ES2207123T3 - Microesferas de liberacion sostenida. - Google Patents

Microesferas de liberacion sostenida.

Info

Publication number
ES2207123T3
ES2207123T3 ES99304616T ES99304616T ES2207123T3 ES 2207123 T3 ES2207123 T3 ES 2207123T3 ES 99304616 T ES99304616 T ES 99304616T ES 99304616 T ES99304616 T ES 99304616T ES 2207123 T3 ES2207123 T3 ES 2207123T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
microspheres
agents
microsphere
polymer
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES99304616T
Other languages
English (en)
Inventor
Terence L. Scott
Larry R. Brown
Frank J. Riske
Charles D. Blizzard
Julia Rashba-Step
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Baxter Healthcare SA
Baxter International Inc
Original Assignee
Baxter Healthcare SA
Baxter International Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Baxter Healthcare SA, Baxter International Inc filed Critical Baxter Healthcare SA
Application granted granted Critical
Publication of ES2207123T3 publication Critical patent/ES2207123T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1682—Processes
    • A61K9/1694—Processes resulting in granules or microspheres of the matrix type containing more than 5% of excipient
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/1652—Polysaccharides, e.g. alginate, cellulose derivatives; Cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/1658—Proteins, e.g. albumin, gelatin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)

Abstract

Una microesfera que comprende: (a) una macromolécula; y (b) al menos un polímero hidrosoluble; en la que la microesfera presenta una superficie lisa que incluye una pluralidad de aberturas de canal, teniendo cada una de estas aberturas de canal un diámetro inferior a 0, 1 m (1.000 angstrom), y en la que la microesfera no es un hidrogel.

