ES2204960T3 - Procedimiento para la estabilizacion de moleculas sensibles a la hidrolisis. - Google Patents
Procedimiento para la estabilizacion de moleculas sensibles a la hidrolisis.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION TRATA DE UN PROCEDIMIENTO PARA LA ESTABILIZACION DE MOLECULAS O TROZOS DE MOLECULAS SENSIBLES A LA HIDROLISIS. EN PARTICULAR TRATA LA INVENCION DE UN PROCEDIMIENTO PARA LA ESTABILIZACION DE MARCADORES SENSIBLES A LA HIDROLISIS O DE TRAZADORES CONTENIENDO MARCADORES EN SOLUCIONES ACUOSAS. ADEMAS TRATA LA INVENCION DE EQUIPOS PARA LLEVAR A CABO PROCESOS DE DETECCION INMUNOLOGICA UTILIZANDO EL PROCEDIMIENTO CITADO.
Description
Procedimiento para la estabilización de moléculas
sensibles a la hidrólisis.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la estabilización de moléculas sensibles a la
hidrólisis, siendo la molécula un marcador empleado en un
procedimiento inmunológico de detección, escogido entre los de la
siguiente lista: ésteres de acridinio, acilsulfonamida de
acridinio, luminol, isoluminol o sus derivados, dioxetano,
luciferina, ésteres del ácido oxálico y amidas del ácido
oxálico.
Los procedimientos inmunológicos de detección han
adquirido en el diagnóstico in vitro una elevada importancia.
La causa de ello es que son muy específicos y extremadamente
sensibles. Además, estos procedimientos se distinguen por ser
sencillamente manipulables. Los procedimientos de detección se
basan en la interacción inmunológica entre el analito que ha de
detectarse y su participante en la unión o sus participantes
en la unión.
En el caso de los "ensayos de emparedado" el
analito es unido por dos anticuerpos diferentes a modo de
emparedado. Uno de los dos anticuerpos porta un marcador por medio
del que puede determinarse su concentración y, con ello, la del
complejo de emparedado. En el caso de analitos pequeños se desecha
el procedimiento de emparedado, ya que por motivos estéricos no
pueden unirse simultáneamente al analito dos anticuerpos distintos.
Aquí encuentran aplicación, por lo regular, los ensayos
competitivos. En este caso el analito y un derivado sintético del
analito compiten por los puntos de unión del anticuerpo. Se marca
por lo regular el derivado del analito (procedimiento competitivo
clásico) o el anticuerpo.
Son marcadores usuales, p. ej., isótopos
radiactivos o luminiscentes (fluorescentes, fosforescentes,
quimio-luminiscentes, bioluminiscentes etc.) o
sustancias capacitadas para la absorción. El reactivo marcado
(anticuerpo, derivado del analito) se designa en adelante como
trazador.
La conservación del trazador se efectúa
frecuentemente en una solución acuosa lista para el uso por el
usuario. Puesto que, en muchos casos, en el caso de los marcadores
se trata de sustancias no resistentes a la hidrólisis, la
conservación en solución acuosa significa, por lo regular, una
limitación no deseada de la estabilidad. Esto se exterioriza, ante
todo, en la medición, por decrecer la altura de la señal al aumentar
el tiempo de almacenamiento. Como consecuencia disminuye
frecuentemente la duración de la estabilidad del kit o estuche
completo.
La presente invención se basó, por lo tanto, en
el problema técnico de poner a disposición un procedimiento que
disminuyese la sensibilidad a la hidrólisis de las moléculas
empleadas como marcadores en los procedimientos inmunológicos de
detección.
