ES2206485T3

ES2206485T3 - Aislamiento del acido nucleico.

Info

Publication number: ES2206485T3
Application number: ES95900235T
Authority: ES
Inventors: Jarle Breivik; Gustav Gaudernack; Anne Spurkland
Original assignee: Qiagen AS
Current assignee: Qiagen AS
Priority date: 1993-11-11
Filing date: 1994-11-10
Publication date: 2004-05-16
Anticipated expiration: 2014-11-10
Also published as: AU682074B2; WO1995013368A1; GB9323305D0; DE69433136D1; US6090935A; EP0728198A1; AU8113194A; DK0728198T3; DE69433136T2; EP0728198B1; ATE249516T1

Abstract

EN LA INVENCION SE PRESENTA UN METODO PARA AISLAR EL ACIDO NUCLEICO DE UNA MUESTRA, EN DONDE DICHO METODO CONSISTE EN HERVIR DICHA MUESTRA Y DEJAR QUE SE ENFRIE, Y CONDENSAR EL ACIDO NUCLEICO SOBRE UN SOPORTE SOLIDO DE ALTA AREA SUPERFICIAL, Y EN PARTICULAR EL USO DE TAL METODO EN LA PREPARACION DE MUESTRAS DE ACIDOS NUCLEICOS PARA UNA AMPLIACION POSTERIOR. EL METODO ES PARTICULARMENTE UTIL PARA EL AISLAMIENTO DE ACIDOS NUCLEICOS DE MUESTRAS ENVEJECIDAS, FIJAS O AGOTADAS DE CUALQUIER OTRO MODO.

Description

Aislamiento del ácido nucleico.

La presente invención se refiere al aislamiento de un ácido nucleico, especialmente de ADN, y en particular a un método para preparar muestras de ácido nucleico para utilización posterior en procedimientos de amplificación.

La técnicas para la amplificación de ácidos nucleicos han revolucionado recientemente la biología molecular y están actualmente establecidas como una herramienta indispensable en muchos procedimientos, por ejemplo en la detección y el diagnóstico de enfermedades genéticas e infecciosas, en medicina forense, en la identificación de nuevos genes o de variaciones o mutaciones alélicas y para facilitar manipulaciones genéticas rutinarias, por ejemplo la secuenciación.

Sin embargo, aunque nuevos y mejorados procedimientos de amplificación están siendo desarrollados continuamente, existen en ciertos casos inconvenientes particulares que limitan la utilidad de la técnica. Así por ejemplo, las técnicas de diagnóstico basadas en ADN que dependen de la amplificación de ADN, por ejemplo mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para detectar la presencia de genes microbianos, han demostrado ser útiles para detectar agentes infecciosos y patógenos bacterianos y víricos y están adquiriendo importancia rápidamente. No obstante, a la vista de ciertos problemas, las técnicas no son adecuadas para todas las utilizaciones diagnósticas. Un problema importante es que las técnicas de amplificación tales como la PCR no pueden ser utilizadas directamente en muestras clínicas, en particular heces o sangre, que contienen sustancias que inhiben los enzimas de amplificación, por ejemplo las polimerasas. La presencia de glóbulos rojos sanguíneos o de hemoglobina presenta un problema particular, y éstos necesitan generalmente ser eliminados. Un problema similar se presenta en el caso de la detección de contaminación microbiana en muestras de alimentos, que a menudo contienen también sustancias inhibidoras.

Para una amplificación con éxito, la muestra tiene que ser diluida muchísimas veces o bien el ADN tiene que ser aislado y purificado a partir de la muestra. En el primer caso, la dilución hasta un grado suficiente para permitir la amplificación supone frecuentemente una pérdida inaceptable de sensibilidad. En el segundo caso, las técnicas de purificación de ácidos nucleicos, que implican por ejemplo la extracción con fenoles, cloroformo y alcoholes, son a menudo tediosas, complicadas y requieren mucho tiempo, y pueden conducir a la pérdida de ADN de la muestra, lo cual puede ser un problema si la muestra es pequeña.

Se ha demostrado también que la PCR es difícil de aplicar en muestras que sean antiguas, que hayan sido tratadas químicamente (por ejemplo mediante fijación o inclusión) o que estén deterioradas de otro modo. Esto disminuye significativamente la utilidad de la técnica en, por ejemplo, el análisis de material archivado fijado o de muestras de sangre y tejidos que no sean frescas o que no hayan sido almacenadas bajo refrigeración. Las técnicas de fijación utilizadas actualmente de manera general no permiten una liberación fácil de ADN adecuado para la amplificación posterior utilizando técnicas convencionales, y aunque se están desarrollando técnicas de fijación mejoradas, menos nocivas, la situación no es totalmente satisfactoria. Generalmente se requieren procedimientos de tratamiento complicados, por ejemplo la desparafinización de material incluido en parafina, la digestión con proteinasas, etc., y en muchos casos no puede conseguirse la amplificación. Esto es aplicable también en el caso de muestras antiguas o no refrigeradas.

