ES2326209T3 - Produccion de microesferas. - Google Patents

Abstract

Proceso en continuo para la preparación de microesferas que comprende las fases de: combinar una macromolécula y un polímero en una solución acuosa, siendo el polímero soluble en agua o soluble en un disolvente miscible en agua; poner en contacto un volumen de la solución acuosa con una superficie en una relación superficie/volumen superior a 6,5 cm-1 , exponer la solución acuosa a una fuente de energía durante un período de tiempo suficiente para formar microesferas; y formar las microesferas de forma continua en la solución acuosa.

Description

Producción de microesferas.

Campo y antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a un proceso para preparar microesferas de proteínas con un elevado contenido en proteína. Las microesferas de proteínas de esta invención se preparan poniendo en contacto una mezcla acuosa de la proteína con un polímero que tiene una superficie con una relación superficie/volumen alta. Las microesferas de proteínas son adecuadas para la preparación de composiciones farmacéuticas, las cuales se pueden suministrar a un paciente principalmente por vía pulmonar, parenteral y oral. El proceso se lleva a cabo como un proceso en continuo para aumentar la eficiencia y la productividad.

La preparación y el suministro de proteínas terapéuticas de interés es un campo de investigación y desarrollo intensivos en la industria farmacéutica. Resulta muy conveniente formular proteínas con unas características de liberación determinadas en el paciente con la máxima eficacia clínica. Para la administración pulmonar, la proteína se prepara de manera ideal en forma de microesferas discretas, que son partículas sólidas o semisólidas con un diámetro de entre 0,5 y 5,0 micras. También es deseable que las partículas tengan un contenido en proteína lo más alto posible para lograr la máxima eficacia terapéutica.

Las microesferas han estado comercialmente disponibles para aplicaciones bioquímicas y bioterapéuticas desde hace muchos años. Por ejemplo, los anticuerpos conjugados en perlas producen partículas relativamente grandes que son específicas para un determinado ligando. Estas grandes partículas recubiertas de anticuerpos se utilizan para la unión de los receptores a la superficie de una célula para la activación celular, para la unión a una fase sólida para la purificación por inmunoafinidad y para la administración de agentes terapéuticos a una diana utilizando anticuerpos específicos tisulares o tumorales. Las perlas se pueden formar a partir de polímeros sintéticos o proteínas, aunque con frecuencia son preferentes los polímeros sintéticos debido a la duración y al coste.

Con frecuencia, las micropartículas producidas por métodos de producción estándar tienen una amplia distribución de tamaño de partícula, falta uniformidad, no proporcionan una cinética de liberación adecuada y son difíciles y costosas de producir. Además, los polímeros utilizados para preparar estas microesferas generalmente son solubles en disolventes inorgánicos, siendo necesario el uso de instalaciones especiales diseñadas para manipular disolventes orgánicos. Los disolventes orgánicos pueden desnaturalizar las proteínas o los péptidos contenidos en las microesferas y también pueden ser tóxicos cuando se administran a seres humanos o animales.

Además, las micropartículas pueden ser grandes y tender a formar agregados, lo que requiere un proceso de selección de tamaño para eliminar las partículas que se consideran demasiado grandes para la administración al paciente por inyección o inhalación. Esto requiere un cribado y la consiguiente pérdida de producto. Las partículas de gran tamaño también pueden requerir el uso de agujas de gran calibre para la inyección, con frecuencia causando molestias al paciente.

Las microesferas disponibles actualmente están diseñadas para liberar proteínas en un medio acuoso, incorporando las proteínas en una matriz hidrofóbica erosionable o no erosionable. Muchas partículas presentan una cinética de liberación basada en la erosión y la difusión. En este tipo de sistema se observa una rotura inicial o una rápida liberación del medicamento. Este efecto de rotura a menudo da lugar a efectos secundarios no deseados en algunos pacientes.

La patente US 5.981.719, la patente US 5.849.884 y la patente US 6.090.925, describen micropartículas que se forman mediante la combinación de una macromolécula, tal como una proteína o un péptido, y un polímero, en una solución acuosa de pH cercano al punto isoeléctrico de la macromolécula. La solución se calienta para preparar micropartículas con un contenido en proteínas superior al 40%. Las micropartículas así formadas comprenden una matriz sustancialmente homogénea, macromoléculas y polímeros entrelazados, que permiten al medio acuoso entrar en los componentes de las micropartículas y disolverlos. Las micropartículas pueden diseñarse de manera que presenten una cinética de liberación a corto plazo o a largo plazo, proporcionando características de liberación rápida o prolongada.

La patente US 6.051.256 se refiere a procesos para la preparación de polvos de macromoléculas biológicas mediante la atomización de soluciones líquidas de las macromoléculas, secado de las gotas y recogida de las partículas resultantes. Las macromoléculas biológicas que pueden utilizarse en este proceso incluyen insulina y calcitonina.

La US 5.204.108 describe una composición para la administración de un medicamento que comprende una pluralidad de microesferas y un medicamento activo asociado con cada microesfera.

La US 6.090.925 describe un proceso para preparar micropartículas que comprenden una macromolécula, consistiendo el proceso en mezclar la macromolécula con un polímero a un pH cercano al punto isoeléctrico de la macromolécula y después someter la mezcla resultante a calor.

Se apreciará que existe una continua necesidad de un proceso para la preparación y el suministro de agentes biológicos, tales como microesferas, a fin de maximizar su eficacia y reducir al mínimo los problemas de seguridad para el agente terapéutico.

Sumario de la invención

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un proceso para la preparación de microesferas según la reivindicación 1.

La invención proporciona un proceso para la producción de microesferas de moléculas biológicas de interés. Las microesferas son útiles como agentes terapéuticos o de diagnóstico para el tratamiento o el diagnóstico de enfermedades en un sujeto in vivo o in vitro. Las microesferas son especialmente útiles como componentes terapéuticos activos en inhaladores para la administración pulmonar a pacientes humanos.

Preferentemente, la superficie con la que se pone en contacto la solución acuosa tiene una relación superficie/volumen de al menos aproximadamente 14 cm^{-1}. Preferentemente, la superficie es una superficie hidrofóbica, tal como un polímero hidrofóbico, o un material metálico o cerámico. Las superficies especialmente preferentes incluyen acero inoxidable, polipropileno, poliestireno, PTFE y polímeros de silicona. Las microesferas se forman como resultado de la interacción entre la solución y la superficie, funcionando como un sitio de nucleación para la formación de microesferas.

En uno de los aspectos del proceso, las microesferas preparadas son sustancialmente esféricas y tienen un diámetro medio que oscila entre aproximadamente 0,1 micras y 10,0 micras. Preferentemente, el diámetro medio de las microesferas oscila entre aproximadamente 0,5 micras y 5,0 micras y en especial entre aproximadamente 1,0 micra y 2,0 micras.

Las macromoléculas que son útiles para la práctica de esta invención incluyen tanto agentes terapéuticos como de diagnóstico. Los agentes terapéuticos incluyen antibióticos, hematopoyéticos, agentes antiinfecciosos, agentes antiulcerosos, agentes antialérgicos, antipiréticos, analgésicos, agentes antiinflamatorios, agentes antidemencia, antivirales, antitumorales, antidepresivos, agentes psicotrópicos, cardiotónicos, agentes antiarrítmicos, vasodilatadores, agentes antihipertensivos, agentes antidiabéticos, agentes anticoagulantes y agentes reductores de colesterol. Otros ejemplos de macromoléculas adecuadas incluyen proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, conjugados de proteínas, virus, partículas virales y mezclas de los mismos. Estas macromoléculas se caracterizan por la capacidad de interactuar con el polímero en presencia de una fuente de energía, tal como calor, para formar microesferas discretas intactas con un alto contenido en macromoléculas. Preferentemente, la macromolécula comprende al menos aproximadamente un 90% en peso de microesferas, en especial al menos aproximadamente un 95% en peso y en particular al menos aproximadamente un 99%. En realizaciones especialmente preferentes, la microesfera tiene un alto contenido en proteína, suficiente para que sea imposible distinguirla de la proteína estándar.