A partir del documento EP-0 487
301 era conocido únicamente un procedimiento para la estabilización
de enzimas, o bien conjugados de enzimas, que disminuye la
inactivación térmica de las enzimas. Sin embargo, de modo
sorprendente, la solución del problema técnico antes mencionado,
provocado por la sensibilidad a la hidrólisis, se efectúa mediante
la puesta a disposición de las formas de realización caracterizadas
en las reivindicaciones. Se comprobó, de modo sorprendente, que la
adición de anticuerpos dirigidos contra las moléculas (marcadores)
que habían de estabilizarse reducía considerablemente la
sensibilidad a la hidrólisis de las citadas sustancias. El efecto
protector frente a la hidrólisis parece basarse en el hecho de que
se dificulta el ataque de las partículas hidrófilas (H_{2}O,
OH^{-}, H_{3}O^{+}) por motivos estéricos y/o por la creación
de un entorno hidrófobo. Un efecto protector de esta clase frente a
la hidrólisis se extiende, por tanto, fundamentalmente a todas las
moléculas (marcadores) sensibles a la hidrólisis, dando por supuesto
que puedan producirse anticuerpos contra estas sustancias, para
poder realizar el procedimiento de acuerdo con la invención.
Por tanto, la invención se refiere a un
procedimiento para la estabilización de moléculas sensibles a la
hidrólisis, en solución acuosa, que está caracterizado porque a la
solución acuosa de las moléculas se añaden anticuerpos dirigidos
contra las moléculas. Por el término "estabilización" se ha de
entender, en relación con la presente invención, un impedimento o
ralentización de la hidrólisis de una molécula (marcador). Por el
término "molecula" (marcador) se ha de entender un compuesto
químico escogido de la siguiente lista de compuestos: ésteres de
acridinio, acilsulfonamida de acridinio, luminol, isoluminol o sus
derivados, dioxetano, luciferina, ésteres del ácido oxálico y amidas
del ácido oxálico. En relación con la presente invención quedan
comprendidos también bajo esta designación los iones o radicales de
estas moléculas. La expresión "sensible a la hidrólisis"
designa, en relación con la presente invención, la capacidad de un
compuesto, aquí de una molécula, de un marcador o trazador, para
iniciar una reacción química con participación de H_{2}O y/o
H_{3}O^{+} y/u OH^{-}, que conduce a un producto final no
deseado, es decir a un producto de capacidad reducida para dar
señal, o ya incapaz de darla.
Por el término "anticuerpos" se han de
entender anticuerpos monoclonales o policlonales. En relación con la
presente invención quedan comprendidos también bajo este término los
anticuerpos quimera, anticuerpos biespecíficos, fragmentos de
anticuerpos (p. ej., (Fab')_{2}, Fab, Fv) y anticuerpos o
fragmentos de anticuerpos (semi)sintéticos y químicamente
modificados.
El procedimiento de acuerdo con la invención hace
posible un considerable aumento de la estabilidad en solución acuosa
de moléculas sensibles a la hidrólisis, contra las que pueden
dirigirse anticuerpos, y por tanto un considerable aumento de la
estabilidad con un trazador marcado con un marcador, que encuentran
empleo en procedimientos inmunológicos de detección.
Los siguientes ejemplos explican la
invención.
Etapa
1
Para la preparación de anticuerpos monoclonales
se inyectaron ratones BALB/c por vía subcutánea o intraperitoneal
con 10 \mug de acilsulfonamida de acridinio-BSA,
que estaba emulsionada en coadyuvante de Freund completo. Siguieron
4 a 5 inmunizaciones adicionales sin coadyuvante (a intervalos de en
cada caso de cuatro semanas). Los cuatro últimos días antes de la
fusión se post-inmunizaron los ratones por vía
intravenosa (10 \mug por día).
Para la preparación de hibridomas se sacrificó a
los animales inmunizados mediante luxación cervical. Se separó el
bazo asépticamente y se desgarró para obtener una suspensión de
células individuales de células del bazo en un medio de Eagle
modificado por Dulbecco (DMEM) exento de suero. Las células se
reunieron mediante centrifugación (5 min; 1800 rpm) y se lavaron una
vez en DMEM. El número total de células se determinó por recuento en
hemocitómetro empleando la técnica de exclusión del azul de tripano.
