branson (modelo Nº 250, Branson Ultrasonics Corporation, Danbury, CT) en dos impactos de 15 segundos. Se eliminan las células no lisadas y los restos por centrifugación a 100 g durante 10 minutos. Las membranas se recogen entonces por centrifugación a 45.000 g durante 30 minutos. Las membranas sedimentadas se resuspenden hasta una concentración de 3 a 10 mg de proteína por ml, determinándose la concentración de proteína por el procedimiento de Bradford [Bradford, M., Anal. Biochem., 72, 248 (1976)]. Las membranas resuspendidas se conservan congeladas a -80ºC hasta su uso.
Ensayo de unión
Las membranas congeladas preparadas de la forma descrita anteriormente son descongeladas y diluidas hasta 0,5 mg/ml (para EP2 de rata) o 0,3 mg/ml (para EP4 de rata) en solución tampón A. Se combina un volumen de preparación de membrana con 0,05 volúmenes del compuesto de ensayo o solución tampón y un volumen de ^{3}H-prostaglandina E_{2} 3 nM (Nº TRK 431, Amersham, Arlington Heights, IL) en solución tampón A. La mezcla (volumen total 205 \mul) se incuba durante una hora a 25ºC. Las membranas se recuperan entonces por filtración en filtros de fibra de vidrio del tipo GF/C (Nº 1205-401, Wallac, Gaithersburg, MD) utilizando un recolector Tomtec (modelo Mach II/96, Tomtec, Orange, CT). Las membranas con unión ^{3}H-prostaglandina E_{2} quedan retenidas en el filtro, mientras que la solución tampón y la ^{3}H-prostaglandina E_{2} no unida pasa por el filtro y se desecha. Cada una de las muestras se lava entonces tres veces con 3 ml de [Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgCl_{2} 10 mM, EDTA 1 mM]. Los filtros se secan entonces mediante calentamiento en un horno de microondas. Para determinar la cantidad de ^{3}H-prostaglandina unida a las membranas, se colocan los filtros secos en bolsas de plástico con líquido de centelleo y se hace el recuento en un lector LKB 1205 Betaplate (Wallac, Gaithersburg, MD). Las CI_{50} se determinan a partir de la concentración del compuesto de ensayo necesaria para desplazar el 50% ^{3}H-prostaglandina E_{2} unida de forma específica.
Las células 293S que expresan los receptores E_{2} de las prostaglandinas EP_{2} o EP_{4} se generan conforme a procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica. De forma típica, se preparan cebadores PCR (reacción en cadena con polimerasa), que corresponden a los extremos terminales 5' y 3' del receptor de longitud total publicado, conforme a procedimientos bien conocidos descritos anteriormente y se usan en una reacción RT-PCR usando el RNA total de riñón de rata para los receptores EP_{2} y EP_{4}.
La secuencia de codificación de longitud completa para el receptor EP2 de rata se prepara como se describe en Nemoto et al., Prostaglandins, 1997, 54, 713-725. La secuencia de codificación de longitud completa para el receptor EP4 de rata se prepara como se describe en Sando et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 1994, 200, 1329-1333. Estos receptores de longitud completa se usan para preparar las células 293S que expresan los receptores EP2 y EP4.
La secuencia de codificación de longitud completa para el receptor EP1 se prepara como se describe en Funk et al., Journal of Biological Chemistry, 1993, 268, 26767-26772. La secuencia de codificación de longitud completa para el receptor EP2 se prepara como se describe en Regan et al., Molecular Pharmacology, 1994, 46, 213-220. La secuencia de codificación de longitud completa para el receptor EP3 se prepara como se describe en Regan et al., British Journal of Pharmacology, 1994, 112, 377-385. La secuencia de codificación de longitud completa para el receptor EP4 se prepara como se describe en Bastien, Journal of Biological Chemistry, 1994, 269, 11873-11877. Estos receptores de longitud completa se usan para preparar las células 293S que expresan los receptores EP_{1}, EP_{2}, EP_{3} y EP_{4}.
Las células 293S que expresan cualquiera de los receptores E_{2} de prostaglandina EP_{1}, EP_{2}, EP_{3} y EP_{4} humanos se generan conforme a procedimientos conocidos por los expertos en la materia. De forma típica, se preparan los cebadores por PCR (reacción en cadena con polimerasa), que corresponden a los extremos 5' y 3' del receptor de longitud completa publicados, conforme a procedimientos bien conocidos descritos antes y se usan en una reacción en cadena con polimerasa y transcriptasa inversa (RT-PCR) usando un RNA total de riñón humano (para EP_{1}), de pulmón humano (para EP_{2}), de pulmón humano (para EP_{3}) o de linfocitos humanos (para EP_{4}) como fuente. Los productos de PCR se clonan por el procedimiento TA con un saliente en pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se confirma la identidad del receptor clonado por secuenciación de DNA.
Las células 293S (Mayo, Dept. of Biochemistry, Northwestern Univ.) se transfectan con el receptor clonado en pcDNA3 por electroporación. Se establecen líneas de células estables que expresan el receptor después de seleccionar las células transfectadas con G418.
Las línea de células clonadas que expresan el número máximo de receptores se eligen después de un ensayo de unión a ^{3}H-PGE_{2} de células completas usando PGE_{2} no marcada como competidor.
Ensayos de curación de fracturas Ensayo de los efectos sobre la curación de fracturas después de la administración sistémica Técnica de fractura
Se anestesian ratas Sprague-Dawley de 3 meses de edad con Ketamina. Se hace una incisión de 1 cm en la cara anteromedia de la parte proximal de la tibia o fémur derechos. A continuación se describe la técnica quirúrgica tibial. La incisión se realiza hasta alcanzar el hueso, y se perfora un orificio de 1 mm, 4 mm proximal a la cara distal de la tuberosidad tibial, 2 mm medial al surco anterior. Se introducen agujas intramedulares mediante un tubo de acero inoxidable de 0,8 mm (carga máxima 36,3 N, rigidez máxima 61,8 N/mm, comprobado bajo las mismas condiciones que los huesos). No se ensancha el canal medular. Se produce una fractura normalizada cerrada 2 mm por encima de la unión tibiofibular mediante curvatura en tres puntos utilizando fórceps ajustable, especialmente diseñado con mordazas romas. Para minimizar el daño al tejido blando, se debe tener precaución para no desplazar la fractura. La piel se cierra con suturas monofilamento de nylon. La operación se realiza bajo condiciones estériles. Se toman radiografías de todas las fracturas inmediatamente después de la inserción de las agujas, y las ratas con fracturas fuera del área diafiseal especificada o con agujas desplazadas, se excluyen. El resto de los animales se dividen aleatoriamente en los siguientes grupos con 10 a 12 animales por subgrupo para comprobar la curación de las fracturas. El primer grupo recibe administraciones por sonda gástrica diarias de vehículo (agua: 100% Etanol = 95:5) en un 1 ml/rata, mientras que los otros reciben administración diaria por sonda nasogástrica de 0,01 a 100 mg/kg/día del compuesto a analizar (1 ml/rata) durante 10, 20, 40 y 80 días.
En los días 10, 20, 40 y 80, se anestesiaron 10 a 12 ratas de cada grupo con Ketamina y se sacrificaron por extracción sanguínea. Se extirpan ambos huesos tibiofibulares por disección y se elimina todo el tejido blando. Se conservaron los huesos de 5 a 6 ratas de cada grupo en etanol al 70% para análisis histológicos y los huesos de otras 5 a 6 ratas de cada grupo se conservaron en solución de Ringer tamponada (+4ºC, pH 7,4) para las radiografías y ensayos biomecánicos que se realizaron.
Análisis histológico
Los procedimientos para análisis histológico del hueso fracturado se han publicado previamente por Mosekilde y Bak (The Effects of Growth Hormone on Fracture Healing in Rats: A histological Description. Bone, 14:19-27, 1993). Explicado brevemente, el lugar de la fractura se aserra 8 mm a cada lado de la línea de la fractura, se introduce descalcificado en metacrilato de metilo, y se cortan las secciones frontales con un microtomo Reichert-Jung Polycut con un espesor de 8 \mum. Las secciones medianas frontales teñidas con Masson-Trichrome (incluyendo ambas tibias y fíbulas) se utilizan para la visualización de la respuesta celular y tisular a la curación de la fractura con y sin tratamiento. Las secciones teñidas de rojo Sirius se utilizan para demostrar las características de la estructura callosa y para diferenciar entre el hueso entrelazado y el lamelar en el lugar de la fractura. Se realizan las siguientes medidas: (1) espacio de fractura - medido como la distancia más corta entre los extremos corticales del hueso en la fractura, (2) longitud y diámetro del callo, (3) área del volumen total óseo del callo, (4) tejido de hueso por área de tejido dentro del área callosa, (5) tejido fibroso en el callo, (6) área de cartílago en el callo.
Análisis biomecánico
Los procedimientos de análisis biomecánico se han publicado previamente por Bak y Andreassen (The Effects of Aging on Fracture Healing in Rats. Calcif Tissue Int 45:292-97, 1989). Explicado en forma resumida, se toman radiografías de todas las fracturas antes del ensayo biomecánico. Se analizan las propiedades mecánicas de las fracturas soldadas mediante un procedimiento destructivo de curvatura en tres o cuatro puntos. Se determina la carga máxima, rigidez, energía en carga máxima, desviación en la carga máxima y esfuerzo máximo.
Ensayo de los efectos sobre la curación de fracturas después de administración local Técnica de fractura
Se utilizan en este estudio perros Beagle macho o hembra de aproximadamente 2 años de edad bajo anestesia. Se producen fracturas radiales transversales por carga lenta continua doblándolo en tres puntos, tal como describen Lenehan et al (Lenehan, T.M.; Balligand, M.; Nunamaker, D.M.; Wood, F.E.: Effects of EHDP on Fracture Healing in Dogs. J. Orthop Res 3:499-507; 1985). Se arrastra el hilo a través del lugar de la fractura para asegurar la interrupción anatómica completa del hueso. Después, se consigue la liberación local de agonistas de prostaglandina en el lugar de la fractura mediante liberación lenta del compuesto suministrado por gránulos de liberación lenta o por la administración de los compuestos en una formulación adecuada como una solución o suspensión de gel en pasta durante 10, 15 o 20 semanas.