EP 0393744 describe un método de extracción, amplificación y detección de un ácido nucleico de sangre completa o de una fracción de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de la misma. La extracción a partir de la fracción de PBMC se lleva a cabo calentando la fracción hasta, o casi, el punto de ebullición del agua durante unos cuantos minutos y recuperando posteriormente el ácido nucleico extraído. La sangre completa puede ser calentada de igual modo después de que sea mezclada con una solución salina que contenga un polisacárido tal como dextrano. El ácido nucleico extraído es luego recuperado de la mezcla calentada. EP 0389063 describe un proceso para aislar ácido nucleico de un material de partida que contenga ácido nucleico tal como sangre completa, suero sanguíneo, orina, heces y cultivos celulares. Este método se caracteriza por la mezcla del material de partida con una sustancia caotrópica y una fase sólida que se una al ácido nucleico. La fase sólida con el ácido nucleico unido es separada posteriormente del líquido. Los complejos fase sólida-ácido nucleico obtenidos son lavados y si se requiere el ácido nucleico puede ser eluido de dichos complejos.

Existe la necesidad de un método mejorado para preparar ácido nucleico para utilización en procedimientos de amplificación, que sea rápido y sencillo de realizar y que pueda ser utilizado en muestras antiguas, no refrigeradas, fijadas o tratadas o deterioradas de otro modo. La presente invención aborda esta necesidad.

Nosotros hemos encontrado ahora que el ácido nucleico puede ser aislado de una muestra en una forma adecuada directamente para amplificación, mediante un procedimiento sencillo y fácil de realizar que implica la ebullición o el calentamiento de la muestra a una temperatura elevada dejándola luego enfriar, y el depósito del ácido nucleico sobre un soporte sólido. Este procedimiento evita muchas de las etapas de tratamiento complicadas y de larga duración de la técnica anterior y, lo que es más importante, puede ser aplicado directamente con éxito a muestras clínicas y a otras muestras que contengan sangre, y a muestras que sean antiguas, que no estén refrigeradas o estén fijadas, en las que las técnicas previas han demostrado no tener éxito. Más particularmente, la invención está basada en el descubrimiento sorprendente de que cuando una muestra es tratada de esta manera, el ácido nucleico liberado es capaz de condensarse alrededor del soporte, permitiendo de este modo que sea separado de la muestra, mientras que al mismo tiempo, conserva la capacidad de actuar como molde en una reacción de amplificación posterior.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona por tanto un método para aislar ácido nucleico de una muestra fijada o antigua, comprendiendo dicho método la ebullición de dicha muestra o el calentamiento de dicha muestra a una temperatura elevada con el fin de liberar el ácido nucleico, dejándola enfriar posteriormente, y la unión del ácido nucleico sobre un soporte sólido con un área de superficie elevada.

Un aspecto adicional de la presente invención proporciona un método para aislar ácido nucleico de una muestra, comprendiendo dicho método la ebullición de dicha muestra o el calentamiento de dicha muestra a una temperatura elevada con el fin de liberar el ácido nucleico, dejándola enfriar posteriormente, y la unión del ácido nucleico sobre un soporte sólido con un área de superficie elevada que comprende partículas magnéticas.

Según se mencionó anteriormente, este método tiene utilidad particular en la preparación de muestras de ácido nucleico para procedimientos de amplificación, ya que las muestras de ácido nucleico condensado resultantes pueden ser utilizadas directamente como molde para la amplificación sin requerir la extracción previa del soporte.

El ácido nucleico puede ser ADN, ARN o cualquier modificación de los mismos. Preferiblemente, sin embargo, el ácido nucleico será ADN, que puede ser genómico o ADNc, y de hebra sencilla o de doble hebra. Cuando el método es utilizado para preparar ácido nucleico para amplificación, será preferiblemente ADN genómico de doble hebra.

La muestra puede se cualquier muestra que contenga ácido nucleico, pero preferiblemente será una muestra clínica tal como sangre, un derivado de sangre, heces o una muestra de tejido, o una muestra que sea antigua o haya sido tratada. Las muestras tratadas incluyen aquéllas que han sido fijadas en, por ejemplo, formalina, acetona, alcoholes o cualquier otro fijador conocido o patentado, por ejemplo Omnifix, o incluidas en, por ejemplo, cera de parafina o en resinas artificiales o naturales. Las muestras antiguas incluyen cualquier muestra que no haya sido recién tomada o que no haya sido refrigerada inmediatamente. Tales muestras antiguas o tratadas incluyen por tanto cualquier fuente de ácido nucleico, vegetal o animal. Además del material de archivo, que puede tener muchos años de antigüedad, por ejemplo más de cien años, o más preferiblemente más de 50 o 20 años de antigüedad, tales muestras incluyen por tanto muestras de cualquier tejido o fluido biológico (por ejemplo sangre, plasma, suero, biopsias de órganos o de otros tejidos) que no hayan sido refrigeradas o procesadas inmediatamente, por ejemplo muestras clínicas tomadas en áreas remotas que necesitan ser transportadas y/o almacenadas algunas veces durante un periodo de días, semanas o meses, antes de que pueden ser procesadas o analizadas.