Las células de mieloma de ratón (Sp2/0) empleadas como parámetro de
fusión se lavaron dos veces en DMEM exento de suero, se reunieron
mediante centrifugación (10 min, 1000 rpm) y se contaron como se
ha descrito antes para las células de bazo.
Aproximadamente 10^{8} células de bazo se
mezclaron con 2 x 10^{7} células de mieloma de ratón Sp2/0.
Después de centrifugar durante 10 minutos a 1000 rpm, se separó el
material sobrenadante y se añadió 1 ml de polietilenglicol (PEG
4000, firma Merck, 50%) al recipiente con el sedimento. El sedimento
se resuspendió entonces mediante golpes ligeros y se incubó durante
1 minuto a 37ºC. Se añadieron gota a gota 10 ml de DMEM exento de
suero con golpes ligeros y la mezcla se incubó durante 2 a 4
minutos. Las células fusionadas se centrifugaron a continuación
durante 10 minutos a 1000 rpm. El sedimento de células obtenido se
suspendió en DMEM que contenía suero de ternero fetal (FCS) al 20% y
HAT (hipoxantina 0,1 mM; aminopterina 0,4 \muM; timidina 16
\muM) y se distribuyó en placas de cultivo (Nunc) con 24 pocillos
con una concentración aproximada de 5 x
10^{4}-10^{6} células por pocillo. Después de 2
a 3 semanas se retiraron las colonias de células individuales de los
pocillos individuales y se cultivaron en los pocillos de una placa
de cultivo nueva.
Se buscaron en los materiales sobrenadantes del
cultivo anticuerpos específicos del antígeno por medio de la técnica
EIA. Cada pocillo de una placa de microtitulación recubierta con
acridinio-BSA (3 \mug/ml) se llenó con 100 \mul
del material sobrenadante y se incubó durante 1 hora a la
temperatura ambiente. Después del lavado se añadieron 100 \mul de
un conjugado POD anticuerpo anti-ratón de conejo
durante una hora adicional a la temperatura ambiente. Después de 30
minutos de incubación con el substrato se leyó el desarrollo de
color a 492 nm en un procesador ELISA de Behring (BEP). Se
escogieron los hibridomas que presentaban anticuerpos con una
especifidad antigénica apropiada y se clonaron empleando un
manipulador monocelular. Para la preparación de grandes cantidades
de anticuerpos monoclonales se multiplicaron los clones en cultivo
masivo. La subsiguiente purificación de los anticuerpos monoclonales
individuales se realizó mediante cromatografía de proteína A.
Etapa
2
Se disolvieron en 0,7 ml de tampón fosfato 0,1
molar (pH 8,0) 0,1 mg de un anticuerpo monoclonal (acm) (anticuerpo
monoclonal que está dirigido contra el antígeno específico de la
próstata; por ejemplo BW 92-284/03, Behringwerke
AG). A esta solución se añadieron 30 \mul de una solución
marcadora (0,1 mg de acilsulfonamida de acridinio (con grupo
reactivo N-succinimidilo) por ml de acetonitrilo) y
la solución de reacción se incubó durante 15 minutos a la
temperatura ambiente. A continuación se añadieron 0,3 ml de una
solución acuosa de lisina (10 mg/ml) y se incubó durante 15 minutos
más. El trazador se purificó por cromatografía en gel (Sephadex G
25).
El trazador purificado se disolvió finalmente a
una concentración de 600 ng/ml en un tampón Tris/HCl 0,05 M (pH 7,4;
2 g de albúmina de suero bovino, 8,8 g de NaCl y 0,5 g de azida de
sodio por litro).
Etapa
3
Solución de trazador A: para la estabilización
se añadieron a la solución de trazador (etapa 2) anticuerpos
anti-etiqueta (BW 90-9/016,
obtenidos en la etapa 1, DSM ACC 2183) en una concentración de 1
\mug/ml.
Solución de trazador B: en la solución
comparativa no se añadió anticuerpo
anti-marcador.
