ES2207255T3 - Procedimiento para la produccion de peptidos recombinantes con un bajo contenido en trisulfuros. - Google Patents
Procedimiento para la produccion de peptidos recombinantes con un bajo contenido en trisulfuros.Info
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Abstract
Uso de una sal de metal alcalino o metal alcalinotérreo en la producción de péptidos recombinantes durante o después de la etapa de fermentación para la reducción de la cantidad de trisulfuros en el producto recombinante.
Description
Procedimiento para la producción de péptidos
recombinantes con un bajo contenido en trisulfuros.
La invención se refiere al uso de una sal de
metal alcalino o metal alcalinotérreo en la producción de péptidos
recombinantes durante o después de la etapa de fermentación para la
reducción de la cantidad de trisulfuros en el producto recombinante.
El péptido es preferiblemente hormona del crecimiento humana y la
sal preferiblemente un fosfato potásico o sódico.
En la producción recombinante de péptidos,
especialmente en la producción de productos farmacéuticos, la
cantidad de contaminación, tal como variantes de la proteína
deseada, debe reducirse tanto como sea posible por los aspectos
tanto económico como terapéutico.
En la producción recombinante de péptidos, a
veces se encuentran variantes con un átomo de azufre adicional en un
puente de disulfuro, y la presente invención se refiere a este
problema.
La hormona del crecimiento humana, hGH, es una
proteína que consiste en una sola cadena de 191 aminoácidos. La
molécula está reticulada mediante dos puentes de disulfuro y la
forma monómera tiene un peso molecular de 22 kDa.
Se han preparado preparaciones de hGH a partir de
pituitarias humanas, pero hoy en día los productos de mercado se
producen mediante procedimientos recombinantes, rhGH.
Dos tipos de preparaciones de hGH recombinante
terapéuticamente útiles están presentes en el mercado: la auténtica,
por ejemplo Genotropin®, Pharmacia & Upjohn AB, y un análogo con
un residuo de metionina adicional en el extremo
N-terminal, por ejemplo Somatonorm®.
La hGH se usa para estimular el crecimiento
lineal en pacientes con enanismo hipopituitario o síndrome de Turner
pero también se han sugerido otras indicaciones.
Se ha encontrado una nueva variante de la hormona
del crecimiento humana, hGH, y se hace referencia a Pavlu y otros,
1993, Bioseparation 3, 257-265. Esta variante se ha
identificado y caracterizado, véase Andersson y otros, 1996, Int. J.
Peptide, Protein., Res. 47, 311-321. Se encuentra
que la variante, que se forma durante la expresión de hGH en
Escherichia coli, es más hidrófoba que rhGH y se ha definido
estructuralmente como una variante de trisulfuro de rhGH.
La variante solo se forma durante la síntesis en
E. coli y no se ha encontrado en preparaciones de hGH
procedentes de pituitarias humanas. Este fenómeno de los trisulfuros
en péptidos, producidos mediante procedimientos recombinantes,
también se ha descrito para superóxido dismutasa recombinante
(Briggs y otros, 1987, Biochem., Biophys. Acta, 537,
100-109) y para una muteína de interleuquina (Breton
J. y otros, J. Chromatogr. A., 1995, 709(1),
135-46).
En WO 94/24127 se describe un procedimiento para
convertir un derivado hidrófobo de una hormona del crecimiento en la
forma natural de hormona del crecimiento. El derivado hidrófobo de
la hormona del crecimiento comprende un átomo de azufre adicional.
El procedimiento es un tratamiento químico del derivado de la
hormona del crecimiento con un mercaptocompuesto. Como ejemplos, se
dan cisteína, glutationa, 2-mercaptoetanol y
ditiotreitol.
En WO 96/02570 se describe un procedimiento que
comprende el tratamiento químico con un compuesto de sulfito para la
conversión del derivado de la hormona del crecimiento en la forma
natural. Se usan mercaptocompuestos y compuestos de sulfito en la
reacción redox para la conversión de la hormona del crecimiento ya
formada que comprende un átomo de azufre adicional.