Análisis histológico
Los procedimientos de análisis histológico de huesos fracturados se han publicado anteriormente por Peter et al (Peter, C.P.; Cook, W.O.; Nunamaker, D.M.; Provost, M.T.; Seedor, J.G.; Rodan, G.A. Effects of alendronate on fracture healing and bone remodeling in dogs. J. Orthop. Res. 14:74-70, 1996) y Mosekilde y Bak (The Effects of Growth Hormone on Fracture Healing in Rats: A Histological Description. Bone, 14:19-27, 1993). Explicado brevemente, después del sacrificio, se aserra el lugar de la fractura 3 cm a cada lado de la línea de la fractura, se introduce una vez descalcificado en metacrilato de metilo y se corta con un microtomo Reichert-Jung Polycut en secciones frontales de 8 \mum de espesor. Se utilizan las secciones teñidas con Masson-Trichrome de la parte media frontal (incluyendo la tibia y la fíbula) para la visualización de la respuesta celular y tisular a la curación de la fractura con y sin tratamiento. Se utilizan las secciones teñidas con rojo Sirius para demostrar las características de la estructura del callo y para diferenciar entre el hueso entrelazado y el lamelar en el lugar de la fractura. Se realizan las siguientes medidas: (1) espacio de fractura - medido como la distancia más corta entre los extremos corticales del hueso en la fractura, (2) longitud y diámetro del callo, (3) área del volumen de hueso total del callo, (4) tejido de hueso por área de tejido dentro del área del callo, (5) tejido fibroso en el callo, (6) área de cartílago en el callo.
Análisis biomecánico
Los procedimientos de análisis biomecánico se han publicado previamente por Bak y Andreassen (The Effects of Aging on Fracture Healing in Rats. Calcif Tissue Int 45:292-297, 1989) y Peter et al. (Peter, C.P.; Cook, W.O.; Nunamaker, D.M.; Provost, M.T.; Seedor, J.G.; Rodan, G.A. Effects of Alendronate On Fracture Healing And Bone Remodeling In Dogs. J. Orthop. Res. 14:74-70, 1996). Explicado brevemente, se toman radiografías de todas las fracturas antes de los ensayos biomecánicos. Se analizan las propiedades mecánicas de las fracturas en curación por un procedimiento destructivo de curvatura en tres o cuatro puntos. Se determina la carga total, rigidez, energía en carga máxima, desviación en carga máxima y tensión máxima.
La administración de agonistas selectivos del receptor EP4 conforme a los procedimientos de esta invención se puede realizar por cualquier modo que libere el agonista selectivo del receptor EP4 por vía sistémica y/o local (por ejemplo, en el lugar de la fractura ósea, osteotomía o cirugía ortopédica). Estos procedimientos incluyen las vías oral, parenteral, intraduodenal y similares. Por lo general, los compuestos de esta invención se administran oralmente, pero se puede utilizar la administración parenteral (por ejemplo, intravenosa, intramuscular, transdérmica, subcutánea, rectal o intramedular), por ejemplo, cuando la administración oral sea inadecuada para el objeto deseado o cuando el paciente sea incapaz de ingerir el fármaco.
Los procedimientos de esta invención se utilizan para el tratamiento y promoción de la curación de las fracturas óseas y osteotomías por aplicación local (por ejemplo, en los lugares de fracturas óseas u osteotomías) de los agonistas selectivos del receptor EP4. Los agonistas selectivos del receptor EP4 de esta invención se aplican a los lugares de fractura ósea u osteotomía, por ejemplo, por inyección del compuesto en un disolvente adecuado (por ejemplo, un disolvente oleoso tal como aceite de cacahuete) en la placa de crecimiento del cartílago o, en casos de cirugía abierta, por aplicación local de tales compuestos en un vehículo, portador o diluyente adecuado tal como cera para hueso, polvo de hueso desmineralizado, cementos óseos poliméricos, selladores de hueso, etc. Como alternativa, se puede conseguir la aplicación local aplicando una solución o dispersión del compuesto en un portador o diluyente adecuado sobre su superficie, o incorporándolo en un implante sólido o semisólido usado convencionalmente en cirugía ortopédica, tal como malla de dacron, espumas de gel y hueso Kiel o prótesis.
En cualquier caso, la cantidad y frecuencia de los compuestos administrados dependerá, por supuesto, del sujeto que se está tratando, de la gravedad de la enfermedad, de la forma de administración y del criterio del médico encargado. Así, debido a la variabilidad entre pacientes, las dosificaciones proporcionadas en la presente son una guía y el médico puede valorar la dosis del fármaco para conseguir el tratamiento (por ejemplo, aumento de la masa ósea) que el médico considere adecuada para el paciente. Al considerar el grado de tratamiento deseado, el médico debe valorar varios factores, tales como el nivel inicial de masa ósea, la edad del paciente, la presencia de enfermedad preexistente, así como la presencia de otras enfermedades (por ejemplo, enfermedad cardiovascular).
En general, se usa una cantidad de agonista selectivo del receptor EP4 de esta invención que es suficiente para aumentar la masa ósea hasta un nivel superior al umbral de fractura ósea (tal como se detalla en el World Health Organization Study citado anteriormente en la presente memoria).
Los agonistas selectivos del receptor EP4 usados en los procedimientos de la presente invención se administran generalmente en forma de una composición farmacéutica que comprende al menos uno de los compuestos de esta invención junto con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Así, el agonista selectivo del receptor EP4 de esta invención se puede administrar individualmente en cualquier forma de dosificación convencional oral, intranasal, parenteral, rectal o transdérmica.
Para administración oral la composición farmacéutica puede adoptar la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, pastillas, cápsulas, polvos y similares. Los comprimidos que contienen diferentes excipientes, tales como citrato de sodio, carbonato de calcio y fosfato de calcio, se emplean junto con diferentes disgregantes, tales como almidón y preferiblemente almidón de patata o tapioca y ciertos silicatos complejos, junto con agentes ligantes tales como polivinilpirrolidona, sacarosa, gelatina y goma arábiga. Adicionalmente, agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, laurilsulfato de sodio y talco son con frecuencia muy útiles para la elaboración de comprimidos. También se emplean composiciones sólidas de un tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina dura y blanda rellenas; los materiales preferidos para este fin incluyen también lactosa o azúcar de la leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular. Cuando se desean suspensiones y/o elixires acuosos para administración oral, los compuestos de esta invención se pueden combinar con diferentes agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes, agentes emulsionantes y/o agentes de suspensión, así como diluyentes como agua, etanol, propilenglicol, glicerina y diferentes combinaciones similares de los mismos.
Para administración parenteral, se pueden emplear soluciones en aceite de sésamo y de cacahuete o en propilenglicol acuoso, así como soluciones acuosas estériles de las correspondientes sales solubles en agua. Tales soluciones acuosas pueden estar adecuadamente tamponadas, si es necesario, y el líquido diluyente se puede hacer primero isotónico con solución salina o glucosa suficiente. Estas soluciones acuosas son especialmente adecuadas para inyecciones intravenosas, intramusculares, subcutáneas e intraperitoneales. En este sentido, todos los medios acuosos estériles empleados son fácilmente obtenibles por técnicas convencionales bien conocidas por los expertos en la técnica.
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Para administración transdérmica (por ejemplo, tópica) se preparan soluciones acuosas estériles diluidas o soluciones parcialmente acuosas (habitualmente en concentración aproximada de 0,1% a 5%), similares a las soluciones parenterales anteriores.
Los procedimientos para preparar las diferentes composiciones farmacéuticas, con una cierta cantidad de ingrediente activo son conocidos, o serán evidentes a la luz de esta descripción, para los expertos en la técnica. Para ejemplos de procedimientos de preparación de composiciones farmacéuticas véase Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19th Edición (1995).
Protocolo de estudio
El objeto de este estudio es determinar si un agonista selectivo del receptor EP4 y, en especial, el ácido 7-(2-(3-hidroxi-4-fenil-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico, puede restaurar la masa ósea en un modelo de rata OVX.
Se ovariectomizaron (OVX) ratas Sprague-Dawley a los 3,5 meses de edad. Diez meses después de la OVX, las ratas se trataron por inyección subcutánea con vehículo o con ácido 7-(2-(3-hidroxi-4-fenil-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico a 30 mg/kg/día durante 28 días. Las ratas se sometieron a autopsia. El fémur derecho se extirpa a cada rata en la autopsia y se explora usando absorciometría de rayos X de doble haz (DEXA, QDR 1000/W, Hologic, Inc., Waltham, MA) equipada con un programa informático "WRegional High Resolution Scan" (Hologic, Inc., Waltham, MA). El tamaño de campo de exploración es de 5 x 1,902 cm, la resolución es de 0,0254 x 0,0127 cm, y la velocidad de exploración es de 7,25 mm/seg. Se analizan las imágenes exploradas femorales. Se determina el contenido mineral óseo (BMC) y se calcula la densidad mineral ósea (MBD) del fémur completo (WF), la metáfisis femoral distal (DFM) y la diáfisis femoral (FS) según el procedimiento descrito en H. Z. et al., Droloxifene, a New Estrogen Antagonist/Agonist, Prevents Bone Loss in Ovariectomized Rats. ENDOCRINOLOGY 136; 2435-2441, 1995.
Resultados del estudio y discusión
Al comparar con las ratas OVX tratadas con vehículo, las ratas OVX tratadas con ácido 7-(2-(3-hidroxi-4-fenil-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico mostraron un BMC femoral total un 17% mayor, una BMD femoral total un 8% mayor, un BMC femoral distal un 8% mayor, una BMD femoral distal un 13% mayor, un BMC de la diáfisis femoral un 20% mayor y una BMD de la diáfisis femoral un 18% mayor. No se apreciaron efectos secundarios similares a PGE2 en ratas tratadas con ácido 7-(2-(3-hidroxi-4-fenil-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico.
Estos datos muestran que el ácido 7-(2-(3-hidroxi-4-fenil-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico, un agonista de PGE2 selectivo para el receptor EP4 estimula la formación ósea y restaura el hueso en ratas OVX ya osteopénicas.
Procedimientos experimentales generales
Los espectros de RMN se registraron en un espectrómetro Varian Unity 400 (Varian Co., Palo Alto, California) a aproximadamente 23ºC a 400 MHz para la RMN de protón. Los desplazamientos químicos se expresan en partes por millón. La forma de los picos se denomina como sigue: s, singlete; d, doblete; t, triplete; q, cuatriplete; m, multiplete; bs=singlete ancho. Se obtuvo el espectro de masas de ionización química a presión atmosférica (APCI) en un espectrofotómetro Fisons Platform II. Cuando se describe la intensidad de iones que contienen cloro o bromo, se observó la relación de intensidad esperada (aproximadamente 3:1 para iones que contienen ^{35}Cl/^{37}Cl y 1:1 para iones que contienen ^{79}Br/^{81}Br) y se proporciona únicamente la intensidad del ion de masa inferior.
