ES2204885T3 - Medio de cultivo para celulas de ovario de hamster chino (cho) y celulas cho adaptadas. - Google Patents

Medio de cultivo para celulas de ovario de hamster chino (cho) y celulas cho adaptadas.

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ES2204885T3 ES91309596T ES91309596T ES2204885T3 ES 2204885 T3 ES2204885 T3 ES 2204885T3 ES 91309596 T ES91309596 T ES 91309596T ES 91309596 T ES91309596 T ES 91309596T ES 2204885 T3 ES2204885 T3 ES 2204885T3
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Abstract

UN MEDIO DE CULTIVO BIOQUIMICAMENTE DEFINIDO PARA CULTIVAR LINEAS DE CELULAS DE OVARIOS DE HAMSTER CHINOS (OHC), QUE ESTA ESENCIALMENTE LIBRE DE PROTEINAS, LIPIDOS Y CARBOHIDRATOS AISLADAS DE UNA FUENTE ANIMAL, QUE CONSTA DE AGUA, UN REGULADOR DE OSMOLATILIDAD, UN TAMPON, UNA FUENTE DE ENERGIA, AMINO ACIDOS INCLUYENDO L-GLUTAMINA, UNA FUENTE INORGANICA O DE HIERRO RECOMBINANTE, Y UN FACTOR DE CRECIMIENTO RECOMBINANTE O SINTETICO, Y OPCIONALMENTE VITAMINAS Y CO-FACTORES DE IONES DE HIERRO METALICOS; TAMBIEN CELULAS ADAPTADAS PARA CRECER EN DICHO MEDIO DE CULTIVO.

Description

Medio de cultivo para células de ovario de hámster chino (CHO) y células CHO adaptadas.
La presente invención se refiere a un medio de cultivo definido bioquímicamente para cultivar líneas de células de ovario de hámster chino (OHC) y células adaptadas para crecer en el medio de cultivo.
Las líneas de células de ovario de hámster chino (OHC) fueron cultivadas, primeramente, por Puck (J. Exp. Med. 108, 945, 1958) a partir de una biopsia de un ovario de una hembra de hámster chino. De estas células originales, varios profesionales clonaron un cierto número de sub-líneas con varias deficiencias, una de las cuales, OHC-K1, carece de prolina y es diploide por el gen de la dihidrofolato reductasa (dhfr). A partir de esta línea de células se desarrolla una línea de células OHC dhfr (OHC DUK B11), (PNAS 77, 1980, 4216-4220) que se caracteriza por la pérdida de la función dhfr como consecuencia de una mutación en un gen dhfr y la subsiguiente pérdida del otro gen. Estas células son funcionalmente dhfr^{-}. Se han obtenido, como resultado, otras sub-líneas OHC DUK que también son fenotípicamente dhfr^{-}. Las células OHC que son dhfr^{-} no pueden crecer sin precursores de nucleótidos tales como timidina, hipoxantina, o los nucleosidos equivalentes.
En dichas células OHC se han expresado diversas proteínas que incluyen el gen XGPRT E. Coli (J. Mol. App. Gen. 1981, 1, 165-175), el activador de plasminógeno tipo-tejido humano (Mol. & Cell Biol. 5, 1750-1759, 1985), el interferón inmune (\gamma) humano (PNAS 80 pp 4654-4658), y el interferón beta humano (Molecular and Cellular Biology 4, 166-172, 1984). Una línea celular OHC dhfr^{-} se transfecta con un gen producto y un gen dhfr, lo cual permite la selección de transformantes de células OHC del fenotipo dhfr^{+}. La selección se lleva a cabo cultivando las colonias en medios carentes de timidina e hipoxantina, cuya ausencia impide que crezcan las células no transformadas. Las transformantes expresan normalmente niveles bajos del gen producto en virtud de la co-integración de ambos genes transfectados. Los niveles de expresión para el gen producto se pueden incrementar por amplificación, usando metotrexato. Este fármaco es un inhibidor directo de la enzima dhfr y permite el aislamiento de las colonias resistentes, las cuales han amplificado suficientemente su numero de copias del gen dhfr como para sobrevivir bajo estas condiciones. Puesto que los genes producto y dhfr están por lo general estrechamente relacionados en los transformantes originales, hay normalmente una amplificación concomitante que da como resultado un incremento de la expresión del gen producto deseado.
