PL211036B1 - Zastosowanie cząsteczki immunostymulującego kwasu oligodezoksynukleinowego (ODN) i zawierająca ją kompozycja - Google Patents

Zastosowanie cząsteczki immunostymulującego kwasu oligodezoksynukleinowego (ODN) i zawierająca ją kompozycja

Info

Publication number
PL211036B1
PL211036B1 PL358982A PL35898201A PL211036B1 PL 211036 B1 PL211036 B1 PL 211036B1 PL 358982 A PL358982 A PL 358982A PL 35898201 A PL35898201 A PL 35898201A PL 211036 B1 PL211036 B1 PL 211036B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
monothiophosphate
monophosphate
odn
deoxyadenosine
use according
Prior art date
Application number
PL358982A
Other languages
English (en)
Other versions
PL358982A1 (pl
Inventor
Walter Schmidt
Karen Lingnau
Carola Schellack
Alena Egyed
Original Assignee
Intercell Biomedizinische Forschungs & Entwicklungs Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AT0100000A external-priority patent/AT410173B/de
Application filed by Intercell Biomedizinische Forschungs & Entwicklungs Ag filed Critical Intercell Biomedizinische Forschungs & Entwicklungs Ag
Publication of PL358982A1 publication Critical patent/PL358982A1/pl
Publication of PL211036B1 publication Critical patent/PL211036B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/24—Heterocyclic radicals containing oxygen or sulfur as ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55516—Proteins; Peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/18—Type of nucleic acid acting by a non-sequence specific mechanism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 358982 (22) Data zgłoszenia: 07.06.2001 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
07.06.2001, PCT/EP01/006433 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
13.12.2001, WO01/93905 (11) 211036 (13) B1 (51) Int.Cl.
A61K 39/39 (2006.01) C07H 21/04 (2006.01) A61P 37/04 (2006.01)
Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy
Zastosowanie cząsteczki immunostymulującego kwasu oligodezoksynukleinowego (ODN) i zawierająca ją kompozycja
(73) Uprawniony z patentu: INTERCELL BIOMEDIZINISCHE
(30) Pierwszeństwo: FORSCHUNGS UND ENTWICKLUNGS AG,
08.06.2000, AT, A1000/2000 Wiedeń, AT
23.11.2000, AT, A1973/2000 (72) Twórca(y) wynalazku:
(43) Zgłoszenie ogłoszono: 23.08.2004 BUP 17/04 WALTER SCHMIDT, Wiedeń, AT KAREN LINGNAU, Wiedeń, AT CAROLA SCHELLACK, Wiedeń, AT ALENA EGYED, Wiedeń, AT
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
30.04.2012 WUP 04/12 (74) Pełnomocnik:
rzecz. pat. Ewa Gromek
PL 211 036 B1
Opis wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania cząsteczki immunostymulującego kwasu oligodezoksynukleinowego (ODN) i zawierającej ją kompozycji.
Szczepionki mogą uratować życie (i zasoby) w większej ilości przypadków niż jakiekolwiek inne interwencje medyczne (Nossal, 1998). Dzięki ogólnoświatowym programom szczepień drastycznie zmniejszono częstość występowania wielu śmiertelnych chorób. Aczkolwiek wyobrażenie takie odnosi się do całego zestawu chorób, na przykład gruźlicy, błonicy, kokluszu, odry i tężca, to w rzeczywistości jednak brak skutecznych szczepionek dla licznych chorób zakaźnych, włącznie z większością zakażeń wirusowych, takich jak AIDS. Nie ma także żadnych skutecznych szczepionek przeciw innym chorobom, czy to zakaźnym, czy niezakaźnym, zabierającym życie milionom chorych każdego roku, w tym takim chorobom jak malaria i rak. Oprócz tego, szybki rozwój bakterii i innych drobnoustrojów opornych na antybiotyki wymaga alternatywnego leczenia przy użyciu szczepionek, co stanowi logiczny wybór.
W końcu, olbrzymie zapotrzebowanie na szczepionki ilustruje fakt, ż e raczej choroby zakaź ne, a nie choroby sercowo-naczyniowe czy rak lub urazy, ciągle jeszcze pozostają najczęstszą przyczyną śmierci i kalectwa w całym świecie (Bloom i Widdus, 1998).
Z immunologicznego punktu widzenia, głównym problemem w dziedzinie szczepionek jest dziś to, że szczepionki tradycyjne (i/lub związki immunomodulujące zawarte w tych preparatach) przeznaczone są do tego, aby powodować powstawanie wysokiego poziomu przeciwciał (Harrow i Lane, 1988). Jednakże, przeciwciała same z siebie nie są skuteczne pod względem zapobiegania wielu chorobom, włącznie z większością chorób powodowanych przez wirusy, bakterie wewnątrzkomórkowe, niektóre pasożyty i raka. Przykładowymi tego rodzaju chorobami są, ale bez ograniczania się tylko do nich, wspomniane powyżej zakażenia wirusem HIV lub, w przypadku malarii, pierwotniakami z rodzaju Plasmodium. W licznych eksperymentalnych układach wykazano, że we wskazaniach tych ważne jest raczej komórkowe ramię układu odpornościowego, włączając w to komórki T, a nie ramię humoralne. Toteż, istnieje zapotrzebowanie na nowe, innowacyjne technologie, niezbędne do pokonania ograniczeń związanych ze szczepionkami typowymi. Skupić się przy tym należy na tych technologiach, które niezawodnie prowadzą do indukowania komórkowego układu odpornościowego, włącznie z komórkami T antygenowo swoistymi, rozpoznającego cząsteczki, do ekspresji których dochodzi na komórkach zakażonych czynnikiem chorobotwórczym. W rozwiązaniu idealnym, szczepionki powinny być tak zaprojektowane, aby indukowały komórki T odróżniające komórki chore i/lub zakażone od komórek normalnych, a równocześnie, aby przeciwciała wydzielane przez komórki B rozpoznawały czynniki chorobotwórcze w przedziałach pozakomórkowych.
Szereg różnych uznanych szczepionek składa się z żywego atenuowanego organizmu i w ich przypadku istnieje ryzyko rewersji do zjadliwego szczepu typu dzikiego. Taki zagrażający życiu scenariusz może wystąpić zwłaszcza u gospodarzy o upośledzonej odporności. Alternatywnie, szczepionki stosuje się w postaci kombinacji antygenów, pochodzących od czynników chorobotwórczych, ze związkami indukującymi lub wzmagającymi odpowiedzi immunologiczne skierowane przeciw tym antygenom (związki tego rodzaju powszechnie nazywa się adiuwantami), ponieważ tego rodzaju szczepionki podjednostkowe same z siebie, na ogół, nie są skuteczne.
Aczkolwiek nie ma wątpliwości, że powyższe szczepionki są cennym lekami, występuje tu jednak ta niekorzyść, że w wyniku ich złożoności wywoływane być mogą poważne działania uboczne, na przykład, wobec antygenów zawartych w szczepionce, które manifestują krzyżową reaktywność z cząsteczkami, do ekspresji których dochodzi w komórkach osobników szczepionych. Poza tym, obowiązujące wymagania władz kontrolnych [takich jak, na przykład, Światowa Organizacja Zdrowia (WHO), Departament Kontroli Żywności i Leków (FDA) i ich partnerzy europejscy], dotyczące dokładnego wyszczególnienia składu szczepionki i mechanizmu indukowania odporności, są trudne do spełnienia. Komórki prezentujące antygen należą do wrodzonego układu odpornościowego, który rozwinął się jako pierwsza linia obrony ograniczająca zakażenie wkrótce po ekspozycji na drobnoustroje (Hoffmann i in., 1999). To raczej komórki wrodzonego układu odpornościowego rozpoznają konfiguracje czy względnie niespecyficzne struktury wyrażane na ich obiektach docelowych, niż bardziej wyrafinowane, specyficzne struktury rozpoznawane przez adaptywny układ odpornościowy (Hoffmann i in., 1999). Przykładowymi komórkami wrodzonego układu odpornościowego są makrofagi i komórki dendrytyczne, a także granulocyty (na przykład, krwinki białe obojętnochłonne), naturalne komórki K, oraz inne jeszcze komórki. W przeciwieństwie do tego, komórki adaptywnego układu odpornościowego rozpoznają specyficzne struktury antygenowe, włącznie z peptydami, jak również trójwymiarowe struktury
PL 211 036 B1 w przypadku komórek B. Adaptywny ukł ad odpornoś ciowy jest o wiele bardziej specyficzny i wyrafinowany niż wrodzony układ odpornościowy, przy czym ulepsza się on po powtarzanej ekspozycji na dany czynnik chorobotwórczy/antygen. Filogenetycznie, wrodzony układ odpornościowy jest starszy i obecność jego można stwierdzić już w organizmach bardzo prymitywnych. Tym niemniej jednak, wrodzony układ odpornościowy ma decydujące znaczenie podczas początkowej fazy ekspozycji antygenu dlatego, że oprócz zawartości czynników chorobotwórczych, komórki wrodzonego układu odpornościowego, na przykład komórki APC, piętnują komórki adaptywnego układu odpornościowego, a przez to wzbudzają swoiste odpowiedzi immunologiczne, skutkują ce oczyszczeniem z intruzów. Podsumowując, komórki wrodzonego układu odpornościowego, a w szczególności komórki APC, odgrywają decydującą rolę w trakcie indukcyjnej fazy odpowiedzi immunologicznych, przez a) powstrzymywanie zakażeń za pomocą prymitywnego systemu rozpoznawania konfiguracji i b) piętnowanie komórek adaptywnego układu odpornościowego prowadzące do zaistnienia swoistych odpowiedzi immunologicznych i pamięci, w wyniku czego dochodzi do oczyszczenia z będących intruzami czynników chorobotwórczych lub innych obiektów docelowych (Roitt i in., 1998). Mechanizmy te mogą także mieć ważne znaczenie, jeśli chodzi o pozbycie się lub powstrzymanie rozwoju komórek rakowych. Jak wyżej wspomniano, komórki wrodzonego układu odpornościowego rozpoznają konfiguracje wyrażone na ich poszczególnych obiektach docelowych. Przykładowo wymienić tu można lipopolisacharydy (LPS) w przypadku bakterii Gram-ujemnych, prątkowe glikolipidy, kwasy lipoteichowe lub bakterie Gram-dodatnie, mannany z drożdży i dwuniciowe RN wirusów (Hoffmann, 1999). Poza tym, mogą one rozpoznawać konfiguracje takie, jak zmienione glikozylacje białek na komórkach nowotworowych.
W opisach współczesnych odkryć podaje się DNA pierwotniaków lub niższych eukariontów jako dalsze przykłady rozpoznawane przez wrodzony (ale także, być może, adaptywny) układ odpornościowy ssaków (i, prawdopodobnie, większości, jeśli nie wszystkich, kręgowców) (Krieg, 1996; Lipford i in., 1998).
Układ odpornościowy rozpoznaje niższe organizmy, włącznie z bakteriami, przypuszczalnie dzięki strukturalnym i sekwencyjnym różnicom występującym między DNA czynnika chorobotwórczego i DNA gospodarza. W szczególności, obiektami docelowymi stają się krótkie fragmenty sekwencji DNA, pochodzące od niekręgowców lub występujące w postaci krótkich syntetycznych ODN zawierających niezmetylowane dinukleotydy cytozynoguaninowe (CpG) w pewnym kontekście zasad (Krieg i in., 1995). Stwierdzono, że motywy CpG występują z oczekiwaną częstotliwoś cią w DNA bakteryjnym, ale o wiele rzadziej w DNA kręgowców (Lipford i in., 1998; Pisetsky, 1999). Oprócz tego, motywy CpG niekręgowców (a więc bakteryjne) nie są zmetylowane, podczas gdy sekwencje CpG kręgowców są zmetylowane. Te różnice między bakteryjnym DNA i DNA kręgowców pozwalają kręgowcom rozpoznawać DNA niekręgowców jako sygnał niebezpieczeństwa.
Naturalne DNA zawierające CpG, ODN, jak również podstawione tiofosforanem (wymiana reszt fosforanowych na tiofosforanowe) ODN zawierające motywy CpG są nie tylko silnymi aktywatorami proliferacji komórek immunologicznie kompetentnych i humoralnych odpowiedzi immunologicznych (Krieg i in., 1995), ale także stymulują silne komórkowe odpowiedzi immunologiczne (przegląd w: Lipford i in., 1998). DNA/ODN zawierające niezmetylowane motywy CpG mogą bezpośrednio aktywować komórki monocytowe (komórki dendrytyczne, makrofagi) i komórki B. Podobnie, naturalne komórki-zabójcy (NK) nie ulegają aktywacji bezpośredniej, ale odpowiadają na kontakt z IL-12 (interleukiną 12) pochodzącą od monocytów, ze znacznym zwiększeniem wytwarzania swych IFN-γ (Chace i in., 1997). W rezultacie, indukcja monocytów i komórek NK przez DNA z CpG pobudza indukcję odpowiedzi typu Th1 i rozwój cytotoksycznych komórek T.
Kwas rybonukleinowy oparty na inozynie i cytozynie, taki jak kwas poliinozynowy-policytydylowy (poli I:C) znany jest z tego, że pobudza odpowiedzi immunologiczne swoiste względem Th1. Znany jest też ze stymulowania wytwarzania przez makrofagi cytokin takich jak IL-1a i IL-12 (Manetti i in., 1995), a także z tego, że jest silnie działającym czynnikiem indukującym tworzenie się interferonu typu 1 (Manetti i in., 1995) i silnym stymulatorem komórek NK (Cavanaugh i in., 1996).
Jednakże, aktywność ta była ściśle ograniczona do kwasu rybonukleinowego zawierającego reszty inozyny i cytydyny (W098/16247).
Wyniki badań przeprowadzonych przez twórców niniejszego wynalazku wykazały, że ODN zawierające motywy niezmetylowanych sekwencji CpG, chociaż skuteczne pod względem stymulowania układu immunologicznego, mają jednak zasadnicze wady, zwłaszcza jeśli chodzi o swoistość (wysokie tło) i działania uboczne, takie jak układowe tworzenie się TNF-α To układowe uwalnianie TNF-α znane
PL 211 036 B1 jest z tego, że powoduje zespół wstrząsu toksycznego, który może doprowadzić do śmierci dotkniętych nim pacjentów.
Celem niniejszego wynalazku są odpowiednie, nowe ODN, bez tego rodzaju drastycznych działań ubocznych, jakie obserwuje się w przypadku ODN opartych na sekwencjach CpG. Celem niniejszego wynalazku jest także zmniejszenie działania ubocznego kompozycji farmaceutycznych zawierających znane ODN i dostarczenie bezpiecznych i skutecznych, dobrze tolerowanych kompozycji farmaceutycznych o skutecznych właściwościach immunostymulujących, odpowiednich do szczepienia zwierząt, zwłaszcza saków, oraz ludzi. Cel ten został osiągnięty przez opracowanie cząsteczki immunostymulującego kwasu oligodezoksynukleinowego (ODN) według wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie cząsteczki immunostymulującego kwasu oligodezoksynukleinowego (ODN) o budowie przedstawionej wzorem (I), w którym:
X oznacza O lub S,
NMP oznacza 2'-dezoksynukleozydomonofosforan lub -monotiofosforan, wybrany z grupy obejmującej dezoksyadenozyno-, dezoksyguanozyno-, dezoksyinozyno-, dezoksycytozyno-, dezoksyurydyno-, dezoksytymidyno-, 2-metylodezoksyinozyno-, 5-metylodezoksycytozyno-, dezoksypseudourydyno-, dezoksyrybozopuryno-, 2-aminodezoksyrybozopuryno-, 6-S-dezoksyguanino-, 2-dimetylodezoksyguanozyno- lub N-izopentenylodezoksyadenozynomonofosforan lub -monotiofosforan,
NUC oznacza 2'-dezoksynukleozyd, wybrany z grupy obejmującej dezoksyadenozynę, dezoksyguanozynę, dezoksyinozynę, dezoksycytozynę, dezoksyurydynę, dezoksytymidynę, 2-metylodezoksyinozynę, 5-metylodezoksycytozynę, dezoksypseudourydynę, dezoksyrybozopurynę, 2-aminodezoksyrybozopurynę, 6-S-dezoksyguanidynę, 2-dimetylodezoksyguanidynę lub N-izopentenylodezoksyadenozynę, a i b oznaczają liczby całkowite od 0 do 100, z tym, że suma a + b mieści się w zakresie od 4 do 150,