La cromatografía de media presión se realizó usando un sistema de purificación Biotage (Biotage, Dyax Corporation, Charlottesville, Virginia) en atmósfera de nitrógeno. La cromatografía ultrarrápida se realizó con gel de sílice Baker (40 m) (J.T. Baker, Phillilpsburg, N.J.) o gel de sílice 60 (EM Sciences, Gibbstown, N.J.) en columnas de vidrio a presión de nitrógeno reducida. Se realizó la cromatografía radial utilizando un Chromatotron® (modelo 7924T, Harrison Research). La cromatografía preparativa se realizó usando Gel de Sílice GF de Analtech Uniplates (20 x 20 cm) (Analtech, Inc., Newark, DE). Los disolventes dimetilformamida (DMF), tetrahidrofurano (THF) y diclorometano (CH_{2}Cl_{2}) usados como disolventes de la reacción eran de calidad anhidra suministrados por Aldrich Chemical Company (Milwaukee, Wisconsin). El término "concentrado" se refiere a la eliminación del disolvente a presión de succión de agua en un evaporador rotatorio. La abreviatura "h" significa horas. El término "TBAF" se refiere a fluoruro de tetrabutilamonio. El término "DMAP" se refiere a dimetilaminopiridina. Los términos "diclorometano" y "cloruro de metileno" son sinónimos y se usan de forma indistinta en toda esta memoria descriptiva y en los Ejemplos y Preparaciones.
Ejemplo 1 Ácido 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico
5
Etapa A
Éster etílico del ácido 7-{2R-[4-(3-cloro-fenil)-3-oxo-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico
Se añadió en varias porciones NaH (60% en peso en aceite, 426 mg, 10,7 mmol) a una solución de éster dimetílico del ácido [3-(3-cloro-fenil)-2-oxo-propil]-fosfónico (2,66 g, 9,63 mmol) en THF (35 ml) a 0ºC. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 40 minutos. La mezcla de reacción se enfrió hasta 0ºC y se añadió una solución de éster etílico del ácido 7-(2R-formil-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico (se suponen 10,6 mmol, preparado conforme al procedimiento descrito en la Preparación 7, pero usando diferentes cantidades de reactivos) en THF y la reacción se agitó durante 18 horas. Se añadió AcOH y la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc. La solución orgánica se lavó de forma sucesiva con solución saturada de NaHCO_{3} (2 veces), agua (1 vez) y salmuera (1 vez). La solución orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía de media presión eluyendo con acetona al 15% en tolueno, proporcionando éster etílico del ácido 7-{2R-[4-(3-cloro-fenil)-3-oxo-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico (2,26 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,27-7,15 (m, 3H), 7,08 (m, 1H), 6,66 (dd, 1H), 6,20 (d, 1H), 4,17 (m, 1H), 4,11 (q, 2H), 3,82 (s, 2H), 3,55 (m, 1H), 2,72 (m, 1H), 2,46-2,23 (m, 5H), 1,79 (m, 1H), 1,58 (m, 2H), 1,47-1,20 (m, 9H); EM 420,2 (M+1), 418,2 (M-1).
Etapa B
Éster etílico del ácido 7-{2R-[4-(3-cloro-fenil)-3S-hidroxi-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico
Se añadió (R)-2-metil-CBS-oxazaborolidina (1M en tolueno, 5 ml, 5 mmol) a una solución del éster etílico del ácido 7-{2R-[4-(3-cloro-fenil)-3-oxo-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico (2,1 g, 5,0 mmol) en CH_{2}Cl_{2} anhidro (200 ml) y la solución se enfrió hasta -45ºC. La mezcla de reacción se agitó durante 20 minutos y se añadió catecolborano (1M en THF, 15 ml, 15 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 18 horas a -45ºC. Se añadió HCl acuoso (1N, 100 ml) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. La fase acuosa ácida se separó y la solución orgánica se lavó con NaOH 1N enfriada en hielo (2 veces), seguido por salmuera (1 vez). La solución orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró. La purificación por cromatografía de media presión (EtOAc:hexanos 1:1 hasta EtOAc al 80% en hexanos) proporcionó éster etílico del ácido 7-{2R-[4-(3-cloro-fenil)-3S-hidroxi-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico (800 mg) como una mezcla aproximadamente 6:1 de los diastereoisómeros alcohol 3S:3R por RMN de ^{1}H. RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,23-7,17 (m, 3H), 7,06 (m, 1H), 5,67 (dd, 1H), 5,46 (dd, 1H), 4,37 (m, 1H), 4,08 (q, 2H), 4,00 (m, 1H), 3,44 (m, 1H), 2,80 (m, 2H), 2,67 (m, 1H), 2,41-2,12 (m, 5H), 1,70-1,20 (m, 13H); EM 422,3 (M+1).
Etapa C
Éster etílico del ácido 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico
Se añadió paladio al 10% sobre carbón (80 mg) a una solución de éster etílico del ácido 7-{2R-[4-(3-cloro-fenil)-3S-hidroxi-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico (800 mg, 1,90 mmol) en EtOH (50 ml). La mezcla de reacción se sometió a hidrogenación en un agitador de Parr a 3,10x10^{5} Pa durante 4,5 horas. Se separó el catalizador por filtración a través de Celite® con la ayuda de EtOH. La purificación por cromatografía de media presión (hexanos:EtOAc 1:1 hasta EtOAc:hexanos 4:1) proporcionó éster etílico del ácido 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico (625 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,27-7,21 (m, 3H), 7,09 (m, 1H), 4,10 (m,2H), 3,84 (m, 1H), 3,61 (m, 2H), 2,90 (m, 1H), 2,78 (dd, 1H), 2,68 (m, 1H), 2,47-2,25 (m, 4H), 2,12 (m, 1H), 1,92-1,22 (m, 17H); EM 424,3 (M+1).
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Etapa D
Ácido 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico
Se añadió NaOH 2N (6 ml) a una solución del éster etílico del ácido 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico (595 mg, 1,40 mmol) en EtOH (25 ml). La reacción se agitó durante 24 horas a temperatura ambiente y se concentró a vacío hasta aproximadamente tres cuartas partes del volumen original. Se añadió HCl 1N acuoso para obtener un pH de aproximadamente 2. La solución acuosa se lavó con cloruro de metileno (3 veces). Las fases orgánicas reunidas se lavaron con agua seguido de salmuera. La solución orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró proporcionando el compuesto del Ejemplo 1 (500 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,26-7,18 (m, 3H), 7,08 (m, 1H), 3,84 (m, 1H), 3,58 (m, 2H), 2,90 (m, 1H), 2,77 (dd, 1H), 2,68 (m, 1H), 2,43-2,28 (m, 4H), 2,10 (m, 1H), 1,78 (m, 1H), 1,66-1,22 (m, 13H); EM 396,2 (M+1), 394,2 (M-1).
Ejemplo 2 Ácido 7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico
6
Etapa A
Éster etílico del ácido 7-{2-oxo-5R-[3-oxo-4-(3-trifluorometil-fenil)-but-1-enil]-pirrolidin-1-il}-heptanoico
Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 1, Etapa A, se hizo reaccionar el anión derivado del éster dimetílico del ácido [2-oxo-3-(3-trifluorometil-fenil)-propil]-fosfónico (4,16 g, 13,40 mmol) y NaH (60% en aceite, 590 mg, 14,7 mmol) con éster etílico del ácido 7-(2R-formil-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico (se suponen 14,74 mmol) durante 24 horas. La purificación por cromatografía de media presión (gradiente de disolvente de EtOAc al 20% en hexanos hasta EtOAC) proporcionó éster etílico del ácido 7-{2-oxo-5R-[3-oxo-4-(3-trifluorometil-fenil)-but-1-enil]-pirrolidin-1 il}-heptanoico (4,29 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,52 (d, 1H), 7,44 (m, 2H), 7,37 (d, 1H), 6,67 (dd, 1H), 6,22 (d, 1H), 4,80 (m, 1H), 4,08 (q, 2H), 3,90 (s, 2H), 3,54 (m, 1H), 2,70 (m, 1H), 2,37 (m, 2H), 2,24 (m, 3H), 1,78 (m, 1H), 1,56 (m, 2H), 1,44-1,20 (m, 9H); EM 454,2 (M+1), 452,2 (M-1).
Etapa B
Éster etílico del ácido 7-{2R-[3S-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico
Se añadió catecolborano (1M en THF, 9,9 ml, 9,9 mmol), gota a gota, a una solución de éster etílico del ácido 7-{2-oxo-5R-[3-oxo-4-(3-trifluorometil-fenil)-but-1-enil]-pirrolidin-1-il}-heptanoico (1,5 g, 3,31 mmol) y (R)-2-metil-CBS-oxazaborolidina (1M en tolueno, 0,5 ml, 0,5 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (100 ml) a -45ºC. La solución se agitó durante 24 horas a -45ºC y se añadió HCl 1N. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y se separaron las fases. La solución acuosa se lavó con CH_{2}Cl_{2} (2 veces) y las fases orgánicas reunidas se lavaron sucesivamente con NaOH 0,5N enfriada en hielo y salmuera (dos veces). La solución orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró. La purificación por cromatografía de media presión (EtOAc al 50% en hexanos hasta EtOAc al 60% en hexanos hasta EtOAc al 80% en hexanos hasta EtOAc hasta MeOH al 5% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó éster etílico del ácido 7-{2R-[3S-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico (1,23 g) como una mezcla aproximadamente 5,5:1 de los diastereoisómeros alcohol 3S:3R por análisis HPLC. RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,51-7,35 (m, 4H), 5,72 (dd, 1H), 5,50 (dd, 1H), 4,44 (m, 1H), 4,09 (q, 2H), 4,01 (m, 1H), 3,44 (m, 1H), 2,90 (d, 2H), 2,71 (m, 1H), 2,37-2,12 (m, 5H), 1,70-1,21 (m, 13H); EM 456,3 (M+1), 454,3 (M-1).
Etapa C
Éster etílico del ácido 7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico
Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 1, Etapa C, se sometió a hidrogenación en presencia de paladio al 10% sobre carbón (120 mg) de 2,75 x 10^{5} a 3,10 x 10^{5} Pa en un agitador de Parr durante 24 horas una solución del éster etílico del ácido 7-{2R-[3S-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico (1,18 g, 2,59 mmol) en EtOH (50 ml). La purificación mediante cromatografía de media presión (EtOAc al 50% en hexanos hasta EtOAc hasta MeOH al 1% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 3% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 5% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 10% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó éster etílico del ácido 7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil- fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico (1,08 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,51-7,39 (m, 4H), 4,09 (q, 2H), 3,86 (m, 1H), 3,60 (m, 2H), 2,89 (m, 2H), 2,76 (m, 1H), 2,33 (m, 4H), 2,11 (m, 1H), 1,80 (m, 1H), 1,68-1,21 (m, 16H).
Etapa D
Ácido 7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico
Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 1, Etapa D, se hidrolizó el éster etílico del ácido 7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico (1,93 g, 4,22 mmol) con NaOH 6N (26 ml) en EtOH (52 ml) durante 24 horas. La purificación por cromatografía de media presión (EtOAc hasta MeOH al 1% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 3% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 5% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 10% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó ácido 7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico (1,66 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,51-7,39 (m, 4H), 3,88 (m, 1H), 3,58 (m, 2H), 2,84 (m, 3H), 2,34 (m, 4H), 2,10 (m, 1H), 1,80 (m, 1H), 1,67-1,26 (m, 13H); EM 430,4 (M+1).