Las macromoléculas preferentes incluyen péptidos, tales como polipéptidos, hidratos de carbono, tales como polisacáridos, proteínas, y en particular proteínas terapéuticas como insulina, seroalbúmina humana, hormona del crecimiento humana, hormona paratiroidea y calcitonina.

En otro aspecto, la fuente de energía utilizada para formar las microesferas es energía térmica. Se puede aplicar calor a la solución acuosa que contiene los componentes para producir las microesferas a fin de calentar la solución a una temperatura que oscila entre aproximadamente 37ºC y aproximadamente 95ºC durante un período de tiempo de entre aproximadamente 1 minuto y 24 horas. La solución acuosa puede contener agua, disolventes miscibles en agua o disolventes solubles en agua, por ejemplo etanol, pirrolidona, 2-pirrolidona, DMSO, acetona y similares.

En otro aspecto, el polímero incorporado en la solución acuosa se selecciona preferentemente de entre el grupo consistente en polímeros carbohidrato, alcoholes polialifáticos, polímeros poli(vinílicos), ácidos poliacrílicos, ácidos poliorgánicos, poliaminoácidos, poliéteres, polímeros que se producen naturalmente, poliimidas, poliésteres, polialdehídos, copolímeros, copolímeros de bloque, terpolímeros, surfactantes, polímeros ramificados, ciclopolímeros y mezclas de los mismos. En especial, el polímero es dextrano, polietilenglicol, polivinilpirrolidona, copolímeros de polietinelglicol y polivinilpirrolidona, alcohol polivinílico, o copolímeros de polioxietileno y polioxipropileno y mezclas de los mismos. En particular, el polímero es un copolímero de polietilenglicol y polivinilpirrolidona o un copolímero de polioxietileno y polioxipropileno.

El polímero es un polímero soluble en agua capaz de eliminar el agua o deshidratar la macromolécula. Los polímeros adecuados incluyen, además de los polímeros específicos mencionados anteriormente, polímeros de cadena lineal o ramificada de alto peso molecular que son solubles en agua o en disolventes miscibles en agua o ambos. Polímeros solubles en agua típicos útiles en esta invención se describen en la solicitud de patente en trámite común asignada US 09/420.361, solicitada el 18 de octubre de 1999.

Un aparato que puede ser empleado para preparar las microesferas comprende un reactor con una relación superficie interna/volumen superior a 6,5 cm^{-1} y medios para calentar la solución acuosa. El reactor contiene una solución acuosa de una macromolécula y un polímero. La superficie interna está en contacto con la solución acuosa y aumenta la superficie interna del reactor. Preferentemente, la superficie interna está provista de un lecho de material inerte sólido, tal como un lecho de gránulos, bolas, placas y similares. Por otra parte, las superficies internas pueden incluir tubos a través de los cuales pasa la solución.

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Con el fin de preparar las microesferas, el área superficial de la superficie interna debe ser suficiente para proporcionar una relación superficie/volumen superior a 6,5 cm^{-1} y preferentemente de al menos unos 14 cm^{-1}. Preferentemente, las superficies se forman a partir de un material hidrofóbico, en particular polímeros hidrofóbicos tales como polipropileno, poliestireno, PTFE o polímeros de silicona. Por otro lado, las superficies pueden formarse a partir de metales, cerámica o vidrio. Un metal preferente es el acero inoxidable. La superficie funciona como un sitio de nucleación para la formación de las microesferas.

El aparato para preparar las microesferas opera de manera continua. Normalmente, el modo de funcionamiento en continuo es más eficiente y rentable que el modo de funcionamiento por lotes.

Las microesferas pueden administrarse a un paciente, y en concreto a un paciente humano que necesita tratamiento médico, mediante un dispositivo adecuado. Las vías de administración adecuadas incluyen las vías parenteral, como i.m, i.v y s.c, y no parenterales, tales como oral, bucal, intratecal, nasal, pulmonar, transdérmica, transmucosa, etc. Los dispositivos de administración incluyen jeringas, tanto sin aguja como con aguja, e inhaladores.

La jeringa puede contener una dosis única de las microesferas para el tratamiento de una enfermedad a tratar mediante la liberación prolongada de la macromolécula in vivo. El número de microesferas presente en la dosis única depende del tipo y de la actividad de la macromolécula. Preferentemente, la dosis única se selecciona para lograr una liberación prolongada durante un período de tiempo óptimo para el tratamiento de la condición médica concreta.

Se puede utilizar un dispositivo inhalador cuando se desee para administrar una dosis terapéutica de microesferas de proteína al pulmón de un sujeto. Las microesferas de proteína se preparan poniendo en contacto una solución acuosa de la proteína y un polímero con una superficie y calentando la solución para formar las microesferas. Preferentemente, la proteína es una proteína terapéutica, tal como insulina, hormona humana del crecimiento, calcitonina u hormona paratiroidea, y preferentemente el contenido en proteínas de las microesferas es de aproximadamente un 90% o superior, en especial de un 95% o superior y en particular de al menos aproximadamente un 99% o superior. Para la administración pulmonar, las microesferas tienen un tamaño ideal con un diámetro medio de entre aproximadamente 0,5 micras y 5,0 micras, y preferentemente de entre 1 y 2 micras.

El inhalador puede usarse para tratar cualquier condición médica en la que la proteína se pueda administrar mediante tratamiento por inhalación. Los inhaladores típicos incluyen inhaladores de polvo seco, inhaladores de dosis medidas, nebulizadores y dispositivos de administración electrostáticos. Las aplicaciones típicas del aparato de suministro incluyen el suministro de insulina y de proteínas análogas en zonas pulmonares distales.

Las microesferas pueden prepararse sin necesidad de usar procesos de secado por atomización o de molienda. Estas microesferas tienen un tamaño y una forma homogéneos. Se ha descubierto que las microesferas de proteína son sorprendentemente estables y forman suspensiones mejores en presencia de propelentes, tanto basados en freón como sustitutos del mismo, de los habitualmente empleados en inhaladores para la administración pulmonar. Se cree que este aumento de estabilidad puede deberse al hecho de que las microesferas se deshidratan como resultado de las interacciones entre el polímero y la macromolécula, y tienen una mayor estabilidad en presencia de propelentes de inhalación.

Aunque es preferente la administración pulmonar, las microesferas pueden administrarse vía oral, vía intranasal, vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, y por otros métodos de administración adecuados para la administración de moléculas terapéuticas.

Estos y otros aspectos de la invención se describen con más detalle a partir de ahora en este documento. Todos los términos técnicos y científicos tienen el significado que se les atribuye o, si no se les atribuye, como comúnmente entienden los expertos en la materia.

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Breve descripción de las figuras

Figura 1: gráfico que muestra el número de partículas, la superficie media y el volumen medio para las microesferas en función del diámetro de las partículas. Las microesferas que se muestran en la Figura se preparan a partir de polietilenglicol, polivinilpirrolidona e insulina.

Figura 2: micrografía de barrido electrónico (SEM) de agregados de insulina preparados mediante un proceso distinto del proceso según la presente invención. Se muestra una masa amorfa de insulina liofilizada.

Figura 3: micrografía de barrido electrónico de microesferas de insulina de entre 1 y 2 micras preparadas usando fragmentos de polipropileno.

Figura 4: micrografía de barrido electrónico que muestra agregados de insulina preparados sin utilizar fragmentos de polipropileno. Como se muestra en la micrografía, la gran mayoría de la masa la constituye un material agregado con muy pocas microesferas efectivas.