Description

Microesferas de liberación sostenida.
Esta invención se refiere a métodos y composiciones para formar y usar microesferas de liberación retardada. Las microesferas son porosas e incluyen una pluralidad de aberturas de canal con un diámetro inferior a 1.000 angstrom.
Las micropartículas, microesferas y microcápsulas, denominadas en la presente memoria colectivamente "micropartículas", son partículas sólidas o semisólidas con un diámetro inferior a un milímetro, más preferentemente inferior a 100 micrómetros, que pueden estar formadas por una diversidad de materiales, incluidos polímeros sintéticos, proteínas y polisacáridos. Las micropartículas se han usado en muchas aplicaciones diferentes, principalmente en separaciones, diagnóstico y administración de fármacos.
Los ejemplos más conocidos de micropartículas usadas en las técnicas de separación son aquellas formadas por polímeros de origen sintético o proteico, tales como poliacrilamida, hidroxiapatito o agarosa. Estas micropartículas poliméricas se usan comúnmente para separar moléculas, tales como proteínas, en función del peso molecular y/o de la carga iónica o por interacción con moléculas químicamente acopladas a las micropartículas.
En el área del diagnóstico, las micropartículas se usan con frecuencia para inmovilizar una enzima, un sustrato para una enzima o un anticuerpo marcado, que después se hace interactuar, tanto directa como indirectamente, con una molécula que se ha de detectar.
En el área de la administración controlada de fármacos, las moléculas se encapsulan dentro de las micropartículas o se incorporan en una matriz monolítica para la liberación posterior. Se usan rutinariamente numerosas técnicas diferentes para preparar estas micropartículas a partir de polímeros sintéticos, polímeros naturales, proteínas y polisacáridos, que incluyen la separación de fases, la evaporación del disolvente, la emulsión y el secado por pulverización. En general, los polímeros forman la estructura de soporte de estas microesferas y el fármaco de interés se incorpora en la estructura polimérica. Ejemplos de polímeros usados para la formación de microesferas incluyen homopolímeros y copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico (PLGA), como se describe en la patente de Estados Unidos nº 5.213.812 de Ruiz, la patente de Estados Unidos nº 5.417.986 de Reid et al., la patente de Estados Unidos nº 4.530.840. de Tice et al., la patente de Estados Unidos nº 4.897.268 de Tice et al., la patente de Estados Unidos nº 5.075.109 de Tice et al., la patente de Estados Unidos nº 5.102.872 de Singh et al., la patente de Estados Unidos nº 5.384.133 de Boyes et al., la patente de Estados Unidos nº 5.360.610 de Tice et al., y la solicitud de patente europea con el número de publicación 248.531 del Southern Research Institute; copolímeros de bloques tales como tetronic 908 y poloxámero 407, como se describe en la patente de Estados Unidos nº 4.904.479 de Ilium; y polifosfacenos como se describe en la patente de Estados Unidos nº 5.149.543 de Cohen et al.. Las microesferas producidas usando polímeros como éstos muestran una baja capacidad de carga y a menudo sólo son capaces de incorporar un pequeño porcentaje del fármaco de interés en la estructura polimérica. Por lo tanto, a menudo se han de administrar cantidades sustanciales de microesferas para lograr un efecto terapéutico.
La solicitud de patente europea con el número de publicación 0357401A describe matrices de hidrogel biodegradables para la liberación controlada de agentes farmacológicamente activos. La matriz se forma reticulando un componente proteico y un polisacárido y cargándola después con un fármaco seleccionado. También se describe la preparación de microesferas reticuladas.
Desde hace muchos años están disponibles en el mercado perlas o partículas esféricas como herramienta para los bioquímicos. Por ejemplo, los anticuerpos conjugados a perlas crean partículas relativamente grandes, específicas de ligandos concretos. Las grandes partículas recubiertas de anticuerpos se usan de forma rutinaria para reticular receptores en la superficie de una célula para la activación celular, se unen a una fase sólida para la purificación por inmunoafinidad y se pueden usar para administrar un agente terapéutico que se libera lentamente en el tiempo usando anticuerpos específicos de tejidos o tumores conjugados a las partículas para dirigir el agente al lugar deseado.
El método más común de unir covalentemente un anticuerpo a una matriz de fase sólida es derivatizar una perla con un agente de conjugación químico y unir después el anticuerpo a la perla activada. El uso de una perla polimérica sintética en lugar de una molécula proteica permite el uso de condiciones de derivatización más rigurosas que las que pueden soportar muchas proteínas, es relativamente barato y a menudo produce una unión que es estable en un amplio intervalo de condiciones desnaturalizantes. En el mercado están disponibles numerosas perlas derivatizadas, todas ellas con diversos constituyentes y tamaños. Las perlas formadas a partir de polímeros sintéticos, tales como poliacrilamida, poliacrilato, poliestireno o látex, se pueden adquirir en el mercado de numerosas fuentes, tales como Bio-Rad Laboratories (Richmond, California) y LKB Produkter (Estocolmo, Suecia). La perlas formadas a partir de macromoléculas y partículas naturales, tales como agarosa, agarosa reticulada, globulina, ácido desoxirribonucleico y liposomas, se pueden adquirir en el mercado de fuentes tales como Bio-Rad Laboratories, Pharmacia (Piscataway, N.J.) e IBF (Francia). Las perlas formadas a partir de copolímeros de poliacrilamida y agarosa se pueden adquirir en el mercado de fuentes tales como IBF y Pharmacia. Las perlas magnéticas se pueden adquirir en el mercado de fuentes tales como Dynal Inc. (Great Neck, N.Y.).
Un inconveniente de las micropartículas o perlas actualmente disponibles reside en que son difíciles y caras de producir. Las micropartículas producidas mediante estos métodos conocidos presentan una amplia distribución de tamaños de partícula, a menudo carecen de uniformidad y no son capaces de mostrar cinéticas de liberación a largo plazo cuando la concentración de los ingredientes activos es alta. Además, los polímeros usados en estos métodos conocidos se disuelven en disolventes orgánicos con el fin de formar microesferas. Las microesferas, por lo tanto, deben ser producidas en instalaciones especiales diseñadas para manejar disolventes orgánicos. Estos disolventes orgánicos pueden desnaturalizar las proteínas o péptidos contenidos en las micropartículas. Los disolventes orgánicos residuales pueden resultar tóxicos cuando se administran a humanos o animales.
Además, las micropartículas disponibles raras veces presentan un tamaño suficientemente pequeño para caber a través de la abertura del tamaño de aguja usado comúnmente para administrar los agentes terapéuticos o para ser útiles para la administración por inhalación. Por ejemplo, las micropartículas preparadas usando ácido poli(láctico-glicólico) (PLGA) son grandes y tienen una tendencia a agregarse. Para eliminar las partículas demasiado grandes para inyección, es necesaria una etapa de selección de tamaños que da lugar a una pérdida de producto. Las partículas de PLGA que presentan un tamaño adecuado para inyección deben ser administradas a través de una aguja de gran calibre para acomodar el gran tamaño de partícula, causando a menudo molestias al paciente.
Generalmente, todas las microesferas actualmente disponibles son activadas para liberar su contenido en medio acuoso y, por lo tanto, han de ser liofilizadas para evitar la liberación prematura. Además, las partículas tales como las que se preparan usando el sistema PLGA presentan cinéticas de liberación basadas tanto en la erosión como en la difusión. En este tipo de sistema se observa un derrame inicial o liberación rápida del fármaco. Este efecto de derrame puede conducir a efectos secundarios no deseados en los pacientes a los que se han administrado las partículas.
Actualmente, están disponibles micropartículas preparadas usando lípidos para encapsular los fármacos diana. Por ejemplo, se pueden usar lípidos ordenados en membranas bicapa que rodean múltiples compartimentos acuosos para formar partículas para encapsular fármacos hidrosolubles para la administración posterior, según se describe en la patente de Estados Unidos nº 5.422.120 de Sinil Kim. Estas partículas generalmente presentan un tamaño mayor que 10 \mum y están diseñadas para la administración intraarticular, intratecal, subcutánea y epidural. De forma alternativa, se han usado liposomas para la administración intravenosa de moléculas pequeñas. Los liposomas son partículas esféricas compuestas por una o múltiples bicapas de fosfolípido y colesterol. Los liposomas presentan un tamaño de 30 \mum o mayor y pueden portar una diversidad de fármacos hidrosolubles o liposolubles. La tecnología de liposomas se ha visto obstaculizada por problemas que incluyen la pureza de los componentes lipídicos, la posible toxicidad, la heterogeneidad y estabilidad de las vesículas, la incorporación excesiva y dificultades de fabricación o de vida útil.
Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de desarrollar nuevos métodos para preparar micropartículas, concretamente aquellas que se puedan adaptar para el uso en las áreas de separaciones, diagnóstico y administración de fármacos. Preferentemente, tales micropartículas mejoradas deberían permitir la liberación retardada de agentes activos de una manera constante y predecible.
La invención resuelve estos y otros problemas proporcionando métodos y composiciones para la liberación retardada de agentes terapéuticos y/o de diagnóstico in vivo e in vitro. La expresión "agente terapéutico" como se usa en adelante en la presente memoria pretende incluir agentes clínicos que se pueden administrar en forma de microcápsulas, tanto si se usan principalmente para tratamiento o para diagnóstico.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona una microesfera que presenta una superficie lisa que incluye una pluralidad de aberturas de canal. Las aberturas de canal tienen un diámetro inferior a 1.000 angstrom, determinado mediante la técnica de adsorción de gas para medir el tamaño de poro. Las microesferas de la invención incluyen una macromolécula, preferentemente una proteína o un ácido nucleico, y al menos un polímero hidrosoluble. En general, las microesferas se forman poniendo en contacto la macromolécula y al menos un polímero hidrosoluble en condiciones acuosas para formar las microesferas, y las microesferas se estabilizan a continuación por reticulación química o por exposición de las microesferas a una fuente de energía, preferentemente calor, o por ambas cosas, a una temperatura que conduce a microesferas que son resistentes en estas condiciones a tratamientos físicos y químicos, tales como sonicación y soluciones cáusticas. Aunque no se desea vincularse a ninguna teoría o mecanismo particular, se cree que las microesferas se forman durante la etapa de mezclado; sin embargo, tales microesferas formadas inicialmente son transitorias y requieren una etapa adicional (por ejemplo, la inclusión de un agente reticulador en la mezcla y/o la aplicación de calor u otra fuente de energía) para estabilizar las microesferas formadas de forma transitoria. Las condiciones concretas para la formación de las microesferas representativas de la invención se describen en los ejemplos. En las realizaciones preferidas, la reacción de formación se realiza en ausencia de adición de aceites o disolventes orgánicos. Aceite se define como sustancia que es grasa líquida insoluble en agua.
El componente proteico de la microesfera puede ser una proteína portadora o una proteína terapéutica (véase, por ejemplo, la Tabla 1). Como se usa en la presente memoria, una "proteína portadora" se refiere a una proteína que presenta un peso molecular de al menos aproximadamente 1.500 y que existe en forma de estructura tridimensional. La proteína portadora puede ser también una proteína terapéutica, es decir, una proteína que tiene una actividad terapéutica; sin embargo, la expresión "proteína portadora" en general se usará en esta solicitud para hacer referencia a una proteína que desempeña la función principal de proporcionar una estructura tridimensional con el fin de formar una microesfera, aunque la proteína portadora también pueda desempeñar una función secundaria como agente terapéutico. En ciertas realizaciones preferidas, la proteína portadora es albúmina, concretamente albúmina de suero humana. Las microesferas proteicas de la invención además incluyen opcionalmente un agente terapéutico, tal como un esteroide (por ejemplo, estradiol, testosterona, prednisolona, dexametasona, hidrocortisona, base de lidocaína, base de procaína) o cualquier otra entidad química de este tipo que se sabe se une a la proteína, preferentemente albúmina, tal como GCSF o paclitaxel. En otras realizaciones más (comentadas más adelante), las microesferas de la invención incluyen además un agente complejante y, más preferentemente, un agente terapéutico (preferentemente un péptido) que se asocia con el agente complejante por medio de una interacción iónica o no iónica. En ciertas realizaciones, la proteína que compone la matriz es una proteína terapéutica (por ejemplo, una hormona tal como la insulina o la hormona de crecimiento humana) y la microesfera se construye y ordena para proporcionar una liberación retardada de la proteína terapéutica in vivo. Más preferentemente, la microesfera se construye y ordena para proporcionar una liberación retardada del agente terapéutico sin un hinchamiento significativo de la microesfera.
Sorprendentemente, la superficie de la microesfera es diferente del interior. El lavado extenso de las microesferas fracturadas por congelación con agua disuelve la mayoría del material de la matriz de la microesfera, dejando una cáscara fina. Además, la superficie de la microesfera es lisa; las aberturas de canal (poro) presentan un diámetro inferior a 1.000 angstrom, determinado mediante la técnica de adsorción de gas para medir el tamaño de poro usando, por ejemplo, la tecnología BET para el análisis de datos.
En general, las microesferas de la invención se forman mezclando la macromolécula, preferentemente una proteína o un ácido nucleico, junto con al menos un polímero hidrosoluble en condiciones que permitan al polímero hidrosoluble eliminar agua de ("deshidratar") la macromolécula, en relaciones especificadas o preferidas entre la macromolécula y el polímero hidrosoluble. Como se usa en la presente memoria, un "polímero hidrosoluble" de la invención se refiere a un polímero o mezcla de polímeros que es capaz de eliminar agua de o deshidratar la macromolécula, o que es capaz de causar de otro modo una exclusión de volumen. Por lo tanto, el procedimiento preferido implica la exclusión de volumen usando un sistema completamente acuoso sin la implicación de aceite o disolventes orgánicos.
Los polímeros hidrosolubles adecuados incluyen polímeros solubles lineales o ramificados, preferentemente aquellos que presentan un alto peso molecular. Los polímeros pueden ser altamente hidrosolubles, moderadamente hidrosolubles o ligeramente hidrosolubles (hidrosolubilidad mayor que 2% p/v). Los polímeros hidrosolubles preferidos son hidrosolubles o solubles en un disolvente miscible con agua. Los polímeros hidrosolubles se pueden solubilizar disolviéndolos primero en un disolvente miscible con agua y combinando después la solución de polímeros con un disolvente acuoso. En las realizaciones especialmente preferidas, los polímeros hidrosolubles de la invención se seleccionan entre los polímeros hidrosolubles identificados en la Tabla 2. En ciertas realizaciones, las microesferas de la invención están compuestas por proteínas y polímeros hidrosolubles y contienen de 40 a menos de 100% en peso de proteína. El producto final de microesfera, que se ha estabilizado usando un agente reticulador y/o por exposición a una fuente de energía tal como calor, no se hincha significativamente en presencia de agua (es decir, no es un hidrogel). En las realizaciones especialmente preferidas, el polímero hidrosoluble es un polímero basado en carbohidratos. Por lo tanto, en ciertas realizaciones preferidas, la microesfera comprende: (1) una proteína, preferentemente albúmina; y (2) un polímero hidrosoluble basado en carbohidratos, preferentemente hidroxietilalmidón, en la que la proteína representa al menos 40% y menos de 100% en peso de la microesfera. Preferentemente, el polímero basado en carbohidratos representa más de 0% y menos de o igual a 30% en peso de la microesfera. En estas y otras realizaciones, las microesferas además comprenden preferentemente un agente activo, preferentemente una hormona liberadora de la hormona luteinizante o un análogo de ella. En general, las microesferas de la invención, cuando se ponen en contacto con una solución de agente activo, son capaces de incorporar al menos 60%, más preferentemente al menos 70%, al menos 80% o al menos 90%, y, lo más preferentemente, al menos 95% o al menos 98% del agente activo. Opcionalmente, las microesferas que contienen el agente activo se estabilizan adicionalmente poniendo en contacto las microesferas con el mismo tipo de agentes reticuladores y usando el mismo tipo de condiciones descritas en la presente memoria para estabilizar inicialmente las microesferas.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una microesfera que incluye adicionalmente un agente complejante. La microesfera de este aspecto incluye: (1) una macromolécula, tal como una proteína (por ejemplo, albúmina, como se describió anteriormente); (2) al menos un polímero hidrosoluble (por ejemplo, hidroxietilalmidón (hetastarch), PEG/PVP); y (3) un agente complejante. Como se usa en la presente memoria, un agente complejante hace referencia a una molécula que es capaz de interactuar con un agente terapéutico (comentado más adelante) para que resulte más fácil cargar, retener y/o retardar de otro modo la liberación del agente terapéutico desde la microesfera (véase, por ejemplo la Tabla 3). Igual que en todos los aspectos de la invención, estas microesferas presentan una superficie lisa que incluye una pluralidad de aberturas de canal que presentan un diámetro inferior a 1.000 angstrom, determinado mediante la técnica de adsorción de gas para medir el tamaño de poro, y, preferentemente, no contienen aceite o disolvente orgánico detectable.
Un método preferido para incorporar un agente complejante es combinar el agente complejante con un polímero hidrosoluble en solución acuosa, añadir después la macromolécula y estabilizar las microesferas con calor y/o agentes reticuladores.
En general, el agente complejante es un agente complejante iónico (es decir, el agente complejante es capaz de una interacción iónica con un agente terapéutico (comentado más adelante)) o un agente complejante no iónico (es decir, el agente complejante es capaz de una interacción no iónica (por ejemplo, hidrófoba, iónica/no iónica mixta) con un agente terapéutico. En la Tabla 3 se proporcionan ejemplos de agentes complejantes. Los agentes complejantes iónicos de la invención se clasifican adicionalmente en agentes complejantes aniónicos (es decir, agentes complejantes con una carga negativa) y agentes complejantes catiónicos (es decir, agentes complejantes con una carga positiva).
En ciertas realizaciones, el agente complejante es un agente complejante aniónico que presenta la estructura de fórmula I:
IPOLY-[Y^{-}]_{n} X^{+}
en la que POLY representa una cadena principal del agente complejante aniónico que puede ser lineal o ramificada;
en la que Y^{-} representa un grupo aniónico, por ejemplo, sulfatos, carboxilos, fosfatos, nitratos, carbonatos y similares, que puede estar acoplado a una o más cualesquiera de las ramificaciones de la cadena principal;
en la que X^{+} representa un grupo catiónico que es, por ejemplo, un contraión del grupo aniónico;
en la que n es un número entero de 1 a 10.000, preferentemente de 5 a 100 y más preferentemente de 5 a 1.000 y aún más preferentemente de 5 a 10.000; y
en la que cuando n es mayor que 1, los n grupos Y^{-} pueden ser iguales o diferentes.
En aún otras realizaciones de la invención, el agente complejante es un agente complejante catiónico que presenta la estructura de fórmula II:
IIPOLY-[X^{+}]_{n} Y^{-}
en la que POLY representa una cadena principal del agente complejante catiónico que puede ser lineal o ramificada;
en la que X^{+} representa un grupo catiónico, por ejemplo un grupo amino, que puede estar acoplado a una o más cualesquiera de las ramificaciones de la cadena principal;
en la que Y^{-} representa un grupo aniónico que es un contraión del grupo catiónico;
en la que n es un número entero de 1 a 10.000, preferentemente de 5 a 100 y más preferentemente de 5 a 1.000 y lo más preferentemente de 5 a 10.000; y
en la que cuando n es mayor que 1, los n grupos X^{+} pueden ser iguales o diferentes.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una microesfera que incluye además un agente activo (véase, por ejemplo, la Tabla 4). Las microesferas en las que se puede cargar el agente activo pueden incluir un agente complejante para facilitar la carga y/o modificar la liberación del agente activo de la microesfera. De forma alternativa, el agente activo se puede cargar en las microesferas antes descritas que carecen de agente complejante, por ejemplo, la proteína y/o los polímeros hidrosolubles de la invención pueden interactuar con el agente activo para facilitar la carga y/o modificar su liberación de la microesfera. En general, aunque el agente activo se puede cargar en una microesfera de la invención durante la preparación de la microesfera, se prefiere cargar el agente activo en una microesfera preformada de la invención, y se prefiere aún más cargar el agente activo en una microesfera preformada que contiene un agente complejante para facilitar la carga y/o la liberación retardada del agente. Al contrario que las microesferas de hidrogel, las microesferas de la invención no se hinchan significativamente en agua y, además, las microesferas no requieren hincharse con el fin de proporcionar una liberación retardada de la proteína terapéutica y/o agente fisiológicamente activo de la microesfera.
Como se usa en la presente memoria, un agente activo hace referencia a un agente que presenta una actividad diagnóstica o terapéutica. Por consiguiente, un agente activo puede incluir una marca detectable (por ejemplo, una marca radiactiva) que es útil para identificar las localizaciones del agente liberado in vivo. Los agentes activos también incluyen agentes terapéuticos que son útiles para tratar una enfermedad o dolencia. En ciertas realizaciones, los agentes fisiológicamente activos preferidos son agentes proteicos o peptídicos. Tales agentes proteicos o peptídicos típicamente se pueden dividir además en categorías en función de la actividad del agente o del tipo de enfermedad o dolencia que se está tratando. Las categorías de agentes fisiológicamente activos que se pueden usar en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, antibióticos, agentes hematopoyéticos, agentes antiinfecciosos, agentes antidemencia, agentes antivirales, agentes antitumorales, antipiréticos, analgésicos, antiinflamatorios, agentes antiulcerosos, agentes antialérgicos, antidepresivos, agentes psicotrópicos, cardiotónicos, agentes antiarrítmicos, vasodilatadores, agentes antihipertensores tales como diuréticos hipotensores, agentes antidiabéticos, anticoagulantes, agentes que bajan el colesterol, agentes terapéuticos para la osteoporosis, hormonas, vacunas etc. (véase, por ejemplo, la Tabla 4).
El péptido o proteína fisiológicamente activo que se emplea de acuerdo con la presente invención es un péptido compuesto por dos o más aminoácidos. Preferentemente, un péptido de este tipo presenta un peso molecular superior a 200, por ejemplo en el intervalo de aproximadamente 200 a 200.000. El intervalo de pesos moleculares más preferido es de aproximadamente 200 a 100.000. Ejemplos más específicos de agentes fisiológicamente activos, incluidos los agentes no proteicos, que se pueden usar en relación con los métodos y composiciones de la invención se proporcionan en la descripción detallada de la invención.
De acuerdo con otro aspecto más de la invención, se proporciona un método para formar una microesfera. El método implica: (1) formar una mezcla acuosa que contiene una macromolécula, preferentemente una proteína o un ácido nucleico, y un polímero hidrosoluble, preferentemente un polímero basado en carbohidratos tal como hidroxietilalmidón; (2) permitir la formación de las microesferas en la mezcla acuosa; (3) estabilizar las microesferas, preferentemente poniendo en contacto las microesferas con un agente reticulador y/o exponiendo las microesferas a una fuente de energía, preferentemente calor, en condiciones suficientes para estabilizar las microesferas; en el que la macromolécula está presente en la mezcla acuosa en una cantidad suficiente para formar una microesfera que contiene al menos 40% y menos de 100% en peso de la macromolécula. Aunque no se desea vincularse a ninguna teoría o mecanismo concreto, se cree que las microesferas se forman durante la etapa de mezclado; sin embargo, tales microesferas formadas inicialmente son transitorias y requieren una etapa posterior (por ejemplo, la inclusión de un agente reticulador en la mezcla y/o la aplicación de calor u otra fuente de energía) para estabilizar las microesferas formadas transitoriamente. En los ejemplos se proporcionan ejemplos de métodos de preparación de las microesferas.
De acuerdo con otro aspecto más de la invención, se proporciona una composición farmacéutica del material y un método para preparar dicha composición. En ciertas realizaciones, la composición incluye un envase que contiene una dosis única de microesferas que contienen un agente activo para tratar una dolencia que se puede tratar mediante la liberación retardada de un agente activo de las microesferas. El número de microesferas en la dosis única depende de la cantidad de agente activo presente en cada microesfera y del periodo de tiempo en el cual se desee la liberación retardada. Preferentemente, la dosis única se selecciona para lograr la liberación retardada del agente activo durante un periodo de aproximadamente 1 a aproximadamente 180 días, seleccionándose la dosis única de microesferas para lograr el perfil de liberación deseado para tratar la dolencia.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una jeringa que contiene cualquiera de las microesferas descritas en la presente memoria. Por ejemplo, la composición puede incluir una jeringa que contiene una dosis única de microesferas que contienen un agente activo para tratar una dolencia que se puede tratar mediante la liberación retardada del agente activo de las microesferas. Preferentemente está acoplada una aguja a la jeringa, presentando la jeringa un diámetro interior de un calibre de 14 a 30.
Cabe destacar que las microesferas de la invención se pueden preparar de modo que tengan unas dimensiones que permitan la administración de las microesferas usando una jeringa sin aguja (MediJector, Derata Corporation, Minneapolis, MN 55427), eliminando de esta forma los problemas de eliminación inherentes a las agujas, que deben desecharse como producto de desecho de riesgo biológico. Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto especialmente preferido de la invención, se proporciona una jeringa sin aguja que contiene una o más dosis de microesferas que contienen un agente activo para tratar una dolencia. Las microesferas se puede preparar de modo que presenten cualidades adecuadas para ser administradas mediante otras vías parenterales y no parenterales, tales como oral, bucal, intratecal, nasal, pulmonar, transdérmica, transmucosal y similares.
De acuerdo con otras realizaciones más de la invención, se proporcionan microesferas que contienen ácido nucleico. Las microesferas que contienen ácido nucleico incluyen: (1) un ácido nucleico (por ejemplo, un plásmido, vector vírico, oligonucleótido, ARN, ácidos nucleicos antisentido y sin sentido); (2) un polímero policatiónico (por ejemplo, polilisina); y (3) un polímero hidrosoluble (como se describió anteriormente). Por lo tanto, se proporciona un método para formar las microesferas que contienen ácido nucleico. El método implica: (1) combinar, en una o más soluciones acuosas, un ácido nucleico, un polímero policatiónico y un polímero hidrosoluble para formar una mezcla acuosa que puede ser mono- o multifásica; y (2) someter la mezcla acuosa a un agente reticulador y/o a una fuente de energía en condiciones (por ejemplo, de concentración, tiempo de incubación) suficientes para estabilizar una microesfera. En los ejemplos se describen ejemplos de métodos para la formación de microesferas de ácido nucleico.
