ES2206424T3 - Oligodesoxinucleotidos inmunoestimulantes. - Google Patents

Oligodesoxinucleotidos inmunoestimulantes.

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ES2206424T3 ES01960277T ES01960277T ES2206424T3 ES 2206424 T3 ES2206424 T3 ES 2206424T3 ES 01960277 T ES01960277 T ES 01960277T ES 01960277 T ES01960277 T ES 01960277T ES 2206424 T3 ES2206424 T3 ES 2206424T3
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Abstract

Uso de una molécula de ácido oligodesoxinucleico (ODN) que tienen la estructura según la fórmula (I): siendo cualquier X O o S, en la que cualquier NMP es un 2¿-desoxinucleósido monofosfato o monotiofosfato, seleccionado del grupo constituido por desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxinosina, desoxicitosina, desoxiuridina, desoxitimidina, 2-metildesoxinosina, 5-metildesoxicitosina, desoxipseudouridina, desoxiribosapurina, 2- aminodesoxiribosapurina, 6-S-desoxiguanidina, 2- dimetildesoxiguanosina o N-isopentenildesoxiadenosina monofosfato o monotiofosfato, NUC es un 2¿- desoxinucleósido, seleccionado del grupo constituido por desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxinosina, desoxicitosina, desoxiuridina, desoxitimidina, 2- metildesoxinosina, 5-metildesoxicitosina, desoxipseudouridina, desoxiribosapurina, 2- aminodesoxiribosapurina, 6-S-desoxiguanina, 2- dimetildesoxiguanosina o N-isopentenildesoxiadenosina, a y b son dígitos entre 0 y 100 con la condición de que a + b esté entre 4 y 150, B yE son grupos comunes para los extremos 5¿ o 3¿ de las moléculas de ácido nucleico, para preparar una composición farmacéutica inmunoestimulante.

Description

Oligodesoxinucleótidos inmunoestimulantes.
La presente invención se refiere a moléculas oligodesoxinucleótidos estimulantes (abreviadamente en inglés ODNs) y a composiciones farmacéuticas que contienen tales ODNs.
Las vacunas pueden salvar más vidas (y recursos) que cualquier otra intervención médica (Nossal, 1998). Debido a los programas mundiales de vacunación la incidencia de muchas enfermedades mortales ha disminuido drásticamente. Aunque esta noción es válida para todo un panel de enfermedades, por ejemplo tuberculosis, difteria, pertussis, paperas y tétanos, no hay vacunas eficaces para muchas enfermedades infecciosas que incluyen la mayoría de las infecciones virales, tal como el SIDA. Tampoco hay vacunas eficaces para otras enfermedades, infecciosas o no infecciosas que afectan a millones de vidas de millones de pacientes por año incluyendo malaria o cáncer. Además, la rápida aparición de bacterias resistentes a antibióticos y microorganismos pide tratamientos alternativos con vacunas como una elección lógica. Finalmente, la gran necesidad de vacunas se ilustra también por el hecho de que las enfermedades infecciosas, más que los desórdenes cardiovasculares o cáncer o lesiones permanecen como la mayor causa de muerte e incapacidad en el mundo (Bloom and Widdus, 1998).
En la actualidad, desde un punto de vista inmunológico, un gran problema en el campo de las vacunas es que las vacunas tradicionales (y/o los compuestos inmunomodulantes contenidos en estas preparaciones) se diseñaron para inducir altos niveles de anticuerpos (Harrow and Lane, 1998). Sin embargo, los anticuerpos por sí mismos no son eficaces en prevenir un gran número de enfermedades incluyendo la mayoría de las enfermedades causadas por virus, bacterias intracelulares, ciertos parásitos y cáncer. Ejemplos de tales enfermedades son, pero sin limitarse a, los virus HIV o especies de Plasmodium en el caso de la malaria mencionadas previamente. En numerosos sistemas experimentales se ha mostrado que el brazo celular del sistema inmune, incluyendo las células T, más que el brazo tumoral, es importante para estas indicaciones. Por tanto, las nuevas tecnologías innovadoras se necesitan para superar las limitaciones de las vacunas convencionales. El centro de atención debe de estar en las tecnologías que inducen de manera fiable el sistema inmune, incluyendo células T específicas de antígeno, las cuales reconocen moléculas expresadas en células infectadas por patógenos. Idealmente, las vacunas se diseñaron para inducir tanto células T que distinguen células infectadas y/o enfermas de células normales y, simultáneamente anticuerpos secretados por células B que reconocen patógenos en compartimentos extracelulares.
Algunas vacunas establecidas consisten en organismos vivos atenuados donde existe riesgo de reversibilidad hacia la cepa salvaje virulenta. En particular en un hospedador inmunodeprimido esto puede ser un panorama vivo amenazante. Alternativamente, las vacunas se administran como una combinación de antígenos derivados de patógenos junto con compuestos que inducen o potencian las respuestas frente a estos antígenos (estos compuestos se denominan habitualmente coadyuvantes), ya que estas vacunas en subunidades no son eficaces por sí mismas.
Mientras que no hay duda de que las vacunas anteriores son tratamientos médicos valiosos está la desventaja de que, debido a su complejidad, se pueden provocar efectos secundarios severos, por ejemplo a antígenos que están contenidos en la vacuna que presenta reactividad cruzada con moléculas expresadas por las células de los individuos vacunados. Además, los requerimientos existentes por parte de las autoridades reguladoras, por ejemplo la Organización Mundial de la Salud (abreviadamente en inglés WHO), la Food and Drug Administration (FDA), y sus homólogas europeas, para especificación exacta de la composición de la vacuna y los mecanismos de inducción de la inmunidad, son difíciles de encontrar.
Las células presentadoras de antígeno pertenecen al sistema inmune innato. que ha evolucionado como primera línea de defensa del hospedador que limita infección poco después de la exposición a microorganismos (Hoffmann et al., 1999). Las células del sistema inmune innato reconocen pautas o estructuras relativamente no específicas expresadas en sus dianas más que más sofisticadas, estructuras específicas que son reconocidas por el sistema inmune adaptativo (Hoffmann et al., 1999). Ejemplos de células del sistema inmune innato son los macrófagos y las células dendríticas, pero también los granulocitos (por ejemplo neutrófilos), las células natural killer y otras. En contraste, las células del sistema inmune reconocen estructuras antigénicas específicas, incluyendo péptidos en el caso de las células T y los péptidos así como estructuras tridimensionales en el caso de las células B. El sistema inmune adaptativo es mucho más específico y sofisticado que el sistema inmune innato y mejora ante la exposición repetida a un patógeno/antígeno. Filogenéticamente, el sistema inmune innato es mucho más antiguo y se puede encontrar ya en organismos muy primitivos. Sin embargo, el sistema inmune innato es crítico durante la fase inicial de exposición antigénica ya que, además de contener patógenos, las células del sistema inmune, es decir APC's, primeras células del sistema inmune adaptativo y por ello desencadenantes de las respuestas inmunes específicas que llevan a la eliminación de los intrusos. En suma, las células del sistema inmune innato y en particular las APC's juegan un papel crítico durante la fase de inducción de respuestas inmune por a) retención de infecciones mediante un sistema de reconocimiento del patrón primitivo y b) células iniciadores del sistema inmune adaptativo que conducen respuestas inmunes específicas y de memoria resultando en la limpieza de los patógenos intrusos o de otras dianas (Roitt et al., 1998). Estos mecanismos también pueden ser importantes para limpiar o contener las células tumorales.
Como se mencionó anteriormente, las células del sistema inmune innato reconocen patrones expresados en sus dianas respectivas. Los poliliposacáridos (abreviadamente en inglés LPS) en el caso de las bacterias Gram negativas, glucolípidos micobacterianos, ácidos lipoteicoicos de las bacterias Gram positivas, las mananas de levaduras y los ARN's de doble cadena de virus (Hoffmann et al., 1999) son ejemplos de ello. Además pueden reconocer patrones tales como glucosilaciones alteradas de proteínas de células tumorales.
Hallazgos recientes describen ADN's de protozoos o eucariotas inferiores como un patrón adicional reconocido por el sistema inmune (pero posiblemente también por el adaptativo) de mamíferos (y probablemente la mayoría si no todos los vertebrados) (Krieg, 1996; Lipford et al., 1998).