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Figuras 5A, 5B y 5C: representaciones gráficas que muestran el volumen diferencial, el número diferencial y la superficie diferencial respectivamente de las microesferas preparadas sin utilizar fragmentos de polipropileno, en función del diámetro de partícula.

Figura 6: micrografía de barrido electrónico de microesferas de insulina formadas mediante un proceso de flujo en continuo que utiliza el método de la presente invención.

Figura 7: gráfico que muestra la disminución de los niveles de glucosa en sangre en ratas. Se trazan los niveles de glucosa en sangre frente al tiempo después de la inyección de insulina para microesferas de insulina y microesferas de insulina disuelta. También se muestra una solución salina de control.

Descripción detallada de la invención

Se describe un proceso para la preparación de microesferas con aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. El proceso implica la combinación de una macromolécula y un polímero en una solución acuosa y la exposición de la solución acuosa a una fuente de energía. Según el proceso de esta invención, un volumen de la solución acuosa se pone en contacto con una superficie bajo aquellas condiciones en las que la relación superficie:volumen es superior a 6,5 cm^{-1} y preferentemente de al menos aproximadamente 14 cm^{-1}. La superficie actúa como sitio de nucleación para estimular la formación de microesferas.

Las aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico de las microesferas incluyen el suministro de medicamentos, vacunas, terapias génicas y diagnóstico por imágenes de tejidos o tumores in vivo. Como vías de administración se incluyen: administración oral o parenteral; administración mucosal; administración oftálmica, inyección intravenosa, subcutánea, intraarticular, o intramuscular, administración por inhalación y administración tópica.

El término "microesferas" tal como se utiliza en este documento se refiere a partículas de forma sustancialmente esférica con una dimensión que oscila generalmente entre aproximadamente 0,1 micras y 10,0 micras de diámetro. Las microesferas normalmente presentan una estrecha distribución de tamaño y se forman como partículas discretas.

Una "solución acuosa" tal como se utiliza aquí incluye soluciones de agua sola o agua mezclada con uno o más disolventes miscibles en agua, tal como etanol, DMSO, acetona y metilpirrolidona, 2-pirrolidona.

Las microesferas se obtienen mediante la mezcla de macromoléculas en una mezcla acuosa con un polímero soluble en agua o con una mezcla de polímeros, poniendo después en contacto la solución con una fuente de energía, preferentemente calor, bajo condiciones suficientes para formar las microesferas. La solución es una solución acuosa. La solución de macromoléculas se añade al polímero o a la solución de polímeros se agrega a la solución de macromoléculas para eliminar el agua de la macromolécula o para deshidratar la macromolécula. Este proceso también se conoce por los expertos en la materia como exclusión de volumen.

La solución de macromoléculas y polímeros se expone después a una fuente de energía tal como calor, radiación, incluyendo la radiación de microondas, o ionización, sola o en combinación con sonicación, agitación excéntrica, mezcla o agitación, durante un período de tiempo predeterminado para formar y estabilizar las microesferas. Las microesferas resultantes se separan después de cualquier componente no incorporado presente en la solución por métodos de separación física bien conocidos por los expertos en la materia y después pueden lavarse o exponerse a otras soluciones que contengan medicamentos para unir otros medicamentos a las microesferas.

El tiempo de incubación depende de las respectivas concentraciones de polímero y macromoléculas y del nivel de energía de la fuente de energía. La estabilización de microesferas puede empezar a producirse inmediatamente después de la exposición a la fuente de energía. Preferentemente, la mezcla de polímeros y macromoléculas se calienta a una temperatura superior a la temperatura ambiente durante entre aproximadamente 1 minuto y 24 horas. En especial, el polímero y las macromoléculas se calientan durante 30 minutos o menos a una temperatura de entre aproximadamente 37ºC y 95ºC.

La formación de las microesferas según el proceso de la presente invención requiere un sitio de nucleación que normalmente es el contenedor o el recipiente para la solución acuosa de macromoléculas y polímeros. Esto se logra mediante la combinación de la macromolécula y el polímero en condiciones suficientes para proporcionar una relación superficie/volumen superior a 6,5 cm^{-1} y preferentemente de al menos aproximadamente 14 cm^{-1}. Las superficies se pueden formar a partir de un material hidrofóbico, por ejemplo un polímero hidrofóbico tal como polipropileno. Alternativamente, la superficie se puede formar a partir de un metal, una cerámica o vidrio.

El recipiente puede tener inherentemente una relación superficie/volumen alta, como en el caso de un reactor tubular, con lo cual no es necesario ajustar esta relación. Por otro lado, la relación superficie/volumen del recipiente puede aumentarse mediante la adición de materiales al mismo, a fin de reducir el volumen interno en relación con la superficie. Esto se puede conseguir utilizando un lecho de partículas, placas o perlas, por ejemplo, en el reactor.

El componente macromolecular de la microesfera es cualquier molécula con una estructura terciaria y cuaternaria o que sea capaz de tener una estructura terciaria y cuaternaria. Preferentemente, la macromolécula es una biomolécula tal como una proteína, incluyendo enzimas y proteínas recombinantes, péptidos, carbohidratos, polisacáridos, conjugados polisacárido-proteína o carbohidrato-proteína, ácidos nucleicos, virus, partículas virales, conjugados de moléculas pequeñas (como un hapteno) y proteínas, o mezclas de los mismos. Puede incorporarse un compuesto farmacéutico o medicamento orgánico o inorgánico natural o sintético en las microesferas añadiendo el medicamento a una macromolécula, tal como una proteína y, a continuación, formando las microesferas a partir del complejo o conjugado macromolécula-medicamento. Los expertos en la materia entenderán que un compuesto que no puede tener una estructura terciaria y cuaternaria se puede formar en una microesfera incorporando o acoplando el compuesto a un molécula portadora que sí tiene un estructura terciaria y cuaternaria. Los expertos en la materia entenderán que la macromolécula puede ser una parte de una molécula, por ejemplo un péptido, un segmento monocatenario de una molécula de ácido nucleico bicatenaria o una partícula viral, teniendo una estructura terciaria y cuaternaria. También se entiende que el término "macromolécula" incluye una pluralidad de macromoléculas e incluye combinaciones de diferentes macromoléculas, tal como una combinación de compuestos farmacéuticos y una molécula de afinidad para dirigir el compuesto farmacéutico a un tejido, órgano o tumor que requiera tratamiento. También se entiende que una molécula de afinidad puede ser la parte receptora o la parte ligando de una interacción receptor-ligando. Ejemplos de ligandos que interactúan con otras biomoléculas incluyen virus, bacterias, polisacáridos o toxinas que actúan como antígenos para generar una respuesta inmune cuando se administran a un animal y que provocan la producción de anticuerpos.

Compuestos o macromoléculas adecuados incluyen, aunque no se limitan a, betaxolol^{TM}, diclofenaco^{TM}, doxorrubicina, rifampin^{TM}, acetato de leuprolide, hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH), (D-Tryp6)-LHRH, acetato de nafarelina, insulina, insulina sódica, insulina-zinc, protamina, lisozima, alfa-lactoalbúmina, factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF), beta-lactoglobulina, tripsina, calcitonina, hormona paratiroidea, anhidrasa carbónica, ovoalbúmina, seroalbúmina bovina (BSA), seroalbúmina humana (HSA), fosforilasa b, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, IgG, fibrinógeno, poli-L-lisina, IgM, ADN, acetato de desmopresina, factor liberador de la hormona de crecimiento (GHRF), somatostatina, antide, Factor VIII, G-CSF/GM-CSF, hormona de crecimiento humana (hGH), interferón beta, antitrombina III, interferón alfa, interferón alfa 2b.