Se ha encontrado ahora un nuevo uso de una sal de
metal alcalino o metal alcalinotérreo en la producción de péptidos
recombinantes durante o después de la etapa de fermentación para la
reducción de la cantidad de trisulfuros en el producto recombinante.
Los péptidos recombinantes pueden ser, por ejemplo, tanto proteínas
como péptidos más pequeños.
La invención se basa en el hallazgo nuevo e
inesperado de que la cantidad de trisulfuros en la producción de
péptidos recombinantes puede reducirse mediante la adición de una
sal metálica, preferiblemente en exceso, ya sea durante o después de
la fermentación y no, como se sugirió previamente, mediante la
conversión del trisulfuro formado de la hormona del crecimiento en
la forma natural.
Esta cantidad reducida del derivado se debe a la
inhibición de la actividad de H_{2}S en el medio y a la prevención
de la formación de la hormona del crecimiento modificada que
comprende un átomo de azufre adicional.
La adición puede realizarse directamente después
de la fermentación, por ejemplo después de que la fermentación haya
terminado y las células se recojan y antes de etapas de
procedimiento adicionales.
La invención puede realizarse, por ejemplo, con
un tampón que incluye la sal.
La proteína puede ser cualquier proteína
recombinante pero es preferiblemente hormona del crecimiento
recombinante que puede ser tanto humana como animal, tal como
hormona del crecimiento humana (hGH), hormona del crecimiento bobina
(bGH) y hormona del crecimiento porcina (pGH).
La sal metálica puede ser cualquier metal elegido
entre metal alcalino y alcalinotérreo.
El pH es preferiblemente igual a o inferior que
pH 7, más preferiblemente, el pH es igual a o inferior que 6,8 y lo
más preferiblemente el pH es igual a o inferior que 6,0.
La regulación del pH puede alcanzarse con un
tampón seleccionado que incluye la sal metálica.
El metal es preferiblemente alcalino, tal como
sodio o potasio, y la sal es preferiblemente fosfato o acetato
sódico o potásico.
La concentración de iones sulfuro libres se
minimiza mediante la adición de la sal metálica en exceso molar.
La sal metálica usada preferiblemente no es un
compuesto de sulfito o mercapto.
Las reivindicaciones adjuntas definen la
invención.
La figura 1 muestra la cantidad de
trisulfuro-GH en los extractos.
La figura 2 muestra la inducción y la inhibición
de la formación de trisulfuro en GH.
En los ejemplos siguientes se ha producido o
usado una hGH producida por recombinación, pero la invención que se
reivindica no se limita a este péptido. La variante de trisulfuro se
denomina trisulfuro-GH.
Se produjo hGH en E. coli de acuerdo con
procedimientos conocidos. Puede hacerse referencia a EP 177343,
ejemplo 8.
El transformante de E. coli se fermentó en
el medio, el cultivo se agitó bajo aireación y se añadió glucosa. La
fermentación se terminó parando la glucosa y la aireación. En este
punto, se tomó una muestra de referencia. Más adelante, las células
se recogieron.
Para la producción de hGH pura, las células
recogidas se concentraron, se lavaron, se solubilizaron mediante
congelación, se descongelaron y se purificaron de acuerdo con
procedimientos conocidos.
El cultivo se recogió y las células se
concentraron mediante microfiltración. El pH era 7,3 en el
concentrado celular. Se tomaron cuatro partidas del concentrado
celular. En tres partidas (500 ml) el pH se ajustó hasta 6,5, 7,0 y
7,8, con HCl o NaOH, respectivamente. La cuarta partida es la
muestra de comparación no tratada. A continuación, los concentrados
celulares se congelaron.
Las cuatro partidas se descongelaron y los
concentrados celulares se diluyeron dos veces con un tampón que
contenía Tris-HCl 10 mM y
Na_{2}-EDTA 1 mM, pH 8,2. Se obtuvieron extractos
celulares libres mediante centrifugación.
Se determinó la cantidad de
trisulfuro-GH en los extractos.
El resultado se muestra en la figura 1.