Esto representa una importante ventaja de la presente invención, ya que en el pasado ha demostrado ser extremadamente difícil, si no imposible, el realizar PCR u otras amplificaciones en muestras clínicas, por ejemplo sangre o biopsias que hayan tenido que ser transportadas, por ejemplo por correo, hasta un laboratorio de referencia para su análisis. Por tanto, de manera ventajosa, la presente invención puede ser utilizada cuando se realizan estudios médicos en regiones remotas del mundo, en las que faltan equipamiento y personal especializado, y en los que las muestras requieren fijación y/o almacenamiento durante extensos periodos de tiempo antes de su análisis. De manera particularmente ventajosa, puede evitarse la necesidad de refrigeración, lo cual es significativamente beneficioso cuando las muestras necesitan ser transportadas, por ejemplo, por correo.

Otras muestras en las que la invención ha demostrado funcionar con éxito en la preparación de ácido nucleico para amplificación en las que han fracasado los métodos previos, incluyen raíces de cabello y células del revestimiento de la mejilla obtenidas mediante lavados bucales, rascados, etc. El método de la invención ha demostrado funcionar particularmente de forma favorable en muestras que contienen ácido nucleico fragmentado. "Ebullición", según se utiliza en la presente, incluye el calentamiento de la muestra a una temperatura elevada, por ejemplo a al menos 80ºC, más preferiblemente a al menos 85 ó 90ºC.

La duración y la temperatura utilizadas en la etapa de ebullición/calentamiento depende hasta cierto punto de la naturaleza y del estado de la muestra que contiene el ácido nucleico. Las muestras tratadas químicamente, por ejemplo tratadas con formalina, o las muestras antiguas, requieren generalmente, y pueden soportar, un tratamiento más agresivo que las suspensiones celulares frescas. En general, la etapa de ebullición/calentamiento será efectuada convenientemente durante un tiempo de 10 segundos a 1 hora, o más si es conveniente, por ejemplo de 30 segundos a 30 minutos, o más particularmente de 3 a 15 minutos. Así, por ejemplo, para la mayoría de las muestras un tratamiento a 94ºC durante 10 minutos permitirá normalmente el aislamiento de ácido nucleico suficiente para permitir una amplificación eficaz.

El soporte puede estar presente con la muestra durante el tratamiento con calor o puede ser introducido posteriormente, incluso días u horas después de que se haya dejado enfriar la muestra. Para suspensiones de células frescas será conveniente generalmente introducir el soporte antes, durante o poco después de la etapa de ebullición/calentamiento; sin embargo, para muestras en las que se separan cantidades de detritus como resultado de la etapa de ebullición/calentamiento, se preferirá generalmente introducir el soporte después de que se haya eliminado tal detritus. Así, para muestras tales como tejido incluido en parafina, la ebullición/calentamiento produce una mezcla no homogénea que contiene tejido y fragmentos de cera. Se prefiere separar la fase líquida que contiene el ácido nucleico de estas mezclas, por ejemplo mediante decantación o pipeteo, después de la ebullición/calentamiento y opcionalmente después del enfriamiento e introducir luego esa fase líquida en el soporte para permitir que tenga lugar la condensación del ácido nucleico.

La condensación del ácido nucleico (y preferiblemente también las etapas de ebullición/calentamiento y enfriamiento) en el método de la invención, se lleva a cabo preferiblemente en una solución acuosa con alta concentración de sal (por ejemplo, que tenga una osmolalidad equivalente a la de al menos una solución acuosa de NaCl 1 M).

Cuando la concentración se realiza poniendo en contacto el soporte con una muestra acuosa que contenga el ácido nucleico ya llevada a ebullición/calentada y enfriada, tal contacto se realiza preferiblemente durante un periodo de algunos minutos, por ejemplo de 1 a 60, especialmente de 10 a 20 minutos, para permitir que tenga lugar la condensación, esto es la unión del ácido nucleico al soporte, hasta un grado adecuado.

El soporte con un área de superficie elevada puede ser cualquier soporte sólido conocido o convencional que presente un área de superficie elevada para la condensación del ácido nucleico. Tales soportes tendrán generalmente una superficie irregular y pueden ser, por ejemplo, porosos o particulados, por ejemplo partículas, fibras, redes, sinterizados o tamices. La condensación del ácido nucleico puede tener lugar sobre o alrededor del soporte, o en el mismo, si tiene por ejemplo una estructura porosa. Ejemplos de soportes sólidos adecuados incluyen pocillos de microvaloración, capilares, fibras, filtros y varillas de inmersión, aunque soportes particulares son generalmente preferidos, especialmente perlas, ya que las mismas, con su ácido nucleico "condensado", capturado, pueden ser fácilmente utilizadas directamente en una etapa posterior de amplificación sin necesidad de desprender el ácido nucleico condensado del soporte.

Convenientemente, un soporte sólido particulado utilizado de acuerdo con la invención comprenderá perlas esféricas. El tamaño de las esferas no es crítico, pero pueden tener un diámetro, por ejemplo, del orden de al menos 1 y preferiblemente de al menos 2 \mum, y pueden tener un diámetro máximo preferiblemente de no más de 10 y más preferiblemente de no más de 6 \mum. Se ha demostrado que las esferas con un diámetro de 2,8 \mum y de 4,8 \mum funcionan bien.