El sistema inmune reconoce organismos inferiores incluyendo bacterias probablemente debido a las diferencias de uso estructurales y de secuencia entre patógenos y ADN del hospedador. En particular, son considerados como diana pequeños plegamientos de ADN derivados de no vertebrados o en forma de pequeños ODNs sintéticos que contienen dinucleótidos de citosina-guanina no metilados (CpG) en un cierto contexto base (Krieg et al., 1995). Los motivos CpG se encuentran en la frecuencia esperada en el ADN bacteriano, pero con mucha menos frecuencia en e ADN vertebrado (Lipford et al., 1998; Pisetsky, 1999). Además, los motivos CpG de no vertebrados (por ejemplo bacterianos) no están metilados, mientras que las frecuencias CpG de vertebrados sí que lo están. Estas diferencias entre ADN bacteriano y ADN de vertebrados permite a los vertebrados reconocer el ADN no vertebrado en forma de señal de peligro.
El ADN natural que contienen CpG, ODNs, así como ODNs sustituidos con tiofosfato (intercambio de residuos de tiofosfato for fosfato) que contienen motivos CpG (CpG-ODN) no son solo potentes activadores de la proliferación de células inmunes y respuestas inmunes humorales (Krieg et al., 1995), pero también estimular fuertes respuestas inmunes celulares (revisado en Lipford et al., 1998). Los ADN/ODNs que contienen motivos CpG no metilados pueden activar directamente celulas monocíticas (células dendríticas, macrófagos), y células B. Probablemente, las células natural killer (NK) no se activan directamente pero responden a IL-12 derivada de monocito (interleukina 12) con un marcado aumento en su producción de IFN-\gamma (Chace et al., 1997).En consecuencia, la inducción de monolitos y células NK por ADN CpG promueve la inducción de respuestas de tipo TH1 y del desarrollo de células T citotóxicas.
El ácido ribonucleico basado en inosina y citosina, como el ácido polinosínico-policitidínico (Poli I:C), se sabe que promueve las respuestas inmunes específicas Th1. Se sabe que estimula a los macrófagos para producir citoquinas tales como las IL-1\alpha e IL-12 (Manetti et al., 1995), se sabe también que es un potente inductor de interferón de tipo 1 (Manetti et al., 1995) y un potente estimulante de células NK (Cavanaugh et al.,1996).
Este efecto, sin embargo, se restringió estrictamente a ácido ribonucleico que contuviera residuos de inosina y citidina (WO98/16247) o dos emulsiones aceite en agua o agua en aceite de homopolímeros de doble cadena híbridos de poli I:dC o poli dI:C en donde cada uno de los homopolímeros (incluyendo poli dI) tienen un peso molecular de 
\hbox{1 x 10 ^{5} }
a 1,5 x 10^{6} (US 3.906.092).
Las investigaciones llevadas a cabo por los inventores de la presente invención mostraron que los ODNs que contienen motivos CpG no metilados, aunque son efectivos en la estimulación del sistema inmune, tienen desventajas esenciales, especialmente con respecto a la especificidad (alto fondo) e inducción de efectos secundarios, tales como generación de alto TNF-\alpha sistémico. Se sabe que la liberación de alto TNF-\alpha sistémico causa síndrome de shock tóxico, que puede causar la muerte de los pacientes afectados.
Los oligonucleótidos que comprenden nucleótidos de desoxinosina se conocen como sondas (de hibridación) e iniciadores por ejemplo en el documento US 5.691.136, WO 92/11389 A, WO 90/14424 A, Gene 38 (1985), 271-274 y NAR 24 (1996), 2470-2475.
Por tanto es objeto de la presente invención proporcional nuevos ODNs adecuados que no tengan tales efectos secundarios drásticos como los ODNs basados en secuencias CpG. Es un objeto adicional reducir los efectos secundarios de las composiciones farmacéuticas que contienen ODNs y proporcionar composiciones farmacéuticas seguras y bien tolerables y eficaces con propiedades eficaces, inmunoestimulantes que son adecuadas para la vacunación de animales, especialmente de mamíferos, incluyendo humanos.
Este objeto se soluciona mediante el uso de una molécula de ácido oligodesoxinucleico (abreviadamente en inglés ODN) que tienen una estructura según la fórmula (I)
1
siendo cualquier X O o S,
en donde cualquier NMP es un 2'-desoxinucleósido monofosfato o monotiofosfato, seleccionado del grupo constituido por desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxinosina, desoxicitosina, desoxiuridina, desoxitimidina, 2-metildesoxinosina, 5-metildesoxicitosina, desoxipseudouridina, desoxiribosapurina, 2-aminodesoxiribosapurina, 6-S-desoxiguanidina, 2-dimetildesoxiguanosina o N-isopentenildesoxiadenosina monofosfato o monotiofosfato, NUC es un 2'-desoxinucleósido, seleccionado del grupo constituido por desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxinosina, desoxicitosina, desoxiuridina, desoxitimidina, 2-metildesoxinosina, 5-metildesoxicitosina, desoxipseudouridina, desoxiribosapurina, 2-aminodesoxiribosapurina, 6-S-desoxiguanina, 2-dimetildesoxiguanosina o N-isopentenildesoxiadenosina,
A y B son dígitos entre 0 y 100 con la condición de que a+b esté entre 4 y 150,
B y E son grupos comunes para los extremos 5' ó 3' de las moléculas de ácido nucleico, para preparar una composición farmacéutica inmunoestimulante.
Sorprendentemente, se encontró que los ODNs que contienen residuos de desoxinosina (I-ODNs) muestran un efecto inmunoestimulante comparable o en muchos casos incluso mejor que los ODNs que contienen motivos CpG. Además, los ODNs según la presente invención producen respuestas inmunes más específicas ante un antígeno dado o un fragmento de antígeno que los ODNs de CpG. Además, los ODNs según la presente invención redujeron la inducción de las reacciones secundarias adversas, especialmente la inducción del TNF-\alpha sistémico o la IL-6.
Mientras que ciertos efectos inmunoestimulantes se han descrito para moléculas de RNA que contienen inosina, tales como las poli-IC o las moléculas mencionadas en el documento WO 98/16247, sorprendentemente se encontró que las moléculas de ácido desoxinucleico que contienen residuos de desoxinosina, pueden ser buenos ODNs estimulantes.
Además, los I-ODNs según la presente invención no son - encontraste con los ODNs basados en el motivo específico CpG - dependientes de un motivo específico o una secuencia palindrómica como se describe para los oligonucleótidos (véanse por ejemplo los documentos EP 0 468 520 A2, WO 96/02555, WO 98/18810, WO 98/37919, WO 98/40100, WO 98/52581, WO 99/51259 y WO 99/56755, todos incorporados aquí en la referencia). Por tanto, un grupo de I-ODNs según la presente invención puede contener preferiblemente un motivo CI (y por tanto los ODNs descritos en estas referencias incorporadas se reemplazan con residuos de desoxinosina son presentaciones preferidas de los presentes ODNs). No es necesario para su propiedad inmunoestimulante principal, ya que los I-ODNs con una inosina no situada en un contexto CI o IC exhiben también propiedades inmunoestimulantes.
El Í-ODN según la presente invención es por lo tanto una molécula de ADN que contiene un resto de deoxinosina provisto preferentemente en forma de una sola hebra.
El I-ODN según la presente invención se puede aislar mediante métodos recombinantes o sintetizarse químicamente. En el último caso, el I-ODN según la presente intención también puede contener oligonucleótidos modificados que se pueden sintetizar usando transformaciones químicas estándares, tales como metilfosfonatos u otros oligonucleótidos modificados basados en fósforo, tales como los triésteres de fósforo, fosfoamidatos y fósforoditioratos. Se pueden usar otros oligonucleótidos modificados no basados en fósforo (Stirchak et al., Mar 17 (1989), 6129-6141), como los monofosfatos o monotiofosfatos, prefiriéndo usarse el 2'-desoxinucleósido monofosfato en la presente invención.