Un sistema diferente de selección y amplificación se proporciona mediante el marcador genético glutamina sintetasa (o GS), el cual se describe en el documento de patente WO87/04462. Las células OCH que han sido transfectadas con éxito con el gen que codifica la enzima GS y el gen del anticuerpo deseado se pueden seleccionar cultivando colonias en medio carente de glutamina y amplificando mediante la adición de metioninsulfoximina (Msx) como se describe en la solicitud PCT publicada con el número WO87/04462.
Las células OHC diseñadas (aquellas en las cuales una línea de células OHC se transfecta con un gen producto y un gen marcador genético) crecen normalmente en medios de cultivo que contienen suero. (Referencias: J. Mol. App. Gen. 1981, 1, 165-175; Mol. & Cell Biol. 5, 1750-1759, 1985; PNAS 80 pp 4654-4658; Molecular and Cellular Biology 4, 166-172, 1984). El suero de ternera fetal (SBF) es probablemente el suero mas ampliamente utilizado para el cultivo de células de mamíferos, aunque se usan otros sueros de mamíferos. Sin embargo, el uso de suero plantea una serie de problemas. El suero es un producto caro, el cual no es fácil de conseguir en las cantidades necesarias para la producción comercial. Es también un material bioquímicamente no definido. Se sabe que el suero contiene muchos componentes mayoritarios que incluyen albúmina y transferrina y también componentes minoritarios muchos de los cuales no han sido completamente identificados ni sus acciones determinadas, así pues el suero diferirá de lote a lote necesitando, posiblemente, análisis para determinar los niveles de los diversos componentes y sus efectos sobre las células. A menudo, el suero está contaminado con microorganismos tales como virus y micoplasma, muchos de los cuales pueden ser inofensivos pero representarán un factor adicional desconocido. Este problema se ha vuelto más serio en los últimos años con la Encefalopatía Espongiforme Bovina (ESB). A pesar de las mejoras en la detección precoz, es probable que las autoridades reguladoras exijan que los productos bovinos procedan de aquellas áreas que estén libres de infecciones (ESB).
Además, la presencia de proteínas animales en el medio de cultivo puede necesitar largos procedimientos de purificación, en particular la presencia de anticuerpos bovinos en la albúmina de suero bovino (ABS), hace la purificación del anticuerpo deseado expresado por la línea de células OHC recombinante, extremadamente difícil. Es posible eliminar el anticuerpo bovino del medio antes de usarlo, pero este y los productos de análisis adicionales requeridos, aumentan en gran medida el coste global de la producción del producto. Consecuentemente, se ha investigado mucho para encontrar un medio de cultivo desprovisto de componentes de procedencia animal que apoyara el crecimiento celular, especialmente de células OHC. Desgraciadamente, los problemas relacionados con la provisión de un medio de este tipo son numerosos en sí mismos. Las células OHC no crecen fácilmente en condiciones libres de suero. Además, la separación del suero puede eliminar también esos componentes que proporcionan protección celular y actividad desintoxicante.
Mendiaz et al (in vitro Cellular & Development Biology Vol.22, No.2, 1986) describen un medio de cultivo sin suero pero que no está libre de componentes de procedencia animal, para su uso en el cultivo de células OHC K1. El medio es una modificación del medio desarrollado por Ham (Microbiology 53, 288-293, 1965), el cual se conoce como "F12 de Ham". Otros ejemplos de medios se han basado en el medio F12 de Ham como por ejemplo el divulgado en EPA390327 y EP325190. Estos medios contienen transferrina como sustitutivo del suero, pero aunque la transferrina es un derivado de procedencia animal, el medio resultante no presenta los problemas de contaminación relacionados con el uso del suero. Un problema adicional que surge con el uso de medios desprovistos de suero es el de las células OHC recombinantes de apoyo que hacen posible el crecimiento y la expresión del producto. Los medios basados en el F12 de Ham que no se suplementan con suero, generalmente no son suficientemente enriquecedores para apoyar el crecimiento completo o la expresión.
Las células OHC diseñadas son también difíciles de crecer en suspensión. Es muy deseable alcanzar el crecimiento en suspensión cuando se usan células para expresar un producto tal como un anticuerpo. Para la producción de una proteína biológica a escala comercial es preferible poder apoyar el crecimiento en fermentadores que van desde vasos de vidrio de 1 litro a tanques de acero inoxidable de muchos miles de litros. Un medio adecuado debe poder mantener las células frente a simples fuerzas procedentes de impulsores de aspas o turbinas y de efectos de barboteado (es decir, suministro de aire, oxigeno y CO_{2} en forma de burbujas directamente al medio).