Después de almacenar durante cinco semanas las
soluciones de trazador A y B a 37ºC la actividad de la señal
inicial en el caso de la solución de trazador A permaneció
prácticamente sin modificar y perdió en el caso de la solución de
trazador B un 87% (figura 1).
Etapa
1
El anticuerpo monoclonal se preparó según el
procedimiento explicado en la Etapa 1 del Ejemplo 1.
Etapa
2
Se disolvieron en 0,7 ml de tampón fosfato 0,1
molar (pH 8,0) 0,1 mg de acm anti-T3, un anticuerpo
monoclonal dirigido contra la hormona del tiroides triyodotironina
(T3) (ImmunoGen International Ltd., Nº de Pedido
13-3 D8-38, Gateshead, Reino Unido).
A esta solución se añadieron con pipeta 5 \mul de una solución
marcadora (1,0 mg de acilsulfonamida de acridinio (con grupo
reactivo N-succinimidilo) por ml de acetonitrilo) y
la solución de reacción se incubó durante 15 minutos a la
temperatura ambiente. A continuación se añadieron 0,3 ml de una
solución acuosa de lisina (10 mg/ml) y se incubó otros 15 minutos.
El trazador se purificó por cromatografía en gel (Sephadex G
25).
Etapa
3
El trazador purificado (Etapa 2) se disolvió a
una concentración de 90 ng/ml en un tampón Tris/HCl 0,05 M (pH 7,4;
2 g de albúmina de suero bovino, 8,8 g de NaCl, 0,25 g de ANS (ácido
8-anilino-naftalino-1-sulfónico)
y 0,5 g de azida de sodio por litro).
Etapa
4
Solución de trazador A: para la estabilización
se añadieron a la solución de trazador (Etapa 3) anticuerpos
anti-marcador (BW 90-9/016, DSM ACC
2183, Etapa 1) en una concentración de 1 \mug/ml.
Solución de trazador B: en la solución
comparativa no se añadió anticuerpo
anti-marcador.
La figura 2 muestra las curvas normalizadas que
se obtuvieron con los dos trazadores después de cuatro semanas de
almacenamiento a 37ºC. La altura de la señal se encuentra, en el
caso de la solución de trazador A, significativamente por encima de
la de la solución de trazador B.
Etapa
1
El anticuerpo monoclonal se preparó según el
procedimiento explicado en la Etapa 1 del Ejemplo 1.
\newpage
Etapa
2
Se disolvieron en 8 ml de tampón PBS, pH 7,2, 40
mg de IgG de conejo. Se añadieron 8 ml de solución de LiBO_{3} 0,2
M (agua con 20% de dioxano) y 0,22 ml de solución de GMBS (10 mg de
éster N-succinimidílico del ácido
gamma-maleinimidobutanoico/ml de dioxano). Después
de 1 hora a la temperatura ambiente se separaron las sales a través
de una columna Biogel P2. El material eluido resultante ("solución
1") tenía un volumen de aproximadamente 20 ml.
6,9 mg de triyodotironina (T3) se disolvieron en
0,69 ml de DMSO. Se añadieron 10 \mul de
N-etilmorfolina y 2,1 mg de SAMSA (anhídrido del
ácido S-acetilmercaptosuccínico) disueltos en 0,1 ml
de DMSO. Después de 30 minutos se añadieron con pipeta 0,1 ml de
solución acuosa de hidroxil-amina 1 M. La solución
("solución 2") se incuba durante 15 minutos a la temperatura
ambiente. Se mezclaron la solución 1 y la solución 2 y se añadieron
3 ml de DMSO. Después de 2 horas se separaron las sales por medio de
Biogel P6 y se liofilizó el conjugado.
