ES2206440T3

ES2206440T3 - Una nueva citoquina.

Info

Publication number: ES2206440T3
Application number: ES91919165T
Authority: ES
Inventors: Ichiro c/o Sankyo Company Ltd. KAWASHIMA; Jun C/O Sankyo Company Ltd. Ohsumi; Kenji c/o Sankyo Company Ltd. MIYADAI; Yo c/o Sankyo Company Ltd. TAKIGUCHI
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1990-11-08
Filing date: 1991-11-07
Publication date: 2004-05-16
Anticipated expiration: 2011-11-07
Also published as: DE69133321T2; EP0556395B1; EP0556395A1; HK1017817A1; DK0556395T3; HU9301330D0; ATE250935T1; KR930702525A; EP0556395A4; HU217803B; JPH0592997A; JP2752819B2; CA2095840A1; WO1992008735A1; DE69133321D1; HUT66624A; KR0139095B1

Abstract

ADN COMPLEMENTARIO PREPARADO EXTRAYENDO ARN MENSAJERO DE LAS CELULAS INTERSTICIALES DE LA MEDULA OSEA HUMANA SE EXPRESO, TRAS SER CLONADO, CON LAS CELULAS DE UN MAMIFERO. UNA PROTEINA CON UNA ACTIVIDAD DE INHIBICION DE FORMACION DE ADIPOCITO SE SEPARO DEL CULTIVO CELULAR SUPERNATATIL CON DICHA ACTIVIDAD Y SE PURIFICO. SE OBSERVO QUE LA PROTEINA TENIA UN PESO MOLECULAR APARENTE DE ALREDEDOR DE 23.000 CONDUCIENDO UN ELECTROFORESIS SDS-PAGE BAJO UNA CONDICION REDUCTORA Y QUE TENIA UN RESIDUO DE PROLINA N TERMINAL CON RESULTADO DE IDENTIFICACION DE LA SECUENCIA DE AMINOACIDO N ESTRUCTURA PRIMARIA TOTAL DE LA PROTEINA SE DETERMINO POR EL HALLAZGO ANTERIOR Y EL RESULTADO DE LA CLONACION GENETICA DESCRITA ANTERIORMENTE REVELA QUE ES UNA CITOQUINA CON UNA ACTIVIDAD DE INHIBICION DE FORMACION DE ADIPOCITO Y UNA NUEVA ESTRUCTURA. DE ESTE MODO HA SIDO POSIBLE PRODUCIR UN NUEVO INHIBIDOR DE FORMACION DE ADIPOCITO EN GRANDES CANTIDADES POR LA TECNOLOGIA DE ADN RECOMBINADO ASI COMO DIAGNOSTICAR Y TRATARVARIAS CITOPENIAS Y OTRAS ENFERMEDADES.

Description

Una nueva citoquina.

Campo de la técnica

La presente invención trata de una única nueva proteína que es capaz de suprimir la diferenciación de las células en adipocitos, es capaz de eliminar la lipoprotein lipasa (LPL) en adipocitos y/o es capaz de producir factor de estimulación de colonia (CSF). La presente invención también trata del ADN que codifica dicha proteína, del vector de expresión de ADN recombinante que contiene dicho ADN, de una célula hospedadora que es transformada por dicho vector de expresión de ADN recombinante, y de una composición proteica que contiene una cantidad efectiva de dicha proteína.

Antecedentes de la técnica

Es de sobras conocido es necesaria que la existencia de células estromales de médula ósea que mantengan la hematopoyesis, además de células madre hematopoyéticas y diversos factores hematopoyéticos, o en otras palabras, un microentorno hematopoyético, para la hematopoyesis en un cuerpo vivo. En humanos, en el momento del nacimiento, la hematopoyesis tiene lugar de forma activa en la médula ósea de todo el cuerpo. Sin embargo, al crecer, cuando la hematopoyesis ya no es necesaria, la médula ósea es ocupada gradualmente por adipocitos, empezando por las extremidades de los miembros debido al crecimiento del espacio medular. La médula ósea en la que tiene lugar la hematopoyesis se conoce como médula roja, mientras que la médula ósea que ha sido reemplazada por adipocitos recibe el nombre de médula amarilla. Cuando la hematopoyesis se acelera debido a una hemorragia o hemólisis, la hematopoyesis se reanuda en la médula amarilla [Kashiwamura, M. (1988), "IGAKU NO AYUMI (Historia de la Medicina)", 146, 264-268].

Las células que tienen función hematopoyética en el microentorno hematopoyético son principalmente preadipocitos. Se sabe que, cuando estas células se diferencian en adipocitos, pierden esta función [Kodama, H. (1986), "SOSHIKI BAIYO (Cultivo de Tejidos)", 12, 191-195].

Por ejemplo, la línea celular de preadipocitos PA6 de tipo médula ósea de ratón es capaz de mantener la proliferación de células madre hematopoyéticas. Sin embargo, cuando estas células se diferencian en adipocitos, esta actividad disminuye [Kodama, H. et al. (1984), J. Cell. Physiol. 118, 233-240]. Se sabe que pueden inducirse células blásticas, megacariocitos y colonias de macrófagos cuando se cultivan conjuntamente células PA6 y células de médula ósea de ratón [Kodama, H. (1987), "JIKKEN IGAKU (Medicina Experimental)", 5, 826-830]. Así pues, la proteína capaz de suprimir la adipogénesis actúa en los preadipocitos y los adipocitos de la médula ósea para promover su capacidad hematopoyética, o, en otras palabras, para promover su capacidad para inducir leucocitos, macrófagos y plaquetas (originados en los megacariocitos).

Además, se ha informado que la cantidad de CSF producida en la línea celular H-1/A de preadipocitos, que se origina a partir de la médula ósea de ratón, se reduce cuando estas células se diferencian en adipocitos [Nakamura, M. et al. (1985), Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 179, 283-287].

Tal como se describirá más adelante, el factor inhibidor de la adipogénesis de la presente invención actúa sobre las células H-1/A para acelerar la producción de factor estimulador de la colonia de macrófagos (M-CSF). Además de la actividad estimuladora contra monocitos y macrófagos, el M-CSF también es capaz de actuar como potenciador de megacariocitos (Meg-POT) [Teramura, M. et al. (1990), Int. J. Cell Cloning, 8, 245-252]. El M-CSF también ha demostrado poseer la habilidad de actuar sobre monocitos para acelerar su producción de Meg-POT. Además, los datos provenientes de terapia clínica indican que el M-CSF promueve la recuperación de la neutropenia y trombocitopenia que sigue a la quimioterapia del cáncer [Motoyoshi, K. (1986), "GAN TO KAGAKURYOHO (Cáncer y Quimioterapia)", 16, 3531-3536].

Así pues, el factor inhibidor de la adipogénesis de la presente invención actúa sobre la médula ósea o los preadipocitos periféricos y los adipocitos para mejorar su capacidad para mantener la hematopoyesis.

Algunos ejemplos de proteínas, conocidas anteriormente a la presente invención y que suprimen la diferenciación de adipocitos y LPL en adipocitos, incluyen: factor de necrosis tumoral alfa (TNF- \alpha ) [Price, S.R. et al. (1986), Arch. Biochem. Biophys., 251, 738-746 y Kawakami, M. et al. (1987), J. Biochem., 101, 331-338]; interleuquina-1 (1L-1) [Beutler, B.A. y Cerami, A. (1985), J. Immunol., 135, 3969-3971]; interferones (IFN) [Keay, S. y Grossberg, S.E. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4099-4103, y Patton, J.S. et al. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 8313-8317]; y factor inhibidor de la leucemia (LIF) [Mori, M. et al. (1989), Biochem. Biophys. Res. Commun., 160, 1085-1092]. Los ADNcs de estos factores ya han sido clonados, y se han confirmado sus estructuras completas.

Además, aunque se publicó un informe con anterioridad a la fecha de prioridad de la presente invención describiendo el aislamiento y la expresión del ADNc del precursor de la interleuquina-11 de mono, junto con el descubrimiento de su actividad estimuladora del crecimiento del plasmacitoma y su actividad de formación de colonias de megacariocitos en el cultivo de la interleuquina-11 humana.

Los documentos US07/441,100 (abandonada) y US07/526,474 (publicada como US-A-5215895) revelan secuencias precursoras de interleuquina-11, pero ninguna de ellas revela la secuencia madura de IL-11.

Los presentes inventores han descubierto una única nueva proteína capaz principalmente de: suprimir la diferenciación de las células en adipocitos, eliminar la lipoprotein lipasa (LPL) en adipocitos; e inducir el factor estimulador de colonia (CSF) (factor inductor de CSF), y ha hecho posible obtener grandes cantidades de dicha proteína utilizando técnicas de manipulación genética.

Las diversas actividades comprenden: la supresión de la diferenciación morfológica de células de preadipocitos en adipocitos; la eliminación de lipoprotein lipasa (LPI) en adipocitos; y el mantenimiento y promoción de la capacidad de los preadipocitos para producir CSF, pueden, de forma individual o colectiva, recibir el nombre de "actividad inhibidora de la adipogénesis", y una proteína que tenga dicha actividad puede recibir el nombre de "factor inhibidor de la adipogénesis".

La presente invención permite la obtención de grandes cantidades de factor inhibidor de la adipogénesis. Así, el factor puede utilizarse con eficacia en el tratamiento y diagnosis de diversos tipos de anemias y otras enfermedades de la sangre. Por ejemplo, el factor puede aplicarse en anemia aplástica, leucopenia causada por toxinas o radiación, infecciones causadas por virus, bacterias y parásitos, citopenia que ocurre después de un transplante de médula ósea, y citopenia causada por quimioterapia con carcinostasia. Además, el factor puede permitir la conservación de los componentes de transfusiones sanguíneas tal como se llevan a cabo en la actualidad a gran escala. Lo que es más, además de estos efectos que mejoran la inmunocompetencia, el factor puede usarse también en la prevención de la obesidad mórbida o como una preparación terapéutica para la enfermedad.

"Citopenia", tal como se utiliza en la presente invención, pertenece a todas estas enfermedades, así como a diversas enfermedades inmunes secundarias. "Aliviador de la citopenia" se utiliza como nombre genérico de aquellos fármacos que son eficaces en la prevención y el tratamiento de la citopenia.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona una proteína que no incluye ninguna otra proteína de origen humano, y que tiene la secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos con números del 1 al 178 de los indicados en el identificador de secuencia (ID SEQ). Nº. 2 del listado de secuencias, o en la cual uno o más de los residuos de aminoácido han sido eliminados en uno o más sitios de dicha proteína, o en la cual uno de los residuos de aminoácido ha sido sustituido en uno de los sitios de dicha proteína, siendo la proteína de 178 mer o una parte de los mismos, donde la proteína o una de sus partes posee actividad inhibidora de la adipogénesis.

Más preferiblemente, la presente invención proporciona una proteína que no incluye ninguna otra proteína de origen humano, consiste en la secuencia de aminoácidos 1-178 del ID SEQ NO: 2 del listado de secuencias y posee actividad inhibidora de la adipogénesis.