Se encontró que la cantidad de
trisulfuro-GH era la más alta a pH 7,8 (12%). Esto
podía compararse con la cuarta partida que no tenía el pH
cambiado.
Un pH por encima de 7,0 daba una cantidad
demasiado alta de trisulfuro-GH en este experimento,
así, el pH debe ser inferior.
El cultivo se recogió y las células se
concentraron mediante microfiltración. El pH en el concentrado
celular era 7,2. El concentrado celular se dividió en dos porciones
(aproximadamente 30 l).
El concentrado celular A se lavó con
aproximadamente un volumen de agua y a continuación se congeló a
-30ºC.
El concentrado celular B se lavó con
aproximadamente un volumen de tampón de fosfato potásico 0,05 M, pH
6,6. El pH en el concentrado celular B era 6,8. El concentrado
celular se congeló a continuación a -30ºC.
Después de descongelar, las células concentradas
se extrajeron mediante diafiltración con tampón de
Tris-HCl/
EDTA y se determinó la cantidad de trisulfuros. La cantidad de trisulfuro-GH era 6% en el extracto A y aproximadamente 3% en el extracto B, así el doble en A en comparación con B. Esto mostraba que el pH bajo y el tampón de sal metálica reducen la cantidad de la variante de trisulfuro de la hormona del crecimiento.
EDTA y se determinó la cantidad de trisulfuros. La cantidad de trisulfuro-GH era 6% en el extracto A y aproximadamente 3% en el extracto B, así el doble en A en comparación con B. Esto mostraba que el pH bajo y el tampón de sal metálica reducen la cantidad de la variante de trisulfuro de la hormona del crecimiento.
Se determinó la cantidad de trisulfuros en la
muestra de referencia, tomada antes de la recogida. El cultivo se
recogió y las células se concentraron mediante microfiltración. El
pH en el concentrado celular era 7,2. El concentrado celular se
dividió en dos porciones (aproximadamente 30 l). El concentrado
celular C se lavó con aproximadamente un volumen de agua y a
continuación se congeló a -30ºC.
El concentrado celular D se lavó con
aproximadamente un volumen de NaCl al 0,9% en agua. El pH en ese
concentrado celular era 7,2. El concentrado celular se congeló a
continuación a -30ºC.
Después de descongelar, las células concentradas
se extrajeron mediante diafiltración con tampón de
Tris-HCl/
EDTA y se determinó la cantidad de trisulfuros. La cantidad de trisulfuro-GH era aproximadamente 5% en el extracto C y aproximadamente 4,8% en D, así igual en C y D. La relación de trisulfuro-GH en el extracto C:muestra de referencia era 5,0%:2,0% = 2,5 y la relación de trisulfuro-GH en el extracto D:muestra de referencia era 4,7%:2,0% = 2,4.
EDTA y se determinó la cantidad de trisulfuros. La cantidad de trisulfuro-GH era aproximadamente 5% en el extracto C y aproximadamente 4,8% en D, así igual en C y D. La relación de trisulfuro-GH en el extracto C:muestra de referencia era 5,0%:2,0% = 2,5 y la relación de trisulfuro-GH en el extracto D:muestra de referencia era 4,7%:2,0% = 2,4.
Esto mostraba que para un extracto periplasmático
no sólo era importante la adición de una sal metálica sino también
el pH bajo.
Se determinó la cantidad de trisulfuros en la
muestra de referencia, tomada antes de la recogida. El cultivo se
recogió y las células se concentraron mediante microfiltración. El
pH en el concentrado celular era 7,2. El concentrado celular (E) se
lavó con aproximadamente un volumen de tampón de fosfato sódico
0,025 M, pH 6,0, al que se añadió 1 ml/l de HCl al 37%. El pH en el
concentrado celular E era 5,9. El concentrado celular se congeló a
continuación a -30ºC.
Después de descongelar, las células concentradas
se extrajeron mediante diafiltración con tampón de
Tris-HCl/
EDTA y se determinó la cantidad de trisulfuros.
EDTA y se determinó la cantidad de trisulfuros.
La relación de trisulfuro-GH en
el extracto E:muestra de referencia era 1,6%:1,4% = 1,1.