Las partículas monodispersas, esto es aquéllas que son sustancialmente uniformes en tamaño (por ejemplo, que tienen una desviación estándar del tamaño de los diámetros inferior al 5%) tienen la ventaja de que proporcionan una reproducibilidad de reacción muy uniforme. Son especialmente adecuadas las partículas poliméricas monodispersas producidas mediante la técnica descrita en US-A-4336173.

Las perlas poliméricas no magnéticas adecuadas para ser utilizadas en el método de la invención están disponibles en Dyno Particles AS (Lillestr\phim, Noruega) así como en Qiagen, Pharmacia y Serotec.

Sin embargo, las partículas magnéticas son particularmente preferidas como soporte sólido de acuerdo con la invención, ya que proporcionan varias ventajas. Muy destacablemente, la agregación magnética proporciona una vía rápida, sencilla y eficaz de separar las partículas después de la etapa de condensación, y es un método mucho menos riguroso que las técnicas tradicionales, tales como la centrifugación, que generan fuerzas de cizallamiento que degradan los ácidos nucleicos.

Las partículas magnéticas adecuadas para ser utilizadas como soportes en el método de la invención están disponibles en Dynal, Advanced Magnetics Inc., Biotechnologies Ltd., Amersham, Promega, Scigen, Advanced Genetic Technologies y Seradyn.

Son especialmente preferidas las partículas superparamagnéticas, por ejemplo las descritas por Sintef en WO-A-83/03920, ya que la agregación y la aglutinación magnética de las partículas durante la reacción pueden ser evitadas, asegurando de este modo la separación uniforme del ácido nucleico.

Las partículas magnéticas bien conocidas comercializadas por Dynal AS (Oslo, Noruega) como DYNABEADS, son particularmente adecuadas para ser utilizadas en la presente invención. Puede hacerse mención particular de Dynabeads® M-450 y M-280.

Puede señalarse que el método de la invención funciona bien a pesar de que estudios previos que utilizaron tales partículas magnéticas habían demostrado que la unión no específica de ADN y/o ARN a tales superficies es muy baja.

Con el fin de mejorar la selectividad y el funcionamiento de la técnica, especialmente cuando están disponibles solamente cantidades mínimas de una muestra, pueden utilizarse adicionalmente sondas oligonucleotídicas específicas para genes o secuencias de nucleótidos particulares, opcionalmente junto con un lavado riguroso. Así, puede introducirse en la muestra una sonda específica que se una a una secuencia diana específica. Para facilitar el aislamiento del ácido nucleico diana de la muestra, puede proporcionarse al soporte sólido un medio para la captura de la sonda. Generalmente, esto se llevará a cabo proporcionando a la sonda y al soporte un miembro de un par de parejas de unión por afinidad correspondientes, de tal manera que la sonda y el soporte pueden ser unidos selectivamente, y si se desea, reversiblemente. Muy convenientemente, la pareja de unión por afinidad comprenderá biotina y avidina/estreptavidina, estando unida la biotina a la sonda y la avidina/estreptavidina al soporte. Las sondas oligonucleotídicas marcadas con biotina y las partículas magnéticas revestidas con estreptavidina están disponibles comercialmente (Dynal AS).

Pueden utilizarse sin embargo otros sistemas de parejas de unión, por ejemplo proteínas de unión a ADN que se unen a regiones específicas de la sonda oligonucleotídica, por ejemplo, la proteína Lac I represora de lac que se une a un sitio del operador lac (LacOP) que puede ser proporcionado en la sonda. Alternativamente, la sonda oligonucleotídica puede estar marcada con un hapteno tal como digoxigenina, y el soporte puede estar provisto de un anticuerpo anti-hapteno. Las técnicas para marcar oligonucleótidos con haptenos tales como digoxigenina son bien conocidas en el oficio, igual que lo son los métodos para unir anticuerpos a soportes sólidos.

Tal sistema es especialmente adecuado para la preparación de muestras que contengan secuencias de ácido nucleico diana específicas de interés, para reacciones de amplificación. En particular, nosotros hemos demostrado que donde fallaron los métodos de la técnica anterior basados en el aislamiento del ADN diana para PCR mediante la utilización de sondas específicas marcadas con biotina unidas a esferas magnéticas revestidas con estreptavidina, por ejemplo en el caso de muestras que contenían sangre, o de muestras antiguas o fijadas, el método de la presente invención ha funcionado con éxito.

De acuerdo con un aspecto más, la presente invención proporciona por tanto un método para preparar una muestra de ácido nucleico para amplificación in vitro, comprendiendo dicho método, secuencialmente o simultáneamente, la puesta en contacto de dicha muestra con una sonda oligonucleotídica específica para una secuencia de nucleótidos diana en dicha muestra, y el aislamiento del ácido nucleico de dicha muestra mediante un método descrito anteriormente, en el que la sonda oligonucleotídica y el soporte sólido están provistos cada uno de un miembro de un par de parejas de unión por afinidad, mediante lo cual la sonda, y por tanto la secuencia de nucleótidos diana, se une al soporte.