La presente invención proporciona además el ADN que codifica las proteínas, especialmente la proteína preferida de la invención. Además, se proporciona el ADN que codifica las proteínas, que consiste en la secuencia de nucleótidos 81 a 614 del ID SEQ NO: 1 del listado de secuencias.

La presente invención proporciona además un vector de expresión de ADN recombinante que contiene el ADN definido anteriormente, donde el ADN puede ser expresado y replicado, y proporciona además una célula hospedadora transformada por tal vector.

La presente invención proporciona además un proceso para la producción de una proteína, que comprende: el cultivo de una célula hospedadora transformada por un vector tal como se ha definido anteriormente, y la recuperación de la proteína del extracto celular o de la solución de cultivo.

También se proporciona una composición farmacéutica que contiene una cantidad efectiva terapéuticamente de la proteína de la presente invención, junto con un vehículo o transportador aceptable farmacéuticamente.

Se prefiere particularmente un aliviador de la citopenia que contenga una cantidad efectiva terapéuticamente de la proteína de la presente invención, junto con un vehículo o transportador aceptable farmacéuticamente.

También se prefiere una preparación anti-obesidad que contenga una cantidad efectiva terapéuticamente de la proteína de la presente invención, junto con un vehículo o transportador aceptable farmacéuticamente.

La presente invención, además, proporciona la utilización de una proteína tal como se ha definido anteriormente en la preparación de un medicamento para la citopenia y/o la obesidad.

Tal como se ha descrito anteriormente, la secuencia de aminoácidos N terminal de las proteínas de la presente invención es los aminoácidos 1-10 del ID SEQ NO: 2, es decir (N)- Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val.

La secuencia de aminoácidos (aminoácidos 1 - 178 del ID SEQ NO: 2) a la cual se ha hecho referencia anteriormente es como sigue:

1

La secuencia de nucleótidos (81 a 614 del ID SEQ NO: 1) a la cual se ha hecho referencia anteriormente es como sigue:

2

El ADN de la presente invención se obtiene, por ejemplo, preparando el ARNm que codifica la proteína que posee actividad inhibidora de la adipogénesis, a partir de células de mamífero que tienen la capacidad de producir la proteína, seguido de la transcripción inversa del ARNm al ADNc de doble torcido mediante métodos conocidos. Se prefiere la línea celular KM-102 de médula ósea humana de origen estromal [Harigaya, K. y Handa, H. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 3477-3480] como fuente de ARNm de células animales, pero también pueden utilizarse otras líneas de células tumorales y células y tejido que pueda ser aislado de mamíferos, u otras líneas celulares consolidadas.

Se pueden emplear el método del fenol caliente tiocianato de guanidina y el método de tiocianato de guanidina- ácido clorhídrico de guanidina para la extracción de ARNm, pero se prefiere el método de cloruro de cesio de tiocianato de guanidina.

La mayoría del ARNm presente en el citoplasma de células eucariotas tiene una cola de poli-A en el extremo 3' terminal, de tal manera que el ARNm puede ser adsorbido en una columna de celulosa oligo(dT) para aprovechar esta característica, y el ARNm puede purificarse entonces por elución. Este ARNm puede fraccionarse adicionalmente mediante métodos como la centrifugación por gradiente de densidad de sucrosa.

\newpage

Para confirmar que la proteína codificada por el ARNm obtenido anteriormente tiene actividad inhibidora de la adipogénesis, puede traducirse este ARNm. Puede ensayarse entonces la actividad fisiológica de la proteína resultante, o bien identificarse utilizando un anticuerpo específico para la proteína. La traducción en la proteína puede llevarse a cabo, por ejemplo, inyectando ARNm en oocitos de rana arborícola africana (Xenopus laevis) [Gurdon, J.B. et al. (1972), Nature, 233, 177-182]. Otros sistemas de traducción incluyen el sistema lisado de reticulocitos de conejo o un sistema de extracto de germen de trigo [Schleif, R.F. y Wensink, P.C. (1981), "Practical Methods en Molecular Biology", Springer-Verlag, NY].

La actividad inhibidora de la adipogénesis puede ensayarse midiendo la capacidad de la proteína de suprimir la diferenciación de preadipocitos en adipocitos utilizando, por ejemplo, la línea celular de ratón 3T3-L1, o midiendo la actividad LPL [Beutler, B.A. et al. (1985), J. Immunol., 135, 3972-3977].

Se puede sintetizar ADNc de torcido simple a partir del ARNm obtenido de esta manera mediante una transcriptasa inversa, y el ADNc de doble torcido puede sintetizarse entonces utilizando el ADNc de torcido simple como molde. Entre los métodos apropiados que pueden utilizarse en esta síntesis incluyen el método de la nucleasa S1 [Efstratiadis, A. et al. (1976), Cell, 7, 279-288], el método Land [Land, H. et al. (1981), Nucleic Acids Res., 9, 2251-2266], y el método O. Joon Yoo [Yoo, O.J. et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1049-1053]. Sin embargo, para el propósito de esta invención, el método preferido es el de Okayama-Berg [Okayama, H. y Berg, P. (1982), Mol. Cell. Biol., 2, 161-170].

Los plásmidos recombinantes resultantes pueden introducirse entonces en Escherichia coli, por ejemplo en la cepa DH5 \alpha, para obtener un hospedador transformado. Los recombinantes deseados pueden seleccionarse utilizando la resistencia a la tetraciclina o la resistencia a la ampicilina como índice. Por ejemplo, en el caso en el que la célula hospedadora es Escherichia coli, la transformación de la célula hospedadora puede realizarse utilizando el método de Hanahan [Hanahan, D. (1983), J. Mol. Biol., 166, 557-580]. Más específicamente, la transformación puede llevarse a cabo mediante la introducción de ADN recombinante en células aceptables preparadas con CaCl_{2}, MgCl_{2} o RbCl. A propósito, los fagos lambda, por ejemplo, pueden utilizarse también como vectores, en lugar de los plásmidos.

Los diversos métodos descritos a continuación pueden emplearse para la selección de una cepa que posea ADN que codifique el factor inhibidor de la adipogénesis deseado a partir del hospedador transformado.

(1) Método de exploración utilizando una sonda de oligonucleótido sintética

Se puede sintetizar una sonda de oligonucleótido cuando la secuencia de aminoácidos de la proteína deseada ha sido elucidada, bien en su totalidad o bien en parte (que puede corresponder a cualquier región de la proteína deseada si la secuencia consiste en una multitud de secuencias específicas continuas), que codifique una parte de la secuencia conocida. La secuencia de nucleótidos puede diseñarse en base a la frecuencia de uso de codones, o bien pueden sintetizarse una multitud de sondas cada una de las cuales tiene una secuencia distinta que codifica la misma secuencia de aminoácidos. En este último caso, el número de secuencias puede minimizarse mediante la incorporación de inosina en la secuencia.

El oligonucleótido resultante puede utilizarse entonces como sonda (marcado con ^{32}P o ^{35}S) para hibridizarse con el ADN desnaturalizado de la cepa transformada, después de que el ADN haya sido inmobilizado en un filtro de nitrocelulosa, seguido por la exploración y selección de la cepa positiva resultante.

(2) Exploración utilizando una sonda preparada mediante reacción en cadena de la polimerasa

En el caso que la secuencia de aminoácidos de la proteína objetivo haya sido total o parcialmente elucidada, pueden sintetizarse los oligonucleótidos de los torcidos sentido y anti-sentido, que corresponden a una porción de la secuencia de aminoácidos. Se puede llevar a cabo una reacción en cadena de la polimerasa [Saiki, R.K. et al. (1988), Science, 239, 487-491] utilizando estos oligonucleótidos para amplificar el fragmento de ADN que codifica el factor inhibidor de la adipogénesis deseado. El ADNc sintetizado a partir del ADN genómico o por transcripción inversa a partir del ARNm de las células que producen el factor inhibidor de la adipogénesis, pueden utilizarse como ADN molde en este proceso. Después del marcado del fragmento de ADN preparado de esta manera con ^{32}P o ^{35}S, se selecciona el clon deseado llevando a cabo una hibridación en colonia o una hibridación en placa utilizando el fragmento de ADN marcado como sonda.

(3) Exploración por producción de factor inhibidor de la adipogénesis mediante la utilización de otras células animales

Las cepas que tienen el ADNc que codifica el factor inhibidor de la adipogénesis deseado pueden seleccionarse de las cepas celulares transformadas originales mediante el cultivo de la cepa transformada, amplificando el gen, transfectando el gen en células animales (en este caso, bien un plásmido auto-replicante que contenga una región promotora de la transcripción o un plásmido que pueda integrarse en un cromosoma de una célula animal), expresando la proteína codificada por el gen y, midiendo la actividad inhibidora de la adipogénesis del sobrenadante del cultivo o del extracto celular, o bien detectando el factor inhibidor de la adipogénesis utilizando un anticuerpo para el factor.

(4) Selección utilizando un anticuerpo para el factor inhibidor de la adipogénesis

La cepa deseada se selecciona insertando con anterioridad ADNc en un vector de expresión, produciendo la proteína en el transformante, y detectando el transformante que produce el factor inhibidor de la adipogénesis deseado utilizando un anticuerpo para el factor inhibidor de la adipogénesis y un anticuerpo secundario para el anticuerpo.

(5) Utilización de un sistema de traducción de hibridación selectivo

En este método, el ARNm proveniente de las células que producen el factor inhibidor de la adipogénesis se hibridiza a ADNc obtenido a partir del transformante, habiéndose absorbido el ADNc en un filtro de nitrocelulosa o similar. Subsiguientemente, el ARNm unido se disocia y se recupera. El ARNm recuperado se inyecta entonces en un sistema de traducción de proteína, como oocitos de rana arborícola africana, o se traduce en una proteína utilizando un sistema libre de células, como lisado de reticulocito de conejo o extracto de germen de trigo, para examinar la actividad inhibidora de la adipogénesis de la proteína o para detectar el factor inhibidor de la adipogénesis utilizando un anticuerpo para el factor.

Tal como se describe en los siguientes Ejemplos, el transformante deseado puede seleccionarse también aplicando el método anterior (3) para los transformantes positivos seleccionados, después de que se haya llevado a cabo una exploración primaria utilizando una sonda de oligonucleótido sintética diseñada usando como referencia el motivo AUUUA [Shaw, G. y Kamen, R. (1986), Cell, 46, 659-667] presente en los ARNms de citoquinas, antes de aplicar los métodos anteriores. Más específicamente, el factor inhibidor de la adipogénesis puede producirse en otras células animales, seguido de exploración.

El ADN que codifica el factor inhibidor de la adipogénesis puede obtenerse a partir del transformante de interés así obtenido de acuerdo con técnicas conocidas [c.f. Maniatis, T. et al. (1982), "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY]. Por ejemplo, ADN plásmido puede aislarse a partir de las células, seguido de aislamiento del ADNc a partir de ADN plásmido.