La presente invención, además, proporciona un medio de cultivo bioquímicamente definido para cultivar células de OHC diseñadas, que esta esencialmente libre de proteínas, lípidos e hidratos de carbono aislados de una fuente animal, que comprende agua, un regulador de osmolalidad, un tampón, una fuerte de energía, aminoácidos que incluyen L-glutamina, una fuerte inorgánica o de hierro recombinante y un factor de crecimiento sintético o recombinante y opcionalmente iones metálicos no ferrosos, vitaminas y cofactores.
Los componentes del medio son en su mayoría inorgánicos, sintéticos o recombinantes y como tales no se obtienen directamente de ninguna fuente animal. Algunos componentes se pueden obtener de una fuente bacteriana o vegetal. Los componentes recombinantes se preparan bajo altas condiciones de pureza para minimizar el riesgo de contaminación procedente de los tejidos de partida al pasar a las células utilizadas para producir los componentes. Se pueden emplear etapas de purificación adicionales para separar las proteínas de las células. De ese modo, se puede conseguir un medio que está esencialmente libre de todas las proteínas, lípidos e hidratos de carbono aislados a partir de una fuente animal. Los medios de cultivos preferidos de la invención no contienen proteínas, lípidos e hidratos de carbono aislados a partir de una fuente animal.
Es ventajoso mantener la osmolalidad en el intervalo 200-350 mOsm preferiblemente en el intervalo 290-350 mOsm. Los reguladores de osmolalidad son generalmente sales. Aquellas que se pueden usar en el medio incluyen ClNa, ClK, NO_{3}K.
Los tampones se usan en el medio para mantener el pH en el intervalo de 6,5-7,5, lo mas preferentemente alrededor de 7,0. Los tampones de uso en el medio incluyen carbonatos tales como CO_{3}HNa; también, cloruros, sulfatos y fosfatos tales como Cl_{2}Ca.2H_{2}O, SO_{4}Mg.7H_{2}O, PO_{4}H_{2}Na.2H_{2}O, o piruvato sódico, estando tales tampones generalmente presentes en una cantidad de 50-500 mg/litro. Otros tampones, tales como el ácido N-[2-hidroxietil]piperazina-N'-[2-etanosulfónico] conocido también como HEPES y el ácido 3-[N-morfolino]-propanosulfónico, también conocido como MOPS, están generalmente presentes en una cantidad de 1000-10.000 mg/litro.
La fuente de energía de uso en el medio está generalmente presente en una cantidad de 1000-10.000 mg/litro y es preferiblemente un monosacárido como por ejemplo manosa, fructosa, galactosa o maltosa, más preferiblemente glucosa, particularmente D-glucosa.
Los iones metálicos no ferrosos de uso opcional en el medio incluyen magnesio, cobre y zinc; también sodio, potasio y selenio. Los iones generalmente se añaden al medio en forma de sales tales como cloruros y sulfatos. Las cantidades son normalmente similares a aquellas proporcionadas en el medio ISCOVES presentado en la Tabla 1, pero evidentemente se pueden variar.
Las vitaminas y vitaminas cofactores enzimáticos (cofactores) de uso opcional en el medio incluyen vitamina B_{6} (piridoxina), vitamina B_{12} (cianocobalamina) y vitamina K (biotina), presentes en una cantidad de 10-30 mg/litro, vitamina B_{2} (riboflavina) presente en una cantidad de 0,1-10 mg/litro y vitamina B_{1} (tiamina), nicotinamida, vitamina B_{5} (D-pentotenato cálcico), ácido fólico, i-inositol generalmente presentes en una cantidad de 0,2-0,8 mg/litro.
En el medio basal se incluye un factor lipídico como cloruro, ácido lipoico, ácido oleico, fosfatidilcolina o metil lineoleato generalmente en una cantidad de 0,05-10 mg/litro. Se pueden añadir también compuestos que participan en la producción de lípidos, por ejemplo alcoholaminas como la etanolamina.
Es preferible incluir en el medio aminoácidos adicionales seleccionados de:
1
Se prefieren las formas puestas entre paréntesis.
Los aminoácidos son preferiblemente de origen sintético. Las cantidades que normalmente se incluyen varían para cada aminoácido, pero generalmente están en el intervalo de 10-150 mg/ml. Sin embargo, la L-glutamina está presente generalmente a mucha más alta concentración, preferiblemente en el intervalo de 400-600 mg/ml.
Puede ser ventajoso incluir en el medio un indicador de pH, por ejemplo sal sódica de rojo fenol, por ejemplo a 5-50 mg/litro.