Etapa E
Sal sódica del ácido 7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico
Se añadió NaHCO_{3} (325 mg, 3,87 mmol) en agua (3 ml) a una solución del ácido 7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico (1,66 g, 3,87 mmol) en EtOH (16 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 5 horas y se concentró a vacío. El residuo se destiló azeotrópicamente con CH_{2}Cl_{2} (3 veces) proporcionando la sal sódica del compuesto del epígrafe del Ejemplo 2 (1,698 g). RMN de ^{1}H (CD_{3}OD) \delta 7,48 (m, 4H), 3,80 (m, 1H), 3,69 (m, 1H), 3,52 (m, 1H), 2,94 (m, 1H), 2,81 (m, 2H), 2,32 (m, 2H), 2,13 (m, 3H), 1,81 (m, 1H), 1,69-1,26 (m, 13H); EM 430,3 (M-Na+1), 428,2 (M-Na-1).
Ejemplo 3 5S-[4-(3-Cloro-fenil)-3-hidroxi-butil]-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona
7
Etapa A
7-{2R-[4-(3-Cloro-fenil)-3-oxo-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 1, Etapa A, se hizo reaccionar con 7-(2R-formil-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanonitrilo (se suponen 13,3 mmol) durante 18 horas con el anión derivado del éster dimetílico del ácido [3-(3-cloro-fenil)-2-oxo-propil]-fosfónico (3,35 g, 12,12 mmol) y NaH (60% en aceite, 533 mg, 13,3 mmol). La purificación por medio de cromatografía de media presión (EtOAc al 20% en hexanos hasta EtOAc al 80% en hexanos) proporcionó 7-{2R-[4-(3-cloro-fenil)-3-oxo-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (1,52 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,24 (m, 2H), 7,17 (s, 1H), 7,06 (m, 1H), 6,64 (dd, 1H), 6,20 (d, 1H), 4,15 (m, 1H), 3,80 (s, 2H), 3,50 (m, 1H), 2,72 (m, 1H), 2,46-2,20 (m, 5H), 1,78 (m, 1H), 1,59 (m, 2H), 1,40 (m, 4H), 1,24 (m, 2H).
Etapa B
7-{2S-[4-(3-Cloro-fenil)-3-oxo-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
Siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 1, Etapa C, se sometió a hidrogenación en presencia de paladio al 10% sobre carbón (86 mg) durante una hora 7-{2R-[4-(3-cloro-fenil)-3-oxo-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (860 mg, 2,31 mmol) en MeOH (40 ml). La purificación por cromatografía radial (hexanos hasta EtOAc al 20% en hexanos hasta EtOAc al 70% en hexanos) proporcionó 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3-oxo-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (730 mg).
\newpage
Etapa C
7-{2S-[4-(3-Cloro-fenil)-3-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
Se añadió NaBH_{4} (35 mg, 0,921 mmol) a una solución de 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3-oxo-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (730 mg, 1,87 mmol) en MeOH (30 ml) a 0ºC. La mezcla de reacción se agitó a 0ºC durante 45 minutos y se añadió agua. Los volátiles se eliminaron a vacío y la solución acuosa que quedó se diluyó con cloruro de metileno. La solución orgánica se lavó con agua y después con salmuera, se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró. La purificación por cromatografía de media presión (hexanos:EtOAc 1:1 hasta EtOAc hasta MeOH al 3% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (730 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,22 (m, 3H), 7,07 (d, 1H), 3,80 (m, 1H), 3,57 (m, 2H), 2,88 (m, 1H), 2,78 (m, 1H), 2,64 (m, 1H), 2,31 (m, 4H), 2,10 (m, 1H), 1,65-1,22 (m, 14H); EM 377,3 (M+1).
Etapa D
5S-[4-(3-Cloro-fenil)-3-hidroxi-butil]-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona
Se calentó a reflujo durante 18 horas una solución de 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (730 mg, 1,94 mmol), trimetilsililazida (0,63 ml, 0,475 mmol) y óxido de dibutilestaño (96 mg, 3,87 mmol) en tolueno (30 ml). Los volátiles se eliminaron a vacío y el residuo se diluyó con CH_{2}Cl_{2}. La solución orgánica se lavó con HCl 1N, seguido de salmuera. La solución orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía de media presión eluyendo con EtOAc hasta MeOH al 2% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 7% en CH_{2}Cl_{2}, dando el complejo en TMS. El residuo se diluyó con MeOH y se añadió HCl 2N y la solución se agitó durante 40 minutos. La solución se diluyó con CH_{2}Cl_{2} y la fase orgánica se lavó con agua y luego con salmuera. La solución orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía de media presión eluyendo con EtOAc hasta MeOH al 7% en CH_{2}Cl_{2}, proporcionando la 5S-[4-(3-cloro-fenil)-3-hidroxi-butil]-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona (521 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,23 (m, 3H), 7,09 (d, 1H), 3,85 (m, 1H), 3,66 (m, 1H), 3,53 (m, 1H), 2,96 (m, 3H), 2,81 (m, 1H), 2,70 (m, 1H), 2,44 (m, 2H), 2,18 (m, 1H), 1,88-1,27 (m, 14H); EM 420,2 (M+1), 418,3 (M-1).
Ejemplo 4 5S-[3R-Hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil]-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona
8
Etapa A
7-{2-Oxo-5R-[3-oxo-4-(3-trifluorometil-fenil)but-1-enil]-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo.
Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 1, Etapa A, se hizo reaccionar el anión derivado de éster dimetílico del ácido [2-oxo-3-(3-trifluorometil-fenil)-propil]fosfónico (2,68 g, 8,64 mmol) y NaH (60% en aceite, 400 mg, 10 mmol) con 7-(2R-formil-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanonitrilo (se suponen 10 mmol) durante 18 horas. La purificación por medio de cromatografía de media presión (EtOAc al 30% en hexanos hasta EtOAc al 80% en hexanos) proporcionó 7-{2-oxo-5R-[3-oxo-4-(3-trifluorometil-fenil)but-1-enil]-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (1,2 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,52 (m, 1H), 7,45 (m, 2H), 7,37 (m, 1H), 6,67 (dd, 1H), 6,23 (d, 1H), 4,18 (m, 1H), 3,90 (s, 2H), 3,53 (m, 1H), 2,73 (m, 1H), 2,45-2,23 (m, 5H), 1,79 (m, 1H), 1,60 (m, 2H), 1,41 (m, 4H), 1,24 (m, 2H); EM 407,2 (M+1), 405,3 (M-1).
Etapa B
7-{2R-[3S-Hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
Se añadió catecolborano (1M en THF, 8,4 ml, 8,4 mmol) gota a gota a una solución de 7-{2-oxo-5R-[3-oxo-4-(3-trifluorometil-fenil)but-1-enil]-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (1,14 g, 2,81 mmol) y (R)-2-metil-CBS-oxazaborolidina (1M en tolueno, 0,42 ml, 0,42 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (112 ml) a -45ºC. La mezcla de reacción se agitó a -45ºC durante 18 horas y se añadió HCl 1N. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 40 minutos y se separaron las fases. La solución orgánica se lavó con NaOH 1N frío (3 veces). La solución orgánica se lavó secuencialmente con HCl 1N, agua y salmuera. La solución orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró. La purificación por cromatografía de media presión (hexanos:EtOAc 1:1 hasta EtOAc al 80% en hexanos) proporcionó 7-{2R-[3S-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (820 mg) como una relación aproximadamente 2,5:1 de los diastereoisómeros alcohol 3S:3R por RMN de ^{1}H. RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,51-7,38 (m, 4H), 5,72 (dd, 1H), 5,49 (dd, 1H), 4,45 (m, 1H), 4,02 (m, 1H), 3,47 (m, 1H), 2,90 (m, 2H), 2,71 (m, 1H), 2,34 (m, 4H), 2,18 (m, 1H), 1,66 (m, 4H), 1,44 (m, 4H), 1,27 (m, 2H); EM 409,2 (M+1).
Etapa C
7-{2S-[3R-Hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 1, Etapa C, se sometió a hidrogenación en presencia de paladio al 10% sobre carbón (100 mg) a 3,45 x 10^{5} Pa durante 18 horas en un agitador de Parr 7-{2R-[3S-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (810 mg) en MeOH (40 ml). La purificación por medio de cromatografía de media presión (hexanos:EtOAc 1:1 hasta MeOH al 3% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó 7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (720 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,44 (m, 4H), 3,84 (m, 1H), 3,58 (m, 2H), 2,88 (m, 2H), 2,73 (m, 1H), 2,32 (m, 4H), 2,11 (m, 1H), 1,78 (m, 1H), 1,65-1,37 (m, 11H), 1,30 (m, 2H); EM411,2 (M+1).
Etapa D
5S-[3R-Hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil]-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona
Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 3, Etapa D, se hizo reaccionar 7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (710 mg, 1,73 mmol) con azidotrimetilsilano (399 mg, 3,46 mmol) y óxido de dibutilestaño (43 mg, 1,7 mmol) en tolueno (25 ml) calentado a reflujo durante 18 horas. Los volátiles se eliminaron a vacío y el residuo se diluyó con CH_{2}Cl_{2}. La solución orgánica se lavó sucesivamente con HCl 1N (dos veces), agua (1 vez) y salmuera (1 vez). La solución orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía de media presión eluyendo con EtOAc hasta MeOH al 2% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 8% en CH_{2}Cl_{2}, proporcionando la 5S-[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil]-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona (450 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,44 (m, 4H), 3,87 (m, 1H), 3,65 (m, 1H), 3,50 (m, 1H), 3,01-2,73 (m, 5H), 2,42 (m, 2H), 2,16 (m, 1H), 1,86-1,23 (m, 14H); EM 454,4 (M+1), 452,4 (M-1).
Etapa E
Sal sódica de la 5S-[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil]-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona
Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 2, Etapa E, el tratamiento de la 5S-[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil]-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona (428 mg, 0,944 mmol) con NaHCO_{3} (79 mg, 0,94 mmol) proporcionó la sal sódica (430 mg). RMN de ^{1}H (CD_{3}OD) \delta 7,48 (m, 4H), 3,79 (m, 1H), 3,67 (m, 1H), 3,51 (m, 1H), 2,86 (m, 5H), 2,30 (m, 2H), 2,12 (m, 1H), 1,84-1,27 (m, 14H); EM 454,4 (M-Na+1), 452,4 (M-Na-1).