Considerado alternativamente, este aspecto de la invención proporciona un método de amplificación del ácido nucleico de una muestra, comprendiendo dicho método las etapas de (a) la puesta en contacto, secuencialmente o simultáneamente, de dicha muestra con una sonda oligonucleotídica específica para una secuencia de nucleótidos diana de dicha muestra, y el aislamiento del ácido nucleico de dicha muestra mediante un método descrito anteriormente, en el que la sonda oligonucleotídica y el soporte sólido están provistos cada uno de un miembro de un par de parejas de unión por afinidad, mediante lo cual la sonda, y por tanto la secuencia de nucleótidos diana, se une al soporte, y (b) el sometimiento del ácido nucleico aislado mediante la etapa (a) a una reacción de amplificación in vitro.

Convenientemente, puede dejarse enfriar la muestra en presencia de un soporte sólido, mediante lo cual el ácido nucleico se condensa sobre o en el soporte.

Generalmente, según se mencionó anteriormente, el par de parejas de unión por afinidad comprenderá biotina/estreptavidina. Este sistema de parejas de unión es utilizado comúnmente en aplicaciones de biología molecular y se conocen muchos métodos para incorporar o fijar biotina y estreptavidina a la sonda/soporte, respectivamente. Así, por ejemplo, la biotina puede ser incorporada por, y la estreptavidina puede ser revestida sobre, el soporte según está discutido por Dynal AS en su "Technical hanbook, molecular biology". La longitud de la sonda oligonucleotídica no es crítica pero puede estar convenientemente en el rango de 10-200 nucleótidos, más preferiblemente de 15-50 nucleótidos.

En el caso en el que el soporte sólido esté en forma de partículas, la funcionalización de las partículas y la unión posterior de las sondas es convenientemente de tal manera que cada partícula lleve 10^{3}-10^{6} sondas o sitios de unión de sondas.

Se han desarrollado varias técnicas de amplificación in vitro y pueden ser utilizadas de acuerdo con la presente invención. La PCR y sus modificaciones, por ejemplo la utilización de cebadores anidados, será sin embargo la técnica principal a utilizar generalmente.

En la PCR clásica se requieren dos cebadores y éstos pueden ser específicos para una secuencia de ADN diana de interés, o uno o dos cebadores de PCR estándar. Ésta puede necesitar la introducción de un sitio de hibridación para un cebador de PCR estándar de acuerdo con técnicas bien conocidas en el oficio, por ejemplo mediante restricción y ligadura.

La PCR anidada implica la utilización de dos cebadores adicionales denominados "internos", que hibridan o "anidan" entre el primer par de cebadores "externos" en una segunda serie de ciclos de amplificación. La utilización de cuatro acontecimientos separados de cebado tiene como resultado una especificidad incrementada de la reacción de amplificación.

La técnica de cebadores anidados ha sido modificada posteriormente en el sistema DIANA (Detección de Ácidos Nucleicos Amplificados Inmovilizados) (ver Wahlberg y col., Mol. Cell Probes 4: 285 (1990)), en el cual el segundo par de cebadores internos lleva, respectivamente, un medio de inmovilización para permitir la captura del ADN amplificado, y una marca o un medio para la fijación de una marca con el fin de permitir el reconocimiento. Esto proporciona la doble ventaja de una señal de fondo reducida y de un medio rápido y fácil para detectar el ADN amplificado.

Otras técnicas de amplificación que merece la pena mencionar incluyen la Replicación de Secuencias Automantenidas (SSR), el sistema de amplificación de la replicasa Q-beta y la Reacción de Amplificación de la Ligasa (LAR).

En SSR, se utilizan cebadores que llevan sitios de unión de polimerasa que permiten la acción de la transcriptasa inversa para amplificar ARN o ADNhs diana.

En el sistema de la replicasa Q-beta, una sonda inmovilizada captura una hebra del ADN diana y posteriormente se hace que hibride con una sonda de ARN que lleva como región molde una estructura terciaria conocida como MDV-1 para una ARN polimerasa dirigida por ARN, normalmente la replicasa Q-beta.

La LAR hibrida dos sondas oligonucleotídicas en posiciones adyacentes sobre el ácido nucleico diana de tal manera que la ligadura, utilizando por ejemplo ligasa de T4, produce una secuencia más larga, la cual después de la separación de las hebras puede funcionar como molde para hibridaciones y ligaduras posteriores.

En los métodos de la invención, el orden en el que se realizan las diferentes etapas no es crítico y son posibles variaciones y modificaciones. Por ejemplo, el soporte sólido puede ser añadido a la muestra antes de la etapa de ebullición/calentamiento o después de la etapa de ebullición/calentamiento. Los cebadores/sondas requeridos para la amplificación pueden ser añadidos igualmente antes de la etapa de ebullición, inmediatamente después de la ebullición/calentamiento o después de la etapa de condensación por enfriamiento.

La utilización de partículas magnéticas como soportes sólidos facilita particularmente las etapas de lavado y separación y tiene una ventaja significativa en cuanto a que todas las reacciones, incluyendo la amplificación, pueden ser realizadas en un recipiente de reacción, simplificando de este modo considerablemente el proceso de reacción y evitando la pérdida de fragmentos de ácido nucleico que se adhieren a las paredes del recipiente.