El medio A como se presenta en la Tabla 1, es un ejemplo de un medio que proporciona las cantidades preferidas de agua, regulador de osmolalidad, tampón, fuente de energía, aminoácidos, iones metálicos no ferrosos, vitaminas y cofactores como base para un medio de cultivo según la invención. Este medio no contiene hipoxantina o timidina y esta comercialmente disponible de GIBCO Ltd., Unit 4, Cowley Mill Td. Est., Uxbridge UB8 2YG. Es similar a un medio de cultivo publicado (Iscoves and Melcher (1978) J.Exp.Med. 1. 47,923), pero no contiene albúmina de suero bovino, transferrina humana pura o lecitina de soja.
TABLA 1
2
3
La modificación de Iscoves DMEM N. and Melcher (1978), J. Exp. Med. 1.47, 923.
Es preferible añadir al medio selenio (opcionalmente en forma de selenito sódico), generalmente en una cantidad de 0,01-0,2 mg/litro ó ácido L-ascórbico generalmente en una cantidad de 20-50 mg/litro, para ayudar a minimizar los efectos tóxicos potenciales de los iones férricos o ferrosos, y el oxigeno. Además, el uso de agentes quelantes como citrato o ácido etilendiaminotetracético (EDTA) o un captador de radicales libres como alfa-tocoferol (vitamina E), es ventajoso para reducir el daño causado por los radicales libres.
Se pueden añadir al medio antibióticos tales como polimixina, neomicina, penicilina o estreptomicina para prevenir la contaminación bacteriana. Estos, normalmente se incluyen en cantidades de 10.000-100.000 UI/litro.
Los factores de crecimiento que se pueden añadir al medio basal son sintéticos o recombinantes e incluyen la insulina. Se pueden incluir otros factores tales como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), tiroxina T_{3}, trombina, interleucinas tales como IL2 y IL6, progesterona, hidrocortisona y vitamina E. Para mejorar el crecimiento de las células se puede añadir ácido fólico, vitamina B6 y vitamina B12, las cuales están involucradas en la ruta del folato.
La hormona peptídica insulina (la cual en el presente contexto incluye análogos de la misma tal como Nucellin (marca registrada de Eli Lilly) se obtiene ventajosamente por técnicas de ADN recombinante, pero no se aísla a partir de una fuente animal. Preferentemente, se añade al medio en una cantidad de 5 \mug-5 mg/litro. Nucellin es la forma de insulina preferente para usar en la invención.
La fuente de hierro que no procede de animales que se usa para complementar el medio, es preferentemente inorgánica y se presenta en una cantidad de 0,25-5 mg/litro. Los ejemplos incluyen sales ferrosas y férricas tales como citrato férrico y sulfato ferroso. Los preferidos son las sales de quelatos tales como citrato férrico y citrato de amonio férrico. No obstante, se puede usar cualquier fuente de hierro que no esté aislada a partir de una fuente animal, por ejemplo, quelantes de hierro químicos o portadores de hierro de proteínas recombinantes.
La concentración de iones férricos y ferrosos se debe controlar cuidadosamente, al poder éstos contribuir a producir superóxidos y radicales libres en el medio, los cuales pueden dañar no sólo las células en sí, sino también componentes del medio y el producto final deseado.
También es preferible añadir al medio, un componente tal como putrescina, ventajosamente como una sal tal como ClH, la cual se sabe que juega un papel en el mantenimiento de la estructura del retículo endoplásmico y que ciertas líneas de células OHC la necesitan para mantener el crecimiento. Preferentemente, la putrescina o una sal de la misma se añade en una cantidad de 0,01-1,0 mg/litro.
Hasta la fecha, los medios sin suero divulgados contienen hipoxantina o timidina. Esto puede interrumpir la presión selectiva puesta en el sistema de amplificación y selección de dhfr, como se ha descrito anteriormente. El resultado puede ser la perdida del material genético que expresa el producto y los genes dhfr. Por lo tanto, en otro aspecto de la invención se ha proporcionado un medio de cultivo para el crecimiento de células OHC dhfr^{-} de diseño según la invención, esencialmente libre de hipoxantina y/o timidina.
El medio de cultivo de la presente invención apoya el crecimiento de células OHC y cuando se complementa con un agente adecuado tal como metotrexato para el sistema dhfr, normalmente en una cantidad 0,1-5,0 \muM, (o MSX para el sistema GS), permite una presión selectiva completa que se ejerce sobre las células. Se entenderá que la hipoxantina y la timidina, a concentraciones que son insuficientes para interrumpir la selección del sistema dhfr pueden estar presentes en el medio, pero no se prefiere la presencia de estos dos precursores nucleótidos para usar en la presente invención.