Las condiciones de incubación se suelen optimizar para incorporar al menos aproximadamente un 90%, preferentemente al menos aproximadamente un 95% y en especial al menos aproximadamente un 99% de la macromolécula en la mezcla de reacción mediante el ajuste del pH, de la temperatura, de la concentración de la macromolécula o la duración de la reacción o de la incubación. En general, se requiere menos energía para formar microesferas en concentraciones más altas de macromolécula.

Preferentemente, las microesferas compuestas de ácidos nucleicos se preparan mezclando en primer lugar el ácido nucleico ya sea con una proteína, tal como seroalbúmina bovina, o, ya que los ácidos nucleicos son aniones, mediante la adición de un catión, tal como polilisina, que ayuda a la formación de microesferas.

Como ya se ha mencionado anteriormente, una pequeña molécula o compuesto que no puede tener estructura terciaria y cuaternaria, tal como un péptido o un compuesto farmacéutico, se puede formar en una microesfera mediante la incorporación o acoplamiento del compuesto en una molécula portadora que sí tiene una estructura terciaria y cuaternaria. Esto puede lograrse de varias maneras. Por ejemplo, las microesferas se pueden formar como se describe en este documento, utilizando una macromolécula con una estructura terciaria y cuaternaria, tal como una proteína y, a continuación, la molécula pequeña o el compuesto se fija en el interior y/o en la superficie de la microesfera. Alternativamente, la molécula pequeña o el compuesto se une a la macromolécula que tiene estructura terciaria y cuaternaria mediante interacciones hidrofóbicas o iónicas y, a continuación, las microesferas se forman a partir del complejo macromolécula-molécula pequeña según el método descrito en este documento. Una tercera forma de obtener microesferas a partir de pequeñas moléculas consiste en preparar las microesferas utilizando una macromolécula con una estructura terciaria y cuaternaria de tal manera que la microesfera tenga una carga neta y, a continuación, añadir una pequeña molécula o compuesto que tenga una carga neta opuesta a fin de que la molécula pequeña sea atraída físicamente y se mantenga unida a la microesfera, aunque pueda liberarse con el tiempo bajo las condiciones adecuadas. Alternativamente, se pueden usar diferentes tipos de interacciones no covalentes, tales como interacciones hidrofóbicas o de afinidad, a fin de permitir la unión y posterior liberación de las moléculas pequeñas.

En la preparación de las microesferas que contienen proteínas, puede añadirse un estabilizador de proteínas, tal como glicerol, ácidos grasos, azúcares como sacarosa, iones tal como zinc, cloruro de sodio, o cualquier otro estabilizador de proteínas conocido por los expertos en la materia, antes de la adición de los polímeros durante la formación de microesferas, para reducir al mínimo la desnaturalización de las proteínas.

Pueden añadirse moléculas distintas a las macromoléculas que forman las microesferase a la superficie exterior de las microesferas mediante métodos conocidos por los expertos en la materia, para "recubrir" o "adornar" las microesferas. La posibilidad de añadir moléculas a la superficie exterior de la microesfera se debe a la alta concentración de macromoléculas en la microesfera. Estas moléculas se añaden con fines tales como facilitar el direccionamiento, mejorar la mediación de receptores y evitar endocitosis o destrucción. Por ejemplo, pueden añadirse biomoléculas tales como fosfolípidos a la superficie de la microesfera para prevenir endocitosis por endosomas; pueden añadirse receptores, anticuerpos u hormonas a la superficie para estimular o facilitar el direccionamiento de la microesfera a los órganos, tejidos o células deseados del cuerpo, y pueden añadirse polisacáridos, tales como glucanos, u otros polímeros, tales como plovinilpirrolidona y PEG, a la superficie exterior de la microesfera para mejorar o evitar la absorción por macrófagos.

Además, una o más moléculas escindibles, desgastables o solubles se pueden unir a la superficie exterior o en el interior de las microesferas. Las moléculas escindibles están diseñadas para que las microesferas se dirijan primero a un determinado sitio adecuado en virtud de las condiciones biológicas y, a continuación, cuando se exponen a un cambio de las condiciones biológicas, por ejemplo un cambio de pH, las moléculas se escindan provocando la liberación de las microesferas en el sitio de destino. De este modo, las microesferas se añaden a o son recogidas por las células debido a la presencia de las moléculas añadidas a la superficie de las microesferas. Cuando la molécula se escinde, las microesferas permanecen en el lugar deseado, por ejemplo en el interior del citoplasma o en el núcleo de una célula, y son libres de liberar las macromoléculas que componen las microesferas. Esto es particularmente útil para suministrar medicamentos, conteniendo las microesferas un medicamento que se dirige a un sitio específico que requiere tratamiento, liberándose el medicamento lentamente en ese sitio. El sitio de escisión preferente es un enlace diéster.

Las microesferas también pueden recubrise con una o más sustancias estabilizadoras, que pueden ser particularmente útiles para su depósito a largo plazo con la administración parenteral o para el suministro oral, permitiendo el paso de las microesferas a través del estómago o el intestino sin que se disuelvan. Por ejemplo, las microesferas destinadas a la administración oral pueden estabilizarse con un recubrimiento de una sustancia tal como mucina, una secreción que contiene mucopolisacáridos producidos por las células caliciformes del intestino, las glándulas submaxilares y otras células glandulares mucosas.

Además, las microesferas pueden recubrise de forma no covalente con compuestos tales como ácidos grasos o lípidos. El recubrimiento puede aplicarse a las microesferas por inmersión en la sustancia de revestimiento disuelta, pulverizando las microesferas con la sustancia o por otros métodos bien conocidos por los expertos en la materia.

En algunas de las realizaciones preferentes, las microesferas incluyen una proteína y al menos un polímero soluble en agua. Como ya se ha mencionado, las microesferas se forman poniendo en contacto la proteína y el al menos un polímero soluble en agua bajo condiciones acuosas, y las microesferas se forman y estabilizan a continuación, exponiendo las microesferas a una fuente de energía, preferentemente calor, bajo condiciones (por ejemplo, concentración, temperatura) que dan como resultado microesferas resistentes a los tratamientos físicos y químicos, tales como sonicación y soluciones cáusticas.

En general, las microesferas se forman mezclando la proteína con al menos un polímero soluble en agua bajo condiciones adecuadas que, preferentemente, permiten que el polímero soluble en agua elimine agua ("deshidrate") de la proteína dentro de las relaciones preferentes (en peso) proteína:polímero soluble en agua (por ejemplo, relaciones que varían entre aproximadamente 1 proteína: 1 polímero y aproximadamente 1 proteína: 1.000 polímero). La relación preferente proteína:polímero soluble en agua en la reacción de formación de microesferas varía entre aproximadamente 1 proteína:5 polímero y aproximadamente 1 proteína:30 polímero. Como ya se ha señalado anteriormente, un "polímero soluble en agua" de la invención es un polímero o una mezcla de polímeros que, de preferencia, son capaces de interactuar con la macromolécula (por ejemplo la proteína u otra molécula) para provocar una exclusión de volumen.

Entre los polímeros solubles en agua adecuados se incluyen polímeros lineales o ramificados, preferentemente aquellos de alto peso molecular. Los polímeros pueden ser altamente solubles en agua, moderadamente solubles en agua o poco solubles en agua (más de 2% peso/volumen de solubilidad en agua). Los polímeros solubles en agua preferentes son solubles en agua o solubles en un disolvente miscible en agua. Los polímeros solubles en agua pueden disolverse primero en agua, en una solución tamponada acuosa o en un disolvente miscible en agua y, a continuación, combinarse la solución de polímeros con un disolvente acuoso. En una realización, el polímero soluble en agua es un polímero basado en carbohidratos. El polímero preferente es polivinilpirrolidona, polietilenglicol, dextrano, copolímero de polioxietileno-polioxipropileno, alcohol polivinílico, almidón, hetaalmidón o mezclas de los mismos, cuyas características se describirán con más detalle más adelante. El polímero o la mezcla de polímeros pueden prepararse de acuerdo con los métodos establecidos en la patente US 5.525.519, de James E. Woiszwillo, o en la solicitud de patente PCT US93-00073 (publicación Internacional WO 93/14110), presentada el 7 de enero de 1993 y publicada el 22 de Julio de 1993, de James E. Woiszwillo, donde el polímero se disuelve en agua o en una solución acuosa, tal como un tampón, en una concentración que oscila entre aproximadamente 1 y 50 g/100 ml, dependiendo del peso molecular del polímero. La concentración total de polímeros preferente en la solución de polímeros oscila entre aproximadamente el 10% y el 80%, expresada como porcentaje en peso/volumen. La concentración preferente de cada polímero en la solución de polímeros oscila entre aproximadamente el 5% y el 50%.