B i E oznaczają grupy zwykłe dla końców 5' i 3' cząsteczek kwasów nukleinowych, do wytwarzania immunostymulującej kompozycji farmaceutycznej.
Korzystnie, cząsteczkę ODN stanowi cząsteczka oligo-C28.
Korzystnie, każda grupa o symbolu NMP jest wybrana z grupy obejmującej dezoksyadenozyno-, dezoksyguanozyno-, dezoksyinozyno-, dezoksycytozyno-, dezoksyurydyno-, dezoksytymidyno-, 2-metylodezoksyinozyno-, 5-metylodezoksycytozynomonofosforan lub -monotiofosforan.
Korzystnie, że suma a + b mieści się w zakresie od 10 do 60, korzystnie w zakresie od 15 do 40.
Korzystnie, co najmniej jeden z symboli X1 i X2 oznacza S i co najmniej jeden z symboli X3 i X4 oznacza O, oraz korzystnie, którykolwiek NMP oznacza nukleozydomonotiofosforan.
Korzystnie, ODN zawiera sekwencję nhh hhh wdi nhh hhh hhh wn, nhh wdi din hhh hdi ndi nh, nhh hhh wdi dhh hhh hhh wn lub nhh wdi did hhh hdi ddi dh, przy czym:
którykolwiek n oznacza 2-dezoksynukleozydomonofosforan lub -monotiofosforan, wybrany z grupy obejmują cej dezoksyadenozyno-, dezoksyguanozyno-, dezoksycytozyno- lub dezoksytymidynomonofosforan lub -monotiofosforan, którykolwiek h oznacza 2'-dezoksynukleozydomonofosforan lub -monotiofosforan, wybrany z grupy obejmują cej dezoksyadenozyno-, dezoksycytozyno- lub dezoksytymidynomonofosforan lub -monotiofosforan, i oznacza dezoksyinozynomonofosforan lub -monotiofosforan,
PL 211 036 B1 którykolwiek w oznacza 2'-dezoksynukleozydomonofosforan lub -monotiofosforan, wybrany z grupy obejmującej dezoksyadenozyno- lub dezoksytymidynomonofosforan lub -monotiofosforan, oraz którykolwiek d oznacza 2'-dezoksynukleozydomonofosforan lub -monotiofosforan, wybrany z grupy obejmują cej dezoksyadenozyno-, dezoksyguanozyno- lub dezoksytymidynomonofosforan lub
-monotiofosforan.
Korzystnie, ODN zawiera sekwencję hhh wdi dhh h.
Korzystnie, ODN zawiera co najmniej jeden 2'-dezoksycytozyno-monofosforan lub -monotiofosforan, przyległy w pozycji 3' do 2'-dezoksyinozynomonofosforanu lub -monotiofosforanu.
Korzystniej, ODN zawiera deoksyinozynę-deoksycytozynę 26-mer.
Korzystnie, ODN zawiera sekwencję:
gacitt, iacitt, gaictt, iaictt, przy czym:
a oznacza dezoksyadenozynomonofosforan lub -monotiofosforan, g oznacza dezoksyguanozynomonofosforan lub -monotiofosforan, i oznacza dezoksyinozynomonofosforan lub -monotiofosforan, c oznacza dezoksycytozynomonofosforan lub -monotiofosforan, oraz t oznacza dezoksytymidynomonofosforan lub -monotiofosforan.
Korzystniej, gacitt stanowi tcc atg aci ttc ctg atg ct.
Korzystnie, ODN zawiera sekwencję:
wdi, wdid, wdidin lub wdidid, przy czym:
w, d, i oraz n mają wyżej podane znaczenie.
Korzystnie, B i E są, niezależnie, wybrane z grupy obejmującej -H, -CH3, -COH, -COCH3, -OH, -CHO, -PO4, -PSO3, -PS2O2, -PS3O, -PS4, -SO3, -PO4(CH2)1-6-NH2 lub -PO4-(CH2)1-6-NH-znacznik.
Korzystnie, immunostymulującą kompozycją farmaceutyczną jest wacyna.
Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna, która zawiera ODN jak określono wyżej.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto kompozycja farmaceutyczna, która zawiera ODN jak określono wyżej oraz antygen.
Korzystnie, kompozycja farmaceutyczna zawiera jeszcze polimer polikationowy, korzystnie peptyd polikationowy, zwłaszcza poliargininę, polilizynę lub peptyd przeciwbakteryjny, zwłaszcza przeciwbakteryjny peptyd wywodzący się z katelicydyny, syntetyczny peptyd zawierający 2KLK-motywy przedzielone łącznikiem o 3-7 hydrofobowych aminkokwasach, albo hormon wzrostu, zwłaszcza ludzki hormon wzrostu.
Korzystnie, kompozycja farmaceutyczna zawiera jeszcze składniki aktywne, zwłaszcza cytokiny, substancje przeciwzapalne, substancje przeciwbakteryjne lub ich kombinacje.
Korzystnie, kompozycja farmaceutyczna zawiera jeszcze substancje pomocnicze, zwłaszcza farmaceutycznie dozwolony nośnik, substancje buforowe, stabilizatory lub ich kombinacje.
Korzystnie, kompozycja farmaceutyczna zawiera jeden, lub więcej niż jeden ODN w ilości mieszczącej się w zakresie od 1 ng do 1 g, korzystnie w zakresie od 100 ng do 10 mg, a zwłaszcza w zakresie od 10 mg do 1 mg.
Nieoczekiwanie stwierdzono, że ODN zawierające reszty dezoksyinozyny (I-ODN) wykazują działanie immunostymulujące porównywalne z działaniem ODN zawierających motywy CpG, a w wielu przypadkach nawet lepsze od niego. Co więcej, ODN według niniejszego wynalazku dają więcej swoistych odpowiedzi immunologicznych na kontakt z danym antygenem lub fragmentem antygenu niż
CpG-ODN. Poza tym, ODN według niniejszego wynalazku redukowały indukcję szkodliwych reakcji ubocznych, a zwłaszcza indukcję układowego TNF-α lub IL-6. Podczas, gdy pewne działania immunostymulujące opisano w przypadku cząsteczek RNA zawierających inozynę (takich jak poli-IC lub cząsteczki wymienione w dokumencie patentowym W098/16247), to nieoczekiwanie stwierdzono, że także cząsteczki kwasu dezoksynukleinowego zawierające reszty dezoksyinozyny mogą być dobrymi immunostymulującymi ODN. Poza tym, I-ODN według niniejszego wynalazku, w przeciwieństwie do
PL 211 036 B1
ODN opartych na specyficznym motywie CpG, nie zależą od specyficznego motywu lub sekwencji palindromowej, jak to opisano dla oligonukleotydów z CpG (patrz, na przykład: EP 0468 520 A2, WO96/02555, WO98/18810, WO98/37919, WO98/40100, WO98/52581, WO99/51259 i WO99/56755, wszystkie te dokumenty włączone do niniejszego opisu jako odnośniki). Toteż, jedna grupa I-ODN według niniejszego wynalazku może, korzystnie, zawierać motyw CI [stąd właśnie ODN opisane w tych dokumentach włączonych do niniejszego opisu jako odnośniki (w których to ODN jedna, lub więcej niż jedna reszta guanozyny jest zastąpiona resztą dezoksyinozyny) stanowią korzystne wykonania ODN według niniejszego wynalazku]. Nie jest to konieczne dla podstawowej właściwości polegającej na immunostymulowaniu, ponieważ I-ODN z inozyną nie umieszczoną w kontekście CI lub IC wykazują równie dobre właściwości immunostymulujące.
Tak więc, I-ODN według niniejszego wynalazku stanowi cząsteczkę zawierającą resztę dezoksyinozyny, korzystnie obecną w postaci pojedynczej nici.
I-ODN według niniejszego wynalazku można wyodrębniać metodami rekombinantowymi, albo otrzymywać na drodze syntezy chemicznej. W tym ostatnim przypadku, I-ODN według niniejszego wynalazku mogą zawierać także oligonukleotydy zmodyfikowane, które można zsyntetyzować z wykorzystaniem typowych transformacji chemicznych, takie jak metylofosfoniany, albo, też w oparciu o fosfor, ale inaczej zmodyfikowane oligonukleotydy, takie jak fosfotriestry, fosfoamidany i ditiofosforany. Uż yć można także innych, nie zmodyfikowanych w oparciu o fosfor oligonukleotydów [Stirchak i in., MAR 17, 6129 - 6141 (1989)], jednakże w niniejszym wynalazku jako 2'-dezoksynukleozydomonofosforanów korzystnie używa się monofosforanów lub monotiofosforanów. NMP w I-ODN według niniejszego wynalazku korzystnie dobiera się z grupy obejmującej dezoksyadenozyno-, dezoksyguanozyno-, dezoksyinozyno-, dezoksycytozyno-, dezoksyurydyno-, dezoksytymidyno-, 2-metylodezoksyinozyno-, 5-metylodezoksycytozynomonofosforan lub -monotiofosforan (jak zwykle, ugrupowanie fosforanu lub tiofosforanu znajduje się w pozycji 5' dezoksyrybozy). Podczas, gdy jest rzeczą istotną dla ODN opartych na motywie CpG, aby motyw ten nie był zmetylowany, nie obowiązuje to, nieoczekiwanie, w przypadku ODN według niniejszego wynalazku. I tak, na przykład, reszty 2-metylodezoksyinozyny lub 5-metylodezoksycytozyny nie wywierają żadnego ogólnego ujemnego wpływu na właściwości immunostymulujące ODN według niniejszego wynalazku. Alternatywnie, zamiast postaci 2-dezoksy NMP, w pozycji 2 ugrupowania rybozy mogą występować także inne, zwłaszcza obojętne, grupy, takie jak, na przykład, -F, -NH2, -CH3, szczególnie -CH3. Oczywiście, dla I-ODN według niniejszego wynalazku wykluczona jest obecność grup -OH i SH w pozycji 2' rybozy, zwłaszcza reszty rybozy dla inozynowych NMP.
Długość ODN według niniejszego wynalazku mieści się w zakresie długości typowych ODN stosowanych w dotychczasowym stanie techniki. Toteż, cząsteczki o ogólnej długości poniżej 4 i powyżej 150 wykazują stopniowe obniżenie potencjału immunostymulacyjnego. Korzystne ODN zawierają od 10 do 60, a zwłaszcza od 15 do 40 zasad (nukleozydów), zakładając, ż e w tych korzystnych wykonaniach wynalazku suma a + b we wzorze I mieści się w zakresie od 10 do 60, korzystnie w zakresie od 15 do 40.
Podczas, gdy cząsteczki kwasu rybonukleinowego zawierające inozynę i cytydynę, opisane jako immunostymulujące w dotychczasowym stanie techniki, stanowią duże i względnie nieokreślone kwasy polinukleinowe o masie cząsteczkowej daleko większej od 200000 [dostępny w handlu kwas poliinozynowy-policytydylowy z firmy Sigma Chemicals ma masę cząsteczkową mieszczącą się w zakresie od 220000 do 460000 (co najmniej 500 - 1000 reszt C + I)], to czą steczki wedł ug niniejszego wynalazku stanowią cząsteczki DNA o znacznie mniejszej długości, mają dobrze określoną długość i skład i są w wysokim stopniu odtwarzalne w produktach.
W dalszym cią gu korzystne jest to, ż e obejmują cy dezoksyinozynę NMP w I-ODN wedł ug wzoru I stanowi monotiofosforan zawierający od 1 do 4 atomów siarki, a także i to, że również dalsze NMP, a zwł aszcza wszystkie dalsze NMP, obecne są jako nukleozydomonotiofosforany, ponieważ takie ODN manifestują wyższą odporność na działanie nukleazy [z punktu widzenia niniejszego wynalazku jest oczywiste, że „mono w „monotiofosforanach odnosi się do fosforanu, co oznacza, że w każdym NMP obecne jest jedno ugrupowanie fosforanowe (jeden atom fosforu)]. Korzystnie, w NMP według niniejszego wynalazku co najmniej jeden z symboli X1 i X2 oznacza S i co najmniej jeden z symboli X3 i X4 oznacza O. Korzystnie, X3 i X4 oznaczają O. [Podstawnik o symbolu X3 moż e wywodzić się (w rezultacie syntezy NMP) na przykład z grupy fosforanowej albo z grupy 3' NMP-rybozy].
Korzystnie, ODN według niniejszego wynalazku zawierają sekwencję: nhh hhh wdi nhh hhh hhh wn, nhh wdi din hhh hdi ndi nh,
PL 211 036 B1 nhh hhh wdi dhh hhh hhh wn lub nhh wdi did hhh hdi ddi dh, przy czym:
którykolwiek n oznacza 2-dezoksynukleozydomonofosforan lub -monotiofosforan, wybrany z grupy obejmują cej dezoksyadenozyno-, dezoksyguanozyno-, dezoksycytozyno- lub dezoksytymidynomonofosforan lub -monotiofosforan, którykolwiek h oznacza 2'-dezoksynukleozydomonofosforan lub -monotiofosforan, wybrany z grupy obejmują cej dezoksyadenozyno-, dezoksycytozyno- lub dezoksytymidynomonofosforan lub -monotiofosforan, i oznacza dezoksyinozynomonofosforan lub -monotiofosforan, którykolwiek w oznacza 2'-dezoksynukleozydomonofosforan lub -monotiofosforan, wybrany z grupy obejmującej dezoksyadenozyno- lub dezoksytymidynomonofosforan lub -monotiofosforan, oraz którykolwiek d oznacza 2'-dezoksynukleozydomonofosforan lub -monotiofosforan, wybrany z grupy obejmują cej dezoksyadenozyno-, dezoksyguanozyno- lub dezoksytymidynomonofosforan lub -monotiofosforan. Jak to w sposób ogólny przedstawiono powyżej, dla I-ODN według niniejszego wynalazku nie jest potrzebny specyficzny motyw (taki, jak CpG lub palindrom). Jednakże, korzystne są ODN zawierające motyw CI, tak, że w korzystnym wykonaniu wynalazku ODN o wzorze I zawiera co najmniej jeden 2'-dezoksycytozy-nomonofosforan lub -monotiofosforan przyległy w pozycji 3' do 2'-dezoksyinozynomonofosforanu lub -monotiofosforanu, z utworzeniem takiego właśnie motywu 5'-CI 3'.
Korzystne ODN według niniejszego wynalazku zawierają jedną, lub więcej niż jedną sekwencję:
gacitt, iacitt, gaictt, iaictt, przy czym:
a oznacza dezoksyadenozynomonofosforan lub -monotiofosforan, g oznacza dezoksyguanozynomonofosforan lub -monotiofosforan, i oznacza dezoksyinozynomonofosforan lub -monotiofosforan, c oznacza dezoksycytozynomonofosforan lub -monotiofosforan, oraz t oznacza dezoksytymidynomonofosforan lub -monotiofosforan.
I-ODN według niniejszego wynalazku w sposób szczególny nadają się do wykorzystania w dziedzinie farmacji, na przykład do stosowania jako leki dla zwierzą t lub ludzi. Są one specyficznie przystosowane do działania jako środki immunostymulujące, zwłaszcza w składzie kompozycji stanowiących szczepionki lub łącznie z takimi kompozycjami. Wynalazek niniejszy dotyczy także kompozycji farmaceutycznej zawierającej ODN według niniejszego wynalazku.
Ponieważ korzystną kompozycją farmaceutyczną według niniejszego wynalazku jest szczepionka, to kompozycja taka powinna zawierać oprócz ODN według niniejszego wynalazku także i antygen. Potencjał tego antygenu wzmagający ochronę/odpowiedź immunologiczną zaszczepionego osobnika ulega silnemu podwyższeniu przez skombinowanie go z ODN według niniejszego wynalazku, a to dzięki ich aktywności immunostymulującej.
Szczepionka może zawierać pełen asortyment rozmaitych antygenów. Przykładowymi antygenami są: zabite w całości organizmy, takie jak zdezaktywowane wirusy lub bakterie, grzyby, pierwotniaki a nawet komórki rakowe. Antygeny mogą także składać się z podfrakcji tych organizmów/tkanek, białek lub, w swej najprostszej postaci, z peptydów. Antygeny mogą być także rozpoznane przez układ odpornościowy w postaci glikozylowanych białek lub peptydów i mogą także stanowić, lub zawierać, polisacharydy lub lipidy. Można użyć krótkich peptydów, ponieważ, na przykład, limfocyty T cytotoksyczne (CTL) rozpoznają antygeny w postaci krótkich (zazwyczaj o długości od 8 do 11 aminokwasów) peptydów łącznie z głównym układem zgodności tkankowej (MHC) [Rammensee i in., Immunogenetics, 41, 178 - 228 (1995)1. Komórki B rozpoznają dłuższe peptydy, od około 15 aminokwasów [Harrow i in., Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]. W przeciwieństwie do epitopów komórek T, trójwymiarowa struktura antygenów komórek B także może mieć ważne znaczenie dla rozpoznania przeciwciał. Do uzyskania przedłużonych, antygenowo swoistych odpowiedzi immunologicznych, pomocne okazują się adiuwanty, mianowicie przy wyzwalaniu kaskad immunologicznych, które wymagają zaangażowania wszystkich komórek układu immunologicznego. Pierwotnie czynne są adiuwanty, ale nie są one ograniczone w sposobie swego działania na tak zwanych komórkach prezentujących antygeny (APC). Komórki te zazwyczaj wpierw spotykają się z antygenem(ami),