Estos y otros aspectos de la invención se describirán con más detalle a continuación. A lo largo de esta descripción, todos los términos técnicos y científicos tienen el significado que entiende habitualmente un experto normal en la técnica a la que pertenece esta invención, salvo que se definan de otra manera.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 es un gráfico que muestra el porcentaje acumulativo de polietilenglicol (PEG) radiomarcado y de albúmina de suero bovina (BSA) radiomarcada liberado de microesferas, frente a la raíz cuadrada del tiempo en horas. El símbolo cuadrado negro representa el PEG y el símbolo cuadrado blanco representa la BSA.
La Fig. 2 es un gráfico que muestra el porcentaje acumulativo de albúmina de suero bovina (BSA) radiomarcada liberado de las microesferas preparadas con tres concentraciones diferentes de polímero, frente a la raíz cuadrada del tiempo en horas. El símbolo cuadrado gris representa una concentración total de polímero de 50%, el símbolo cuadrado blanco representa una concentración total de polímero de 40% y el símbolo triangular negro representa una concentración total de polímero de 25%.
La Fig. 3 es un gráfico que muestra el porcentaje acumulativo de polietilenglicol (PEG) radiomarcado liberado de las microesferas preparadas con tres concentraciones diferentes de polímero frente a la raíz cuadrada del tiempo en horas. El símbolo triangular blanco representa una concentración total de polímero de 50%, el símbolo cuadrado negro representa una concentración total de polímero de 40% y el símbolo cuadrado blanco representa una concentración total de polímero de 25%.
La Fig. 4 es un gráfico que muestra el porcentaje acumulativo de albúmina de suero bovina (BSA) radiomarcada liberada de las microesferas preparadas con tres concentraciones diferentes de polímero a diversas temperaturas de incubación, frente a la raíz cuadrada del tiempo en horas. El símbolo cuadrado blanco representa una concentración total de polímero de 25% y una incubación a 58ºC, el símbolo cuadrado negro representa una concentración total de polímero de 25% y una incubación a 70ºC, el símbolo circular blanco representa una concentración total de polímero de 40% y una incubación a 58ºC, el símbolo circular negro representa una concentración total de polímero de 40% y una incubación a 70ºC, el símbolo triangular blanco representa una concentración total de polímero de 50% y una incubación a 58ºC, el símbolo triangular negro representa una concentración total de polímero de 50% y una incubación a 70ºC, el símbolo "X" claro representa una concentración total de polímero de 25% y una incubación a 37ºC y 58ºC, y el símbolo "X" oscuro representa una concentración total de polímero de 25% y una incubación a 37ºC y 70ºC.
La Fig. 5 es un gráfico que muestra el porcentaje acumulativo de polietilenglicol (PEG) radiomarcado liberado de las microesferas preparadas con tres concentraciones diferentes de polímero a diversas temperaturas de incubación frente a la raíz cuadrada del tiempo en horas. Los símbolos son los mismos que los descritos en la Fig. 4.
La Fig. 6 es un gráfico que muestra el porcentaje acumulativo de polietilenglicol (PEG) radiomarcado liberado de las microesferas preparadas con tres concentraciones diferentes de polímero a una temperatura de incubación que incluye 58ºC, frente a la raíz cuadrada del tiempo en horas. El símbolo triangular blanco representa una concentración total de polímero de 50% y una incubación a 58ºC, el símbolo cuadrado negro representa una concentración total de polímero de 40% y una incubación a 58ºC, el símbolo triangular gris representa una concentración total de polímero de 25% y una incubación a 37ºC y 58ºC, y el símbolo cuadrado blanco representa una concentración total de polímero de 25% y una incubación a 58ºC.
La Fig. 7 es un diagrama de barras que muestra la cantidad de producto génico expresado mediante la actividad beta-galactosidasa en miliunidades, frente a la formación de microesferas para ADN desnudo, liposomas catiónicos que contienen ADN y microesferas de ADN.
La Fig. 8 es un gráfico del porcentaje acumulativo de liberación de acetato de leuprolida liberado de las microesferas a lo largo del tiempo en días.
La Fig. 9 es un gráfico del porcentaje acumulativo de liberación de acetato de nafarelina frente al tiempo en horas para tres concentraciones de sulfato de cinc usadas durante la preparación de las microesferas. El símbolo circular representa sulfato de cinc 0,01 M; el símbolo cuadrado representa sulfato de cinc 0,1 M; y el símbolo triangular representa sulfato de cinc 1 M.
La Fig. 10 muestra la liberación retardada de estradiol in vitro de las microesferas de la invención.
La Fig. 11 muestra la liberación retardada de estradiol in vivo (concentraciones en suero) de las microesferas de la invención.
La Fig. 12 muestra la eficacia de la incorporación de diclofenaco sódico ajustando las condiciones de incubación.
La Fig. 13 muestra un perfil de distribución de tamaños representativo para las microesferas de la invención.
La invención proporciona métodos y composiciones para la liberación retardada de agentes terapéuticos y/o diagnósticos in vivo y/o in vitro. Las microesferas presentan un tamaño y una forma generalmente uniformes, oscilando su tamaño entre aproximadamente 0,5 micrómetros y aproximadamente 20 micrómetros, dependiendo de las condiciones de fabricación. Las características de las microesferas se pueden alterar durante la preparación manipulando la concentración de polímero hidrosoluble, la temperatura de reacción, el pH, la concentración de proteínas, el agente reticulador y/o el periodo de tiempo que la macromolécula está expuesta al agente reticulador y/o a la fuente de energía.
Las microesferas son útiles para una amplia variedad de separaciones y fines diagnósticos, terapéuticos, industriales, comerciales, cosméticos y de investigación, o para cualquier fin que requiera la incorporación y la estabilización de una molécula activa, reactante o fármaco. Por lo tanto, las microesferas de la invención son útiles para aplicaciones médicas y diagnósticas, tales como la administración de fármacos, la vacunación, la terapia génica y el diagnóstico por imagen histopatológico o de tejidos o tumores in vivo. Por consiguiente, las microesferas son adecuadas para la administración oral o parenteral; la administración a través de las mucosas; la administración oftálmica; la inyección intravenosa, subcutánea, intraarticular o intramuscular; la administración por inhalación; y la administración tópica.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona una microesfera que presenta una superficie lisa que incluye una pluralidad de aberturas de canal. Cada abertura de canal presenta un diámetro inferior a 1.000 angstrom, determinado mediante la técnica de adsorción de gas para medir el tamaño de poro usando, por ejemplo, la metodología BET para el análisis de datos.
Las microesferas se preparan mezclando o disolviendo las macromoléculas con un polímero hidrosoluble o con una mezcla de polímeros hidrosolubles, tales como polímeros lineales o ramificados de la Tabla 2, a un pH cercano al punto isoeléctrico de la macromolécula. La mezcla de macromoléculas y polímeros se expone a un agente reticulador y/o a una fuente de energía, tal como calor, en condiciones suficientes para estabilizar las microesferas. Las microesferas se separan después de los reactivos no incorporados mediante métodos de separación, tales como filtración o centrifugación.
La macromolécula o combinación de macromoléculas componen al menos 40% y menos de 100% en peso del peso final de cada microesfera. Preferentemente, la concentración de polímero en la microesfera es superior a 0% e inferior o igual a 30% en peso. Los tipos de macromoléculas que forman las microesferas incluyen, pero no se limitan a, proteínas, péptidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, virus o sus mezclas.
Cada microesfera se compone de macromoléculas y moléculas poliméricas que están entrelazadas o intercaladas en la microesfera y que, generalmente, están distribuidas homogéneamente. Aunque no se desea vincularse a ninguna teoría o mecanismo concreto, se cree que la matriz interior es hidrosoluble y que, cuando se solubiliza, la matriz interior difunde a través de la superficie externa en condiciones apropiadas, según se explica con más detalle a continuación. Las microesferas muestran una estrecha distribución de tamaños y presentan una forma generalmente uniforme. La distribución de tamaños también se puede ajustar modificando las condiciones y los reactivos usados durante el proceso de preparación, y puede estar asociada con la cinética de liberación según se describe a continuación. Las microesferas presentan generalmente un diámetro inferior a 10 \mum. Véase la figura 13 para una distribución de tamaños representativa de las microesferas de la invención. La forma uniforme de las microesferas es sustancialmente esférica, razón por la que las micropartículas también se denominan en la presente memoria "microesferas".
La superficie externa de cada microesfera es permeable a agua y macromoléculas disueltas, y no sólo permite la entrada de líquidos acuosos en la microesfera sino también permite la salida de la macromolécula y del polímero solubilizados de la microesfera. Las microesferas se puede preparar de modo que liberen la macromolécula y el polímero del interior de la microesfera cuando se colocan en un medio acuoso apropiado, tal como líquidos corporales o un tampón fisiológicamente aceptable, en condiciones fisiológicas durante un periodo de tiempo prolongado, proporcionando así una liberación retardada de macromoléculas. Además, las microesferas se pueden preparar de modo que liberen la macromolécula sin que se produzca un derrame inicial o liberación rápida de la macromolécula. La liberación retardada se define en la presente memoria como liberación de macromoléculas durante un periodo de tiempo prolongado. El periodo de tiempo durante el cual las macromoléculas continúan liberándose de la microesfera depende de las características de la macromolécula que se libera y de los parámetros usados para formar las microesferas, pero en todos los casos es mayor que el de la difusión acuosa libre de la macromolécula. Las microesferas que contienen compuestos farmacéuticos se pueden preparar de modo que liberen el compuesto farmacéutico junto con la macromolécula y el polímero, según se describió anteriormente.
Como se comentó antes brevemente y se comentará con más detalle a continuación, las características de las microesferas se pueden manipular durante la preparación ajustando el tipo de polímero, la concentración de polímero, la composición del polímero, la temperatura de incubación, el pH, la concentración de macromolécula o el periodo de tiempo que la macromolécula se expone a la fuente de energía.
Las microesferas se pueden administrar a un humano o animal por administración oral o parenteral, incluidas la inyección intravenosa, subcutánea o intramuscular; la administración por inhalación; la administración intraarticular; la administración a través de las mucosas; la administración oftálmica; y la administración tópica. La administración intravenosa incluye la cateterización o angioplastia. La administración puede ser para fines tales como fines terapéuticos y diagnósticos, como se comentará a continuación.
Formación de las microesferas
Las microesferas se producen mezclando las macromoléculas en una mezcla acuosa con un polímero hidrosoluble o una mezcla de polímeros para formar las microesferas y, opcionalmente, poniendo en contacto después las microesferas con un agente reticulador y/o una fuente de energía, preferentemente calor, en condiciones suficientes para estabilizar las microesferas. La solución es preferentemente una solución acuosa. O bien la solución de macromolécula se añade al polímero, o bien la solución de polímero se añade a la solución de macromolécula para provocar la eliminación de agua, o deshidratación, de las macromoléculas. Los expertos en la técnica también denominan este proceso exclusión de volumen. Aunque no se desea vincularse a ninguna teoría o mecanismo concreto, se cree que las microesferas se forman durante la etapa de mezclado; sin embargo, tales microesferas formadas inicialmente son transitorias y requieren una etapa adicional (por ejemplo, la inclusión de un agente reticulador en la mezcla y/o la aplicación de calor u otra fuente de energía) para estabilizar las microesferas formadas de forma transitoria.
El pH de la solución de macromolécula y polímero se ajusta, bien antes, después o durante el mezclado del polímero con la macromolécula, a un pH cercano al punto isoeléctrico (pI) de la macromolécula, preferentemente en el intervalo de 3 a 4 unidades de pH del pI de la macromolécula, más preferentemente en un intervalo de 1,5 a 2 unidades de pH del pI de la macromolécula.
El ajuste del pH se puede realizar añadiendo un ácido, una base, bien en solución o bien en forma sólida, o un tampón u otra solución o sal que ajusta el pH a la solución de macromolécula, a la solución de polímero o a la mezcla de macromolécula y polímero de acuerdo con métodos conocidos para los expertos en la técnica. Preferentemente, el polímero se disuelve en un tampón que presenta un pH cercano al pI de la macromolécula y, después, la solución de polímero con pH ajustado se añade a la macromolécula, que se ha disuelto en una solución acuosa. El pH de la solución final debe permanecer cercano al pI de la macromolécula.
La solución de macromolécula y polímero se expone después a un agente reticulador y/o a una fuente de energía, tal como calor, radiación o ionización, sola o en combinación con sonicación, agitación en vórtex, mezclado o agitación, durante un periodo de tiempo predeterminado para estabilizar las microesferas. Las microesferas resultantes se separan después de todos los componentes no incorporados presentes en la solución mediante métodos de separación físicos conocidos para los expertos en la técnica, y después se pueden lavar.
El periodo de tiempo de incubación depende de las concentraciones respectivas de polímero y macromolécula y del nivel de energía de la fuente de energía. La estabilización de las microesferas puede comenzar inmediatamente después de la exposición a la fuente de energía. Preferentemente, la mezcla de macromolécula y polímero se calienta a una temperatura superior a la temperatura ambiente durante aproximadamente 5 minutos a 24 horas. Lo más preferentemente, el polímero y las macromoléculas se mezclan mediante agitación o balanceo durante 30 minutos a una temperatura de aproximadamente 37ºC a 70ºC.
Macromolécula
La macromolécula que forma la microesfera es cualquier molécula que presenta una estructura terciaria y cuaternaria o que es capaz de presentar una estructura terciaria y cuaternaria. Lo más preferentemente, la macromolécula es una biomolécula tal como una proteína, incluidas enzimas y proteínas recombinantes, un péptido, carbohidrato, polisacárido, conjugado de carbohidrato- o polisacárido-proteína, ácido nucleico, virus, partícula vírica, conjugado de una molécula pequeña (tal como un hapteno) y una proteína, o mezclas de ellos. Se puede incorporar en las microesferas un compuesto farmacéutico o fármaco natural o sintético, orgánico o inorgánico, uniendo el fármaco a una macromolécula, tal como una proteína, y formando después las microesferas a partir del complejo o conjugado de macromolécula-fármaco. Los expertos en la técnica entenderán que se puede introducir en una microesfera un compuesto incapaz de presentar una estructura terciaria y cuaternaria incorporando o acoplando el compuesto a una molécula portadora que presente una estructura terciaria y cuaternaria. Los expertos en la técnica entenderán también que la macromolécula puede ser una parte de una molécula, tal como, por ejemplo, un péptido, un segmento de cadena sencilla de una molécula de ácido nucleico de cadena doble o una partícula vírica, que presenta una estructura terciaria y cuaternaria. Asimismo, los expertos en la técnica entenderán que el término "macromolécula" incluye una pluralidad de macromoléculas y que incluye combinaciones de diferentes macromoléculas, tales como una combinación de un compuesto farmacéutico y una molécula de afinidad para dirigir el compuesto farmacéutico a un tejido, órgano o tumor que requiera tratamiento. Se entenderá, además, que una molécula de afinidad puede ser tanto la parte de un receptor como la parte de un ligando de una interacción receptor-ligando. Ejemplos de ligandos que interactúan con otras biomoléculas incluyen virus, bacterias, polisacáridos o toxinas que actúan de antígenos para generar una respuesta inmune cuando se administran a un animal y provocan la producción de anticuerpos.
Los compuestos o macromoléculas adecuados incluyen, pero no se limitan a, betaxolol^{TM}, diclofenac^{TM}, doxorrubicina, rifampicin^{TM}, acetato de leuprolida, hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH), (D-Tryp6)-LHRH, acetato de nafarelina, insulina, insulina sódica, insulina de cinc, protamina, lisozima, alfa-lactalbúmina, factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), beta-lactoglobulina, tripsina, anhidrasa carbónica, ovoalbúmina, albúmina de suero bovina (BSA), albúmina de suero humana (HSA), fosforilasa b, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, IgG, fibrinógeno, poli-L-lisina, IgM, ADN, desmopressin acetate^{TM}, factor liberador de la hormona de crecimiento (GHRF), somatostatina, antida, factor VIII, G-CSF/GM-CSF, hormona de crecimiento humana (hGH), interferón beta, antitrombina III, interferón alfa, interferón alfa 2b.
Las condiciones de incubación típicamente se optimizan para incorporar aproximadamente 100% de la macromolécula en la mezcla de reacción ajustando el pH, la temperatura, la concentración de macromolécula o la duración de la reacción o incubación. En general, se requiere menos energía para formar microesferas a concentraciones más altas de macromolécula.
Las microesferas compuestas por ácido nucleico se preparan preferentemente mezclando primero el ácido nucleico con una proteína, tal como albúmina de suero bovina, o, dado que los ácido nucleicos son aniones, añadiendo un catión, tal como polilisina, que contribuye en gran medida a la formación de las microesferas.
Como se mencionó anteriormente, se puede introducir en una microesfera una molécula o compuesto pequeño incapaz de presentar una estructura terciaria y cuaternaria, tal como un péptido o un compuesto farmacéutico, incorporando o acoplando el compuesto a una molécula portadora que presenta una estructura terciaria y cuaternaria. Esto se puede lograr de varias maneras. Por ejemplo, las microesferas se pueden formar como se describe en la presente memoria usando una macromolécula que presenta una estructura terciaria y cuaternaria, tal como una proteína, y después la molécula o compuesto pequeño se une en el interior y/o en la superficie de la microesfera. De forma alternativa, la molécula o compuesto pequeño se une a la macromolécula que presenta una estructura terciaria y cuaternaria usando interacciones hidrófobas o iónicas y después se forman las microesferas a partir del complejo de macromolécula-molécula pequeña usando el método descrito en la presente memoria. Una tercera manera de hacer microesferas a partir de moléculas pequeñas consiste en preparar las microesferas usando una macromolécula que presenta una estructura terciaria y cuaternaria de tal manera que la microesfera presente una carga neta y añadir después una molécula o compuesto pequeño que presenta una carga neta opuesta, de manera que la molécula pequeña es atraída físicamente por y permanece unida a la microesfera pero puede ser liberada a lo largo del tiempo en las condiciones apropiadas. De forma alternativa, se pueden usar diferentes tipos de interacciones no covalentes, tales como interacciones hidrófobas o de afinidad, para permitir la unión y la liberación posterior de moléculas pequeñas.
Cuando se preparan microesferas que contienen proteína, se puede añadir, antes de la adición de los polímeros y durante la formación de microesferas, un estabilizador de proteínas, tal como glicerol, ácidos grasos, azúcares tales como sacarosa, iones tales como cinc, cloruro sódico, o cualquier otro estabilizador de proteínas conocido para los expertos en la técnica, para minimizar la desnaturalización de la proteína.
Macromolécula marcada
Antes de incorporarla en una microesfera, la macromolécula se puede marcar con una marca detectable. Los diferentes tipos de marcas y métodos de marcado de proteínas y moléculas de ácido nucleico son conocidos para los expertos en la técnica. Los expertos en la técnica entenderán que en la definición del término marca queda incluida una sustancia magnética, tal como un metal. Por ejemplo, la macromolécula se puede marcar con una sustancia metálica, tal como un metal, de manera que las microesferas se puedan separar de otras sustancias en una solución con la ayuda de un dispositivo magnético.
A continuación se exponen diversas otras marcas o grupos reporteros específicos. Por ejemplo, la marca puede ser una radiomarca tal como [32]P, [3]H, [14]C, [35]S, [125]I o [131]I, sin estar limitada a éstas. Se puede conjugar una marca de [32]P a una proteína con un reactivo de conjugación o se puede incorporar en la secuencia de una molécula de ácido nucleico mediante traslado de la mella, marcado de extremos o incorporación de un nucleótido marcado. Por ejemplo, una marca de [3]H, [14]C o [35]S se puede incorporar en una secuencia de nucleótidos mediante la incorporación de un precursor marcado o mediante modificación química, mientras que una marca de [125]I o [131]I se incorpora generalmente en una secuencia de nucleótidos mediante modificación química. La detección de una marca se puede realizar mediante métodos tales como el recuento de centelleo, la espectrometría de rayos gamma o la autorradiografía.
La marca también puede ser una marca de resonancia magnética nuclear o de masa (RMN) tal como, por ejemplo, [13]C, [15]N o [19]O. La detección de una marca de este tipo puede realizarse por espectrometría de masas o RMN. También se pueden usar tintes, agentes quimiluminiscentes, agentes bioluminiscentes y fluorógenos para marcar la macromolécula. Ejemplos de tintes útiles para marcar ácidos nucleicos incluyen bromuro de etidio, acridina, propidio y otros tintes intercalantes, y 4',6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.) u otros tintes de ácidos nucleicos. Ejemplos de fluorógenos incluyen fluoresceína y sus derivados, ficoeritrina, alo-ficocianina, ficocianina, rodamina, Rojo Texas u otros fluorógenos. Los fluorógenos se unen generalmente mediante modificación química. Las marcas de tinte se pueden detectar mediante un espectrofotómetro y los fluorógenos se pueden detectar mediante un detector de fluorescencia.
La macromolécula también se puede marcar con un cromógeno (sustrato enzimático) para proporcionar una marca enzimática o de afinidad, o con una enzima. De forma alternativa, la macromolécula se puede biotinilar de manera que se pueda utilizar en una reacción de biotina-avidina, que también se puede acoplar a una marca tal como una enzima o fluorógeno. La macromolécula se puede marcar con peroxidasa, fosfatasa alcalina u otras enzimas que producen una reacción cromogénica o fluorogénica al añadir el sustrato.
También se puede producir una marca incorporando cualquier base, aminoácido o precursor modificado que contiene cualquier marca, incorporando una base o aminoácido modificado que contiene un grupo químico reconocible por anticuerpos específicos o detectando cualquier complejo de anticuerpo unido mediante diversos medios, que incluyen inmunofluorescencia o reacciones inmunoenzimáticas. Tales marcas se pueden detectar usando inmunoensayos con enzimas ligadas (ELISA) o detectando un cambio de color con la ayuda de un espectrofotómetro.
Microesferas recubiertas
A la superficie externa de las microesferas se pueden unir moléculas distintas de las macromoléculas de las que están compuestas las microesferas mediante métodos conocidos para los expertos en la técnica para "recubrir" o "decorar" las microesferas. La capacidad para unir moléculas a la superficie externa de las microesferas se debe a la alta concentración de macromolécula presente en la microesfera. Estas moléculas se unen con fines tales como para facilitar el direccionamiento, potenciar la mediación a través de receptores y evitar la endocitosis o destrucción. Por ejemplo, se pueden unir a la superficie de la microesfera biomoléculas tales como fosfolípidos, para evitar la endocitosis por endosomas; se pueden unir a la superficie receptores, anticuerpos u hormonas para promover o facilitar el direccionamiento de la microesfera al órgano, tejido o células deseados del cuerpo; y se pueden unir a la superficie externa de la microesfera polisacáridos tales como glucanos para potenciar o evitar la captación por macrófagos.
Además, se pueden unir a la superficie externa o en el interior de las microesferas una o más moléculas escindibles. Las moléculas escindibles se diseñan de manera que las microesferas sean dirigidas primero a un sitio predeterminado en condiciones biológicas apropiadas y después, cuando se exponen a un cambio de las condiciones biológicas, tales como un cambio de pH, las moléculas se escindan causando la liberación de la microesfera del sitio diana. De esta forma, las microesferas se unen a o son absorbidas por células debido a la presencia de las moléculas unidas a la superficie de las microesferas. Cuando se escinde la moléculas, las microesferas permanecen en la localización deseada, como en el citoplasma o núcleo de una célula, y pueden liberar libremente las macromoléculas de las cuales se componen las microesferas. Esto es especialmente útil para la administración de fármacos, en la que las microesferas contienen un fármaco que es dirigido a un lugar específico que requiere tratamiento y el fármaco se puede liberar lentamente en ese lugar. El sitio preferido de escisión es un enlace diéster.
Las microesferas también se pueden recubrir con una o más sustancias estabilizadoras, que pueden ser especialmente útiles para la deposición a largo plazo con administración parenteral o para administración oral, permitiendo el paso de las microesferas a través del estómago o intestino sin disolverse. Por ejemplo, las microesferas pensadas para la administración oral se pueden estabilizar con un recubrimiento de una sustancia tal como mucina, una secreción que contiene mucopolisacáridos producida por las células caliciformes del intestino, las glándulas submaxilares y otras células glandulares mucosas.
Además, las partículas se pueden recubrir de forma no covalente con compuestos tales como ácidos grasos o lípidos. El recubrimiento se puede aplicar a las microesferas por inmersión en la sustancia de recubrimiento solubilizada, rociado de las microesferas con la sustancia u otros métodos conocidos para los expertos en la técnica.
En algunas de las realizaciones preferidas, las microesferas de la invención incluyen una proteína y al menos un polímero hidrosoluble. Como se comentó anteriormente, las microesferas se forman poniendo en contacto la proteína y al menos un polímero hidrosoluble en condiciones acuosas para formar las microesferas, y las microesferas se estabilizan después mediante reticulación química o exposición de las microesferas a una fuente de energía, preferentemente calor, o mediante ambas, en condiciones (por ejemplo, concentración, temperatura) que producen microesferas que son resistentes a tratamientos físicos y químicos, tales como sonicación y soluciones cáusticas. En los ejemplos se describen las condiciones concretas para la formación de las microesferas representativas de la invención. En las realizaciones preferidas, la reacción de formación se realiza en ausencia de la adición de aceites o disolventes orgánicos.
El componente proteico de la microesfera puede ser una proteína portadora o una proteína terapéutica (véase, por ejemplo, la Tabla 1), que representa de aproximadamente 40 a menos de 100% (% en peso) de la microesfera.
Como se usa en la presente memoria, una "proteína portadora" se refiere a una proteína que presenta un peso molecular de al menos aproximadamente 1.500 y que existe en forma de estructura tridimensional. La proteína portadora también puede ser una proteína terapéutica, es decir, una proteína que presenta una actividad terapéutica; sin embargo, en general, la expresión "proteína portadora" se usará en esta solicitud para hacer referencia a una proteína que desempeña la función principal de proporcionar una estructura tridimensional para la formación de la microesfera, aunque la proteína portadora también puede desempeñar una función secundaria como agente terapéutico. En ciertas realizaciones preferidas, la proteína portadora es albúmina, concretamente albúmina de suero humana. Las microesferas de proteína de la invención incluyen además opcionalmente un agente terapéutico, tal como un esteroide (por ejemplo, estradiol, testosterona, prednisolona, dexametasona, hidrocortisona, base de lidocaína, base de procaína) o cualquier otra entidad química de este tipo que se sabe se une a la albúmina, tal como GCSF o paclitaxel. En otras realizaciones más (comentadas a continuación), las microesferas de la invención incluyen adicionalmente un agente complejante (preferentemente un agente complejante iónico) y, más preferentemente, un agente terapéutico (preferentemente un péptido) que se asocia con el agente complejante mediante una interacción iónica o no iónica. En ciertas otras realizaciones, la proteína que compone la matriz es una proteína terapéutica (por ejemplo, una hormona tal como insulina o la hormona de crecimiento humana) y la microesfera se construye y ordena para proporcionar una liberación retardada de la proteína terapéutica in vivo. Más preferentemente, la microesfera se construye y ordena para proporcionar una liberación retardada de la proteína terapéutica en ausencia de hinchamiento significativo de la microesfera.