Los NPS de los I-ODNs según la presente invención se seleccionan preferiblemente del grupo consistente en desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxinosina, desoxicitosina, desoxiuridina, desoxitimidina, 2-metildesoxinosina, 5-metildesoxicitosina monofosfato o monotiofosfato (de manera habitual, el grupo fosfato o tiofosfato está en la posición 5' de la desoxirribosa). Mientras que es esencial para los ODNs basados en el motivo CpG que este motivo no esté metilado, sorprendentemente no es el caso de los ODNs según la presente invención. Alternativamente, en vez de las formas 2-desoxi de los NMPs, también otros, especialmente grupos inertes pueden estar presentes en la posición 2 del grupo ribosa, tales como por ejemplo -F, -NH_{2}, -CH_{3}, especialmente -CH_{3}. Por supuesto, los grupos -OH y -SH se excluyen de los ODNs según la presente invención para estar presente en la posición 2' de la ribosa, especialmente el residuo de ribosa para NMP de inosina.
La longitud de los ODNs según la presente invención está en el intervalo de los ODNs estándares según la técnica anterior. Por tanto las moléculas con una longitud total por debajo de 4 y por encima de 150 muestran un potencial gradualmente decreciente inmunoestimulante. Los ODNs preferidos contienen entre 10 a 60, especialmente entre 15 y 40 bases (nucleósidos), implicando que a + b en la fórmula I está entre 10 y 60, preferiblemente entre 15 y 40 en estas presentaciones preferidas.
Mientras que las moléculas de ácido ribonucleico que contienen inosina y histidina son descritas como inmunoestimulantes en la técnica anterior son ácidos polinucleicos grandes y relativamente indefinidos con pesos moleculares superiores a 200.000 (un ácido poliinosínico-policitidínico disponible comercialmente en Sigma Chemicals tienen un peso molecular que oscila entre los 220.00 a 460.000 (al menos 500-1000 residuos C+I). Las moléculas según la presente invención son moléculas de ADN de longitud mucho menor con una longitud y composición bien definidas, siendo altamente reproducible en productos.
Se prefiere además que la desoxinosina de los NMP que contienen desoxinosina de los I-ODNs según la fórmula I sea un monotiofosfato con uno a cuatro átomos de azufre y que también NMPs adicionales, especialmente todos los NMPs adicionales, estén presentes en forma de nucleósidos monotiofosfatos, porque tales ODNs exponen alta resistencia a nucleasa (está claro para la presente invención que el "mono" en los "monotiofosfatos" se refiere al fosfato, es decir, que un grupo fosfato (un átomo de fósforo) está presente en cada NMP). Preferiblemente, al menos uno entre X_{1} y X_{2} es S y al menos uno entre X_{3} y X_{4} es O en los NMPs según la presente invención. Preferiblemente, X_{3} y X_{4} son O. (X_{3} puede ser (debido a la síntesis del NMP) derivado por ejemplo del grupo fosfato o del grupo 3' de los ribosa-NMPs).
Preferiblemente los ODNs según la presente invención contienen la secuencia
hhh wdi dhh h
nhh hhh wdi nhh hhh hhh wn,
nhh wdi din hhh hdi ndi nh,
nhh hhh wdi dhh hhh hhh wn o
nhh wdi did hhh hdi ddi dh,
en donde cualquier n es un 2'-desoxinucleósido monofosfato o monotiofosfato, seleccionado del grupo consistente en desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxicitosina o desoxitimidina monofosfato o monotiofosfato,
cualquier h es un 2'-desoxinucleósido monofosfato o monotiofosfato, seleccionado del grupo consistente en desoxiadenosina, desoxicitosina o desoxitimidina monofosfato o monotiofosfato
i es desoxinosina monofosfato o monotiofosfato,
cuaquier w es un 2'-desoxinucleósido monofosfato o monofosfato, seleccionado del grupo consistente en desoxiadenosina o desoxitimidina monofosfato o monotiofosfato, y
cualquier d es un 2' desoxinucleósido monofosfato o monotiofosfato, seleccionado del grupo consistente en desoxiadenosina, desoxiguanosina o desoxitimidina monofosfato o monotiofosfato.
Como se subrayó anteriormente, un motivo específico (tal como CpG o un palíndrome) no es necesario para los I-ODNs según la presente invención. Sin embargo, se prefieren los ODNs que contienen un motivo CI de manera que una presentación preferida del ODN según la fórmula I contienen al menos un 2'desoxicitosina monofosfato o monotiofosfato para formar tal motivo 5'-CI 3', especialmente un desoxinosina-desoxicitosina 26-mer.
Los ODNs preferidos según la presente invención contienen una o más de la secuencia
gacitt, especialmente tcc atg aci ttc ctg atg ct,
iacitt
gaictt,
iaictt,
en donde
a es desoxiadenosina monofosfato o monotiofosfato
g es desoxiguanosina monofosfato o monotiofosfato
i es desoxinosina monofosfato o monotiofosfato
c es desoxicitidina monofosfato o monotiofosfato y
t es desoxitimidina monofosfato o monotiofosfato.
Los I-ODNs según la presente invención son especialmente adecuados para aplicación en el campo farmacéutico, por ejemplo para ser aplicados como medicina en un animal o en humanos. Están adaptados específicamente para actuar como un agente inmunoestimulante, especialmente en o junto a composiciones de vacunas.
Por tanto, la presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un ODN según la presente invención.
Ya que una composición farmacéutica preferida según la presente invención es una vacuna, esta composición debería contener un antígeno además del ODN según la presente invención. El potencial de este antígeno para dar lugar a una respuesta de protección/inmune de los individuos vacunados se aumenta fuertemente por combinación con los ODNs según la presente invención, especialmente debido a su actividad inmunoestimulante.
Una vacuna puede contener toda una variedad de antígenos diferentes, Ejemplos de antígenos son organismos muertos tales como virus inactivados o bacterias, hongos, protozoos o incluso células cancerígenas. Los antígenos pueden consistir también en subfracciones de estos organismos/tejidos, de proteínas, o en su forma más simple, de péptidos. Los antígenos también pueden ser reconocidos por el sistema inmune en forma de proteínas glucosiladas o péptidos y también pueden ser o contener polisacáridos o lípidos. Los péptidos cortos se pueden usar ya que por ejemplo las células T citotóxicas (abreviadamente en inglés CTL) reconocen antígenos en forma de péptidos largos de 8-11 aminoácidos inusualmente cortos en unión con el complejo mayor de histocompatibilidad (abreviadamente en inglés MHC) (Rammensee et al., Inmunogenetics 41, (1995), 178-228). Las células reconocen péptidos más largos empezando alrededor de 15 aminoácidos (Harrow et al, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)). En contraste con los epitopos de las células T, las estructura tridimensional de los antígenos de las células B también pueden ser importantes para el reconocimiento de anticuerpos. En orden de obtener respuestas inmunes sostenidas, específicas de antígeno, los coadyuvantes son útiles para desencadenar cascadas inmunes que implican todas las células del sistema inmune necesarias. En primer lugar, los coadyuvantes están actuando, pero no se restringen en su modo de acción, en las denominadas células presentadoras de antígeno (abreviadamente en inglés APCs). Estas células habitualmente encuentran primero los antígeno(s) seguidos por la presentación del antígeno procesado o no modificado al efector inmune. Los tipos de células intermediarias también pueden estar implicadas. Solo las células efectoras con la especifidad apropiada son activadas en una respuesta inmune productiva. El coadyuvante también puede retener localmente antígenos y otros factores co-inyectados. Además el coadyuvante puede actuar como quimioatrayente para otras células inmunes o puede actuar localmente y/o sistémicamente como un agente estimulante para el sistema inmune.
Según una presentación preferida, los epitopos de las células T se usan como antígenos. Alternativamente, una combinación de los epitopos de las células T y los epitopos de las células B también pueden preferirse.
Los antígenos a usar en las presentes composiciones no son críticos. Por supuesto también se pueden usar mezclas de antígenos diferentes según la presente invención. Preferiblemente, se usan proteínas o péptidos derivados de un virus o de un patógeno bacteriano o de un hongo o parásitos como tales antígenos (incluyendo antígenos derivatizados o antígenos glucosilados o lipídicos o polisacáridos o lípidos). Otra fuente preferida de antígenos son antígenos tumorales. Los patógenos preferidos se seleccionan del virus de la inmunodeficiencia humana (abreviadamente en inglés HIV), virus de la hepatitis A y B, virus de la hepatitis C (abreviadamente en inglés HCV), virus del sarcoma rojo (abreviadamente en inglés RSV), virus de Epstein Barr (abreviadamente en inglés EBV), virus Influenza, Rotavirus, Staphylococcus aureus, Chlamydia pneumonias, Chlamidia trachomatis, Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus pneumonias, Bacillus anthracis, Vibrio cholerae, Plasmodium sp. (Pl. falciparum, Pl. vivax, etc.), Aspergillus sp. o Candida albicans. Los antígenos también pueden ser moléculas expresadas por células cancerígenas (antígenos tumorales). Los procesos de derivación pueden incluir la purificación de una proteína específica de las células patógenas/cancerígenas, la inactivación del patógeno así como la derivatización proteolítica o química o estabilización de una proteína sí. De la misma manera los antígenos antitumorales (vacunas de cáncer) o antígenos autoinmunes se pueden usar en la composición farmacéutica según la presente invención. Con tales composiciones se puede realizar una vacunación tumoral o un tratamiento para enfermedades autoinmunes.