En fermentadores a gran escala, las células de mamíferos son particularmente susceptibles a las simples fuerzas que provienen del barboteo de los vasos con gases y de la mezcla con el impulsor. Para minimizar la ocurrencia de daño celular es ventajoso que el medio contenga un protector celular tal como polietilenglicol, alcoholes pilivinílicos o polioles plurónicos. De estos, se prefiere el poliol F68 Pluronic (marca registrada de BASF Wyandotte Corp) ya que a diferencia de los alcoholes polivinílicos, este no es una substancia tóxica y a diferencia de los polietilenglicoles no interfiere con la purificación aguas abajo.
Además, se pueden obtener mejoras en el crecimiento de células de OHC, suplementando el medio con un péptido digerido, hidrolizados o extractos, tales como Triptona, hidrolizado de caseína, extracto de levadura, o preferentemente peptona de soja digerida con papaína. Las cantidades preferidas son de 1%-0,025% p/v, más preferentemente 0.25% p/v.
Los medios de la invención para el cultivo células OHC recombinantes son capaces de apoyar el crecimiento y la secreción del producto a partir de tales células en suspensión en fermentadores a pequeña y gran escala, en cultivos estáticos y/o agitados. El medio de cultivo según la invención es también capaz de apoyar el crecimiento de células a densidad celular alta, particularmente más de 1 x 10^{5} células/ml hasta o más de 1,5 x 10^{6} células/ml y secreción de producto de 30 mg/l hasta más de 150 mg/l. El medio según la invención es también capaz de apoyar este crecimiento y la secreción de producto en múltiples pases que duran hasta ó más de 6 meses.
El medio se prefiere para la producción de todo tipo de anticuerpos naturales y alterados. La invención, por lo tanto, incluye la producción de anticuerpos humanos en los que las secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera son homólogas con esas secuencias de anticuerpos producidas por linfocitos humanos in vivo, o in vitro mediante hibridomas. También, siempre que sean anticuerpos híbridos en los cuales la cadena pesada y ligera sean homólogas a un anticuerpo natural pero estén combinadas de una manera que no ocurriría de modo natural. Por ejemplo, un anticuerpo biespecífico tiene sitios específicos de unión antigénica para más de un antígeno. La región constante del anticuerpo puede estar vinculada a una u otra de las regiones de unión antigénica ó puede proceder de un anticuerpo adicional. Los anticuerpos alterados, por ejemplo anticuerpos híbridos, tienen regiones variables de un anticuerpo y regiones constantes de otro. De ese modo, los anticuerpos híbridos pueden ser especies/híbridos de especies ó clases/híbridos de clases. Tales anticuerpos híbridos pueden tener una o más modificaciones ulteriores para mejorar la capacidad de unión antigénica o para modificar el funcionamiento efector. Los anticuerpos injertados-CDR o los humanizados se incluyen dentro de la invención, en particular Campath 1H (EP328404) (Campath es una marca registrada de The Wellcome Foundation), así como anticuerpos compuestos, en los que partes de las regiones hipervariables, además de a las CDRs, se transfieren a la estructura humana. Se pueden alterar aminoácidos adicionales en la estructura o regiones constantes de tales anticuerpos. La invención, por otro lado, incluye la producción de fragmentos Fab, los cuales son mas o menos equivalentes a las porciones ramificadas Y de las cadenas pesada y ligera; esto incluye fragmentos incompletos o fragmentos que incluyen parte de la región Fc.
En un aspecto adicional de la invención se proporciona una célula OHC de diseño adaptada para crecer en un medio según la invención. En particular una célula OHC diseñada para expresar proteínas tales como un activador de plasminógeno tisular o anticuerpos como los definidos anteriormente. En particular la invención proporciona una línea de células OHC-dhfr transfectadas con un gen que codifica una proteína biológicamente activa y un gen marcador genético dhfr, adaptado para crecer en un medio de cultivo según la invención. La proteína es preferentemente un anticuerpo según se ha definido anteriormente.
Los ingredientes del medio de cultivo se pueden añadir en cualquier orden pero es preferible añadir la fuente de hierro y por último, en el momento en que se use, tirosina, para evitar la precipitación.
Las figuras anexas son solamente para ilustración.
La Figura 1 muestra el crecimiento de C1H 3D11* 44 en WCM5 (medio sin proteína) en un fermentador de 1 litro medido como número de células/ml en más de 90 días.