La secuencia de ADN obtenida de esta manera puede determinarse, por ejemplo, de acuerdo con el método de modificación química Maxam - Gilbert [Maxam, A.M. y Gilbert, W. (1980), "Methods en Enzymology", 65, 499-559], o mediante el método de terminación de cadena de dideoxinucleotido utilizando el fago M13 [Messing, J. y Vieira, J. (1982), Gene, 19, 269-276].

El fragmento resultante que contiene el gen que codifica el factor inhibidor de la adipogénesis puede clonarse entonces una vez más en un vector de ADN apropiado, de tal manera que sea capaz de transformar las células hospedadoras de otros procariotas o eucariotas. Además, mediante la introducción de un promotor y secuencia apropiados implicados con la expresión génica en estos vectores, el gen puede expresarse el las células hospedadoras respectivas.

Algunos ejemplos de células hospedadoras eucariotas incluyen, por ejemplo, Escherichia coli y Bacillus subtilis. Para llevar a cabo la expresión del gen de interés en estas células hospedadoras, las célula hospedadoras pueden transformarse con un replicón derivado a partir de una especie compatible con el hospedador o, en otras palabras, con un vector plásmido que contenga un punto de origen de replicación y secuencias reguladoras. Además, es deseable que el vector tenga una secuencia capaz de proporcionar células transformadas con un carácter de expresión seleccionable (fenotipo).

Por ejemplo, la cepa K12 de E.coli se utiliza con frecuencia para el hospedador, mientras que los plásmidos pBR322 y pUC se utilizan comúnmente para el vector. Sin embargo, la presente invención no se haya restringida a la utilización de éstos, y puede utilizarse cualquiera de los tipos conocidos de cepas bacterianas y vectores. Algunos ejemplos de promotores incluyen promotores de triptofano (trp), lactosa (lac), triptofano-lactosa (tac), lipoproteina (lpp), bacteriofago-originado lambda (\lambda) P_{L} y factor extensor de cadenas polipeptídicas Tu (tufB) en Escherichia coli. Cualquiera de estos promotores puede utilizarse en la producción del factor inhibidor de la adipogénesis de la presente invención.

Si se utiliza Bacillus subtilis para la célula hospedadora, la cepa preferida es la 207-25, y la pTUB228 (Ohmura, K. et al. (1984), J. Biochem., 95, 87-93) y de la misma manera se utilizan para el vector. Sin embargo, la presente invención no se haya limitada a éstos. La secuencia reguladora del gen \alpha-amilasa de Bacillus subtilis se utiliza con frecuencia para el promotor. La secreción al exterior de la bacteria puede conseguirse también utilizando una secuencia de ADN que codifique la secuencia del péptido señal de la \alpha-amilasa, si se considera necesario.

Las células hospedadoras eucariotas incluyen las células de vertebrados, insectos y levaduras. Mientras que las células COS, que derivan de células de mono [Gluzman, Y. (1981), Cell, 23, 175-182] y la cepa deficiente de dihidrofolato reductasa de las células de ovario de hámster chino (CHO) [Urlaub, G. y Chasin, L.A. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220], etc. se utilizan con frecuencia cuando se desean utilizar células de vertebrados, la presente invención no se limita a ellas.

Los vectores que tienen un promotor situado secuencia arriba respecto al gen a ser expresado, un sitio de empalme de ARN, un sitio de poliadenilación o una secuencia de terminación de la transcripción, etc. se pueden utilizar para el vector de expresión de la célula de vertebrado. Tales vectores pueden tener también un origen de replicación, si se considera necesario. El vector de expresión se ejemplifica con el vector pSV2dhfr, que tiene un promotor temprano SV40 [Subramani, S. et al. (1981), Mol. Cell. Biol., 1, 854-864]. Sin embargo, la presente invención no está limitada a dicho vector de expresión.

Típicamente se utiliza una levadura como hospedador eucariota. Se prefieren en particular los Saccharomyces, como Saccharomyces cerevisiae. Los vectores de expresión para los microorganismos eucariota, como la levadura, utilizan preferiblemente, por ejemplo, el promotor del gen de la alcohol deshidrogenasa [Bennetzen, J.L. y Hall, B.D. (1982), J. Biol. Chem., 257, 3018-3025] o el promotor del gen de la fosfatasa ácida [Miyanohara, A. et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 1-5].

Las células COS son un ejemplo apropiado de células hospedadoras. Un vector apropiado para las células COS es replicable de forma autónoma en células COS, y tiene un origen de replicación SV40, un promotor de la transcripción, una señal de terminación de la transcripción y un sitio de empalme de ARN. La transformación de las células COS por el vector puede alcanzarse utilizando el método DEAE-dextrano [Luthman, H. y Magnusson, G. (1983), Nucleic Acids Res., 11, 1295-1308], el método de coprecipitación de fosfato de calcio-ADN [Graham, F.L. y van der Ed, A.J. (1973), Virology, 52, 456-457], o el método de electroporación [Neumann, E. et al. (1982), EMBO J., 1, 841-845].

Si se utilizan células CHO, pueden obtenerse células transformadas que producen de forma estable el factor inhibidor de la adipogénesis mediante co-transfección del vector de expresión juntamente con el vector seleccionable capaz de expresar un neo gen que funcione como un marcador de resistencia G418, como el pRSVneo [Sambrook, J. et al. (1989), "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY] o el pSV2-neo [Southern, P.J. y Berg. P (1982), J. Mol. Appl. Genet., 1, 327-341], seguido de selección de colonias resistentes G418.

El transformante deseado obtenido de esta manera puede cultivarse mediante métodos convencionales, y el factor inhibidor de la adipogénesis puede producirse tanto dentro como fuera de las células. El medio de cultivo utilizado puede seleccionarse de forma apropiada de entre los diversos tipos utilizados normalmente, según la célula hospedadora que se utilice. Algunos ejemplos de medio para células COS incluyen el medio RPMI-1640 y el medio esencial mínimo Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) al cual se ha añadido, si se considera necesario, un componente de sérum, como sérum fetal bovino.

Así pues, el factor inhibidor de la adipogénesis producido bien dentro o fuera de las células del transformante puede aislarse y purificarse mediante diversos tipos de procesos de aislamiento conocidos, aprovechando las propiedades físicas y las propiedades químicas, etc. del factor inhibidor de la adipogénesis. Algunos ejemplos de realización prácticos de los métodos incluyen el tratamiento con precipitantes de proteína ordinarios, ultrafiltración, diversos tipos de cromatografía líquida como la cromatografía de tamiz molecular (filtración de gel), cromatografía de adsorción, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad y cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC), diálisis o una combinación de estos métodos.

De acuerdo con los métodos anteriores, el factor inhibidor de la adipogénesis deseado puede fabricarse con facilidad a escala industrial, tanto con alto rendimiento como con alta pureza. Las diversas propiedades físicas del factor inhibidor de la adipogénesis recombinante de la presente invención obtenido de esta forma se describen en detalle en los siguientes Ejemplos.

El factor inhibidor de la adipogénesis es útil en diversos campos (descritos anteriormente) debido a sus actividades biológicas.

La proteína que posee actividad inhibidora de la adipogénesis consiste en 178 aminoácidos que tienen Pro (aminoácido número 1 de la secuencia de aminoácidos indicada en la secuencia número 2 del listado de secuencias) en sus extremos N- terminal, o, en otras palabras, esta proteína se considera que es un factor inhibidor de la adipogénesis madura. Esta proteína tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 23,000 en un ensayo de electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida bajo condiciones reductoras.

Además, el ADN que codifica el factor inhibidor de la adipogénesis madura también sirve como ADN de la presente invención. Más preferiblemente, el ADN es el ADN que consiste en los nucleótidos número 81 a 614 de la secuencia nucleotídica número 1 del listado de secuencias.

En general, se considera que los genes de eucariotas muestran polimorfismo, como se sabe que ocurre en el caso del gen del interferon [c.f. Nishi, T. et al. (1985), J. Biochem., 97, 153-159]. Cuando como resultado de este polimorfismo se hayan sustituido uno o más nucleótidos, en ocasiones es posible que de los varios aminoácidos, todos permanezcan iguales, a pesar del cambio en la secuencia nucleotídica.

Las proteínas que corresponden al factor inhibidor de la adipogénesis madura (aminoácidos número +1 al +178 de la secuencia de aminoácidos indicada en la secuencia número 2), y en las cuales uno o más residuos de aminoácido han sido eliminados, en al menos un sitio, o en las cuales uno de los residuos de aminoácido ha sido sustituido en uno de los sitios de dicha proteína, también puede poseer la actividad del factor inhibidor de la adipogénesis. Aquí se hará referencia a estas proteínas como equivalentes del factor inhibidor de la adipogénesis.

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Por ejemplo, se sabe que el codón de cisteína del gen de la interleuquina 2 (IL-2) puede cambiarse por un codón de serina, y que la proteína resultante mantiene su actividad IL-2 [Wang, A. et al. (1984), Science, 224, 1431-1433]. Por esta razón, todas las proteínas, bien de origen natural o sintético, y que todavía poseen actividad inhibidora de la adipogénesis, se incluyen en la presente invención.

Además, el ADN que codifica estas proteínas también está incluido en la presente invención.

Los diversos tipos de ADN de la presente invención pueden sintetizarse químicamente mediante métodos convencionales, como el método fosfito-triéster [Hunkapiller, M. et al. (1984), Nature, 310, 105-111], en base a los datos de la secuencia del factor inhibidor de la adipogénesis.

Se conocen diversos codones para los aminoácidos deseados. Los codones apropiados pueden seleccionarse de forma arbitraria, o pueden determinarse de acuerdo con los métodos utilizados comúnmente [viz., Grantham, R. et al. (1981), Nucleic Acids Res., 9, r43-r74] teniendo en cuenta, por ejemplo, la frecuencia de la utilización de codones en el hospedador que se usa. La alteración parcial de los codones de estas secuencias nucleotídicas puede llevarse a cabo mediante métodos convencionales, como mutagénesis dirigida [Mark, D.F. et al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666], utilizando un cebador de oligonucleótido sintético que codifique la mutación deseada.

El factor inhibidor de la adipogénesis de la presente invención puede administrarse sólo, o bien de forma conjunta con otros fármacos terapéuticos, para el tratamiento de la anemia aplástica, leucopenia causada por toxinas o radiación, infecciones causadas por virus, bacterias y parásitos, citopenia que ocurre después de un transplante de médula ósea, y pancitopenia refractaria y otros desórdenes inmunológicos adicionales. El factor inhibidor de la adipogénesis puede utilizarse también sólo o bien en combinación con otros fármacos terapéuticos en la prevención y el tratamiento de la obesidad patológica.

El aliviador de la citopenia y/o las composiciones anti-obesidad de la presente invención comprenden una mezcla de transportadores médicamente aceptables y una cantidad efectiva terapéuticamente del factor inhibidor de la adipogénesis. La composición puede administrarse en diversas formas, por ejemplo, tabletas, cápsulas, gránulos, polvos o jarabe para la administración oral; e inyecciones, goteo intravenoso o supositorios para la administración parenteral.