En el caso de antígenos peptídicos el uso de mimimitopos peptídicos/agonistas/superagonistas/antagonistas o péptidos cambió en ciertas posiciones sin afectar a las propiedades inmunológicaso mimitopos no peptídicos/agonistas/su-
peragonistas/antagonistas (revisado en Sparbier and Walden, 1999) se incluye en la presente invención. Los antígenos peptídicos también pueden contener elongaciones tanto en el extremo carboxi o amino terminal del antígeno peptídico, facilitando la interacción con el compuesto(s) policatiónicos o el compuesto(s) inmunoestimulante. Se pueden aplicar antagonistas peptídicos para el tratamiento de las enfermedades autoinmunes.
Los antígenos también se pueden derivatizar para incluir moléculas que potencian la presentación del antígeno y hacen de diana de antígenos a las células presentadoras de antígeno.
En una realización de la invención, la composición farmacéutica sirve para conferir tolerancia ante proteínas o fragmentos proteicos y péptidos que están implicados en las enfermedades autoinmunes. Los antígenos usados en estas presentaciones sirven para tolerar el sistema inmune o regular negativamente las respuestas inmunes frente a epitopos implicados en procesos autoinmunes.
Preferiblemente la composición farmacéutica según la presente invención, especialmente en la forma de una vacuna, comprende además un polímero policatiónico, preferiblemente un péptido policatiónico, especialmente poliarginina, polilisina o un péptido antimicrobiano.
El compuesto(s) policatiónico para usar según la presente invención puede ser cualquier compuesto policatiónico que presente el efecto característico según el documento WO 97/30721. Los compuestos policatiónicos preferidos se seleccionan a partir de polipéptidos básicos, policationes orgánicos, poliaminoácidos básicos o mezclas de los mismos. Estos poliaminoácidos deberían de tener una longitud de cadena de al menos 4 residuos de aminoácido (véase:Tuftsin como se describe en Golldman et al. (1983)). Son preferidas especialmente sustancias que contienen enlaces peptídicos, como polilisina, poliarginina y polipéptidos que contienen más del 20%, especialmente más del 50% de residuos de aminoácidos básicos en un intervalo de más de 8, especialmente más de 20, residuos de aminoácidos o mezclas de los mismos. Otros policationes preferidos y sus composiciones farmacéuticas de describen en el documento WO 97/30721 (por ejemplo polietilenimina) y el documento WO 99/38528. Preferiblemente estos polipéptidos contienen entre 20 y 500 residuos de aminoácidos, especialmente entre 30 y 200 residuos.
Estos compuestos policatiónicos se pueden producir químicamente o por recombinación o se pueden obtener a partir de fuentes naturales.
Los (poli)péptidos catiónicos también pueden ser péptidos microbianos antibacterianos policatiónicos con propiedades como las revisadas en (Ganz and Lehrer, 1999; Hancock, 1999). Esto (poli)péptidos puden ser de origen procariótico o animal o provenir de plantas, o se pueden producir químicamente o por recombinación (Andreu y Rivas, 1998; Ganz and Lehrer, 1999; Simmaco et al., 1998). Los péptidos también puden pertenecer a la clase de las defensinas(Ganz, 1999; Ganz and Lehrer, 1999). Las secuencias de tales péptidos se puede encontrar, por ejemplo, en la Antimicrobial Secuences Database en la siguiente dirección de internet:
http://www.bbcm.univ.trieste.it/\simtossi/pag1.html
Tales péptidos de defensa o defensivos del hospedador también son una forma preferida del polímero policatiónico según la presente invención. Generalmente, un compuesto que permita como activación de producto final (o regulación negativa) del sistema inmune adaptativo, preferiblemente mediado por APC's (incluyendo células dendríticas) se usa como polímero policatónico.
Especialmente preferidos para uso como sustancia policatiónica en la presente invención son la catelicidina derivada de péptidos antimicrobianos o derivados de los mismos (documento A 1416/2000, incorporado aquí por referencias), especialmente péptidos antimicrobianos derivados de catelicidina de mamíferos, preferiblemente de humanos, bovina o de ratón, o compuestos neuroactivos, tales como la hormona del crecimiento (humana).
Los compuestos policatiónicos derivados de fuentes naturales incluyen HIV-REV o HIV-TAT (derivados de péptidos catiónicos, péptidos de antenappedios, quitosanas u otros derivados de quitinas) u otros péptidos derivados de estos péptidos o proteínas mediante producción bioquímica o por recombinación. Otros compuestos policatiónicos preferidos son la catalina o sustancias relacionadas con o derivadas de la catalina. Por ejemplo, la catalina de ratón es un péptido que tienen la secuencia de aminoácidos NH_{2}-RLAGLLRKGKEKIGEKLKKIGOKIKNFFQKLVPQPE-COOH. Las sustancias relacionadas con o derivadas de la catalina contienen todas las partes de la secuencia de la catalina con al menos 15-20 residuos de aminoácidos. Las derivaciones pueden incluir la sustitución o modificación e los amoinoácidos naturales por aminoácidos que no están entre los 20 aminoácidos estándar. Además, los residuos catiónicos adicionales se pueden introducir dentro de tales moléculas de catalina. Se prefiere que estas moléculas de catalina estén combinadas con el antígeno y el ODN inmunológico según la presente invención. Sin embargo, estas moléculas de catalina sorprendentemente se ha encontrado que también son eficaces como coadyuvantes para un antígeno sin adición de coadyuvantes adicionales. Por tanto es posible usar tales moléculas de catalina como coadyuvantes eficaces en formulaciones de vacunas con o sin sustancias inmunoactivantes adicionales.
Otra sustancia policatiónica preferida para usar según la presente invención un péptido sintético que contiene al menos 2 motivos KLF separados por una unión de 3 a 7 aminoácidos hidrofóbicos (documento A 1789/2000, incorporado aquí por referencia).
Para los autores fue muy sorprendente que el efecto inmunoestimulante de la composición farmacéutica según la presente invención fuese significativamente mayor de lo que se podía esperar de la adición de los efectos de cada componente por separado o incluso de la adición de los efectos del ODN o del policatión con el antígeno.
\newpage
En la fórmula (I), B y E son grupos habituales en los extremos 5' y/o 3' de las moléculas de ácido nucleico. Ejemplos de tales grupos están disponibles para los expertos en la técnica (Véase por ejemplo "Oligonucleotides and Analogues- A practical approach" (1991), ed. Eckstein, Oxford University Press). Para los I-ODNs según la presente invención B y/o E se seleccionan preferiblemente independientemente del grupo constituido por H, CH_{3}, COCH\cdot, OH, CHO, un fosfato, tiofosfato, un grupo sulfato o tiosulfato, o un grupo fosfoalquilo, especialmente con una longitud de alquilo de C_{1}-C_{6} y/o un grupo amino terminal (el grupo amino puede usarse además para marcaje de los I-ODNs según la presente invención, por ejemplo con PO_{4},-(CH_{2})n, NH_{2} o PO_{4}-(Ch_{2})_{n}-NH). Especialmente preferidos como B son los nucleósidos, especialmente los 2'-desoxinucleótidos mencionados anteriormente (es decir sin el grupo fosfato o tiofosfato).Alternativamente estos grupos también pueden contener grupos de unión a otras moléculas, especialmente moléculas transportadoras o marcadoras. En tales formas, los ODNs en donde los ODNs están unidos superficies sólidas o partículas o marcadores, estas superficies, partículas, marcadores, etc. También forman parte de los grupos B y/o E.