TABLA 1 Proteínas
Proteínas
Proteínas o moléculas portadoras Proteínas o péptidos o moléculas terapéuticos
\begin{minipage}[t]{70mm} Albúmina (preferentemente albúmina de suero humana); HSA; BSA; IgG, IgM; insulina; hGH; lisozima; alfa-lactoglobulina; factor de crecimiento de fibroblastos básico; VEGF; quimotripsina; tripsina; anhidrasa carbónica; ovoalbúmina; fosforilasa b; fosfatasa alcalina; beta-galactosidasa; fibrinógeno; poli-L-lisina; ADN; anticuerpos; caseína; colágeno; proteína de soja; y gelatina. \end{minipage} \begin{minipage}[t]{70mm} insulina; hormona de crecimiento humana; GCSF; GMCSF; LHRH; VEGF; factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF); ADN; ARN; asparaginasa; tPA; uriquinasa; estreptoquinasa; interferón; glucagón; ACTH; oxitocina; secretina; vasopresina; y levotiroxina. \end{minipage}
En general, las microesferas de la invención se forman mezclando la proteína junto con al menos un polímero hidrosoluble en condiciones que permiten al polímero hidrosoluble eliminar agua de ("deshidratar") la proteína (véase, por ejemplo, la Tabla 2), en relaciones especificadas o preferidas (p/p) de proteína y polímero hidrosoluble (por ejemplo, las relaciones oscilan entre aproximadamente 1 proteína: 1 polímero a aproximadamente 1 proteína: 1.000 polímero). La relación preferida de proteína y polímero hidrosoluble en la reacción de formación de las microesferas se encuentra en el intervalo de aproximadamente 1 proteína: 5 polímero a 1 proteína: 30 polímero. Como se señaló anteriormente, un "polímero hidrosoluble" de la invención hace referencia a un polímero o mezcla de polímeros que son capaces de interactuar con la macromolécula (por ejemplo, proteína u otra molécula) para provocar una exclusión de volumen. Por lo tanto, el procedimiento preferido implica el uso de un sistema completamente acuoso sin la implicación de aceite o disolventes orgánicos.
Los polímeros hidrosolubles adecuados incluyen polímeros solubles lineales o ramificados, preferentemente aquellos que presentan un alto peso molecular. Los polímeros pueden ser altamente hidrosolubles, moderadamente hidrosolubles o ligeramente hidrosolubles (hidrosolubilidad superior a 2% p/v). Los polímeros hidrosolubles preferidos son solubles en agua o solubles en un disolvente miscible con agua. Los polímeros hidrosolubles se pueden solubilizar disolviéndolos primero en un disolvente miscible con agua y combinando después la solución de polímero con un disolvente acuoso. En las realizaciones especialmente preferidas, los polímeros hidrosolubles de la invención se seleccionan entre los polímeros hidrosolubles identificados en la Tabla 2. En las realizaciones especialmente preferidas, el polímero hidrosoluble es un polímero basado en carbohidratos.
El polímero preferido es polivinilpirrolidona, polietilenglicol, dextrano, copolímero de polioxietileno-polioxipropileno, poli(alcohol vinílico), almidón, hidroxietilalmidón o mezclas de ellos, cuyas características se describen con más detalle a continuación. El polímero o mezcla de polímeros se puede preparar de acuerdo con los métodos expuestos en la patente de Estados Unidos nº 5.525.519 de James E. Woiszwillo o en la solicitud de patente PCT nº US93-00073 (publicación internacional nº WO 93/14110), presentada el 7 de enero de 1993 y publicada el 22 de julio de 1993 por James E. Woiszwillo), en los que el polímero se disuelve en agua o en una solución acuosa, tal como un tampón, en una concentración de aproximadamente 1 a 50 g/100 ml, dependiendo del peso molecular del polímero. La concentración total preferida de polímero en la solución de polímeros se encuentra entre 10% y 80%, expresada como porcentaje en peso/volumen. La concentración preferida de cada polímero en la solución de polímeros se encuentra entre 5% y 50%. Como se comentó anteriormente, el pH de la solución de polímeros se puede ajustar antes de combinarla con la macromolécula, de manera que la adición del polímero produce un ajuste de pH de la solución de macromolécula, lo más preferentemente en el intervalo de una unidad de pH del pI. El pH se puede ajustar durante la preparación de la solución de polímero preparando el polímero en un tampón con un pH predeterminado. De forma alternativa, el pH se puede ajustar después de la preparación de la solución de polímeros con un ácido o una base.
El copolímero de polioxietileno-polioxipropileno, conocido también como poloxámero, lo vende BASF (Parsippany, N.J.) y está disponible en una variedad de formas con diferentes porcentajes relativos de polioxietileno y polioxipropileno en el copolímero.
TABLA 2 Polímeros hidrosolubles
Polímeros hidrosolubles
\begin{minipage}{150mm} 1) polímeros basados en carbohidratos, tales como metilcelulosa, polímeros basados en carboximetilcelulosa, dextrano, polidextrosa, quitinas derivatizadas, quitosán y almidón (incluido hidroxietilalmidón) y sus derivados; 2) alcoholes polialifáticos, tales como poli(óxido de etileno) y sus derivados, incluido polietilenglicol (PEG), acrilatos de PEG, polietilenimina, poli(acetato de vinilo) y sus derivados; 3) polímeros polivinílicos, tales como poli(alcohol vinílico), poli(vinil)pirrolidona, poli(fosfato de vinilo), ácido poli(vinil)fosfónico y sus derivados; 4) ácidos poliacrílicos y sus derivados; 5) ácidos poliorgánicos, tales como ácido polimaleico y sus derivados; 6) poliaminoácidos, tales como polilisina, y poliiminoácidos, tales como poliiminotirosina y sus derivados; 7) copolímeros y copolímeros de bloques, tales como poloxámero 407 o el polímero Pluronic L-101 TM y sus derivados; 8) terc-polímeros y sus derivados; 9) poliéteres, tales como poli(tetrametilenéterglicol) y sus derivados; 10) polímeros presentes en la naturaleza, tales como ceína y pululano y sus derivados; 11) poliimidas, tales como poli(metacrilato de n-tris(hidroximetil)metilo) y sus derivados; 12) agentes tensioactivos, tales como polioxietilensorbitán y sus derivados; 13) poliésteres, tales como poli((n)monometil éter de etilenglicol) éster de mono(succinimidilsuccinato) y sus derivados; 14) polímeros ramificados y cíclicos, tales como PEG ramificado y ciclodextrinas y sus derivados; y 15) polialdehídos, tales como poli(óxido de perfluoropropileno períluoroformaldehído) y sus derivados. \end{minipage}
La PVP es un polímero hidrófilo, no ionogénico, que presenta un peso molecular medio en el intervalo de aproximadamente 10.000 a 700.000 y la fórmula química (C_{6}H_{9}NO)[n]. La PVP se conoce también como poli[1-(2-oxo-1-pirrolidinil)etileno], Povidone^{TM}, Polyvidone^{TM}, RP 143^{TM}, Kollidon^{TM}, Peregal ST^{TM}, Periston^{TM}, Plasdone^{TM}, Plasmosan^{TM}, Protagent^{TM}, Subtosan^{TM} y Vinisil^{TM}. La PVP no es tóxica, altamente higroscópica y se disuelve fácilmente en agua o disolventes orgánicos.
El polietilenglicol (PEG), conocido también como poli(oxietilen)glicol, es un polímero de condensación de óxido de etileno y agua que presenta la fórmula química general HO(CH_{2}CH_{2}O)[n]H.
Dextrano es el término que se aplica a los polisacáridos producidos por bacterias que crecen en un sustrato de sacarosa. Los dextranos nativos producidos por bacterias tales como Leuconostoc mesenteroides y Lactobacteria dextranicum presentan normalmente un alto peso molecular. Los dextranos están disponibles de forma rutinaria y se usan en forma inyectable como agente de expansión de plasma en humanos.
El poli(alcohol vinílico) (PVA) es un polímero preparado a partir de poli(acetatos de vinilo) por sustitución de los grupos acetato por grupos hidroxilo y presenta la fórmula (CH_{2}CHOH)[n]. La mayoría de los poli(alcoholes vinílicos) son solubles en agua.
El PEG, dextrano, PVA y PVP están disponibles en el mercado de suministradores químicos tales como Sigma Chemical Company (St. Louis, Mo.).
Lo más preferentemente, el polímero es una mezcla de polímeros que contiene una solución acuosa de PVP con un peso molecular de 10.000 a 360.000, lo más preferentemente de 40.000, y PEG con un peso molecular de 200 a 35.000. Se prefiere PVP con un peso molecular de 40.000 y PEG con un peso molecular de 3.500. Preferentemente, la PVP se disuelve en un tampón acetato y el PEG se añade a la solución acuosa de PVP. La concentración de cada polímero se encuentra preferentemente entre 1 y 40 g/100 ml, dependiendo del peso molecular de cada polímero. Concentraciones iguales de PVP y PEG proporcionan, generalmente, la mezcla de polímeros más favorable para la formación de microesferas.
Un polímero preferido alternativo es un dextrano con un peso molecular de aproximadamente 3.000 a 500.000 dalton.
El volumen de polímero añadido a la macromolécula varía en función del tamaño, la cantidad y la concentración de la macromolécula. Preferentemente se añaden dos volúmenes de la mezcla de polímeros, a una concentración total de polímero de 5 a 50%, a un volumen de una solución que contiene la macromolécula. El polímero está presente en fase líquida durante la reacción con la macromolécula. En algunas de las realizaciones, y concretamente en las realizaciones de las microesferas que no contienen adicionalmente un agente complejante, el polímero hidrosoluble preferentemente no es PEG, PVP, dextrano, etoxilatos de nonilfenol y/o poli(alcohol vinílico).
Agentes complejantes
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una microesfera que incluye adicionalmente un agente complejante. La microesfera de este aspecto incluye: (1) una macromolécula, tal como una proteína (por ejemplo, albúmina, como se describió anteriormente); (2) al menos un polímero hidrosoluble (por ejemplo, hidroxietilalmidón, PEG/PVP, como se describió anteriormente); y (3) un agente complejante. Como se usa en la presente memoria, un agente complejante hace referencia a una molécula que es capaz de interactuar con un agente terapéutico (comentado más adelante) para que resulte más fácil cargar, retener y/o retardar de otro modo la liberación del agente terapéutico de la microesfera (véase, por ejemplo, la Tabla 3).
TABLA 3 Agentes complejantes
Agentes complejantes
Iónicos Otra interacción
Polianiónicos Policatiónicos (incluidas las interacciones no iónicas
y las iónicas y no iónicas mixtas
Dextrán sulfato Polilisina albúmina
Heparín sulfato poliarginina IgG
Heparán sulfato poliiminoácidos IgM
Condroitín sulfato poliiminotirosina polímeros hidrófobos
Poliestireno sulfonato sódico resina de colestiramina silicona
dietilaminoetil-celulosa ceína
Carboximetil-celulosa policitrulina lignina
TABLA 3 (continuación)
Agentes complejantes
Iónicos Otra interacción
Polianiónicos Policatiónicos (incluidas las interacciones no iónicas
y las iónicas y no iónicas mixtas
Poli(ácido aspártico) poliornitina ácidos grasos
fosfolípidos
Poli(ácido glutámico) gelatina
cationes divalentes (por ejemplo,
calcio, magnesio, cinc)
Igual que en todos los aspectos de la invención, estas microesferas presentan también una superficie lisa que incluye una pluralidad de aberturas de canal inferiores a 1.000 angstrom, determinado mediante la técnica de adsorción de gas para medir el tamaño de poro, y preferentemente no contienen aceite o disolventes orgánicos detectables.
Un método preferido para incorporar un agente complejante iónico consiste en combinar el complejo iónico con un polímero hidrosoluble en solución acuosa y la proteína en solución acuosa y estabilizar la microesfera con calor o con agentes reticuladores.
En general, el agente complejante es un agente complejante iónico (es decir, el agente complejante es capaz de una interacción iónica con un agente terapéutico (comentado más adelante)) o un agente complejante no iónico (es decir, el agente complejante es capaz de una interacción no iónica (por ejemplo, hidrófoba) con un agente terapéutico) o un agente que presenta tanto interacciones iónicas como no iónicas (por ejemplo, IgG). En la Tabla 3 se proporcionan ejemplos de agentes complejantes no iónicos y de agentes complejantes iónicos, tales como agentes complejantes aniónicos (es decir, agentes complejantes que presentan una carga negativa) y agentes complejantes catiónicos (es decir, agentes complejantes que presentan una carga positiva).
En ciertas realizaciones, el agente complejante es un agente complejante aniónico que presenta la estructura de fórmula I:
IPOLY-[Y^{-}]_{n} X^{+}
en la que POLY representa una cadena principal del agente complejante aniónico que puede ser lineal o ramificada;
en la que Y^{-} representa un grupo aniónico, por ejemplo, sulfatos, carboxilos, fosfatos, nitratos, carbonatos y similares, que puede estar acoplado a una o más cualesquiera de las ramificaciones de la cadena principal;
en la que X^{+} representa un grupo catiónico que es, por ejemplo, un contraión del grupo aniónico;
en la que n es un número entero de 1 a 10.000, preferentemente de 5 a 100 y más preferentemente de 5 a 1.000 y aún más preferentemente de 5 a 10.000; y
en la que cuando n es mayor que 1, los n grupos Y^{-} pueden ser iguales o diferentes.
En otras realizaciones más de la invención, el agente complejante es un agente complejante catiónico que presenta la estructura de fórmula II:
IIPOLY-[X^{+}]_{n} Y^{-}
en la que POLY representa una cadena principal del agente complejante catiónico que puede ser lineal o ramificada;
en la que X^{+} representa un grupo catiónico, por ejemplo un grupo amino, que puede estar acoplado a una o más cualesquiera de las ramificaciones de la cadena principal;
en la que Y^{-} representa un grupo aniónico que es un contraión del grupo catiónico;
en la que n es un número entero de 1 a 10.000, preferentemente de 5 a 100 y más preferentemente de 5 a 1.000 y lo más preferentemente de 5 a 10.000; y
en la que cuando n es mayor que 1, los n grupos X^{+} pueden ser iguales o diferentes.
Agentes activos
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una microesfera que incluye adicionalmente un agente activo. En la Tabla 4 se proporcionan ejemplos de categorías de agentes activos.
TABLA 4 Agentes terapéuticos: Categorías
Agentes terapéuticos – Categorías
\begin{minipage}{150mm} Hormonas, antibióticos y otros agentes antiinfecciosos, agentes hematopoyéticos, agentes trombopoyéticos, agentes antidemencia, agentes antivirales, agentes antitumorales (agentes quimioterapéuticos), antipiréticos, analgésicos, agentes antiinflamatorios, agentes antiulcerosos, agentes antialérgicos, antidepresivos, agentes psicotrópicos, cardiotónicos, agentes antiarrítmicos, vasodilatadores, agentes antihipertensores tales como diuréticos hipotensores, agentes antidiabéticos, anticoagulantes, agentes que bajan el colesterol, agentes terapéuticos para la osteoporosis, enzimas, vacunas, agentes y adyuvantes inmunológicos, citoquinas, factores de crecimiento, nucleótidos y ácidos nucleicos; carbohidratos y polisacáridos; virus y partículas víricas; conjugados o complejos de moléculas pequeñas y proteínas o sus mezclas; y fármacos farmacéuticos sintéticos orgánicos o inorgánicos. \end{minipage}
Las microesferas en las que se puede cargar el agente activo pueden incluir un agente complejante para facilitar la carga y/o modificar la liberación del agente activo de la microesfera. De forma alternativa, el agente activo se puede cargar en las microesferas antes descritas que carecen de agente complejante, por ejemplo, la proteína y/o los polímeros hidrosolubles de la invención pueden interactuar con el agente activo para facilitar la carga y/o modificar su liberación de la microesfera. En general, aunque el agente activo se puede cargar en una microesfera de la invención durante la preparación de la microesfera, se prefiere cargar el agente activo en una microesfera preformada de la invención y, más preferentemente, cargar el agente activo en una microesfera preformada que contiene un agente complejante para facilitar la carga y/o la liberación retardada del agente. Al contrario que las microesferas de hidrogel, las microesferas de la invención no se hinchan significativamente en agua y, además, las microesferas estabilizadas no necesitan hincharse para proporcionar una liberación retardada de la proteína terapéutica y/o del agente fisiológicamente activo de la microesfera.
Como se usa en la presente memoria, un agente activo hace referencia a un agente que presenta una actividad diagnóstica o terapéutica. Por consiguiente, un agente activo incluye opcionalmente una marca detectable (por ejemplo, una marca radiactiva) que es útil para identificar las localizaciones del agente liberado in vivo; los agentes activos también incluyen agentes terapéuticos que son útiles para tratar una enfermedad o dolencia. En ciertas realizaciones, los agentes fisiológicamente activos preferidos son agentes proteicos o peptídicos. Tales agentes proteicos o peptídicos típicamente se pueden dividir adicionalmente en categorías en función de la actividad del agente o del tipo de enfermedad o dolencia que se está tratando. El agente fisiológicamente activo que se puede usar en la presente invención incluye, pero no se limita a, las categorías de antibióticos, agentes hematopoyéticos, agentes antiinfecciosos, agentes antidemencia, agentes antivirales, agentes antitumorales, antipiréticos, analgésicos, agentes antiinflamatorios, agentes antiulcerosos, agentes antialérgicos, antidepresivos, agentes psicotrópicos, cardiotónicos, agentes antiarrítmicos, vasodilatadores, agentes antihipertensores tales como diuréticos hipotensores, agentes antidiabéticos, anticoagulantes, agentes para bajar el colesterol, agentes terapéuticos para la osteoporosis, hormonas, vacunas, etc. (véase, por ejemplo, la Tabla 4). Si bien a continuación se mencionan ejemplos específicos de agentes activos (por ejemplo, agentes peptídicos y no peptídicos) para uso de acuerdo con esta invención, esto no significa que queden excluidos otros agentes peptídicos o no peptídicos. Estos agentes activos pueden ser sustancias presentes en la naturaleza, recombinantes o sintetizadas químicamente.
Los agentes fisiológicamente activos de la invención incluyen agentes proteicos o peptídicos, así como agentes no proteicos o no peptídicos. Para facilitar la discusión, tales agentes proteicos o peptídicos se denominan en la presente memoria colectivamente agentes peptídicos; los agentes no proteicos y no peptídicos se denominarán en la presente memoria colectivamente agentes no peptídicos. Ejemplos de agentes no peptídicos incluyen las siguientes categorías no limitantes de agentes: a) nucleótidos y ácidos nucleicos; b) carbohidratos y polisacáridos; c) virus y partículas víricas; d) conjugados o complejos de moléculas pequeñas y proteínas o sus mezclas; y e) fármacos farmacéuticos naturales o sintéticos orgánicos o inorgánicos. En las patentes de Estados Unidos nº 5.482.706, 5.514.670 y 4.357.259 se muestra una descripción adicional de estos y otros agentes que se pueden usar de acuerdo con los métodos y composiciones de la presente invención.
Los agentes peptídicos fisiológicamente activos preferidos incluyen hormonas peptídicas, citoquinas, factores de crecimiento, factores que actúan sobre el sistema cardiovascular, factores que actúan sobre los sistemas nerviosos central y periférico, factores que actúan sobre electrolitos humorales y sustancias orgánicas hemáticas, factores que actúan sobre los huesos y el esqueleto, factores que actúan sobre el sistema gastrointestinal, factores que actúan sobre el sistema inmune, factores que actúan sobre el sistema respiratorio, factores que actúan sobre los órganos genitales y enzimas.
Ejemplos de hormonas incluyen la insulina, la hormona de crecimiento, la hormona paratiroidea, la hormona liberadora de la hormona luteinizante (LH-RH), la hormona adrenocorticotrópica (ACTH), la amilina, la oxitocina, la hormona luteinizante, la (D-Tryp6)-LHRH, el acetato de nafarelina, el acetato de leuprolida, la hormona estimulante del folículo, el glucagón, las prostaglandinas, PGE1, PGE2 y otros factores que actúan sobre los órganos genitales y sus derivados, análogos y congéneres. Como análogos de dicha LH-RH se pueden mencionar sustancias conocidas tales como las descritas en las patentes de Estados Unidos nº 4.008.209, 4.086.219, 4.124.577, 4.317.815 y 5.110.904.
Ejemplos de antibióticos incluyen tetraciclina, aminoglucósidos, penicilinas, cefalosporinas, sulfonamidas, succinato sódico del cloranfenicol, eritromicina, vancomicina, lincomicina, clindamicina, nistatina, anfotericina B, amantidina, idoxuridina, ácido p-aminosalicílico, isoniazida, rifampina, antinomicina D, mitramicina, daunomicina, adriamicina, bleomicina, vinblastina, vincristina, procarbazina, imidazol carboxamida.
Ejemplos de factores hematopoyéticos o trombopoyéticos incluyen, entre otros, la eritropoyetina, el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), el factor estimulante de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) y el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), preparaciones del factor de proliferación de leucocitos (Leucoprol, Morinaga Milk), la trombopoyetina, el factor estimulante de la proliferación de plaquetas, el factor (estimulante) de la proliferación de megacariocitos y el factor VIII.
Ejemplos de agentes antidemencia incluyen el selegeleno.
Ejemplos de agentes antivirales incluyen la amantidina e inhibidores de proteasas.
Ejemplos de agentes antitumorales incluyen la doxorrubicina, la daunorrubicina, el taxol y el metotrexato. Ejemplos de antipiréticos y analgésicos incluyen la aspirina, Motrin, el ibuprofeno, el naprosin, la indocina y el acetaminofeno.
Ejemplos de agentes antiinflamatorios incluyen NSAIDS, aspirina, esteroides, dexametasona, hidrocortisona, prednisolona y diclofenaco sódico.
Ejemplos de agentes antiulcerosos incluyen famotidina, cimetidina, nizatidina, ranitidina y sucralfato.
Ejemplos de agentes antialérgicos incluyen antihistaminas, difenildramina, loratadina y clorfeniramina.
Ejemplos de agentes antidepresivos y psicotrópicos incluyen litio, amitriptalina, antidepresivos tricíclicos, fluoxetina, prozac y paroxetina.
Ejemplos de cardiotónicos incluyen la digoxina.
Ejemplos de agentes antiarrítmicos incluyen metoprolol y procainamida.
Ejemplos de vasodilatadores incluyen nitroglicerina, nifedipina y dinitrato de isosorbida.
Ejemplos de diuréticos incluyen hidroclorotiazida y furosemida.
Ejemplos de agentes antihipertensores incluyen captopril, nifedipina y atenolol.
Ejemplos de agentes antidiabéticos incluyen glucozida, cloropropamida, metformina e insulina.
Ejemplos de anticoagulantes incluyen warfarina, heparina e hirudina.
Ejemplos de agentes que bajan el colesterol incluyen lovastatina, colestiamina y clofibrato.
Ejemplos de agentes terapéuticos para tratar la osteoporosis y de otros factores que actúan sobre los huesos y el esqueleto incluyen el calcio, el alendronato, el péptido GLa de huesos, la hormona paratiroidea y sus fragmentos activos (osteostatina, Endocrinology 129, 324, 1991), el péptido de formación y proliferación óseas relacionado con la histona H4 (OGP, The EMBO Journal 11, 1867, 1992) y sus muteínas, derivados y análogos de ellos.
Ejemplos de enzimas y cofactores enzimáticos incluyen: pancreasa, L-asparaginasa, hialuronidasa, quimotripsina, tripsina, tPA, estreptoquinasa, uroquinasa, pancreatina, colagenasa, tripsinógeno, quimotripsinógeno, plasminógeno, estreptoquinasa, adenilciclasa y superóxido dismutasa (SOD).
Ejemplos de vacunas incluyen vacunas contra la hepatitis B, la triple vírica (sarampión, parotiditis, rubéola) y contra la polio.
Ejemplos de adyuvantes inmunológicos incluyen: el adyuvante de Freund, los dipéptidos muramílicos, la concavalina A, BCG y levamisol.
Ejemplos de citoquinas incluyen linfoquinas, monoquinas, factores hematopoyéticos, etc. Las linfoquinas y citoquinas útiles en la práctica de la invención incluyen interferones (por ejemplo, interferón alfa, beta y gamma), interleuquinas (por ejemplo, interleuquinas 2 a 11), etc. Las monoquinas útiles en la práctica de la invención incluyen interleuquina 1, factores de necrosis tumoral (por ejemplo, TNF alfa y beta), el factor inhibidor de leucocitos malignos (LIF), etc.
Ejemplos de factores de crecimiento incluyen los factores de crecimiento nerviosos (NGF, NGF-2/NT-3), el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), el factor de crecimiento de tipo insulínico (IGF), el factor de crecimiento transformante (TGF), el factor de crecimiento celular procedente de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), etc.
Ejemplos de factores que actúan sobre el sistema cardiovascular incluyen factores que controlan la presión arterial, la arteriosclerosis, etc., tales como las endotelinas, los inhibidores de endotelina, los antagonistas de endotelina descritos en los documentos EP 436189, 457195, 496452 y 528312, el documento JP [abierto a consulta por el público] nº H-3-94692/1991 y 130299/1991, los inhibidores de la enzima productora de endotelina vasopresina, renina, angiotensina I, angiotensina II, angiotensina III, el inhibidor de la angiotensina I, antagonista del receptor de la angiotensina II, el péptido natriurético atrial (ANP), péptido antiarrítmico, etc.
Ejemplos de factores que actúan sobre los sistemas nerviosos central y periférico incluyen péptidos opiáceos (por ejemplo, encefalinas, endorfinas), el factor neurotrópico (NTF), el péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP), la hormona liberadora de la hormona tiroidea (TRH), sales y derivados de TRH [documento JP [abierto a consulta por el público] nº 50-121273/1975 (patente de Estados Unidos nº 3.959.247) documento JP [abierto a consulta por el público] nº 52-116465/1977 (patente de Estados Unidos nº 4.100.152)], la neurotensina, etc.
Ejemplos de factores que actúan sobre el sistema gastrointestinal incluyen secretina y gastrina.
Ejemplos de factores que actúan sobre electrolitos humorales y sustancias orgánicas hemáticas incluyen factores que controlan la hemaglutinación, el nivel de colesterol en plasma o las concentraciones de iones metálicos, tales como calcitonina, apoproteína E e hirudina. La laminina y la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM 1) representan ejemplos de factores de adhesión celular.
Ejemplos de factores que actúan sobre el riñón y el tracto urinario incluyen sustancias que regulan la función del riñón, tales como el péptido natriurético procedente del cerebro (BNP), la urotensina, etc.
Ejemplos de factores que actúan sobre los órganos sensoriales incluyen factores que controlan la sensibilidad de los diferentes órganos, tales como la sustancia P.
Ejemplos de factores que actúan sobre el sistema inmune incluyen factores que controlan la inflamación y los neoplasmas malignos y factores que atacan a microorganismos infecciosos, tales como péptidos quimiotácticos y bradiquininas.
Ejemplos de factores que actúan sobre el sistema respiratorio incluyen factores asociados con respuestas asmáticas.
Asimismo se incluyen los péptidos o proteínas presentes en la naturaleza, sintetizados químicamente o recombinantes que pueden actuar como antígenos, tales como polen de cedro y polen de ambrosía. Estos factores se administran en las formulaciones de acuerdo con la presente invención bien independientemente, acoplados a haptenos o junto con un adyuvante.
Formación, estabilización y caracterización de las microesfera
El método de formación de las microesferas de la invención implica: (1) combinar, en una o más soluciones acuosas, una macromolécula tal como una proteína, un polímero hidrosoluble (por ejemplo, un polímero basado en carbohidratos) y un agente complejante para formar una mezcla acuosa (como sistema monofásico o multifásico); y (2) someter la mezcla acuosa a un agente reticulador (por ejemplo, EDC [1-etil-3-(3-dimetilaminopropilcarbodiimida]) y/o a una fuente de energía durante un tiempo suficiente para formar una microesfera con una superficie lisa que incluye una pluralidad de aberturas de canal que presentan un diámetro inferior a 1.000 angstrom, determinado mediante la técnica de adsorción de gas para medir el tamaño de poro. En los ejemplos se proporcionan ejemplos de métodos de preparación de las microesferas.