Cuando la ruta de administración es mediante inyección o goteo intravenoso, la composición terapéutica de la presente invención está en la forma de una solución acuosa no pirogénica y aceptable parenteralmente. La preparación de una solución proteica aceptable parenteralmente, que tenga en consideración el pH, la isotonicidad y estabilidad, está dentro del alcance de los conocimientos sobre esta tecnología para aquellos con experiencia en la técnica.

La dosificación y forma de administración en el tratamiento de las condiciones anteriores pueden ser determinadas por un médico, tomando en consideración factores que tengan efecto en la acción de la preparación, como la condición del paciente, el peso corporal, el sexo, la edad, la dieta, la importancia de otras infecciones, el tiempo de administración y otros factores clínicos significativos. Normalmente, para la administración oral, pueden administrarse alrededor de entre 0,01 a 1.000 mg por día a un adulto, bien de una vez o en diversas dosis. Para la administración no oral, pueden inyectarse alrededor de entre 0,01 a 100 mg en una vez, de forma subcutánea, intramuscular o intravenosa.

La composición de aliviador de la citopenia de la presente invención puede utilizarse en combinación con otros factores hematopoyéticos, como IL-1 - IL-10, LIF, factor de célula madre, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, Meg-CSF, TNF, IFN y eritropoyetina. Mientras que pueden mezclarse otros factores hematopoyéticos como uno de los componentes de la composición de aliviador de la citopenia de la presente invención, también pueden administrarse a los pacientes como una composición separada. Además, la utilización de composiciones de la presente invención puede mejorar la actividad o el efecto del tratamiento de otros factores hematopoyéticos.

La composición antiobesidad de la presente invención puede utilizarse en combinación con otros fármacos antiobesidad apropiados, como anorécticos, inhibidores de la absorción intestinal, inhibidores de las enzimas digestivas, preparaciones de hormonas de aceleración metabólica, inhibidores de la síntesis de grasas e inhibidores de la secreción de insulina. Además, puede utilizarse en combinación con terapia alimentaria y terapia de ejercicio. En tales casos. la utilización de la composición antiobesidad puede promover la actividad o el efecto del tratamiento de otros fármacos antiobesidad, así como el efecto del tratamiento de otras terapias antiobesidad.

Ya que los mejoradores de la citopenia o las preparaciones antiobesidad de la presente invención son de origen biológico, o se derivan de recombinantes genéticos, tienen niveles de toxicidad bajos. Las proteínas de la presente invención se administraron, per os, a ratones macho adultos de la cepa ddY (que tenían un peso corporal de unos 20g) a unos niveles de 500 mg/kg o inferiores durante 5 días. Ninguna de las proteínas de la presente invención mostró toxicidad.

En los Ejemplos que siguen, se hace referencia a los dibujos que se adjuntan, en los cuales:

La Fig. 1 es el mapa de la enzima de restricción del ADNc que codifica el factor inhibidor de la adipogénesis, en el cual ORF representa el marco de lectura abierto;

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La Fig. 2 muestra, de forma esquemática, la construcción de un plásmido que expresa el factor inhibidor de la adipogénesis de acuerdo con el Ejemplo 6 que se adjunta; y

La Fig. 3 muestra un cromatograma SDS-PAGE y una transferencia de Western que utiliza un anticuerpo antipéptido bajo condiciones reductoras para el total de proteína contenido en el sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectado con pcDL-SR \alpha-296 y pSR \alpha-20-2.

La presente invención se describirá a continuación más específicamente mediante Ejemplos no limitativos, un Ejemplo de Referencia y un Ejemplo de Preparación. Los métodos empleados para la medición de las diversas actividades del factor inhibidor de la adipogénesis se describirán en el Ejemplo de Referencia adjunto.

Ejemplo de referencia

Inhibición de la adipogénesis

La actividad inhibidora de la adipogénesis se ensayó de la siguiente forma. Las células utilizadas en la medición fueron de la línea celular 3T3-L1 de fibroblasto de embrión de ratón [Green, H. y Kehinde, O. (1974), Cell 1, 113-116], adquiridas de la American Cell Type Culture Collection (ATCC). El cultivo celular se llevó a cabo utilizando medio A (DMEM 4,5 g/l de glucosa, fabricado por Gibco) que contenía FBS 10% inmobilizado (fabricado por Hyclone) y HEPES 10 mM (pH 7.2, fabricado por Sigma)), a 37ºC en presencia de una mezcla gaseosa humidificada de CO_{2} 10% y aire 90%. La inducción de la diferenciación de las células en adipocitos se llevó a cabo de acuerdo con el método descrito por Rubin [Rubin, C.S. et al. (1978), J. Biol. Chem., 253, 7570-7578].

Ensayo de la actividad supresora sobre la diferenciación de células 3T3-L1 en adipocitos

Las células 3T3-L1 se cultivaron mediante la suspensión de las células en medio A (definido anteriormente) a una densidad de 1,0 x 10^{4} células/ml. Se pipetearon 0,5 ml de la suspensión celular en cada uno de los pocillos de una placa multicluster de 48 pocillos (Costar). Después de 3 días, las células se volvieron confluyentes. El medio se reemplazó entonces con medio A nuevo y, después de continuar el cultivo durante otros 2 días adicionales, el medio se reemplazó con medio B [DMEM (4,5 g/l de glucosa) que contiene HEPES 10 mM (pH 7,2), FBS 3% no activado, 5 \mug/ml de insulina bovina (Sigma), 8 \mug/ml de d-biotina (Sigma), 4 \mug/ml de ácido pantoténico (Sigma), dexametasona 1,0 \muM (Sigma) e isobutilmetilxantina 0,5 mM (Aldrich)], para inducir la diferenciación adipogénica. Entonces se añadió la muestra del factor inhibidor de la adipogénesis. Posteriormente, el medio se reemplazó con medio B nuevo cada 2 días, y se añadió muestra de nuevo. En el cuarto-séptimo día después de que se añadieran por primera vez el medio B y la muestra, el medio se reemplazó con medio C [DMEM (que contiene 4,5 g/l de glucosa) que contiene FBS 5% inmobilizado, HEPES 10 mM (pH 7,2) y 100 ng/ml de insulina bovina] para mantener los adipocitos.

Después de continuar el cultivo durante 2 días en el medio C, las células se fijaron con formaldehído 5%. Las gotas de grasa que se habían acumulado en las células y en los núcleos celulares se tiñeron con rojo-O al aceite y hematoxilina, respectivamente. Después de que se tomaran las microfotografías, se contaron el número de células en las cuales se habían acumulado gotas de grasa teñidas de rojo, determinadas a partir de las fotografías, así como el número de células nucleadas teñidas con hematoxilina. La razón de diferenciación adipogénica se calculó entonces utilizando la fórmula que se muestra a continuación.

Razón \ de \ diferenciación \ adipogénica \ (%) = 100 \ x \ \frac{No \ de \ células \ que \ contienen \ gotas \ de \ grasa}{No \ de \ células \ nucleadas}

La fijación celular, la tinción con rojo-O al aceite y la tinción con hematoxilina se llevaron a cabo de acuerdo con el manual experimental "Mitomo, Y. y Takayama S., "RINSHOKENSAKOZA (Seminario de Pruebas Clínicas)", Vol. 12, "Pathology" (1982), Ishiyaku Publishing".

Ensayo de la actividad supresora LPL

El ensayo se llevó a cabo de acuerdo, de forma sustancial, con el método descrito por Beutler [Beutler, B.A. et al. (1985), J. Immunol., 135, 3972-3977]. Los adipocitos 3T3-L1 transformados en células de grasa se prepararon utilizando el método descrito anteriormente (Ensayo de la Actividad Supresora sobre la Diferenciación de Células 3T3-L1 en Adipocitos), con la excepción de que no se añadió muestra cuando se indujo la diferenciación en adipocitos. El medio se reemplazó entonces con medio nuevo C, y se añadió muestra. Después de continuar el cultivo durante 18 horas, se eliminó el medio y las células se lavaron dos veces con PBS(-) (salino con tampón de fosfato, Nissui Seiyaku). A continuación, se añadió a cada pocillo 300 \mul de medio D (DMEM (4,5 g/l glucosa) conteniendo FBS inmobilizado 5%, HEPES 10 mM (pH 7,2), 100 ng/ml de insulina bovina y heparina sódica 10 U/ml (Nobo Industries)). Después de continuar el cultivo durante 1 hora, se recogieron 100 \mul del sobrenadante del cultivo y se utilizaron para la medición de la actividad LPL. La medición de la actividad supresora de LPL se realizó tres veces para cada muestra, y se calculó el promedio de los tres valores medidos.

La medición de la actividad LPL se realizó de acuerdo con el método de Nilsson-Ehle y Schotz [Nilsson-Ehle, P. y Schotz, M.C. (1976), J. Lipid Res., 17, 536-541]. Se mezclaron 100 l de sobrenadante del cultivo, preparado tal como se ha descrito anteriormente, con un volumen igual de solución de sustrato (ácido glicerol-tri[9,10(n)-^{3}H]oleico 13 \muM (51,8 KBeq/ \mumol, Amersham, preparado tal como se describe a continuación), 1,3 mg/ml de L-\alpha distearoil fosfatidilcolina (Sigma), 20 mg/ml de albúmina de sérum bovina (Sigma), Tris-hidrocloruro 135 mM (Tris-HCl, pH 8,1, Sigma), glicerol 16,5% (v/v) y FBS inmobilizado 16,5% (v/v)), y se dejó reaccionar a 37ºC durante 120 minutos. La reacción se detuvo mediante la adición de 1,05 ml de tampón carbonato de potasio-ácido bórico 0,1 M (pH 10,5) y 3,25 ml de metanol : cloroformo : heptano = 141 : 125 : 100 (v/v). Después de una agitación vigorosa, la mezcla de reacción se centrifugó a 3.000 x g durante 15 minutos. El contaje de ^{3}H de la capa agua-metanol se realizó utilizando un contador de centelleo líquido. Se definió 1 unidad de actividad LPL como la cantidad de actividad que produce 1 \mumol de ácido graso en 1 minuto. El ácido glicerol-tri[9,10(n)-^{3}H]oleico (utilizado en la solución de sustrato) se preparó diluyendo ácido glicerol-tri[9,10(n)-^{3}H]oleico (Amersham, 37,0 GBeq/mol) con trioleina (Sigma), seguido de purificación por cromatografía de columna de gel de sílice.

Ejemplo 1 Aislamiento de poli(A) ^{+}RNA a partir de células KM-102

Las células KM-102 se cultivaron en 36 placas de cultivo de plástico (15 cm de diámetro) con medio esencial mínimo modificado por Iscove (fabricado por Boehringer-Mannheim) que contiene FBS 10%. Después de que las células se hubiesen dejado crecer hasta la confluencia, se añadieron forbol miristato acetato (PMA) e ionoforo de calcio A23187 hasta alcanzar unas concentraciones de 10 ng/ml y 0,2 \muM, respectivamente. Se continuó el cultivo, y entonces se indujo lisis en las células de 12 placas a la vez con solución de guanidina-tiocianato [guanidina tiocianato 4M, sarcosil 1%, ácido etilendiamintetraacético (EDTA) 20 mM, citrato de sodio 25 mM (pH 7,0), 2-mercaptoetanol 100 mM y antiespuma A 0,1%] después de 3, 6 y 14 horas, respectivamente, y se recuperó la solución.