La ebullición/calentamiento de la muestra puede tener lugar en cualquier medio conocido o convencional conocido en la técnica para manipulación de ácidos nucleicos. Así, por ejemplo, se conocen muchos tampones típicos, por ejemplo tampones de lavado, y pueden ser utilizados. Generalmente, se prefiere la utilización de medios acuosos con alto contenido en sal (por ejemplo 1-4 M). Tampones ejemplares incluyen soluciones salinas tamponadas con Tris y el tampón de Unión y Lavado de Dynal AS (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 2,0 M, pH 7,5) es particularmente adecuado. Pueden utilizarse tampones similares para cualquier etapa de lavado intermedia que pueda ser requerida. Se ha encontrado favorable incluir sal, por ejemplo NaCl de 1 a 4 M, preferiblemente NaCl 2 M, en el medio de ebullición.

Los tiempos de incubación para la etapa de ebullición/calentamiento pueden variar entre 10 segundos y varias horas, más convenientemente entre 1 y 15 minutos. Así, por ejemplo, se han alcanzado resultados favorables calentando muestras a una temperatura de 80 a 100ºC durante un periodo de 10 minutos o, en algunos casos, de 3 a 5 minutos.

El enfriamiento puede tener lugar simplemente dejando reposar la muestra a temperatura ambiente durante, por ejemplo, un periodo de 3 a 20 minutos.

En el caso en el que se utilicen sondas oligonucleotídicas específicas, puede ser posible controlar hasta cierto punto el grado de fragmentación del ácido nucleico y el nivel de desnaturalización y condensación del ácido nucleico y por tanto el grado de especificidad, reduciendo la duración y/o la temperatura de la etapa de ebullición/calentamiento.

Se ha encontrado que los métodos de la invención funcionan con éxito con volúmenes de muestra de 0,1 \mul a 100 ml. Generalmente, se prefieren volúmenes de muestra pequeños de 1 a 100 \mul, por ejemplo de 10 a 20 \mul. En el caso de que se utilicen partículas como soporte sólido, pueden utilizarse convenientemente cantidades de 1 a 500 \mug, preferiblemente de 20 a 200 \mug.

La capacidad del método de la invención para ser realizado con tales pequeñas cantidades de muestra es de particular beneficio, ya que la cantidad de muestra disponible es a menudo muy limitada, por ejemplo con biopsias con aguja y muestras forenses o cuando es importante mantener la muestra para un estudio posterior.

Cuando se utiliza una sonda oligonucleotídica para incrementar la especificidad, pueden utilizarse cantidades de 0,1 pmoles a 50 pmoles, por ejemplo de 1 a 5 pmoles.

Los componentes requeridos para llevar a cabo el método de la invención pueden ser suministrados convenientemente en forma de kits, y tales kits constituyen un aspecto adicional de la invención. En una realización preferida, tal kit contendrá generalmente los reactivos necesarios para identificar segmentos génicos particulares de cualquier tipo de muestra dada, y ejemplos particulares de tales kits serían para la amplificación selectiva de genes ras o HLA o sus mutaciones, por ejemplo K-ras y sus mutaciones puntuales de los codones 12/13. Típicamente, tales kits incluirán esferas magnéticas para la condensación del ácido nucleico; un medio acuoso, por ejemplo solución salina tamponada, para la etapa de tratamiento con calor; cebadores de los extremos 5' y 3', los enzimas polimerasa del ácido nucleico y de restricción para la amplificación por PCR y, si se desea para el ensayo de RFLP; y, opcionalmente, sondas oligonucleotídicas conjugadas o conjugables a las esferas (por ejemplo sondas biotiniladas que sean conjugables a esferas revestidas con estreptavidina) que hibriden con toda o con parte de la secuencia génica o con las secuencias adyacentes.

Según se mencionó anteriormente, el método de la invención tiene varios usos y aplicaciones. Estos incluyen, por ejemplo, la detección de patógenos, de enfermedades y de variaciones alélicas. Muestras clínicas pueden ser sometidas a cribado por información epidemiológica. Una utilización principal propuesta es en el análisis de muestras clínicas recogidas en lugares remotos que son transportadas a laboratorios de referencia; las muestras de sangre pueden ser por ejemplo enviadas directamente por correo sin refrigeración una vez que haya tenido lugar la condensación del ácido nucleico y la depuración del plasma y los fragmentos celulares. De este modo, las muestras pueden ser tratadas in situ mediante la sencilla etapa de ebullición para condensar el ácido nucleico sobre un soporte sólido antes de eliminar mediante lavado de la muestra otros restos y el transporte
posterior.

La técnica tiene también utilidad en medicina forense y en todas las disciplinas en las que se requiera el almacenamiento de la muestra o espécimen, por ejemplo en zoología, botánica, biología de conservación y evolutiva, en el estudio de la diversidad biológica o de procesos ecológicos.