La Figura 2 muestra la producción de anticuerpos a partir de células C1H 3D11* 44 en WCM5 en un fermentador de 1 litro medido como microgramos de anticuerpo/ml en más de 80 días.
Ejemplo 1 Formulación para el medio WCM4
4
Este medio no contiene hipoxantina, timidina o ácido folínico, los cuales pueden interrumpir la selección del metotrexato. El medio contiene glicina, la cual no puede interrumpir por sí misma la selección. De ese modo, este medio mantiene la selección completa por resistencia del metotrexato.
Ejemplo 2 Formulación para Medio WCM5
5
Ejemplo 3 Producción a partir de C1H3D11*44 en WCM4 y crecimiento
Las células C1H 3D11* son células CHO DUKB11 genéticamente diseñadas (Urlaub and Chasin (1980)) PNAS 77, 7 pp 4216-4220). Las células CHO DUKB11 no pueden producir dihidrofolato reductasa (dhfr). Estas células fueron diseñadas para producir un anticuerpo IgG humanizado, Campath 1H (Winter et al., Nature, 1988, 322, 323-327), usando estructuras plásmidas para expresar las cadenas ligera y pesada del anticuerpo y el dhfr de ratón. La expresión se amplifica y se mantiene usando el folato antagonista del metotrexato. Las células C1H 3D11* que crecían en una monocapa en Iscoves + 10% FBS de Flow, sin aminoácidos esenciales, metotrexato 10^{-6}M y anticuerpos, eran aproximadamente confluentes en un 90%. Estas células se separaron del plástico con tripsina/versena, se lavaron en medio Iscoves sin suplementos, se centrifugaron y se resuspendieron a 5x10^{4}/ml en medio WCM4 + 0,25% de peptona + 0,1% de polietilenglicol (PEG) 10.000 + 0,5% de suero de ternera fetal (SBF) sin metotrexato (MTX). Se prepararon tres frascos de 25 cm^{2} con 10 ml de una suspensión de células + hipoxantina (H), timidina (T) o HT. Estos frascos se incubaron a 36,5ºC en un incubador con atmósfera de CO_{2} al 5%.
Después de 6 días, los frascos se mezclaron y se añadió igual volumen de WCM4 + MTX sin peptona o PEG, y se transfirieron a un frasco de 75 cm^{2}.
Estas células se usaron para sembrar una centrífuga Technner de 500 ml, se incubaron a 36,5ºC girando a 40 rpm. Las células continuaron creciendo sin suero durante un periodo de más de 5 meses y aunque se encontró que las células necesitaban un periodo de adaptación, la velocidad de crecimiento y la viabilidad mejoraron continuamente. El tiempo de duplicación de la población se calculó que era de 73,1 horas por encima de aproximadamente 7 semanas; este disminuyó a 47,4 horas por encima de los 20 días subsiguientes, después se estabilizó. La secreción de anticuerpos permaneció alta, con niveles por encima de 60\mug/ml. Se determinó que el número de copias del gen en estas células no disminuyó, según la intensidad de banda obtenida usando el análisis de transferencia Northem.
En fermentadores, estas células producen anticuerpos por encima de 70 \mum/ml y niveles alcanzados regularmente de 100 \mum/ml o más. A estas células se las denomina C1H 3D11*44.
Ejemplo 4 Crecimiento y producción de C1H 3D11*44 en WCM5 en un fermentador de un litro
Las células C1H 3D11*44 del ejemplo 3 que han estado creciendo sin suero más de 2 meses, se transfirieron a un fermentador SGi de 1 litro con una paleta angular de acero inoxidable que giraba a 70rpm. La temperatura se ajustó a 37ºC, dO_{2} al 10% y control de pH a 7-7,2. El fermentador se sembró en el día 0 con 0,22x10^{6} células/ml en WCM4 (Ejemplo 1), con 0,1% de polietilenglicol (PEG) 10.000 y 0,25% de peptona de soja, y se gaseó al máximo con O_{2}. Las células se pasaron periódicamente usando medio fresco y una tasa de división generalmente entre 1 a 2 y 1 a 4.
Sobre el día 33 el gaseado máximo se reemplazó por un barboteo intenso, el cual se puede esperar que cause más daño físico a las células.
Del día 50 en adelante se usó WCM5 (ejemplo 2) junto con peptona y PEG en vez de WCM4.
Sobre el día 53 el PEG se remplazó por 0,1% de Pluronic F68. El crecimiento resultante y los niveles de anticuerpos alcanzados se muestran en los gráficos adjuntos (Figuras 1 y 2), y demuestran la capacidad de la invención para permitir la producción de anticuerpos sin proteínas en fermentadores, por encima de 100\mug/ml.