Esto mostraba que la cantidad de
trisulfuro-GH puede reducirse mediante la adición de
una sal metálica y un pH bajo.
Se determinó la cantidad de trisulfuros en la
muestra de referencia, tomada antes de la recogida. El cultivo se
recogió y las células se concentraron mediante microfiltración. El
pH en el concentrado celular era 7,2. El concentrado celular se
dividió en dos porciones (aproximadamente 30 l).
El concentrado F se lavó con aproximadamente un
volumen de tampón de acetato, que contenía acetato sódico x
3H_{2}O, 8,03 g/l, y ácido acético (100%), 2,35 ml/l. El pH en el
concentrado celular F era 5,9. El concentrado celular se congeló a
continuación a -30ºC.
El concentrado celular G se lavó con
aproximadamente un volumen de tampón de fosfato sódico 0,025 M, pH
6,0, al que se añadían 0,5 ml/l de H_{2}SO_{4} concentrado. El
pH en el concentrado celular G era 5,9. El concentrado celular se
congeló a continuación a -30ºC.
Después de descongelar, las células concentradas
se extrajeron mediante diafiltración con tampón de
Tris-HCl/
EDTA y se determinó la cantidad de trisulfuros.
EDTA y se determinó la cantidad de trisulfuros.
La relación de trisulfuro-GH en
el extracto F:muestra de referencia era 3,4%:3,1% = 1,1 y la
relación de trisulfuro-GH en el extracto G:muestra
de referencia era 2,6%:3,1% = 0,8.
Esto mostraba que la cantidad de
trisulfuro-GH puede reducirse mediante la adición de
una sal metálica y un pH bajo.
Se mezclaron 250 \mul de hGH pura (de la
producción de Genotropin®) en agua (2,436 mg/ml) + 250 \mul de
diferentes tampones 10 mM, véase la Tabla 1. Se usó H_{2}S
saturado (0,11 M) en agua destilada inmediatamente después de la
preparación. Se añadieron a cada muestra 50 \mul de agua destilada
(control) o H_{2}S en tres diluciones diferentes (H_{2}S 0,5,
0,1 y 0,02 mM, respectivamente).
La concentración era a continuación 1,11 mg de
hGH/ml.
Estas soluciones se incubaron con las diferentes
concentraciones de H_{2}S durante 3 horas a temperatura ambiente
para la preparación de la variante de trisulfuro de hGH.
Después de la incubación, la congelación, la
descongelación y el desalado de todas las muestras en
Tris-HCl 25 mM a pH 7,6, se analizó la cantidad de
trisulfuro.
Los tampones se prepararon de acuerdo con tablas
estándar.
| Fosfato Na, | pH 7,8 |
| Fosfato Na, | pH 7,0 |
| Fosfato Na, | pH 6,5 |
| Fosfato Na, | pH 6,0 |
| Citrato Na, | pH 6,2 |
| Tris-HCl, | pH 7,6 |
| Citrato amónico, | pH 6,2 |
El resultado se muestra en la figura 2.
El citrato amónico no daba reducción de los
trisulfuros a pesar del pH bajo.
El fosfato de Na a pH 6,0 daba el mejor resultado
pero también puede usarse fosfato Na a pH superior.
Esto mostraba que para hGH pura, la adición de
una sal metálica es importante para la cantidad de trisulfuros.
Claims (8)
1. Uso de una sal de metal alcalino o metal
alcalinotérreo en la producción de péptidos recombinantes durante o
después de la etapa de fermentación para la reducción de la cantidad
de trisulfuros en el producto recombinante.
2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado por la adición de la sal durante o después de
la etapa de fermentación.
3. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el
que la adición se realiza directamente después de la
fermentación.
4. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el pH es igual o inferior que pH
7.
5. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el metal es preferiblemente
potasio o sodio.
6. Uso de acuerdo con la reivindicación 5, en el
que la sal es preferiblemente fosfato o acetato potásico o
sódico.
7. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el péptido es hormona del
crecimiento.
8. Uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el
que el péptido es hormona del crecimiento humana.
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