La invención será descrita ahora mediante los Ejemplos no limitantes siguientes, con referencia a las figuras en las cuales:

La Figura 1 muestra:

(a) los resultados de la electroforesis en gel después del análisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) de los productos de PCR del Ejemplo 1:

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Calle 1: \+ ADN marcador.\cr  Calle 2: \+ PCR de ADN aislado
magnéticamente  de\cr  \+ una pequeña cantidad de tejido tumoral\cr 
\+ fijado.\cr  Calle 3: \+ PCR de 5  \mu l de líquido procedente de
una\cr  \+ muestra llevada a ebullición.\cr  Calle 4: \+ PCR de 1
 \mu g de ADN control mutado\cr  \+ (control positivo).\cr  Calle 5:
\+ PCR sin ADN (control
negativo);\cr}

(b) electroforesis en gel que muestra los resultados de la secuenciación en fase sólida del producto de PCR mutado (mutación del gen ras) (Calle 2 de la Figura 1 (a)); mutación indicada por una flecha.

La Figura 2 muestra:

(a) los resultados de la electroforesis en gel después del análisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) de los productos de PCR del Ejemplo 2:

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Calle 1: \+ ADN marcador.\cr  Calle 2: \+ PCR de ADN aislado
magnéticamente\cr  \+ de una muestra de sangre.\cr  Calle 3: \+ PCR
de 5  \mu l de líquido de una muestra\cr  \+ llevada a
ebullición.\cr  Calle 4: \+ PCR de 1  \mu g de ADN control
(control\cr  \+ positivo).\cr  Calle 5: \+ PCR sin ADN (control
negativo);\cr}

(b) electroforesis en gel que muestra los resultados de la secuenciación en fase sólida del producto de PCR mutado (secuencia del gen HLA-DQB) (Calle 2 de la Figura 2 (a)).

Ejemplo 1 Identificación de una mutación de K-ras procedente de cáncer pancreático

Dos láminas de 5 \mum de espesor son cortadas del bloque de parafina de una biopsia con aguja fijada en formalina e incluida en parafina procedente de un cáncer pancreático y añadidas a 400 \mul de tampón de Unión y Lavado (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, NaCl 2,0 M) que contenía 3 pmoles de un oligonucleótido biotinilado (por ejemplo, 5'-B-ACTGA ATATA AACTT GTGGT AGTTG GACCT-3') complementario al extremo 5' del segmento del gen

\hbox{K-ras.}

Los tubos son incubados a 94ºC durante 5 minutos y el contenido es mezclado dos veces en un mezclador vórtex durante 20 segundos durante esta incubación.

Cuando los tubos han sido enfriados hasta temperatura ambiente en un ciclador térmico durante 3 minutos aproximadamente, la fase líquida es retirada con una pipeta y mezclada con 20 \mug de esferas paramagnéticas revestidas con estreptavidina (Dynabeads® M-280 estreptavidina, Dynal, Noruega).

La mezcla se deja a temperatura ambiente durante 15 minutos.

Las esferas son aisladas por separación magnética (Dynal MPC®-E, Dynal, Noruega) y añadidas como molde a una mezcla de reacción de PCR específica para K-ras (utilizando por ejemplo los cebadores de los extremos 5' y 3', 5'-ACTGA ATATA AACTT GTGGT AGTTG GACCT-3' y 5'-TCAAA GAATG GTCCT GGAAC-3', y ADN polimerasa Taq). Se utilizan como molde 5 \mul del líquido llevado a ebullición, recogidos antes de añadir las esferas, en un procedimiento control paralelo.

Se realizan tres PCRs seriadas con dos destrucciones intermedias de alelos no mutados por una endonucleasa específica (por ejemplo, Bst NI).

Para el análisis de RFLP los productos de amplificación son digeridos, por ejemplo con Bst NI, y analizados utilizando electroforesis en gel. Los resultados están mostrados en la Figura 1a. Se obtuvo un producto de amplificación detectable (Calle 2) de la PCR en la que las esferas que llevaban ADN sirvieron como molde, pero no cuando se utilizó el líquido llevado a ebullición sin esferas (Calle 3).

El producto de la PCR es identificado como mutado por RFLP, y la secuencia de nucleótidos fue determinada mediante secuenciación en fase sólida (Figura 1b), indicando la presencia de una mutación puntual en el codón 12.

La amplificación por PCR convencional y los ensayos de RFLP para oncogenes ras han sido discutidos en varias publicaciones y los cebadores y enzimas utilizados convencionalmente pueden ser empleados en el método de la invención. Tales publicaciones incluyen Kahn y col., Amplifications 4:22-26 (1990), Chen y col., Anal. Biochem. 195:51-56 (1991), Kahn y col., Oncogene 6:1079-1083 (1991), Haliassos y col., Nucleic Acids Research 17:3606 (1989) y Kumar y col., Oncogene 3:647-651 (1988).

Ejemplo 2 Tipificación del HLA de una muestra de sangre antigua

Se añadieron 10 \mul de EDTA-sangre, almacenada a temperatura ambiente durante 7 días, a 200 \mul de tampón de Unión y Lavado (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, NaCl 2,0 M) mezclado con 20 \mug de esferas paramagnéticas (Dynabeads® M-450, Dynal, Noruega). Se preparó una muestra control paralela sin esferas.

Los tubos fueron incubados a 94ºC durante 10 minutos y enfriados hasta temperatura ambiente.