Ejemplo 5 Crecimiento de CHO AJ19 MCB1 en WCM4 y comparación con CHO AJ19 MCB1 crecidas en medio que contiene suero
Las células de ovario de hamster chino CHO AJ19 MCB1, obtenidas a partir de células CHO DUK, (Urlaub & Chasin PNAS, 77, 7, pp4216-4220, 1980), se diseñaron genéticamente para producir tPA bajo la selección del metotrexato. Esta línea de células se había crecido habitualmente en un fermentador como un cultivo de suspensión que utilizaba un medio de cultivo normal que consiste en medio RPMI 1640 (GIBCO), suero de bovino adulto hidrolizado con ácido (Imperial) 2,5%, Triptona 0,5%, polimicina 50 UI/ml, neomicina 20 UI/ml, metotrexato (MTX) 50nM.
Se formuló el medio WCM4, para lo cual se añadió:
46B
Peptona de soja N-Z (Sigma P1265) al 0,25% p/v, Polietilenglicol (PEG) 20.000 (Serva, Carbowax 20M) al 0,1% p/v, MTX 1uM.
46C
Extracto de levadura (Sigma Y0500) al 0,25% p/v, PEG 20.000 al 0,1% p/v, MTX 1uM. En este medio el Iscoves en CM4 se remplazó por medio RPMI 1640 (ICN FLOW).
46D
Extracto de levadura al 0,25% p/v, PEG 20.000 al 0,1% p/v, 1uM MTX.
46E
Extracto de levadura al 0.25% p/v, PEG 20.000 al 0,1% p/v, suero de ternera fetal (Imperial) al 0,25%, 1uM MTX.
Los extractos de levadura, Peptona y PEG se prepararon como soluciones al 10% p/v con agua (unidad de producción de medios de Wellcome) y se filtraron a través de un filtro desechable (Gelman, Supor Vac) de 0,2um, después se diluyeron para su empleo. Las células se incubaron a 37ºC en un incubador humidificado que contenía 5% de CO_{2}.
Las células que crecían en medio de cultivo normal se precipitaron mediante centrifugación a 1.2000g +4ºC durante 5 minutos, se lavaron en RPMI 1640 sin suplementos y se precipitaron otra vez. Luego, las células se resuspendieron a 10^{5} cel/min en medio de cultivo normal (46A) y en otros medios (46B, 46C, 46D o 46E). Se sembraron placas de 24 pocillos (pocillos de 16mm Costar) con 1ml/pocillo y se incubaron a 37ºC en un incubador que contenía 5% de CO_{2}. Sobre los días 3, 4, 5 y 6 se contó un pocillo de cada una, usando un hemocitómetro y la exclusión de azul tripan. Se recogieron dos pocillos adicionales de cada una, se mezclaron y se precipitaron a 1.200g +4ºC durante 5 minutos. El sobrenadante se separó y se guardó a -20ºC. Estas muestras se analizaron más tarde por tPA. Sobre el día 6 solamente se recogieron muestras de 46A y 46D.
Resultados Actividades específicas tPA en varias tomas en bruto
El material en bruto producido en los cinco medios diferentes se examinó utilizando un ensayo ELISA validado por control de calidad para medir las concentraciones de antígeno tPA en \mug/ml utilizando la unión a un anticuerpo policlonal frente a tPA, y un ensayo de lisis de coágulo para medir la actividad tPA en UI/ml. Las actividades específicas se calcularon a partir de estos resultados (Tabla 2).
TABLA 2
6 
\newpage
Según la tabla anterior no había cambio de la actividad específica para los cinco materiales en bruto. El rendimiento de tPA a partir de medio B, C y D sin proteínas, fue casi igual al rendimiento de tPA a partir de medio de cultivo estándar en el grupo A y E.
Ejemplo 6 Crecimiento continuo de OHC AJ19MCBI en WCM4
Se precipitaron y lavaron como en el Ejemplo 5, células OHC AJ19MCBI en WCM4 que crecían en medio de cultivo normal y se resuspendieron a 7x10^{4}/ml en 500ml de medio 46B. Estas células se transfirieron a un frasco centrifugador Techne y se incubaron, como se ha indicado anteriormente, agitando a 40rpm. Las células se contaron a varios intervalos de tiempo y subcultivaron usando el mismo medio. Se tomó una muestra para el ensayo de tPA y se trató como en el Ejemplo 5.