El aislamiento de poli(A)^{+}-ARN se llevó a cabo esencialmente tal como se describe en "Molecular Cloning - A Laboratory Manual" [Maniatis, T. et al. (1982), pp. 196-198]. Más específicamente, el aislamiento se llevó a cabo tal como se describe a continuación.

Las soluciones celulares sometidas a lisis recuperadas se recogieron repetidamente y se descargaron utilizando jeringas de 10 ml equipadas con agujas 21G. Cada uno de los tubos centrífugos polialomar compatibles con el cubo rotor RPS-40T fabricado por Hitachi Koki contenía 3 ml de CsCl 5,7 M - EDTA 0,1 M (pH 7,5), y las soluciones celulares sometidas a lisis se añadieron sobre la solución añadida previamente hasta que se llenaron los tubos. Después que estas soluciones se hubieron centrifugado durante 18 horas a 20ºC y 30.000 rpm, los gránulos resultantes se disolvieron en 400 \mul de agua destilada, seguido de precipitación con etanol. Los gránulos resultantes se redisolvieron en 400 \mul de agua destilada, y se le añadió un volumen igual de cloroformo : 1-butanol (4 : 1), seguido de agitación. La capa acuosa se recuperó entonces mediante separación por centrifugación. Después de que la capa acuosa se hiciera precipitar con etanol, los gránulos precipitados se disolvieron en 600 \mul de agua destilada para obtener el ARN total. Se obtuvieron alrededor de 4,5 mg de ARN total de cada muestra después de 3, 6 y 14 horas de estimulación con PMA-A23187.

Se mezclaron 600 \mug de los tres lotes de ARN total obtenidos anteriormente, y la mezcla se sometió a cromatografía en columna de oligo (dT) celulosa para purificar el poli(A)^{+}-ARN. Más específicamente, después de la disolución de ARN total en tampón de adsorción [NaCl 0.5 M, Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), 1 mM EDTA y sulfato de dodecil sodio (SDS)0,1%] y calentamiento a 65ºC durante 5 minutos, la solución resultante se aplicó a una columna de oligo(dT) celulosa (Pharmacia, Tipo 7) rellenada con la misma solución. El poli(A)^{+}-RNA se recuperó mediante elución con un eluyente [Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM y SDS 0,05%] para obtener 100 \mug de poli(A)^{+}ARN.

Ejemplo 2 Preparación de una librería de ADNc

Se llevó a cabo la preparación de una librería de ADNc de acuerdo con el método de Okayama-Berg. Más específicamente, se dejaron reaccionar 5 \mug de poli(A)^{+}-ARN y 24 unidades de transcriptasa reversa en una mezcla de reacción {Tris-HCl 50 mM (pH 8,3), MgCl_{2} 8 mM, KCl 30 mM, ditiotreitol (DTT) 0,3 mM, dATP 2 mM, dGTP 2 mM, dCTP 2 mM, dTTP 2 mM, 10 \mu Ci[ \alpha-^{32}P]dCTP y 1,4 \mug de ADN vector cebador [3'-oligo(dT)-terminal pcDV-1, Pharmacia]} a 42ºC durante 60 minutos.

Después de que la reacción se hubiera detenido mediante la adición de 2 \mul de EDTA 0,25 M y 1 \mul de SDS 10%, se eliminó la proteína mediante el tratamiento con 20 \mul de fenol-cloroformo (1 : 1). Se añadieron 20 \mul de acetato de amonio 4M y 80 \mu de etanol a la capa acuosa que había sido recogida mediante centrifugación, seguido de enfriamiento a -70ºC durante 15 minutos. El precipitado se recogió entonces mediante centrifugación y se lavó con etanol 75%, seguido de secado bajo presión reducida.

El precipitado seco se disolvió entonces en 15 \mul de una mezcla de reacción transferasa terminal [cacodilato de potasio 140 mM, Tris-HCl 30 mM (pH 6,8), CoCl_{2} 1 mM, DTT 0,5 mM, 0,2 \mug de poliA y dCTP 100 mM]. La mezcla de reacción se mantuvo a 37ºC durante 3 minutos, después de lo cual se añadieron 18 unidades de transferasa deoxinucleotidil terminal y se dejaron reaccionar durante 5 minutos. La proteína se eliminó entonces mediante tratamiento con fenol-cloroformo, después de que la reacción se hubiera detenido mediante la adición de 1 \mul de EDTA 0,25M y 0,5 \mul de SDS 10%. Después de la centrifugación de la mezcla de reacción, se recuperó la capa acuosa, y se le añadieron 15 \mul de acetato de amonio 4M y 60 \mul de etanol, seguido de mezcla vigorosa. Después de enfriar la mezcla a -70ºC durante 15 minutos, el precipitado así formado se recogió mediante centrifugación.

Este precipitado se disolvió entonces en 10 \mul de tampón de enzima de restricción [NaCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), MgCl_{2} 10 mM y DTT 1 mM], y se le añadieron 2,5 unidades del enzima de restricción Hind III, y el precipitado se digirió a 37ºC durante alrededor de 1 hora.

Las proteínas se eliminaron mediante tratamiento con fenol-cloroformo, y después se realizó una precipitación con etanol. Después de que la mezcla de reacción se enfriara a -70ºC durante 15 minutos, el precipitado se recogió mediante centrifugación y se disolvió en 10 \mul de tampón TE [Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) y EDTA 1 mM]. Se añadió 1 \mul de esta solución a 9 \mul de una mezcla de reacción [Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM y NaCl 100 mM] a la cual se añadieron 10 ng de ADN espaciador oligo(dG)-terminal [espaciador 3'-oligo(dG)terminal pL-1 Hind3, Pharmacia], seguido de calentamiento a 65ºC durante 5 minutos. La mezcla de reacción se dejó reposar a 42ºC durante 30 minutos. La mezcla de reacción se enfrió en agua helada, después de lo cual se le añadieron 10 \mul de 10x tampón ligasa [ATP 10 mM, Tris-HCl 660 mM (pH 7,5), MgCl_{2} 66 mM y DTT 100 mM], 78 \mul de agua destilada y 8 unidades de T4 ADN ligasa, y la mezcla se dejó reposar a 12ºC durante toda la noche.

Se añadieron entonces 10 \mul de KCl 1M, 1 unidad de ribonucleasa H, 33 unidades de ADN polimerasa I, 4 unidades de ligasa ADN T4, 0,5 \mul de una solución nucleotídica (dATP 20 mM, dGTP 20 mM, dCTP 20 mM y dTTP 20 mM) y 0,1 \mul de albúmina de sérum bovina (50 \mug/\mul), y la mezcla se mantuvo a 12ºC durante 1 hora, y después a 25ºC durante 1 hora. Después de que la mezcla de reacción se diluyera cinco veces con agua destilada, se transformó DH5 \alpha de Escherichia coli de forma inmediata de acuerdo con el método de Hanahan [Hanahan, D. (1983), J. Mol. Biol., 166, 557-580] para dar una librería de ADNc de células KM-102.

Ejemplo 3 Preparación de una sonda de oligonucleótido

El oligonucleótido de 15 bases 5'-TAAATAAATAAATAA-3', designado como ATT-3, se sintetizó químicamente en base a la secuencia AUUUA conservada en la región 3' no traducida del ARNm de citoquinas. La síntesis se llevó a cabo utilizando un sintetizador de ADN automático 380B (Applied Biosystems) de acuerdo con los procedimientos que se exponen en el manual. Este método está basado en el principio descrito por Caruthers et al. [Metteucci, M.D. y Caruthers, M.H. (1981), J. Am. Chem. Soc., 103, 3185-3191], y que se conoce como método de la fosfoamidita. Una vez que se hubieron sintetizado los 15 nucleótidos, se desprotegieron mediante la liberación de la resina de soporte, y la mezcla resultante se secó por congelación para dar un polvo de oligonucleótido. El polvo se disolvió entonces en agua destilada y se almacenó, congelado a -20ºC, hasta que se necesitó.

Ejemplo 4 Exploración de la librería de ADNc

6.500 cepas de ADNs recombinantes de la librería de ADNc preparada en el Ejemplo 3 se fijaron en un filtro de nitrocelulosa de acuerdo con el método de Grunstein, M. y Hogness, D.S. [Grunstein, M. y Hogness, D.S. (1975), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3961-3965]. El extremo 5'-terminal de la sonda (ATT-3) se marcó con ^{32}P mediante métodos convencionales (ver "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", supra), después de lo cual se realizó la hibridación de la colonia. La pre-hibridación se realizó a 37ºC durante 3 horas en una solución que contenía 6 X SSC (1 X SSC = NaCl 150 mM y citrato trisódico 15 mM), 1 X solución de Denhardt, SDS 0,25%, pirofosfato de sodio 0,05% y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. La hibridación se realizó a 31ºC durante toda la noche en una mezcla de reacción de 6 X SSC que contenía la sonda marcada ^{32}P (ATT-3), 1 X solución de Denhardt, 17 \mug/ml de ARNt de levadura y pirofosfato de sodio 0,05%. Una vez se hubo completado de la reacción, se lavó el filtro de nitrocelulosa con una solución 6 X SSC que contiene pirofosfato de sodio 0,05% a temperatura ambiente durante 2 horas, y entonces se sometió a autoradiografía. Como resultado, se obtuvieron 33 clones positivos. Después del aislamiento del ADN plásmido de estos clones mediante el procedimiento convencional, se seleccionaron diversos clones al azar, y se determinó una secuencia nucleotídica parcial del ADNc resultante mediante el método dideoxi. Se comprobó la homología con las secuencias nucleotídicas registradas en las bases de datos del EMBL o del GenBank utilizando un ordenador personal. De esta manera se determinó que la región a la cual se hibridizó la sonda ATT-3 era homóloga con los miembros de la secuencia repetitiva Alu [Schmid, C.W. y Jelinek, W.R. (1982), Science, 216, 1065-1070].

Cuando se marcó con ^{32}P un fragmento de ADN que contiene la secuencia repetitiva Alu preparada a partir de ADN de genoma humano y se utilizó como sonda para realizar la hibridación en colonia de los 33 clones mencionados anteriormente, se estableció que 12 de los clones poseían las secuencias repetitivas Alu. Se determinó la longitud del ADNc insertado para los 21 clones restantes, y se encontró que los segmentos insertados contenían de 50 a 3.600 bases. Después de mapear el ADNc de los 21 clones con enzimas de restricción, las secuencias nucleotídicas del ADNc se determinaron parcialmente. Se buscaron secuencias homólogas en las bases de datos mencionadas anteriormente, y se seleccionaron los clones que tenían nuevas secuencias no registradas en esas bases de datos.

Ya que estos plásmidos contienen un promotor temprano SV40 y un origen de replicación, son apropiados para la expresión de ADNc en células COS-1. Así pues, el ADN plásmido se introdujo en células COS-1. La transfección de las células COS-1 se llevó a cabo mediante electroporación utilizando la unidad de implantación génica Shimadzu GTE-1.