Ejemplo 5 5-[4-(4-Fluoro-fenil)-3-hidroxi-butil]-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona
9
Etapa A
7-{2-[3-(terc-Butil-dimetil-silaniloxi)-4-(4-fluoro-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
Se añadió una solución de 5-[3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-4-(4-fluoro-fenil)-butil]-pirrolidin-2-ona (150 mg, 0,41 mmol) en DMF (5 ml) a NaH (60% en peso en aceite, 16 mg, 0,41 mmol) en DMF (10 ml). Después de 1,5 horas, se añadió 7-bromoheptanonitrilo (78 mg, 0,41 mmol) en DMF (5 ml) y la mezcla de reacción se agitó a 90ºC durante 2,5 horas. Se añadió agua (20 ml) y la solución acuosa se lavó con EtOAc (4 x 15 ml). Las soluciones orgánicas reunidas se lavaron con agua (2 x 15 ml), se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó por cromatografía de media presión (hexanos:EtOAc 1:1), proporcionando 7-{2-[3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-4-(4-fluoro-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (161 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,09 (m, 2H), 6,95 (m, 2H), 3,81 (m, 1H), 3,54 (m, 2H), 2,86 (m, 1H), 2,68 (m, 2H), 2,29 (m, 4H), 2,06 (m, 1H), 1,74-1,23 (m, 13H), 0,85 (s, 9H), 0,04 (m, 3H), 0,19 (m, 3H); EM 475,1 (M+1).
Etapa B
7-{2-[4-(4-fluoro-fenil)-3-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo.
Se añadió TBAF (1M en THF, 0,50 ml, 0,50 mmol) a una solución de 7-{2-[3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-4-(4-fluoro-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (158 mg, 0,333 mmol) en THF (20 ml) a 0ºC. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas y se añadió NaHCO_{3} acuoso saturado. Los volátiles se eliminaron a vacío. La solución acuosa que quedó se lavó con CHCl_{3} (4 x 5 ml) y las soluciones orgánicas reunidas se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó por cromatografía de media presión (hexanos:EtOAc 1:1 hasta EtOAc) proporcionando 7-{2-[4-(4-fluoro-fenil)-3-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (82 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,15 (m, 2H), 7,00 (m, 2H), 3,77 (m, 1H), 3,58 (m, 2H), 2,89 (m, 1H), 2,79 (m, 1H), 2,64 (m, 1H), 2,34 (m, 4H), 2,12 (m, 1H), 1,68-1,24 (m, 14H); EM 361,2 (M+1).
Etapa C
5-[4-(4-Fluoro-fenil)-3-hidroxi-butil]-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona
Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 3, Etapa D, se hizo reaccionar 7-{2-[4-(4-fluoro-fenil)-3-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (71 mg, 0,197 mmol) con azidotrimetilsilano (45 mg, 0,394 mmol) y óxido de dibutilestaño (5 mg, 0,02 mmol) en tolueno (10 ml) calentado a reflujo durante 16 horas. Se añadieron cantidades adicionales de azidotrimetilsilano (200 mg) y de óxido de dibutilestaño (50 mg) y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 5 horas. La mezcla de reacción se acidificó con HCl 1N hasta pH 2 (5 ml) y la solución acuosa se lavó con EtOAc (4 x 10 ml). Las soluciones orgánicas reunidas se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron. La purificación por cromatografía de media presión (EtOAc hasta EtOAc:MeOH 39:1 hasta EtOAc:MeOH 19:1) proporcionó el compuesto del epígrafe del Ejemplo 5A (39 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,16 (m, 2H), 7,00 (m, 2H), 3,81 (m, 1H), 3,68 (m, 1H), 3,53 (m, 1H), 2,99 (m, 3H), 2,80 (m, 1H), 2,68 (m, 1H), 2,47 (m, 2H), 2,20 (m, 1H), 1,88-1,22 (m, 14H); EM 404,3 (M+1), 402,3 (M-1).
Ejemplo 6 5-(4-Bifenil-3-il-3-hidroxi-butil)-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona
10
Etapa A
7-{2-[4-Bifenil-3-il-3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 5, Etapa A, se alquiló el anión derivado de 5-[4-bifenil-3-il-3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-butil]-pirrolidin-2-ona (239,1 mg, 0,564 mmol) y NaHMDS (1M en THF, 0,67 ml, 0,67 mmol) con 7-bromoheptanonitrilo (118 mg, 0,620 mg) a 70ºC durante 24 horas. La purificación por cromatografía de media presión (CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 1% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 2% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 4% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó 7-{2-[4-bifenil-3-il-3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (187 mg). EM 533,3 (M+1).
Etapa B
7-[2-(4-Bifenil-3-il-3-hidroxi-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il]-heptanonitrilo
Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 5, Etapa B, se desprotegió 7-{2-[4-bifenil-3-il-3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (187 mg, 0,351 mmol) con TBAF (1M en THF, 0,53 ml, 0,53 mmol). La adición se llevó a cabo a 0ºC y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. La purificación por cromatografía de media presión (CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 1% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 2% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 6% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 10% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó 7-[2-(4-bifenil-3-il-3-hidroxi-butil)-5-oxo- pirrolidin-1-il]-heptanonitrilo (85 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,58 (m, 1H), 7,51-7,33 (m, 4H), 7,21-7,12 (m, 4H), 3,85 (m, 1H), 3,60 (m, 2H), 2,90 (m, 1H), 2,83-2,60 (m, 2H), 2,45-2,30 (m, 4H), 2,14 (m, 1H), 1,73-1,25 (m, 14H).
Etapa C
5-(4-Bifenil-3-il-3-hidroxi-butil)-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona
Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 3, Etapa D, se hizo reaccionar 7-[2-(4-bifenil-3-il-3-hidroxi-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il]-heptanonitrilo (109 mg, 0,260 mmol) con azidotrimetilsilano (0,69 ml, 0,52 mmol) y óxido de dibutilestaño (11 mg, 0,044 mmol) en tolueno (5,3 ml) calentado a reflujo durante 72 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se añadió agua. La mezcla se acidificó con HCl 1N hasta pH 2 y la solución acuosa se lavó con MeOH al 5% en CH_{2}Cl_{2} (tres veces). Las soluciones orgánicas reunidas se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron. La purificación por cromatografía de media presión (hexanos:EtOAc 1:1 hasta EtOAc hasta MeOH al 2% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 4% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 8% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó el compuesto del epígrafe del Ejemplo 6 (107 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,57 (m, 1H), 7,51-7,32 (m, 4H), 7,25-7,13 (m, 4H), 3,91 (m, 1H), 3,74-3,50 (m, 2H), 2,96 (m, 3H), 2,77 (m, 1H), 2,50 (m, 2H), 2,22 (m, 1H), 2,07 (m, 1H), 1,90-1,22 (m, 14H); EM 462,2 (M+1), 460,1 (M- 1).
Ejemplo 7 5-[4-(3-Fluoro-fenil)-3-hidroxi-butil]-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona
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Etapa A
7-{2-[3-(terc-Butil-dimetil-silaniloxi)-4-(3-fluoro-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 5, Etapa A, se alquiló el anión derivado de 5-[3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-4-(3-fluoro-fenil)-butil]-pirrolidin-2-ona (250 mg, 0,684 mmol) y NaHMDS (1M en THF, 0,80 ml, 0,80 mml) con 7-bromoheptanonitrilo (142 mg, 0,748 mg) a 70ºC durante 72 horas. La purificación por cromatografía de media presión (hexanos:EtOAc 1:1 hasta EtOAc hasta MeOH al 5% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó 7-{2-[3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-4-(3-fluoro-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (261,7 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,26 (m, 1H), 6,92 (m, 3H), 3,89 (m, 1H), 3,59 (m, 2H), 2,89 (m, 1H), 2,75 (m, 2H), 2,36 (m, 4H), 2,11 (m, 1H), 1,72-1,26 (m, 13H), 0,89 (s, 9H), 0,09 (s, 6H); EM 475,3 (M+1).
Etapa B
7-{2-[4-(3-fluoro-fenil)-3-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
Siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 5, Etapa B, se desprotegió con TBAF (1M en THF, 0,83 ml, 0,83 mmol) 7-{2-[3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-4-(3-fluoro-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (261,7 mg, 0,551 mmol). La adición se llevó a cabo a 0ºC y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. La purificación por cromatografía de media presión (CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 1% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 2% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 4% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó 7-{2-[4-(3-fluoro-fenil)-3-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (141 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,32 (m, 1H), 6,98 (m, 3H), 3,86 (m, 1H), 3,64 (m, 2H), 2,99-2,80 (m, 2H), 2,71 (m, 1H), 2,38 (m, 4H), 2,16 (m, 1H), 1,74-1,29 (m, 14H); EM 361,3 (M+1).
Etapa C
5-[4-(3-Fluoro-fenil)-3-hidroxi-butil]-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona
Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 6, Etapa C, se hizo reaccionar 7-{2-[4-(3-fluoro-fenil)-3-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (141,3 mg, 0,392 mmol) con azidotrimetilsilano (0,210 ml, 1,57 mmol) y óxido de dibutilestaño (29 mg, 0,116 mmol) en tolueno (8 ml) calentado a reflujo durante 72 horas. La purificación por cromatografía de media presión (CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 2% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 4% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 6% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó el compuesto del epígrafe del Ejemplo 5C (101,5 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,26 (m, 1H), 6,94 (m, 3H), 3,87 (m, 1H), 3,70 (m, 1H), 3,52 (m, 1H), 2,98 (m, 3H), 2,78 (m, 2H), 2,48 (m, 2H), 2,20 (m, 1H), 1,89-1,24 (m, 14H); EM 404,2 (M+1), 401,9 (M-1).
Ejemplo 8 5S-[4-(3-Cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona
12
Etapa A
7-{2R-[3S-hidroxi-4-(3-cloro-fenil)-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
Se añadió (R)-2-metil-CBS-oxazaborolidina (1M en tolueno, 1,3 ml, 1,3 mmol) a una solución de 7-{2-oxo-5R-[3-oxo-4-(3-cloro-fenil)-but-1-enil]-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (1,62 g, 4,34 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (200 ml) a -45ºC. Después de agitar durante 20 minutos, se añadió catecolborano (1M en THF, 13 ml, 13 mmol) gota a gota. La reacción se agitó a -45ºC durante 16 horas y se añadió HCl 1N. La mezcla se calentó a temperatura ambiente y se separaron las fases. La solución orgánica se lavó con NaOH 1N (3 veces) frío. La solución orgánica se lavó sucesivamente con HCl 1N, agua y salmuera. La solución orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró. La purificación por cromatografía de media presión (hexanos:EtOAc 1:1 hasta MeOH al 20% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó 7-{2R-[3S-hidroxi-4-(3-cloro-fenil)-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (536 mg) como una mezcla 8,2:1 de los alcoholes 3S:2R. RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,24-7,17 (m, 3H), 7,07 (m, 1H), 5,69 (dd, 1H), 5,46 (dd, 1H), 4,40 (m, 1H), 4,01 (m, 1H), 3,46 (m, 1H), 2,81 (m, 2H), 2,68 (m, 1H), 2,42-2,28 (m, 4H), 2,20 (m, 1H), 1,73-1,59 (m, 4H), 1,42 (m, 4H), 1,25 (m, 2H); EM 375 (M+1).