Las esferas fueron aisladas por separación magnética (Dynal MPC®-E, Dynal, Noruega) y se añadieron a una mezcla de reacción de PCR específica para HLA-DQB (utilizando por ejemplo los cebadores de los extremos 5' y 3', DQ-AMP A: 5'-GCATG TGCTA CTTCA CCAAC G-Biotina 3' y DQ-AMP B: 5'-CAGGT AGTTG TGTCT GCACA C-3', y ADN polimerasa Taq). Se utilizaron 5 \mul de la solución de la muestra preparada sin esferas como molde en un procedimiento control paralelo.

Se realizó una PCR de 30 ciclos.

Para el análisis de RFLP, los productos de amplificación fueron analizados utilizando electroforesis en gel. Los resultados se muestran en la Figura 2a.

Se obtuvo un producto de amplificación detectable (Columna 2) de la PCR en la que las esferas que llevaban ADN sirvieron como molde, pero no cuando se utilizó líquido llevado a ebullición sin esferas (Columna 3).

La secuencia de nucleótidos fue determinada mediante secuenciación en fase sólida (Figura 2b).

Etapas del método general

Para utilización en la amplificación de fragmentos de ácido nucleico, el método de la invención puede ser por tanto efectuado convenientemente utilizando las etapas siguientes:

Etapa 1

Liberación del ácido nucleico de la muestra mediante ebullición/calentamiento en presencia (Ejemplo 2) o ausencia (Ejemplo 1) de un soporte sólido y en presencia (Ejemplo 1) o ausencia (Ejemplo 2) de una sonda oligonucleotídica.

Etapa 2

Unión del ácido nucleico a un soporte sólido.

a) Enfriamiento en presencia del soporte sólido (Ejemplo 2).

b) Adición del soporte sólido al líquido enfriado (Ejemplo 1).

Etapa 3

Aislamiento del soporte sólido con el ácido nucleico unido (por ejemplo, separación magnética).

Etapa 4

Soporte sólido con el ácido nucleico unido utilizado como molde en una reacción de amplificación posterior.

Claims

1. Un método para aislar un ácido nucleico de una muestra fijada o antigua, comprendiendo dicho método la ebullición de dicha muestra o el calentamiento de dicha muestra a una temperatura elevada con el fin de liberar el ácido nucleico, dejándola luego enfriar, y la unión del ácido nucleico sobre un soporte sólido con un área de superficie elevada.

2. Un método para aislar un ácido nucleico de una muestra, comprendiendo dicho método la ebullición de dicha muestra o el calentamiento de dicha muestra a una temperatura elevada con el fin de liberar el ácido nucleico, dejándola luego enfriar, y la unión del ácido nucleico sobre un soporte sólido con un área de superficie elevada que comprende partículas magnéticas.

3. Un método como el reivindicado en la reivindicación 1 ó 2, en el que la muestra es llevada a ebullición.

4. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el ácido nucleico es ADN.

5. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la muestra es una muestra clínica.

6. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la muestra está fijada.

7. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la muestra es antigua.

8. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la etapa de ebullición/calentamiento es efectuada mediante el calentamiento de la muestra a al menos 80ºC.

9. Un método como el reivindicado en la reivindicación 8, en el que la muestra es calentada durante 10 segundos a 1 hora.

10. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el soporte es añadido a la muestra antes de o durante la etapa de ebullición/calentamiento.

11. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el soporte es añadido a la muestra después de la etapa de ebullición/calentamiento.

12. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que las etapas de ebullición/calentamiento y/o enfriamiento y/o condensación son llevadas a cabo en una solución acuosa con alta concentración de sal.

13. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el soporte sólido es particulado.

14. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el soporte sólido comprende partículas magnéticas.

15. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende además la adición a la muestra de una sonda oligonucleotídica específica para el ácido nucleico diana, y la provisión al soporte de un medio para la captura de la sonda.

16. Un método para preparar una muestra de ácido nucleico para amplificación in vitro, comprendiendo dicho método la puesta en contacto, secuencialmente o simultáneamente, de dicha muestra con una sonda oligonucleotídica específica para una secuencia de nucleótidos diana en dicha muestra, y el aislamiento del ácido nucleico de dicha muestra mediante un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que la sonda oligonucleotídica y el soporte sólido están provistos cada uno de un elemento de un par de parejas de unión por afinidad, mediante lo cual la sonda, y por tanto la secuencia de nucleótidos diana, se une al soporte.

17. Un método para amplificar un ácido nucleico en una muestra, comprendiendo dicho método las etapas de (a) la puesta en contacto, secuencialmente o simultáneamente, de dicha muestra con una sonda oligonucleotídica específica para una secuencia de nucleótidos diana en dicha muestra, y el aislamiento del ácido nucleico de dicha muestra mediante un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que la sonda oligonucleotídica y el soporte sólido están provistos cada uno de un miembro de un par de parejas de unión por afinidad, mediante lo cual la sonda, y por tanto la secuencia de nucleótidos diana, se une al soporte, y (b) el sometimiento del ácido nucleico aislado mediante la etapa (a) a una reacción de amplificación in vitro.