La actividad específica de tPA en varios subcultivos de células
Se midió la actividad específica de los sobrenadantes procedentes de diferentes niveles de pases de crecimiento de células en WCM4 con peptona y PEG 20K al 0,1%, mediante combinación de ELISA y ensayo de lisis del coagulo. Las actividades especificas de los diferentes pases de células se resumen en la Tabla 3.
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 3
8
Durante un periodo de 48 días, de acuerdo a la tasa de división indicada anteriormente, una célula podía dividirse para dar 3,77x10^{8} células. Esto es equivalente a los 31,8 duplicados de población, con un tiempo de duplicación de 38 horas.
Los resultados de los experimentos dirigidos de los Ejemplos 5 y 6 demuestran que el medio sin suero de la presente invención es capaz de apoyar crecimientos de células y rendimientos tPA comparables a los alcanzados en los medios que contienen suero.

Claims (17)

1. Un método para cultivar células OHC recombinantes para obtener un producto, el cual comprende hacer crecer células OHC en un medio que está libre de proteínas, lípidos y carbohidratos aislados a partir de una fuente animal, que incluye transferrina y comprende
agua,
un regulador de osmolalidad para mantener la osmolalidad del medio dentro del intervalo de aproximadamente 200-350 mOsm, un tampón para mantener el pH del medio dentro del intervalo de aproximadamente 6,5-7,5
y una fuente de energía en el intervalo de 1000-10.000 mg/litro,
y además, un suplemento que comprende:
aminoácidos, incluyendo L-glutamina en el intervalo de 400-600 mg/l,
una fuente de hierro recombinante o inorgánica,
una fuente de lípidos en el intervalo de 0,05-10 mg/l
una insulina o análogo de insulina recombinante,
un potenciador del crecimiento celular que está involucrado en la ruta del folato, seleccionado a partir del grupo que consiste en ácido fólico, vitamina B6 y vitamina B12,
en el que dicho medio es capaz de sustentar tanto el crecimiento de células en suspensión a una densidad mayor de
1 x 10^{5} células/ml como la subsiguiente secreción del producto a partir de dichas células en ausencia de suero.
2. Un método según la reivindicación 1, en el que los medios comprenden además un péptido digerido, un hidrolizado o un extracto en el intervalo de 1%-0,025% p/v.
3. Un método según la reivindicación 2, en el que el péptido digerido, el hidrolizado o el extracto se seleccionan a partir del grupo que consiste en Triptona, hidroxilato de caseína, extracto de levadura o peptona de soja digerida con papaína.
4. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los medios comprenden además un factor seleccionado de uno cualquiera del grupo que consiste en PDGF, tiroxina T3, trombina, interleucinas tales como IL2 y IL6, progesterona, hidrocortisona y Vitamina E.
5. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los aminoácidos son uno o más seleccionados de:
L-Alanina
L-Arginina
L-Asparagina
Ácido L-aspártico
L-Cisteína
Ácido L-glutámico
Glicina
L-Histidina
L-Isoleucina
L-Leucina
L-Lisina
L-Metionina
L-Fenilalanina
L-Prolina
L-Serina
L-Treonina
L-Triptófano
L-Tirosina
L-Valina
6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la fuente de energía es un monosacárido.
7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la fuente de hierro recombinante o inorgánica se encuentra en el intervalo de 0,25-5 mg/l.
8. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los medios comprenden además selenio o ácido L-ascórbico para ayudar a minimizar los efectos tóxicos potenciales de los iones ferrosos y férricos, y oxigeno.
9. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los medios comprenden además agentes quelantes tales como citrato o ácido etilendiaminotetracético (EDTA) o un captador de radicales libres tal como \alpha-tocoferol (Vitamina E) para reducir el daño del radical libre.
10. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los medios comprenden además antibióticos tales como polimixina, neomicina, penicilina, o estreptomicina en el intervalo de 10.000-100.000 UI/litro para prevenir la contaminación bacteriana.
11. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los medios comprenden además putrescina o una sal de la misma en un intervalo de 0,01-1,0 mg/litro.
12. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los medios comprenden además metotrexato.
13. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los medios comprenden además un protector de células seleccionado a partir del grupo que consiste en polietilenglicol, alcoholes polivinílicos o polioles plurónicos.
14. Un método según la reivindicación 13, en el que el protector celular es Pluronic poliol F68.
15. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la fuente de hierro del medio de cultivo se añade al medio de cultivo al final, para evitar la precipitación.
16. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el producto es un anticuerpo.
17. Un método según la reivindicación 16, en el que el producto es un anticuerpo anti-CDw52.
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