Etapa B
7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo
Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 4, Etapa C, se sometió a hidrogenación en presencia de paladio al 10% sobre carbón (60 mg) durante 3,5 horas el 7-{2R-[3S-hidroxi-4-(3-cloro-fenil)-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (536 mg) en EtOH (30 ml). La purificación por cromatografía de media presión (hexanos:EtOAc 1:1 hasta MeOH al 20% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (440 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,22 (m, 3H), 7,08 (m, 1H), 3,83 (m, 1H), 3,59 (m, 2H), 2,90 (m, 1H), 2,77 (dd, 1H), 2,66 (dd, 1H), 2,39-2,29 (m, 4H), 2,11 (m, 1H), 1,78 (m, 1H), 1,68-1,39 (m, 11H), 1,29 (m, 2H); EM 377,2 (M+1).
Etapa C
S-[4-(3-Cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona
Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 3, Etapa D, se calentó a reflujo durante 16 horas una mezcla de 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanonitrilo (420 mg, 1,114 mmol), trimetilsililazida (257 mg, 2,23 mmol) y óxido de dibutilestaño (56 mg) en tolueno (30 ml). Los volátiles se eliminaron a vacío y el residuo se disolvió en MeOH y se agitó con HCl 3N durante 3 horas. La reacción se diluyó con agua y CH_{2}Cl_{2} y se separaron las fases. La fase orgánica se lavó con agua seguida de salmuera. La solución orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró. La purificación por cromatografía de media presión (EtOAc hasta MeOH al 2% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 7% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó 5S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona (311 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,22 (m, 3H), 7,08 (m, 1H), 3,86 (m, 1H), 3,66 (m, 1H), 3,52 (m, 1H), 2,96 (m, 3H), 2,82-2,68 (m, 2H), 2,45 (m, 2H), 2,17 (m, 1H), 1,88-1,22 (m, 14H); EM 420,2 (M+1), 418,3 (M-1).
Ejemplo 9 Ácido 7-{2R-[3-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico
13
Etapa A
Éster etílico del ácido 7-{2-oxo-5R-[3-oxo-4-(3-fenoxi-fenil)-but-1-enil]-pirrolidin-1-il}-heptanoico
Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 1, Etapa A, se hizo reaccionar el anión derivado de éster dimetílico del ácido [2-oxo-3-(3-fenoxi-fenil)-propil]-fosfónico (633 mg, 1,98 mmol) y NaH (60% en aceite, 70 mg, 1,74 mmol) con éster etílico del ácido 7-(2R-formil-5-oxo- pirrolidin-1-il)-heptanoico (se supone 1,58 mmol) durante 24 horas. La cromatografía de media presión (EtOAc) proporcionó éster etílico del ácido 7-{2-oxo-5R-[3-oxo-4-(3-fenoxi-fenil)-but-1-enil]-pirrolidin-1-il}-heptanoico (215 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,28 (m, 3H), 7,08 (m, 1H), 6,97 (m, 2H), 6,89 (m, 2H), 6,83 (m, 1H), 6,62 (dd, 1H), 6,19 (d, 1H), 4,13 (m, 1H), 4,08 (q, 2H), 3,79 (s, 2H), 3,51 (m, 1H), 2,68 (m, 1H), 2,35 (m, 2H), 2,24 (m, 3H), 2,24 (m, 3H), 1,75 (m, 1H), 1,54 (m, 2H), 1,43-1,20 (m, 9H).
Etapa B
Éster etílico del ácido 7-{2R-[3-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico
Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 3, Etapa C, se hizo reaccionar el éster etílico del ácido 7-{2-oxo-5R-[3-oxo-4-(3-fenoxi-fenil)-but-1-enil]-pirrolidin-1-il}-heptanoico (215 mg, 0,451 mmol) con NaBH_{4} (17 mg, 0,45 mmol) en EtOH (3 ml) a 0ºC durante 4 horas. La purificación por cromatografía de media presión (EtOAc) proporcionó éster etílico del ácido 7-{2R-[3-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico (167 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,33 (m, 2H), 7,25 (m, 1H), 7,10 (m, 1H), 6,99 (m, 2H), 6,93 (m, 1H), 6,86 (m, 2H), 5,72 (m, 1H), 5,45 (m, 1H), 4,37 (m, 1H), 4,10 (q, 2H), 3,47 (m, 1H), 2,82 (m, 3H), 2,35 (m, 2H), 2,26 (t, 2H), 2,15 (m, 1H), 1,70-1,21 (m, 13H).
Etapa C
Ácido 7-{2R-[3-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico
Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 1, Etapa D, se hidrolizó el éster etílico del ácido 7-{2R-[3-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico (29 mg, 0,060 mmol) con NaOH 2M en EtOH (4,0 ml) a temperatura ambiente durante 24 horas, proporcionando el compuesto del epígrafe (20 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,33-7,21 (m, 3H), 7,08 (m, 1H), 6,98-6,84 (m, 5H), 5,70 (m, 1H), 5,44 (m, 1H), 4,36 (m, 1H), 4,00 (m, 1H), 3,44 (m, 1H), 2,85-2,51 (m, 3H), 2,32 (m, 4H), 2,14 (m, 1H), 1,68-1,18 (m, 10H).
Ejemplo 10 Ácido 7-{2S-[3-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico
14 
\newpage
Etapa A
Éster etílico del ácido 7-{2S-[3-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico
Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 1, Etapa C, se sometió a hidrogenación en un agitador de Parr a 3,45 x 10^{5} Pa durante 18 horas una mezcla del éster etílico del ácido 7-{2R-[3-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-but-1-enil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico (139 mg, 0,290 mmol), MeOH (30 ml) y paladio al 10% sobre carbón (14 mg). La purificación por cromatografía de media presión (hexanos:EtOAc 1:1) proporcionó éster etílico del ácido 7-{2S-[3-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico (86 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,35-7,24 (m, 3H), 7,10 (m, 1H), 6,99 (m, 2H), 6,93 (m, 1H), 6,87 (m, 2H), 4,09 (q, 2H), 3,80 (m, 1H), 3,58 (m, 2H), 2,82 (m, 2H), 2,64 (m, 1H), 2,42-2,24 (m, 4H), 2,10 (m, 1H), 1,77 (m, 1H), 1,66-1,21 (m, 16H).
Etapa B
Ácido 7-{2S-[3-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico
Siguiendo el procedimiento descrito para el Ejemplo 1, Etapa D, se hidrolizó el éster etílico del ácido 7-{2S-[3-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico (86 mg, 1,79 mmol) con NaOH 2N en MeOH (4 ml) durante 18 horas, proporcionando el compuesto del epígrafe (62 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,33-7,23 (m, 3H), 7,09 (m, 1H), 6,98 (m, 2H), 6,91 (m, 1H), 6,86 (m, 2H), 3,80 (m, 1H), 3,56 (m, 2H), 2,88 (m, 1H), 2,77 (m, 1H), 2,64 (m, 1H), 2,38-2,28 (m, 4H), 2,09 (m, 1H), 1,77 (m, 1H), 1,64-1,21 (m, 13H).
Preparación 1 7-(2R-Hidroximetil-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanonitrilo
Etapa A
7-[2R-(terc-Butil-dimetil-silaniloximetil)-5-oxo-pirrolidin-1-il]-heptanonitrilo
Se añadió una solución de 5R-(terc-butil-dimetil-silaniloximetil)-pirrolidin-2-ona (Tetrahedron: Asymmetry, 1996, 7, 2113) (20,00 g, 87,19 mmol) en DMF (50 ml) a una mezcla de NaH (60% en aceite, 3,836 g, 0,0959 mmol, lavada con 20 ml de DMF) en DMF (50 ml). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas y se añadió una solución de 7-bromoheptanonitrilo (16,574 g, 87,19 mmol) en DMF (50 ml). La reacción se agitó a 90ºC durante 3 horas. La reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y se añadió agua (750 ml). La solución acuosa se lavó con EtOAc (4x250 ml). Las soluciones orgánicas reunidas se lavaron con agua (2x250 ml), se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron. La purificación por cromatografía de media presión eluyendo con un gradiente de disolvente (hexanos:EtOAc 9:1 hasta hexanos:EtOAc 7:3 hasta hexanos EtOAc 1:1) proporcionó 7-[2R-(terc-butil-dimetil-silaniloximetil)-5-oxo-pirrolidin-1-il]-heptanonitrilo (22,46 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 3,69-3,55 (m, 4H), 2,99 (m, 1H), 2,42 (m, 1H), 2,34-2,24 (m, 3H), 2,05 (m, 1H), 1,81 (m, 1H), 1,67-1,42 (m, 6H), 1,31 (m, 2H), 0,86 (s, 9H), 0,03 (s, 6H); EM 339,3 (M+1).
Etapa B
7-(2R-Hidroximetil-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanonitrilo
Se añadió lentamente una solución de fluoruro de tetrabutilamonio (1M en THF, 100,0 ml, 100,0 mmol) a una solución de 7-[2R-(terc-butil-dimetil-silaniloximetil)-5-oxo-pirrolidin-1-il]-heptanonitrilo (22,39 g, 66,13 mmol) en THF (400 ml) a 0ºC. La reacción se calentó hasta temperatura ambiente y se agitó durante 4 horas. Se añadió NaHCO_{3} acuoso saturado (250 ml) y los volátiles se eliminaron a vacío. La solución acuosa que quedó se lavó con CHCl_{3} (4x200 ml). Las soluciones orgánicas reunidas se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron. La purificación por cromatografía de media presión eluyendo con un gradiente de disolvente (hexanos:EtOAc 9:1 hasta hexanos:EtOAc 4:1 hasta hexanos:EtOAc 7:3 hasta hexanos:EtOAc 6:4 hasta hexanos:EtOAc 1:1 hasta EtOAc hasta EtOAc:MeOH 9:1) proporcionó 7-(2R-hidroximetil-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanonitrilo (14,922 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 3,78 (dd, 1H), 3,71-3,58 (m, 3H), 3,00 (m, 1H), 2,46 (m, 1H), 2,36-2,27 (m, 3H), 2,08 (m, 1), 1,93 (m, 1H), 1,77 (m, 1H), 1,68-1,43 (m, 6H), 1,32 (m, 2H); EM 225,1 (M+1).