Por supuesto, cualquier forma ionizada (sal) o formas tautoméricas de las moléculas según la fórmula I se incluyen en esta fórmula I.
La composición farmacéutica según la presente invención puede comprender además ingredientes activos (sustancias activas farmacéuticamente), especialmente sustancias que se puedan usar en conexión con una vacuna. Las presentaciones preferidas de tales ingredientes activos adicionales son citoquinas, sustancias antiinflamatorias, sustancias antimicrobianas o combinaciones de las mismas.
Por supuesto, la composición farmacéutica según la presente invención puede contener además sustancias auxiliares, especialmente un vehículo farmacéutico adecuado, sustancias tampón, estabilizantes o combinaciones de los mismos.
Las cantidades relativas de los ingredientes de la presente composición farmacéutica son altamente dependientes de las necesidades de los antígenos individuales de los animales/humanos a los cuales se les debería aplicar esta composición. Por tanto, la composición farmacéutica según la presente invención contiene preferiblemente uno o más ODNs según la presente invención, preferiblemente 1 pg a 10 g, preferiblemente 1 ng a 1 g, más preferiblemente 100 ng a 10 mg, especialmente 10\mug a 1mg. El antígeno, así como el polímero policatiónico pueden aplicarse en dosis similares, un intervalo de 1 a 10.000 mg de antígeno y prefiriéndose 0,1 a 1.000 mg de aplicación por vacunación
Las presentes composiciones se pueden aplicar a un paciente, por ejemplo un candidato para vacunar, en cantidades efectivas por ejemplo semanalmente, bisemanalmente o en intervalos mensuales. Los pacientes a tratar con las presentes composiciones también se pueden vacunar repetidamente o solamente una vez. Un uso preferido de la presente invención es la inmunización activa, especialmente de humanos o animales sin protección frente a un antígeno específico.
La vía de aplicación para la presente composición no es crítica, siendo adecuadas por ejemplo la inyección subcutánea, intramuscular, intradérmica o transdérmica así como la administración oral.
También es posible aplicar la presente composición separadamente, por ejemplo inyectando la sustancia inmunoestimulante separadamente de la composición de antígeno/policatión. Por tanto, la presente invención también está dirigida a un kit que comprende una composición que contienen el antígeno y el polímero policatiónicos como un componente y una composición que contienen la sustancia inmunoestimulante o quimiotáctica como segundo componente.
Se describen los detalles de la presente invención en los siguientes ejemplos y figuras, pero por supuesto la invención no sólo se limita a ellos.
La figura 1 muestra la respuesta inmune frente al péptido OVA_{257-264} derivado de ovoalbúmina después de la inyección de OVA_{257-264}, poli-L-arginina (pR 60) y desoxinosina que contienen I-oligodesoxinucleótidos (abreviadamente en inglés I-ODN) o CpG 1668. Se inyectó a los ratones en la almohadilla de la pata trasera con las mezclas que se indican. Cuatro días más tarde del drenaje de células de nódulo linfático se estimularon ex vivo con OVA_{257-264} 24 horas más tarde usando un ensayo ELISPOT. Los resultados se expresaron como el número de puntos/1x10^{6} células de nódulo linfático.
La figura muestra la inducción de producción de TNF-a sistémico después de la inyección de OVA_{257-264},poli-L-arginina (pR 60) y desoxinosina que contienen I-oligodesoxinucleótidos (abreviadamente en inglés I-ODN) o CpG 1668 . Se inyectó a los ratones en las patas traseras con las mezclas que se indican. Una hora después de la inyección se extrajo sangre de la vena de la cola y se preparó suero. La concentración de TNF-a en suero se determinó usando un ensayo ELISA.
La figura 3 muestra la respuesta inmune frente al péptido OVA_{257-264} derivado de ovoalbúmina después de la inyección de OVA_{257-264}, poli-L-arginina (pR 60) y desoxinosina que contienen I-oligodesoxinucleótidos (abreviadamente en inglés I-ODN) o CpG 1668. Se inyectó a los ratones en las patas traseras con las mezclas que se indican. Cuatro días más tarde del drenaje de células de nódulo linfático se estimularon ex vivo con OVA_{257-264}, un péptido irrelevante mTRP2_{181-188} (proteína 2 relacionada con murina tiroxinasa, VYDFFVWL) o pR 60. El número de células productoras de IFN-g se determinó 24 horas más tarde usando un ensayo ELISPOT. Los resultados se expresaron como el número de puntos/1x10^{6} células de nódulo linfático con la desviación estándar de los triplicados.
La figura 4 muestra la inducción de la producción de TNF-a sistémico después de la inyección de OVA_{257-264}, poli-L-arginina (pR 60) y desoxinosina que contienen I-oligodesoxinucleótidos (abreviadamente en inglés I-ODN) o CpG 1668. Se inyectó a los ratones en las patas traseras con las mezclas que se indican. Una hora después de la inyección se extrajo sangre de la vena de la cola y se preparó suero. La concentración de TNF-a y IL-6 en el suero se determinó usando ELISAS específicos de citoquinas.
La figura 5 muestra la respuesta inmune frente al péptido OVA_{257-264} derivado de ovoalbúmina después de la inyección de TRP-2, poli-L-arginina, CpG 1668 o secuencias de 20-mer al azar que contienen desoxinosina. Se inyectó a los ratones en las patas traseras con las mezclas que se indican. Cuatro días más tarde del drenaje de células de nódulo linfático se estimularon ex vivo con TRP-2, un péptido irrelevante OVA_{257-264}, o pR 60. El número de células productoras de IFN.g se determinó 24 horas más tarde usando un ensayo ELISPOT. Los resultados se expresaron como el número de puntos/1x10^{6} células de nódulo linfático con la desviación estándar de los triplicados.
La figura 6 muestra la inyección combinada de I-ODN y poli- L-arginina (PR 60) junto con un péptido derivado de melanoma.
La figura 7 muestra que la inyección combinada de I-ODN y pR 60 junto con un péptido derivado de melanoma reduce la inducción de TNF-\alpha sistémico e IL-6.
La figura 8 muestra la inyección combinada de 10-mer al azar de I-ODNs y pR60 junto con un péptido derivado de melanoma.
La figura 9 muestra que la aplicación combinada de ovoalbúmina (abreviadamente OVA) con oligo-dIC_{26-mer} y pR potencia la producción de anticuerpos IgG específicos de OVA. Se inyectó a los ratones subcutáneamente en las patas traseras con las mezclas que se indican. Los días 24 y 155 después de la inyección, se recogió el suero y se examinaron mediante ELISA anticuerpos de IgG2A (A) e IgG1 (B) específicos de OVA. Los resultados se muestran en forma de valoración de anticuerpos.
Ejemplos
En todos los experimentos se usaron ODNs sustituidos con tiofosfato (con residuos de tiofosfato que sustituyen a fosfato, denominados de aquí en adelante "oligonucleótidos sustituidos con tiofosfato") ya que tales ODNs exhiben una alta resistencia nucleasa (Ballas et al., 1996; Krieg et al., 1995; Parronchi et al., 1999).
Ejemplo 1 La inyección combinada de I-ODNs diferentes y poli-L-arginina (pR 60) sinérgicamente potencia la respuesta frente a un péptido derivado de ovoalbúmina (OVA)
Ratones C57BI/6 (Harlan/Olac)
Péptido Péptido OVA_{257-264} (SIINFEKL), un MHC de clase I (H-2Kb) - epitopo
limitado de ovoalbúmina de pollo (Rotzschke et al., 1991), que se
sintetizó usando una fase sólida F-moc de síntesis química, purificado
mediante HPLC y analizado mediante espectroscopia de masas para
purificación.
Dosis: 300 mg/ratón.
Poli-L-arginina60 (pR60) Poli-L-arginina con un grado medio de polimerización de 60 residuos
de arginina; SIGMA chemicals.
Dosis: 100 mg/ratón.
CpG-ODN 1668 ODNs sustituidos con tiofosfato que contienen un motivo CpG: tcc atg
acg ttc ctg atg ct, que se sintetizaron en NAPS GMBH, Gottingen.
Dosis: 5nmol/ratón
I-ODN 1 ODNs sustituidos con tiofosfato que contienen desoxinosina: tcc ati aci
ttc ctg atg ct, que se sintetizaron en NAPS GMBH, Gottingen.