El copolímero de polioxieileno-polioxipropileno, también conocido como poloxamer, es vendido por BASF (Parsippany, NJ) y está disponible en diferentes formatos, con porcentajes relativamente diferentes de polioxietileno y polioxipropileno dentro del copolímero.

El PVP es un polímero hidrofílico no ionogénico con un peso molecular medio que oscila entre aproximadamente 10.000 y 700.000 y su fórmula química es (C_{6}H_{9}NO) [n]. El PVP también se conoce como poli[1-(2-oxo-1-pirrolidinil)etileno], Povidona^{TM}, Polividona^{TM}, RP 143^{TM}, Kollidon^{TM}, Peregal ST^{TM}, Peristona^{TM}, Plasdona^{TM}, Plasmosan^{TM}, Protagent^{TM}, Subtosan^{TM} y Vinisil^{TM}. El PVP no es tóxico, es altamente higroscópico y se disuelve fácilmente en agua o en disolventes orgánicos.

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El polietilenglicol (PEG), también conocido como poli(oxietilen)glicol, es un polímero de condensación de óxido de etileno y agua que tiene la fórmula química general HO(CH_{2}CH_{2}O)[n]H.

"Dextrano" es un término que se aplica a polisacáridos producidos por bacterias que crecen en un sustrato de sacarosa. Los dextranos nativos producidos por bacterias tales como Leuconostoc mesenteroides y Lactobacteria dextranicum normalmente tienen un alto peso molecular. Los dextranos se pueden adquirir de manera habitual y se utilizan en forma inyectable como expansores plasmáticos en humanos.

El alcohol polivinílico (PVA) es un polímero que se prepara a partir de acetatos de polivinilo sustituyendo los grupos acetato por grupos hidroxilo y tiene la fórmula (CH_{2}CHOH)[n]. La mayoría de los alcoholes polivinílicos son solubles en agua.

El PEG, el dextrano, el PVA y el PVP se pueden adquirir comercialmente de suministradores químicos tales como la Compañía Química Sigma (St. Louis, Mo.).

Preferentemente, el polímero es una mezcla de polímeros que contiene una solución acuosa de PVP con un peso molecular que oscila entre 10.000 y 360.000, en especial de 40.000, y un PEG con un peso molecular de entre 200 y 35.000. Es preferente un PVP con un peso molecular de 40.000 y un PEG con un peso molecular de 3.500. Preferentemente, el PVP se disuelve en un tampón de acetato y el PEG se añade a la solución de PVP acuosa. Preferentemente, la concentración de cada polímero oscila entre 1 y 40 g/100 ml, dependiendo del peso molecular de cada polímero. Normalmente, concentraciones iguales de PVP y PEG proporcionan la mezcla de polímeros más favorable para la formación de microesferas.

Un polímero alternativo preferente es un dextrano con un peso molecular de aproximadamente entre 3.000 y 500.000 dalton.

El volumen de polímero añadido a la macromolécula varía dependiendo del tamaño, la cantidad y la concentración de la macromolécula. Preferentemente se añaden dos volúmenes de la mezcla de polímeros en una concentración de polímero total de entre 5 y 50% a un volumen de la solución que contiene la macromolécula, normalmente en una concentración de 10 mg/ml. El polímero está presente en fase líquida durante la reacción con la macromolécula.

Los solicitantes han descubierto que cuando se pone en contacto un volumen de la solución acuosa con una superficie que tiene una relación superficie:volumen superior a 6,5 cm^{-1}, preferentemente al menos aproximadamente 14 cm^{-l}, se forman microesferas esféricas en vez de agregados y otras formas de partículas amorfas. Preferentemente, la superficie es una superficie hidrofóbica, tal como un polímero hidrofófico o un metal o un material cerámico. Las superficies particularmente preferentes incluyen acero inoxidable, polipropileno, poliestireno, PTFE y polímeros de silicona. Las superficies pueden adoptar la forma de tubos o de un lecho de bolitas, bolas, placas, etc. Se cree que las microesferas se forman como resultado de la interacción entre la solución y la superficie, que funciona como un sitio de nucleación para la formación de microesferas.

El proceso opera de manera continua. El modo de funcionamiento en continuo es normalmente más efectivo y más rentable que el modo de funcionamiento por lotes.

La fuente de energía preferente es el calor. Sin embargo, los expertos en la materia entienden que otras fuentes de energía incluyen calor, radiación e ionización, solos o en combinación con sonicación, agitación excéntrica, mezcla o agitación. La formación de microesferas puede ocurrir inmediatamente después de la exposición a la fuente de energía o puede requerir una exposición prolongada a la fuente de energía, dependiendo de las características de los componentes y de las condiciones. Preferentemente, la mezcla solución de macromoléculas-polímeros se incuba en un baño de agua a una temperatura superior o igual a 37ºC e inferior o igual a 95ºC durante aproximadamente entre 1 minuto y 24 horas. En especial, la mezcla se incuba durante un tiempo de entre 5 y 30 minutos a una temperatura de entre 50ºC y 90ºC. La temperatura de incubación máxima viene determinada por las características de la macromolécula y de la función última de la microesfera.

Las microesferas formadas se separan de los componentes no incorporados de la mezcla de incubación mediante métodos de separación convencionales bien conocidos por los expertos en la materia. Preferentemente, la mezcla de incubación se centrifuga, de manera que el sedimento de las microesferas se posa en el fondo del tubo de centrifugado y los componentes no incorporados permanecen en el sobrenadante, que se retira después mediante decantación. Alternativamente, se filtra la suspensión que contiene las microesferas formadas, de manera que las microesferas quedan retenidas en el filtro y los componentes no incorporados lo atraviesan.

Se consigue una purificación adicional de las microesferas mediante lavado en un volumen adecuado de una solución de lavado. La solución de lavado preferente es agua o un disolvente miscible en agua capaz de eliminar los polímeros solubles en agua. Los lavados se pueden repetir las veces que sean necesarias y las microesferas se pueden separar de la solución de lavado del modo ya descrito.

Como ya se ha mencionado anteriormente, las características de las microesferas pueden modificarse manipulando las condiciones de incubación. Por ejemplo, se puede retrasar la cinética de liberación de las microesferas aumentando la temperatura de reacción o prolongando el tiempo de reacción durante la formación de micoresferas. Las cinéticas de liberación también se manipulan mediante la selección de diferentes polímeros, diferentes concentraciones de polímeros o diferentes relaciones de los polímeros usados en la formación de las microesferas.

El tamaño, la forma y la cinética de liberación de las microesferas también se pueden controlar regulando las condiciones de formación de las microesferas. Por ejemplo, se pueden optimizar las condiciones de formación de las microesferas para producir microesferas más grandes o más pequeñas, o se puede aumentar el tiempo de incubación total o la temperatura de incubación, dando esto como resultado microesferas con cinéticas de liberación prolongadas.