Las microesferas se estabilizan por incubación de las microesferas formadas en presencia de un agente reticulador y/o una fuente de energía (por ejemplo, calor) durante un periodo de tiempo predeterminado. Ejemplos de agentes reticuladores incluyen dialdehídos, aminas, iones polivalentes, moléculas polifuncionales que presentan una afinidad por grupos reactivos específicos en la macromolécula que se va a reticular, maleimidas N-sustituidas, haluros de alquilo bifuncionales, haluros de arilo, isocianatos, ácidos dicarboxílicos alifáticos o aromáticos, ácidos disulfónicos alifáticos o aromáticos, imidoésteres bifuncionales y vinilsulfonas. En el documento US 5.578.709, expedido a J. Woiszwillo, se describen agentes reticuladores y métodos adicionales para su uso para estabilizar una microesfera. La fuente de energía preferida es calor. Sin embargo, los expertos en la técnica entenderán que otras fuentes de energía incluyen calor, radiación e ionización, solos o en combinación con sonicación, agitación en vórtex, mezclado o agitación. La formación y/o estabilización de las microesferas se puede producir inmediatamente después de la exposición a la fuente de energía o puede requerir una exposición prolongada a la fuente de energía, dependiendo de las características de los componentes y las condiciones. Preferentemente, la mezcla en solución de macromolécula-polímero se incuba en un baño de agua a una temperatura superior o igual a 37ºC e inferior o igual a 90ºC durante aproximadamente 5 minutos a 2 horas. Lo más preferentemente, la mezcla se incuba durante 5 a 30 minutos a una temperatura entre 50ºC y 90ºC. Cabe señalar que las microesferas se pueden formar a temperaturas más bajas usando una concentración más alta de macromolécula. La temperatura de incubación máxima viene determinada por las características de la macromolécula y la función final de la microesfera. Por ejemplo, para una microesfera en la que la macromolécula es una proteína, se prefiere una temperatura inferior a aproximadamente 70ºC para conservar la actividad de la proteína.
Las microesferas formadas se separan de los componentes no incorporados de la mezcla de incubación mediante métodos de separación convencionales conocidos para los expertos en la técnica. Preferentemente, la mezcla de incubación se centrifuga de manera que las microesferas sedimentan en el fondo del tubo de centrífuga y los componentes no incorporados permanecen en el sobrenadante, que se elimina después por decantación. De forma alternativa, una suspensión que contiene microesferas formadas se filtra de manera que las microesferas quedan retenidas en el filtro y los componentes no incorporados pasan a través del filtro.
Una purificación adicional de las microesferas se consigue mediante el lavado en un volumen apropiado de una solución de lavado. La solución de lavado preferida es un tampón, lo más preferentemente una solución acuosa no iónica o una solución acuosa no iónica que contiene polímeros hidrosolubles. Se pueden usar repetidos lavados según sea necesario, y las microesferas se pueden separar de la solución de lavado como se describió anteriormente.
Como se mencionó anteriormente, las características de las microesferas se pueden alterar manipulando las condiciones de incubación. Por ejemplo, la cinética de liberación de las microesferas se puede retrasar aumentando la temperatura de reacción o prolongando el tiempo de reacción durante la formación de las microesferas. La cinética de liberación también se manipula eligiendo diferentes polímeros, diferentes concentraciones de polímeros o diferentes relaciones de los polímeros usados en la formación de las microesferas.
El tamaño, la forma y la cinética de liberación de las microesferas también se pueden controlar ajustando las condiciones de formación de las microesferas. Por ejemplo, las condiciones de formación de las partículas se pueden optimizar para que se produzcan partículas más pequeñas o más grandes, o se puede aumentar el tiempo de incubación total o la temperatura de incubación, lo que da como resultado partículas que presentan una cinética de liberación prolongada.
Microesferas de ácido nucleico
De acuerdo con otras realizaciones más de la invención, se proporcionan microesferas en las que la macromolécula es un ácido nucleico. Las microesferas que contienen ácido nucleico incluyen: (1) un ácido nucleico (por ejemplo, un plásmido, vector vírico, oligonucleótido, ARN, ácidos nucleicos antisentido y sin sentido); (2) un polímero policatiónico (por ejemplo, polilisina); y (3) un polímero hidrosoluble (como se describió anteriormente). Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto relacionado de la invención, se proporciona un método para formar las microesferas que contienen ácido nucleico. El método implica: (1) combinar, en una o más soluciones acuosas, un ácido nucleico, un polímero policatiónico y un polímero hidrosoluble para formar una mezcla acuosa; y (2) someter la mezcla acuosa a un agente reticulador y/o a una fuente de energía durante un tiempo suficiente para formar una microesfera. En los ejemplos se proporcionan ejemplos de métodos de formación de las microesferas de ácido nucleico.
Composiciones farmacéuticas
De acuerdo con otro aspecto más de la invención, se proporciona una composición farmacéutica del material y un método para producirla. La composición incluye un envase que contiene una dosis única de microesferas que contienen un agente activo para el tratamiento de una dolencia que se puede tratar mediante la liberación retardada de un agente activo de las microesferas. El número de microesferas en la dosis única depende de la cantidad de agente activo presente en cada microesfera y del periodo de tiempo durante el cual se desea la liberación retardada. Preferentemente, la dosis única se selecciona de modo que se logre la liberación retardada del agente activo durante un periodo de aproximadamente 1 a aproximadamente 180 días con el perfil de liberación deseado.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una composición que contiene una jeringa. La composición incluye una jeringa que contiene una dosis única de microesferas que contienen un agente activo para el tratamiento de una dolencia que se puede tratar mediante la liberación retardada del agente activo de las microesferas; y una aguja acoplada a la jeringa, donde la aguja presenta un diámetro interno de un calibre de 14 a 30.
Cabe destacar que las microesferas de la invención se pueden preparar de manera que tengan unas dimensiones que permitan la administración de las microesferas usando una jeringa sin aguja (MediJector, Derata Corporation, Minneapolis, MN 55427), eliminando de este modo los problemas de eliminación inherentes a las agujas, que deben ser desechadas como producto de desecho de riesgo biológico. Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto especialmente preferido de la invención, se proporciona una jeringa sin aguja que contiene una o más dosis de microesferas que contienen un agente activo para el tratamiento de una dolencia. Las microesferas se pueden preparar de modo que tengan cualidades adecuadas para ser administradas mediante otras vías parenterales y no parenterales, tales como la oral, bucal, intratecal, nasal, pulmonar, transdérmica, transmucosal y similares.
Utilidades
Resumiendo, se puede pensar en las composiciones de la invención como la combinación de diferentes componentes, como se ejemplifica en las tablas, en condiciones para formar microesferas que presentan las características deseables de superficie lisa, que se pueden cuantificar determinando si se han formado las microesferas (por ejemplo, por detección visual) y determinando el diámetro de las aberturas de canal de las microesferas. Por lo tanto, en algunos de sus aspectos más amplios, las composiciones de la invención se dirigen a microesferas que presentan las dimensiones de abertura de canal requeridas y que comprenden una macromolécula (preferentemente una proteína de la Tabla 1) y un polímero hidrosoluble (preferentemente un polímero de la Tabla 2). En otro aspecto más, las microesferas comprenden una macromolécula (preferentemente una proteína de la Tabla 1), un polímero hidrosoluble (preferentemente un polímero de la Tabla 2) y un agente complejante (preferentemente de la Tabla 3). En otros aspectos más, la invención se dirige a cualquiera de estos aspectos en los que las microesferas comprenden adicionalmente un agente terapéutico (preferentemente de la Tabla 4). Por lo tanto, en ciertas realizaciones de estos aspectos, se combinan una o más proteínas de la Tabla 1 con un polímero hidrosoluble de la Tabla 2 y un agente activo de la Tabla 4. En otras realizaciones más de estos aspectos, se combina un ácido nucleico con un policatión de la Tabla 3, un polímero hidrosoluble de la Tabla 2 y, opcionalmente, un agente terapéutico de la Tabla 4. Por consiguiente, los métodos de la invención proporcionan diversas microesferas que se pueden diseñar para diferentes aplicaciones terapéuticas y diagnósticas seleccionando la combinación apropiada de agentes para lograr el objetivo terapéutico o diagnóstico.
Cuando se usan en terapia, las microesferas de la invención se administran en cantidades terapéuticamente eficaces. En general, una cantidad terapéuticamente eficaz significa aquella cantidad de agente activo necesaria para retrasar el comienzo de, inhibir la progresión de o detener por completo la dolencia concreta que se está tratando. Generalmente, la cantidad terapéuticamente eficaz variará en función de la edad, estado y sexo del sujeto, así como de la naturaleza y extensión de la enfermedad en el sujeto, pudiendo ser determinados todos ellos por un experto normal en la técnica. El médico o veterinario individual puede ajustar la dosis, especialmente en el caso de cualquier complicación. La cantidad terapéuticamente eficaz de agente activo varía típicamente entre 0,01 mg/kg y aproximadamente 1.000 mg/kg, preferentemente entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 200 mg/kg y lo más preferentemente entre aproximadamente 0,2 mg/kg y aproximadamente 20 mg/kg, en una o más administraciones de dosis al día, durante uno o más días, a la semana, al mes, cada dos o tres meses, etc.
Las microesferas se pueden administrar solas o en combinación con otras terapias con fármacos como parte de una composición farmacéutica. Una composición farmacéutica de este tipo puede incluir las microesferas en combinación con cualquier vehículo convencional fisiológica y/o farmacéuticamente aceptable conocido en la técnica. Las composiciones deben ser estériles y contener una cantidad terapéuticamente eficaz de la microesfera en una unidad de peso o volumen adecuada para la administración a un paciente. La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" como se usa en la presente memoria significa una o más cargas, diluyentes o sustancias de encapsulación sólidos o líquidos compatibles que son adecuados para la administración a un humano o a otro animal. El término "vehículo" indica un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el cual se combina el ingrediente activo para facilitar la aplicación. Los componentes de las composiciones farmacéuticas también son capaces de comezclarse con las moléculas de la presente invención, y entre sí, de tal manera que no haya interacción que pueda deteriorar sustancialmente la eficacia farmacéutica deseada. Farmacéuticamente aceptable significa además un material no tóxico que es compatible con un sistema biológico tal como una célula, un cultivo celular, un tejido o un órgano. Las características del vehículo dependerán de la vía de administración. Los vehículos fisiológica y farmacéuticamente aceptables incluyen diluyentes, cargas, sales, tampones, estabilizadores, desecantes, agentes emulsionantes, propelentes, agentes acidificantes, agentes de recubrimiento, solubilizadores y otros materiales que son conocidos en la técnica. En Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, se pueden encontrar formulaciones de vehículo adecuadas para las administraciones oral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, etc.
Existe una variedad de vías de administración. El modo concreto seleccionado dependerá, por supuesto, del fármaco concreto seleccionado, de la gravedad de la dolencia que se está tratando y de la dosificación necesaria para obtener una eficacia terapéutica. En términos generales, los métodos de la invención se pueden llevar a la práctica usando cualquier modo de administración que sea médicamente aceptable, es decir, cualquier modo que produzca niveles eficaces de los compuestos activos sin causar efectos adversos clínicamente inaceptables. Tales modos de administración incluyen las vías oral, rectal, tópica, nasal, interdérmica o parenteral. El término "parenteral" incluye las vías subcutánea, intravenosa, intramuscular o la infusión. Se preferirá la administración oral para el tratamiento profiláctico debido a la comodidad para el paciente, así como debido a la pauta de dosificación.
Las composiciones farmacéuticas se pueden presentar convenientemente en forma de dosificación unitaria y se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica de farmacia. Todos los métodos incluyen la etapa de poner la microesfera en contacto con un vehículo que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las composiciones se preparan poniendo las microesferas uniforme e íntimamente en contacto con un vehículo líquido, un vehículo sólido finamente dividido, o ambas cosas, y conformando después el producto si fuera necesario.
Las preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Ejemplos adicionales de disolventes incluyen propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, sales y soluciones tamponantes, tales como medios salinos o tamponados, soluciones y emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, aceites de Ringer o fijados con lactato. Los vehículos intravenosos incluyen agentes de reposición de líquido y nutrientes, agentes de reposición de electrolitos (tales como los que están basados en la dextrosa de Ringer) y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares. En general, las microesferas se pueden administrar al sujeto (cualquier receptor mamífero) usando los mismos modos de administración que los que se usan actualmente para la terapia con micropartículas en humanos. Las microesferas son útiles para una gran variedad de separaciones y fines de diagnóstico, terapéuticos, industriales, comerciales, cosméticos y de investigación, como se comenta con más detalle a continuación. Por ejemplo, para fines de diagnóstico in vivo, las microesferas pueden incluir una macromolécula, tal como una inmunoglobulina o un receptor celular marcado con una marca detectable. La administración de la microesfera marcada a un paciente crea un agente de formación de imagen para el diagnóstico de un trastorno proliferativo, tal como cáncer, o una herramienta para la evaluación del éxito de un agente terapéutico en la reducción de la proliferación de una célula u organismo adverso concreto.
Para el diagnóstico in vitro, las microesferas que contienen una macromolécula, tal como una inmunoglobulina, un receptor celular o una sonda oligonucleotídica específica para la célula u organismo que se investiga, se combinan con una muestra de ensayo, las microesferas se separan de todo componente no unido de la muestra y las moléculas unidas se detectan mediante métodos convencionales.
Las microesferas son útiles como agentes terapéuticos y pueden permitir el uso de vías alternativas de administración cuando las microesferas incluyen un fármaco terapéutico y se administran a un paciente para la liberación lenta o la administración dirigida del fármaco en un lugar que necesita tratamiento. Las microesferas también son útiles como agentes terapéuticos o profilácticos cuando las microesferas incluyen una macromolécula que es en sí un agente terapéutico o profiláctico, tal como una enzima o inmunoglobulina. La liberación lenta de tales agentes terapéuticos resulta especialmente útil para las proteínas o péptidos terapéuticos que presentan semividas cortas y deben ser administrados por inyección.
Las microesferas también son útiles para la purificación de moléculas de una mezcla compleja, como reactivo para la detección o cuantificación de una molécula específica o para la producción de moléculas, tales como anticuerpos. Por ejemplo, las microesferas que contienen una macromolécula tal como una inmunoglobulina, se pueden acoplar a una columna cromatográfica y usar en la cromatografía de inmunoafinidad para separar un ligando de una mezcla compleja. De forma alternativa, se pueden usar microesferas que incluyen una macromolécula marcada o una mezcla de macromoléculas marcadas específicas para diferentes células o biomoléculas, tales como receptores celulares, para detectar cambios en el número de células o biomoléculas en respuesta a una condición de ensayo concreta, usando técnicas tales como citometría de flujo.
Asimismo, las microesferas se pueden usar como adyuvantes para la producción de vacunas, en las que las microesferas que contienen el antígeno se inyectan en un animal de laboratorio, tal como un ratón o conejo, para desencadenar una respuesta inmune intensificada para la producción de anticuerpos frente al antígeno.
Otros usos comerciales incluyen formulaciones de limpieza, tales como la formación de partículas enzimáticas para la adición a detergentes; cosméticos, tales como la formación de partículas de colágeno para su suspensión en una loción o crema; y pinturas.
Diagnóstico in vitro
Ensayos in vitro: Las microesferas descritas en la presente memoria son útiles como partículas de fase sólida en un ensayo, tal como un ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas, hibridación puntual o transferencia de tipo Western, para la detección de una diana concreta tal como una célula, biomolécula o fármaco en una muestra biológica. Las microesferas diseñadas para este uso están compuestas por moléculas de afinidad específicas de la molécula diana. Por ejemplo, la macromolécula es una inmunoglobulina, un receptor celular o una sonda oligonucleotídica y está unida a un tubo de ensayo o a una placa de microvaloración.
Para la detección o cuantificación de una molécula diana de interés, se combina una muestra con una solución que contiene las microesferas, se hacen reaccionar las macromoléculas en las microesferas con la molécula diana, las microesferas se separan de todo componente no unido de la muestra y las microesferas que contienen moléculas unidas se detectan mediante métodos convencionales. Las microesferas teñidas con fluorescencia son especialmente adecuadas para el análisis por citometría de flujo de acuerdo con los métodos conocidos para los expertos en la técnica.
Histopatología: Las microesferas descritas en la presente memoria son útiles como sondas o marcadores visuales de patología en una muestra histológica. Las macromoléculas de las microesferas diseñadas para este uso son específicas de biomoléculas expresadas durante un estado patológico concreto y se marcan con una marca detectable. Por ejemplo, la macromolécula es una inmunoglobulina, un receptor celular o una sonda oligonucleotídica específica de una célula anormal, tal como una célula que prolifera con rapidez, o de un organismo patógeno, por ejemplo, un virus.
Para la detección de un estado patogénico, se combina una muestra histológica con una solución que contiene las microesferas, se hacen reaccionar las macromoléculas marcadas en las microesferas con la molécula diana de interés y las microesferas unidas se detectan detectando la marca de acuerdo con métodos conocidos para los expertos en la técnica.
Diagnóstico por imagen in vivo
Las microesferas descritas en la presente memoria son útiles como agentes de formación de imágenes para la localización in vivo de una molécula, tipo celular o estado patológico concreto de manera similar a la descrita anteriormente en relación con el uso de las microesferas para histopatología. Las macromoléculas en las microesferas diseñadas para este uso son específicas de moléculas expresadas por una célula o un organismo patológico concreto y se marcan con una marca detectable. Por ejemplo, la macromolécula es una inmunoglobulina, un receptor celular o una sonda oligonucleotídica específica de una célula tumoral o de un organismo patógeno, tal como un virus.
Las microesferas se usan tanto para detectar un estado patológico como para seguir el éxito de una terapia, tal como una quimioterapia o cirugía para asegurarse de que el tamaño de un tumor de tejido anormal ha disminuido o se ha extirpado por completo. Para este uso, un paciente recibe una administración de una solución de microesferas, preferentemente por vía intravenosa, se les da a las macromoléculas marcadas en las microesferas un tiempo suficiente para localizar el órgano o región corporal afectado, se hace reaccionar la macromolécula con una molécula diana expresada por la célula u organismo en estudio y las microesferas unidas se detectan detectando la marca mediante técnicas de imagen convencionales conocidas para los expertos en la técnica, tales como rayos X.
Sistemas de administración de fármacos
Las microesferas son útiles para la terapia o profilaxis cuando la macromolécula es un agente terapéutico o un compuesto farmacéutico que se administra a un paciente y se libera lentamente de las microesferas a lo largo del tiempo. Estas microesferas son especialmente útiles para la liberación lenta de fármacos con semividas biológicas cortas, tales como proteínas o péptidos. Si el compuesto farmacéutico no se puede introducir en una partícula, se compleja con un portador, tal como albúmina, y el complejo portador-compuesto farmacéutico se introduce en una microesfera. La microesfera puede proporcionar la liberación lenta del agente en el cuerpo, o bien la microesfera puede incluir una molécula de afinidad específica de un tejido diana o tumor y se puede inyectar a un paciente para la liberación lenta dirigida del agente terapéutico, tal como un agente antitumoral, antiviral, antibacteriano, antiparasitario o antiartrítico, citoquina, hormona o insulina, directamente en el lugar que requiere tratamiento. Como se comentó anteriormente, la molécula de afinidad puede se escindible.
Las microesferas compuestas por proteínas antigénicas o conjugados polisacárido-proteína capaces de provocar una respuesta inmune son especialmente adecuadas para el uso como vacunas.
Las microesferas también son útiles como vehículos para la terapia génica o la producción de "vacunas genéticas" cuando están compuestas por ácidos nucleicos, tales como ADN o ARN, que se incorporan en el ADN del paciente o son transfectadas en una célula diana para producir una proteína deseada. Por ejemplo, se pueden administrar polinucleótidos que codifican proteínas nucleares de virus, tales como el influenzavirus o el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), en forma de microesferas para la expresión de una proteína antigénica. Esto resulta ventajoso en cuanto a que no hace falta desarrollar vacunas nuevas con tanta frecuencia ya que las proteínas nucleares víricas mutan en mucha menor medida que los antígenos de la superficie celular, usados actualmente en las vacunas. Las microesferas de ácido nucleico se administran a las células de mamíferos de una manera bastante similar a la que se administra el ADN desnudo. La secuencia de ácido nucleico deseada se inserta en un vector, tal como ADN plasmídico, con un promotor, tal como el promotor de SV40 o el promotor de citomegalovirus, y puede incluir, opcionalmente, un gen reportero, tal como la beta-galactosidasa. El ácido nucleico se combina preferentemente con una proteína portadora y/o un catión, tal como polilisina, para facilitar la formación de partículas como se describió anteriormente. Las microesferas se administran después directamente al paciente o se transfectan en células de mamífero que se administran después al paciente que requiere tratamiento o profilaxis. Las microesferas de ácido nucleico pueden incluir una sustancia tal como cloroquinona, que permite que los ácidos nucleicos salgan de los compartimentos citoplasmáticos y penetren en el citoplasma de manera que las células los puedan transcribir y traducir más fácilmente. Además, las microesferas se pueden recubrir con una sustancia que aumenta la eficacia de la traducción o se pueden recubrir con una sustancia para proporcionar un direccionamiento específico de célula de las microesferas.
Aplicaciones en investigación
Las microesferas son útiles como herramientas de investigación para la purificación de una biomolécula de una mezcla compleja, como reactivo para la detección o cuantificación de una biomolécula o para la producción de biomoléculas tales como anticuerpos.
Por ejemplo, las microesferas compuestas por una macromolécula tal como una inmunoglobulina, se acoplan a una columna cromatográfica y se usan en la cromatografía de inmunoafinidad para separar un ligando de una mezcla compleja. Los expertos en la técnica entenderán que la microesfera para uso en la cromatografía líquida de alta presión se debe acoplar primero a una esfera o perla en fase sólida no compresible, de manera que el relleno de la columna mantiene su estructura rígida bajo presión.
De forma alternativa, las microesferas que incluyen una macromolécula marcada o una mezcla de macromoléculas marcadas específicas de diferentes células o receptores celulares se usan para detectar cambios en el número de células o receptores de la superficie celular en respuesta a una condición de ensayo concreta, usando técnicas tales como citometría de flujo.
La invención se entenderá mejor en referencia a los ejemplos siguientes. Se pretende, sin embargo, que estos ejemplos meramente ilustren las realizaciones de la invención, y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención.
Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de microesferas que contienen un agente farmacéutico
Se prepararon microesferas con albúmina de suero humana (HSA) adecuadas para uso como vehículo de administración de fármacos.
Preparación de microesferas de Rifampicin TM-HSA
Se añadió carbonildiimidazol (124 mg, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) a una solución de 50 mg del antibiótico Rifampicin TM (3-[4-metilpiperaziniliminometil]rifamicina, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) en 2 ml de dimetilformamida (DMF). La mezcla resultante se dejó en reposo a temperatura ambiente durante cuatro horas. A la mezcla se añadió una mezcla de 1 ml de albúmina de suero humana (HSA, 25%, Annour Pharmaceutical Co., Collegeville, Pa.) y 2 ml de agua desionizada. La mezcla se dejó a temperatura ambiente durante la noche. Se añadieron a la mezcla 14 ml de una solución de polímeros que contenía 25% de PVP (40.000 dalton) y 25% de PEG (3.350 dalton) en NaOAc 0,1 M, pH 4. La mezcla se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente, durante 30 minutos a 37ºC y durante 30 minutos a 58ºC, y después se enfrió a temperatura ambiente. Las partículas se aislaron por centrifugación, se lavaron tres veces con agua desionizada y se resuspendieron en 20 ml de agua. El porcentaje de HSA incorporado en las partículas fue de 74% (determinado mediante el ensayo de proteínas BCA TM (Pierce, Rockford, Ill.)). El porcentaje de Rifampicin TM incorporado en las partículas fue superior a 6,8%. Se determinó que el tamaño medio de las partículas fue de 68 nm de diámetro usando un clasificador de células Coulter TM.
Preparación de microesferas de Virazole TM-HSA
Se añadió carbonildiimidazol (100 mg, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) a una solución de 36 mg del fármaco antiviral Virazole Marca Registrada (ICN Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, Calif.) en 0,2 ml de dimetilformamida (DMF). La mezcla resultante se dejó en reposo a temperatura ambiente durante cuatro horas. A la mezcla se añadió una mezcla de 0,2 ml de albúmina de suero humana (HSA) (25%, Annour Pharmaceutical Co., Collegeville, Pa.) y 0,4 ml de agua desionizada. La mezcla se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente, durante 30 minutos a 37ºC y durante 30 minutos a 58ºC, y después se enfrió a temperatura ambiente. Las partículas se aislaron por centrifugación, se lavaron tres veces con agua desionizada y se resuspendieron en 20 ml de agua. El porcentaje de HSA incorporado en las partículas fue de 61% (determinado mediante el ensayo de proteínas BCA TM (Pierce, Rockford, Ill.)). El porcentaje de Virazole Marca Registrada incorporado en las partículas fue de 10%.
Ejemplo 2 Acoplamiento de polisacárido a la superficie externa de microesferas de proteína
El polisacárido PRP-AH se acopló a la superficie externa de dos microesferas de proteína diferentes.
Se preparó un derivado dihidrazida de ácido adípico (AH) del fosfato de polirribosilrribitol (PRP) de Haemophilus influenza tipo b (Hib), uno de los organismos principales causantes de la meningitis bacteriana, denominado PRP-AH, acoplando PRP a ácido adípico (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) en presencia de bromuro de cianógeno (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) (El PRP se obtuvo de Massachusetts Public Health Biologic Laboratory (Jamaica Plain, Mass.)).
Acoplamiento de PRP-AH a microesferas de ovoalbúmina
Se prepararon microesferas de ovoalbúmina añadiendo ovoalbúmina (1%, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) a una solución de polímeros que contenía 25% de PVP (40.000 dalton) y 25% de PEG (3.500 dalton). La mezcla se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente, 30 minutos a 37ºC y 30 minutos a 58ºC, provocando la formación de microesferas. Las partículas se recogieron por centrifugación. Se determinó un diámetro medio de las partículas de aproximadamente 0,068 \mum. Las partículas de ovoalbúmina (1,5 mg) en tampón MES 1 M, pH 5,0 (0,1 ml) se combinaron con el PRP-AH (1,5 mg). Seguidamente, se añadieron 2,79 mg de hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC, Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.). La reacción se mezcló a temperatura ambiente durante tres horas. Las partículas se recogieron por centrifugación y se lavaron tres veces con tampón MES 1 M, pH 5,0 (400 ml). Se determinó un rendimiento de PRP de 25% mediante el ensayo de polisacárido libre Anthrone, descrito en METHODS IN IMMUNOLOGY AND IMMUNOCHEMISTRY, vol. II, Williams, C.A. y Chase, M.W. (editores), 1968, págs. 288-289, Academic Press, NY. Mediante el ensayo de proteínas BCA TM (Pierce, Rockford, Ill.) se determinó un contenido en proteínas de 55%. La relación entre PRP y proteína fue de 0,46. El diámetro medio de las partículas resultantes fue de 0,067 \mum.