Dosis: 5nmol/ratón
(Continuación)
Ratones C57BI/6 (Harlan/Olac)
I-ODN 2 ODNs sustituidos con tiofosfato que contienen desoxinosina: tcc atg aci
ttc ctg atg ct, que se sintetizaron en NAPS GMBH, Gottingen.
Dosis: 5nmol/ratón
I-ODN 3 ODNs sustituidos con tiofosfato que contienen desoxinosina:tcc ati aci
iic cti ati ct, que se sintetizaron en NAPS GMBH, Gottingen.
Dosis: 5nmol/ratón
Grupos experimentales (5 ratones por grupo)
1. OVA_{257-264}
2. OVA_{257-264} + pR 60
3. OVA_{257-264} CpG 1668
4. OVA_{257-264} + I-ODN 1
5. OVA_{257-264} + I-ODN 2
6. OVA_{257-264} + I-ODN 3
7. OVA_{257-264} + CpG 1668 + pR 60
8. OVA_{257-264} + I-ODN 1 + pR 60
9. OVA_{257-264} + I-ODN 2 + pR 60
10. OVA_{257-264} + I-ODN 3 + pR 60
Se inyectaron ratones a día cero en cada una de las patas traseras con un volumen total de 100 ml (50 ml por almohadilla del pie) conteniendo los compuestos anteriormente mencionados. Se sacrificaron los animales 4 días después de la inyección y se recolectaron los nódulos linfáticos popliteales. Los nódulos linfáticos se pasaron a través de un tamiz de 70 mm de célula y se lavaron dos veces medio DMEM (GIBCO BRL) que contiene suero de fetal de ternera al 5% (FCS, SIGMA chemicals). Se ajustaron las células a 3x10^{6} células/ml en DMEM/5%/FCS. Se llevó a cabo un ensayo ELISPOT de IFN-g en triplicado como se describe (Miyahira et al., 1995). Este método es un procedimiento que se usa ampliamente que permite la cuantificación de células T específicas de antígeno. Los linfocitos se estimularon ex vivo con medio control de fondo, péptido OVA_{257-264} ó Concavalina A (abreviadamente Con A). Los puntos que representan células T individuales productoras de IFN-g se contabilizaron como el número de puntos de fondo que se sustrajo de todas las muestras.
El alto número de puntos detectados después de la estimulación con Con A (no se muestran los datos) indican la buena condición de los linfocitos usados. Para cada grupo experimental de ratones el número de puntos/1x10^{6} células se ilustra en la figura 1.
Una hora después de la inyección, se extrajo sangre de la vena de la cola y se preparó suero para determinar la inducción de TF-a sistémico usando un ELISA (figura 2).
Ejemplo 2 El intercambio de Guanosina por desoxinosina convierte la secuencia GpC no inmunogénica en una altamente inmunogénica, especialmente cuando se combina con poli-L-arginina (pR60)
Ratones C57BI/6 (Harlan/Olac)
Péptido Péptido OVA_{257-264} (SIINFEKL), un MHC de clase I (H-2Kb) - epitopo
limitado de ovoalbúmina de pollo (Rotzschke et al., 1991), que se
sintetizó usando una fase sólida F-moc de síntesis química, purificado
mediante HPLC y analizado mediante espectroscopia de masas para
purificación.
Dosis: 300 \mug/ratón.
Poli-L-arginina60 (pR60) Poli-L-arginina con un grado medio de polimerización de 60 residuos
de arginina; SIGMA chemicals.
Dosis: 100 \mug/ratón.
CpG-ODN 1668 ODNs sustituidos con tiofosfato que contienen un motivo CpG: tcc atg
acg ttc ctg atg ct, que se sintetizaron en NAPS GMBH, Gottingen.
Dosis: 5nmol/ratón
CpG-ODN ODNs sustituidos con tiofosfato que contienen un motivo CpG no
inmunogénico: tcc atg agc ttc ctg, que se sintetizaron en NAPS GMBH,
Gottingen.
Dosis: 5nmol/ratón
I-ODN 9 ODNs sustituidos con tiofosfato que contienen desoxinosina: tcc atg aic
ttc ctg atg ct, que se sintetizaron en NAPS GMBH, Gottingen.
Dosis: 5nmol/ratón
I-ODN 10 ODNs sustituidos con tiofosfato que contienen desoxinosina: tcc ati aic
ttc cti ati ct, que se sintetizaron en NAPS GMBH, Gottingen.
Dosis: 5nmol/ratón
Grupos experimentales (5 ratones por grupo)
OVA_{257-264}
OVA_{257-264} + pR 60
OVA_{257-264} CpG 1668
OVA_{257-264} CpG
OVA_{257-264} + I-ODN 9
OVA_{257-264} + I-ODN 10
OVA_{257-264} + CpG 1668 + pR 60
OVA_{257-264} + CpG + pR 60
OVA_{257-264} + I-ODN 9 + pR 60
OVA_{257-264} + I-ODN 10 + pR 60
Se inyectaron ratones a día cero en las patas traseras con un volumen total de 100 \mul (50 \mul por almohadilla del pie) conteniendo los compuestos anteriormente mencionados. Se sacrificaron los animales 4 días después de la inyección y se recolectaron los nódulos linfáticos popliteales. Los nódulos linfáticos se pasaron a través de un tamiz de 70 \mum de célula y se lavaron dos veces medio DMEM (GIBCO BRL) que contiene suero de fetal de ternera al 5% (FCS, SIGMA chemicals). Se ajustaron las células a 3x10^{6} células/ml en DMEM/5%/FCS. Se llevó a cabo un ensayo ELISPOT de IFN-g en triplicado como se describe (Miyahira et al., 1995). Este método es un procedimiento que se usa ampliamente que permite la cuantificación de células T específicas de antígeno. Los linfocitos se estimularon ex vivo con medio (de fondo), péptido OVA_{257-264} un péptido irrelevante mTRP2181-188 (proteína 2 relacionada con murina tiroxinasa, VYDFFVWL), pR 60, y Concavalina A (abreviadamente Con A). Los puntos que representan células T individuales productoras de IFN-g se contabilizaron como el número de puntos de fondo que se sustrajo de todas las muestras.
El alto número de puntos detectados después de la estimulación con Con A (no se muestran los datos) indican la buena condición de los linfocitos usados. Para cada grupo experimental de ratones el número de puntos/1x10^{6} células se ilustra en la figura 3, se da la desviación estándar de los triplicados estimulados ex vivo.
Una hora después de la inyección, se extrajo sangre de la vena de la cola y se preparó suero para determinar la inducción de TNF-a sistémico IL-6 usando ELISAS específicos de citoquinas.
Ejemplo 3 La inyección combinada de secuencias 20-mer al azar que contienen desoxinosina y péptido derivado de melanoma induce una fuerte respuesta frente al péptido que puede ser potenciada adicionalmente por la co-aplicación de poli-L-arginina (pR60)
Ratones C57Bl/6 (Harlan/Olac)
Péptido Péptido TRP2 (VYDFFVWL), un MHC de clase I (H-2Kb) - epitopo limitado
de proteína 2 relacionada con tiroxinasa de ratón (Bllom et al., 1997), que se
sintetizó usando una fase sólida F-moc de síntesis química, purificado mediante
HPLC y analizado mediante espectroscopia de masas para purificación.
Dosis: 300 \mug/ratón.
Poli-L-arginina60 (pR60) Poli-L-arginina con un grado medio de polimerización de 60 residuos de arginina;
SIGMA chemicals.
Dosis: 100 \mug/ratón.
CpG-ODN 1668 ODNs sustituidos con tiofosfato que contienen un motivo CpG: tcc atg acg ttc ctg
atg ct, que se sintetizaron en NAPS GMBH, Gottingen.
Dosis: 5nmol/ratón
wdi ODNs sustituidos con tiofosfato:nhh hhh wdi nhh hhh hhh wn, que se sintetizaron
en NAPS GMBH, Gottingen.
Dosis: 5nmol/ratón
wdidin ODNs sustituidos con tiofosfato:nhh hhh nhh hhh hhh wn, que se sintetizaron en
NAPS GMBH, Gottingen.
Dosis: 5nmol/ratón
wdid ODNs sustituidos con tiofosfato:nhh hhh wdi dhh hhh hhh wn, que se sintetizaron
en NAPS GMBH, Gottingen.