Más específicamente, las células COS-1 se hicieron crecer en un frasco hasta un estado semiconfluyente, las células se recogieron mediante tratamiento con tripsina-EDTA y se lavaron dos veces con tampón PBS(-) (Nissui Seiyaku). Seguidamente, las células se suspendieron en un tampón PBS(-) a 6 x 10^{7} células/ml. Por otra parte, cada uno de los ADNs plásmidos preparados mediante el método del cloruro de cesio se ajustaron a 200 \mug/ml con tampón PBS(-). Se mezclaron 20 \mul de cada una de las suspensiones celulares mencionadas anteriormente y la solución de ADN, y entonces se colocaron en una cámara con una separación entre los electrodos de 2 mm. Se aplicaron dos veces pulsos de 30 \museg y 600V a intervalos de 1 seg. Después de enfriar la cámara a 4ºC durante alrededor de 5 minutos, la mezcla de células-ADN en la cámara se añadió a 10 ml de DMEM que contenía FBS 10%. La mezcla resultante se transfirió entonces a una placa y se cultivó en presencia de CO_{2} 5% a 37ºC durante toda la noche. Se eliminó el sobrenadante del cultivo, las células se lavaron con medio libre de sérum (DMEM), y se añadieron 10 ml de DMEM, seguido de cultivo durante 3 días. El sobrenadante se recuperó del cultivo celular obtenido, y se sometió a un ensayo para detectar la actividad supresora sobre la diferenciación de células 3T3-L1 en adipocitos, tal como se describe en el Ejemplo de referencia.

La actividad inhibidora de adipocitos solamente se detectó en el sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con el plásmido (designado pcD-20-2) del clon al cual habíamos dado el número 20-2. Los datos de la actividad inhibidora de la transformación de adipogénesis se muestran el la Tabla 1.

TABLA 1

Aditivo	Razón de Diferenciación de Adipogénesis (%)
DMEM libre de sérum (referencia)	72
Sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con	41
pUC-CAT (adición 4%)
Sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con	13
pcD-20-2 (adición 4%)

El pUC-CAT es un plásmido obtenido mediante la inserción del gen cloramfenicol acetil transferasa en un vector pUC, y puede utilizarse como control negativo, ya que no tiene un promotor que funcione en células de mamífero. La transfección se llevó a cabo de la misma forma que para el pcD-20-2. Tal como se muestra en la Tabla 1, la actividad inhibidora sobre la diferenciación de células 3T3-L1 en adipocitos pudo detectarse en el sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con pcD-20-2. Además, en aquellas células 3T3-L1 inducidas para diferenciarse en adipocitos (Tabla 2), la actividad LPL se vio fuertemente suprimida. Los valores en la Tabla representan un valor relativo (%) sobre la base de que el 100% de actividad LPL (referencia) se toma como la que ocurre cuando sólo se añade DMEM libre de sérum.

TABLA 2

Aditivo	Valor relativo de la Actividad LPL (%)
DMEM libre de sérum (referencia)	100
Sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con	95
pUC-CAT (adición 4%)
Sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con	38
pcD-20-2 (adición 4%)

Se confeccionó un mapa de una enzima de restricción del ADNc insertado de pcD-20-2 (Fig. 1). Se determinó entonces la secuencia nucleotídica entera del ADNc mediante el método dideoxi, y se obtuvo la secuencia nucleotídica indicada con el número de secuencia 1 (SEQ ID NO: 1) del listado de secuencias. Se encontró que el ADNc insertado en pcD-20-2 contiene 1065 bases con un extremo terminal poli(A) (41 residuos A). También se encontró que el ADNc tiene un marco de lectura abierto (ORF) que consiste en 199 aminoácidos que empieza con metionina. Cuando se comparó la secuencia nucleotídica resultante con las secuencias en las bases de datos del EMBL y del GenBank, no se encontró homología con ninguna secuencia conocida. La secuencia de aminoácidos codificada por el ORF también se comparó con las bases de datos NBRF y SWISS Prot, y no se observó homología con ninguna secuencia conocida. Así pues, se estableció que el ORF del ADNc insertado en pcD-20-2 codifica un nuevo polipéptido. La secuencia de aminoácidos codificada por el ORF se indica en la secuencia número 2 (SEQ ID NO: 2) del listado de secuencias.

En la región N-terminal de la secuencia de aminoácidos se observa una región que contiene aminoácidos altamente hidrofóbicos (un péptido señal), que empieza con metionina, que también ha sido observada en diversas proteínas secretoras. Ello sugiere que la proteína es una proteína secretora.

Ejemplo 5 Síntesis peptídica y preparación del antisérum antipéptido

Se sintetizó el péptido que corresponde a la secuencia de aminoácidos 27 - 41 desde la metionina a la región N-terminal (NH_{2}-Gly-Pro-Pro-Arg-Val-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-COOH) para confirmar que el nuevo péptido codificado por el ORF del ADNc insertado en pcD-20-2 es una proteína secretora, y también para detectar el factor inhibidor de la adipogénesis durante el proceso de purificación del factor, que se describe más adelante. El péptido así sintetizado se utilizó entonces como antígeno para inmunizar un conejo y preparar antisérum.

Entrando en detalles, la síntesis del péptido se llevó a cabo de acuerdo con el método en fase sólida tBOC-amino ácido [Merrifield, R.B. (1963), J. Am. Chem. Soc., 85, 2149-2154] siguiendo un programa de síntesis automática estándar utilizando un sintetizador de péptidos 430A fabricado por Applied Biosystems. Después de la desprotección y eliminación de la resina, el péptido se purificó en una columna de intercambio aniónico. La confirmación del patrón de picos principales se llevó a cabo por HPLC utilizando una columna de fase inversa. Después de la concentración del péptido por secado por congelación, los picos se separaron y recogieron por HPLC utilizando una columna de fase inversa. Después de que se concentrara nuevamente la proteína por secado por congelación, se llevaron a cabo un análisis por HPLC y un análisis de composición de aminoácidos. La composición de aminoácidos se analizó utilizando un Pico Tag System, un analizador de aminoácidos automático fabricado por Waters.

Se acopló hemocianina Keyhole Limpet (KLH), que actúa como proteína transportadora, al péptido resultante mediante el método del glutaraldehído (GAD) [Konopka, J.B. et al. (1984), J. Virol., 51, 223-232], y se utilizó como antígeno para la inmunización del conejo. El antígeno se suspendió de forma homogénea en adyuvante completo de Freund (FCA), y se inmunizó un conejo mediante la administración de la suspensión en su lomo de forma subdérmica. Después de la administración de la suspensión, se recogió tres veces sangre entera en intervalos de aproximadamente dos semanas. La medición de la cantidad de anticuerpo en el sérum del conejo se llevó a cabo mediante un ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA). Se preparó una fracción IgG a partir del antisérum resultante utilizando una columna Protein A-Sepharose 6MB fabricada por Pharmacia. Ésta se utilizó entonces como anticuerpo primario.

Ejemplo 6 Producción y purificación de factor inhibidor de la adipogénesis en células COS-1 i) Construcción de un vector de alta expresión y expresión en células COS-1

Después de la digestión del pcD-20-2 con BamH1, se aisló y purificó el fragmento 1240 bp que contiene el ADNc insertado. Mientras tanto, después de la digestión del vector de alta expresión pcDL-SR \alpha296 [Takebe, Y. et al. (1988), Mol. Cell. Biol., 8, 466-472], también con BamH1, se preparó el fragmento de 3,4 kb que contiene el promotor SR \alpha, y el fragmento ADNc BamH1 se ligó a él mediante una reacción que utiliza T4 ADN ligasa. El ADN resultante se utilizó entonces para transformar DH5 \alpha de Escherichia coli, y se llevó a cabo un análisis del plásmido en el transformante resultante. Se seleccionó una cepa en la cual la dirección de la transcripción del ADNc es la misma que la dirección del promotor SR \alpha, y este plásmido se denominó pSR \alpha-20-2 (Fig. 2).

El promotor SR \alpha comprende un promotor temprano SV40 y la secuencia R-U5 de la secuencia terminal repetida larga (LTR) de HTLV-1, y demuestra una actividad promotora de 10 a 100 veces mayor que la del promotor temprano SV40 en solitario.

Seguidamente, se transfectaron células COS-1 con el plásmido pSR \alpha-20-2 resultante para confirmar, utilizando el anticuerpo obtenido en el Ejemplo 5, que el factor inhibidor de la adipogénesis se secreta en el sobrenadante del cultivo. La transfección de células COS-1 se llevó a cabo de acuerdo con el método de electroporación o bien el método DEAE-dextrano [Luthman, H. y Magnusson G. (1983), Nucleic Acids Res., 11, 1295-1308]. 160 \mul de sobrenadante del cultivo libre de sérum obtenido de cada uno de los siguientes: células COS-1 transfectadas con plásmido de contro negativo; células COS-1 transfectadas con pcDL-SR \alpha 296 que no contiene ADNc, y células COS-1 transfectadas con pSR \alpha-20-2 y que expresan factor inhibidor de la adipogénesis, se trataron con ácido tricloroacético (TCA) para precipitar la proteína, y el precipitado se obtuvo entonces mediante separación centrífuga. Después de que el precipitado se lavara utilizando acetona enfriada con hielo y se enfriara al aire, se disolvió en un tampón muestra que contenía 2-mercaptoetanol y se sometió a electroforesis de gel SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) bajo condiciones reductoras utilizando un gel al 12,5%. La detección de las bandas de proteína después de la electroforesis se llevó a cabo mediante tinción con plata utilizando Silbest Stain fabricado por Nacalai Tesque (panel a la izquierda de la Fig. 3). Se detectó una única banda con el patrón específico en la posición indicada por la flecha (peso molecular: aproximadamente 23.000) en el sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con pSR \alpha-20-2.

Además, se llevó a cabo un análisis de transferencia Western utilizando el anticuerpo primario preparado en el Ejemplo 5, después de que se absorbieran las bandas de proteína obtenidas por electroforesis en gel de poliacrilamida en una membrana de nitrocelulosa utilizando un secante de membrana de gel (fabricado por Marysol, KS-8441) de acuerdo con el método de Towbin et al. [Towbin, H. et al. (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350-4354]. El procedimiento de transferencia de Western se llevó a cabo utilizando el Kit de Ensayo Immun-Blot (GAR-HRP) fabricado por Bio-Rad, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (panel a la derecha de la Fig. 3). Sólo la banda específica detectada mediante la tinción con plata (peso molecular: aproximadamente 23.000) reaccionó con el anticuerpo antipéptido, confirmando así que la proteína codificada por el ORF del ADNc insertado del pcD-20-2 es una proteína secretora.

Seguidamente se llevó a cabo un estudio de la actividad inhibidora de la diferenciación de la adipogénesis utilizando el sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con pSR \alpha-20-2. Los datos de actividad se muestran en la Tabla 3.