Las microesferas pueden formar parte de una composición farmacéutica. La composición incluye un recipiente que contiene una única dosis de microesferas conteniendo un agente activo para tratar una condición tratable mediante la liberación prolongada de un agente activo desde las microesferas. El número de microesferas en la dosis única depende de la cantidad de agente activo presente en cada microesfera y del periodo de tiempo durante el cual se desee la liberación prolongada. Preferentemente, la dosis única se selecciona para conseguir la liberación prolongada del agente activo durante un periodo de tiempo de entre aproximadamente 1 y 180 días, con el perfil de liberación deseado.

La composición puede incluir una jeringa con una única dosis de microesferas que contienen un agente activo para tratar una condición tratable mediante la liberación prolongada del agente activo desde las microesferas, y una aguja unida a la jeringa, teniendo la aguja un diámetro interior de un calibre que oscila entre 14 y 30.

Las microesferas preferentes también pueden prepararse de manera que tengan dimensiones que permitan su suministro con una jeringa sin aguja, evitando así los problemas de la eliminación inherente de las agujas, que tienen que desecharse como producto de desecho de riesgo biológico. Así, se proporciona una jeringa sin aguja con una o más dosis de microesferas que contienen un agente activo para tratar una condición.

Las microesferas también pueden prepararse de manera que tengan cualidades adecuadas para ser suministradas por otras vías parenterales o no parenterales tales como oral, bucal, intracecal, nasal, pulmonar, transdérmica, transmucosal y similares.

Se puede utilizar un dispositivo inhalador para el suministro pulmonar de una dosis terapéutica de microesferas de proteínas al pulmón de un sujeto. Para la administración pulmonar, las microesferas tienen un tamaño ideal con un diámetro medio que oscila entre aproximadamente 0,5 micras y 5,0 micras, preferentemente de entre 1 y 2 micras.

El inhalador se puede emplear para tratar cualquier condición médica en la que la proteína puede administrarse mediante un tratamiento por inhalación. Los dispositivos inhaladores típicos incluyen inhaladores de polvo seco, inhaladores de dosis medida, nebulizadores y dispositivos de administración electrostáticos. Las aplicaciones típicas del dispositivo inhalador incluyen el suministro de insulina y de proteínas similares en zonas pulmonares distales.

Se ha descubierto que las microesferas de proteína son sorprendentemente estables en presencia de los propelentes, tanto basados en freón y como sustitutivos del mismo, usados en inhaladores para el suministro pulmonar. Sin aludir a ninguna teoría o mecanismo de funcionamiento en particular, se cree que esta mayor estabilidad puede deberse al hecho de que las microesferas de la invención se deshidratan como resultado de la interacción entre el polímero y la macromolécula. Esto permite que las microesferas permanezcan intactas durante periodos de tiempo prolongados en presencia de propelentes de inhalación.

Cuando las microesferas se usan terapéuticamente, se administran en cantidades adecuadas desde el punto de vista terapéutico. En general, una cantidad adecuada desde el punto de vista terapéutico se refiere a la cantidad de macromoléculas necesaria para alterar una respuesta terapéutica o para retrasar el comienzo, impedir la progresión o detener por completo la condición determinada que se está tratando. En general, una cantidad adecuada desde el punto de vista terapéutico varía dependiendo de la edad del paciente, de su condición y del sexo, además de con la naturaleza y el grado de la enfermedad del sujeto, todo lo cual puede ser determinado por cualquier experto en la materia. La dosis puede ser ajustada por el médico o veterinario particular, en concreto en el caso de que surja cualquier complicación. Una cantidad adecuada desde el punto de vista terapéutico de agente activo varía normalmente entre 0,01 mg/kg y aproximadamente 1.000 mg/kg, preferentemente entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 200 mg/kg, y en especial entre aproximadamente 0,2 mg/kg y aproximadamente 20 mg/kg, en una o más administraciones diarias, durante uno o más días, semanalmente, mensualmente, cada dos o tres meses, etc.

Las microsesferas pueden administrarse solas o en combinación con otras medicaciones como parte de una composición farmacéutica. Tal composición farmacéutica puede incluir las microesferas en combinación con cualquier otro vehículo estándar farmacéuticamente y/o fisiológicamente aceptable bien conocido en el estado de la técnica. Las composiciones deben ser estériles y contener una cantidad adecuada desde el punto de vista terapéutico de microesferas en una unidad de peso o volumen adecuada para su administración a un paciente. El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" tal como se emplea aquí se refiere a una o más cargas sólidas o líquidas compatibles, diluyentes o sustancias encapsuladoras adecuadas para su administración a un ser humano u otro animal. El término "vehículo" alude a un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el que se combina el ingrediente activo para facilitar la aplicación.

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"Farmacéuticamente aceptable" también quiere decir un material no tóxico compatible con un sistema biológico, tal como una célula, un cultivo celular, un tejido y un organismo. Las características del vehículo dependerán de la vía de administración. Los portadores fisiológica y farmacéuticamente aceptables incluyen diluyentes, cargas, sales, tampones, estabilizantes, desecantes, espesantes, propelentes, agentes acidificantes, agentes de recubrimiento, solubilizantes y otros materiales bien conocidos en el estado de la técnica. Las formulaciones vehículo adecuadas para la administración oral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, etc., se pueden encontrar en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA.

Se dispone de múltiples vías de administración. El modo determinado seleccionado va a depender, naturalmente, del medicamento determinado seleccionado, de la gravedad de la condición que se está tratando y de la dosis necesaria para que el tratamiento sea efectivo. En general, los métodos se pueden poner en práctica usando cualquier modo de administración médicamente aceptable, esto decir cualquier modo que produzca niveles adecuados de compuestos activos sin producir efectos adversos clínicamente inaceptables. Tales modos de administración incluyen la vía oral, rectal, tópica, nasal, interdérmica o parenteral. El término "parenteral" incluye subcutáneo, intravenoso, intramuscular o por infusión.

Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse cómodamente en forma de dosis unitaria y pueden prepararse con cualquier método bien conocido en el estado de la técnica de la farmacia. Todos los métodos incluyen una fase que consiste en asociar las microesferas con un vehículo que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las composiciones se preparan asociando de manera uniforme e íntima las microesferas con un vehículo líquido, un vehículo sólido finamente divido, o con ambos, y a continuación, si es necesario, conformando el producto.

Las preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones estériles acuosas o no acuosas, suspensiones y emulsiones. Otros ejemplos de disolventes incluyen propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, sales y soluciones tampón, tales como una solución salina y medios tamponados, soluciones alcohólicas/acuosas y emulsiones o suspensiones. Los vehículos parenterales incluyen una solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer lactado o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen acumuladores de fluidos y de nutrientes, acumuladores de electrolitos (tales aquellos basados en dextrosa de Ringer) y equivalentes. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, por ejemplo antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y similares. En general, las microesferas se pueden administrar al sujeto (cualquier receptor mamífero) usando los mismos modos de administración que los que se usan actualmente para el tratamiento con micropartículas en humanos.

Las microesferas son útiles como agentes terapéuticos y pueden permitir el uso de vías de administración alternativas cuando las microesferas incluyen un medicamento terapéutico y se administran a un paciente para liberar lentamente o administrar de manera específica el medicamento al sitio que necesita tratamiento. Las microesferas también son útiles como agentes terapéuticos o profilácticos cuando las microesferas incluyen una macromolécula que es en sí misma un agente terapéutico o profiláctico, tal como una enzima o una inmunoglobulina. La liberación lenta de tales agentes terapéuticos es particularmente conveniente para proteínas o péptidos terapéuticos con periodos de vida media cortos que han de administrarse mediante inyección.