Preparación 2 Éster etílico del ácido 7-(2R-hidroximetil-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico
Etapa A
Éster etílico del ácido 7-[2R-(terc-butil-dimetil-silaniloximetil) 5-oxo-pirrolidin-1-il]-heptanoico
Siguiendo el procedimiento descrito para la Preparación 1, Etapa A, se hizo reaccionar con 7-bromoheptanoato de etilo (32,559 g, 137,3 mmol) durante 3 horas a 90ºC el anión derivado de 5R-(terc-butil-dimetil-silaniloximetil)-pirrolidin-2-ona (30,000 g, 130,8 mmol) y NaH (60% en aceite, 5,756 g, 143,9 mmol) en DMF (600 ml). La purificación por cromatografía de media presión eluyendo con un gradiente de disolvente (hexanos:EtOAc 9:1 hasta hexanos EtOAc 4:1 hasta hexanos:EtOAc 7:3 hasta hexanos:EtOAc 6:4) proporcionó éster etílico del ácido 7-[2R-(terc-butil-dimetil-silaniloximetil)-5-oxo-pirrolidin-1-il]-heptanoico (39,46 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 4,10 (q, 2H), 3,62 (m, 4H), 2,95 (m, 1H), 2,42 (m, 1H), 2,27 (m, 3H), 2,04 (m, 1H), 1,81 (m, 1H), 1,65-1,26 (m, 8H), 1,23 (t, 3H), 0,86 (s, 9H), 0,03 (s, 6H); EM 386,2 (M+1).
Etapa B
Éster etílico del ácido 7-(2R-hidroximetil-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico
Siguiendo el procedimiento descrito para la Preparación 1, Etapa B, se desprotegió el éster etílico del ácido 7-[2R-(terc-butil-dimetil-silaniloximetil)-5-oxo-pirrolidin-1-il]-heptanoico (39,46 g, 102,3 mmol) con TBAF (1M en THF, 154,0 ml, 154,0 mmol) con un tiempo de reacción de 2,5 horas. La purificación por medio de cromatografía de media presión eluyendo con un gradiente de disolvente (hexanos:EtOAc 9:1 hasta hexanos:EtOAc 6:4 hasta hexanos:EtOAc 1:1 hasta EtOAc hasta EtOAc:MeOH 19:1) proporcionó éster etílico del ácido 7-(2R-hidroximetil-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico (25,41 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 4,10 (q, 2H), 3,77 (dd, 1H), 3,64 (m, 3H), 2,96 (m, 1H), 2,46 (m, 1H), 2,35-2,25 (m, 3H), 2,08 (m, 1H), 1,93 (m, 1H), 1,71 (m, 1H), 1,63-1,27 (m, 8H), 1,23 (t, 3H); EM 272,2 (M+1).
Preparación 3 Éster dimetílico del ácido [2-oxo-3-(3-trifluorometil-fenil)-propil]-fosfónico
Etapa A
N-Metoxi-N-metil-2-(3-trifluorometil-fenil)-acetamida
Se añadió trietilamina (2,25 ml) a una solución de clorhidrato de N,O-dimetilhidroxilamina (1,577 g, 16,2 mmol) en DMF (25 ml) y CH_{2}Cl_{2} (25 ml) a 0ºC. Después de agitar durante 5 minutos, se añadieron ácido 3- trifluorometilfenilacético (3,0 g, 14,7 mmol), HOBT (3,177 g, 23,5 mmol) y DEC (clorhidrato del cloruro de 2-dietilaminoetilo, 3,10 g, 16,2 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas y se concentró a vacío. El residuo se diluyó con EtOAc y la solución orgánica se lavó sucesivamente con NaOH 1N (2 veces), agua y salmuera. La solución orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró a vacío. La cromatografía de media presión (EtOAc al 20% en hexanos hasta EtOAc al 50% en hexanos) proporcionó N-metoxi-N-metil-2-(3-trifluorometil-fenil)-acetamida.
Etapa B
Éster dimetílico del ácido [2-oxo-3-(3-trifluorometil-fenil)-propil]-fosfónico
Se añadió lentamente n-BuLi (2,5M en hexanos, 28 ml, 70 mmol) a una solución de metilfosfonato de dimetilo (9,4 g, 75,8 mmol) en tolueno (80 ml) a -78ºC. La mezcla de reacción se agitó durante 1 hora y se añadió lentamente una solución de N-metoxi-N-metil-2-(3-trifluorometil-fenil)-acetamida (14,39 g) en tolueno (50 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 2,5 horas y se añadió AcOH (40 ml). La mezcla de reacción se calentó hasta temperatura ambiente y se añadió agua. La fase orgánica se lavó con agua, seguido por salmuera. La solución orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró a vacío. La cromatografía de media presión (CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 2% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó el compuesto del epígrafe de la Preparación 3 (9,37 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,52 (m, 1H), 7,44 (m, 2H), 7,37 (m, 1H), 3,96 (s, 2H), 3,87 (s, 3H), 3,76 (s, 3H), 3,12 (d, 2H).
Preparación 4 Éster dimetílico del ácido [3-(3-cloro-fenil)-2-oxo-propil]-fosfónico
Sustituyendo los materiales apropiados, se preparó el compuesto del epígrafe de la Preparación 4 siguiendo un procedimiento análogo al descrito para la Preparación 3.
Preparación 5 Éster dimetílico del ácido [3-(3-cloro-fenil)-2-oxo-propil]-fosfónico
Se añadió lentamente n-BuLi (2,5M, 64,2 ml, 160,6 mmol) a una solución de metilfosfonato de dimetilo (17,93 g, 144 mmol) en THF (270 ml) a -78ºC. La mezcla de reacción se agitó durante 1 hora y se añadió lentamente éster metílico del ácido (3-cloro-fenil)-acético (26,93 g, 146 mmol). La mezcla de reacción se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó durante 24 horas. Se añadió AcOH (15 ml) y los volátiles se eliminaron a vacío. El residuo se diluyó con CH_{2}Cl_{2} y la solución orgánica se lavó cuidadosamente con NaHCO_{3} acuoso saturado (3 veces). La fase orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró a vacío. La purificación por medio de cromatografía de media presión (EtOAc al 20% en hexanos hasta EtOAc) proporcionó el compuesto del epígrafe (9,28 g).
Preparación 6 Tetrahidro-pirrolizin-3,5-diona
El compuesto del epígrafe de la Preparación 6 se preparó siguiendo el procedimiento descrito en la patente de Estados Unidos número 4.663.464.
Preparación 7 Éster etílico del ácido 7-(2R-formil-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico
Se añadió clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (3,46 g, 18,03 mmol) y DMSO (1,5 ml, 24,04 mmol) a una solución de éster etílico del ácido 7-(2R-hidroximetil-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico (1,63 g, 6,01 mmol) en benceno (50 ml). La solución se enfrió hasta 0ºC y se añadió trifluoroacetato de piridinio (1,28 g, 6,61 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 0ºC durante 15 minutos y luego a temperatura ambiente durante 2 horas. La solución se decantó del residuo oleoso. El residuo se lavó con benceno (3 veces) y las aguas de lavado del benceno reunidas se concentraron a vacío proporcionando el éster etílico del ácido 7-(2R-formil-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico, que se usó sin purificación posterior.
Preparación 8 Éster metílico del ácido 4-(3-{2-[4-bifenil-3-il-3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-propil)-benzoico
Etapa A
5-(3-Bromo-3-oxo-butil)-pirrolidin-2-ona.
Se añadió bromuro de 3-bromobencilmagnesio (0,25 M en Et_{2}O, 155 ml, 38,8 mmol), gota a gota, a una solución de tetrahidropirrolizin-3,5-diona (5 g, 36 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (320 ml) a 0ºC. La solución se agitó a 0ºC durante 2 horas y se inactivó con cloruro amónico acuoso saturado. Se añadió HCl 1N acuoso para llegar a un pH de 3. Después de calentar hasta temperatura ambiente, la solución acuosa se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (3 veces). Los extractos orgánicos reunidos se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron. La purificación por cromatografía de media presión usando un gradiente de disolvente (hexanos:EtOAc 1:1 hasta EtOAc hasta MeOH al 5% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó 5-(3-bromo-3-oxo-butil) -pirrolidin-2-ona (7,84 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,41-7,11 (m, 4H), 6,24 (s ancho, 1H), 3,67 (s, 2H), 3,60 (m, 1H), 2,52 (t, 2H), 2,32 (m, 2H), 2,20 (m, 1H), 1,88-1,60 (m, 3H).
Etapa B
5-(3-Bromo-3-hidroxi-butil)-pirrolidin-2-ona
Se añadió NaBH_{4} (480 mg, 12,6 mmol) a una solución de 5-(3-bromo-3-oxo-butil)-pirrolidin-2-ona (7,84 g, 25,3 mmol) en EtOH (130 ml) a 0ºC y la reacción se agitó a 0ºC durante 2,5 horas. La reacción se inactivó con cloruro amónico acuoso saturado. Se añadieron agua y CH_{2}Cl_{2}. La fase acuosa se lavó con CH_{2}Cl_{2} (3 veces) y los extractos orgánicos reunidos se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron. La purificación por cromatografía de media presión usando un gradiente de disolvente (hexanos:EtOAc 1:1 hasta EtOAc hasta MeOH al 1% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 3% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 5% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 8% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó 5-(3-bromo-3-hidroxi-butil)-pirrolidin-2-ona (6,76 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,36-7,09 (m, 4H), 6,27 (d, 1H), 3,78 (m, 1H), 3,63 (m, 1H), 2,75 (m, 1H), 2,62 (m, 1H), 2,32- 2,18 (m, 3H), 1,88 (m, 1H), 1,73-1,42 (m, 5H); EM 312,2, 314,1 (M+).
Etapa C
5-[3-Bromo-3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-butil]-pirrolidin-2-ona
Se añadió cloruro de terc-butildimetilsililo (3,59 g, 23,8 mmol), seguido por imidazol (2,95 g, 43,3 mmol) y DMAP (264 mg, 2,16 mmol) a una solución de 5-(3-bromo-3-hidroxi-butil)-pirrolidin-2-ona (6,76 g, 21,6 mmol) en DMF (86 ml). La reacción se agitó durante 24 horas y se inactivó con cloruro amónico acuoso saturado. La solución acuosa se lavó con EtOAc (3 veces) y los extractos orgánicos reunidos se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron. La purificación por cromatografía de media presión usando un gradiente de disolvente (CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 1% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 3% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 5% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 8% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó 5-[3-bromo-3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)- butil]-pirrolidin-2-ona (7,45 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,30 (m, 2H), 7,12 (m, 1H), 7,04 (m, 1H), 5,71 (m, 1H), 3,81 (m, 1h), 3,56 (m, 1H), 2,66 (m, 2H), 2,32-2,17 (m, 3H), 1,70-1,35 (m, 5H), 0,82 (s, 9H), -0,06 (d, 3H), - 0,24 (d, 3H); EM 426,2, 428,2 (M+).