TABLA 3

Aditivo	Razón de Diferenciación Adipogénica (%)
DMEM libre de sérum (referencia)	85
Sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con	84
pcDL-SR \alpha296 (adición 0.6%)
Sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con	29
pSR \alpha-20-2 (adición 0.6%)

Aunque no se observa actividad inhibidora de la diferenciación de la adipogénesis en el sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con pcDL-SR \alpha296 (control negativo que no contiene insertado ADNc), se detectó una actividad destacable en el caso de pSR \alpha-20-2. Además, la actividad LPL fue fuertemente suprimida en las células 3T3-L1 que habían sido inducidas a diferenciarse en adipocitos (Tabla 4). La actividad inhibidora indicada en la Tabla 3 y en la Tabla 4 fue marcadamente mayor que cuando se había utilizado pcD-20-2 (Tabla 1 y Tabla 2).

TABLA 4

Aditivo	Valor relativo de Actividad LPL (%)
DMEM libre de sérum (referencia)	100
Sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con	117
pcDL-SR \alpha296 (adición 0.8%)
Sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con	17
pSR \alpha-20-2 (adición 0.8%)

ii) Purificación y análisis de la secuencia de aminoácidos N terminal

Se sometieron a diálisis 7 L de sobrenadante del cultivo libre de sérum, obtenido mediante transfección de células COS-1 con pSR \alpha-20-2 tal como se ha descrito anteriormente, con un volumen 20 veces mayor de tampón de diálisis [ácido bórico-NaOH 10 mM (pH 9,0) y KCl 13 mM] a 4ºC durante 15 horas, después de lo cual se llevó a cabo una cromatografía de intercambio iónico suave utilizando el FPLC fabricado por Pharmacia bajo las condiciones que se indican a continuación:

: Columna: CM-Toyopearl Pack 650M (2,2 x 20 cm, fabricada por Tosoh)

: Solución tampón de elución:

: Solución A: ácido bórico-NaOH 10 mM (pH 9,0), KCl 13 mM

: Solución B: Solución A que contiene NaCl 300 mM

: Velocidad del flujo: 3 ml/min.

: Volumen de las fracciones: 3 ml/tubo

: Gradiente de la concentración: gradiente de concentración lineal desde 100% de solución A hasta 100% de solución B en el curso de 50 minutos

Se realizó una transferencia de Western para cada una de las fracciones obtenidas, utilizando el antipéptido anticuerpo preparado en el Ejemplo 5 para identificar la fracción que contiene factor inhibidor de la adipogénesis (Nos. 35 - 45). La cantidad total de fracción pico (No. 41) que contiene la mayor cantidad de factor inhibidor de la adipogénesis eluído con NaCl 260 mM se concentró mediante tratamiento de precipitación TCA y se analizó mediante SDS-PAGE utilizando un gel del 12,5% bajo condiciones reductoras. Después de la electroforesis, se absorbieron las bandas de proteína del gel de poliacrilamida en una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (fabricada por Millipore, Immobilon) utilizando un secante de membrana de gel (Marysol, KS-8441) en un tampón de transferencia [SDS 0,02%, metanol 20% y Tris-borato 25 mM (pH 9,5)] a 4ºC durante 15 horas con una corriente de 0,8 mA/cm. La membrana transferida se lavó durante 5 minutos con tampón de borato de sodio 10 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 25 mM y seguidamente con agua destilada bajo agitación, durante 5 minutos, después de lo cual la membrana se dejó secar al aire. Seguidamente, la porción a la cual se había transferido el factor inhibidor de la adipogénesis se separó de la membrana, y se determinó la secuencia hasta 10 residuos de aminoácido a partir del extremo N-terminal utilizando un secuenciador de proteínas en fase de gas (fabricado por Applied Biosystems, Modelo 475A).

Los feniltiohidantoína (PHT)-aminoácidos obtenidos en los respectivos ciclos de reacción se separaron e identificaron mediante HPLC en fase inversa (Applied Biosystems, Modelo 120A). La secuencia de aminoácidos determinada mediante el procedimiento mencionado anteriormente es la que se indica a continuación, y corresponde a los aminoácidos 1-10 de la SEQ ID NO: 2.

Pro-Gly-Pro-Pro-Pro-Gly-Pro-Pro-Arg-Val-

Ello indica que el factor inhibidor de la adipogénesis humano se secreta fuera de las células en una forma madura, empezando con un residuo de Pro, después de la biosíntesis de un precursor compuesto de 199 aminoácidos, y la pérdida del péptido señal compuesto de 21 aminoácidos en el extremo N-terminal por separación.

Ejemplo 7 Actividad biológica del factor inhibidor de la adipogénesis purificado

El factor inhibidor de la adipogénesis se purificó del sobrenadante del cultivo libre de sérum, obtenido mediante la transfección de células COS-1 con pSR \alpha-20-2, de acuerdo con métodos conocidos, combinando cromatografía de intercambio catiónico suave, cromatografía hidrofóbica y cromatografía de columna de filtración en gel y demás, y el factor se detectó en la forma de una única banda mediante análisis SDS-PAGE. Se detectó una actividad destacable como resultado de examinar la actividad inhibidora de la diferenciación de la adipogénesis y la actividad supresora de LPL utilizando este factor inhibidor de la adipogénesis purificado.

Así pues, se concluyó que el factor inhibidor de la adipogénesis de la presente invención resulta de una única proteína que posee actividad de factor inhibidor de la adipogénesis.

Ejemplo 8 Producción secretora de factor inhibidor de la transformación de adipogénesis en células CHO

Se co-transfectaron células CHO en fase de crecimiento logarítmico con pSR \alpha-20-2 y pSRVneo, a una razón de ADN de 5 : 1, utilizando el método de co-precipitación de fosfato de calcio-ADN. La selección de las cepas transformadas se llevó a cabocultivando con medio HamF12 (Nissui Seiyaku) que contenía 400 \mug/ml de G418 (Gibco Oriental) y FBS 10% durante 9 días. Después de que se seleccionaran 15 cepas de entre las colonias resistentes resultantes, las colonias se transfirieron a una placa de 24 pocillos utilizando un anillo de clonación, y se continuó el cultivo. Aquellas células que alcanzaron un estado confluyente se transfirieron a recipientes cuadrados y se subcultivaron, y se sometió a ensayo la producción de factor inhibidor de la adipogénesis en las 15 cepas, utilizando el método de transferencia Western que se ha descrito anteriormente.

Se seleccionó el clon que demostró la mayor producción de factor inhibidor de la adipogénesis, y seguidamente se cultivó mediante una técnica de dilución limitante, utilizando una placa de 96 pocillos. Se transfirieron 4 clones derivados de esta única célula. Las 4 cepas se transfirieron a placas de cultivo y se cultivaron hasta un estado confluyente, y se sometió a ensayo la cantidad de factor inhibidor de la adipogénesis utilizando el método de transferencia Western para cada sobrenadante del cultivo. Las cantidades de producción secretoria de factor inhibidor de la adipogénesis fueron estables, y no se observó una gran diferencia en las cantidades entre las 4 cepas. Además, se investigaron los efectos de los sobrenadantes de los cultivos obtenidos anteriormente sobre la actividad supresora de LPL de las células 3T3-L1, y se detectó actividad supresora de LPL en los sobrenadantes de los cultivos de los 4 clones. Seguidamente, se cultivó una de las 4 cepas en un medio libre de sérum (sistema de medio completo CHO-1, fabricado por Ventrex). Después de que la cepa se hubo cultivado en el medio libre de sérum durante 2 días, se llevó a cabo un subcultivo mediante tratamiento con tripsina-EDTA, seguido de cultivo durante otros 3 días. Seguidamente se recuperó el sobrenadante del cultivo y se examinó utilizando el método de transferencia Western, y se confirmó que el factor inhibidor de la adipogénesis se estaba produciendo de forma estable.

Ejemplo 9 Acción inhibidora sobre la diferenciación adipogénica de la línea celular de preadipocitos H-1/A derivada de médula ósea de ratón

Se suspendió línea celular de preadipocitos H-1/A derivada de médula ósea de ratón [Nakamura, M. et al. (1985), Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 179, 283-287] a una densidad de 2,0 x 10^{4} células/ml en medio E [medio de Fischer (Gibco) que contiene FBS inmobilizado 10% (Hyclone)]. Esta suspensión celular se pipeteó en una placa Celltight C-1 48F (Sumitomo Bakelite), a 0,5 ml por pocillo, y se cultivó a 33ºC en una mezcla gaseosa humidificada de CO_{2} 5% y aire 95%. Tres días después, el medio se reemplazó con medio F [medio E que contiene hidrocortisona 1 \muM (Sigma)] para inducir la diferenciación adipogénica. Al mismo tiempo, se añadió el sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con plásmido pSR \alpha-20-2, el sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con plásmido pcDL-SR \alpha296, o medio DMEM libre de sérum. El medio se reemplazó con medio nuevo F, y se añadieron sobrenadante del cultivo celular COS-1 o medio DMEM nuevos, cada 4 días. Las células se fijaron con formaldehído 5% en el vigésimosexto día después de la adición de medio F, y las gotas de grasa que se habían acumulado en las células y en los núcleos celulares se tiñeron utilizando rojo-O al aceite y hematoxilina, respectivamente. La razón de diferenciación adipogénica se calculó entonces utilizando el mismo método que el utilizado para la medición de la acción inhibidora de la diferenciación adipogénica de células 3T3-L1. Tal como se muestra en la Tabla 5, se detectó una acción fuertemente inhibidora de la diferenciación adipogénica en células H-1/A en el sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con pSR \alpha-20-2. El factor inhibidor de la adipogénesis purificado del sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con pSR \alpha-20-2 también inhibió de forma destacable la diferenciación adipogénica de las células H-1/A.

TABLA 5

Aditivo	Razón de Diferenciación Adipogénica (%)
DMEM libre de sérum (adición 8%)	34
Sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con	36
pcDL-SR \alpha296 (adición 8%)
Sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con	5
pSR \alpha-20-2 (adición 8%)

Ejemplo 10 Acción inductora de CSF en la línea celular de preadipocitos H-1/A derivada de médula ósea

Se suspendieron células H-1/A a una densidad de 1,0 x 10^{4} células/ml en medio E y se pipetearon 3 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos (Cosaer). Las células se cultivaron a 33ºC en una mezcla gaseosa humidificada de CO_{2} 5% y aire 95%. Después de que las células se hubieron cultivado durante 6 días, el medio se reemplazó con medio nuevo E. Entonces, se añadió el sobrenadante del cultivo de las células COS-1 transfectadas con plásmido pSR \alpha-20-2, el sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con plásmido pcDL-SR \alpha 296, o medio DMEM libre de sérum, seguido de cultivo durante otras 5 horas.