Dosis: 5nmol/ratón
wdidid ODNs sustituidos con tiofosfato:nhh wdi did hdi ddi dh, que se sintetizaron en
NAPS GMBH, Gottingen.
Dosis: 5nmol/ratón
Grupos experimentales (5 ratones por grupo)
1. TRP-2
2. TRP-2 + pR 60
3. TRP-2 + CpG 1668
4. TRP-2 + wdi
5. TRP-2 + wdidin
6. TRP-2 + wdid
7. TRP-2 + wdidid
8. TRP-2 + CpG 1668 + pR 60
9. TRP-2 + wdi + pR 60
10. TRP-2 + wdidin + pR 60
11. TRP-2 + wdid + pR 60
12. TRP-2 + wdidid + pR 60
Se inyectaron ratones a día cero en las patas traseras con un volumen total de 100 \mul (50 \mul por almohadilla del pie) conteniendo los compuestos anteriormente mencionados. Se sacrificaron los animales 4 días después de la inyección y se recolectaron los nódulos linfáticos popliteales. Los nódulos linfáticos se pasaron a través de un tamiz de 70 \mum de célula y se lavaron dos veces medio DMEM (GIBCO BRL) que contiene suero de fetal de ternera al 5% (FCS, SIGMA chemicals). Se ajustaron las células a 3x10^{6} células/ml en DMEM/5%/FCS. Se llevó a cabo un ensayo ELISPOT de IFN-g en triplicado como se describe (Miyahira et al., 1995). Este método es un procedimiento que se usa ampliamente que permite la cuantificación de células T específicas de antígeno. Los linfocitos se estimularon ex vivo con medio (de fondo), péptido TRP2, un péptido irrelevante OVA_{257-264}, pR 60, y Concavalina A (abreviadamente Con A). Los puntos que representan células T ndividuales productoras de IFN-g se contabilizaron como el número de puntos de fondo que se sustrajo de todas las muestras.
El alto número de puntos detectados después de la estimulación con Con A (no se muestran los datos) indican la buena condición de los linfocitos usados. Para cada grupo experimental de ratones el número de puntos/1x10^{6} células se ilustra en la figura 5, se da la desviación estándar de los triplicados estimulados ex vivo.
Ejemplo 4 La inyección combinada de I-ODN y poli-L-arginina (pR60) potencia sinérgicamente la respuesta inmune frente a péptido derivado de melanoma Grupos experimentales (5 ratones por grupo)
1. TRP-2_{181-188}
2. TRP-2_{181-188} + pR 60
3. TRP-2_{181-188} + CpG 1668
4. TRP-2_{181-188} + I-ODN 2
5. TRP-2_{181-188} + CpG 1668 + pR60
Se inyectaron ratones a día cero en las patas traseras con un volumen total de 100 \mul (50 \mul por almohadilla del pie) conteniendo los compuestos anteriormente mencionados. Se sacrificaron los animales 4 días después de la inyección y se recolectaron los nódulos linfáticos popliteales. Los nódulos linfáticos se pasaron a través de un tamiz de 70 \mum de célula y se lavaron dos veces en medio DMEM (GIBCO BRL) que contiene suero de fetal de ternera al 5% (FCS, SIGMA chemicals). Se ajustaron las células a 3x10^{6} células/ml en DMEM/5%/FCS. Se llevó a cabo un ensayo ELISPOT de IFN-g en triplicado como se describe (Miyahira et al., 1995). Este método es un procedimiento que se usa ampliamente que permite la cuantificación de células T específicas de antígeno. Los linfocitos se estimularon ex vivo con medio control de fondo, péptido TRP-2_{181-188}, un péptido irrelevante OVA_{257-264}, pR 60, y Concavalina A (abreviadamente Con A). Los puntos que representan células T puntuales productoras de IFN-ã se contabilizaron como el número de puntos de fondo que se sustrajo de todas las muestras.
El alto número de puntos detectados después de la estimulación con Con A (no se muestran los datos) indican la buena condición de los linfocitos usados. Para cada grupo experimental de ratones el número de puntos/1x10^{6} células se ilustra en la figura 6, se da la desviación estándar de los triplicados estimulados ex vivo. Una hora después de la inyección, se extrajo sangre de la vena de la cola y se preparó suero para determinar la inducción de TNF-a sistémico IL-6 usando ELISAS específicos de citoquinas (figura 7).
Ejemplo 5 La inyección combinada de secuencias 10-mer al azar de I-ODN y poli-L-arginina (pR60) potencia sinérgicamente la respuesta inmune frente a péptido derivado de melanoma Grupos experimentales (5 ratones por grupo)
1. TRP-2_{181-188}
2. TRP-2_{181-188} + pR 60
3. TRP-2_{181-188} + CpG 1668
4. TRP-2_{181-188} + ODN 17
5. TRP-2_{181-188} + CpG 1668 + pR60
6. TRP-2_{181-188} + ODN 17 + pR60
Se inyectaron ratones a día cero en las patas traseras con un volumen total de 100 \mul (50 \mul por almohadilla del pie) conteniendo los compuestos anteriormente mencionados. Se sacrificaron los animales 4 días después de la inyección y se recolectaron los nódulos linfáticos popliteales. Los nódulos linfáticos se pasaron a través de un tamiz de 70 \mum de célula y se lavaron dos veces en medio DMEM (GIBCO BRL) que contiene suero de fetal de ternera al 5% (FCS, SIGMA chemicals). Se ajustaron las células a 3x10^{6} células/ml en DMEM/5%/FCS. Se llevó a cabo un ensayo ELISPOT de IFN-g en triplicado como se describe (Miyahira et al., 1995). Este método es un procedimiento que se usa ampliamente que permite la cuantificación de células T específicas de antígeno. Los linfocitos se estimularon ex vivo con medio control de fondo, péptido TRP-2_{181-188}, un péptido irrelevante OVA_{257-264}, pR 60, y Concavalina A (abreviadamente Con A). Los puntos que representan células T puntuales productoras de IFN-\gamma se contabilizaron como el número de puntos de fondo que se sustrajo de todas las muestras.
El alto número de puntos detectados después de la estimulación con Con A (no se muestran los datos) indican la buena condición de los linfocitos usados. Para cada grupo experimental de ratones el número de puntos/1x10^{6} células se ilustra en la figura 8, se da la desviación estándar de los triplicados estimulados ex vivo.
Ratones C57Bl/6 (Harlan/Olac)
Péptido Péptido TRP2 (VYDFFVWL), un MHC de clase I (H-2Kb) – epitopo limitado
de proteína 2 relacionada con tiroxinasa de ratón (Bllom et al., 1997), que se
sintetizó usando una fase sólida F-moc de síntesis química, purificado mediante
HPLC y analizado mediante espectroscopia de masas para purificación.
Dosis: 100 \mug/ratón.
Poli-L-arginina60 (pR60) Poli-L-arginina con un grado medio de polimerización de 60 residuos de arginina;
SIGMA chemicals.
Dosis: 100 \mug/ratón.
CpG-ODN 1668 ODNs sustituidos con tiofosfato que contienen un motivo CpG: tcc atg acg ttc ctg
atg ct, que se sintetizaron en NAPS GMBH, Gottingen.
Dosis: 5 nmol/ratón
ODN 17 ODNs sustituidos con tiofosfato que contienen desoxinosina: hhh wdi dhh h, que
se sintetizaron en NAPS GMBH, Göttingen.
(h= CAT, w = AT, d = GAT)
Dosis: 10 nmol/ratón
(Continuación)
Ratones C57Bl/6 (Harlan/Olac)
Péptido Péptido TRP2 (VYDFFVWL), un MHC de clase I (H-2Kb) - epitopo limitado
de proteína 2 relacionada con tiroxinasa de ratón (Bllom et al., 1997), que se
sintetizó usando una fase sólida F-moc de síntesis química, purificado mediante
HPLC y analizado mediante espectroscopia de masas para purificación.
Dosis: 100 \mug/ratón.
Poli-L-arginina60 (pR60) Poli-L-arginina con un grado medio de polimerización de 60 residuos de arginina;
SIGMA chemicals.
Dosis: 100 \mug/ratón.
CpG-ODN 1668 ODNs sustituidos con tiofosfato que contienen un motivo CpG: tcc atg acg ttc ctg
atg ct, que se sintetizaron en NAPS GMBH, Gottingen.