Las microesferas son útiles para el tratamiento o la profilaxis cuando la macromolécula es un agente terapéutico o un compuesto farmacéutico que se suministra a un paciente y se libera lentamente de las microesferas en función del tiempo. Estas microesferas son particularmente convenientes para liberar lentamente medicamentos con periodos de vida biológicos medios cortos, tales como proteínas o péptidos. Cuando el compuesto farmacéutico no puede formarse como una partícula se combina con un vehículo, tal como albúmina, y el complejo vehículo-compuesto farmacéutico se forma como una microesfera. La microesfera puede proporcionar la liberación lenta del agente a través del cuerpo o puede incluir una molécula de afinidad específica para un tejido o tumor específico, e inyectarse a un paciente para una liberación lenta específica del agente terapéutico, tal como un agente antitumoral, antiviral, antibacteriano, antiparásito o antiartrítico, citoquina, hormona o insulina, directamente al sitio que necesita tratamiento.

Los siguientes ejemplos ilustran determinadas realizaciones de la invención y tienen como objetivo describir con más detalle la presente invención, sin limitarla.

Ejemplo comparativo 1

Preparación de Microesferas de Insulina en Recipientes de Tamaños Diversos

Se preparan microesferas de insulina según los métodos que se describen en la patente US 5.981.719. Las microesferas se forman incorporando soluciones acuosas de insulina, polietilenglicol y polivinilpirrolidona en tubos de centrifugado y calentando la solución a temperaturas que van de 37ºC hasta 95ºC durante un periodo de tiempo de aproximadamente 30 minutos.

Se emplean cuatro (4) tubos de centrifugado de diferente tamaño del siguiente modo: 1,5 ml, 15 ml, 50 ml y
100 ml. Se forman microesferas con un tamaño de partícula definido y de forma esférica en los tubos de 1,5 ml, aunque sólo se forman precipitados amorfos en vez de microesferas en los tubos de 15 ml, 50 ml y 100 ml. Los intentos de formar microesferas en los tubos de 15 ml, 50 ml y 100 ml por cambios en la condición de calentamiento, el pH, la concentración de proteínas, la concentración o el tipo de polímeros, el tiempo de calentamiento o la alteración de las condiciones de agitación no son satisfactorios y no se pueden reproducir microesferas en los tubos más grandes.

Se calcula la relación superficie:volumen de los tubos. El tubo de 1,5 ml tiene una relación superficie:volumen de aproximadamente 6,5 cm^{-1}; y el tubo de 50 ml tiene una relación superficie:volumen de aproximadamente 3,5 cm^{-1}.

Ejemplo comparativo 2

Preparación de Microesferas de Insulina en un Recipiente de Lecho Cargado

La producción de microesferas de insulina se lleva a cabo en un recipiente con una superficie aumentada con respecto al volumen de la solución de insulina/polímero. Con miras a demostrar los efectos de una superficie relativamente grande, se corta un tubo de centrifugado de 50 ml de polipropileno en fragmentos de plástico de aproximadamente 5 cm de longitud y 1 cm de ancho. Estos fragmentos de plástico se colocan después en un tubo de centrifugado de 15 ml de polipropileno. Se añaden al tubo de centrifugado 3,35 ml de una solución de insulina de 10 mg/ml en agua desionizada ajustada a un pH 3 con HCl 1N. Se añaden al tubo de centrifugado de 15 ml 6,66 ml de polietilenglicol al 12,5% (peso/volumen) (PEG, MW-3350 dalton) y polivinilpirrolidona al 12,5% (peso/volumen) (PVP, MW-40,000) en un tampón de acetato de sodio 100 mM, pH 5,6. También se realiza un experimento de control usando un tubo de polipropileno de 15 ml similar que no contiene fragmentos de polipropileno con la misma cantidad de insulina y de solución de PEG/PVP como ya se ha descrito.

Las soluciones se calientan en un baño de agua a 91ºC sin agitar durante 15 minutos. Una vez transcurrido este tiempo, los tubos se centrifugan a 3.200 rpm durante 20 minutos. Los tubos se retiran de la centrifugadora y se descarta el sobrenadante. Se añaden cinco (5) ml de agua desionizada al gránulo y se agita excéntricamente el tubo para resuspender el gránulo. Después, se centrifuga de nuevo el tubo a 3.200 rpm durante 20 minutos. Esta fase de lavado se repite.

Las microesferas se someten después a un análisis de tamaño de partícula con un analizador de tamaño de partícula de difracción de luz láser Coulter.

Los datos que aparecen en la Figura 1 muestran que el tamaño de partícula de más del 95% de las microesferas de insulina es de 1,5 micras como promedio, superficie media y volumen medio. Estas estrechas correspondencias de tamaño de partícula indican una población de microesferas muy homogénea, sin evidencias de formación de agregados.

Se preparan micrografías por barrido electrónico (SEMs) de las microesferas de insulina de entre 1 y 2 micras mediante liofilización de las microesferas de insulina y se recubren con oro. Las microesferas se observan después con un microscopio electrónico de barrido.

En la Figura 3 se muestra un SEM de las microesferas de insulina de entre 1 y 2 micras que demuestra que se forman microesferas no agregadas discretas. Como control, la Figura 2 presenta una muestra de insulina liofilizada no sometida a las condiciones de fabricación de microesferas que se describen aquí. La Figura 2 muestra una gran masa amorfa de insulina liofilizada, sin evidencias de formación de microesferas.

Un estudio realizado sin añadir fragmentos de plástico a la misma escala de 10 ml produce los agregados que se ven en la Figura 4. La Figura 4 muestra una masa de material agregado con muy pocas microesferas presentes.

Para volúmenes de tubo mayores de 1,5 ml, el análisis del tamaño de partícula indicó que, sin la presencia de una superficie aumentada conseguida por la presencia de los fragmentos de plástico, normalmente se observaban agregados de microesferas de insulina y la formación de partículas grandes. Véase la Figura 5.

La Figura 5 es un análisis del tamaño de partícula de microesferas preparadas mediante un proceso que no está dentro del propósito de la presente invención, tal como en tubos grandes que no tienen su superficie interna aumentada mediante la presencia de fragmentos de polipropileno. La Figura 5 muestra que el tamaño de partícula medio es de 1,05 micras. Esto indica que hay gran cantidad de partículas pequeñas. Sin embargo, el tamaño de partícula medio en superficie y volumen es de 31,0 micras y 783,2 micras, respectivamente. Esto indica que, sin la superficie adecuada durante la fabricación de tubos, también se forman agregados de insulina grandes. Este análisis del tamaño de partícula de la Figura 5 puede contrastarse con la Figura 1, que no muestra evidencia de formación de agregados de insulina.

Ejemplo 3 Producción en Continuo de Microesferas de Proteína

Se monta un aparato para producir microesferas de tamaño pequeño y uniforme sin agregados. El aparato contiene una bomba para bombear soluciones de insulina/PEG/PVP a través de tubos de plástico de estrecho diámetro interno, hechos con polipropileno u otros materiales similares, a temperaturas elevadas. De ese modo se pueden aplicar métodos de circulación en continuo para producir microesferas de manera continua, controlada y reproducible. El uso de tubos con un diámetro interno relativamente pequeño de entre 0,79 y 3,17 mm (entre 1/32 y 1/8 pulgadas) asegura una relación superficie/volumen alta, y la inmersión del tubo en un baño de agua a temperatura controlada permite controlar la temperatura hasta que termine la formación de microesferas.

En este ejemplo se usan los siguientes materiales:

Teflón (tubo flexible con un diámetro interno de 0,79 mm (1/32'')

Insulina (Calbiochem cat # 40769)

25% PEG/PVP pH 5,6 en un tampón 100 mM de NaOAc

Baño de agua a 90ºC (American Scientific Products)

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Se pesan 36,5 mg de insulina y se suspenden en 3 ml de agua desionizada. Se añaden 30 \mul de HCl 1N para disolver la insulina. El volumen final de la solución es 3,65 ml con agua desionizada. Se añaden después 7,3 ml de la solución de PEG/PVP a la solución de insulina, agitándose excéntricamente a continuación. Esto produce una solución homogénea de insulina y PEG/PVP.