Se disolvieron 0,1 mg del conjugado de
IgG-T3 en 0,7 ml de tampón fosfato 0,1 molar (pH
8,0). A esta solución se añadieron con pipeta 10 \mul de una
solución marcadora (0,1 mg de acilsulfonamida de acridinio (con
grupo reactivo N-succinimidilo) por ml de
acetonitrilo y la solución de reacción se incubó durante 15 minutos
a la temperatura ambiente. A continuación se añadieron 0,3 ml de una
solución acuosa de lisina (10 mg/ml) y se incubó durante otros 15
minutos. El trazador se purificó por cromatografía en gel (Sephadex
G 25).
Etapa
3
El trazador purificado (Etapa 2) se disolvió a
una concentración de 30 ng/ml en un tampón Tris/HCl 0,05 molar (pH
7,4; 2 g de albúmina de suero bovino, 8,8 g de NaCl, 0,25 g de ANS y
0,5 g de azida de sodio por litro).
Etapa
4
Solución de trazador A: para la estabilización
se añadieron a la solución de trazador (Etapa 3) anticuerpos
anti-marcador (BW 90-9/016, DSM,
AACC 2183, Etapa 1) a una concentración de 1 \mug/ml.
Solución de trazador B: en la solución
comparativa no se añadió anticuerpo
anti-marcador.
La figura 3 muestra curvas normalizadas que se
obtuvieron con los dos trazadores después de cuatro semanas de
almacenamiento a 37ºC. La altura de la señal se encuentra, en el
caso de la solución de trazador A, significativamente por encima de
la de la solución de trazador B.
Los anticuerpos anti-marcador
investigados mostraron en parte un comportamiento muy diferente
respecto de su capacidad para estabilizar trazadores (Figura 4a) y
respecto de la cinética de la emisión de luz. La figura 4b muestra
los rendimientos luminosos de los distintos anticuerpos
anti-marcador en función del tiempo de medida.
El hibridoma enumerado a continuación se depositó
en la DSM de Braunschweig. La designación del anticuerpo producido
por este hibridoma corresponde a la del hibridoma.
| Hibridoma | Número de depósito DSM | Fecha del depósito |
| BW 90-342-9-016 | 2183 | 1-7-94 |
Figura 1: Estabilidad de la señal del trazador
anti-PSA tras su almacenamiento a 37ºC; con adición
de anticuerpos anti-marcador y sin ella; RLU
significa unidades de luz relativas.
Figura 2: T3-SPALT (solid phase
antigen luminescence technique: ensayos del procedimiento de
luminiscencia de antígenos en fase sólida), realización con
trazadores almacenados durante 4 semanas a 37ºC. El ensayo SPALT es
un inmunoensayo luminiscente competitivo, en el que un derivado de
analito marcado (= trazador analito) compite con el analito que ha
de determinarse por los puntos de unión de un anticuerpo marcado
(trazador anticuerpo).
Figura 3: T3-LIAs (inmunoensayo
luminiscente); realización con trazadores almacenados durante 4
semanas a 37ºC. El LIA es un inmunoensayo luminiscente competitivo
en el que un derivado del analito marcado (=trazador analito)
compite con el analito que ha de determinarse por los puntos de
unión de un anticuerpo (aquí unido en fase sólida).
Figura 4a: Distinto efecto de estabilización de
diferentes anticuerpos anti-etiqueta.
Figura 4b: Rendimientos luminosos de un trazador
anti-PS A en función del anticuerpo
anti-etiqueta monoclonal añadido.
Claims (2)
1. Procedimiento para la estabilización de una
molécula sensible a la hidrólisis en solución acuosa,
caracterizado porque a la solución acuosa de la molécula se
añade un anticuerpo dirigido contra la molécula, y porque la
molécula es un marcador empleado en un procedimiento inmunológico de
detección, escogido entre los de la siguiente lista: ésteres de
acridinio, acilsulfonamida de acridinio, luminol, isoluminol o sus
derivados, dioxetano, luciferina, ésteres del ácido oxálico y
amidas del ácido oxálico.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo quimera, un
anticuerpo (semi)sintético, un fragmento de anticuerpo o un
anticuerpo químicamente modificado o un fragmento de anticuerpo
químicamente modificado.
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