La recuperación de polisacárido libre y la carga de polisacárido en las partículas (relación de polisacárido:ovoalbú-
mina) dependía de la relación inicial entre polisacárido y partícula de ovoalbúmina. A medida que aumentaba la relación entre polisacárido y partícula de ovoalbúmina, disminuía la recuperación de polisacárido libre y aumentaba la carga de polisacárido en las partículas, como se muestra en la siguiente Tabla 1 de ejemplos.
TABLA 1 DE EJEMPLOS Recuperación y carga de polisacárido en microesferas de ovoalbúmina
Relación inicial de polisacárido: partícula Recuperación de polisacárido (%) Carga de polisacárido
1:1 25 0,46
1:2 30 0,29
1:4 66 0,21
1:8 94 0,14
Acoplamiento de PRP-AH a microesferas con toxoide tetánico
Se combinó el toxoide tetánico (27 mg/ml, obtenido del Massachusetts Public Health Biologic Laboratory (Laboratorio Biológico para la Salud Publica de Massachusetts) (Jamaica Plain, Mass.)) con dos volúmenes de una solución de polímeros que contenía 25% de PVP (40.000 dalton) y 25% de PEG (3.500 dalton), pH 5,0. La mezcla se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente, 30 minutos a 37ºC y 30 minutos a 58ºC, provocando la formación de microesferas. Las partículas se recogieron por centrifugación. Se determinó un diámetro medio de las partículas de aproximadamente 0,082 \mum.
Las partículas de toxoide tetánico (0,825 mg) en tampón MES 1 M, pH 5,0 (0,1 ml) se combinaron con PRP-AH (1,5 mg). Seguidamente, se añadieron 2,79 mg de hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC, Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.). La reacción se mezcló a temperatura ambiente durante tres horas. Las partículas se recogieron por centrifugación y se lavaron tres veces con tampón MES 1 M, pH 5,0 (400 ml). Se determinó un rendimiento de PRP de 16% mediante el ensayo de polisacárido libre Anthrone, descrito en METHODS IN IMMUNOLOGY AND IMMUNOCHEMISTRY, vol. 11, Williams, C.A. y Chase, M.W. (editores), 1968, págs. 288-289, Academic Press, N.Y. Se determinó un contenido en proteína de 99% mediante el ensayo de proteínas BCA TM (Pierce, Rockford, Ill.). La relación entre PRP y proteína fue 0,1. El diámetro medio de las partículas resultantes fue de 0,080 \mum.
Ejemplo 3 Liberación de proteína y polímero radiomarcados de microesferas
Se prepararon microesferas usando proteína radiomarcada (albúmina de suero bovina, BSA) y polímero radiomarcado (PEG). Se midió la liberación de radiactividad en función del tiempo.
Las microesferas se prepararon combinando proteína radiomarcada (10 mg/ml de [14]C-BSA, NEN, Boston, Mass.) con dos volúmenes de una solución de polímeros que contenía 25% de PVP (40.000 dalton) y 25% de [3]H-PEG (3.500 dalton, NEN, Boston, Mass.), pH 5,0. La mezcla se incubó durante 30 minutos a 37ºC, 30 minutos a 58ºC y 30 minutos a 70ºC, provocando la formación de microesferas. Las partículas se recogieron por centrifugación.
La proteína y el polímero se liberaron lentamente de las microesferas añadiendo 500 ml de solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4) e incubando la mezcla a 37ºC bajo suave agitación usando un rotador Nutator TM. En diferentes momentos, se precipitaron las partículas por centrifugación a 8.000 rpm durante 10 minutos, se eliminó el sobrenadante con una pipeta y se analizó la radiactividad añadiendo líquido de centelleo líquido y contando en un contador de centelleo líquido. Las partículas se resuspendieron después en 500 ml de solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4) y se volvieron a colocar a 37ºC con suave agitación hasta el siguiente momento. En la Fig. 1 se muestra la cinética de liberación de la proteína y el polímero radiomarcados durante la incubación a 37ºC.
Se prepararon microesferas y se analizó la liberación como se describió anteriormente, pero se usaron tres concentraciones diferentes de polímero y las microesferas se formaron por incubación a 58ºC. En la primera preparación se usó 25% de PEG y 25% de PVP. En la segunda preparación se usó 20% de PEG y 20% de PVP. En la tercera preparación se usó 12,5% de PEG y 12,5% de PVP. En la Fig. 2 se muestra la cinética de liberación de proteína radiomarcada. En la Fig. 3 se muestra la cinética de liberación de polímero radiomarcado.
Se volvieron a preparar microesferas y se analizó la liberación como se describió anteriormente, pero se usaron tres concentraciones diferentes de polímero y las microesferas se formaron por incubación a 58ºC, 70ºC, tanto a 37ºC como 58ºC y tanto a 37ºC como 70ºC. En la Fig. 4 se muestra la cinética de liberación de proteína radiomarcada. En la Fig. 5 se muestra la cinética de liberación de polímero radiomarcado. En la Fig. 6 se muestra la liberación de PEG en función de la concentración de polímero.
Ejemplo 4 Formación microesferas que contienen ADN
Se prepararon microesferas que contenían ADN y se transfectaron en fibroblastos. Se analizó la eficacia de la transfección y la expresión de proteínas en las microesferas.
Una alícuota de 0,025 ml de una solución de 1 mg/ml de un ADN plasmídico (pCMV beta Gal, Promega, Milwaukee, Wis.) se complejó con 0,025 ml de una solución de 5,0 mg/ml de poli-L-lisina con un peso molecular medio comprendido en el intervalo de 1 kDa a 40 kDa (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.).
Al complejo de ADN plasmídico-poli-L-lisina se añadió agitando con vórtex 0,1 ml de una solución de 25% (peso/volumen) de polivinilpirrolidona (peso molecular medio 40 kDa, Spectrum, Gardena, Calif.) y 25% (peso/volumen) de polietilenglicol (peso molecular medio 3,35 kDa, Spectrum, Gardena, Calif.) en acetato sódico 0,1 M, pH 5,5.
La mezcla se incubó a 37ºC durante 30 minutos y después a 70ºC durante 30 minutos. Se formaron microesferas que contenían ADN. La mezcla se centrifugó a 17.500 x g durante 10 minutos, se aspiró el sobrenadante y las partículas se lavaron tres veces con 0,3 ml de glicerol al 10% (volumen/volumen) en agua desionizada. Las microesferas se resuspendieron en 0,050 ml de agua desionizada. Las microesferas que contenían ADN se aplicaron en fibroblastos NIH3T3 y se incubaron hasta 24 horas para permitir la incorporación de las microesferas en las células. La incorporación se terminó lavando las células tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS/Ca[2+] + Mg[2+] -libre) (GIBCO-BRL, Gaithersburg, Md.) y añadiendo medio mínimo esencial de Dulbecco (DMEM, GIBCO-BRL, Gaithersburg, Md.).
La incorporación y expresión del ADN de pCMV beta Gal se analizó en términos de la eficacia de la transfección y la cantidad de enzima beta-galactosidasa expresada. La eficacia de la transfección se determinó fijando las células y observando el desarrollo de color con el sustrato de la enzima beta-galactosidasa X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galactopiranósido, GIBCO-BRL, Gaithersburg, Md.). La cantidad de enzima beta-galactosidasa expresada se determinó lisando las células transfectadas y midiendo la actividad enzimática total con el sustrato de la enzima beta-galactosidasa CPRG (rojo de clorofenol- beta-D-galactopiranósido, Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.).
Resultados
En la Fig. 7 se muestra la cantidad de enzima beta-galactosidasa expresada en las células lisadas, que fueron transfectadas usando: 1) ADN desnudo (ninguna adición); 2) liposomas catiónicos más ADN; o 3) microesfera que contenía ADN, preparada como se describió anteriormente.
Ejemplo 5 Formación de microesferas que contienen acetato de leuprolida
Se prepararon microesferas que contenían péptido acetato de leuprolida y albúmina de suero humana. El acetato de leuprolida es un análogo genérico de la hormona liberadora de la hormona luteinizante, que es un péptido usado principalmente en el tratamiento del cáncer de próstata.
Se añadió una alícuota de 0,010 ml de una solución de 10-100 mg/ml de acetato de leuprolida en agua (LHRH, TAP Pharmaceuticals, Deerfield, Ill.) a 0,168 ml de una solución al 2-10% (peso/volumen) de dextrán sulfato en agua (peso molecular medio 500 kDa) y la solución se agitó a conciencia. A la solución de leuprolida/dextrano se añadió una alícuota de 0,856 ml de una solución que contenía 25% (peso/volumen) de polietilenglicol con un peso molecular medio de 3,35 kDa (Spectrum, Gardena, Calif.) y 25% (peso/volumen) de polivinilpirrolidona con un peso molecular medio de 40 kDa en una solución acuosa de acetato sódico 0,1 M, pH 5,5. La solución resultante se mezcló a conciencia y se dejó reposar durante hasta 30 minutos. Después se añadió a la solución una alícuota de 0,25 ml de una solución al 20% (peso/volumen) de albúmina de suero humana (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) en agua. La solución final se mezcló a conciencia y se colocó en un baño de agua a entre 70ºC y 90ºC durante un periodo de tiempo de 30 minutos a 3 horas. Se formaron microesferas.
Las microesferas se recogieron por centrifugación a 17,5K x g durante 10 minutos, se lavaron en 0,5 ml de H_{2}Od y se recogieron de nuevo por centrifugación.
Se prepararon partículas estériles usando el procedimiento anterior y esterilizando todas las soluciones por filtración antes del uso y realizando todas las manipulaciones con tubo abierto en una campana de flujo laminar para el cultivo tisular.
La liberación in vitro de acetato de leuprolida se midió centrifugando las microesferas y resuspendiéndolas en un medio de liberación salino tamponado con fosfato. En la Fig. 8 se muestra la cinética de liberación.
Las microesferas estaban compuestas por aproximadamente 10% de acetato de leuprolida, 50% de albúmina de suero humana, 20% de dextrán sulfato y 20% de polietilenglicol/ polivinilpirrolidona.
Se prepararon partículas similares que también incluían sulfato de cinc o ácido caprílico, que retardan ambos la liberación de proteínas y péptidos de las microesferas.
Ejemplo 6 Preparación de microesferas de albúmina de suero bovina usando polietilenglicol y poloxámero 407
Las microesferas de albúmina de suero bovina se prepararon usando una mezcla de polímeros de polietilenglicol y poloxámero 407. Se disolvieron 1,25 gramos de polietilenglicol (PM 3.550, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) y poloxámero 407 (BASF, Parsippany, N.J.) en 100 ml de un tampón acetato sódico 0,1 N, pH 5,5, para obtener una solución al 12,5%. Se disolvió en H_{2}Od una solución de 10 mg/ml de albúmina de suero bovina (BSA, Fracción V, Sigma Chemical Co.). Se combinó una alícuota de 400 ml de la solución de BSA con 800 ml de la solución de polímeros. La mezcla se agitó en vórtex. Se formó una solución transparente. La solución se calentó a 70ºC durante 30 minutos. La formación de partículas se observó mediante la presencia de una suspensión blanca lechosa.
La solución de polímeros residual se eliminó por centrifugación a 12.500 rpm durante 10 minutos y decantación siguiente del disolvente. Se realizaron dos lavados y etapas de centrifugación con etanol al 10% en agua para eliminar más polímero residual.
Ejemplo 7 Preparación de microesferas de albúmina de suero bovina usando dextrano
Se prepararon microesferas de albúmina de suero bovina usando dextrano.
Se disolvieron 12,5 gramos de dextrano (PM 500.000, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) en 100 ml de un tampón acetato sódico 0,1 M, pH 5,0, para obtener una solución al 12,5%. Se disolvió albúmina de suero bovina (BSA, Sigma Chemical Co.) en H_{2}Od a una concentración de 10 mg/ml. Se colocó una alícuota de 400 ml de la solución de BSA en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Se añadió a la solución de BSA una alícuota de 800 ml de la solución de polímero de dextrano. La solución se agitó en vórtex. Se formó una solución transparente. El tubo de microcentrífuga se colocó en un baño de agua de 70ºC durante 30 minutos. Se observó una suspensión blanca lechosa que indica la formación de microesferas.
La solución de polímero de dextrano residual se eliminó por centrifugación a 12.500 rpm durante 10 minutos y decantación siguiente del disolvente. Se realizaron dos lavados y etapas de centrifugación con etanol al 10% en agua para eliminar más polímero residual. Las micrografías electrónicas de barrido revelaron la formación de microesferas de tamaño submicrónico, ordenadas a menudo en una estructura de tipo cuerda.
Ejemplo 8 Preparación de microesferas de albúmina de suero bovina usando Eudragit Marca Registrada E100
Se prepararon microesferas de albúmina de suero bovina usando el polímero Eudragit® E100. Este polímero es soluble en un disolvente orgánico que es miscible con agua.
El polímero Eudragit® E100 (Rohm, Malden, Mass.) se disolvió en una solución 1:1 de tampón acetato sódico 0,1 M (pH 5,0) y etanol. El pH final de la solución fue pH 6,5. Una alícuota de 400 ml de una solución de 10 mg/ml de albúmina de suero bovina (BSA, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) se combinó con 800 ml de la solución del polímero Eudragit® E100. Se formó una solución transparente. La solución de BSA/polímero se incubó en un baño de agua a 70ºC durante 30 minutos. Se observó una suspensión blanca lechosa que indica la formación de microesferas. Las partículas se recogieron por centrifugación durante 10 minutos a 8.000 rpm y decantación del líquido.
Ejemplo 9 Preparación de microesferas de insulina usando dextrano
Se prepararon microesferas de insulina usando un polímero de dextrano.
Se disolvió una solución al 20% (peso/peso) de un polímero de dextrano (PM 500.000, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) en tampón acetato sódico, pH 5,0. Se añadieron 1,9 ml de H_{2}Od a 20,5 mg de insulina (Sigma Chemical Co.). Se añadieron 100 ml de HCl 0,2 M para disolver la insulina. Se colocó una alícuota de 400 ml de la solución de insulina en un tubo de ensayo. Se añadió a la solución de insulina una alícuota de 800 ml de la solución de dextrano. La mezcla se agitó en vórtex. La mezcla se volvió turbia al añadir la solución de dextrano. Los tubos se calentaron a una temperatura final de 70ºC o 90ºC para formar microesferas de insulina. Las microesferas se centrifugaron a 10.000 rpm durante 5 minutos y el líquido se decantó para eliminar polímero residual. Las microesferas se lavaron con etanol al 10% en agua.
Las microesferas se colocaron en una solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4, para determinar las características de disolución. Las partículas de insulina formadas a una temperatura final de 90ºC no se disolvían en la solución salina tamponada con fosfato, mientras que las partículas de insulina preparadas a una temperatura final de 70ºC se disolvían al cabo de 15 minutos. Por lo tanto, la estabilidad de las partículas de insulina se puede ajustar variando la temperatura de incubación usada durante la formación de las partículas.
Ejemplo 10 Preparación de microesferas usando diferentes polímeros
Se prepararon microesferas de albúmina de suero humana usando nueve polímeros diferentes o mezclas de polímeros.
Procedimiento
Se preparó una solución de proteína (1-5% de albúmina de suero humana, pH 4,5-5,5, o albúmina de suero bovina) en un tampón. Se prepararon las siguientes soluciones de polímeros:
polietilenglicol/ polivinilpirrolidona (PEG de 3kDa/PEG de 40 kDa en una mezcla 1:1); hidroxietilalmidón (500 kDa); polímero Pluronic L-101^{TM}; dextrano (3-500 kDa); dextrán sulfato (3-500 kDa); polivinilpirrolidona (10-360 kDa); polietilenglicol/ polivinilpirrolidona con inulina (un polisacárido); polietilenglicol/polivinilpirrolidona con polímero Pluronic L-101^{TM}; dextrano con polímero Pluronic L-101^{TM}. Se mezcló aproximadamente un volumen de solución de proteína con dos volúmenes de solución de polímero. La mezcla se incubó en un baño de agua a entre 70ºC y 90ºC durante treinta minutos. La mezcla se colocó después en un baño de hielo. Se observó la formación de microesferas.
Las microesferas se centrifugaron hasta compactarlas en un sedimento, el sobrenadante se decantó y el sedimento se lavó dos veces en una solución de etanol al 10% en agua para eliminar la solución de polímero residual. A continuación las microesferas se lavaron tres veces con agua desionizada. La microesferas se usaron o ensayaron inmediatamente, o se liofilizaron para uso posterior.
Observaciones
Las microesferas preparadas usando polímeros con un peso molecular más alto o una concentración más alta de polímeros proporciona un medio más viscoso que produce una distribución más uniforme del tamaño de las microesferas. La inclusión de un agente tensioactivo, tal como el polímero Pluronic L-101^{TM}, o el mezclado durante la formación de las microesferas afectó el tamaño de las microesferas. Un aumento en la concentración de proteína durante la formación de las microesferas provocó un aumento en la incorporación de proteína en las microesferas. Un aumento en el tamaño del polímero provocaba generalmente un aumento en la incorporación de proteína en las microesferas. El uso de diferentes polímeros afectaba la cinética de liberación. Por ejemplo, las microesferas de albúmina de suero bovina (BSA) preparadas usando dextrano liberaban aproximadamente 15% menos de BSA que las microesferas preparadas usando PEG/PVP. Sin embargo, la liberación de polisacárido de las microesferas de proteína-polisacárido, tal como la liberación de [3]H-inulina de microesferas de albúmina de suero humana/inulina, era más rápida cuando se empleaba dextrano en lugar de PEG/PVP.
Ejemplo 11 Preparación de microesferas de proteína que contienen acetato de nafarelina usando diferentes polímeros
Se prepararon microesferas de proteína que contenían el fármaco acetato de nafarelina.
El acetato de nafarelina es útil en el tratamiento de la endometriosis, la pubertad precoz y el cáncer de próstata.
Procedimiento
Se prepararon microesferas de albúmina de suero humana como se describió anteriormente en el Ejemplo 10, usando nueve polímeros diferentes o mezclas de polímeros. Se disolvió acetato de nafarelina (Roche Laboratories, Nutley, N.J.) en agua desionizada para producir una solución de 10 mg/ml.
A 1 mg de acetato de nafarelina se añadieron 10 mg de las microesferas de albúmina de suero humana. La mezcla se agitó en vórtex y mezcló durante 16 horas a 4ºC. Se añadió a la mezcla una solución de sulfato de amonio 3 M a una concentración final de 0,5 M y se agitó en vórtex y mezcló durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se añadió una solución de sulfato de cinc 1 M a una concentración final de 0,01 M, 0,1 M o 1 M y se agitó en vórtex y mezcló durante 1 hora a temperatura ambiente.
Las mezclas se centrifugaron, el sobrenadante se decantó y el sedimento se resuspendió tres veces en agua desionizada para lavar las microesferas.
Observaciones
La adición de sulfato de cinc redujo la velocidad de liberación de acetato de nafarelina de las microesferas de albúmina de suero humana. Los resultados se muestran en la Fig. 9.
Ejemplo 12 Preparación de microesferas de doxorrubicina/albúmina
Se prepararon microesferas de albúmina de suero humana que contenían el fármaco quimioterapéutico doxorrubicina.
A 1 ml de una solución de 250 mg/ml de albúmina de suero humana (Sigma, St. Louis, Mo.) en H_{2}Od se añadieron 0,05 ml de una solución de 5 mg/ml de doxorrubicina (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) en H_{2}Od, la solución combinada se mezcló y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. A la solución anterior se añadieron 3,0 ml de una solución de 200 mg/ml de dextrán sulfato (PM 500.000, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) en H_{2}Od y la solución resultante se mezcló e incubó a 37ºC durante 30 minutos. La solución se incubó después a 70ºC durante 30 minutos, después de lo cual se añadió 1 ml de acetato sódico 3,0 M, pH 5,0, y la solución resultante se mezcló. La solución se incubó después a 90ºC durante 30 minutos. Se formaron microesferas. Las microesferas se lavaron dos veces con 5,0 ml de H_{2}Od.
Ejemplo 13 Incorporación de LHRH en microesferas de dextrán sulfato/albúmina
Se incorporó la hormona liberadora de la hormona luteinizante en microesferas compuestas por albúmina de suero humana y dextrán sulfato.
A 0,168 ml de una solución al 10% (peso/volumen) de dextrán sulfato (PM medio 500.000, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) en H_{2}Od se añadieron 0,25 ml de una solución al 20% (peso/volumen) de albúmina de suero humana (Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.) en H_{2}Od. La solución se mezcló a conciencia y se añadieron 0,856 ml de una solución de 25% (peso/volumen) de polietilenglicol (PM medio 3,35 kDa, Spectrum, Gardena, Calif.) y 25% (peso/volumen) de polivinilpirrolidona (PM medio 40 kDa, Spectrum, Gardena, Calif.) en una solución acuosa de acetato sódico 0,1 M, pH 5,5.
La solución resultante se mezcló a conciencia y se colocó en un baño de agua a una temperatura de 70ºC a 90ºC durante 30 minutos a 3 horas. Se formaron microesferas. Las microesferas se recogieron por centrifugación a 17,5K x g durante 10 minutos, se resuspendieron en 0,5 ml de H_{2}Od para el lavado y se recogieron de nuevo por centrifugación. Las microesferas se resuspendieron en 0,3 ml de una solución de acetato sódico 0,1 M, pH 5,5. Se añadió una alícuota de 0,01 ml de una solución de 10 mg/ml de la hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) en H_{2}Od y se incubó durante 16 horas a temperatura ambiente para permitir la unión del péptido LHRH a las microesferas. Después de la incubación de unión de 16 horas, el péptido LHRH no unido se eliminó mediante dos ciclos de lavado con H_{2}Od y recogida por centrifugación. El rendimiento de la incorporación de LHRH fue típicamente 83 a 90%.
Ejemplo 14 Incorporación de estradiol en microesferas ProMaxx®
Se formaron microesferas de albúmina de suero humana combinando 12,5% en peso de polietilenglicol y 12,5% en peso de polivinilpirrolidona en tampón acetato sódico 50 mM a pH 5,3 con 1% (p/v) de albúmina de suero humana disuelta en solución acuosa. La solución se mantuvo a 70ºC durante 30 minutos. Se formaron las microesferas y precipitaron en la solución. La suspensión de microesferas se lavó 3 veces en agua desionizada. A continuación se cargó estradiol en las microesferas de albúmina de suero humana en 3 cargas de diferente porcentaje en peso. El estradiol se disolvió en alcohol etílico y se incubó en presencia de las microesferas de albúmina. La afinidad del estradiol por la albúmina por medio de interacciones hidrófobas hizo que se pudiera cargar el estradiol en cargas de diferentes porcentajes en peso. Las microesferas que contenían 10% en peso de estradiol contenían 1 mg de estradiol y 8,33 mg de albúmina de suero humana (HSA). Las microesferas que contenían 49% en peso de estradiol contenían 8,15 mg de estradiol y 8,33 mg de HSA. Las microesferas que contenían 77% en peso de estradiol contenían 27,68 mg de estradiol y 8,33 mg de HSA.
Las microesferas se liberaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a pH 7,4.
Todas las muestras se hicieron girar a 20 rpm a 37ºC para asegurar un mezclado constante. Se añadió un (1) ml de PBS a las microesferas que se alojaron en tubos de centrífuga de polipropileno convencionales. En cada tiempo, se centrifugaron los tubos, se eliminó el sobrenadante y el 1 ml de medio de liberación se colocó en un vial de muestra. Cada muestra de 1 ml se secó por centrifugado al vacío y se resuspendió en 200 \mul de etanol. El estradiol liberado se medió mediante HPLC.
En la Figura 10 se muestra la liberación retardada de estradiol.
La liberación retardada de estradiol se demostró también in vivo. Las microesferas se inyectaron en cinco perros y se determinaron las concentraciones séricas resultantes mediante un radioinmunoensayo para el estradiol. Los resultados se muestran en la Figura 11. Cada uno de los tres grupos formados por cinco perros incluía un control de estradiol, que produjo las concentraciones más bajas y la semivida más baja in vivo. ProMaxx®, que son las microesferas de albúmina cargadas con estradiol, proporcionaron concentraciones plasmáticas de estradiol sustancialmente mayores con una semivida significativamente más larga. Y cuando las microesferas con estradiol se estabilizaron químicamente con EDC (etildimetilaminopropilcarbodiimida), se observaron mayores niveles plasmáticos constantes y una semivida más larga de estradiol durante un periodo de 43 días.
Ejemplo 15 Incorporación de diclofenaco sódico en microesferas ProMaxx®
Se formaron microesferas de albúmina de suero bovina combinando 12,5% en peso de polietilenglicol y 12,5% en peso de polivinilpirrolidona en tampón acetato sódico 50 mM a pH 5,3 y con albúmina de suero bovina disuelta en solución acuosa. La solución se colocó a 70ºC durante 30 minutos. Las microesferas se formaron y precipitaron en la solución. La suspensión de microesferas se lavó 3 veces en agua desionizada.
El fármaco antiinflamatorio no esteroideo diclofenaco sódico se unió a las microesferas de albúmina manipulando el grado de ionización del diclofenaco sódico mediante la alteración del pH de las soluciones de incubación. La eficacia de la incorporación de diclofenaco sódico se pudo optimizar a una incorporación de 65% ajustando las condiciones de incubación a un pH tal como se muestra en la Figura 12.
Ejemplo 16 Formación de microesferas que contenían acetato de leuprolida
El acetato de leuprolida es un análogo de la hormona liberadora de la hormona luteinizante.
Se añade una solución acuosa de albúmina (por ejemplo, albúmina de suero humana, bovina, de ratón o de rata) a una solución acuosa de un agente complejante aniónico (dextrán sulfato con un peso molecular (PM) de 10 kDa a 500 kDa, o heparín o heparán sulfato, o los ácidos poliglutámico o poliaspártico) con o sin solución acuosa de cationes divalentes (calcio o magnesio o cinc) a temperatura ambiente y la mezcla resultante se agita durante un periodo de tiempo de 5 minutos a 3 horas. A esta mezcla se añade después una solución acuosa de polímero (o bien polietilenglicol (PEG) de PM 3,5 kDa a 40 kDa; polivinilpirrolidona (PVP) de PM 6 a 40 kDa, o bien mezclas de PEG y PVP, o almidón o hidroxietilalmidón de PM 500 kDa). La concentración de albúmina en la mezcla final es de 5 a 30 g/l, la del agente complejante iónico es de 5 a 30 g/l, la de los cationes divalentes de 0 a 30 g/l y la concentración de polímero es de 100 g/l a 400 g/l. La mezcla se agita durante un periodo de 5 minutos a 6 horas a temperatura ambiente. La temperatura de la mezcla se sube a continuación a una temperatura de 37ºC a 50ºC durante un periodo de 5 minutos a 3 horas. Las microesferas se someten a una estabilización mediante la adición de un estabilizador químico (EDC u otro agente enlazante) o a una estabilización térmica mediante el calentamiento a una temperatura de 70ºC a 100ºC durante un periodo de 0,5 a 6 horas. La mezcla se somete al estabilizador durante un periodo de 10 minutos a 16 horas o, para la estabilización térmica, la temperatura se mantiene en el valor final durante 10 minutos a 6 horas. A continuación se recogen las microesferas y se separan de los componentes no incorporados de la mezcla de reacción por filtración o centrifugación con lavado siguiente, o por diafiltración. La incorporación de acetato de leuprolida en las microesferas se efectúa añadiendo una solución acuosa de la solución de leuprolida a una suspensión acuosa de las microesferas. Las concentraciones de microesferas son 1 a 50 g/l y las de acetato de leuprolida son de 1 a 100 g/l en un medio acuoso de un tampón 0 a 100 mM a pH 2,5 a 10,0. Después de la incubación del acetato de leuprolida con la suspensión de microesferas durante 5 minutos a 8 horas a entre 5 y 50ºC, las microesferas que contienen el péptido se lavan mediante los métodos antes descritos para eliminar péptido no unido. Las microesferas que contienen péptido se someten en algunos casos a una estabilización posterior mediante una exposición repetida a estabilizadores químicos, como se describió anteriormente, y después se lavan para eliminar el péptido no unido. Las microesferas finales que contienen péptido se resuspenden después en agua o se liofilizan. Su eficacia farmacéutica se determina usando un modelo farmacodinámico de rata de supresión de testosterona durante periodos de 7 a 180 días. Las microesferas que contenían acetato de leuprolida, fabricadas de acuerdo con el método anterior, se inyectaron en ratas y se detectó acetato de leuprolida en suero durante 7 a 120 días. La testosterona de suero de rata fue reprimida durante 7 a 120 días en las ratas que habían recibido la inyección de las microesferas que contenían acetato de leuprolida. Estos resultados ponen de manifiesto la liberación retardada del acetato de leuprolida fisiológicamente activo durante este periodo de tiempo.