PL 211 036 B1 po czym następuje prezentacja poddanego obróbce lub niezmodyfikowanego antygenu efektorowi immunologicznemu. Mogą także być zaangażowane pośrednie typy komórek. Jedynie komórki efektorowe o odpowiedniej swoistości są zaktywowane w produkcyjnej fazie odpowiedzi immunologicznej. Adiuwant może także miejscowo zatrzymywać antygeny i współwstrzyknięte inne czynniki. Oprócz tego, adiuwant może być czynny jako chemoatraktant dla innych komórek immunologicznie kompetentnych, albo może też działać miejscowo i/lub układowo jako środek stymulujący układ immunologiczny.
Zgodnie z korzystnym sposobem wykonania wynalazku, jako antygeny stosuje się epitopy komórek T. Alternatywnie, może też okazać się korzystna kombinacja epitopów komórek T i epitopów komórek B.
Rodzaj antygenów przewidzianych do użycia w kompozycji według niniejszego wynalazku nie jest decydujący. Oczywiście, w niniejszym wynalazku można wykorzystać także mieszaniny rozmaitych antygenów. Korzystnie, jako tego rodzaju antygeny stosuje się białka lub peptydy pochodzące od wirusów lub bakterii chorobotwórczych, albo od grzybów lub pasożytów (włącznie z antygenami derywatyzowanymi, antygenami glikozylowanymi, antygenami lipidowanymi albo polisacharydami lub lipidami). Innym korzystnym źródłem antygenów są antygeny nowotworowe. Korzystne czynniki chorobotwórcze wybiera się z grupy obejmującej ludzki wirus upośledzenia odporności (HIV), wirusy zapalenia wątroby typu A i typu B, wirus zapalenia wątroby typu C (HCV), wirus mięsaka Rousa (RSV), wirus Epsteina i Barr (EBV), wirus grypy, rotawirus, Staphylococcus aureus, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus pneumoniae, Bacillus anthracis, Vibrio cholerae, Plasmodium sp. (PI. falciparum, Pi. vivax itd.), Aspergillus sp. lub Candida albicans. Antygenami mogą być także cząsteczki, których ekspresja dokonuje się z udziałem komórek rakowych (antygeny nowotworowe). Proces derywatyzacji może obejmować wyodrębnianie specyficznego białka z czynnika chorobotwórczego/komórek rakowych, inaktywację czynnika chorobotwórczego, jak również proteolityczną lub chemiczną derywatyzację lub stabilizację białka tego rodzaju. W taki sam sposób można wykorzystać w składzie kompozycji według niniejszego wynalazku także antygeny nowotworowe (szczepionki rakowe) albo antygeny autogeniczne. W przypadku takich kompozycji można przeprowadzić szczepienie szczepionką nowotworową lub leczenie choroby autoimmunizacyjnej. W przypadku antygenów peptydowych, wynalazek obejmuje swym zakresem zastosowanie peptydowych mimitopów/agonów/superagonów/antagonów lub peptydów zmienionych w niektórych pozycjach bez wpływu na ich właściwości immunologiczne (przegląd w: Sparbier i Walden, 1999). Antygeny peptydowe mogą także zawierać, albo przy C-końcu, albo przy N-końcu antygenu peptydowego, elongacje ułatwiające wzajemne oddziaływanie ze związkiem (związkami) polikationowymi lub immunostymulującymi. Do leczenia chorób autoimmunizacyjnych można użyć antagonów peptydowych.
Antygeny można także derywatyzować, w celu włączenia cząsteczek wzmagających prezentację antygenu i nacelowujących antygeny na komórki prezentujące antygen.
W jednym z wykonań niniejszego wynalazku, kompozycja farmaceutyczna sł u ż y do nadawania tolerancji białkom lub fragmentom białek i peptydom zaangażowanym w chorobach autoimmunizacyjnych. Antygeny używane w takich wykonaniach wynalazku służą nadawaniu tolerancji układowi immunologicznemu, albo supresyjnej regulacji odpowiedzi immunologicznych skierowanych przeciw epitopom zaangażowanym w procesach autoimmunizacyjnych.
Korzystnie, kompozycja farmaceutyczna według niniejszego wynalazku, zwłaszcza w postaci szczepionki, zawiera jeszcze polimer polikationowy, korzystnie peptyd polikationowy, a zwłaszcza poliargininę, polilizynę lub przeciwbakteryjny peptyd.
Związkiem (związkami) polikationowymi przeznaczonymi do stosowania według niniejszego wynalazku mogą być jakiekolwiek związki polikationowe przejawiające charakterystyczne działanie zgodne z opisem zamieszczonym w dokumencie patentowym WO 97/30721. Korzystne związki polikationowe wybiera się z grupy obejmującej polipeptydy zasadowe, polikationy organiczne, poliaminokwasy zasadowe lub ich mieszaniny. Wspomniane poliaminokwasy powinny mieć długość wynoszącą co najmniej 4 reszty aminokwasów [patrz: tuftsyna, jak opisano w: Goldman i in., (1983)]. Szczególnie korzystne są substancje zawierające wiązania peptydowe, takie jak polilizyna, poliarginina i polipeptydy zawierające więcej niż 20%, zwłaszcza ponad 50% zasadowych aminokwasów, w liczbie ponad 8, a zwł aszcza ponad 20 reszt aminokwasowych lub ich mieszanin. Inne korzystne polikationy i zawierające je kompozycje farmaceutyczne są opisane w dokumentach patentowych WO 97/30721 (na przykład, polietylenoimina) i WO 99/38528. Korzystnie, polipeptydy te zawierają od 20 do 500 reszt aminokwasów, w szczególności od 30 do 200 reszt. Tego rodzaju związki polikationowe można wytwarzać chemicznie lub rekombinacyjnie, albo też można je uzyskiwać ze źródeł naturalnych.
PL 211 036 B1 (Poli)peptydami kationowymi mogą być też polikationowe, przeciwbakteryjne peptydy drobnoustrojowe o właściwościach podanych przeglądowo w: Ganz i Lehrer, (1999); Hancock, (1999). (Poli)peptydy te mogą pochodzić od zwierząt lub roślin, względnie można je wytworzyć chemicznie lub rekombinacyjnie (Andreu i Rivas, 1998; Ganz i Lehrer, 1999; Simmaco i in., 1998). Peptydy te mogą także należeć do grupy defenzyn (Ganz, 1999; Ganz i Lehrer, 1999). Sekwencje tych peptydów można znaleźć, na przykład, w Antimicrobial Sequences Database pod następującym adresem internetowym: http://www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/pagl.html
Takie peptydy obronne lub defenzyny także stanowią korzystną formę polimeru polikationowego według niniejszego wynalazku. Ogólnie, jako polimeru polikationowego używa się związku umożliwiającego, jako produkt końcowy, aktywację (lub regulację supresyjną) adaptywnego układu immunologicznego, korzystnie takiego, w którym pośredniczą APC (włącznie z komórkami dendrytycznymi).
Specjalnie korzystne, jeśli chodzi o użycie jako substancji polikationowych w niniejszym wynalazku, okazują się wywodzące się z katelicydyny przeciwbakteryjne peptydy lub ich pochodne (dokument patentowy A 1416/2000, włączony do niniejszego opisu jako odnośnik), a zwłaszcza peptydy przeciwbakteryjne wywodzące się z katelicydyny ssaków, korzystnie z katelicydyny ludzkiej, bydlęcej lub mysiej, albo związki neuroaktywne, takie jak (ludzki) hormon wzrostu (somatotropina).
Do związków polikationowych pochodzących ze źródeł naturalnych należą HIV-REV lub HIV-TAT (pochodne peptydy kationowe, peptydy antennapedia, chitozan i inne pochodne chityny) lub inne peptydy pochodzące od tych peptydów lub białek, otrzymane metodą biochemiczną lub rekombinacyjną. Innymi korzystnymi związkami polikationowymi są katelina, albo substancje pokrewne katelinie lub pochodzące od niej. I tak, na przykład, katelina mysia jest peptydem o następującej sekwencji aminokwasów:
NH2-RLAGLLRKGGEKIGEKLKKIGOKIKNFFQKLVPQPE-COOH.
Substancje pokrewne katelinie lub pochodzące od niej, zawierają całość lub części sekwencji kateliny o co najmniej 15 - 20 resztach aminokwasowych. Derywatyzacja może obejmować podstawienie lub modyfikację naturalnych aminokwasów przez aminokwasy, nie należące do grupy 20 występujących powszechnie aminokwasów typowych. Ponadto, do tego rodzaju cząsteczek kateliny wprowadzić można dalsze reszty kationowe.
Korzystnie, te kationowe cząsteczki kombinuje się z antygenem i immunogennym ODN według niniejszego wynalazku. Jednakże, nieoczekiwanie stwierdzono, że takie cząsteczki kateliny są skuteczne także jako adiuwant dla antygenu i to bez dodatku innych adiuwantów. Tak więc, stało się możliwe użycie tego rodzaju cząsteczek kateliny jako skutecznych adiuwantów w preparatach szczepionek wraz z innymi substancjami immunoaktywującymi lub bez nich.
Inną korzystną substancją polikationową nadającą się do wykorzystania w niniejszym wynalazku jest peptyd syntetyczny zawierający co najmniej 2 motywy KLK, przedzielone łącznikiem o 3 - 7 hydrofobowych aminokwasach (dokument patentowy A 1789/2000, włączony do niniejszego opisu jako odnośnik). Bardzo zaskakujący był fakt, że efekt immunostumulacyjny powodowany przez kompozycję farmaceutyczną według niniejszego wynalazku okazał się znacząco większy niż można było tego oczekiwać na podstawie zsumowania skutków działania wszystkich poszczególnych składników, a nawet zsumowania skutków działania ODN lub polikationu i antygenu. Symbole B i E we wzorze I oznaczają grupy zwykłe dla końców 5' i/lub 3' cząsteczek kwasów nukleinowych. Przykłady grup tego rodzaju są łatwo dostępne dla specjalistów w tej dziedzinie techniki [patrz, na przykład: Oligonucleotides and Analogues - A Practical Approach red. Eckstein, Oxford University Press (1991)]. W przypadku I-ODN według niniejszego wynalazku B i/lub E korzystnie dobiera się, niezależnie, z grupy obejmującej -H, -CH3, -COCH3, -OH, -CHO, ugrupowanie fosforanu, tiofosforanu, siarczanu lub tiosiarczanu, albo grupę fosfoalkilową, szczególnie z częścią alkilową o długości C1 - C6 i/lub z końcową grupą aminową (grupy aminowej można w dalszym ciągu użyć do dalszego znakowania I-ODN według niniejszego wynalazku, na przykład: -PO4-(CH2)n-NH2 lub -PO4-(CH2)n-NH-znacznik). Szczególnie korzystne jako B są nukleozydy, a zwłaszcza wyżej wspomniane 2'-dezoksynukleotydy (to jest bez ugrupowań fosforanowych lub tiofosforanowych). Alternatywnie, ugrupowania takie mogą także zawierać grupy łącznikowe, łączące z innymi cząsteczkami, w szczególności cząsteczkami nośnika lub znacznikami. W takich postaciach ODN, w których są one związane ze stałymi powierzchniami, cząstkami lub znacznikami, powierzchnie takie, cząstki, znaczniki itd. także stanowią część grup o symbolu B i/lub E.
Oczywiście, jakiekolwiek postacie zjonizowane (sole) lub tautomeryczne cząsteczek według wzoru I są objęte zakresem wspomnianego wzoru I.
PL 211 036 B1
Kompozycja farmaceutyczna według niniejszego wynalazku może jeszcze obejmować dalsze składniki aktywne (substancje farmaceutycznie aktywne), w szczególności substancje nadające się do wykorzystania w szczepionkach. Korzystnymi przykładowymi dalszych składnikami aktywnymi tego rodzaju są cytokiny, substancje przeciwzapalne, substancji przeciwbakteryjne lub ich kombinacje.
Oczywiście, kompozycja farmaceutyczna według niniejszego wynalazku może jeszcze zawierać substancje pomocnicze, w szczególności farmaceutycznie dozwolony nośnik, substancje buforujące, stabilizatory lub ich kombinacje.
Względne ilości składników obecnych w kompozycji farmaceutycznej według niniejszego wynalazku w wysokim stopniu zależą od wymagań odnoszących się do danego antygenu i konkretnego zwierzęcia/człowieka, któremu ta kompozycja ma być zaaplikowana. Stąd też, kompozycja farmaceutyczna według niniejszego wynalazku korzystnie może zawierać jeden, lub więcej niż jeden ODN według niniejszego wynalazku, korzystnie w ilości mieszczącej się w zakresie od 1 pg do 10 g, także korzystnie w zakresie od 1 ng do 1 g, korzystniej w zakresie od 100 ng do 10 mg, a zwłaszcza w zakresie od 10 mg do 1 mg. Antygen, a również polimer polikationowy stosuje się w podobnych dawkach, przy czym korzystnie substancje te stosuje się w ilości mieszczącej się w zakresie od 1 do 10000 mg antygenu i w zakresie od 0,1 do 1000 mg polikationu na jedno szczepienie.
Kompozycje według niniejszego wynalazku można stosować u chorego, na przykład u osobnika kandydującego do szczepienia, w ilości skutecznej, na przykład w przedziałach czasowych jedno- lub dwutygodniowych, albo miesięcznych. Pacjenci przewidziani do leczenia kompozycjami według niniejszego wynalazku także mogą być zaszczepiani wielokrotnie lub tylko jeden raz. Korzystne wykorzystanie niniejszego wynalazku polega na aktywnym uodpornieniu, zwłaszcza ludzi lub zwierząt nie zabezpieczonych przeciw konkretnemu antygenowi. Rodzaj drogi podawania kompozycji według niniejszego wynalazku nie jest decydujący i odpowiednie jest w tym przypadku podskórne, domięśniowe, doskórne lub przezskórne podawanie leku, jak również przyjmowanie go drogą doustną. Możliwe jest także oddzielne stosowanie kompozycji według niniejszego wynalazku, to znaczy przez wstrzyknięcie substancji immunostymulującej oddzielnie od kompozycji antygen/polikation. Toteż, wynalazek niniejszy ukierunkowany jest także na zestaw zawierający jako jeden swój składnik kompozycję składającą się z antygenu i polimeru polikationowego, i jako drugi składnik kompozycję obejmującą substancję immunostymulującą lub chemotaktyczną. Składniki kompozycji można stosować w tym samym miejscu lub czasie, jednakże możliwe jest także stosowanie ich w różnych miejscach i w różnym czasie lub w rozmaitych okresach. Można także dokonywać zmian w układowym lub miejscowym stosowaniu kompozycji lub jej składników.
Szczegóły niniejszego wynalazku opisano w następujących przykładach i przedstawiono na figurach, oczywiście nie ograniczających zakresu wynalazku w jakikolwiek sposób. Fig 1. przedstawia odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciw pochodzącemu z owoalbuminy peptydowi OVA257-264 po wstrzyknięciu OVA257-264, poli-L-argininy (pR 60) i zawierających dezoksyinozynę I oligodezoksynukleotydów (I-ODN) lub CpC 1668. Myszom wstrzyknięto w poduszeczki tylnych łap mieszaniny pokazane na figurze. Po upływie 4 dni limfocyty węzłów chłonnych drenujących stymulowano ex vivo OVA257-264. Liczbę komórek produkujących IFN-g oznaczone po upływie 24 godzin z zastosowaniem testu ELISPOT. Otrzymane wyniki wyrażono jako liczbę plam/1x106 komórek węzłów chłonnych.