Dosis: 5 nmol/ratón
I-ODN 2 ODNs sustituidos con tiofosfato que contienen desoxinosina: tcc atg aci ttc ctg atg
ct, que se sintetizaron en NAPS GMBH, Gottingen.
Dosis: 5nmol/ratón
Ejemplo 6 La aplicación combinada de oligodesoxiIC_{26mer} y poli-L-arginina (pR60) potencia la respuesta humoral específica de ovoalbúmina (OVA)
Ratones C57Bl/6 (Harlan/Olac)
Péptido Péptido TRP2 (VYDFFVWL), un MHC de clase I (H-2Kb) - epitopo limitado
de proteína 2 relacionada con tiroxinasa de ratón (Bllom et al., 1997), que se
sintetizó usando una fase sólida F-moc de síntesis química, purificado mediante
HPLC y analizado mediante espectroscopia de masas para purificación.
Dosis: 50 \mug/ratón.
Poli-L-arginina (pR) Poli-L-arginina con un grado medio de polimerización de 60 residuos de arginina;
SIGMA chemicals, P-4663, Lote 68H5903
Dosis: 100 \mug/ratón.
Desoxioligo IC 26-mer Se sintetizó el Oligo – dIC_{26-mer} mediante la química estándar de la fosfodiamida
(oligo -dIC_{26-mer}) en una escala de 4 \mumol y se purificó mediante HPLC (NAPS GMBH, Gottingen.
Dosis: 5 nmol/ratón
Grupos experimentales (5 ratones por grupo)
1. OVA + oligo - dIC_{26-mer} + pR
2. OVA + oligo - dIC_{26-mer}
3. OVA + Pr
4. OVA
Se inyectaron ratones a día cero en las patas traseras con un volumen total de 100 \mul (50 \mul por almohadilla del pie) conteniendo los compuestos anteriormente mencionados. Se recolectó el suero 24 días después de lainyección y se buscaron mediante ELISA la presencia de anticuerpos específicos de OVA. Estos resultados muestran que la inyección de OVA en combinación con oligo-dIC y pR potencian la producción de anticuerpos IgG específicos de OVA cuando se compara con la inyección de OVA con cada una de las sustancias solas (figura 13ª, B). De manera interesante, las valoraciones de Ig2a e IgG1 aumentaron con una sola inyección de OVA con oligo-dIC/pR, implicando que ambas células Th1 y Th2 estuvieron implicadas. Sin embargo, después de 115 días solo aumentaron los niveles de IgG2a eran aun detectables en el suero de los ratones inyectados con OVA y oligo-dIC/pR.
Estos datos demuestran que la inyección combinada de OVA con oligo-dIC y pR potencia la respuesta humoral específica de OVA. Esta respuesta se caracteriza porque la producción de ambos isotipos de anticuerpos inducidos Th1 y Th2 en la fase inicial, pero más tarde, principalmente los anticuerpos inducidos Th1.
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Claims (16)

1. Uso de una molécula de ácido oligodesoxinucleico (ODN) que tienen la estructura según la fórmula (I):
2
siendo cualquier X O o S,
en la que cualquier NMP es un 2'-desoxinucleósido monofosfato o monotiofosfato, seleccionado del grupo constituido por desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxinosina, desoxicitosina, desoxiuridina, desoxitimidina, 2-metildesoxinosina, 5-metildesoxicitosina, desoxipseudouridina, desoxiribosapurina, 2-aminodesoxiribosapurina, 6-S-desoxiguanidina, 2-dimetildesoxiguanosina o N-isopentenildesoxiadenosina monofosfato o monotiofosfato, NUC es un 2'-desoxinucleósido, seleccionado del grupo constituido por desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxinosina, desoxicitosina, desoxiuridina, desoxitimidina, 2-metildesoxinosina, 5-metildesoxicitosina, desoxipseudouridina, desoxiribosapurina, 2-aminodesoxiribosapurina, 6-S-desoxiguanina, 2-dimetildesoxiguanosina o N-isopentenildesoxiadenosina,
a y b son dígitos entre 0 y 100 con la condición de que a + b esté entre 4 y 150,
B y E son grupos comunes para los extremos 5' ó 3' de las moléculas de ácido nucleico, para preparar una composición farmacéutica inmunoestimulante.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que cualquier NMP se selecciona del grupo constituido por desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxinosina, desoxicitosina, desoxiuridina, desoxitimidina, 2-metildesoxinosina, 5-metildesoxicitosina monofosfato o monotiofosfato.
3. Uso según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque a + b está entre 10 y 60, preferiblemente entre 15 y 40.
4. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque al menos uno entre X_{1} y X_{2} es S y al menos uno entre X_{3} y X_{4} es O y preferiblemente cualquier NMP es un nucleósido monotiofosfato.
5. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dicho ODN contienen la secuencia
hhh wdi dhh h
nhh hhh wdi nhh hhh hhh wn,
nhh wdi din hhh hdi ndi nh,
nhh hhh wdi dhh hhh hhh wn o
nhh wdi did hhh hdi ddi dh,
en la que
cualquier n es un 2'-desoxinucleósido monofosfato o monotiofosfato, seleccionado del grupoconsistente en desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxicitosina o desoxitimidina monofosfato o monotiofosfato,
cualquier h es un 2'-desoxinucleósido monofosfato o monotiofosfato, seleccionado del grupo consistente en desoxiadenosina, desoxicitosina o desoxitimidina monofosfato o monotiofosfato
i es desoxinosina monofosfato o monotiofosfato,
cuaquier w es un 2'-desoxinucleósido monofosfato o monofosfato, seleccionado del grupo consistente en desoxiadenosina o desoxitimidina monofosfato o monotiofosfato, y
cualquier d es un 2' desoxinucleósido monofosfato o monotiofosfato, seleccionado dej grupo consistente en desoxiadenosina, desoxiguanosina o desoxitimidina monofosfato o monotiofosfato.
6. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho ODN contiene al menos un 2'-desoxicitosinamonofosfato o monotiofosfato 3' adyacente a un 2'-desoxinosinamonofosfato monotiofosfato, especialmente desoxinosinadesoxicitosina 26-mer.
7. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dicho ODN contienen la secuencia
gacitt, especialmente tcc atg aci ttc ctg atg ct,
iacitt,
gaictt,
iaictt,
en la que
a es desoxiadenosina monofosfato o monotiofosfato
g es desoxiguanosina monofosfato o monotiofosfato
i es desoxinosina monofosfato o monotiofosfato
c es desoxicitidina monofosfato o monotiofosfato y
t es desoxitimidina monofosfato o monotiofosfato.
8. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque dicho ODN contiene la secuencia
wdi,
wdid,
wdidin o,
wdidid,
en la que w, d, i y n se definen como antes.
9. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque B y E se seleccionan independientemente del grupo constituido por H, --CH_{3}, -COH, COCH_{3}, OH, CHO, PO_{4}, PSO_{3}, PS_{2}O_{2}, PS_{3}O, PS_{4}, SO_{3}, PO_{4}-(CH_{2})_{1}-_{6}-NH_{2} o PO_{4}-(CH_{2})_{1}-_{6}-NH-marcador.
10. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque dicha composición farmacéutica immunoestimulante es una vacuna.
11. Una composición farmacéutica que comprenden un ODN como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
12. Una composición farmacéutica que comprende:
- un ODN como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y
- un antígeno.
13. Una composición farmacéutica según la reivindicación 11 ó 12, caracterizada porque además comprende un polímero policatiónico, preferiblemente un péptido policatiónico, especialmente poliarginina, polilisina o un péptido antimicrobiano, especialmente un péptido antimicrobiano derivado de catelicidina, un péptido sintético que contienen 2 motivos KLK separados por una unión de 3 a 7 aminoácidos hidrofóbicos, o una hormona de crecimiento, especialmente una hormona de crecimiento humana.
14. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 que además comprende ingredientes activos adicionales, especialmente citoquinas, sustancias antiinflamatorias, sustancias antimicrobianas o combinaciones de las mismas.
\newpage
15. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizada porque además comprende sustancias auxiliares, especialmente un vehículo farmacéutico aceptable, sustancias tampón, estabilizantes o combinaciones de las mismas.
16. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, caracterizada porque contiene 1 ng a 1 g, preferiblemente 100 ng a 10 mg, especialmente 10 \mug a 1mg, de uno o más ODNs según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
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