Claims (30)

1. Una microesfera que comprende:
(a) una macromolécula; y
(b) al menos un polímero hidrosoluble;
en la que la microesfera presenta una superficie lisa que incluye una pluralidad de aberturas de canal, teniendo cada una de estas aberturas de canal un diámetro inferior a 0,1 \mum (1.000 angstrom), y en la que la microesfera no es un hidrogel.
2. Una microesfera según la reivindicación 1, en la que la macromolécula es una proteína o un ácido nucleico.
3. Una microesfera según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la microesfera contiene de 40 a menos de 100% de proteína.
4. Una microesfera según la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en la que la proteína se selecciona entre las proteínas: albúmina (preferentemente albúmina de suero humana); HAS; BSA; IgG; IgM; insulina; hGH; lisozima; alfa-lactoglobulina; factor de crecimiento de fibroblastos básico; VEGF; quimotripsina; tripsina; anhidrasa carbónica; ovoalbúmina; fosforilasa b; fosfatasa alcalina; beta-galactosidasa; fibrinógeno; poli-L-lisina; anticuerpos; caseína; colágeno; proteína de soja; gelatina; hormona de crecimiento humana; GCSF; GMCSF; LHRH; asparaginasa; tPA; uroquinasa; estreptoquinasa; interferón; glucagón; ACTH; oxitocina; secretina; vasopresina; y levotiroxina.
5. Una microesfera según la reivindicación 4, en la que la proteína es albúmina.
6. Una microesfera según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el polímero hidrosoluble se selecciona entre:
(1) polímeros basados en carbohidratos, tales como metilcelulosa, polímeros basados en carboximetilcelulosa, dextrano, polidextrosa, quitinas derivatizadas, quitosán y almidón (incluido hidroxietilalmidón) y sus derivados;
(2) alcoholes polialifáticos tales como poli(óxido de etileno) y sus derivados, incluidos polietilenglicol (PEG), acrilatos de PEG, polietilenimina, poli(acetato de vinilo) y sus derivados;
(3) polímeros polivinílicos tales como poli(alcohol vinílico), poli(vinil)pirrolidona, poli(fosfato de vinilo), ácido poli(vinil)fosfónico y sus derivados;
(4) ácidos poliacrílicos y sus derivados;
(5) ácidos poliorgánicos, tales como ácido polimaleico y sus derivados;
(6) poliaminoácidos, tales como polilisina, y poliiminoácidos, tales como poliiminotirosina, y sus derivados;
(7) copolímeros y copolímeros de bloques, tales como poloxámero 407 o el polímero Pluronic L-101 TM y sus derivados;
(8) terc-polímeros y sus derivados;
(9) poliéteres, tales como poli(tetrametilen éter glicol) y sus derivados;
(10) polímeros presentes en la naturaleza, tales como ceína y pululano, y sus derivados;
(11) poliimidas, tales como poli(metacrilato de n-tris(hidroximetil)metilo) y sus derivados;
(12) agentes tensioactivos, tales como polioxietilensorbitán y sus derivados;
(13) poliésteres, tales como poli((n)monometil éter de etilenglicol) éster de mono(succinimidilsuccinato) y sus derivados;
(14) polímeros ramificados y cíclicos, tales como PEG ramificado y ciclodextrinas y sus derivados; y
(15) polialdehídos, tales como poli(óxido de perfluoropropileno-b-perfluoroformaldehído) y sus derivados.
7. Una microesfera según la reivindicación 6, en la que el polímero hidrosoluble es un polímero basado en carbohidratos.
8. Una microesfera según la reivindicación 7, en la que el polímero basado en carbohidratos es hidroxietilalmidón.
9. Una microesfera según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la microesfera no contiene aceite o disolvente orgánico detectable.
10. Una microesfera según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente un agente terapéutico y/o un agente complejante.
11. Una microesfera según la reivindicación 10, en la que el agente complejante es:
(a) un agente complejante seleccionado entre: Dextrán sulfato; heparín sulfato; heparán sulfato; condroitín sulfato; poliestireno sulfonato sódico; carboximetilcelulosa; poli(ácido aspártico); poli(ácido glutámico); polilisina; poliarginina; poliiminoácidos; poliiminotirosina; resina de colestiramina; dietilaminoetilcelulosa; policitrulina; poliornitina; albúmina; IgG; IgM; polímeros hidrófobos; silicona; ceína; lignina; ácidos grasos; fosfolípidos; gelatina; y cationes divalentes (por ejemplo, calcio, magnesio, cinc);
(b) un agente complejante que presenta la estructura de fórmula I:
IPOLY-[Y^{-}]_{n} X^{+}
en la que POLY representa una cadena principal del agente complejante aniónico que puede ser lineal o ramificada;
en la que Y^{-} representa un grupo aniónico, por ejemplo, un grupo sulfato, carboxilo, fosfato, nitrato, carbonato o similar, que puede estar acoplado a una o más cualesquiera de las ramificaciones de la cadena principal;
en la que X^{+} representa un grupo catiónico que es, por ejemplo, un contraión del grupo aniónico;
en la que n es un número entero de 1 a 10.000, de 5 a 100, de 5 a 1.000 o de 5 a 10.000; y
en la que cuando n es mayor que 1, los n grupos Y^{-} pueden ser iguales o diferentes; o
(c) un agente complejante que presenta la estructura de fórmula II:
IIPOLY-[X^{+}]_{n} Y^{-}
en la que POLY representa una cadena principal del agente complejante catiónico que puede ser lineal o ramificada;
en la que X^{+} representa un grupo catiónico, por ejemplo un grupo amino, que puede estar acoplado a una o más cualesquiera de las ramificaciones de la cadena principal;
en la que Y^{-} representa un grupo aniónico que es un contraión del grupo catiónico;
en la que n es un número entero de 1 a 10.000, de 5 a 100, de 5 a 1.000 o de 5 a 10.000; y
en la que cuando n es mayor que 1, los n grupos X^{+} pueden ser iguales o diferentes.
12. Una microesfera según la reivindicación 11, en la que el agente complejante es dextrán sulfato.
13. Una microesfera según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente un agente activo.
14. Una microesfera según la reivindicación 13, en la que el agente activo se selecciona entre hormonas, antibióticos y otros agentes antiinfecciosos, agentes hematopoyéticos, agentes trombopoyéticos, agentes antidemencia, agentes antivirales, agentes antitumorales (agentes quimioterapéuticos), antipiréticos, analgésicos, agentes antiinflamatorios, agentes antiulcerosos, agentes antialérgicos, antidepresivos, agentes psicotrópicos, cardiotónicos, agentes antiarrítmicos, vasodilatadores, agentes antihipertensores tales como diuréticos hipotensores, agentes antidiabéticos, anticoagulantes, agentes que bajan el colesterol, agentes terapéuticos para la osteoporosis, enzimas, vacunas, agentes y adyuvantes inmunológicos, citoquinas, factores de crecimiento, nucleótidos y ácidos nucleicos; carbohidratos y polisacáridos; virus y partículas víricas; conjugados o complejos de moléculas pequeñas y proteínas o sus mezclas; y fármacos farmacéuticos sintéticos orgánicos o inorgánicos.
15. Una microesfera según la reivindicación 14, en la que el agente activo es una hormona liberadora de la hormona luteinizante (LH-RH) o un análogo suyo.
16. Una microesfera según la reivindicación 15, en la que el agente activo es leuprolida.
17. Una microesfera según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la macromolécula es albúmina, preferentemente albúmina de suero humana, y el polímero hidrosoluble es un polímero basado en carbohidratos, preferentemente hidroxietilalmidón.
18. Una microesfera según la reivindicación 17, que comprende adicionalmente un agente complejante, preferentemente dextrán sulfato, y un agente activo, preferentemente acetato de leuprolida.
19. Una jeringa que contiene una dosis única de las microesferas según una cualquiera de la reivindicaciones precedentes, en la que la jeringa incluye además opcionalmente una aguja que presenta un diámetro interior de 2,03 a 0,70 mm (calibre 14 a 30).
20. Un método para formar una microesfera según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, que comprende:
(1) formar una mezcla acuosa que contiene una macromolécula y un polímero hidrosoluble;
(2) permitir la formación de las microesferas en la mezcla acuosa; y
(3) estabilizar las microesferas.
21. Un método según la reivindicación 20, en el que la macromolécula está presente en la mezcla acuosa en una cantidad suficiente para formar una microesfera que contiene al menos 40% y menos de 100% en peso de 
\hbox{macromolécula.}
22. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 20 y 21, en el que:
(a) la macromolécula es una proteína o un ácido nucleico; y/o
(b) el polímero hidrosoluble es un polímero basado en carbohidratos, tal como hidroxietilalmidón;
(c) las microesferas se estabilizan poniéndolas en contacto con un agente reticulador y/o exponiéndolas a una fuente de energía en condiciones suficientes para estabilizar las microesferas.
23. Un método según la reivindicación 22, en el que la fuente de energía es calor.
24. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en el que la macromolécula es un ácido nucleico y el polímero hidrosoluble es un polímero policatiónico.
25. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, que comprende adicionalmente la etapa de:
(4) poner la microesfera en contacto con una solución de un agente activo para incorporar el agente activo en la microesfera.
26. Un método según la reivindicación 25, en el que el agente activo se selecciona entre hormonas, antibióticos y otros agentes antiinfecciosos, agentes hematopoyéticos, agentes trombopoyéticos, agentes antidemencia, agentes antivirales, agentes antitumorales (agentes quimioterapéuticos), antipiréticos, analgésicos, agentes antiinflamatorios, agentes antiulcerosos, agentes antialérgicos, antidepresivos, agentes psicotrópicos, cardiotónicos, agentes antiarrítmicos, vasodilatadores, agentes antihipertensores tales como diuréticos hipotensores, agentes antidiabéticos, anticoagulantes, agentes que bajan el colesterol, agentes terapéuticos para la osteoporosis, enzimas, vacunas, agentes y adyuvantes inmunológicos, citoquinas, factores de crecimiento, nucleótidos y ácidos nucleicos; carbohidratos y polisacáridos; virus y partículas víricas; conjugados o complejos de moléculas pequeñas y proteínas o sus mezclas; y fármacos farmacéuticos sintéticos orgánicos o inorgánicos.
27. Un método según la reivindicación 26, en el que el agente activo es una hormona liberadora de la hormona luteinizante o un análogo suyo.
28. Un método según la reivindicación 27, en el que el agente activo es leuprolida.
29. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, en el que la etapa de poner en contacto la microesfera con la solución de agente activo produce un rendimiento de incorporación de al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% del agente activo.
30. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 29, que comprende además la etapa de:
\newpage
(5) estabilizar las microesferas, preferentemente poniendo las microesferas en contacto con un agente reticulador en condiciones suficientes para estabilizar la microesfera.
ES99304616T 1999-06-14 1999-06-14 Microesferas de liberacion sostenida. Expired - Lifetime ES2207123T3 (es)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP99304616A EP1060741B1 (en) 1999-06-14 1999-06-14 Sustained release microspheres