Fig. 2 przedstawia indukcję wytwarzania układowego TNF-a po wstrzyknięciu OVA257-264, poli-L-argininy (pR 60) i zawierających I oligodezoksynukleotydów (I-ODN) lub CpG 1668. Myszom wstrzyknięto w poduszeczki tylnych łap mieszaniny pokazane na figurze. Po upływie godziny od wstrzyknięcia, z żyły ogonowej pobrano krew i sporządzono preparat surowicy. Techniką ELISA oznaczono w surowicach stężenie TNF-a.
Fig. 3 przedstawia odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciw pochodzącemu z owoalbuminy peptydowi OVA257-264, po wstrzyknięciu OVA257-264, poli-L-argininy (pR 60) i zawierających dezoksyinozynę oligodezoksynukleotydów (I-ODN), CpG 1668 lub GpC. Myszom wstrzyknięto w poduszeczki tylnych łap mieszaniny pokazane na figurze. Po upływie 4 dni limfocyty węzłów chłonnych drenujących stymulowano ex vivo OVA257-264, peptydem mTRP2181-188, tu nieistotnym (pokrewne mysiej tyrozynazie białko-2, VYDFFVWL), lub pR 60. Liczbę komórek produkujących IFN-g oznaczono po upływie 24 godzin z zastosowaniem testu ELISPOT. Otrzymane wyniki wyrażono jako liczbę plam/1x106 komórek węzłów chłonnych, z odchyleniem standardowym z trzech powtórzeń.
Fig. 4 przedstawia indukcję wytwarzania układowego TNF-a po wstrzyknięciu OVA257-264, poli-L-argininy (pR 60) i zawierających I oligodezoksynukleotydów (I-ODN), GpC lub CpG 1668. Myszom wstrzyknięto w poduszeczki tylnych łap mieszaniny pokazane na figurze. Po upływie godziny od
PL 211 036 B1 wstrzyknięcia, z żyły ogonowej pobrano krew i sporządzono preparat surowicy. Techniką ELISA specyficzną względem cytokin oznaczono w surowicach stężenie TNF-a.
Fig. 5 przedstawia odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciw pochodzącemu z owoalbuminy peptydowi OVA257-264, po wstrzyknięciu TRP-2, poli-L-argininy, CpG 1668 i dezoksyinozyny zawierającej losowe 20-merowe sekwencje. Myszom wstrzyknięto w poduszeczki tylnych łap mieszaniny pokazane na figurze. Po upływie 4 dni limfocyty węzłów chłonnych drenujących stymulowano ex vivo TRP-2, peptydem OVA257-254, tu nieistotnym, lub pR 60. Liczbę komórek produkujących IFN-g oznaczono po upływie 24 godzin z zastosowaniem testu ELISPOT. Otrzymane wyniki wyrażono jako liczbę plam/1x106 komórek węzłów chłonnych, z odchyleniem standardowym z trzech powtórzeń.
Fig. 6 przedstawia połączone wstrzyknięcie I-ODN i poli-L-argininy (pR 60) razem z peptydem pochodzącym z czerniaka.
Fig. 7 pokazuje, że połączone wstrzyknięcie I-ODN i pR 60 razem z peptydem pochodzącym z czerniaka redukuje indukcję układowego TNF-α i Il-6.
Fig. 8 przedstawia połączone wstrzyknięcie I-ODN z losową 10-merową sekwencją razem z peptydem pochodzącym z czerniaka.
Fig. 9 pokazuje, że łączne zastosowanie owoalbuminy (OVA) z oligo-dIC26-mer i pR wzmaga wytwarzanie swoistych względem OVA przeciwciał IgG. Myszom wstrzyknięto w poduszeczki tylnych łap mieszaniny pokazane na figurze. W dniu 24 i 115 po wstrzyknięciu zebrano surowice i podano badaniu przesiewowemu techniką ELISA na obecność swoistych względem OVA przeciwciał IgG2a (A) i IgGl (B). Otrzymane wyniki przedstawiono jako miano przeciwciała.
P r z y k ł a d y
We wszystkich eksperymentach użyto podstawionych tiofosforanem ODN (z resztami fosforanowymi zastąpionymi przez reszty tiofosforanowe, w niniejszym opisie nazywanych „oligodezoksynukleotydami podstawionymi tiofosforanem), ponieważ takie właśnie ODN manifestują większą odporność na działanie nukleaz (Bailas i in., 1996; Krieg i in., 1995; Parronchi i in., 1999).
P r z y k ł a d 1
Połączone wstrzyknięcie różnych I-ODN i poli-L-argininy (pR 60) w sposób synergistyczny wzmaga odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciw peptydowi pochodzącemu z owoalbuminy.
Myszy C57BI/6 (Harlan/Olac)
Peptyd Peptyd OVA257-264 (SIINFEKL), epitop owoalbuminy kurzej z zależną od MHC klasa I restrykcją związaną z układem (H-2Kb) (Rotzschke i in., 1991), zsyntetyzowano typową metodą syntezy na podłożu stałym (chemia F-moc), poddano oczyszczaniu metodą HPLC i analizowano metodą spektroskopii mas pod względem czystości. Dawka: 300 mg/mysz.
Poli-L-arginina 60 (pR60) Poli-L-arginina o średnim stopniu polimeryzacji 60 reszt argininy; SIGMa Chemicals. Dawka: 100 mg/mysz.
CpG-ODN 1668 Podstawione tiofosforanem ODN zawierające motyw CpG: tcc atg acg ttc ctg atg ct zsyntetyzowane przez NAPS GmbH, Getynga. Dawka: 5 nmoli/mysz.
I-ODN 1 ODN podstawione tiofosforanem zawierające dezoksyinozynę: tcc ati aci ttc ctg atg ct zsyntetyzowane przez NAPS GmbH, Getynga. Dawka:5 nmoli/mysz.
I-ODN 2 Podstawione tiofosforanem ODN zawierające dezoksyinozynę: tcc atg aci ttc ctg atg ct zsyntetyzowane przez NAPS GmbH, Getynga. Dawka: 5 nmoli/mysz.
I-ODN 3 Podstawione tiofosforanem ODN zawierające dezoksyinozynę: tcc ati aci ttc cti ati ct zsyntetyzowane przez NAPS GmbH, Getynga. Dawka: 5 nmoli/mysz.
PL 211 036 B1
Grupy doświadczalne (5 myszy w grupie).
1. OVA257-264 2. OVA257-264 + pR 60
3. OVA257-264 + CpG 1668
4. OVA257-264 + I-ODN 1 5. OVA257-264 + I-ODN 2 6. OVA257-264 + I-ODN 3
7. OVA257-264 + CpG 1668 + pR 60
8. OVA257-264 + I-ODN 1 + pR 60
9. OVA257-264 + I-ODN 2 + pR 60
10. OVA257-264 + I-ODN 3 + pR 60
W dniu 0 myszom wstrzyknięto do poduszeczek obu tylnych łap po, ogółem, 100 μl (a więc po 50 gl w każdą poduszeczkę) preparatów zawierających związki wyżej wymienione. Po upływie 4 dni od wstrzyknięcia zwierzęta uśmiercono i pobrano podkolanowe węzły chłonne. Węzły chłonne przepuszczono przez 70 μm perkolator do komórek i przemyto 2 razy podłożem DMEM (GIBCO BRL) zawierającym 5% płodowej surowicy cielęcej (FCS, SIGMA Chemicals). Komórki doprowadzono do stężenia 3 x 106 komórek/ml w DMEM/5 %/FCS. Przeprowadzono test IFN-g ELISPOT, w trzech powtórzeniach, sposobem już opisanym (Miyahira i in., 1995). Sposób ten jest szeroko stosowaną metodą umożliwiającą kwantyfikowanie komórek T antygenowo swoistych.
Limfocyty stymulowano ex vivo przy użyciu podłoża tło-kontrola, peptydu OVA257-264 lub konkanawaliny A (Con A). Zliczono plamy reprezentujące pojedyncze komórki wytwarzające IFN-g i odjęto liczbę plam tła z wszystkich próbek. Duża liczba wykrytych plamek po stymulacji z udziałem Con A (dane nie uwidocznione) wskazuje na dobrą kondycję użytych limfocytów. Dla każdej doświadczalnej grupy myszy liczba plamek/1 x 106 komórek jest przedstawiona na fig. 1. Po upływie godziny od wstrzyknięcia, pobrano krew z żyły ogonowej i sporządzono preparaty surowicy w celu oznaczenia indukcji układowego INF-a zastosowaniem techniki ELISA (Fig. 2).
P r z y k ł a d 2
Wymiana guanozyny na dezoksinozynę przekształca sekwencję GpC nieimmunogenną w sekwencję wysoce immunogenną, zwłaszcza przy połączeniu z poli-L-argininą (pR60)
Myszy C57BI/6 (Harlan/Olac)
Peptyd Peptyd OVA257-264 (SIINFEKL), epitop owoalbuminy kurzej z zależną od MHC klasa I restrykcją związaną z układem (H-2Kb) (Rotzschke i in., 1991), zsyntetyzowano typową metodą syntezy F-moc na podłożu stałym, poddano oczyszczaniu metodą HPLC i analizowano metodą spektroskopii mas pod względem czystości. Dawka: 300 gg/mysz.
Poli-L-arginina 60 (pR60) Poli-L-arginina o średnim stopniu polimeryzacji 60 reszt argininy; SIGMA Chemicals. Dawka: 100 gg/mysz.
CpG-ODN 1668 Podstawione tiofosforanem ODN zawierające motyw CpG: tcc atg acg ttc ctg atg ct zsyntetyzowane przez NAPS GmbH, Getynga. Dawka: 5 nmoli/mysz.
GpC-ODN Podstawione tiofosforanem ODN zawierające nieimmunogenny motyw GpC: tcc atg agc ttc ctg atg ct zsyntetyzowane przez NAPS GmbH, Getynga. Dawka: 5 nmoli/mysz.
I-ODN 9 Podstawione tiofosforanem ODN zawierające dezoksyinozynę: tcc atg aic ttc ctg atg ct zsyntetyzowane przez NAPS GmbH, Getynga. Dawka: 5 nmoli/mysz.
I-ODN 10 ODN podstawione tiofosforanem zawierające dezoksyinozynę: tcc ati aic ttc cti ati ct zsyntetyzowane przez NAPS GmbH, Getynga. Dawka: 5 nmoli/mysz.
PL 211 036 B1
Grupy doświadczalne (5 myszy w grupie)
OVA257 -264 OVA257-264 + pR 60
OVA257-264 + CpG 1668 OVA257-264 + GpC
OVA257-264 + I-ODN 9
OVA257-264 + I-ODN 10
OVA257-264 + CpG 1668 + pR 60
OVA257-264 + GpC + pR 60
OVA257-264 + I-ODN 9 + pR 60
OVA257-264 + I-ODN 10 + pR 60
W dniu 0 myszom wstrzyknięto do poduszeczek obu tylnych łap po, ogółem, 100 μl (a więc po 50 μl w każdą poduszeczkę) preparatów zawierających związki wyżej wymienione. Po upływie 4 dni od wstrzyknięcia zwierzęta uśmiercono i pobrano podkolanowe węzły chłonne. Węzły chłonne przepuszczono przez 70 μm perkolator do komórek i przemyto 2 razy podłożem DMEM (GIBCO BRL) zawierającym 5% płodowej surowicy cielęcej (ECS, SIGMA Chemicals). Komórki doprowadzono do stężenia 3 x 106 komórek/ml w DMEM/5 %/FCS. Przeprowadzono test IFN-g ELISPOT, w trzech powtórzeniach, sposobem już opisanym (Miyahira i in., 1995). Sposób ten jest szeroko stosowaną metodą umożliwiającą kwantyfikowanie komórek T antygenowo swoistych. Limfocyty stymulowano ex vivo, w trzech powtórzeniach, przy użyciu podłoża (tło), peptydu OVA257-264, peptydu mTRP-2181-188 (pokrewnego mysiej tyrozynazie biaika-2, VYDFFVWL), tu nieistotnego, pR 60 i konkanawaliny A (Con A). Zliczono plamy reprezentujące pojedyncze komórki wytwarzające IFN-g i odjęto liczbę plam tła z wszystkich próbek. Duża liczba wykrytych plamek po stymulacji z udziałem Con A (dane nie uwidocznione) wskazuje na dobrą kondycję użytych limfocytów. Dla każdej doświadczalnej grupy myszy liczba plamek/1 x 106 komórek jest przedstawiona na fig. 3. Podano odchylenia standardowe z trzech ex vivo stymulowanych powtórzeń. Po upływie godziny od wstrzyknięcia, pobrano krew z żyły ogonowej i sporządzono preparaty surowicy w celu oznaczenia indukcji układowego TNFa i IL-6, z zastosowaniem techniki ELISA specyficznej dla cytokin (Fig. 4).
P r z y k ł a d 3
Połączone wstrzyknięcie losowych 20-merowych sekwencji zawierających dezoksyinozynę i peptydu pochodzącego z czerniaka indukuje silną odpowiedź immunologiczną skierowną przeciw peptydowi, którą można jeszcze wzmóc przez łączne z nimi zastosowanie poli-L-argininy (pR 60).
Myszy C57BI/6 (Harlan/Olac)
1 2
Peptyd Peptyd TRP-2 (VYDFFVWL), epitop pokrewnego mysiej tyrozynazie białka-2 z zależną od MHC klasa I restrykcją związaną z układem (H-2Kb) (Bloom i in., 1997), zsyntetyzowano typową metodą syntezy F-moc na podłożu stałym, poddano oczyszczaniu metodą HPLC i analizowano metodą spektroskopii mas pod względem czystości. Dawka: 300 μq/mysz.
Poli-L-arginina 60 (pR60) Poli-L-arginina o średnim stopniu polimeryzacji 60 reszt argininy; SIGMA Chemicals. Dawka: 100 μq/mysz.
CpG-ODN 1668 Podstawione tiofosforanem ODN zawierające motyw CpG: tcc atq acq ttc ctq atq ct zsyntetyzowane przez NAPS GmbH, Getynga. Dawka: 5 nmoli/mysz.
wdi Podstawione tiofosforanem ODN: nhh hhh wdi nhh hhh hhh wn zsyntetyzowane przez NAPS GmbH Getynqa. Dawka: 5 nmoli/mysz.
wdidin Podstawione tiofosforanem ODN: nhh hhh wdi nhh hhh hhh wn zsyntetyzowane przez NAPS GmbH, Getynqa. Dawka: 5 nmoli/mysz.
PL 211 036 B1 cd. tabeli
1 2
wdid Podstawione tiofosforanem ODN: nhh hhh wdi dhh hhh hhh wn zsyntetyzowane przez NAPS GmbH, Getynga. Dawka: 5 nmoli/mysz.
wdidid Podstawione tiofosforanem ODN: nhh wdi did hhh hdi ddi dh zsyntetyzowane przez NAPS GmbH, Getynga. Dawka: 5 nmoli/mysz.
Grupy eksperymentalne
1. TRP - 2
2. TRP - 2 + pR 60
3. TRP - 2 + CpG 1668
4. TRP - 2 + wdi
5. TRP - 2 + wdidin
6. TRP - 2 + wdid
7. TRP - 2 + wdidid
8. TRP - 2 + CpG 1668 + pR 60
9. TRP - 2 + wdi + pR 60
10. TRP - 2 + wdidin + pR 60
11. TRP - 2 + wdid + pR 60
12. TRP - 2 + wdidid + pR 60
W dniu 0 myszom wstrzyknięto do poduszeczek obu tylnych łap po, ogółem, 100 μl (a więc po 50 μl w każdą poduszeczkę) preparatów zawierających związki wyżej wymienione. Po upływie 4 dni od wstrzyknięcia zwierzęta uśmiercono i pobrano podkolanowe węzły chłonne. Węzły chłonne przepuszczono przez 70 μm perkolator do komórek i przemyto 2 razy podłożem DMEM (GIBCO BRL) zawierającym 5% płodowej surowicy cielęcej (FCS, SIGMA chemicals). Komórki doprowadzono do stężenia 3 x 106 komórek/ml w DMEM/5 %/FCS. Przeprowadzono test IFN-g ELISPOT, w trzech powtórzeniach, sposobem już opisanym (Miyahira i in., 1995). Sposób ten jest szeroko stosowaną metodą umożliwiającą kwantyfikowanie komórek T antygenowo swoistych. Limfocyty stymulowano ex vivo, w trzech powtórzeniach, przy użyciu podłoża (tło), peptydu TRP-2, peptydu OVA257-264, tu nieistotnego, pR 60 i konkanawaliny A (Con A). Zliczono plamy reprezentujące pojedyncze komórki wytwarzające IFN-g i odjęto liczbę plam tła z wszystkich próbek. Duża liczba wykrytych plamek po stymulacji z udziałem Con A (dane nie uwidocznione) wskazuje na dobrą kondycję użytych limfocytów. Dla każdej doświadczalnej grupy myszy liczba plamek/1 x 106 komórek jest przedstawiona na fig. 5. Podano odchylenia standardowe z trzech ex vivo stymulowanych powtórzeń.
P r z y k ł a d 4
Połączone wstrzyknięcie I-ODN i poli-L-argininy (pR 60) wzmaga sposób synergistyczny odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciw peptydowi pochodzącemu z czerniaka.
Grupy doświadczalne (5 myszy w grupie) 1. TRP-2181-188 2. TRP-2181 -188 + pR 60
3. TRP-2181-188 + CpG 1668
4. TRP-2181-188 + I-ODN 2
5. TRP-2181-188 + CpG 1668 + pR 60
6. TRP-2181-188 + I-ODN 2 + pR 60
W dniu 0 myszom wstrzyknięto do poduszeczek obu tylnych łap po, ogółem, 100 μl (a więc po 50 μl w każdą poduszeczkę) preparatów zawierających związki wyżej wymienione. Po upływie 4 dni od wstrzyknięcia zwierzęta uśmiercono i pobrano podkolanowe węzły chłonne. Węzły chłonne przepuszczono przez 70 μm perkolator do komórek i przemyto 2 razy podłożem DMEM (GIBCO BRL) zawierającym 5% płodowej surowicy cielęcej (FCS, SIGMA Chemicals). Komórki doprowadzono do stężenia 3 x 106 komórek/ml w DMEM/5 %/FCS. Przeprowadzono test IFN-γ ELISPOT, w trzech powtórzeniach, sposobem już opisanym (Miyahira i in., 1995). Sposób ten jest szeroko stosowaną metodą umożliwiającą kwantyfikowanie komórek T antygenowo swoistych. Limfocyty stymulowano ex vivo w trzech powtórzeniach przy użyciu podłoża tło-kontrola, peptydu TRP-2181-188, peptydu OVA257-264, tu
PL 211 036 B1 nieistotnego, i konkanawaliny A (Con A). Zliczono plamy reprezentujące pojedyncze komórki wytwarzające IFN-γ i odjęto liczbę plam tła z wszystkich próbek. Duża liczba wykrytych plamek po stymulacji z udziałem Con A (dane nie uwidocznione) wskazuje na dobrą kondycję użytych limfocytów. Dla każdej doświadczalnej grupy myszy liczba plamek/1 x 106 komórek jest przedstawiona na fig. 6. Podano odchylenie standardowe z trzech ex vivo stymulowanych powtórzeń.