Después del cultivo, las células se lavaron tres veces con medio de Fischer libre de sérum, y se añadieron 3 ml de medio E nuevo a cada pocillo, y el cultivo se continuó durante otras 14 horas. El sobrenadante del cultivo se recogió de cada pocillo. El sobrenadante del cultivo así obtenido se filtró utilizando un filtro Millex GV con un tamaño de poro de 0,22 \mum (Nippon Millipore Industries), y el filtrado se utilizó entonces para realizar una prueba de actividad de estimulación de colonia de acuerdo con el método de Kubota et al. [Kubota, K. et al. (1981), Cancer Res., 41, 3052-3057]. Se suspendieron células de médula ósea femoral de ratones hembra C3H He/N (adquiridas de Japan Charles River) a una densidad de 1,0 x 10^{5} células/ml en medio RPMI 1640 (Gibco) al cual se había añadido bactoagar 0,3% (Difco), FBS 20% y sobrenadante del cultivo celular H-1/A 10%. Se pipetearon porciones de 1 ml cada una de esta suspensión en placas de plástico de 35 x 10 mm (Lux). Después de que las células hubieran sido cultivadas a 37ºC en una mezcla gaseosa humidificada de CO_{2} 5% y aire 95% durante 7 días, se comprobó el número de colonias formado en cada placa.

El sobrenadante del cultivo de células H-1/A tratado con medio E, al cual se había añadido el sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con pSR \alpha-20-2, demostró una actividad estimuladora de colonia significativamente más alta (p<0,01) que el sobrenadante del cultivo de H-1/A células tratado con medio E al cual se había añadido el sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con pcDL-SR \alpha 296 ó DMEM libre de sérum. Los resultados se resumen el la Tabla 6.

TABLA 6

Aditivo	Número de Colonias
	(media\pmS.D., n=6)
Sobrenadante del cultivo de células H-1/A tratado con medio E que contiene	46,7 \pm 13,8
DMEM libre de sérum 2,5%
Sobrenadante del cultivo de células H-1/A tratado con medio E que contiene	44,5 \pm 13,6
sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con pcDL-SR \alpha296 2,5%
Sobrenadante del cultivo de células H-1/A tratado con medio E que contiene	72,0 \pm 14,3
sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con pSR \alpha-20-2 2,5%

Se suspendieron 5,0 x 10^{6} células H-1/A en 50 ml de medio E y se cultivaron en un recipiente Accel (Costar) durante 5 días. Seguidamente, el medio se reemplazó con medio nuevo E, y se añadieron simultáneamente el sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con pSR \alpha-20-2, el sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con pcDL-SR \alpha 296, o DMEM libre de sérum. Después de que la mezcla se hubiera cultivado durante 18 horas, se aisló el ARN total de las células de la misma forma que en el Ejemplo 1. La cantidad de M-CSF ARNm se midió mediante el método de hibridación de Northern [Thomas, P.S. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5201-5205] utilizando 20 \mug de ARN total. El M-CSF ADNc preparado mediante reacción en cadena de la polimerasa [Ladner, M.B. et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 85, 6706-6710] se marcó con ^{32}P utilizando el Multiprime ADN Labelling System (Amersham) y se utilizó como sonda. La cantidad de sonda marcada con ^{32}P se determinó utilizando un analizador de imagen (Fuji Photo Film). La sonda marcada con ^{32}P se hibridizó a ARN con un tamaño de alrededor de 2,5 kb y alrededor de 4,5 kb. Cuando se compararon las cantidades totales de sonda de hibridizadas hasta estos tamaños, se encontró que la cantidad de M-CSF ARNm por unidad de ARN total había aumentado en las células H-1/A tratadas con medio E al cual se había añadido sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con pSR \alpha-20-2 5%, al comparar con células H-1/A tratadas con medio E al cual se había añadido sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con pcDL-SR \alpha 296 5% (Tabla 7).

TABLA 7

Aditivo	Valor relativo de la cantidad de M-CSF ARNm (%)
Sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con	100
pcDL-SR \alpha296 (adición 5%)
Sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con	154
pSR \alpha-20-2 (adición 5%)

Ejemplo 11 Acción inductiva de CSF en células H-1/A diferenciadas en adipocitos

Se suspendieron células 5,0 x 10^{6} H-1/A en 50 ml de medio F y se cultivaron a 33ºC durante 12 días en un recipiente Accel. Durante el cultivo, el medio se reemplazó con medio nuevo F una vez cada 4 días. Después de este período, el medio se reemplazó con medio E y se continuó el cultivo durante otros 3 días. Como resultado, se observó que se habían acumulado gotas de aceite en el 40% o más de las células, indicando la diferenciación en adipocitos. El medio se reemplazó entonces con medio E al cual se había añadido sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con pSR \alpha-20-2 5%, sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con pcDL-SR \alpha 296 ó bien DMEM libre de sérum, y el cultivo continuó durante 18 horas. Después del cultivo, se eliminó el medio y las células se lavaron dos veces con PBS(-), seguido de la adición de 25 ml de medio E al cual se había añadido heparina sódica hasta una concentración final de 10 U/ml. Esta mezcla se cultivó a 33ºC durante 15 minutos. Cuando se midió la actividad LPL en el sobrenadante del cultivo, sólo se observó una supresión de LPL destacable cuando se había añadido el sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con pSR \alpha-20-2 (Tabla 8).

TABLA 8

Aditivo	Valor relativo de la Actividad LPL (%)
DMEM libre de sérum (referencia)	100
Sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con	80
pcDL-SR \alpha296 (adición 5%)
Sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con	10
pSR \alpha-20-2 (adición 5%)

Subsiguientemente, se aisló el ARN total, de la misma forma que en el Ejemplo 1, de las células preparadas anteriormente. Se midió entonces la cantidad de M-CSF ARNm de la misma forma que en el Ejemplo 10, con la excepción de que se utilizaron 10 \mug de ARN total cada vez. Las células H-1/A tratadas con medio E que contiene sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con pSR \alpha-20-2 5% demostraron un incremento destacable en la cantidad de M-CSF ARNm por unidad de ARN total, cuando se compararon con células H-1/A tratadas con medio E que contiene sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas con pcDL-SR \alpha296 5% (Tabla 9).

TABLA 9

Aditivo	Valor relativo de la Cantidad de M-CSF ARNm (%)
Sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas	100
con pcDL-SR \alpha296 (adición 5%)
Sobrenadante del cultivo de células COS-1 transfectadas	172
con pSR \alpha-20-2 (adición 5%)

Ejemplo de preparación 1

Preparación de gránulos cubiertos entéricos que contienen factor inhibidor de la adipogénesis 50%

Se pesaron 70 partes (partes en peso, lo mismo se aplicará de aquí en adelante) de factor inhibidor de la adipogénesis purificado obtenido en el Ejemplo 8, 10 partes de lactosa y 20 partes de celulosa microcristalina y se mezclaron a conciencia en un mortero, seguido de amasamiento con una cantidad apropiada de agua. La mezcla amasada se extrusionó a través de un granulizador cilíndrico equipado con una rejilla con un tamaño de poro de 1,2 mm para formar gránulos. Los gránulos se pasaron a través de un MARUMERIZER para proporcionar así una preparación granular. Después de que estos gránulos se secaran a 40ºC durante 2 horas en un secador de circulación de aire, los gránulos secos resultantes se clasificaron haciéndolos pasar por un tamiz con malla de 35. Aquellos gránulos mayores que la malla de 35 se utilizaron para fabricar los gránulos cubiertos entéricos. Primero, se preparó una solución de hidroxipropilmetilcelulosa 5% en cantidades iguales de cloruro de metileno y etanol de acuerdo con en procedimiento convencional, y se recubrieron con spray 100 partes de los gránulos secos mencionados anteriormente con 100 partes de esta solución en una cuba de recubrimiento. A continuación, los gránulos así tratados se recubrieron con spray de la misma manera que se ha descrito anteriormente con 300 partes de una solución de ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa 10% (Shin-Etsu Chemical, HP-55), ácido esteárico 1,5%, acetona 50% y etanol 38,5% preparados según el procedimiento convencional. Los gránulos recubiertos obtenidos de esta forma se secaron a 40ºC durante 1 hora en un secador de circulación de aire, para formar una preparación entérica de factor inhibidor de la adipogénesis. Estos gránulos contienen un 50% de factor inhibidor de la adipogénesis.

Ejemplo de preparación 2

Cápsulas

Se cargaron 200 mg de los gránulos cubiertos entéricos preparados en el Ejemplo de Preparación 1 en cápsulas No. 3 para producir cápsulas duras que contienen 100 mg de factor inhibidor de la adipogénesis por cápsula.

Ejemplo de preparación 3

Inyección

El factor inhibidor de la adipogénesis puede utilizarse en la forma de una ampolla que contiene una solución estéril del factor, disuelto o suspendido en agua o en cualquier otro líquido aceptable farmacéuticamente. Por otra parte, una ampolla que contenga una preparación de polvo estéril (preferiblemente factor inhibidor de la adipogénesis secado por congelación) puede diluirse para su uso con un líquido farmacéuticamente aceptable.

(1) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEQ. NO: 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

: Longitud de la secuencia: 1065

: Tipo de secuencia: Ácido nucleico

: Tipo de torcido: doble

: Topología: lineal

: Tipo molecular: ADNc a ARNm

: Hipotética: No

: Antisentido: No

: Fuente:

: Nombre del organismo: Homo sapiens

: Línea celular: KM-102

: Características de la secuencia:

: 18-614 E CDS

: 81-614 E mat_peptide

: 18-80 E sig_peptide

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

3

4

5

\vskip0.666000\baselineskip

(1) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEQ. NO: 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

: Longitud de la secuencia: 199

: Tipo de secuencia: Aminoácido

: Topología: lineal

: Tipo molecular: Proteína

: Hipotética: No

: Fuente:

: Nombre del organismo: Homo sapiens

: Línea celular: KM-102

: Características de la secuencia:

: -21--1 E sig_peptide

: 1-178 E mat_peptide

: Secuencia

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Claims

1. Una proteína que no incluye ninguna otra proteína de origen humano y que consiste en la secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos con números del 1 al 178 de los indicados en el ID. SEQ. NO. 2 del listado de secuencias, o en la cual uno o más de los residuos de aminoácido son eliminados en uno o más sitios de dicha proteína o en la cual uno de los residuos de aminoácido se sustituye en uno de los sitios de dicha proteína, siendo la proteína de 178 mer o una parte de los mismos, donde la proteína o una parte de la misma posee actividad inhibidora de la adipogénesis.

2. Una proteína de acuerdo con la Reivindicación 1 que consiste en la secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos con números del 1 al 178 de los que se indican en el ID. SEQ. NO. 2 del listado de secuencias y que posee actividad inhibidora de la adipogénesis.

3. El ADN que codifica una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.

4. El ADN que codifica una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, que consiste en una secuencia nucleotídica que corresponde a los nucleótidos con números del 81 al 614 de los indicados en el ID. SEQ. NO 1 del listado de secuencias.

5. Un vector de expresión de ADN recombinante que comprende el ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4, en el cual dicho ADN puede ser expresado y replicado.

6. Una célula hospedadora transformada por un vector de acuerdo con la Reivindicación 5.

7. Un proceso para la producción de una proteína, que comprende:

el cultivo de una célula hospedadora de acuerdo con la Reivindicación 6, y la recuperación de dicha proteína del extracto celular o de la solución de cultivo.

8. Una composición farmacéutica que contiene una cantidad efectiva terapéuticamente de la proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, junto con un vehículo o transportador farmacéuticamente aceptable.

9. La utilización de una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de la citopenia.

10. La utilización de una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de la obesidad.