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2207123T3 true ES2207123T3 (es) 2004-05-16

Family

ID=8241454

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES99304616T Expired - Lifetime ES2207123T3 (es) 1999-06-14 1999-06-14 Microesferas de liberacion sostenida.

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP1060741B1 (es)
AT (1) ATE248587T1 (es)
DE (1) DE69910987T2 (es)
ES (1) ES2207123T3 (es)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9006175B2 (en) 1999-06-29 2015-04-14 Mannkind Corporation Potentiation of glucose elimination
US6458387B1 (en) 1999-10-18 2002-10-01 Epic Therapeutics, Inc. Sustained release microspheres
AU2001251349A1 (en) * 2000-04-06 2001-10-23 Sontra Medical, Inc. Method and device for enhanced transdermal drug delivery
ATE430558T1 (de) * 2000-10-27 2009-05-15 Baxter Healthcare Sa Herstellung von mikrokügelchen
JP4460892B2 (ja) 2001-06-21 2010-05-12 ジェネンテック インコーポレイテッド 徐放性組成物
WO2003080149A2 (en) 2002-03-20 2003-10-02 Mannkind Corporation Inhalation apparatus
AU2003230320A1 (en) * 2002-05-09 2003-11-11 Peptron Co., Ltd Sustained release formulation of protein and preparation method thereof
BRPI0412735A (pt) * 2003-07-18 2006-09-26 Baxter Int métodos para a fabricação, uso e composição de partìculas esféricas pequenas preparadas mediante a separação de fase controlada
MXPA06012992A (es) 2004-05-12 2007-02-12 Baxter Int Microesferas que comprenden proteina y que muestran inyectabilidad en altas concentraciones de este agente.
US8728525B2 (en) 2004-05-12 2014-05-20 Baxter International Inc. Protein microspheres retaining pharmacokinetic and pharmacodynamic properties
EP1765294B1 (en) 2004-05-12 2008-09-24 Baxter International Inc. Nucleic acid microspheres, production and delivery thereof
CA2566199C (en) 2004-05-12 2013-10-22 Baxter International Inc. Delivery of as-oligonucleotide microspheres to induce dendritic cell tolerance for the treatment of autoimmune type 1 diabetes
PL1786784T3 (pl) 2004-08-20 2011-04-29 Mannkind Corp Kataliza syntezy diketopiperazyn
KR101644250B1 (ko) 2004-08-23 2016-07-29 맨카인드 코포레이션 약물 전달용 디케토피페라진염, 디케토모르포린염 또는 디케토디옥산염
AU2014271222B2 (en) * 2005-09-14 2016-04-28 Mannkind Corporation Method of drug formulation based on increasing the affinity of crystalline microparticle surfaces for active agents
CA2818900C (en) * 2005-09-14 2018-02-06 Mannkind Corporation Method of drug formulation based on increasing the affinity of crystalline microparticle surfaces for active agents
CN104324362B (zh) 2005-09-14 2018-04-24 曼金德公司 以提高活性试剂对结晶微粒表面的亲和力为基础的药物配制方法
IN2015DN00888A (es) 2006-02-22 2015-07-10 Mannkind Corp
US20070281031A1 (en) * 2006-06-01 2007-12-06 Guohan Yang Microparticles and methods for production thereof
CN101500616A (zh) 2006-08-04 2009-08-05 巴克斯特国际公司 预防和/或逆转新发作自身免疫糖尿病的基于微球的组合物
WO2009137689A2 (en) * 2008-05-07 2009-11-12 Surmodics, Inc. Delivery of nucleic acid complexes from particles
US8485180B2 (en) 2008-06-13 2013-07-16 Mannkind Corporation Dry powder drug delivery system
ES2929343T3 (es) 2008-06-13 2022-11-28 Mannkind Corp Inhalador de polvo seco accionado por aspiración para la administración de fármacos
KR101628410B1 (ko) 2008-06-20 2016-06-08 맨카인드 코포레이션 흡입 활동에 관한 실시간 프로파일링을 위한 대화형 장치 및 방법
TWI614024B (zh) 2008-08-11 2018-02-11 曼凱公司 超快起作用胰島素之用途
US8323685B2 (en) 2008-08-20 2012-12-04 Baxter International Inc. Methods of processing compositions containing microparticles
US8367427B2 (en) 2008-08-20 2013-02-05 Baxter International Inc. Methods of processing compositions containing microparticles
US8323615B2 (en) 2008-08-20 2012-12-04 Baxter International Inc. Methods of processing multi-phasic dispersions
US8314106B2 (en) 2008-12-29 2012-11-20 Mannkind Corporation Substituted diketopiperazine analogs for use as drug delivery agents
DK2405963T3 (da) 2009-03-11 2013-12-16 Mannkind Corp Apparat, system og fremgangsmåde til at måle modstand i en inhalator
CN104721825B (zh) 2009-06-12 2019-04-12 曼金德公司 具有确定比表面积的二酮哌嗪颗粒
WO2011056889A1 (en) 2009-11-03 2011-05-12 Mannkind Corporation An apparatus and method for simulating inhalation efforts
IL223742A (en) 2010-06-21 2016-06-30 Mannkind Corp A dry powder inhaler and preparation for it
US8901092B2 (en) 2010-12-29 2014-12-02 Surmodics, Inc. Functionalized polysaccharides for active agent delivery
AU2012236150B2 (en) 2011-04-01 2016-03-31 Mannkind Corporation Blister package for pharmaceutical cartridges
WO2012174472A1 (en) 2011-06-17 2012-12-20 Mannkind Corporation High capacity diketopiperazine microparticles
BR112014009686A2 (pt) 2011-10-24 2018-08-07 Mannkind Corp composição analgésica inalável, pó seco e método para tratar dor
CN104619369B (zh) 2012-07-12 2018-01-30 曼金德公司 干粉药物输送系统和方法
US10159644B2 (en) 2012-10-26 2018-12-25 Mannkind Corporation Inhalable vaccine compositions and methods
AU2013365623B2 (en) * 2012-12-20 2017-08-24 Omrix Biopharmaceuticals Ltd. Viral inactivated biological mixture
AU2014228415B2 (en) 2013-03-15 2018-08-09 Mannkind Corporation Microcrystalline diketopiperazine compositions and methods
MX375448B (es) 2013-07-18 2025-03-06 Mannkind Corp Composiciones farmacéuticas en polvo seco estables al calor y métodos.
US11446127B2 (en) 2013-08-05 2022-09-20 Mannkind Corporation Insufflation apparatus and methods
US10307464B2 (en) 2014-03-28 2019-06-04 Mannkind Corporation Use of ultrarapid acting insulin
US10561806B2 (en) 2014-10-02 2020-02-18 Mannkind Corporation Mouthpiece cover for an inhaler
US20230181471A1 (en) * 2020-07-09 2023-06-15 Hoffmann-La Roche Inc. Concentrated compositions of proteins, their preparation and use thereof
CN121752251A (zh) * 2023-08-31 2026-03-27 环球生命科学解决方案加拿大有限公司 用于肺部递送纳米颗粒的鼻内制剂、组合物、用途及其制造方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5160745A (en) * 1986-05-16 1992-11-03 The University Of Kentucky Research Foundation Biodegradable microspheres as a carrier for macromolecules
US4925677A (en) * 1988-08-31 1990-05-15 Theratech, Inc. Biodegradable hydrogel matrices for the controlled release of pharmacologically active agents
US5008116A (en) * 1988-11-14 1991-04-16 Frederick Cahn Immunostimulatory microsphere
JPH08225454A (ja) * 1995-02-23 1996-09-03 Chugai Pharmaceut Co Ltd マイクロスフェア製剤

Also Published As

Publication number Publication date
DE69910987D1 (de) 2003-10-09
EP1060741B1 (en) 2003-09-03
DE69910987T2 (de) 2004-05-19
ATE248587T1 (de) 2003-09-15
EP1060741A1 (en) 2000-12-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2207123T3 (es) Microesferas de liberacion sostenida.
ES2341578T3 (es) Microesferas de liberacion prolongada.
US6268053B1 (en) Macromolecular microparticles and methods of production and use
US5981719A (en) Macromolecular microparticles and methods of production and use
ES2326209T3 (es) Produccion de microesferas.
ES2318860T3 (es) Gel sensible a la temperatura para el aporte sostenido de farmacos a base de proteinas.
ES2625685T3 (es) Composiciones de ácido nucleico-lipopolímero
ES2527286T3 (es) Microesferas de liberación sostenida y métodos de fabricación y uso de las mismas
ES2229286T3 (es) Cesion prolongada de gm-csf.
JP3856471B2 (ja) 安定なタンパク質：リン脂質の組成物および方法
ES2243497T3 (es) Composicion de vacuna, procedimiento de preparacion de la misma y procedimiento para vacunacion de vertebrados.
US20110135732A1 (en) Multiple phase cross-linked compositions and uses thereof
US20060013883A1 (en) Poloxamer and poloxamine compositions for nucleic acid delivery
BRPI0715299A2 (pt) mÉtodo para preparar nanoparticulas polimÉricas, mÉtodod para preparar uma coposiÇço micelar, micelas polimÉricas reconstituÍveis, composiÇço polimÉrica bioativa de nanopartÍculas, mÉtodo para proporcionar um medicamento a um paciente e processo para preparar composiÇÕes de nanoparticulas polimÉricas
JP2014532071A5 (es)
BRPI0714718B1 (pt) Composição de micela polimérica de encapsulamento de polipeptídeos ou proteínas e seu método de preparo
Crooke et al. Lung tissue delivery of virus-like particles mediated by macrolide antibiotics
Ferreiro et al. Alginate/poly-L-lysine microparticles for the intestinal delivery of antisense oligonucleotides
JP2019537600A (ja) ポリマーナノ粒子
ES2242287T3 (es) Microparticulas para la administracion controlada de moleculas biologicamente activas.
US20160158154A1 (en) Protein vesicles and methods of making and using thereof
CN118512400A (zh) 膜联蛋白在提高具有磷脂表面的纳米载体入瘤效率中的应用
AU720757B2 (en) Lipid-binding proteins and their therapeutic and diagnostic use
WO2023014293A2 (en) A ph-responsive composition for facilitating delivery of a cargo and a method of encapsulating cargo with a ph-responsive composition
Italiani et al. Concepts for Nano-delivery of Therapeutic Immunomodulatory Agents