Po upływie godziny od wstrzyknięcia, pobrano krew z żyły ogonowej i sporządzono preparaty surowicy w celu oznaczenia indukcji układowego TNF-α i IL-6 z zastosowaniem specyficznej techniki ELISA (Fig. 7).
P r z y k ł a d 5
Połączone wstrzyknięcie losowego 10-merowego I-ODN i poli-L-argininy (pR 60) wzmaga w sposób synergistyczny odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciw peptydowi pochodzącemu z czerniaka.
Grupy doświadczalne (5 myszy w każdej grupie) 1. TRP-2181-188 2. TRP-2181-188 + pR 60
3. TRP-2181-188 + CpG 1668
4. TRP-2181-188 + ODN 17
5. TRP-2181-188 + CpG 1668 + pR 60
6. TRP-2181-188 + ODN 17 + pR 60.
W dniu 0 myszom wstrzyknięto do poduszeczek obu tylnych łap po, ogółem, 100 gl (a więc po 50 gl w każdą poduszeczkę) preparatów zawierających związki wyżej wymienione. Po upływie 4 dni od wstrzyknięcia zwierzęta uśmiercono i pobrano podkolanowe węzły chłonne. Węzły chłonne przepuszczono przez 70 gm perkolator do komórek i przemyto 2 razy podłożem DMEM (GIBCO BRL) zawierającym 5% płodowej surowicy cielęcej (FCS, SIGMA Chemicals). Komórki doprowadzono do stężenia 3 x 106 komórek/ml w DMEM/5 %/FCS. Przeprowadzono test IFN-γ ELISPOT w trzech powtórzeniach, sposobem już opisanym (Miyahira i in., 1995). Sposób ten jest szeroko stosowaną metodą umożliwiającą kwantyfikowanie komórek T antygenowo swoistych. Limfocyty stymulowano ex vivo, w trzech powtórzeniach, przy użyciu podłoża-tła, peptydu TRP-2181-188, peptydu OVA257-264, tu nieistotnego i konkanawaliny A (Con A). Zliczono plamy reprezentujące pojedyncze komórki wytwarzające IFN-γ i odjęto liczbę plam tła z wszystkich próbek. Duża liczba wykrytych plamek po stymulacji z udziałem Con A (dane nie uwidocznione) wskazuje na dobrą kondycję użytych limfocytów. Dla każdej doświadczalnej grupy myszy liczba plamek/1 x 106 komórek jest przedstawiona na fig. 8. Podano odchylenia standardowe z trzech ex vivo stymulowanych powtórzeń.
Myszy C57BI/6 (Harlan/Olac)
1 2
Peptyd Peptyd TRP-2 (VYDFFVWL), epitop pokrewnego mysiej tyrozynazie białka-2 z zależną od MHC klasa I restrykcją związaną z układem (H-2Kb) (Bloom i in., 1997), zsyntetyzowano typową metodą syntezy F-moc na podłożu stałym, poddano oczyszczaniu metodą HPLC i analizowano metodą spektroskopii mas pod względem czystości. Dawka: 100 gg/mysz.
Poli-L-arginina 60 (pR60) Poli-L-arginina o średnim stopniu polimeryzacji 60 reszt argininy; SIGMA Chemicals. Dawka: 100 gg/mysz.
CpG-ODN 1668 Podstawione tiofosforanem ODN zawierające motyw CpG: tcc atg acg ttc ctg atg ct zsyntetyzowane przez NAPS GmbH, Getynga. Dawka: 5 nmoli/mysz.
ODN 17 Podstawione tiofosforanem ODN zawierające dezoksyinozynę: hhh wdi dhh h zsyntetyzowane przez NAPS GmbH, Getynga. Dawka: 10 nmoli/mysz.
Myszy C57BI/6 (Harlan/Olac)
PL 211 036 B1 cd. tabeli
1 2
Peptyd Peptyd IRP-2 (VYDFFVWL), epitop pokrewnego mysiej tyrozynazie białka-2 z zależną od MHC klasa I restrykcją związaną z układem (H-2Kb) (Bloom i in., 1997), zsyntetyzowano typową metodą syntezy F-moc na podłożu stałym, poddano oczyszczaniu metodą HPLC i analizowano metodą spektroskopii mas pod względem czystości. Dawka: 100 gg/mysz.
Poli-L-arginina 60 (pR60) Poli-L-arginina o średnim stopniu polimeryzacji 60 reszt argininy; SIGMA Chemicals. Dawka: 100 gg/mysz.
CpG-ODN 1668 Podstawione tiofosforanem ODN zawierające motyw CpG: tcc atg acg ttc ctg atg ct zsyntetyzowane przez NAPS GmbH, Getynga. Dawka: 5 nmoli/mysz.
I-ODN 2 Podstawione tiofosforanem ODN zawierające dezoksyinozynę: tcc atg aci ttc ctg atg ct zsyntetyzowane przez NAPS GmbH, Getynga. Dawka: 5 nmoli/mysz.
P r z y k ł a d 6
Połączone zastosowanie oligodezoksyIC26-mer i poli-L-argininy (pR) wzmaga humoralną odpowiedź swoistą względem ovoalbuminy (OVA).
Myszy C57BI/6 (Harlan/Olac)
Owoalbumina (OVA) Ovoalbumina z jaja kurzego, gatunek V, SIGMA Chemicals, A-5503, seria 54H7070 Dawka: 50 gg/mysz
Poli-L-arginina (PR) Poli-L-arginina o średnim stopniu polimeryzacji 60 reszt argininy; SIGMA Chemicals, P-4663, seria 68H5903 Dawka: 100 gg/mysz
Oligodezoksy IC, 26merowy (oligo-dIC26-mer) 0ligo-dIC26-mer zsyntetyzowany typową chemiczną metodą fosfoamidytową w skali 4 gmoli i oczyszczony metodą HPLC (NAPS Getynga, Niemcy). Dawka: 5 nomoli/mysz.
Grupy eksperymentalne (4 myszy w grupie)
1. OVA + oligo-dIC26-mer + PR
2. OVA + oligo -dIC26-mer
3. OVA + pR
4. OVA
W dniu 0 myszom wstrzyknięto do poduszeczek obu tylnych łap po, ogółem, 100 μΐ (a więc po 50 gl w każdą poduszeczkę) preparatów zawierających związki wyżej wymienione. Po upływie 24 godzin od wstrzyknięcia, zebrano surowice i podane je badaniu przesiewowemu techniką ELISA na obecność przeciwciał swoistych względem OVA. Otrzymane wyniki pokazują, że wstrzyknięcie ONA łącznie z oligo-dlC i pR wzmagało wytwarzanie swoistych względem OVA przeciwciał IgG, co widać w porównaniu z wynikami wstrzyknięcia OVA łącznie z każdą z tych substancji osobno (Fig. 13A, B). Jest rzeczą interesującą, że zarówno miano IgG2a jak i miano IgGl zwiększało się po pojedynczym wstrzyknięciu OVA z oligo-dIC/pR, co nasuwa wniosek, że zaangażowane tu były tak komórki Th1 jak i komórki Th2. Jednakże, po upływie 115 dni, w surowicach myszy, którym wstrzyknięto OVA i oligodIC/pR, wykrywalne były ciągle jeszcze jedynie podwyższone poziomy miana IgG2a.
Dane powyższe pokazują, że połączone wstrzyknięcie OVA, oligo-dlC i pR powoduje wzmożenie humoralnej odpowiedzi swoistej względem OVA. Odpowiedź ta charakteryzuje się wytwarzaniem we wczesnej fazie izotypów przeciwciał indukowanych tak przez Th1 jak i przez Th2, ale później przeważnie przeciwciał indukowanych przez Th1.
PL 211 036 B1
Odnośniki
D. Andreu i L. Rivas, Animal amtimicrobial peptides: a overview, 47, 415 - 433 (1998).
Z.K. Bailas, W.L. Rasmussen i A.M. Krieg, Induction of NK activity in murine and human cells by CpG motif in oligodeoxynucleotides and bacterial DNA, J. Immunol., 157, 1840 -1845 (1996).
B.R. Bloom i R. Widdus, „Vaccine visions and their global impact, Nat. Med., 4, 480 - 484 (1998).
M.B. Bloom, D. Perry-Lalley, P.F. Robbins, Y. Li., M. el-Gamil, S.A. Rosenberg i J.C. Yang, „Identification of tyrosinase-related protein 2 as a tumor rejection antigen for the B 16 melanoma,
J. Exp. Med., 185, 453 - 459 (1997).
M. Buschle, W. Schmidt, M. Berger, G. Schaffner, R. Kurz-bauer, L. Killisch, J.K. Tiedemarm, B. Trska, H. Kirlappos, K. Mechtler, F. Schilcher, C. Gabier i M.L. Birntsrlel, Chemically defined, cell free cancer vaccines: use of tumor antigen-derived peptides or polyepitope proteins for vaccination, Gene Ther. Mol. Biol., 1, 309 - 321 (1998).
M. Buschle, W. Schmidt, W. Zauner, K. Mechtler, B. Trska, H. Kirlappos i M.L. Birnstiel, „Transloading of tumor antigen-derived peptides into antigen-presenting cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 3256 3261 (1997).
P.F. Cavanaugh, jr, Y-K Ho i T.J. Bardos, „The activation of murine macrophages and natural killer cells by the Partially tiolated double stranded RNA poly (1).mercapto poly (C), Res. Comm. Mol. Pathol. Pharmacol., 91, 131 - 147 (1996).
J.H. Chace, N.A. Hooker, K.L. Mildenstein, A.M. Krieg i J.S. Cowdery, Bacterial DNA-induced NK cell IFN-gamma production is dependent on macrophage secretion of IL-12, Clin. Immunol. Immunopathol., 84, 185 - 193 (1997).
H.L.Davis, R. Weeranta, T.J. Waldschmidt, L. Tygrett, J. Schorr i A.M. Krieg, „CpG DNA is a potent enhancer of specific immunity in mice immunized with recombinant hepatitis B surface antigen, J. Immunol., 160, 870 - 876 (1998).
G.M. Deng, L.M Nilsson, M. Verdrengh, L.V. Collins i A. Tarkowski, „Intra-articularly localized bacterial DNA containing CpG motifs induces arthritis, Nat. Med., 5, 702 -705 (1999).
T. Ganz, „Defensins and host defense [comment], Science, 286, 420 - 421 (1999).
T. Ganz i R.L. Lehrer, „Antibiotic peptides from higher eukaryotes: biology and applications, Mol. Med. Today, 5, 292 -297 (1999).
R.E. Hancock, „Host defence (cationic) peptides: what is their future clinical potential?, Drugs, 57, 469 - 473 (1999).
E. Harlow i D. Lane, Antibodies: a laboratory manual, (Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory) (1988). G. Harmann, G.J. Weiner i A.M. Krieg, „CpG DNA: A potent signal for growth, activation and maturation of human dendritic cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 9305 - 9310 (1999).
J.A. Hoffmann, F.C. Kafatos, C.A. Janeway i R.A. Ezekowitz, „Phylogenetic perspectives in innate immunuity, Science, 284, 1313 - 1318 (1999).
D.M. Klinman, A.K. Yi, S.L. Beaucage, S.L. Conover i A.M. Krieg, „CpG motifs present in bacteria DNA rapidly induce Lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon gamma, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 2879 - 2883 (1996).
A.M. Krieg, „CpG DNA: a nowel immunomodulator [letter], Trends Microbiol, 7, 64 - 65 (1999).
A.M. Krieg, „An innate immune defense mechanism based on the recognition of CpG motifs in microbial DNA, J. Lab. Clin. Med., 128, 128 - 133 (1996).
A.M. Krieg, A.K. Yi, S. Matson, T.J. Waldschmidt, G.A. Bishop, R. Teasdale, G.A. Koretzky i D.M. Klinman, „CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation, Nature, 374, 546 - 549 (1995).
A. M. Krieg, A.K. Y±, J. Schorr i H.h. Davis, „The role of CpG dinucleotides in DNA vaccines, Trends Microbiol., 6, 23 - 27 (1998).
B. Lethe, B. van den Eynde, van Pel, G. Corradin i T. Boon, „Mouse tumor rejection antigens P815A i P815B: two epitopes carried by a single peptide, Eur. J. Immunol., 22, 2283 -2288 (1992).
S. Liljeqvist i S. Stahl, Production of recombinant subunit vaccines: protein immunogens, live delivery systems and nucleic acid vaccines, J. Biotechnol., 73, 1 - 33 (1999).
G.B.Lipford, K. Heeg i H. Wagner, Bacterial DNA as immune cell activator, Trends Microbiol., 6, 496 - 500 (1998).
PL 211 036 B1
R. Manetti, F. Annunziato, L. Tomasevic, V. Gianno, P. Parronchi, S. Romagnani i E. Maggi, „Polyinosinic acid:policytydylic acid promotes T helper type 1-specific immune responses by stimulating macrophage production of interferon-a and interleukin-12, Eur. J. Immunol., 25, 2656 -2660 (1995).
T.R. Mosmann, H. Cherwinski, M.W. Bond, M.A. Giedlin i R.L. Coffman, „Two types of murine helper T cell clone. 1. Definition according to profiles of Lymphokine activities and secreted proteins, J. Immunol., 136, 2348 - 2357 (1986).
G. Nossal, „Living up to the legacy, Nat. Med., 4, 475 - 476 (1998).
A. Oxenius, M.M. Martinic, H. Hengartner i P. Klenerman, „CpG-containing oligonucleotides are efficient adjuvants for induction of protective antiviral immune responses with T-cell peptide vaccines, J. Virol., 73, 4120 - 4126 (1999).
F. Paillard, „CpG: the double-edged sword [comment], Hum. Gene. Ther., 10, 2089 - 2090 (1999).
E.G. Pamer, J.T. Harty i M.J. Bevan, Precise prediction of a dominant class I MHC-restricted epitope of Listeria monocytogenes, Nature, 353, 852 - 855 (1991).
P. Parronchi, F. Brugnolo, F. Annunziato, C. Manuelli, S. Sampognaro, C. Mavilia, S. Romagnani i E. Maggi, „Phosphorothioate oligodeoxynucleotides promote the in vitro development of human allergen-specific CD4+ T cells into Th1 effectors, J. Immunol., 163, 5946 - 5953 (1999).
D.S. Pisetzky, „lmmunostimulatory DNA: a clear and present danger?, Nat. Med., 3, 829 - 831 (1997).
D.S. Pisetzky, „The influence of base sequence on the immunostimulatory properties of DNA, Immunol. Res, 19, 35 - 46 (1999).
H. G. Rammensee, T. Friede, S. Stevanoviic, „MHC ligands and peptide motifs: first listing, Immunogenetics, 41, 178 - 228 (1995).
M. Rodrigues, R.S. Nussenzweig, P. Romero i F. Zavala, „The in vivo cytotoxic activity of CD8+ T cell clones correlates with their levels of expression of adhesion molecules, J. Exp. Med., 175, 895 905 (1992).
L. Roitt, J. Brostoff i D. Male, Immunology (Londyn, Mosby International Ltd) (1998).
O. Rotzschke, K. Falk, S. Stevanovic, G. Jung, P. Walden i H.G. Rammensee, „Exact prediction of a natural T cell epitope, Eur. J. Immunol., 21, 2891 - 2894 (1991).
W. Schmidt, M. Buschle, W. Zauner, H. Kirlappos, K. Mechtler. B. Trska i M.L. Bimstiel, „Cellfree tumor antigen peptide-based cancer vaccines, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 3262 - 3267 (1997).
D.A. Schwartz, T.J. Quinn, P.S. Thome, S. Sayeed, A.K. Yi i A.M Krieg, „CpG motifs in bacterial DNA cause inflammation in the lower respiratory tract, J. Clin. Invest., 100, 68 - 73 (1997).
R. Shimonkevitz, S. Colon, J.W. Kappler, P. Marrack i H.M. Grey, „Antigen recognition by H2-restricted T-cells 11. A tryptic ovalbumin peptide that substitutes for processed antigen, J. Immunol., 133, 2067 - 2074 (1984).
M. Simmaco, G. Mignogna i D. Barra, „Antimicrobial peptides from amphibian skin: what do they tell us?, Biopolymers, 47, 435 - 450 (1998).
K. Sparbier i P. Walden, „T-cell receptor specifity and mimotopes, Curr. Opin. Immunol., 11, 214 - 218 (1999).
T. Sparwasser, E.S. Koch, R.M. Vabulas, K. Heeg, G.B. Lip-ford, J.W. Ellwart i H. Wagner, Bacterial DNA and immunostimulatory CpG oligonucleotides trigger maturation and activation of murine dendritic cells, Eur. J. Immunol., 28, 2045 - 2054 (1998).
T. Sparwasser, I. Miethke, G. Lipford, K. Borschert, H. Hacker, K. Heeg i H. Wagner, Bacterial DNA causes septic shock [letter], Nature, 386, 336 - 337 (1997).
T. Sparwasser. I. Miethke, G. Lipford, A. Erdmann, H. Hacker, K. Heeg i H. Wagner, „Microphages sense pathogens via DNA motif: induction of tumor necrosis factor-alfa-mediated shock, Eur. J. Immunol., 27, 1671 - 1679 (1997).
G. J. Weiner, H.M. Liu, J.E. Wooldridge, CE. Dahle i A.M. Krieg, „Immunostimulatory oligodeoxynucleotides containing the CpG motif are effective as immune adjuvants in tumor antigen immunization, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 10833 -10837 (1997).
N. S. Yew, K.X. Wang, M. Przybylska, R.G. Bagley, M. Stedman, J. Marshall, R.K. Scheule i S.H. Cheng, Contribution of plasmid DNA to inflammation in the lung after administration of cationic lipid:pDNA complexes, Hum. Gene Ther., 10, 223 -234 (1999).
PL 211 036 B1