Los tubos se conectan a través de una bomba peristáltica BioRad que funciona a una velocidad de 0,4 ml/min. Los tubos se sumergen en un baño de agua a 90ºC. Los tubos se sacan del baño de agua y se insertan en un tubo de recogida sumergido en hielo.

El caudal se establece en 0,4 ml/minuto y el tiempo de proceso total es de 35 minutos para los 10,95 ml de volumen. Después de recoger las microesferas, el tubo de recogida se centrifuga 3.000 rpm durante 20 minutos en una centrifugadora Beckman J613. Se completa un segundo lavado con agua y los los gránulos de microesferas se centrifugan a 2.600 rpm durante 15 minutos. El agua final se centrifuga a 1.500 rpm durante 15 minutos.

Se retira una alícuota para analizar el tamaño de partícula en el Coulter LS 230. Las microesferas se congelan a 90ºC y se colocan en un liofilizado durante 2 días.

Se determina que el tamaño de partícula es de 1,397 micras (volumen), 1,119 micras (superficie) y 0,691 micras (número). La Figura 6 es una micrografía de barrido electrónico que muestra microesferas de insulina de tamaño uniforme y sin agregar.

El uso del sistema de circulación, con la insulina expuesta a temperaturas de 90ºC durante un periodo de tiempo corto, permite la producción de partículas que son microesferas 100% esféricas. La composición final de las microesferas es prácticamente toda proteína (insulina), según se determina mediante HPLC. Estos resultados concuerdan con la observación de que los fragmentos de plástico y de vidrio uniformes que aumentan las relaciones superficie volumen dan como resultado la formación de microesferas en vez de precipitados de proteína amorfos, el 70% de la materia prima se incorpora en las microesferas de insulina, según se determina mediante el uso de insulina radiomarcada.

Los análisis HPLC del producto disuelto indican que el tiempo de elución de las microesferas de insulina disuelta no es significativamente diferente al de una insulina estándar o al de la materia prima de insulina nativa.

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Ejemplo 4 Bioactividad de las Microesferas de Insulina

La bioactividad de la insulina incorporada a las microesferas de la presente invención se demuestra en un modelo de disminución de glucosa en ratas. El propósito de este experimento consiste en determinar si hay bioactividad de insulina residual en las microesferas de insulina de esta invención. Para ello se inyectan en los animales microesferas disueltas y microesferas suspendidas preparadas a partir de insulina-Zn.

En este experimento se utilizan los siguientes materiales:

8 ratas Fisher macho con un peso medio de 264 gramos

2 x 2 mg de microesferas de insulina

agua desionizada

jeringuillas de insulina de 0,5 cc

un monitor de glucosa AccuCheck Advantage (Roche Diagnostics)

tiras reactivas para la detección de glucosa AccuCheck Comfort Curve

Los animales se dividen en tres grupos: Grupo A, Grupo B y Grupo C. Cada grupo contiene tres animales. El peso medio de los animales del Grupo A es de 262 gramos. El peso medio de los animales del Grupo B es de 256 gramos. El peso medio de los animales del Grupo C es de 280 gramos. Se añade 1 ml de PBS al vial, se agita excéntricamente y se disuelven las partículas. Se añade 1ml de agua desionizada al vial 2, se agita excéntricamente y las partículas permanecen en suspensión. Cada rata recibe 200 \mul de insuina (1 mg de insulina tiene 26 unidades de actividad y 1.000 \mul tienen 52 unidades). El Grupo A recibe las partículas de insulina disuelta. El Grupo B recibe las microesferas suspendidas en agua desionizada. El Grupo C recibe 200 \mul de solución salina.

Los resultados de la glucosa en sangre se basan en presangrados y en sangrados por inyección postsangrado obtenidos mediante sangrado retroorbital.

Aparece una disminución de la glucosa en el grupo de partículas de insulina y en el grupo de partículas de insulina disueltas, como se muestra en la Figura 7. Las ratas normales no muestran cambios significativos de la glucosa en sangre con respecto a los valores de preinyección.

En base a lo anterior, se demuestra claramente la bioactividad de la insulina incorporada en microesferas ProMaxx, dentro del modelo de disminución de la glucosa en sangre en la rata. Las concentraciones de glucosa en sangre disminuyen a los 30 minutos de la inyección y llegan a sus niveles más bajos después de entre 4 y 5 horas de la inyección.

Claims (20)

1. Proceso en continuo para la preparación de microesferas que comprende las fases de:

combinar una macromolécula y un polímero en una solución acuosa, siendo el polímero soluble en agua o soluble en un disolvente miscible en agua;

poner en contacto un volumen de la solución acuosa con una superficie en una relación superficie/volumen superior a 6,5 cm^{-1},

exponer la solución acuosa a una fuente de energía durante un período de tiempo suficiente para formar microesferas; y

formar las microesferas de forma continua en la solución acuosa.

2. Proceso según la reivindicación 1, caracterizado porque la relación superficie/volumen es de al menos aproximadamente 14 cm^{-1}.

3. Proceso según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la superficie es una superficie hidrofóbica.

4. Proceso según reivindicación 3, caracterizado porque la superficie hidrofóbica se forma a partir de un metal, un material cerámico, vidrio o un polímero hidrofóbico.

5. Proceso según la reivindicación 4, caracterizado porque la superficie hidrofóbica se forma a partir de PTFE.

6. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la macromolécula es:

a)

un ácido nucleico;

b)

un conjugado de proteína;

c)

un virus o una partícula viral;

d)

un péptido;

e)

un polipéptido;

f)

un carbohidrato;

g)

una proteína; y/o

h)

una mezcla de cualquiera de los anteriores.

7. Proceso según la reivindicación 6, caracterizado porque la macromolécula es una proteína terapéutica seleccionada de entre el grupo consistente en insulina, seroalbúmina humana, hormona del crecimiento humana, hormona paratiroidea y calcitonina.

8. Proceso según la reivindicación 7, caracterizado porque la macromolécula es insulina.

9. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las microesferas tienen un diámetro medio que oscila entre aproximadamente 0,1 micras y aproximadamente 10,0 micras, entre aproximadamente 0,5 micras y aproximadamente 5,0 micras o entre aproximadamente 1,0 micras y aproximadamente 2,0 micras.

10. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el polímero es un polímero carbohidrato, un alcohol polialifático, un polímero poli(vinílico), un ácido poliacrílico, un ácido poliorgánico, un poliaminoácido, un poliéter, un polímero que se produce naturalmente, una poliimida, un poliéster, un polialdehído, un copolímero, un copolímero de bloque, un terpolímero, un surfactante, un polímero ramificado, un ciclopolímero, o una mezcla de los mismos.

11. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el polímero es dextrano, polietilenglicol, polivinilpirrolidona, un copolímero de polietilenglicol y polivinilpirrolidona, alcohol polivinílico, un copolímero de polioxietileno y polioxipropileno o una mezcla de los mismos.

12. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la macromolécula comprende más del 90% en peso de las microesferas.

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13. Proceso según la reivindicación 12, caracterizado porque la macromolécula comprende más del 99% en peso de las microesferas.

14. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la superficie es proporcionada mediante la superficie interna de tubos a través de los cuales pasa la solución acuosa.

15. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la mezcla de polímeros se combina con la macromolécula.

16. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la fuente de energía es energía térmica.

17. Proceso según la reivindicación 16, caracterizado porque la solución acuosa de la macromolécula y el polímero se calienta a una temperatura que oscila entre aproximadamente 37ºC y aproximadamente 95ºC durante un período de tiempo de entre aproximadamente 1 minuto y 24 horas.

18. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque la fuente de energía es una radiación.

19. Proceso según la reivindicación 18, caracterizado porque la radiación es una radiación de microondas.

20. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la fuente de energía se usa en combinación con sonicación, agitación excéntrica, mezcla o agitación.