\newpage
Etapa D
5-[4-Bifenil-3-il-3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-butil]-pirrolidin-2-ona
Se añadió ácido fenilborónico (236 mg, 1,93 mmol) a una solución de 5-[3-bromo-3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-butil]-pirrolidin-2-ona (750 mg, 1,76 mmol) en DME (15 ml). Se añadieron acetato de paladio (26,8 mg, 0,088 mmol) y tri-o-tolilfosfina (39,5 mg, 0,176 mmol), seguido de una solución de Na_{2}CO_{3} (37,3 mg, 3,52 mmol) en agua (1,8 ml). La reacción se calentó a reflujo durante 24 horas. La reacción se enfrió y los volátiles se eliminaron a vacío. El residuo se diluyó con salmuera y EtOAc. La solución acuosa se lavó con EtOAc (3 veces) y los extractos orgánicos reunidos se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron. La purificación por cromatografía de media presión eluyendo con un gradiente de disolvente (hexanos:EtOAc 1:1 hasta EtOAc hasta MeOH al 1% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 3% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 5% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó 5-[4-bifenil-3-il-3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-butil]-pirrolidin-2-ona (717,3 mg). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,57 (m, 2H), 7,43 (m, 2H), 7,33 (m, 3H), 7,11 (m, 2H), 5,78 (m, 1H), 3,91 (m, 1H), 3,59 (m, 1H), 2,76 (m, 2H), 2,27 (m, 3H), 1,73-1,38 (m, 5H), 0,83 (s, 9H), -0,03 (d, 3H), -0,16 (d, 3H); EM 424,3 (M+1).
Preparación 9 5-[3-(terc-Butil-dimetil-silaniloxi)-4-(3-fluoro-fenil)-butil]-pirrolidin-2-ona
Etapa A
5-[4-(3-Fluoro-fenil)-3-oxo-butil]-pirrolidin-2-ona
Siguiendo el procedimiento descrito para la Preparación 8, Etapa A, se hizo reaccionar tetrahidro-pirrolizin-3,5-diona (2 g, 14 mmol) con cloruro de 3-fluorobencilmagnesio (0,25M en Et_{2}O, 62 ml, 15,5 mmol) durante 2,5 horas. La purificación por cromatografía de media presión usando un gradiente de disolvente (hexanos:EtOAc 1:1 hasta EtOAc:hexanos 2:1 hasta EtOAc hasta MeOH al 2% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 10% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó 5-[4-(3-fluoro-fenil)-3-oxo-butil]-pirrolidin-2-ona (2,1730 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,32-7,27 (m, 1H), 7,00-6,90 (m, 3H), 6,12 (s ancho, 1H), 3,69 (s, 2H), 3,59 (m, 1H), 2,52 (t, 2H), 2,30 (m, 2H), 2,19 (m, 1H), 1,75 (m, 2H), 1,65 (m, 1H).
Etapa B
5-[4-(3-Fluoro-fenil)-3-hidroxi-butil]-pirrolidin-2-ona
Siguiendo el procedimiento descrito para la Preparación 8, Etapa B, se redujo 5-[4-(3-fluoro-fenil)-3-oxo-butil]-pirrolidin-2-ona (2,17 g, 8,71 mmol) con NaBH_{4} (165 mg, 4,35 mmol). La purificación por cromatografía de media presión usando un gradiente de disolvente (hexanos:EtOAc 1:1 hasta EtOAc hasta MeOH al 1% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 3% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 6% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó 5-[4-(3-fluoro-fenil)-3-hidroxi-butil]-pirrolidin-2-ona (2,23 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,27 (m, 1H), 6,94 (m, 3H), 6,38 (m, 1H), 3,82 (m, 1H), 3,66 (m, 1H), 2,79 (m, 1H), 2,67 (m, 1H), 2,33-2,21 (m, 3H), 1,92 (d, J=4,15 Hz, 1H), 1,75-1,40 (m, 5H); EM 252,2 (M+1).
Etapa C
5-[3-(terc-Butil-dimetil-silaniloxi)-4-(3-fluoro-fenil)-butil]-pirrolidin-2-ona
Siguiendo el procedimiento descrito para la Preparación 8, Etapa C, se hizo reaccionar la 5-[4-(3-fluoro-fenil)-3-hidroxi-butil]-pirrolidin-2-ona (2,23 g, 8,87 mmol) con cloruro de terc-butildimetilsililo (1,47 g, 9,76 mmol). La purificación por cromatografía de media presión usando un gradiente de disolvente (hexanos:EtOAc 1:1 hasta EtOAc hasta MeOH al 1% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 2% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 4% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó 5-[3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-4-(3-fluoro-fenil)-butil]-pirrolidin-2-ona (2,84 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,23 (m, 1H), 6,88 (m, 3H), 5,75 (m, 1H), 3,85 (m, 1H), 3,57 (m, 1H), 2,71 (m, 2H), 2,30 (m, 2H), 2,25 (m, 1H), 1,70-1,38 (m, 5H), 0,84 (s, 9H), 0 (s, 3H), -0,2 (s, 3H).
Preparación 10 5-[3-(terc-Butil-dimetil-silaniloxi)-4-(4-fluoro-fenil)-butil]-pirrolidin-2-ona
Etapa A
5-[4-(4-Fluoro-fenil)-3-oxo-butil]-pirrolidin-2-ona
Siguiendo el procedimiento descrito para la Preparación 8, Etapa A, se hizo reaccionar tetrahidro-pirrolizin-3,5-diona (1,41 g, 10,1 mmol) con cloruro de 4-fluorobencilmagnesio (0,25M en Et_{2}O, 50 ml, 12,5 mmol) durante 5 horas. La purificación por cromatografía de media presión (MeOH al 2% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó 5-[4-(4-fluoro-fenil)-3-oxo-butil]-pirrolidin-2-ona (2,64 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,18 (m, 2H), 7,03 (m, 2H), 6,34 (m, 1H), 3,70 (s, 2H), 3,62 (m, 1H), 2,54 (t, 2H), 2,34-2,15 (m, 3H), 1,82-1,61 (m, 3H).
Etapa B
5-[4-(4-Fluoro-fenil)-3-hidroxi-butil]-pirrolidin-2-ona
Siguiendo el procedimiento descrito para la Preparación 8, Etapa B, se redujo 5-[4-(4-fluoro-fenil)-3-oxo-butil]-pirrolidin-2-ona (2,64 g, mmol) con NaBH_{4} (400 mg, mmol) a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadió más NaBH_{4} (150 mg) y la reacción se agitó durante 20 horas. La purificación por cromatografía de media presión usando un gradiente de disolvente (CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 2% en CH_{2}Cl_{2} hasta MeOH al 4% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó 5-[4-(4-fluoro-fenil)-3-hidroxi-butil]-pirrolidin-2-ona (2,01 g). RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,14 (m, 2H), 6,98 (m, 2H), 6,78 (m, 1H), 3,76 (m, 1H), 3,65 (m, 1H), 2,76 (m, 1H), 2,64 (m, 1H), 2,32-2,18 (m, 4H), 1,72-1,47 (m, 5H).
Etapa C
5-[3-(terc-Butil-dimetil-silaniloxi)-4-(4-fluoro-fenil)-butil]-pirrolidin-2-ona
Siguiendo el procedimiento descrito para la Preparación 8, Etapa C, se hizo reaccionar la 5-[4-(4-fluoro-fenil)-3-hidroxi-butil]-pirrolidin-2-ona (1,95 g, 7,79 mmol) con cloruro de terc-butildimetilsililo (1,47 g, 9,76 mmol). La purificación por cromatografía de media presión usando un gradiente de disolvente (MeOH al 1% en CH_{2}Cl_{2}) proporcionó 5-[3-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-4-(4-fluoro-fenil)-butil]-pirrolidin-2-ona. RMN de ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,12 (m, 2H), 6,97 (m, 2H), 5,75 (m, 1H), 3,83 (m, 1H), 3,60 (m, 1H), 2,71 (m, 2H), 2,36-2,24 (m, 3H), 1,70-1,38 (m, 5H), 0,84 (s, 9H), -0,05 (d, 3H), -0,2 (d, 3H).
Preparación 11 Éster dimetílico del ácido [2-oxo-3-(3-fenoxi-fenil)-propil]-fosfónico
El compuesto del epígrafe de la Preparación 11 se preparó de forma análoga a la descrita para el compuesto de la Preparación 5, sustituyendo los materiales apropiados.

Claims (10)

1. Uso de un agonista selectivo del receptor EP4 de Fórmula I:
15
o de una de las sales farmacéuticamente aceptables de dicho compuesto, en la que:
Q es COOR^{3}, CONHR^{4} o tetrazol-5-ilo;
A es un enlace sencillo o cis-doble;
B es un enlace sencillo o trans-doble;
=U es
16
R^{2} es \alpha -tienilo, fenilo, fenoxi, fenilo monosustituido o fenoxi monosustituido, siendo dichos sustituyentes cloro, fluoro, fenilo, metoxi, trifluorometilo o alquilo C_{1}-C_{3};
R^{3} es hidrógeno, alquilo C1-C5, fenilo o p-bifenilo;
R^{4} es COR^{5} o SO_{2} R^{5}; y
R^{5} es fenilo o alquilo C_{1}-C_{5};
o de ácido 7-{2R-[3-hidroxi-4-(3-fenoxifenil)but-1-enil]-5-oxopirrolidin-1-il}-heptanoico o ácido 7-{2S-[3-hidroxi-4-(3-fenoxifenil)butil]-5-oxopirrolidin-1-il}-heptanoico;
para la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno que cursa con masa ósea reducida.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que Q es 5-tetrazolilo y =U es
17
3. Uso según la reivindicación 2, en el que el compuesto de Fórmula I es 5R-(3S-hidroxi-4-fenil-but)-1-enil)-1-[6-(1H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona, 5S-(3R-hidroxi-4-fenil-butil)-1-[6-(1H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona, 5S-(4-(3-clorofenil)-3R-hidroxi-butil)-1-(6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil-pirrolidin-2-ona o 5S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-1-(6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil)-pirrolidin-2-ona.
4. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho agonista selectivo del receptor EP4 es un compuesto de Fórmula I, siendo Q COOH y =U es
18
5. Uso según la reivindicación 4, en el que dicho compuesto es ácido 7-(2S-(3R-hidroxi-4-fenil-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico, ácido 7-[2R-(3S-hidroxi-4-fenil-but-1-enil)-5-oxo-pirrolidin-1-il]-heptanoico, ácido 7-{2S-
[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico, ácido 7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico, ácido 7-(2S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico o ácido 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico.
6. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho trastorno es osteoporosis, fragilidad, una fractura osteoporótica, un defecto óseo, pérdida ósea idiopática de la infancia, pérdida ósea alveolar, pérdida ósea mandibular, fractura ósea, osteotomía, pérdida ósea asociada con periodontitis o recrecimiento protésico.
7. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el medicamento está destinado a la administración local o sistémica.
8. Un compuesto seleccionado de ácido 7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-hepta-
noico; ácido 7-(2S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-5-oxo-pirrolidin-1-il)-heptanoico; ácido 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico; 5S-(4-(3-(cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil)-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona; y 5S-(3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil)-1-(6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil)-
pirrolidin-2-ona.
9. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto según la reivindicación 8 y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
10. Un compuesto según la reivindicación 8 para su uso como medicamento.
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