Claims (20)

1. Zastosowanie cząsteczki immunostymulującego kwasu oligodezoksynukleinowego (ODN) o budowie przedstawionej wzorem (I), w którym:
Zastrzeżenia patentowe
X oznacza O lub S,
NMP oznacza 2'-dezoksynukleozydomonofosforan lub -monotiofosforan, wybrany z grupy obejmującej dezoksyadenozyno-, dezoksyguanozyno-, dezoksyinozyno-, dezoksycytozyno-, dezoksyurydyno-, dezoksytymidyno-, 2-metylodezoksyinozyno-, 5-metylodezoksycytozyno-, dezoksypseudourydyno-, dezoksyrybozopuryno-, 2-aminodezoksyrybozopuryno-, 6-S-dezoksyguanino-, 2-dimetylodezoksyguanozyno- lub N-izopentenylodezoksyadenozynomonofosforan lub -monotiofosforan,
NUC oznacza 2'-dezoksynukleozyd, wybrany z grupy obejmującej dezoksyadenozynę, dezoksyguanozynę, dezoksyinozynę, dezoksycytozynę, dezoksyurydynę, dezoksytymidynę, 2-metylodezoksyinozynę, 5-metylodezoksycytozynę, dezoksypseudourydynę, dezoksyrybozopurynę, 2-aminodezoksyrybozopurynę, 6-S-dezoksyguanidynę, 2-dimetylodezoksyguanidynę lub N-izopentenylodezoksyadenozynę, a i b oznaczają liczby całkowite od 0 do 100, z tym, że suma a + b mieści się w zakresie od 4 do 150,
B i E oznaczają grupy zwykłe dla końców 5' i 3' cząsteczek kwasów nukleinowych, do wytwarzania immunostymulującej kompozycji farmaceutycznej.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że cząsteczkę ODN stanowi cząsteczka oligo-C28.
3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że każda grupa o symbolu NMP jest wybrana z grupy obejmującej dezoksyadenozyno-, dezoksyguanozyno-, dezoksyinozyno-, dezoksycytozyno-, dezoksyurydyno-, dezoksytymidyno-, 2-metylodezoksy-inozyno-, 5-metylodezoksycytozynomonofosforan lub -monotiofosforan.
4. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienne tym, że suma a + b mieści się w zakresie od 10 do 60, korzystnie w zakresie od 15 do 40.
5. Zastosowanie według zastrz. 1-4, znamienne tym, że co najmniej jeden z symboli X1 i X2 oznacza S i co najmniej jeden z symboli X3 i X4 oznacza O, oraz korzystnie, którykolwiek NMP oznacza nukleozydomonotiofosforan.
6. Zastosowanie według zastrz. 1-5, znamienne tym, że ODN zawiera sekwencję nhh hhh wdi nhh hhh hhh wn, nhh wdi din hhh hdi ndi nh, nhh hhh wdi dhh hhh hhh wn lub nhh wdi did hhh hdi ddi dh, przy czym:
którykolwiek n oznacza 2-dezoksynukleozydomonofosforan lub -monotiofosforan, wybrany z grupy obejmującej dezoksyadenozyno-, dezoksyguanozyno-, dezoksycytozyno- lub dezoksytymidynomonofosforan lub -monotiofosforan, którykolwiek h oznacza 2'-dezoksynukleozydomonofosforan lub -monotiofosforan, wybrany z grupy obejmującej dezoksyadenozyno-, dezoksycytozyno- lub dezoksytymidynomonofosforan lub -monotiofosforan, i oznacza dezoksyinozynomonofosforan lub -monotiofosforan, którykolwiek w oznacza 2'-dezoksynukleozydomonofosforan lub -monotiofosforan, wybrany z grupy obejmującej dezoksyadenozyno- lub dezoksytymidynomonofosforan lub -monotiofosforan, oraz
PL 211 036 B1 którykolwiek d oznacza 2'-dezoksynukleozydomonofosforan lub -monotiofosforan, wybrany z grupy obejmują cej dezoksy-adenozyno-, dezoksyguanozyno- lub dezoksytymidynomonofosforan lub
-monotiofosforan.
7. Zastosowanie według zastrz. 1-6, znamienne tym, że ODN zawiera sekwencję hhh wdi dhh h.
8. Zastosowanie według zastrz. 1-7, znamienne tym, że ODN zawiera co najmniej jeden 2'-dezoksycytozyno-monofosforan lub -monotiofosforan, przyległy w pozycji 3' do 2'-dezoksyinozynomonofosforanu lub -monotiofosforanu.
9. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że ODN zawiera deoksyinozynędeoksycytozynę 26-mer.
10. Zastosowanie według zastrz. 1-9, znamienne tym, że ODN zawiera sekwencję:
gacitt, iacitt, gaictt, iaictt, przy czym:
a oznacza dezoksyadenozynomonofosforan lub -monotiofosforan, g oznacza dezoksyguanozynomonofosforan lub -monotiofosforan, i oznacza dezoksyinozynomonofosforan lub -monotiofosforan, c oznacza dezoksycytozynomonofosforan lub -monotiofosforan, oraz t oznacza dezoksytymidynomonofosforan lub -monotiofosforan.
11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że gacitt stanowi tcc atg aci ttc ctg atg ct.
12. Zastosowanie według zastrz. 1-11, znamienne tym, że ODN zawiera sekwencję:
wdi, wdid, wdidin lub wdidid, przy czym:
w, d, i oraz n mają wyżej podane znaczenie.
13. Zastosowanie według zastrz. 1-11, znamienne tym, że B i E są, niezależnie, wybrane z grupy obejmującej -H, -CH3, -COH, -COCH3, -OH, -CHO, -PO4, -PSO3, -PS2O2, -PS3O, -PS4, -SO3,
-PO4(CH2)1-6-NH2 lub -P04-(CH2)1-6-NH-znacznik.
14. Zastosowanie według zastrz. 1-13, znamienne tym, że immunostymulującą kompozycją farmaceutyczną jest wacyna.
15. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera ODN określoną w zastrz. 1.
16. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera ODN określoną w zastrz. 1-13, oraz antygen.
17. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 15 albo 16, znamienna tym, że zawiera jeszcze polimer polikationowy, korzystnie peptyd polikationowy, zwłaszcza poliargininę, polilizynę lub peptyd przeciwbakteryjny, zwłaszcza przeciwbakteryjny peptyd wywodzący się z katelicydyny, syntetyczny peptyd zawierający 2KLK-motywy przedzielone łącznikiem o 3-7 hydrofobowych aminokwasach, albo hormon wzrostu, zwłaszcza ludzki hormon wzrostu.
18. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 15 albo 16, albo 17, znamienna tym, że zawiera jeszcze składniki aktywne, zwłaszcza cytokiny, substancje przeciwzapalne, substancje przeciwbakteryjne lub ich kombinacje.
19. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 15-18, znamienna tym, że zawiera jeszcze substancje pomocnicze, zwłaszcza farmaceutycznie dozwolony nośnik, substancje buforowe, stabilizatory lub ich kombinacje.
20. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 15-19, znamienna tym, że zawiera jeden, lub więcej niż jeden ODN określoną w zastrz. 1-13 w ilości mieszczącej się w zakresie od 1 ng do 1 g, korzystnie w zakresie od 100 ng do 10 mg, a zwłaszcza w zakresie od 10 mg do 1 mg.
PL358982A 2000-06-08 2001-06-07 Zastosowanie cząsteczki immunostymulującego kwasu oligodezoksynukleinowego (ODN) i zawierająca ją kompozycja PL211036B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT0100000A AT410173B (de) 2000-06-08 2000-06-08 Antigene zusammensetzung
AT19732000 2000-11-23
PCT/EP2001/006433 WO2001093905A1 (en) 2000-06-08 2001-06-07 Immunostimulatory oligodeoxynucleotides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL358982A1 PL358982A1 (pl) 2004-08-23
PL211036B1 true PL211036B1 (pl) 2012-04-30

Family

ID=25608484

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL358982A PL211036B1 (pl) 2000-06-08 2001-06-07 Zastosowanie cząsteczki immunostymulującego kwasu oligodezoksynukleinowego (ODN) i zawierająca ją kompozycja

Country Status (25)

Country Link
US (3) US8568742B2 (pl)
EP (1) EP1296713B1 (pl)
JP (2) JP5271471B2 (pl)
KR (1) KR100799788B1 (pl)
CN (1) CN1309418C (pl)
AT (1) ATE249839T1 (pl)
AU (2) AU8181201A (pl)
BR (1) BRPI0111639B8 (pl)
CA (1) CA2411575C (pl)
CZ (1) CZ304195B6 (pl)
DE (1) DE60100814T2 (pl)
DK (1) DK1296713T3 (pl)
ES (1) ES2206424T3 (pl)
HU (1) HU228264B1 (pl)
IL (2) IL152959A0 (pl)
IS (1) IS1993B (pl)
MX (1) MXPA02012010A (pl)
NO (1) NO329492B1 (pl)
PL (1) PL211036B1 (pl)
PT (1) PT1296713E (pl)
RU (2) RU2293573C2 (pl)
SI (1) SI1296713T1 (pl)
SK (1) SK287689B6 (pl)
TR (1) TR200302015T4 (pl)
WO (1) WO2001093905A1 (pl)

Families Citing this family (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6977245B2 (en) 1999-04-12 2005-12-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
WO2001051500A1 (en) 2000-01-14 2001-07-19 The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
HU228264B1 (en) * 2000-06-08 2013-02-28 Intercell Ag Immunostimulatory oligodeoxynucleotides
WO2002069369A2 (en) * 2000-12-08 2002-09-06 Coley Pharmaceutical Gmbh Cpg-like nucleic acids and methods of use thereof
EP1347775B1 (en) 2001-01-05 2016-11-30 Valneva Austria GmbH Uses for polycationic compounds as vaccine adjuvants
US20040081655A1 (en) * 2001-01-05 2004-04-29 Karen Lingnau Methods and compositions comprising polycationic compounds
WO2002053184A2 (en) * 2001-01-05 2002-07-11 Intercell Ag Uses for polycationic compounds as vaccine adjuvants
WO2002053185A2 (en) * 2001-01-05 2002-07-11 Intercell Ag Anti-inflammatory use of polycationic compounds
AT410798B (de) 2001-01-26 2003-07-25 Cistem Biotechnologies Gmbh Verfahren zur identifizierung, isolierung und herstellung von antigenen gegen ein spezifisches pathogen
EP1390494A2 (en) * 2001-05-21 2004-02-25 Intercell AG Method for stabilising of nucleic acids
EP1412390A2 (en) * 2001-07-26 2004-04-28 Tanox, Inc. Agents that activate or inhibit toll-like receptor 9
US7666674B2 (en) 2001-07-27 2010-02-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of sterically stabilized cationic liposomes to efficiently deliver CPG oligonucleotides in vivo
US7354909B2 (en) * 2001-08-14 2008-04-08 The United States Of America As Represented By Secretary Of The Department Of Health And Human Services Method for rapid generation of mature dendritic cells
MX339524B (es) 2001-10-11 2016-05-30 Wyeth Corp Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica.
US20050250716A1 (en) * 2001-12-07 2005-11-10 Intercell Ag Immunostimulatory oligodeoxynucleotides
AU2002366710A1 (en) 2001-12-20 2003-07-09 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of USE OF CpG OLIGODEOXYNUCLEOTIDES TO INDUCE ANGIOGENESIS
US8466116B2 (en) 2001-12-20 2013-06-18 The Unites States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of CpG oligodeoxynucleotides to induce epithelial cell growth
US8088388B2 (en) 2002-02-14 2012-01-03 United Biomedical, Inc. Stabilized synthetic immunogen delivery system
CA2388049A1 (en) 2002-05-30 2003-11-30 Immunotech S.A. Immunostimulatory oligonucleotides and uses thereof
JP2005533855A (ja) 2002-07-24 2005-11-10 インターツェル・アクチェンゲゼルシャフト 病原性ウイルスからの別のリーディングフレームによりコードされる抗原
AR040996A1 (es) 2002-08-19 2005-04-27 Coley Pharm Group Inc Acidos nucleicos inmunoestimuladores
US7785608B2 (en) 2002-08-30 2010-08-31 Wyeth Holdings Corporation Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease
EP1537418A2 (en) 2002-09-13 2005-06-08 Intercell AG Method for isolating hepatitis c virus peptides
US8263091B2 (en) 2002-09-18 2012-09-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Method of treating and preventing infections in immunocompromised subjects with immunostimulatory CpG oligonucleotides
JP5116971B2 (ja) 2002-10-15 2013-01-09 インターセル アーゲー Ｂ群連鎖球菌の接着因子をコードする核酸、ｂ群連鎖球菌の接着因子、およびその使用
CN1756843B (zh) 2003-03-04 2012-03-21 英特塞尔股份公司 化脓链球菌抗原
ES2351489T3 (es) * 2003-03-24 2011-02-07 Intercell Ag Vacunas mejoradas.
AU2004224746B2 (en) 2003-03-24 2009-04-23 Valneva Austria Gmbh Improved vaccines
AU2004226262A1 (en) 2003-03-31 2004-10-14 Intercell Ag Staphylococcus epidermidis antigens
US7635487B2 (en) 2003-04-15 2009-12-22 Intercell Ag S. pneumoniae antigens
EP1620460A2 (en) 2003-05-07 2006-02-01 Intercell AG Streptococcus agalactiae antigens i + ii
EP1629005A2 (en) 2003-05-30 2006-03-01 Intercell AG Enterococcus antigens
CA2530062A1 (en) * 2003-07-11 2005-01-20 Intercell Ag Hcv vaccines
JP4817599B2 (ja) * 2003-12-25 2011-11-16 独立行政法人科学技術振興機構 免疫活性増強剤とこれを用いた免疫活性の増強方法
KR100721928B1 (ko) * 2004-11-05 2007-05-28 주식회사 바이오씨에스 ＣｐＧ 올리고데옥시뉴클레오티드를 함유하는 피부질환의치료 또는 예방용 약학적 조성물
DK1931379T3 (da) 2005-10-07 2013-08-19 Sec Dep For Health Proteiner med forbedret opløselighed samt fremgangsmåder til frembringelse og anvendelse af samme
TW200806315A (en) 2006-04-26 2008-02-01 Wyeth Corp Novel formulations which stabilize and inhibit precipitation of immunogenic compositions
KR20090024292A (ko) 2006-06-28 2009-03-06 스태튼스 세룸 인스티튜트 단백질 단편 또는 펩타이드 혼합물로서 전달되는 항원을 가진 백신접종에 의해 준우성 항원결정기를 포함하는 ｔ세포 레퍼토리 확장
EP2292647A3 (en) 2006-07-07 2011-06-08 Intercell AG Small Streptococcus pyogenes antigens and their use
EP2289906A1 (en) 2006-09-15 2011-03-02 Intercell AG Borrelia antigens
EP1923069A1 (en) 2006-11-20 2008-05-21 Intercell AG Peptides protective against S. pneumoniae and compositions, methods and uses relating thereto
AR064642A1 (es) 2006-12-22 2009-04-15 Wyeth Corp Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi
EP2266592A3 (en) 2007-01-12 2012-08-08 Intercell AG Protective proteins of S. agalactiae, combinations thereof and methods of using the same
CA2685805A1 (en) 2007-05-02 2008-11-13 Intercell Ag Klebsiella antigens
EP2012122A1 (en) 2007-07-06 2009-01-07 Medigene AG Mutated parvovirus structural proteins as vaccines
EP2158211B1 (en) 2007-05-31 2016-08-10 Medigene AG Mutated structural protein of a parvovirus
EP2511291A3 (en) 2007-06-18 2012-11-07 Intercell AG Chlamydia antigens
AU2009226949A1 (en) 2008-03-17 2009-09-24 Intercell Ag Peptides protective against S. pneumoniae and compositions, methods and uses relating thereto
WO2009155484A2 (en) 2008-06-20 2009-12-23 Wyeth Compositions and methods of use of orf1358 from beta-hemolytic streptococcal strains
EP2424882A2 (en) 2009-02-05 2012-03-07 Intercell AG Peptides protective against e. faecalis, methods and uses relating thereto
EP2405938A2 (en) 2009-02-13 2012-01-18 Intercell AG Nontypable haemophilus influenzae antigens
AU2010264538B2 (en) 2009-06-22 2013-10-03 Wyeth Llc Immunogenic compositions of Staphylococcus aureus antigens
WO2011041003A2 (en) 2009-06-22 2011-04-07 Wyeth Llc Compositions and methods for preparing staphylococcus aureus serotype 5 and 8 capsular polysaccharide conjugate immunogenic compositions
AU2010288239B2 (en) 2009-08-27 2014-01-16 Novartis Ag Adjuvant comprising aluminium, oligonucleotide and polycation
EP2319871A1 (en) 2009-11-05 2011-05-11 Sanofi-aventis Polypeptides for binding to the "receptor for advanced glycation endproducts" as well as compositions and methods involving the same
PH12012500564A1 (en) 2009-10-09 2012-10-22 Sanofi Sa Polypeptides for binding to the receptor for advanced glycation endproducts as well as compositions and methods involving the same
EP2308896A1 (en) 2009-10-09 2011-04-13 Sanofi-aventis Polypeptides for binding to the "receptor for advanced glycation endproducts" as well as compositions and methods involving the same
US8765148B2 (en) 2010-02-19 2014-07-01 Valneva Austria Gmbh 1C31 nanoparticles
WO2012020326A1 (en) 2010-03-18 2012-02-16 Novartis Ag Adjuvanted vaccines for serogroup b meningococcus
EP3626263A1 (en) 2010-06-04 2020-03-25 Wyeth LLC Vaccine formulations
CA2808975C (en) 2010-08-23 2018-10-30 Wyeth Llc Stable formulations of neisseria meningitidis rlp2086 antigens
KR101907434B1 (ko) 2010-09-03 2018-10-12 발네바 오스트리아 게엠베하 C. 디피실의 a 독소 및 b 독소 단백질의 분리된 폴리펩타이드 및 이의 용도
AR082925A1 (es) 2010-09-08 2013-01-16 Medigene Ag Proteinas estructurales mutadas por parvovirus con epitopo de celulas b de proteccion cruzada, producto y metodos relacionados
KR101584871B1 (ko) 2010-09-10 2016-01-22 와이어쓰 엘엘씨 네이세리아 메닝기티디스 orf2086 항원의 비-지질화된 변이체
HUE033072T2 (hu) 2010-12-22 2017-11-28 Wyeth Llc Staphylococcus aureus antigének immunogén készítményei
JP5872684B2 (ja) * 2011-05-26 2016-03-01 インターベット インターナショナル ベー． フェー． 免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチド
US9315814B2 (en) * 2011-05-26 2016-04-19 Intervet Inc. Immunostimulatory oligodeoxynucleotides
ITMI20111182A1 (it) 2011-06-28 2012-12-29 Canio Buonavoglia Vaccino per coronavirus canino
SA115360586B1 (ar) 2012-03-09 2017-04-12 فايزر انك تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها
CA2865745C (en) 2012-03-09 2018-01-09 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
RU2672053C2 (ru) 2012-12-20 2018-11-09 Пфайзер Инк. Способ гликоконъюгации
CA2903716C (en) 2013-03-08 2019-04-09 Pfizer Inc. Immunogenic fusion polypeptides
RU2662968C2 (ru) 2013-09-08 2018-07-31 Пфайзер Инк. Иммуногенная композиция против neisseria meningitidis (варианты)
WO2016130569A1 (en) 2015-02-09 2016-08-18 Mj Biologics, Inc. A composition comprising pedv antigens and methods for making and using the composition
CN106488929B (zh) * 2014-05-09 2021-08-24 乌得勒支大学控股有限公司 新型cath2衍生物
KR20190049940A (ko) 2015-02-19 2019-05-09 화이자 인코포레이티드 나이세리아 메닌지티디스 조성물 및 그의 방법
KR102143534B1 (ko) 2015-05-04 2020-08-12 화이자 인코포레이티드 B군 스트렙토코쿠스 폴리사카라이드-단백질 접합체, 접합체를 생산하는 방법, 접합체를 포함하는 면역원성 조성물, 및 그의 용도
US10751402B2 (en) 2016-11-09 2020-08-25 Pfizer Inc. Immunogenic compositions and uses thereof
SG11201906519RA (en) 2017-01-31 2019-08-27 Pfizer Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
EP3527223A1 (en) 2018-02-16 2019-08-21 2A Pharma AB Mutated parvovirus structural protein
CN112074295A (zh) 2018-02-16 2020-12-11 2A制药公司 用于治疗自身免疫性疾病的细小病毒结构蛋白
KR20220010478A (ko) 2019-05-20 2022-01-25 발네바 에스이 기도 감염의 치료 또는 예방용 서브유닛 백신
WO2020240268A1 (en) 2019-05-31 2020-12-03 Universidad De Chile An immunogenic formulation that induces protection against shiga toxin-producing escherichia coli (stec)
CA3155669A1 (en) 2019-09-27 2021-04-01 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
WO2021211279A1 (en) 2020-04-17 2021-10-21 Regents Of The University Of Minnesota SARS-CoV-2 SPIKE RECEPTOR BINDING DOMAIN AND COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
EP4203995A1 (en) 2020-08-26 2023-07-05 Pfizer Inc. Group b streptococcus polysaccharide-protein conjugates, methods for producing conjugates, immunogenic compositions comprising conjugates, and uses thereof
WO2022074061A1 (en) 2020-10-07 2022-04-14 Valneva Sweden Ab Cholera vaccine formulation
WO2023083964A1 (en) 2021-11-11 2023-05-19 2A Pharma Ab Parvovirus structural protein against beta- and gamma-hpv
WO2023232901A1 (en) 2022-06-01 2023-12-07 Valneva Austria Gmbh Clostridium difficile vaccine
KR20250054810A (ko) 2022-09-29 2025-04-23 화이자 인코포레이티드 Rsv f 단백질 삼량체를 포함하는 면역원성 조성물
WO2026038177A1 (en) 2024-08-16 2026-02-19 Pfizer Inc. Immunogenic compositions and uses thereof

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3725545A (en) 1971-02-03 1973-04-03 R Maes Enhancement of antibody production by nucleic acid-polycation complexes
US3906092A (en) * 1971-11-26 1975-09-16 Merck & Co Inc Stimulation of antibody response
CA2016841C (en) * 1989-05-16 1999-09-21 William D. Huse A method for producing polymers having a preselected activity
ZA908001B (en) * 1989-10-11 1991-08-28 Merrell Dow Pharma Inosine/guanosine derivatives as immunosuppressive agents
US5514577A (en) * 1990-02-26 1996-05-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide therapies for modulating the effects of herpes viruses
DK0515660T3 (da) * 1990-12-21 1997-07-28 Hoffmann La Roche HLA-DQbeta-DNA-typebestemmelse
US5098437A (en) * 1991-02-13 1992-03-24 Pfizer Hospital Products Group, Inc. Acetabular cup positioning insert
DK0610396T3 (da) * 1991-10-23 2001-01-29 Baylor College Medicine Fingeraftryksidentifikation af bakteriestammer med anvendelse af repetitiv DNA-sekvensamplifikation
US5646262A (en) * 1994-07-28 1997-07-08 Georgetown University Antisense oligonucleotides against hepatitis B viral replication
US20020081577A1 (en) * 1995-06-06 2002-06-27 Robert L. Kilkuskie Oligonucleotides speciific for hepatitis c virus
ZA964446B (en) * 1995-06-06 1996-12-06 Hoffmann La Roche Oligonucleotides specific for hepatitis c virus
ES2168472T3 (es) * 1995-06-06 2002-06-16 Beth Israel Hospital Procedimiento y aparato para ensayo diagnostico de adn.
AU736785B2 (en) * 1996-10-02 2001-08-02 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Detection and identification of non-polio enteroviruses
WO1998016247A1 (en) * 1996-10-11 1998-04-23 The Regents Of The University Of California Immunostimulatory polynucleotide/immunomodulatory molecule conjugates
WO1998055609A1 (en) 1997-06-06 1998-12-10 The Regents Of The University Of California Inhibitors of dna immunostimulatory sequence activity
US5955443A (en) * 1998-03-19 1999-09-21 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of PECAM-1
US6001651A (en) * 1998-03-20 1999-12-14 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of LFA-3
IL126919A0 (en) * 1998-11-05 1999-09-22 Univ Ben Gurion Antisense oligomer
AU765940B2 (en) * 1998-06-24 2003-10-02 Innogenetics N.V. Particles of HCV envelope proteins: use for vaccination
WO2001022972A2 (en) 1999-09-25 2001-04-05 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acids
AU2001257366B2 (en) 2000-05-01 2006-03-16 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
AT410173B (de) * 2000-06-08 2003-02-25 Cistem Biotechnologies Gmbh Antigene zusammensetzung
HU228264B1 (en) * 2000-06-08 2013-02-28 Intercell Ag Immunostimulatory oligodeoxynucleotides
AU2004224746B2 (en) * 2003-03-24 2009-04-23 Valneva Austria Gmbh Improved vaccines
US7951845B2 (en) * 2006-01-19 2011-05-31 The Regents Of The University Of Michigan Composition and method of treating hearing loss

Also Published As

Publication number Publication date
NO20025835L (no) 2002-12-04
TR200302015T4 (tr) 2004-01-21
RU2007103151A (ru) 2008-08-20
AU2001281812B2 (en) 2005-04-07
BR0111639A (pt) 2003-03-25
IL152959A (en) 2008-04-13
PT1296713E (pt) 2004-02-27
CN1309418C (zh) 2007-04-11
US8945591B2 (en) 2015-02-03
MXPA02012010A (es) 2005-04-22
HUP0301229A3 (en) 2010-01-28
BRPI0111639B8 (pt) 2021-05-25
IL152959A0 (en) 2003-06-24
KR20030032964A (ko) 2003-04-26
US20130183339A1 (en) 2013-07-18
CZ304195B6 (cs) 2013-12-27
HK1056678A1 (en) 2004-02-27
WO2001093905A1 (en) 2001-12-13
ES2206424T3 (es) 2004-05-16
DE60100814D1 (de) 2003-10-23
IS6627A (is) 2002-11-18
CA2411575C (en) 2015-04-07
BRPI0111639B1 (pt) 2017-04-11
CZ20024168A3 (cs) 2003-09-17
SK287689B6 (sk) 2011-06-06
IS1993B (is) 2005-03-15
KR100799788B1 (ko) 2008-01-31
US20150125488A1 (en) 2015-05-07
JP5908851B2 (ja) 2016-04-26
JP5271471B2 (ja) 2013-08-21
ATE249839T1 (de) 2003-10-15
PL358982A1 (pl) 2004-08-23
SK18152002A3 (sk) 2003-08-05
RU2413520C2 (ru) 2011-03-10
RU2293573C2 (ru) 2007-02-20
AU8181201A (en) 2001-12-17
NO329492B1 (no) 2010-11-01
CA2411575A1 (en) 2001-12-13
EP1296713B1 (en) 2003-09-17
DE60100814T2 (de) 2004-07-01
DK1296713T3 (da) 2004-01-26
US8568742B2 (en) 2013-10-29
HU228264B1 (en) 2013-02-28
CN1434723A (zh) 2003-08-06
US9492537B2 (en) 2016-11-15
HUP0301229A2 (hu) 2003-08-28
SI1296713T1 (en) 2004-02-29
US20030171321A1 (en) 2003-09-11
NO20025835D0 (no) 2002-12-04
EP1296713A1 (en) 2003-04-02
JP2013121962A (ja) 2013-06-20
JP2003535146A (ja) 2003-11-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9492537B2 (en) Methods and compositions involving immunostimulatory oligodeoxynucleotides
US7858588B2 (en) Immunostimulatory oligodeoxynucleic molecules
AU784403B2 (en) Pharmaceutical composition for immunomodulation and preparation of vaccines comprising an antigen and an immunogenic oligodeoxynucleotide and a polycationic polymer as adjuvants
AU2001281812A1 (en) Immunostimulatory oligodeoxynucleotides
ZA200209479B (en) Immunostimulatory oligodeoxynucleotides.
AU2002320762A1 (en) Immunostimulatory oligodeoxynucleic molecules

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification