ES2208516T3

ES2208516T3 - Intermedios para la preparacion de inhibidores de trombina como agentes anticoagulantes.

Info

Publication number: ES2208516T3
Application number: ES01200634T
Authority: ES
Inventors: Valentine Joseph Klimkowski; Aaron Leith Schacht; Michael Robert Wiley
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1996-06-25
Filing date: 1997-06-25
Publication date: 2004-06-16
Anticipated expiration: 2017-06-25
Also published as: CA2258915A1; US6160176A; US5863929A; US6034104A; DE69716823D1; WO1997049404A1; DE69725354D1; US6008367A; DE69716823T2; AU3496297A; EP0816376A1; ATE251176T1; ES2185876T3; PT816376E; DK0816376T3; DE69725354T2; ATE227306T1; JP2000514788A; US6552038B1; EP0816376B1

Abstract

Esta invención trata de productos intermedios útiles en la síntesis de inhibidores de la trombina, que son agentes anticoagulantes útiles en mamíferos. En particular, trata de productos intermedios útiles en la síntesis de derivados de ortohidroxibenzamidina que tienen actividad anticoagulante. Estos inhibidores de la trombina, y las composiciones farmacéuticas que contienen los compuestos como ingredientes activos, se aplican como anticoagulantes para la profilaxis y el tratamiento de trastornos tromboembólicos tales como trombosis venosa, embolia pulmonar, trombosis arterial, en particular isquemia miocárdica, infarto de miocardio y trombosis cerebral, estados de hipercoagulación general y estados de hipercoagulación local, tales como después de angioplastia e intervenciones de bypass coronario, y lesiones tisulares generalizadas ya que están relacionadas con el proceso inflamatorio. Además, los agentes son útiles como anticoagulantes en aplicaciones in vitro. El proceso de la coagulaciónde la sangre, la trombosis, está desencadenado por una cascada proteolítica compleja que conduce a la formación de trombina. La trombina elimina de forma proteolítica los péptidos de activación de las cadenas A alfa y de las cadenas B beta del fibrinógeno, que es soluble en el plasma sanguíneo, iniciando la formación de fibrina insoluble.

Description

Intermedios para la preparación de inhibidores de trombina como agentes anticoagulantes.

Esta invención trata de productos intermedios útiles en la síntesis de inhibidores de la trombina, que son agentes anticoagulantes útiles en mamíferos. En particular, trata de productos intermedios útiles en la síntesis de derivados de ortohidroxibenzamidina que tienen actividad anticoagulante. Estos inhibidores de la trombina, y las composiciones farmacéuticas que contienen los compuestos como ingredientes activos, se aplican como anticoagulantes para la profilaxis y el tratamiento de trastornos tromboembólicos tales como trombosis venosa, embolia pulmonar, trombosis arterial, en particular isquemia miocárdica, infarto de miocardio y trombosis cerebral, estados de hipercoagulación general y estados de hipercoagulación local, tales como después de angioplastia e intervenciones de bypass coronario, y lesiones tisulares generalizadas ya que están relacionadas con el proceso inflamatorio. Además, los agentes son útiles como anticoagulantes en aplicaciones in vitro.

El proceso de la coagulación de la sangre, la trombosis, está desencadenado por una cascada proteolítica compleja que conduce a la formación de trombina. La trombina elimina de forma proteolítica los péptidos de activación de las cadenas A\alpha y de las cadenas B\beta del fibrinógeno, que es soluble en el plasma sanguíneo, iniciando la formación de fibrina insoluble.

En la actualidad se consigue la anticoagulación mediante la administración de heparinas y cumarinas. El control farmacológico parenteral de la coagulación y la trombosis se basa en la inhibición de la trombina a través del uso de heparinas. Las heparinas actúan indirectamente sobre la trombina acelerando el efecto inhibidor de la antitrombina III endógena (el principal inhibidor fisiológico de la trombina). Dado que los niveles plasmáticos de la antitrombina III varían y puesto que la trombina de unión a la superficie parece ser resistente a estos mecanismos indirectos, las heparinas pueden ser un tratamiento ineficaz. Como los análisis de coagulación se cree que están asociados con la eficacia y con la seguridad, deben controlarse los niveles de heparina con los análisis de coagulación (particularmente con el tiempo de tromboplastina parcial activada, análisis (TTPA)). Las cumarinas impiden la generación de trombina bloqueando la gamma-carboxilación postraduccional en la síntesis de protrombina y otras proteínas de este tipo. Debido a su mecanismo de acción, el efecto de las cumarinas solo se puede desarrollar lentamente, 6-24 horas después de su administración. Además, no son anticoagulantes selectivos. Las cumarinas también requieren control con los análisis de coagulación (particularmente el análisis del tiempo de protrombina (TP)).

Recientemente, ha crecido el interés en moléculas sintéticas pequeñas que muestran una potente inhibición directa de la trombina. Véase, por ejemplo, Robert M. Scarborough, Annual Reports in Medicinal Chemistry, (1995), 30, 71-80, donde los inhibidores que no tienen una funcionalidad polarizable para interaccionar con el sitio activo Ser-195 del grupo hidroxilo de la trombina se denominan inhibidores de sitio activo. Los inhibidores de sitio activo en los que la fracción C terminal comprende una fracción amidinofenilo (benzamidina) insustituida o ciertas insustituidas se ilustran en los documentos EP 623596, WO 94/29336, WO 95/23609 y WO 95/35309. La fracción amidinofenilo es fuertemente básica, una propiedad que va en contra de una buena biodisponibilidad oral. Véase, por ejemplo, R. J. Misra, y col., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, (1994), 4, 2165-2170, donde se demostró que los análogos del argatrobano, menos básicos, retenían una útil potencia inhibidora de trombina al mismo tiempo que exhibían mejores propiedades de distribución, como lo demuestra la mayor permeabilidad celular al Caco-2. El documento EP-A-672658 también describe derivados peptídicos que son potentes inhibidores de trombina útiles como anticoagulantes. Como se comenta más adelante, los compuestos descritos en la presente invención retienen una útil potencia inhibidora de la trombina al mismo tiempo que exhiben mejores coeficientes de distribución como consecuencia de sus fracciones de amidinofenilo particularmente sustituidas.

Posterior a la fecha de prioridad de la presente solicitud se publicaron las solicitudes de patente internacional WO 96/24609 y WO 96/25426 que describían ciertos compuestos de amidinofenilo sustituidos, incluyendo el diclorhidrato de D-ciclohexilglicil-N-[[4-(aminoiminometil)-3-hidroxifenil]metil-L-prolinamida del Ejemplo 53 del documento WO 96/25426.

Aunque las heparinas y las cumarinas son anticoagulantes eficaces, todavía no ha surgido de las pequeñas moléculas sintéticas ningún fármaco comercial aceptado de forma general; y a pesar de las promesas continuas acerca de esta clase de compuestos, todavía existe una necesidad de anticoagulantes que actúen de forma selectiva sobre la trombina y que, independientes de la antitrombina III, ejerzan su acción inhibitoria poco después de su administración, preferiblemente a través de una vía oral, y que no interfieran en la lisis de los coágulos de sangre, como se requiere para la hemostasis.

La presente invención está relacionada con el descubrimiento de que los compuestos de fórmula I, como se define a continuación, son potentes inhibidores de la trombina que pueden tener una biodisponibilidad elevada tras la administración oral.

IX-C(O)-Y-G-R

en la que

X-C(O)- es D-prolinilo, D-homoprolinilo, R^{m}-(CH_{2})_{g}-NH-CH_{2}-C(O)-,

1

2

donde

R^{d} es carboxi o metilsulfonilo;

R^{e} es NHR^{c}, NHCOR^{c} o NHCOOR^{c}; en la que

R^{c} es alquilo (C_{1}-C_{10}), cicloalquilo (C_{3}-C_{8}) o un radical cicloalquil (C_{3}-C_{8})-alquilo (C_{1}-C_{6}) de 4-10 carbonos;

T es cicloalquilo (C_{3}-C_{8}), alquilo (C_{1}-C_{8}),

3

a es 0, 1 ó 2; y

Q es -OH, alcoxi (C_{1}-C_{4}) o -NH-A;

A es hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{4}), R''SO_{2}-, R''OC(O)-, R''C(O)-. R^{n}C(O)- o (CH_{2})_{g}-R^{m};

g es 1, 2 ó 3;

B es hidrógeno o alquilo (C_{1}-C_{4});

R' es hidrógeno o alquilo (C_{1}-C_{4});

R'' es alquilo (C_{1}-C_{4}), fluoroalquilo (C_{1}-C_{4}) con uno a cinco átomos de flúor, -(CH_{2})_{d}-R^{m} o arilo insustituido o sustituido, donde arilo es fenilo, naftilo, un anillo heterocíclico aromático de 5 ó 6 miembros insustituido o sustituido que tiene uno o dos heteroátomos que son iguales o diferentes y que se seleccionan de entre azufre, oxígeno y nitrógeno, o un grupo heterocíclico aromático bicíclico condensado de 9 ó 10 miembros insustituido o sustituido, que tiene uno o dos heteroátomos que son iguales o diferentes y que se seleccionan de entre azufre, oxígeno y nitrógeno;

R^{m} es -COOR^{b}, -SO_{2} (alquilo C_{1}-C_{4}), -SO_{3}H, -P(O)(OR^{b})_{2} o tetrazol-5-ilo;

R^{n} es -COOR^{b} o tetrazol-5-ilo;

cada R^{b} es de forma independiente hidrógeno o alquilo (C_{1}-C_{4});

d es 1, 2 ó 3;

m es 0, 1 ó 2;

n es 0, 1 ó 2; y

Z es hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{4}), alcoxi (C_{1}-C_{4}), hidroxi, halo o alquilsulfonilamino (C_{1}-C_{4});

-Y-G- es

4

donde

r es 0, 1 ó 2;

R^{g} es alquilo (C_{1}-C_{6}), cicloalquilo (C_{3}-C_{8}) o -(CH_{2})_{p}-L-(CH_{2})_{q}-T';

R^{p} es alquilo (C_{1}-C_{6}), cicloalquilo (C_{3}-C_{8}) o -(CH_{2})_{p}-L-(CH_{2})_{q}-T';

donde p es 0, 1, 2, 3 ó 4; L es un enlace -O-, -S- o -NH-; q es 0, 1, 2 ó 3; y T' es alquilo (C_{1}-C_{4}), cicloalquilo (C_{3}-C_{8}), -COOH, -CONH_{2} o Ar, donde Ar es arilo insustituido o sustituido, donde arilo es fenilo, naftilo, un anillo heterocíclico aromático de 5 ó 6 miembros insustituido o sustituido, que tiene uno o dos heteroátomos que son iguales o diferentes y que se seleccionan de entre azufre, oxígeno y nitrógeno, o un grupo heterocíclico aromático bicíclico condensado insustituido o sustituido de 9 ó 10 miembros, que tiene uno o dos heteroátomos que son iguales o diferentes y que se seleccionan de entre azufre, oxígeno y nitrógeno;

R^{y} es -CH_{2}-, -O-, -S-, o -NH; y

R^{z} es un enlace o, tomado con R^{y} y los tres átomos de carbono adyacentes, forma un anillo carbocíclico saturado de 5-8 átomos, un átomo de los cuales puede ser -O-, -S- o -NH-;

-G-R es -C(O)-NH-(CH_{2})_{s}-R, -CH_{2}-NH-(CH_{2})_{s}-R, -CH_{2}-NH-C(O)-R o (CH_{2})_{t}-O-R, donde s es 1 ó 2 y t es 1, 2 ó 3; y

R es un grupo 4-amidino-3-hidroxifenilo que lleva 0, 1, 2 ó 3 sustituyentes de flúor;

o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

En esta descripción se usan las siguientes definiciones, a menos que se describa lo contrario: Halo es flúor, cloro, bromo o yodo. Alquilo, alcoxi etc. representan grupos tanto lineales como ramificados; pero la referencia a un radical individual como "propilo" abarca solo el radical de cadena lineal ("normal"), representando específicamente un isómero de cadena ramificada como "isopropilo".

El término "anillo heterocíclico aromático de 5 ó 6 miembros" representa cualquier anillo de 5 ó 6 miembros que aportará una estructura estable que contenga uno o dos átomos de nitrógeno; un átomo de azufre; un átomo de oxígeno; un átomo de nitrógeno y un átomo de azufre; o un átomo de nitrógeno y un átomo de oxígeno. El anillo de 5 miembros tiene dos dobles enlaces y el anillo de 6 miembros tiene tres dobles enlaces.

El término "grupo heterocíclico aromático bicíclico condensado de 9 ó 10 miembros" representa cualquier grupo bicíclico en el que cualquiera de los anillos de 5 ó 6 miembros anteriores se condensa en posición orto con un anillo de benceno o con un anillo aromático heterocíclico de 6 miembros como se ha definido antes de forma que proporcionará una estructura estable.

Debe apreciarse que muchos de los heterociclos anteriores pueden existir en formas tautoméricas. Todas esas formas están incluidas dentro del alcance de esta invención.

Cada uno de los grupos heteroaromáticos o aromáticos recogidos en la definición de Ar o R'' está independientemente insustituido o sustituido con uno o dos sustituyentes que aportarán una estructura estable seleccionada de forma independiente de entre halo, hidroxi, alquilo (C_{1}-C_{4}), alcoxi (C_{1}-C_{4}), amino, mono (alquil C_{1}-C_{4})amino, di (alquil C_{1}-C_{4})amino, -(CH_{2})_{j}COOH, mercapto, -S(O)_{h}(alquilo C_{1}-C_{4}), -NHS(O)_{h}(alquilo C_{1}-C_{4}), NHC(O)(alquilo C_{1}-C_{4}),

\hbox{-S(O) _{h} }

NH_{2} -S(O)_{h}NH(alquilo C_{1}-C_{4}) o -S(O)_{h}N(alquilo C_{1}-C_{4})_{2}, h es 0, 1 ó 2 y j es 0, 1, 2, 3 ó 4.

En la representación de Fórmula I, la funcionalidad carbonilo del grupo X-(CO)- está unida a la funcionalidad amina del grupo -Y-.

El grupo 5 , donde Z y A son ambos hidrógeno, se denomina a veces en la presente invención fenilglicilo y en forma abreviada Phg. Los compuestos en los que A es, por ejemplo, metilo, se denominan grupo N^{\alpha}-metil-fenilglicilo y, de forma abreviada, MePhg. Los compuestos sustituidos en los que Z es distinto a hidrógeno se designan por el tipo y posición del grupo sustituyente, por ejemplo.

3'-clorofenilglicilo o Phg (3-Cl).

El grupo 6 , donde Z y A son ambos hidrógeno, se denominan a veces en la presente invención fenilalanina y, de forma abreviada, Phe. Los compuestos en los que A es, por ejemplo, metilo, se denominan grupo N^{\alpha}-metil-fenilalanilo y, de forma abreviada, MePhe. Los compuestos sustituidos en los que Z es distinto a hidrógeno se designan por el tipo y posición del grupo sustituyente, por ejemplo.

3'-clorofenilalanilo o Phe (3-Cl).

Los grupos 7 , donde R' es hidrógeno, se denominan a veces en la presente invención 1- y 3-tetrahidro-isoquinolincarbonilo, respectivamente y, respectivamente, se abrevian como 1-Tiq y 3-Tiq.

Los grupos 8 , donde R' es hidrógeno, se denominan a veces en la presente invención 1- y 3-perhidro-isoquinolincarbonilo, respectivamente, y se abrevian, respectivamente, como 1-Piq y 3-Piq. Como indican las líneas sinuosas, existen diversos isómeros de condensación de anillos de estos sustituyentes. Esta invención contempla cualquier isómero individual y combinaciones del mismo.

El grupo 9 , en el que r es 0, 1 ó 2 se denomina azetidina-2-carbonilo, prolinilo u homoprolinilo y se abrevia AZT, Pro o hPro, respectivamente.

El grupo 10 representa un sistema bicíclico saturado del tipo 4,5; 5,5; 6,5; 7,5 ó 8,5. La estereoquímica en 3ª es cis con respecto del carbonilo; el otro enlace en cabeza de puente puede ser cis o trans, a excepción de en los sistemas 4,5 y 5,5, en los que el enlace en cabeza de puente deben ser cis. Las definiciones de R^{y} y R^{z} proporcionan que el anillo variable, que incluye los tres átomos de carbono mostrados, es un sistema carbocíclico saturado de 4-8 átomos. Todos los átomos del anillo pueden ser carbono o uno de los átomos del anillo puede ser un heteroátomo seleccionado de entre -O-, -S- y -NH-. Esta definición incluye la fracción derivada del ácido octahidroindol-2-carboxílico, como está representado por

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Las diversas formas cis y trans de esta fracción se contemplan en esta invención. El isómero preferido derivado del ácido [2S-(2\alpha, 3a\beta, 7a\beta)]-octahidro-indol-2-carboxílico se abrevia "Ohi" y se representa

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Los asteriscos en el radical Y denotan un centro quiral que corresponde a (L) en los aminoácidos naturales. El asterisco en el radical X denota un centro quiral que es (D) o (DL); el # en el radical X denota un centro quiral que es (L).

Debe apreciarse que ciertos compuestos de Fórmula I pueden existir en, y aislarse en, formas isoméricas, incluyendo formas tautoméricas o isómeros cis o trans, así como formas diastereoméricas o racémicas ópticamente activas. La presente invención abarca productos intermedios útiles en la síntesis de un compuesto de Fórmula I en cualquiera de las formas tautoméricas o como una mezcla de las mismas. Debe entenderse que la presente invención abarca productos intermedios útiles en la síntesis de un compuesto de Fórmula I como una mezcla de diastereómeros, así como en la forma de un diaetereómero individual, y que la presente invención abarca productos intermedios útiles en la síntesis de un compuesto de Fórmula I como una mezcla de enantiómeros, así como en la forma de un enantiómero individual, cualquiera de tales mezclas o formas posee propiedades inhibitorias frente a la trombina, siendo bien conocida en la técnica la forma de preparación o de aislamiento de formas particulares y cómo determinar las propiedades inhibitorias frente a la trombina mediante pruebas estándar, incluyendo las descritas más adelante.

Además, un compuesto de Fórmula I puede exhibir polimorfismo o puede formar un solvato con agua o un disolvente orgánico. La presente invención también abarca productos intermedios útiles en la síntesis de cualquier forma polimórfica, cualquier solvato o cualquier mezcla de los mismos.

Los valores particulares se recogen en una lista más adelante con los radicales (solos o como parte de otro radical), sustituyentes e intervalos, sólo como ilustración y no excluyen otros valores definidos u otros valores dentro de los intervalos definidos para los radicales y sustituyentes.

Un valor particular para un grupo alquilo (C_{1}-C_{4}), un grupo alquilo (C_{1}-C_{6}), un grupo alquilo (C_{1}-C_{8}) o un grupo alquilo (C_{1}-C_{10}) es metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo o t-butilo. Un valor particular para un grupo alcoxi (C_{1}-C_{4}) es metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi o t-butiloxi. Un valor particular para un grupo cicloalquilo (C_{3}-C_{8}) es ciclopropilo, ciclopentilo o ciclohexilo. Un valor particular para un grupo fluoroalquilo (C_{1}-C_{4}) es trifluorometilo o 2,2,2-trifluoroetilo. Un valor particular para arilo es fenilo, naftilo, furilo, tienilo, piridilo, indolilo, quinolinilo o isoquinolinilo.

Un compuesto particular de Fórmula I como se ha definido antes es uno en el que

X-C(O)- es D-homoprolinilo,

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14

donde T es ciclohexilo o fenilo; a es 0 ó 1; y A es hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{4}), (alquil C_{1}-C_{4})sulfonilo, (alquil C_{1}-C_{4})oxi-carbonilo, (alquil C_{1}-C_{4})carbonilo o carboximetilo; y

Y-G- es NR^{g}-CH_{2}-G-

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donde R^{g} es alquilo (C_{1-}C_{6}), -(CH_{2})_{q}-cicloalquilo (C_{3}-C_{8}) o (CH_{2})_{q}-fenilo; q es 0, 1, 2 ó 3 ; y r es 0, 1 ó 2;

o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

Un compuesto preferido de Fórmula I como se ha definido antes es uno en el que

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en la que T es ciclohexilo; a es 1; y A es hidrógeno, etilsulfonilo o carboximetilo, particularmente carboximetilo; y

-Y-G es

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donde r es 0 ó 1;

o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

Para cualquiera de los compuestos de Fórmula I definidos anteriormente, un valor particular de -G-R- es -C(O)-NH-(CH_{2})_{s}-R; y un valor preferido de -G-R- es -C(O)-NH-(CH_{2})_{s}-R en el que s es 1, es decir -C(O)-NH-CH_{2}-R.

Un particular compuesto de Formula I en el que -G-R es -C(O)-NH-CH_{2}-R y los otros grupos tienen cualquiera de las definiciones mencionadas anteriormente puede representarse mediante la fórmula Ia

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donde f es 0, 1, 2 ó 3.

Para cualquiera de los compuestos de Fórmula I definidos anteriormente, un valor particular de R es 4-amidino-3-hidroxifenilo o 4-amidino-3-hidroxi-2,5,6-trifluorofenilo; y un valor más particular es 4-amidino-3-hidroxifenilo.

Un particular compuesto de Fórmula I es uno de aquéllos descritos en la presente invención como Ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 9, 10 ó 11; y un compuesto preferido es uno descrito como Ejemplo 1, 3 ó 5, particularmente Ejemplo 3; o una sal de los mismos farmacéuticamente aceptable.

Un compuesto de Fórmula I puede prepararse mediante procedimientos que incluyen procedimientos conocidos en la técnica química para la producción de compuestos estructuralmente análogos o mediante un procedimiento nuevo descrito en la presente invención. Los productos intermedios nuevos y su uso para la fabricación de un compuesto de Fórmula I como se ha definido antes proporcionan las características de la invención y se ilustran mediante los siguientes procedimientos en los que los significados de los radicales genéricos son como se ha definido antes, a menos que se especifique otra cosa. Debe reconocerse que puede ser preferible o necesario preparar un compuesto de Fórmula I en el que un grupo funcional se protege usando un grupo protector convencional, y después eliminar el grupo protector para proporcionar el compuesto de Fórmula I.

(A) Para un compuesto de Fórmula I en el que -G-R es -C(O)-NH-(CH_{2})_{s}-R, acoplar un ácido de Fórmula II,

IIX-C(O)-Y-C(O)-OH

o un derivado activado del mismo, con una amina de Fórmula III.

IIIH_{2}N-(CH_{2})_{s}-R

El acoplamiento se lleva a cabo usando un procedimiento convencional, por ejemplo usando un reactivo de acoplamiento tal como benzotriazol-1-iloxitripirrolidinofosfonio hexafluorofosfato, por ejemplo como se describe en el Ejemplo 1-E, o tal como 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, por ejemplo como se ha descrito en el Ejemplo 5.

(B) Acoplamiento de un ácido de Fórmula IV,

IVX-C(O)-OH

o un derivado activado del mismo, con una amina de Fórmula V.

VH-Y-G-R-

El acoplamiento se lleva a cabo usando un procedimiento convencional, por ejemplo usando uno de los procedimientos descritos antes en (A). La presente invención proporciona un compuesto que tiene la Fórmula VI, como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 más adelante.

Un compuesto de Fórmula I puede prepararse a partir de un compuesto de Fórmula VI mediante el siguiente procedimiento

(C) Hidrogenación del enlace -N-O de un correspondiente compuesto de Fórmula VI

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donde f es 0, 1, 2 ó 3. Convenientemente, la hidrogenólisis se lleva a cabo usando un catalizador de paladio sobre carbono en alcohol acuoso ácido a temperatura ambiente y en condiciones de presión de hidrógeno ambiental o bajo una presión de algunos bares; y se aísla el producto como su sal formada por la adición de ácido.

Tras esto, para cualquiera de los procedimientos anteriores, cuando un grupo funcional está protegido usando un grupo protector, se retira el grupo protector.

Tras esto, para cualquiera de los procedimientos anteriores, cuando se requiere una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de Fórmula I, se obtiene mediante la reacción de la forma ácida o básica de tal compuesto de Fórmula I con una base o un ácido que proporciona un contraión fisiológicamente aceptable o mediante cualquier otro procedimiento convencional, tal como, por ejemplo, el intercambio del contraión de una sal.

Un compuesto correspondiente a un compuesto de Fórmula I, en el que uno o más grupos funcionales están protegidos, puede representarse como un compuesto de Fórmula Ip

Ip(p^{x})X-C(O)-(P^{y})-Y-G(P^{G})-R(P^{R})

que lleva uno o más de los grupos protectores P^{X},P^{Y}, P^{G} y P^{R}, en la que P^{X} es uno o varios grupos protectores opcionales para uno o varios grupos funcionales de X-C(O)-; P^{Y} es uno o varios grupos protectores opcionales para uno o varios grupos funcionales de -Y-; P^{G} es un grupo protector de amino opcional para G cuando G-R es -(CH_{2})-NH-(CH_{2})_{s}-R; y P^{R} es uno o varios grupos protectores opcionales para un grupo funcional de R. Los valores típicos para P^{X} y para P^{Y} incluyen los grupos que forman un t-butiléster o un éster de bencilo cuando el grupo funcional protegido es carboxi, los grupos que forman un uretano de t-butilo o un uretano de bencilo cuando el grupo funcional protegido es amino, y los grupos que forman un éter de metilo, un éter de t-butilo o un éter de bencilo cuando el grupo funcional protegido es hidroxi. Debe reconocerse que algunos compuestos de Fórmula I pueden servir como un equivalente protegido de otro compuesto de Fórmula I. Por ejemplo, un compuesto de Fórmula I es el que A es R''OC (O)-, en la que R'' es t-butilo, es un equivalente protegido de un compuesto de Fórmula I en el que A es hidrógeno, como se ha descrito en el Ejemplo 1. De igual forma, un compuesto de Fórmula I en el que R^{m} es COOR^{b}, donde R^{b} t-butilo es un equivalente protegido de un compuesto de Fórmula I, en el que R^{m} es -COOR^{b} y R^{b} es hidrógeno.

Como se ha mencionado antes, un compuesto de Fórmula I incluye una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto inhibidor de trombina definido por la Fórmula I anterior. Una particular benzamidina de Fórmula I posee uno o más grupos funcionales lo bastante básicos como para que reaccionen con cualquiera de un número de ácidos atóxicos inorgánicos y orgánicos para formar una sal farmacéuticamente aceptable. Los ácidos empleados de forma habitual para formar las sales de adición de ácidos son ácidos inorgánicos, tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido yodhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico y similares, y ácidos orgánicos tales como ácido p-tolueno sulfónico, ácido metanosulfónico, ácido oxálico, ácido p-bromo fenil sulfónico, ácido carbónico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido acético y similares. Por tanto, ejemplos de tales sales farmacéuticamente aceptables son sulfato, pirosulfato, bisulfato, sulfito, bisulfito, fosfato, monohidrógenofosfato, dihidrógenofosfato, metafosfato, pirofosfato, cloruro, bromuro, yoduro, acetato, propionato, decanoato, caprilato, acrilato, formiato, isobutirato, caproato, heptanoato, propiolato, oxalato, malonato, succinato, suberato, sebacato, fumarato, maleato, butino-1,4-dioato, hexino-1,6-dioato, benzoato, clorobenzoato, metilbenzoato, dinitrobenzoato, hidroxibenzoato, metoxibenzoato, ftalato, sulfonato, xilenosulfonato, fenilacetato, fenilpropionato, fenilbutirato, citrato, lactato, gamma hidroxibutirato, glicolato, tartrato, metanosulfonato, propanosulfonato, naftaleno-1-sulfonato, naftaleno-2-sulfonato, mandelato y similares. Entre las sales formadas por adición de ácidos preferidas se incluyen aquellas formadas con ácidos minerales tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico y ácido sulfúrico.

Para un compuesto de Fórmula I en el que X o Y llevan una fracción ácida, tal como un grupo carboxi, se puede preparar una sal farmacéuticamente aceptable con una base que proporciona un catión farmacéuticamente aceptable, que incluye sales de metal alcalino (especialmente sodio y potasio), sales de metal alcalino térreo (especialmente calcio y magnesio), sales de aluminio y sales de amonio, así como sales preparadas a partir de bases orgánicas fisiológicamente aceptables tales como trietilamina, morfolina, piperidina y trietanolamina.

Si no están disponibles comercialmente, los materiales de partida necesarios para la preparación de un compuesto de Fórmula I pueden prepararse mediante procedimientos que se seleccionan de entre las técnicas estándar de química orgánica, incluyendo la transformación y sustitución aromática y heteroaromática, de entre las técnicas que son análogas a la síntesis de compuestos conocidos estructuralmente similares, especialmente síntesis de péptidos, y de entre las técnicas que son análogas a los procedimientos descritos anteriormente o a los procedimientos descritos en los Ejemplos. Debe quedar claro para un experto en la técnica que existe una variedad de secuencias para la preparación de los materiales de partida.

Un material de partida ácido de Fórmula II y también puede representarse como un ácido de Fórmula IIp.

IIp(p^{x})X-C(O)-(P^{y})-Y-C(O)-OH

en la que P^{X} y P^{Y} son grupos protectores opcionales como se ha definido anteriormente. Convenientemente, un ácido de Fórmula IIp puede prepararse acoplando un ácido opcionalmente protegido de Fórmula VII

VII(p^{x})X-C(O)-OH

con un derivado aminoácido de Fórmula VIII

VIIIH-(P^{Y})Y-C(O)-OP^{C}

en la que P^{C} es hidrógeno o un grupo protector carboxi, tales como, por ejemplo, metilo, etilo, t-butilo o bencilo, seguido por la eliminación del grupo protector P^{C}, cuando está presente.

Una ruta general conveniente para la preparación de una amina de Fórmula III o una amina de Fórmula V se esboza en el Esquema I, en el que G^{a} representa una forma latente o protegida del grupo H_{2}N-(CH_{2})_{s}- o del grupo H-Y-G-, respectivamente, y f es 0, 1, 2 ó 3.

Esquema I

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Por tanto, de acuerdo con el procedimiento de Shutske y Kapples (J. Heterocyclic Chem. (1989), 26, 1293-1298), y ortofluoro benzonitrilo de Fórmula X se trata con el anión potásico de oxima de acetona para proporcionar la correspondiente oxima de Fórmula XI; la hidrólisis ácida de la oxima proporciona la amina de Fórmula XII que se cicla in situ para dar lugar al derivado sustituido 3-amino-1,2-benzisoxazol de Fórmula XIII. El grupo G^{a} puede convertirse en H_{2}N-(CH_{2})_{s}- para dar una amina de Fórmula XIV o en -H-Y-G para dar una amina de Fórmula XV, respectivamente; la hidrogenolisis del benzisoxazol, usando un procedimiento similar al descrito en el apartado (C) antes, proporciona la amina respectiva de Fórmula III o Fórmula V. Por otro lado, pude ser preferible primero hidrogenolizar el benzisoxazol de Fórmula XIII en un correspondiente compuesto de Fórmula XVI antes de transformar el grupo G^{a} para dar una amina de Fórmula III o Fórmula V. Como se describe en el Ejemplo 1-D y en el Ejemplo 2-B, la conversión de G^{a} (como ciano) en H_{2}N-CH_{2}- puede llevarse a cabo al mismo tiempo que la hidrogenolisis, proporcionando por tanto una conversión directa de un compuesto de Fórmula XIII en una amina de Fórmula III.

Puede prepararse un material de partida de Fórmula VI mediante una ruta análoga a una descrita antes, por ejemplo usando un compuesto de Fórmula XIV o de Fórmula XV, o un derivado protegido del mismo.

El mejor modo de aislar un compuesto de Fórmula I es en la forma de una sal de adición de ácido. Una sal del compuesto de Fórmula I formada con un ácido como uno de los mencionados anteriormente es útil como una sal farmacéuticamente aceptable para administrar el agente antitrombótico y para preparar una formulación del agente. En el aislamiento y la purificación del compuesto pueden prepararse y usarse otras sales de adición de ácido.

Uno de los nuevos productos intermedios de la invención es un compuesto de Fórmula III o una sal y/o un derivado protegido del mismo.

Un particular compuesto de Fórmula III es uno en el que s es 1 y que puede representarse mediante la Fórmula IIIa

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en la que f es 0, 1, 2 ó 3. Un particular compuesto de Fórmula IIIa es uno en el que f es 0 ó 3.

Otro aspecto de la invención en el uso de un compuesto de Fórmula III (o de Fórmula IIIa) como se ha definido anteriormente, o una sal o un derivado protegido del mismo, como un material de partida en la síntesis de un inhibidor de la trombina.

Como otro aspecto de la invención, se proporciona un nuevo fragmento estructural de la fórmula

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en la que f es 0, 1, 2 ó 3 (particularmente f es 0 ó 3) como un nuevo elemento estructural en un inhibidor de la trombina, particularmente en un inhibidor peptidomimético de la trombina.

Otro nuevo producto intermedio de la invención es un compuesto de Fórmula XIII en la que G^{a} es ciano y que puede representarse mediante la Fórmula XIIIa.

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en la que f es 0, 1, 2 ó 3; particularmente en la que f es 0 ó 3.

Como se ha podido observar antes, los isómeros y diastereoisómeros ópticamente activos de los compuestos de Fórmula I también se consideran parte de la Fórmula I. Tales isómeros ópticamente activos pueden prepararse a partir de sus precursores ópticamente activos respectivos mediante los procedimientos descritos anteriormente o mediante la resolución de las mezclas racémicas. Esta resolución puede llevarse a cabo mediante derivatización con un reactivo quiral seguido de cromatografía o mediante cristalización repetida. La eliminación del auxiliar quiral mediante procedimientos estándar da lugar a isómeros sustancialmente ópticamente puros de los compuestos de la presente invención o sus precursores. Más detalles acerca de las resoluciones se pueden obtener en Jacques y col., Enantiomers, Racemates, and Resolutions, John Wiley y Sons, 1981.

Se cree que los compuestos de Fórmula I inhiben de forma selectiva la trombina frente a otras proteinasas y proteínas no enzimáticas implicadas en la coagulación de la sangre sin que produzca interferencia apreciable en la capacidad natural del organismo para la lisis de coágulos (los compuestos tienen en efecto inhibidor bajo sobre la fibrinolisis). Asimismo, generalmente exhiben mayor selectividad para el compuesto de trombina frente al compuesto amidinofenilo previo. Además, se cree que tal selectividad permite su uso con agentes trombolíticos sin producir grandes interferencias en la trombolisis y en la fibrinolisis.

Se espera que los compuestos de Fórmula I sean útiles en mamíferos, incluyendo en los seres humanos, para el tratamiento o profilaxis de trombosis e hipercoagulabilidad en sangre y tejidos. Los trastornos en los que los compuestos tienen una utilidad potencial son en el tratamiento o profilaxis de trombosis e hipercoagulabilidad en sangre y tejidos. Los trastornos en los que los compuestos tienen una utilidad potencial, como tratamiento o profilaxis, incluyen trombosis venosa y embolia pulmonar, trombosis arterial, como en la isquemia miocárdica, infarto de miocardio, angina inestable, accidente cerebrovascular por trombosis y trombosis arterial periférica. Además, los compuestos tienen una utilidad esperada en el tratamiento o profilaxis de trastornos ateroescleróticos (enfermedades) tales como enfermedad de arterias coronarias, enfermedad arteriocerebral y enfermedad arterial periférica. Además, se espera que los compuestos sean útiles junto con los trombolíticos en el infarto de miocardio. Además, los compuestos tienen una utilidad esperada en la profilaxis de la reoclusión tras trombolisis, angioplastia transluminal percutánea (PTCA) e intervenciones de bypass coronario. Es más, los compuestos tienen una utilidad esperada en la prevención de la retrombosis tras microcirugía. Además, se espera que los compuestos sean útiles en el tratamiento anticoagulante relacionado con órganos artificiales y válvulas cardíacas. Además, los compuestos tienen una utilidad esperada en el tratamiento anticoagulante en hemodiálisis y en la coagulación intravascular diseminada. Otra utilidad esperada es en el lavado de los catéteres y dispositivos mecánicos usados en pacientes in vivo y como anticoagulante para la conservación de sangre, plasma y otros productos sanguíneos in vitro. Todavía más, los compuestos tienen una utilidad esperada en otras enfermedades en las que la coagulación sanguínea podría ser un proceso contribuyente fundamental o una fuente de enfermedad secundaria, tal como cáncer, incluyendo metástasis, enfermedades inflamatorias, incluyendo artritis, y diabetes. El compuesto anticoagulante se administra por vía oral, parenteral, por ejemplo infusión intravenosa (iv), inyección intramuscular (im) o por vía subcutánea (sc).

La dosis específica de un compuesto administrado para obtener efectos terapéuticos y/o profilácticos la determinarán por supuesto, las circunstancias particulares que rodeen al caso, incluyendo, por ejemplo, el compuesto administrado, la velocidad de administración, la ruta de administración y la enfermedad a tratar.

Una dosis diaria típica para cada una de las utilidades anteriores se encuentra entre aproximadamente 0,01 mg/kg y aproximadamente 1000 mg/kg. El régimen de dosificación puede variar, por ejemplo, para uso profiláctico puede administrarse una única dosis diaria o puede ser adecuado administrar varias dosis como 3 ó 5 veces al día. En las situaciones de cuidado crítico, se administra un compuesto de la invención mediante infusión iv a una velocidad de entre 0,01 mg/kg/h y aproximadamente 20 mg/kg/h y preferiblemente entre alrededor de 0,1 mg/kg/h y alrededor de 5 mg/kg/h.

El procedimiento también se practica junto con un agente de lisis de coágulos, por ejemplo activador de plasminógeno tisular (t-PA), t-PA modificado, estreptoquinasa o uroquinasa.

En los casos en los que se ha producido la formación de un coágulo y se ha bloqueado una arteria o una vena, ya sea parcial o totalmente, se suele emplear un agente de lisis de coágulos. Un compuesto de Fórmula I puede administrase antes o al mismo tiempo que el agente de lisis o posteriormente a su uso, y preferiblemente además se administra junto con ácido acetilsalicílico para prevenir la repetición de la formación del coágulo.

El procedimiento también se practica junto con un antagonista del receptor glucoproteico de las plaquetas (IIb/IIIa), que inhibe la agregación plaquetaria. Un compuesto de Fórmula I puede administrarse antes o al mismo tiempo que el antagonista IIb/IIIa o tras su uso para prevenir que se produzca o que se vuelva a producir la formación de coágulos.

El procedimiento también se practica junto con ácido acetilsalicílico. Un compuesto de Fórmula I puede administrarse antes o al mismo tiempo que el ácido acetilsalicílico o tras su uso para prevenir que se produzca o que se vuelva a producir la formación de coágulos. Como se ha indicado anteriormente, preferiblemente se administra un compuesto de Fórmula I junto con un agente de lisis de coágulos y ácido acetilsalicílico.

Las composiciones farmacéuticas para usar en el procedimiento terapéutico descrito antes comprenden una cantidad eficaz inhibidora de trombina de un compuesto de fórmula I asociado con un vehículo, un excipiente o un diluyente farmacéuticamente aceptable. Para la administración oral, el compuesto antitrombótico se formula en cápsulas o comprimidos de gelatina que pueden contener excipientes tales como ligantes, lubricantes, agentes de desintegración y similares. Para la administración parenteral, el antitrombótico se formula en un diluyente farmacéuticamente aceptable, por ejemplo suero fisiológico salino (0,9 por ciento), dextrosa al 5 por ciento, solución de Ringer y similares.

El compuesto de Fórmula I puede formularse en formulaciones de dosificación unitaria que comprendan una dosis de entre alrededor de 0,1 mg y alrededor de 1000 mg. Preferiblemente el compuesto está en forma de una sal farmacéuticamente aceptable, como por ejemplo la sal sulfato, la sal acetato o la sal fosfato. Un ejemplo de una formulación de dosificación unitaria comprende 5 mg de un compuesto de la presente invención como una sal farmacéuticamente aceptable en una ampolla de 10 ml de vidrio estéril. Otro ejemplo de una formulación de dosificación unitaria comprende alrededor de 10 mg de un compuesto de la presente invención como una sal farmacéuticamente aceptable en 20 ml de suero salino isotónico contenidos en una ampolla estéril.

Los compuestos pueden administrarse mediante varias rutas, incluyendo las vías oral, rectal, transdérmica, subcutánea, intravenosa, intramuscular e intranasal. Los compuestos de Fórmula I se formulan, preferiblemente, antes de la administración.

El ingrediente activo en tales formulaciones comprende desde 0,1 por ciento a 99,9 por ciento en peso de la formulación. Por "farmacéuticamente aceptable" se quiere decir que el vehículo, el diluyente o el excipiente debe ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no perjudiciales para el receptor de los mismos.

Las presentes composiciones farmacéuticas se preparan mediante procedimientos conocidos usando ingredientes bien conocidos y fácilmente disponibles. Las composiciones de esta invención pueden formularse de manera que proporcionen liberación rápida, prolongada o tardía del ingrediente activo después de la administración al paciente empleando procedimientos bien conocidos en la técnica. Al preparar las composiciones, el ingrediente activo generalmente se mezclará con un vehículo o se diluirá con un vehículo o se incluirá dentro de un vehículo que puede estar en la forma de una cápsula, un sello, un papel u otro contenedor. Cuando el vehículo sirve como diluyente, puede ser un material sólido, semisólido o líquido que actúa como vehículo, excipiente o medio para el ingrediente activo. Por tanto, las composiciones pueden estar en la forma de comprimidos, píldoras, polvos, pastillas, sellos, obleas, elixires, suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes, aerosoles, (como un sólido o en un medio líquido), cápsulas de gelatina blanda y dura, supositorios, soluciones inyectables estériles, polvos empaquetados estériles y similares.

Los siguientes ejemplos de formulación solo son ilustrativos y con ellos no se pretende limitar de ningún modo el alcance de la invención. "Ingrediente activo", por supuesto, significa un compuesto según la Fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato del mismo.

Formulación 1

Las cápsulas de gelatina dura se preparan usando los siguientes ingredientes:

	Cantidad (mg/cápsula)
Ingrediente activo	250
Almidón seco	200
Estearato de magnesio	10
Total	\overline{460}	mg

Formulación 2

Un comprimido se prepara usando los siguientes ingredientes:

	Cantidad (mg/comprimido)
Ingrediente activo	250
Celulosa microcristalina	400
Dióxido de silicio, pirólisis	10
Ácido esteárico	5
Total	\overline{665}	mg

Los componentes se mezclan y comprimen para formar comprimidos, cada uno de ellos con un peso de 665 mg.

Formulación 3

Una solución de aerosol se prepara para que contenga los siguientes ingredientes:

\newpage

	Peso
Ingrediente activo	0,25
Etanol	25,75
Propelente 22 (Clorodifluorometano)	70,00
Total	\overline{100,00}

El compuesto activo se mezcla con etanol y la mezcla se añade a una porción del propelente 22, se enfría hasta -30ºC y se transfiere a un dispositivo de llenado. A continuación se introduce la cantidad requerida en un contenedor de acero inoxidable y se diluye con el resto del propelente. Después se ajustan las unidades valvulares en el contenedor.

Formulación 4

Los comprimidos, conteniendo cada uno de ellos 60 mg de ingrediente activo, se preparan como sigue:

Ingrediente activo	60,0 mg
Almidón	45,0 mg
Celulosa microcristalina	35,0 mg
Polividona (como solución al 10% en agua)	4,0 mg
Carboximetilalmidón sódico	4,5 mg
Estearato de magnesio	0,5 mg
Talco	1,0 mg
Total	\overline{\text{150,0 mg}}

El ingrediente activo, el almidón y la celulosa se pasan a través de un tamiz de 355 \mum (nº de malla 45 de EE.UU.) y se mezclan por completo. La solución acuosa que contiene la polividona se mezcla con el polvo resultante y después la mezcla se pasa a través de un tamiz de 1,40 mm (nº de malla 14 de EE.UU.). Los gránulos producidos de esta manera se secan a 50ºC y se pasan a través de un tamiz de 1,00 mm (nº de malla 18 de EE.UU.). El almidón de carboximetil sódico, el estearato de magnesio y el talco, previamente pasados por un filtro de 250 \mum (nº de malla 60 de EE.UU.), se añaden a los gránulos que, tras el mezclado, se comprimen en una máquina de comprimidos para dar los comprimidos, cada uno de ellos con un peso de 150 mg.

Formulación 5

Las cápsulas, cada una de ellas con 80 mg de ingrediente activo, se preparan como sigue:

Ingrediente activo	80 mg
Almidón	59 mg
Celulosa microcristalina	59 mg
Estearato de magnesio	2 mg
Total	\overline{\text{200 mg}}

Se mezclan el ingrediente activo, la celulosa, el almidón y el estearato de magnesio, se pasan a través de un tamiz de 355 \mum (nº de malla 45 de EE.UU.) y se introducen dentro de cápsulas de gelatina dura en cantidades de 200 mg.

Formulación 6

Los supositorios, cada uno de ellos con 225 mg de ingrediente activo, se preparan como sigue:

Ingrediente activo	225 mg
Glicéridos de ácidos grasos saturados	2.000 mg
Total	\overline{\text{2.225 mg}}

El ingrediente activo se pasa a través de un tamiz de 250 \mum (nº de malla de EE.UU.) y se suspende en los glicéridos de ácidos grasos saturados previamente fundidos usando el mínimo calor necesario. A continuación la mezcla se vierte en un molde de supositorios de una capacidad nominal de 2 g y se deja enfriar.

Formulación 7

Las suspensiones, cada una de ellas con 50 mg de ingrediente por dosis de 5 ml, se preparan como sigue:

\newpage

Ingrediente activo	50 mg
Carboximetilcelulosa sódica	50 mg
Jarabe	1,25 ml
Solución de ácido benzoico	0,10 ml
Aroma	c.v.
Color	c.v.
Agua purificada hasta un total	5 ml

El ingrediente activo se pasa a través de un tamiz de nº de malla 45 de EE.UU. y se mezcla con la carboximetilcelulosa sódica y el jarabe para formar una pasta blanda. La solución de ácido benzoico, el aroma y el color se diluyen con una porción del agua y se añaden en agitación. A continuación se añade una cantidad suficiente de agua para producir el volumen requerido.

Formulación 8

Una formulación intravenosa puede prepararse como sigue:

Ingrediente activo	100 mg
Suero salino isotónico	1.000 ml

Generalmente la solución de los ingredientes anteriores se administra a un sujeto por vía intravenosa a una velocidad de 1 ml por minuto.

La capacidad de un compuesto de Fórmula I para ser un inhibidor de trombina eficaz y oralmente activo se evalúa en uno o más de los siguientes ensayos.

Los compuestos de Fórmula I inhiben de forma selectiva la acción de la trombina en mamíferos. La inhibición de la trombina se demuestra mediante inhibición in vitro de la actividad amidasa de la trombina medida en un ensayo en el que la trombina hidroliza el sustrato cromogénico, N-benzoil-L-fenilalanil-L-valil-L-arginil-p-nitroanilida, N-benzoil-L-Phe-L-Val-L-Arg-p-nitroanilida.

El ensayo se lleva a cabo mezclando 50\mul del tampón (Tris 0,03M, NaCl 0,15 M, pH 7,4) con 25 \mul de solución de trombina humana (trombina humana purificada, Enzyme Research Laboratories, South Bend, Indiana, a 8 NIH unidades/ml) y 25 \mul del compuesto de prueba en un disolvente (50% de metanol acuoso (v:v)). A continuación se añaden 150 \mul de una solución acuosa del sustrato cromogénico (a 0,25 mg/ml) y se miden las tasas de hidrólisis del sustrato controlando las reacciones a 405 nm para la liberación de p-nitroanilina. Las curvas estándar se construyen representando gráficamente la concentración de trombina libre frente a la tasa de hidrólisis. Después, las tasas de hidrólisis observadas para los compuestos de prueba se convierten en los valores de "trombina libre" en los respectivos análisis usando las curvas estándar. La trombina ligada (unida al compuesto de prueba) se calcula restando la cantidad de trombina libre observada en cada ensayo de la cantidad inicial conocida de trombina usada en el ensayo. La cantidad de inhibidor libre en cada ensayo se calcula restando el número de moles de trombina ligada del número de moles de inhibidor añadido (compuesto de prueba).

El valor Kass es la constante de equilibrio hipotético para la reacción entre la trombina y el compuesto de prueba (I).

\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Trombina + I \+  \rightarrow  \+ Trombina–I\cr  \+
 \leftarrow \+\cr}

Kass = \frac{[Trombina-I]}{[(Trombina) x (I)]}

La Kass se calcula para un intervalo de concentraciones de compuestos de prueba y el valor medio se expresa en unidades de litro por mol. En general, un compuesto inhibidor de trombina de Fórmula I de la presente invención exhibe una Kass de 0,1 x 10^{6} l/mol o mucho mayor. Por ejemplo, se determinó que cada uno de los ejemplos de la invención particularmente preferidos indicados anteriormente tiene una Kass de al menos 100 x 10^{6} l/mol. Por tanto, se encontró que los compuestos de los Ejemplo 1, 3 y 5 tenían una Kass de 770 x 10^{6} l/mol, 1.200 x 10^{6} l/mol y 100 x 10^{6} l/mol, respectivamente.

Siguiendo sustancialmente los procedimientos descritos antes para la trombina humana y usando otras serínproteasas del sistema de coagulación de sangre humano y usando serínproteasas del sistema fibrinolítico, con los sustratos cromogénicos adecuados, que se identifican más adelante, se evalúa la selectividad de los compuestos de Fórmula I respecto de las serínproteasas del factor de coagulación y de las serínproteasas fibrinolíticas, así como su sustancial ausencia de interferencias en la fibrinolisis de coágulos de plasma humano.

Los factores humanos X, Xa, IXa, XIa y XIIa se obtienen de Enzyme Research Laboratories, South Bend, Indiana; la uroquinasa humana de Leo Pharmaceuticals, Dinamarca y la proteína C activada recombinante (PCa) se prepara en Eli Lilly y Co., en gran medida según la patente americana 4.981.952. Sustratos cromogénicos: N-benzoil-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilida (para el factor Xa); N-Cbz-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilida (para el ensayo del factor IXa como el sustrato del factor Xa); piroglutamil-Pro-Arg-p-nitroanilida (para el factor XIa y para PCa); H-D-Pro-Phe-Arg-p-nitroanilida (para el factor XIIa); y piroglutamil-Gly-Arg-p-nitroanilida (para la uroquinasa) se obtienen de Kabi Vitrum, Estocolmo, Suecia, o de Midwest Biotech, Fishers, Indiana. La tripsina bovina se obtiene de Worthington Biochemicals, Freehold, New Jersey y la calicreína de plasma humano de Kabi Vitrum, Estocolmo, Suecia. El sustrato cromogénico H-D-Pro-Phe-Arg-p-nitroanilida para la calicreína plasmática se obtiene de Kabi Vitrum, Estocolmo, Suecia. N-benzoil-Phe-Val-Arg-p-nitroanilida, el sustrato para la trombina humana y para la tripsina, se sintetiza de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente para los compuestos de la presente invención, usando procedimientos conocidos de acoplamiento peptídico a partir de reactivos disponibles en el mercado, o se obtiene de Midwest Biotech, Fishers, Indiana.

La plasmina humana se obtiene de Boehringer Mannheim, Indianápolis, Indiana; nt-PA se obtiene como referencia de actividad de cadena sencilla de American Diagnostica, Greenwich, Connecticut; t-PA6 modificada (mt-PA6) se prepara en Eli Lilly and Company, mediante procedimientos conocidos en la técnica (Véase Burck, y col., J. Biol. Chem., 265, 5120-5177 (1990).

El sustrato cromogénico de plasmina H-D-Val-Leu-Lys-p-nitroanilda y el sustrato del activador de plasminógeno tisular (t-PA) H-D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilida se obtienen de Kabi Vitrum, Estocolmo, Suecia.

En los sustratos cromogénicos descritos anteriormente los símbolos de tres letras Ile, Glu, Gly, Pro, Arg, Phe, Val, Leu y Lys se usan para indicar el correspondiente grupo aminoacídico isoleucina, ácido glutámico, glicina, prolina, arginina, fenilalanina, valina, leucina y lisina, respectivamente.

Preferiblemente, los inhibidores de la trombina deberían respetar la fibrinolisis inducida por la uroquinasa, el activado de plasminógeno tisular (t-PA) y la estreptoquinasa. Esto sería importante para el uso terapéutico de tales agentes como adyuvantes de la terapia trombolítica mediada por la estreptoquinasa, el t-PA o la uroquinasa y para el uso de tales agentes como agentes antitrombóticos endógenos que respetan la fibrinolisis (respecto del t-PA y la uroquinasa). Además de la inexistencia de interferencias con la actividad amidasa de las proteasas fibrinolíticas, esta conservación del sistema fibrinolítico puede estudiarse mediante el uso de coágulos de plasma humanos y su lisis mediante los activadores de plasminógeno fibrinolítico respectivos.

Materiales

Se obtiene plasma canino de perros de caza de raza mixta conscientes (de cualquier sexo Hazelton-LRE, Kalamazoo, Michigan, EE.UU.) mediante venopunción en citrato 3,8 por ciento. Se prepara fibrinógeno a partir de plasma fresco canino y el fibrinógeno humano se prepara a partir de sangre humana ACD sin caducar en la fracción I-2 según los procedimientos y descripciones anteriores. Smith, Biochem. J., 185, 1-11 (1980); y Smith, y col., Biochemistry, 11, 2958-2967, (1972). El fibrinógeno humano (98 por ciento puro/sin plasmina) es de American Diagnostica, Greenwich, Connecticut. El marcaje radiactivo de las preparaciones I-2 de fibrinógeno se realiza como se ha indicado anteriormente. Smith y col., Biochemistry, 11, 2958-2967, (1972). La uroquinasa se obtiene de Leo Pharmaceuticals, Dinamarca, en 2200 unidades Ploug /vial. La estreptoquinasa se obtiene de Hoechst-Roussel Pharmaceuticals, Somerville, New Jersey.

Procedimientos-efectos sobre la lisis de coágulos de plasma humano mediante t-PA

Los coágulos de plasma humano se forman en tubos de micropruebas añadiendo 50 \mul de trombina (73 NIH unidad/ml) a 100 \mul de plasma humano que contienen 0,0229 \muCi de fibrinógeno marcado con yodo-125. La lisis del coágulo se estudia cubriendo los coágulos con 50 \mul de uroquinasa o estreptoquinasa (50, 100 ó 1000 unidades/ml) e incubando durante 20 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, los tubos se centrifugan en una Beckman Microfuge. A un volumen de 1,0 ml de tampón tris 0,03M/NaCl 0,15M se añaden 25 \mul del sobrenadante para su recuento en el contador gamma. Los controles de recuento en los que se ha producido una lisis del 100 por ciento se obtienen no añadiendo trombina (y sustituyendo con un tampón). Se evalúan los inhibidores de trombina para determinar si existen posibles interferencias con la fibrinolisis incluyendo los compuestos en las soluciones cubiertas a concentraciones de 1, 5 y 10 \mug/ml. Se han hecho estimaciones aproximadas de los valores de CI_{50} mediante extrapolaciones lineares de los puntos de datos a un valor que representaría el 50% de lisis para esa determinada concentración de agente fibrinolítico.

Actividad anticoagulante Materiales

El plasma canino y el plasma de rata se obtienen de perros de caza de raza mixta y conscientes (de cualquier sexo, Hazelton-LRE, Kalamazoo, Michigan, EE.UU.) o de ratas Sprague-Dawley anestesiadas macho (Harlan Sprague-Dawley, Inc., Indianápolis, Indiana, EE.UU.) mediante venopunción en citrato al 3,8 por ciento. Se prepara fibrinógeno a partir de sangre humana ACD sin caducar como la fracción I-2 según los procedimientos y descripciones anteriores. Smith, Biochem. J., 185, 1-11 (1980); y Smith y col., Biochemistry, 11, 2958-2967 (1972). El fibrinógeno humano también se obtiene como 98 por ciento puro/sin plasmina de American Diagnostica, Greenwich, Connecticut. Los reactivos de la coagulación, actina, tromboplastina y el plasma humano son de Baxter Healthcare Corp., Dade Division, Miami, Florida. La trombina bovina de Parke-Davis (Detroit, Michigan) se usa para los ensayos de coagulación en plasma.

Procedimientos Determinaciones de anticoagulación

Los procedimientos de los ensayos de coagulación se realizan como se ha descrito anteriormente. Smith y col., Thrombosis Research, 50, 163-174 (1988) Para todas las mediciones de los ensayos de coagulación se usa un instrumento de coagulación CoAScreener (American Labor, Inc.). El tiempo de trombina (TT) se mide añadiendo 0,05 ml de suero salino y 0,05 ml de trombina (10 NIH unidades/ml) a 0,05 ml del plasma de prueba. El tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA) se mide mediante incubación de 0,05 ml del plasma de prueba con 0,05 ml de reactivo Actina durante 120 segundos, seguido por 0,05 ml de CaCl_{2} (0,02M). El tiempo de protrombina (TP) se mide añadiendo 0,05 ml de suero salino y 0,05 ml de reactivo tromboplastina-C a 0,05 ml de plasma de prueba. Los compuestos de Fórmula I se añaden al plasma humano o animal durante un amplio intervalo de concentraciones para determinar los efectos de prolongación en los ensayos del TT, el TTPA y el TP. Se realizan extrapolaciones lineales para estimar las concentraciones requeridas para doblar el tiempo de coagulación para cada ensayo. Se determinó que cada uno de los ejemplos de la presente invención particularmente preferidos enumerados anteriormente tenían un valor de TT inferior a 50 ng/ml. Por ejemplo, para los compuestos de los Ejemplos 1, 3 y 5 los respectivos valores de TT (en ng/ml) fueron 6, 6 y 23.

Animales

Se anestesian ratas Sprague-Dawley macho (350-425 g, Harlan Sprague Dawley Inc., Indianápolis, IN) con xilazina (20 mg/kg, s.c.) y quetamina (120 mg/kg, s.c.) y se mantienen en un manto de agua caliente (37ºC). Se inserta una cánula en la vena yugular para poder realizar las infusiones.

Modelo de derivación arteriovenosa

En la vena yugular izquierda y en la arteria carótida derecha se insertan cánulas de 20 cm de longitud de polietileno PE 60. Un tubo mayor (PE 190) de 6 cm de sección central con una hebra de algodón (5 cm) en el lumen se ajusta por fricción entre las secciones más largas para completar el circuito de derivación arteriovenosa. Se hace circular la sangre a través de la derivación durante 15 minutos antes de retirar cuidadosamente la hebra y pesarla. El peso de una hebra húmeda se resta del peso total de la hebra y el trombo (véase J. R. Smith, Br. J. Pharmacol., 77: 29, 1982).

Modelo FeCl_{3} de lesión arterial

Se aíslan las arterias carótidas mediante una incisión cervical en la línea central ventral. Debajo de cada arteria se coloca un termopar y se registra de forma continua la temperatura de los vasos en un registrador gráfico continuo. Alrededor de cada carótida, directamente por encima del termopar, se coloca un manguito de los tubos (0,058 DI x 0,077 DE x 4 mm, Baxter Med. Calidad Silicona) cortado en dirección longitudinal. Se disuelve FeCl_{3} hexahidrato en agua y la concentración (20 por ciento) se expresa en términos del peso real de solo el FeCl_{3}). Para dañar la arteria e inducir trombosis, con una pipeta se introducen en el manguito 2,85 \mul para bañar la arteria por encima de la sonda del termopar. La oclusión arterial viene indicada por un rápido descenso de la temperatura. El tiempo transcurrido hasta que se produce la oclusión se expresa en minutos y representa el tiempo transcurrido entre la aplicación del FeCl_{3} y el rápido descenso de la temperatura en el vaso (véase K.D. Kurz, Thromb. Res., 60: 269, 1990).

Modelo de trombolisis espontánea

Los datos in vitro sugieren que los inhibidores peptídicos de trombina inhiben la trombina y, a concentraciones más elevadas, pueden inhibir otras serínproteasas, tales como la plasmina y el activador de plasminógeno tisular. Para valorar si los compuestos inhiben la fibrinolisis in vivo, se determina la tasa de trombolisis espontánea implantando en la circulación pulmonar un coágulo de sangre entera marcado. Se mezcla con rapidez sangre de rata (1 ml) con trombina bovina (4UI, Parke Davis) y fibrinógeno humano marcado con ^{125}I (5\muCI, ICN), e inmediatamente se introducen en un tubo silástico y se incuban a 37ºC durante 1 hora. El trombo maduro se saca del tubo, se corta en segmentos de 1 cm, se lava 3 veces con suero salino normal y cada uno de los segmentos de somete a recuento en un contador gamma. Un segmento con recuentos conocidos se aspira en un catéter que posteriormente se implanta en la vena yugular. Se hace avanzar la punta del catéter hacia las proximidades de la aurícula derecha y se expele el coágulo para que flote en la circulación pulmonar. Una hora después del implante, se recogen el corazón y los pulmones y se sometan a recuento por separado.

La trombolisis se expresa en forma de porcentaje, donde:

%trombolisis = \frac{\text{(cpm inyectada - cpm de los pulmones)}}{\text{cpm inyectada}} x 100

La disolución fibrinolítica del coágulo implantado es dependiente de tiempo (véase J. P. Clozel, Cardiovasc. Pharmacol., 12: 520, 1988).

Parámetros de coagulación

El tiempo de trombina plasmática (TT) y el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA) se miden con un fibrómetro. La muestra de sangre se obtiene de un catéter colocado en la yugular y se recoge en una jeringuilla que contiene citrato de sodio (3,8 por ciento, 1 parte por 9 partes de sangre). Para medir el TT, se mezcla el plasma de rata (0,1 ml) con suero salino (0,1 ml) y trombina bovina (0,1 ml, 30 U/ml en tampón Tris; Parke Davis) a 37ºC. Para el TTPA, el plasma (0,1 ml) y la solución de TTPA (0,1 ml, Organon Teknika) se incuban durante 5 minutos (37ºC) y se añade CaCl_{2} (0,1 ml, 0,025M) para iniciar la coagulación. Los ensayos se realizan por duplicado y se obtienen las medias.

Índice de biodisponibilidad

Una medida de bioactividad, el tiempo de trombina plasmática (TT), sirve como un sustituto del ensayo del compuesto original suponiendo que los incrementos en el TT se debieron a la inhibición de la trombina por sólo el compuesto original. El curso cronológico del efecto del inhibidor de trombina sobre el TT se determina después de la administración en bolo i.v. a ratas anestesiadas y después del tratamiento oral de ratas conscientes en ayunas. Debido a las limitaciones del volumen de sangre y el número de puntos requeridos para determinar el curso cronológico desde el inicio del tratamiento hasta el momento en el que la respuesta vuelve a los valores previos al tratamiento, se usan dos poblaciones de ratas. Cada población de muestra representa puntos de tiempo secuenciales alternos. El TT medio sobre el curso cronológico se usa para calcular el área por debajo de la curva (AUC). El índice de biodisponibilidad se calcula mediante la fórmula mostrada a continuación y se expresa como el porcentaje de la actividad relativa.

El área por debajo de la curva (AUC) del curso cronológico del TT plasmática se determina y se ajusta en función de la dosis. Este índice de biodisponibilidad se denomina "% de actividad relativa" y se calcula como

% actividad relativa= \frac{AUC \ v.o.}{AUC \ i.v.} x \frac{Dosis \ i.v.}{Dosis \ v.o.} x 100

Compuestos

Las soluciones de los compuestos se preparan todos los días en suero salino normal y se inyectan en forma de bolo o mediante infusión comenzando 15 minutos antes y continuando durante toda la alteración experimental, que dura 15 minutos en el modelo de derivación arteriovenosa y 60 minutos en el modelo de lesión arterial por FeCl_{3} y en el modelo de trombolisis espontánea. El volumen de la inyección en bolo es 1 ml/kg para la i.v. y 5 ml/kg para la v.o. y el volumen de infusión es de 3 ml/hora.

Estadísticas

Los resultados se expresan como las medias \pm ETM. Para detectar si existen diferencias estadísticamente significativas se usa un análisis de la varianza de una vía y después se aplica la prueba de Dunnett para determinar qué medias son diferentes. El nivel de significación para el rechazo de la hipótesis nula de medias iguales es P < 0,05.

Animales

Se mantienen perros macho (Sabuesos; 18 meses-2 años; 12-13 kg, Marshall Farms, North Rose, Nueva York 14516) en ayunas durante toda la noche y 240 minutos después de la administración de la dosis se alimentan con la Dieta de Prescripción certificada por Purina (Purine Mills, St. Louis, Missouri). Tenían acceso libre al agua. La temperatura del ambiente se mantiene entre 18,8ºC-23,3ºC; 45-50 por ciento de humedad relativa y con iluminación desde las 6:00 a las 18:00 horas.

Modelo farmacocinético

El compuesto de prueba se formula inmediatamente antes de administrar la dosis disolviendo en suero salino estéril al 0,9% hasta conseguir una preparación de 5 mg/ml. Los perros reciben una única dosis de 2 mg/kg del compuesto de prueba por vía oral. Las muestras de sangre (4,5 ml) se obtienen de la vena cefálica 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 3, 4 y 6 horas después de la administración de la dosis. Las muestras se recogen en tubos Vacutainer con citrato y se mantienen en hielo antes de la reducción a plasma mediante centrifugación. Las muestras de plasma se analizan mediante HPLC-EM. Se registra la concentración en plasma del compuesto de prueba y se usa para calcular los parámetros farmacocinéticos: constante de la tasa de eliminación, Ke; aclaramiento total, Clt; volumen de distribución, V_{D}; tiempo de la concentración máxima del compuesto de prueba en plasma, Tmax; concentración máxima del compuesto de prueba de Tmax, Cmax; semivida en plasma, t_{0,5}; y el área por debajo de la curva, A.U.C.; fracción absorbida del compuesto de prueba, F.

Modelo canino de trombosis de la arteria coronaria

La preparación quirúrgica e instrumentación de los perros son como se describe en Jackson y col., Circulation, 82, 930-940 (1990). Los perros de caza de raza mixta (de 6-7 meses de edad, de cualquier sexo, Hazelton-LRE, Kalamazoo, Mi EE.UU.) se anestesian con pentobarbital sódico (30 mg/kg por vía intravenosa, i.v.), se intuban y se ventilan con aire ambiente. El volumen corriente y las frecuencias respiratorias se ajustan para mantener la PO_{2}, la PCO_{2} y el pH de la sangre dentro de los límites normales. Se insertan electrodos de aguja subdérmicos para registrar un ECG en derivación II.

La vena yugular izquierda y la arteria carótida común se aíslan a través de una incisión mediolateral izquierda en el cuello. La presión de sangre arterial (PSA) se mide de forma continua con un transductor Millar previamente calibrado (modelo (MPC-500, Millar Instruments, Houston, Tx, EE.UU.) insertado en la arteria carótida. En la vena yugular se introduce una cánula para la obtención de muestras de sangre durante el experimento. Además, se introducen cánulas en las venas femorales de ambas patas traseras para la administración del compuesto de prueba.

En el quinto espacio intercostal se lleva a cabo una toracotomía izquierda y se suspende el corazón en un soporte pericárdico. Un segmento de 1 a 2 cm de la arteria coronaria circunfleja izquierda (LCX) se aísla en sentido proximal a la primera rama ventricular diagonal mayor. En la LCX y en contacto con la superficie íntima de la arteria (confirmado al final del experimento) se inserta un electrodo anódico de cable terminado en aguja de 0,447 mm de diámetro (26 gauge) (recubierto con teflón, cable de cobre plateado de 0,254 mm de diámetro (30 gauge) de 3-4 mm de longitud. El circuito estimulante se completa colocando el cátodo en un sitio subcutáneo (s.c.). Alrededor de la LCX, sobre la región del electrodo, se coloca un dispositivo de oclusión ajustable. Alrededor de la LCX, proximal al ánodo se coloca un medidor electromagnético de flujo previamente calibrado (Carolina Medical Electronics, King, NC, EE.UU.) para medir el flujo de sangre coronaria (FSC). El dispositivo de oclusión se ajusta para producir una inhibición del 40-50% de la respuesta hiperémica del flujo sanguíneo observada tras 10 segundos de oclusión mecánica de la LCX. Todas las medidas hemodinámicas y ECG se registran y se analizan con un sistema de adquisición de datos (modelo M3000, Modular Instruments, Malvern, PA, EE.UU.).

Formación de trombo y regímenes de administración de los compuestos

La lesión electrolítica de la íntima de la LCX se produce aplicando una corriente continua (CC) de 100 \muA en el ánodo. La corriente se mantiene durante 60 minutos y después se interrumpe, se haya o no ocluido el vaso. La formación del trombo progresa de forma espontánea hasta que la LCX está totalmente ocluida (determinado por un FSC de cero y un aumento en el segmento S-T). Tras dejar madurar durante 1 hora al trombo que está ocluyendo la arteria se comienza a administrar el compuesto. Simultáneamente a una infusión de un agente trombolítico (por ejemplo, activador de plasminógeno tisular, estreptoquinasa, APSAC) se inicia una infusión de 2 horas de los compuestos de la presente invención a dosis de 0,5 y 1 mg/kg/hora. La reperfusión siguió durante tres horas después de la administración del compuesto de prueba. La reoclusión de las arterias coronarias tras la trombolisis satisfactoria se define como un FSC de cero que persistió durante 30 minutos.

Determinaciones hematológicas y del tiempo de hemorragia

El recuento de células en sangre entera y los valores de hemoglobina y de hematocrito se determinan en una muestra de 40 \mul de sangre con citrato (3,8 por ciento) (1 parte de citrato: 9 partes de sangre) con un analizador hematológico (Cell-Dyn 900, Sequoia-Turner. Mount View, CA, EE.UU.).- Los tiempos de hemorragia gingival se determinan con un dispositivo de tiempo de hemorragia Simplate II (Organon Teknika Durham, N.C., EE.UU.). El dispositivo se usa para hacer dos incisiones horizontales en la encía de la mandíbula izquierda superior o inferior. Cada incisión tiene una anchura de 3 mm y una profundidad de 2 mm. Se realizan las incisiones y se usa un cronómetro para determinar la duración de la hemorragia. Para absorber la sangre a medida que sale de la incisión se usa un bastoncillo de algodón. El tiempo de hemorragia es el tiempo que transcurre desde la incisión hasta que la hemorragia para. Los tiempos de hemorragia se toman justo antes de la administración del compuesto de prueba (0 minutos), a los 60 minutos durante la infusión, al final de la administración del compuesto de prueba (120 minutos) y al final del experimento.

Todos los datos se analizan mediante un análisis de la varianza de una vía (ANOVA) seguido por una prueba de t de Student-Neuman-Kuels a posteriori para determinar el nivel de significación. Se usan varias medidas de ANOVA para determinar las diferencias significativas entre los puntos de tiempo durante los experimentos. Se determina que los valores son estadísticamente diferentes al menos al nivel de p < 0,05. Todos los valores son las medias \pm ETM. Todos los estudios se llevan a cabo de acuerdo con las directrices de la American Physiological Society. En Jackson, y col., J. Cardiovasc. Pharmacol., 21, 587-589 (1993) se describen más detalles en relación con los procedimientos.

Comparados con los compuestos amidino-fenilo correspondientes, los compuestos de la presente invención, en los que un grupo hidroxi se yuxtapone en posición orto al grupo amidino, poseen propiedades fisicoquímicas que son mucho más favorables para la absorción oral. El logD (D = coeficiente de distribución octanol/agua) a pH 7,4 [logD (7,4)] observado para el compuesto del Ejemplo 5 [logD (7,4)= 1,91] exhibe un valor más favorable que el del compuesto de referencia [logD (7,4)= -3,89], un cambio [\DeltalogD (7,4)] de 5,80 unidades log. Para el compuesto del Ejemplo 3 [logD (7,4)= 0,55], comparado con el compuesto amidino fenilo correspondiente, se observaron \DeltalogD (7,4)= 1,13 unidades log.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir más la invención y no deben interpretarse como limitaciones de la misma.

Las abreviaturas usadas en los ejemplos tienen los siguientes significados.

Aminoácidos: Azt= ácido azetidina-2-carboxílico, Phe= fenilalanina, hPro= homoprolina, Pro= prolina, Cha= \beta= ciclohexilalanina, Ohi= ácido [2S-(2\alpha, 3a\beta, 7a\beta)]-octahidro-indol-2-carboxílico, (1R, 4aR, 8aR)-1-Piq= (1R, 4aR, 8aR)-1-perhidro isoquinolincarboxilato, Sar= sarcosina (N-metilglicina).

Anal.= análisis elemental

Boc= t-butiloxicarbonilo

Bn= bencilo

BOP-Cl= cloruro bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfínico

t-Bu= t-butilo

n-BuLi= butillitio

Cbz= benciloxicarbonilo

18-Crown-6= 1,4,7,10,13,16-hexaoxaciclooctadecano

DIBAL= hidruro de diisobutilaluminio

DMF= dimetilformamida

DMSO= dimetilsulfóxido

Et= etilo

EtOAc= acetato de etilo

Et_{2}O= dietiléter

EtOH= etanol

EM-BRA= Espectrometría de masas de bombardeo rápido de átomos

EM-DC= Espectrometría de masas de desorción de campo

HPLC= Cromatografía líquida de alta resolución

EMAR= Espectrometría de masas de alta resolución

HOBT= hidrato de 1-hidroxibenzotriazol

i-PrOH= isopropanol

IR= Espectro de infrarrojos

Me= Metilo

MeOH= metanol

RMN= Resonancia magnética nuclear

RPHPLC= Cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa

SiO_{2}= gel de sílice

TEA= trietilamina

TFA= ácido trifluoroacético

THF= tetrahidrofurano

TLC= cromatografía de capa fina

Ts= tosilo (p-toluensulfonilo)

Para la RPHPLC se usaron los siguientes parámetros: Disolvente A: ácido clorhídrico acuoso al 0,05% (1,5 ml de ácido clorhídrico concentrado en 3 l de agua); Disolvente B: acetonitrilo; Gradiente: como se ha definido en cada Ejemplo; Columna: Vydac™ C_{18}- 5 cm X 25 cm; Velocidad de flujo: 10 ml/minuto.

A menos que se indique lo contrario, los ajustes de pH y tratamientos se realizan con soluciones acuosas básicas o ácidas. RMN-^{1}H indica que se ha obtenido un espectro RMN satisfactorio para el compuesto descrito. IR indica que se ha obtenido un espectro infrarrojo satisfactorio para el compuesto descrito.

Ejemplo 1 Preparación de D-ciclohexilalanil-N-[[4-(aminoiminometil)-3-hidroxifenil]metil]-L-prolinamida diclorhidrato

50

D-Cha-Pro-NHCH_{2}C_{6}H_{3}-3-OH-4-C(NH)NH_{2}\cdot 2HCl

A) Preparación de Boc-D-Cha-Pro-OH

Una solución de Boc-D-Cha-OH (50,4 g, 185 mmol) en diclorometano (360 ml) se enfrió hasta alcanzar 0ºC y se añadió N-hidroxisuccinimida (22,3 g, 194 mmol). Después se añadió 1,3-diciclohexilcarbodiimida (39,0 g, 189 mmol) en dos porciones como una solución en diclorometano (90 ml). Después de agitar durante 3 horas a 0ºC, se añadieron L-Pro-OH (27,6 g, 240 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (30,9 g, 239 mmol). Después de agitar otras 3 horas entre 0ºC y 10ºC, la mezcla se filtró sobre tierra diatomácea. El filtrado se lavó con diclorometano (100 ml); después los filtrados combinados se concentraron al vacío. El aceite residual se fraccionó entre acetato de etilo (100 ml) y NaHCO_{3} acuoso 0,625M (320 ml). Las capas se separaron y se lavó la fase orgánica con NaHCO_{3} acuoso 0,625M (80 ml). Los extractos de bicarbonato combinados se lavaron después con acetato de etilo (100 ml). A continuación, la fase acuosa se agitó con acetato de etilo (300 ml) y se acidificó con HCl 12N (aproximadamente 37 ml). Se separaron las capas y se extrajo la fase acuosa acídica con acetato de etilo (100 ml). Los extractos combinados de acetato de etilo se concentraron al vacío. El residuo se mezcló con una cantidad mínima de acetato de etilo, se filtró, se lavó otra vez con acetato de etilo y se secó para dar 50,1 g (73%) de polvo blanco.

RMN-^{1}H

EM-BRA, m/e 369 (M^{+})

Análisis para C_{19}H_{32}N_{2}O_{5}

Calculado:	C, 61,93; H, 8,75; N, 7,60;
Encontrado:	C, 62,01; H, 8,96; N, 7,75

B) Preparación de 2-fluorotereftalonitrilo

Una solución de 4-bromo-2-fluorobenzonitrilo (20 g, 100 mmol), cianuro de zinc (7 g, 60 mmol) y tetrakis (trifenil-fosfina)paladio (4,6 g, 4 mmol) en DMF (100 ml) se calentó a 80ºC durante 4 horas. Se añadieron tolueno (300 ml)y cloruro de amonio acuoso saturado (300 ml) y se separaron las capas. La capa orgánica se lavó una vez con cloruro de amonio acuoso saturado y dos veces con salmuera. La fase orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró. El producto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice, eluyendo con un gradiente de hexanos a 30% EtOAc/hexanos (11 g, 75%).

IR

RMN-^{1}H

EM-DC, m/e 146 (M^{+})

Análisis para C_{8}H_{3}FN_{2}

Calculado:	C, 65,76; H, 2,07; N, 19,17;
Encontrado:	C, 65,69; H, 2,33; N, 19,05

C) Preparación de 3-amino-1,2-benzisoxazol-5-carbonitrilo

A una solución en agitación de t-butóxido potásico (8,4 g, 75 mmol) en THF (100 ml) se añadió oxima de acetona (5,5 g, 75 mmol). Tras agitar durante 30 minutos se añadió una solución de 2-fluorotereftalonitrilo (10 g, 68 mmol) en THF (50 ml) y se prosiguió agitando durante 2 horas más. Se añadió cloruro de amonio acuoso saturado (100 ml) y se eliminaron los disolventes al vacío. El residuo se fraccionó entre EtOAc y salmuera. Se separaron las capas y se lavó la fase orgánica una vez con salmuera, se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró. Este sólido bruto se suspendió en una solución de EtOH (150 ml), HCl concentrado (50 ml) y agua (100 ml). Esta mezcla se sometió a reflujo durante 2 horas. Después de enfriar hasta alcanzar la temperatura ambiente, los disolventes se eliminaron al vacío. El residuo se trató con bicarbonato sódico acuoso saturado (200 ml) y se extrajo el producto lavando la capa acuosa tres veces con EtOAc. Esta solución orgánica se lavó una vez con salmuera, se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró para dar un sólido de color rosado (9,4 g, 86%).

IR

RMN-^{1}H

EM-DC, m/e 159 (M^{+})

Análisis para C_{8}H_{5}N_{3}O

Calculado:	C, 60,38; H, 3,17; N, 26,40;
Encontrado:	C, 60,96; H, 3,44; N, 25,58

D) Preparación de 4-aminometil-2-hidroxibenzamidina diclorhidrato

El compuesto 3-amino-1,2-benzisoxazol-5-carbonitrilo (5 g, 31 mmol) se disolvió en EtOH (130 ml). Se añadieron 5% de Pd/C (2,5 g) y HCl 5N (15 ml) y la mezcla se hidrogenó a 4,1.10^{5} pascales en un agitador durante 4 horas. El catalizador se filtró y el filtrado se concentró para dar un sólido de color marrón claro. Éste se trituró con dietiléter y se recogió mediante filtración (3,2 g, 43%).

IR

RMN-^{1}H

EM-DC, m/e 165 (M^{+})

Análisis para C_{8}H_{11}N_{3}O \cdot 2HCl

Calculado:	C, 40,35; H, 5,50; N, 17,65; Cl, 29,78;
Encontrado:	C, 40,75; H, 6,13; N, 15,91; Cl, 28,26.

E) Preparación de D-Cha-Pro-NHCH_{2}C_{6}H_{3}-3-OH-4-C(NH)NH_{2} \cdot 2HCl

A una solución en agitación de Boc-D-Cha-Pro-OH (1,1 g, 2,9 mmol), 4-aminometil-2-hidroxibenzamidina diclorhidrato (0,71 g, 3 mmol) y diisopropiletilamina (1,7 ml, 10 mmol) en DMF (60 ml) se añadió benzotriazol-1-iloxi-tripirrolidinofosfonio hexafluorofosfato (1,6 g, 3,1 mmol). Tras agitar durante la noche, el disolvente se eliminó al vacío. El residuo resultante se fraccionó entre EtOAc y cloruro de amonio acuoso saturado. Las capas se separaron y la fase orgánica se lavó una vez con cloruro de amonio acuoso saturado y dos veces con salmuera, se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró, dando un residuo. A esto se añadió anisol (2,5 ml) y TFA (50 ml). La solución se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos, seguido por la eliminación de TFA al vacío. El residuo se disolvió en HCl 1N (50 ml) y se lavó dos veces con EtOAc. El producto bruto se concentró al vacío y se purificó mediante el Procedimiento 1 de HPLC usando un gradiente de 98/2 A/B a 50/50 A/B durante 2,5 horas. Las fracciones que contenían sólo el producto deseado (juzgado mediante HPLC analítica) se acumularon, se concentraron y se liofilizaron para dar un polvo blanco (486 mg, 35%).

IR

RMN-^{1}H

EM-BRA, m/e 416,3 (MH^{+})

Análisis para C_{22}H_{33}N_{5}O_{3} \cdot 2HCl

Calculado:	C, 54,10; H, 7,22; N, 14,34;
Encontrado:	C, 53,89; H, 7,28; N, 14,07.

Ejemplo 2 Preparación de D-ciclohexilalanil-N-[[4-(aminoiminometil)-3-hidroxi-2,5,6-trifluorofenil]metil]-L-prolinamida di-clorhidrato

24

D-Cha-Pro-NHCH_{2}C_{6}F_{3}-3-OH-4-C(NH)NH_{2} \cdot 2HCl

A) Preparación de 3-amino-4,6,7-trifluoro-1,2-benzisoxazol-5-carbonitrilo

A una solución en agitación de N,N-diisopropiletilamina (19,2 g, 110 mmol) en CH_{3}CN (100 ml) se añadió oxima de acetona (8 g, 110 mmol). Tras agitar durante 30 minutos se añadió una solución de tetrafluorotereftalonitrilo (20 g, 100 mmol) en CH_{3}CN (50 ml) y la mezcla de agitó durante la noche. Se añadió cloruro de amonio acuoso saturado (100 ml) y se eliminaron los disolventes al vacío. El residuo se fraccionó entre EtOAc y salmuera. Se separaron las capas y se lavó la fase orgánica una vez con salmuera, se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró. Este sólido bruto se suspendió en EtOH (150 ml), se añadieron HCl concentrado (50 ml) y agua (100 ml). Esta mezcla se sometió a reflujo durante 3 horas. Después de enfriar hasta alcanzar la temperatura ambiente, los disolventes se eliminaron al vacío. El residuo se trató con bicarbonato sódico acuoso saturado (200 ml) y se extrajo el producto lavando la capa acuosa tres veces con EtOAc. Esta solución orgánica se lavó una vez con salmuera, se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró para dar un sólido amarillo. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice, eluyendo con un gradiente de hexanos a 40% EtOAc/hexanos (9,2 g, 43%).

IR

RMN-^{1}H

EM-DC, m/e 213 (M^{+})

Análisis para C_{8}H_{2}F_{3}N_{3}O

Calculado:	C, 45,09; H, 0,95; N, 19,72; F, 26,74;
Encontrado:	C, 45,47; H, 1,12; N, 19,39, F, 27,68.

B) Preparación de 4-aminometil-2-hidroxi-3,5,6-trifluorobenzamidina diclorhidrato

3-amino-4,6,7-trifluoro-1,2-bencisoxazol-5-carbonitrilo (5 g, 31 mmol) se disolvió en EtOH (130 ml). Se añadieron 5% de Pd/C (2,5 g) y HCl 5N (15 ml) y la mezcla se hidrogenó a 4,1. 10^{5} pascales en un agitador durante 4 horas. El catalizador se filtró y el filtrado se concentró para dar una espuma blanca (7,4 g, 100%).

IR

RMN-^{1}H

EM-DC, m/e 219 (M^{+})

Análisis para C_{8}H_{8}F_{3}N_{3}O \cdot 2HCl:

Calculado:	C, 32,90; H, 3,45; N, 14,38; Cl, 24,28;
Encontrado:	C, 32,80; H, 4,00; N, 12,75, Cl, 22,22.

C) Preparación de D-Cha-Pro-NHCH_{2}C_{6}F_{3}-3-OH-4-C(NH)NH_{2} \cdot 2HCl

Mediante procedimientos sustancialmente equivalentes a los descritos en el ejemplo 1-E, se prepararon 0,04 g de D-Cha-Pro-NHCH_{2}C_{6}F_{3}-3-OH-4-C(NH)NH_{2}. 2HCl a partir de 4-aminometil-2-hidroxi-3,5,6-trifluorobenzamidina diclorhidrato.

RMN-^{1}H

EM-DC, m/e 470 (MH^{+})

Análisis para C_{22}H_{30}F_{3}N_{5}O_{3} \cdot 2HCl:

Calculado:	C, 48,71; H, 5,95; N, 12,91;
Encontrado:	C, 48,90; H, 6,03; N, 12,86.

Ejemplo 3 Preparación de N-carboximetil-D-ciclohexilalanil-N-[[4-(aminoiminometil)-3-hidroxifenil]metil-L-prolinamida clorhidrato

25

HO_{2}CCH_{2}-D-Cha-Pro-NHCH_{2}C_{6}H_{3}-3-OH-4-C(NH)NH_{2} HCl

A) Preparación de N-(t-BuO_{2}CCH_{2})-N-Boc-D-Cha-Pro-OH

A una solución de D-Phe-Pro-Obn HCl (20g, 51 mmol) en DMF (100 ml) se añadió de una sola vez t-butil-bromoacetato (9,9 g, 56 mmol) y, gota a gota en 30 minutos, N,N-diisopropiletilamina (17,4 ml, 101 mmol). Se dejó agitar la mezcla durante 18 h. Después se añadieron de una vez di-t-butil dicarbonato (16,6 g, 76 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (13,2 ml, 76 mmol) y se dejó la reacción en agitación durante 24 horas más. Se eliminó el disolvente al vacío y se fraccionó el residuo entre EtOAc (1 l) y ácido cítrico acuoso 1M (500 ml). Se separaron las capas y la fase orgánica se lavó una vez con ácido cítrico acuoso 1 M, dos veces con bicarbonato sódico acuoso saturado, y una vez con salmuera (500 ml de cada uno). La fase orgánica se secó (Na_{2}SO_{4}), se filtró y se concentró al vacío. El aceite de color ámbar se purificó con cromatografía en gel de sílice, eluyendo con un gradiente EtOAc/hexanos (hexanos a EtOAc al 30%/hexanos).

Las fracciones que contenían producto se combinaron y concentraron para obtener 19,0 g (66%) de N-(t-BuOOCC
H_{2})-N-Boc-D-Phe-Pro-OBn en forma de un aceite incoloro que cristalizó lentamente en reposo.

RMN-^{1}H

EM-DC, m/e 566 (M^{+})

Análisis de C_{32}H_{42}N_{2}O_{7}:

Calculado:	C, 67,82; H, 7,47; N, 4,94
Encontrado:	C, 68,06; H, 7,33; N, 5,17

A una solución de N-(t-BuOOCCH_{2})-N-Boc-D-Phe-Pro-OBn (18,5 g, 33 mmol) en EtOAc (250 ml) se añadió un catalizador Pd/C al 5% (5 g). Esta solución se desgasificó al vacío varias veces y se sometió a agitación en atmósfera de hidrógeno durante 2 h. Se quitó el globo, se añadió tierra de diatomáceas y se filtró la pasta a través de un filtro de tierra de diatomáceas. El filtrado se concentró al vacío, obteniéndose 13,2 g (84%) de N-(t-BuO_{2}CCH_{2})-N-Boc-D-Phe-Pro-OH en forma de una espuma blanca.

RMN-^{1}H

EM-DC, m/e 476 (M^{+})

Análisis de C_{25}H_{36}N_{2}O_{7}:

Calculado:	C, 63,01; H, 7,61; N, 5,88
Encontrado:	C, 63,23; H, 7,73; N, 5,59

Se disolvió N-(t-BuO_{2}CCH_{2})-N-Boc-D-Phe-Pro-OH (13 g, 27 mmol) en etanol (750 ml) y se añadió PtO_{2} (13 g). La suspensión se agitó en atmósfera de hidrógeno (4,1. 10^{-5} pascales) a 40ºC durante 16 h. A continuación se filtró el catalizador y el filtrado se concentró al vacío, obteniéndose 11,7 g (90%) de N-(t-BuO_{2}CCH_{2})-N-Boc-D-Cha-Pro-OH en forma de una espuma blanca.

IR

RMN-^{1}H

EM-DC, m/e 483 (M^{+})

Análisis de C_{25}H_{42}N_{2}O_{7}:

Calculado:	C, 62,22; H, 8,77; N, 5,80
Encontrado:	C, 62,99; H, 8,96; N, 5,48

B) Preparación de HO_{2}CCH_{2}-D-Cha-Pro-NHCH_{2}C_{6}H_{3}-3-OH-4-C(NH)NH_{2} HCl

Por medio de procedimientos sustancialmente equivalentes a los descritos en el ejemplo 1-E, se prepararon 0,22 g de HO_{2}CCH_{2}-D-Cha-Pro-NHCH_{2}C_{6}H_{3}-3-OH-4-C(NH)NH_{2} HCl.

RMN-^{1}H

EM-DC, m/e 474.3 (MH^{+})

Análisis de C_{24}H_{35}N_{5}O_{5}1 \cdot 5HCl:

Calculado:	C, 54,57; H, 6,96; N, 13,26
Encontrado:	C, 54,52; H, 6,95; N, 13,09

Ejemplo 4 Preparación de N-[[4-(aminoiminometil)-3-hidroxifenil]-metil]-1-[(1R,4aR,8aR)-perhidroisoquinolin-1-ilcarbonil]-L-prolinamida diclorhidrato

26

(1R, 4aR, 8aR)-1-Piq-Pro-NHCH_{2}C_{6}H_{3}-3-OH-4-C(NH)NH_{2} 2HCl

Se obtuvo 1-[(1R, 4aR, 8aR)-2-Cbz-Perhidroisoquinolin-1-ilcarbonil]-L-prolina ([\alpha]_{D}= -34,2º (C = 0,5 MeOH )) tal como se describe en la Patente Americana Nº 5.430.023 en su ejemplo 25, columna 23, línea 23 hasta la columna 24, línea 46. Este compuesto es conocido también como Cbz-D-cis[4aR, 8aR]-1-Piq-Pro-OH.

A una solución en agitación de Cbz-(1R, 4aR, 8aR)-1-Piq-Pro-OH (1,1 g, 2,5 mmol), 4-aminometil-2-hidroxibenzamidina diclorhidrato (0,66 g, 2,75 mmol) y diisopropiletilamina (1,5 ml, 8,8 mmol) en DMF (60 ml), se añadió benzotriazol-1-iloxitripirrolidinofosfonio hexafluorofosfato (1,4 g, 2,75 mmol). Tras dejar en agitación durante la noche, el disolvente se extrajo al vacío. El residuo resultante se fraccionó entre EtOAc y cloruro de amonio acuoso saturado. Se separaron las capas y la fase orgánica se lavó una vez con cloruro de amonio acuoso saturado y dos veces con salmuera, se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró, obteniéndose un residuo. Este residuo se disolvió en EtOH (100 ml) y agua (50 ml). Se añadió HCl 1 N (5 ml) y Pd/C al 5% (0,5 g). La pasta se desgasificó y se colocó en atmósfera de hidrógeno durante la noche. Se añadió tierra de diatomeas y la pasta se filtró a través de un filtro de tierra de diatomeas y se concentró al vacío. El producto en bruto se purificó por el procedimiento 1 del HPLC utilizando un gradiente de 98/2 A/B a 30/70 A/B durante 2,5 h. Las fracciones que contenían el producto puro (de acuerdo con la HPLC analítica) se juntaron, se concentraron y se liofilizaron, obteniéndose un polvo blanco (0,22 g, 18%).

RMN-^{1}H

EM-BRA, m/e 428,3 (MH^{+})

Análisis de C_{23}H_{33}N_{5}O_{3}2HCl:

Calculado:	C, 55,20; H, 7,05; N, 13,99
Encontrado:	C, 54,93; H, 7,31; N, 14,00

Ejemplo 5 Preparación de N-etilsulfonil-D-ciclohexilalanil-N-[[4-(aminoiminometil)-3-hidroxifenil]metil]-L-prolinamida clorhidrato

27

EtSO_{2}-D-Cha-Pro-NHCH_{2}C_{6}H_{3}-3-OH-4-C(NH)NH_{2} HCl

A) Preparación de EtSO_{2}-D-Phe-OH

A una suspensión en agitación de D-fenilalanina (50 g, 300 mmol) en THF (400 ml) se añadió N,O-bis (trimetilsilil)acetamida (92 g, 450 mmol). Tras mantenerla en agitación durante 12 h, la solución se enfrió hasta alcanzar -78ºC y se añadió N,N-diisopropiletilamina (58 ml, 330 mmol). A esta solución se añadió lentamente cloruro de etanosulfonilo (31 ml, 330 mmol) y se eliminó el baño frío. Tras mantener en agitación durante 20 h, los disolventes se eliminaron al vacío, y el residuo se fraccionó entre NaHCO_{3} acuoso saturado y acetato de etilo. La fase acuosa se lavó con dietiléter, se acidificó con ácido cítrico sólido y se extrajo dos veces con acetato de etilo. Los extractos de acetato de etilo combinados se lavaron con salmuera, se secaron con MgSO_{4}, se filtraron y se concentraron al vacío, obteniéndose 61 g (79%) de un aceite incoloro espeso.

IR

RMN-^{1}H

EM-DC, m/e 257 (M^{+})

B) Preparación de EtSO_{2}-D-Phe-Pro-OBn

A una suspensión en agitación de EtSO_{2}-D-Phe-OH (25,7 g, 100 mmol), Pro-Obn HCl (26,6 g, 100 mmol), HOBT (13,5 g, 100 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (43,5 ml, 250 ml) en THF (1 l) a 0ºC se añadió 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida clorhidrato (23 g, 120 ml). Tras mantener en agitación durante 20 h, el disolvente se eliminó al vacío y el residuo se fraccionó entre acetato de etilo y ácido cítrico 1N. La fase orgánica se lavó dos veces con KHCO_{3} 1 N, dos veces con salmuera, se secó con MgSO_{4}, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se sometió a cromatografía en gel de sílice eluyendo con un gradiente escalonado de hexanos a 50% de acetato de etilo/hexanos. Las fracciones que contenían el producto se combinaron y se concentraron al vacío, obteniéndose 29 g (65 %) de un aceite claro y espeso.

IR

RMN-H^{1}

EM-DC, m/e 444 (M^{+})

C) Preparación de EtSO_{2}-D-Phe-Pro-OH

A una solución de EtSO_{2}-D-Phe-Pro-Obn (28,5 g, 64 mmol) en etil acetato (500 ml) se añadió Pd/C al 10% (5 g). Se evacuó el vaso y se dejó en atmósfera de hidrógeno. Tras dejar en agitación durante 16 h, la solución se filtró sobre tierra de diatomeas y a continuación se lavó el filtro con metanol y se filtró. Los filtrados combinados se concentraron al vacío, obteniéndose 22 g (97%) de un sólido casi blanco.

IR

RMN-^{1}H

EM-DC, m/e 355 (MH^{+})

Análisis de C_{16}H_{22}N_{2}O_{5}S:

Calculado:	C, 54,22; H, 6,26; N, 7,90
Encontrado:	C, 53,98; H, 6,12; N, 7,63

D) Preparación de EtSO_{2}-D-Cha-Pro-OH

A una solución de EtSO_{2}-D-Phe-Pro-OH (10 g, 28 mmol) en etanol (300 ml) se añadió PtO_{2} (5 g). La mezcla se hidrogenó usando un aparato de presión elevada a 4,1.10^{5} pascales y a 20ºC durante 20 horas. Después, la solución se filtró con tierras de diatomeas y se concentró, proporcionando 8,1 g (80%) de un aceite espeso.

IR

RMN-^{1}H

EM-DC, m/e 361 (M-H^{+})

E) Preparación de EtSO_{2}-D-Cha-Pro-NHCH_{2}C_{6}H_{3}-3-OH-4-C(NH)NH_{2}2HCl

A una solución en agitación de EtSO_{2}-D-Cha-Pro-OH (0,87 g, 2,4 mmol), diclorhidrato de 4-aminometil-2-hidroxibenzamidina (0,63 g, 2,64 mmol) y diisopropiletilamina (1,5 ml, 8,8 mmol) en DMF (60 ml) se añadió benzotriazol-1-iloxitripirrolidinofosfonio hexafluorofosfato (1,4 g, 2,75 mmol). Tras agitar durante la noche, se eliminó el disolvente al vacío. Las fases se separaron y la fase acuosa se lavó tres veces con Et_{2}O y se concentró al vacío. El producto bruto se purificó mediante el Procedimiento 1 de HPLC usando un gradiente de 90/10 A/B a 40/60 A/B durante 2,5 horas. Las fracciones que contenían el producto puro (juzgado mediante la HPLC analítica) se acumularon, se concentraron y se liofilizaron para dar un polvo blanco (0,30 g, 21%).

RMN-^{1}H

EM-DC, m/e 508 (MH^{+})

Análisis para C_{24}H_{37}N_{5}O_{5}S 3HCl:

Calculado:	C, 46,72; H, 6,53; N, 11,35
Encontrado:	C, 46,36; H, 6,16; N, 11,22

Ejemplo 6 Preparación de N.etilsulfonil-D-ciclohexilalanil-N-[[4-(aminoiminometil)-3-hidroxi-2,5,6-trifluorofenil]-metil]-L-prolinamida clorhidrato

28

EtSO_{2}-D-Cha-Pro-NHCH_{2}C_{6}F_{3}-3-OH-4-C(NH)NH_{2} \cdot HCl

Mediante un procedimiento sustancialmente equivalente al descrito en el Ejemplo 5, se prepararon 0,54 g de EtSO_{2}-D-Cha-Pro-NHCH_{2}C_{6}F_{3}-3-OH-4-C(NH)NH_{2} \cdot HCl a partir de EtSO_{2}-D-Cha-Pro-OH y 4-aminometil-2-hidroxi-3,5,6-trifluorobenzamidina diclorhidrato.

RMN-^{1}H

EM-BRA, m/e 562,2 (MH^{+})

Análisis para C_{23}H_{34}F_{3}N_{5}O_{5}S 2HCl:

Calculado:	C, 45,43; H, 5,72; N, 11,04
Encontrado:	C, 45,54; H, 5,61; N, 11,03

Ejemplo 7 Preparación de 1-[N-etilsulfonil-D-fenilalanil]-N-[[4-(aminoiminometil)-3-hidroxifenil]metil]-[2S-(2\alpha, 3a\beta, 7a\beta)]-octahidroindol-2-carboxamida clorhidrato

29

EtSO_{2}-D-Phe-Ohi-NHCH_{2}C_{6}H_{3}-3-OH-4-C(NH)NH_{2} \cdot HCl

A) Preparación del éster de etilo del ácido [2S-(2\alpha, 3a\beta, 7a\beta)]-octahidroindol-2-carboxílico HCl (Ohi-OEt HCl)

Se burbujeó gas HCl a través de una suspensión en agitación de ácido (s)-indolin-2-carboxílico (20 g, 110 mmol) en etanol (400 ml). Cuando el ácido se disolvió completamente, la solución se llevó al reflujo. Tras 16 horas, la solución se enfrió y se extrajo el disolvente al vacío. El residuo se trituró con dietiléter y el sólido casi blanco resultante se recogió por medio de filtración, se lavó con hexanos y se secó durante la noche en un horno de vacío a 30ºC (25,5 g, 100%). Este sólido, clorhidrato del éster de etilo del ácido (s)-indolin-2-carboxílico se disolvió en etanol (455 ml). Se añadió Pd/C al 5% (25,5 g) y la suspensión resultante se hidrogenó a 4,1.10^{-5} pascales en un agitador durante 8 horas. La solución se filtró para eliminar el catalizador y el filtrado se concentró al vacío. El residuo se trituró con dietiléter y el sólido resultante se aisló mediante filtración, proporcionando 18,8 g (73%) de un polvo blanco.

RMN-^{1}H

EM-DC, m/e 197 (M^{+})

Análisis para C_{11}H_{19}NO_{2}HCl:

Calculado:	C, 56,53; H, 8,63; N, 5,99
Encontrado:	C, 56,24; H, 8,44; N, 6,00.

B) EtSO_{2}-D-Phe-Ohi-OEt

Mediante procedimientos sustancialmente equivalentes a los descritos en el Ejemplo 5, se preparó EtSO_{2}-D-Phe-Ohi-OEt (57%) a partir de EtSO_{2}-D-Phe-OH y HCl Ohi-OEt.

IR

RMN-^{1}H

EM-DC, m/e 436,1 (M^{+})

Análisis para C_{22}H_{32}N_{2}O_{5}S:

Calculado:	C, 60,53; H, 7,39; N, 6,42;
Encontrado:	C, 60,62; H, 7,31; N, 6,22.

C) EtSO_{2}-D-Phe-Ohi-OH

A una solución en agitación de EtSO_{2}-D-Phe-Ohi-OEt (12 g, 27,5 mmol) en p-dioxano (300 ml) se añadió una solución de LiOH\cdotH_{2}O (2,3 g, 55 mmol) en agua (150 ml). Tras agitar durante 16 horas, se eliminó el disolvente al vacío y el residuo se volvió a disolver en agua y se lavó dos veces con dietiléter. La fase acuosa se acidificó con HCl 5N y el precipitado se filtró, se lavó con agua y se secó al vacío, proporcionando 10,1 g (90%) de un sólido amarillo claro.

IR

RMN-^{1}H

EM-DC, m/e 409,1 (M^{+})

Análisis para C_{20}H_{28}N_{2}O_{5}S:

Calculado:	C, 58,80; H, 6,91; N, 6,86
Encontrado:	C, 58,57; H, 7,00; N, 6,63.

D) Preparación de EtSO_{2}-D-Phe-Ohi-NHCH_{2}C_{6}H_{3}-3-OH-4-C(NH)NH_{2} . HCl

Mediante procedimientos sustancialmente equivalentes a los descritos en el Ejemplo 5, se obtuvieron 400 mg de EtSO_{2}-D-Phe-Ohi- NHCH_{2}C_{6}H_{3}-3-OH-4-C(NH)NH_{2} \cdot HCl. Se usó el procedimiento 1 de HPLC (gradiente de 80/20 A/B a 30/70 A/B durante 2,5 horas).

RMN-^{1}H

EM-DC, m/e 556,1 (MH^{+})

Análisis para C_{28}H_{37}N_{5}O_{5}S 2HCl 1,3 H_{2}O:

Calculado:	C, 51,58; H, 6,43; N, 10,74;
Encontrado:	C, 51,51; H, 6,22; N, 10,71.

Ejemplo 8 Preparación de 1-[N-etilsulfonil-D-ciclohexilalanil]-N-[[4-(aminoiminometil)-3-hidroxifenil]metil]-[2S-(2\alpha, 3a\beta, 7a\beta)]-octahidroindol-2-carboxamida clorhidrato

30

EtSO_{2}-D-Cha-Ohi-NHCH_{2}C_{6}H_{3}-3-OH-4-C(NH)NH_{2} \cdot HCl

A) Preparación de EtSO_{2}-D-Cha-Ohi-OH

Mediante procedimientos sustancialmente equivalentes a los descritos en el Ejemplo 5-D, se preparó EtSO_{2}-D-Cha-Ohi-OH (95%) a partir de EtSO_{2}-D-Phe-Ohi-OH.

IR

RMN-^{1}H

EM-DC, m/e 415,3 (MH^{+})

B) Preparación de EtSO_{2}-D-Cha-Ohi- NHCH_{2}C_{6}H_{3}-3-OH-4-C(NH)NH_{2} \cdot HCl

Mediante procedimientos sustancialmente equivalentes a los descritos en el Ejemplo 5-E, se obtuvieron 744 mg.

RMN-^{1}H

EM-DC, m/e 562,1 (MH^{+})

Análisis para C_{28}H_{43}N_{5}O_{5}S 2HCl 2 H_{2}O:

Calculado:	C, 50,15; H, 7,36; N, 10,44;
Encontrado:	C, 50,31; H, 6,97; N, 10,49.

Ejemplo 9 Preparación de 1-[N-etilsulfonil-D-fenilalanil]-N-[[4-(aminoiminometil)-3-hidroxifenil]metil]-S-azetidina-2-carboxamida clorhidrato

31

EtSO_{2}-D-Phe-Azt-NHCH_{2}C_{6}H_{3}-3-OH-4-C(NH)NH_{2} \cdot HCl

Mediante procedimientos sustancialmente equivalentes a los descritos en el Ejemplo 5, se obtuvieron 350 mg.

RMN-^{1}H

EM-DC, m/e 488,0 (MH^{+})

Análisis para C_{23}H_{29}N_{5}O_{5}S 3HCl:

Calculado:	C, 46,28; H, 5,40; N, 11,73;
Encontrado:	C, 46,22; H, 5,10; N, 11,49.

Ejemplo 10 Preparación de 1-[N-etilsulfonil-D-ciclohexilalanil]-N-[[4-(aminoiminometil)-3-hidroxifenil]metil]-S-azetidina-2-carboxamida clorhidrato

32

EtSO_{2}-D-Cha-Azt-NHCH_{2}C_{6}H_{3}-3-OH-4-C(NH)NH_{2} \cdot HCl

Mediante procedimientos sustancialmente equivalentes a los descritos en el Ejemplo 5, se obtuvieron 284 mg.

RMN-^{1}H

EM-DC, m/e 494,0 (MH^{+})

Análisis para C_{23}H_{35}N_{5}O_{5}S 2,5HCl 0,9 H_{2}O:

Calculado:	C, 45,97; H, 6,59; N, 11,65;
Encontrado:	C, 46,25; H, 6,27; N, 11,31.

Ejemplo 11 Preparación de N-etilsulfonil-D-fenilalanil-N-[[4-(aminoiminometil)-3-hidroxifenil]metil]-L-prolinamida clorhidrato

33

EtSO_{2}-D-Phe-Pro-NHCH_{2}C_{6}H_{3}-3-OH-4-C(NH)NH_{2} \cdot HCl

Mediante procedimientos sustancialmente equivalentes a los descritos en el Ejemplo 5, se obtuvieron 151 mg.

RMN-^{1}H

EM-DC, m/e 502,1 (MH^{+})

Análisis para C_{24}H_{31}N_{5}O_{5}S 3HCl 1,5 H_{2}O:

Calculado:	C, 45,18; H, 5,85; N, 10,97;
Encontrado:	C, 45,12; H, 5,45; N, 10,85.

Ejemplo 12 Preparación de N-etilsulfonil-D-fenilalanil-N-[[4-(aminoiminometil)-3-hidroxifenil]metil]-sarcosinamida clorhidrato

34

EtSO_{2}-D-Phe-Sar-NHCH_{2}C_{6}H_{3}-3-OH-4-C(NH)NH_{2} \cdot HCl

RMN-^{1}H

EM-DC, m/e 476,1 (MH^{+})

Análisis para C_{22}H_{29}N_{5}O_{5}S 2,5 HCl 0,5 H_{2}O:

Calculado:	C, 45,90; H, 5,69; N, 12,16;
Encontrado:	C, 45,72; H, 5,36; N, 12,03.

Claims

1. Un compuesto que tiene la fórmula VI

35

en la que

X-C(O)- es D-prolinilo, D-homoprolinilo, R^{m}-(CH_{2})_{g}-NH-CH_{2}-C(O)-,

36

37

donde

R^{d} es carboxi o metilsulfonilo;

R^{e} es NHR^{c}, NHCOR^{c} o NHCOOR^{c}; en la que

T es cicloalquilo (C_{3}-C_{8}), alquilo (C_{1}-C_{8}),

38

a es 0, 1 ó 2; y

Q es -OH, alcoxi (C_{1}-C_{4}) o -NH-A;

g es 1, 2 ó 3;

B es hidrógeno o alquilo (C_{1}-C_{4});

R' es hidrógeno o alquilo (C_{1}-C_{4});

R'' es alquilo (C_{1}-C_{4}), fluoroalquilo (C_{1}-C_{4}) con uno a cinco átomos de flúor, -(CH_{2})_{d}-R^{m} o arilo insustituido o sustituido, donde arilo es fenilo, naftilo, un anillo heterocíclico aromático de 5 ó 6 miembros insustituido o sustituido, que tiene uno o dos heteroátomos que son iguales o diferentes y que se seleccionan de entre azufre, oxígeno y nitrógeno, o un grupo heterocíclico aromático bicíclico condensado de 9 ó 10 miembros insustituido o sustituido, que tiene uno o dos heteroátomos que son iguales o diferentes y que se seleccionan de entre azufre, oxígeno y nitrógeno;

R^{n} es -COOR^{b} o tetrazol-5-ilo;

cada R^{b} es de forma independiente hidrógeno o alquilo (C_{1}-C_{4});

d es 1, 2 ó 3;

m es 0, 1 ó 2;

n es 0, 1 ó 2; y

-Y-G- es

39

-NR^{g}-CH_{2}-G-

40

donde

r es 0, 1 ó 2;

R^{g} es alquilo (C_{1}-C_{6}), cicloalquilo (C_{3}-C_{8}) o -(CH_{2})_{p}-L-(CH_{2})-_{q}-T';

donde p es 0, 1, 2, 3 ó 4; L es un enlace -O-, -S- o -NH-; q es 0, 1, 2 ó 3; y T' es alquilo (C_{1}-C_{4}), cicloalquilo (C_{3}-C_{8}), -COOH, -CONH_{2} o Ar, donde Ar es arilo insustituido o sustituido, donde arilo es fenilo, naftilo, un anillo heterocíclico aromático de 5 ó 6 miembros insustituido o sustituido, que tiene uno o dos heteroátomos que son iguales o diferentes y que se seleccionan de entre azufre, oxígeno y nitrógeno, o un grupo heterocíclico aromático bicíclico condensado de 9 ó 10 miembros insustituido o sustituido, que tiene uno o dos heteroátomos que son iguales o diferentes y que se seleccionan de entre azufre, oxígeno y nitrógeno;

R^{y} es -CH_{2}-, -O-, -S-, o -NH; y

-G- es -C(O)-NH-(CH_{2})_{s}-, -CH_{2}-NH-(CH_{2})_{s}-, -CH_{2}-NH-C(O)- o (CH_{2})_{t}-O-, donde s es 1 ó 2 y t es 1, 2 ó 3; y f es 0, 1, 2 ó 3.

2. Un compuesto según la reivindicación 1, en la que halo es flúor, cloro, bromo o yodo; un grupo alquilo (C_{1}-C_{4}), un grupo alquilo (C_{1}-C_{6}), un grupo alquilo (C_{1}-C_{8}) o un grupo alquilo (C_{1}-C_{10}) es metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo o t-butilo; un grupo alcoxi (C_{1}-_{4}) es metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi o t-butiloxi; un grupo cicloalquilo (C_{3}-C_{8}) es ciclopropilo, ciclopentilo o ciclohexilo; un grupo fluoroalquilo (C_{1}-C_{4}) es trifluorometilo o 2,2,2-trifluoroetilo y arilo es fenilo, naftilo, furilo, tienilo, piridilo, indolilo, quinolinilo o isoquinolinilo.

3. Un compuesto según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que

X-C(O) es D-homoprolinilo,

41

donde T es ciclohexilo o fenilo; a es 0 ó 1; y A es hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{4}), alquilsulfonilo (C_{1}-C_{4}), (alquil C_{1}-C_{4})oxi-carbonilo, (alquil C_{1}-C_{4})carbonilo o carboximetilo; y

-Y-G es -NR^{g}-CH_{2}-G-

42

donde R^{g} es alquilo(C_{1}-C_{6}), (CH_{2})_{q}- cicloalquilo (C_{3}-C_{8})- o (CH_{2})_{q}-fenilo; q es 0, 1, 2 ó 3; y r es 0, 1 ó 2.

4. Un compuesto según las reivindicaciones 1, 2 ó 3, donde

X-C(O)- es

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en la que T es ciclohexilo; a es 1; y A es hidrógeno, etilsulfonilo o carboximetilo; y

-Y-G- es

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donde r es 0 ó 1.

5. Un compuesto según la reivindicación 4, donde A es carboximetilo.

6. Uso de un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en un procedimiento para la preparación de un compuesto de la Fórmula I

X-C(O)-Y-G-R

en la que

X-C(O)- es D-prolinilo, D-homoprolinilo, R^{m}-(CH_{2})_{g}-NH-CH_{2}-C(O)-,

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donde

R^{d} es carboxi o metilsulfonilo;

R^{e} es NHR^{c}, NHCOR^{c} o NHCOOR^{c}; en el que

T es cicloalquilo (C_{3}-C_{8}), alquilo (C_{1}-C_{8}),

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a es 0, 1 ó 2; y

Q es -OH, alcoxi (C_{1}-C_{4}) o -NH-A;

g es 1, 2 ó 3;

B es hidrógeno o alquilo (C_{1}-C_{4});

R' es hidrógeno o alquilo (C_{1}-C_{4});

R^{n} es -COOR^{b} o tetrazol-5-ilo;

cada R^{b} es de forma independiente hidrógeno o alquilo (C_{1}-C_{4});

d es 1, 2 ó 3;

m es 0, 1 ó 2;

n es 0, 1 ó 2; y

-Y-G- es

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donde

r es 0, 1 ó 2;

donde p es 0, 1, 2, 3 ó 4; L es un enlace -O-, -S- o -NH-; q es 0, 1, 2 ó 3; y T' es alquilo (C_{1}-C_{4}), cicloalquilo (C_{3}-C_{8}), -COOH, -CONH_{2} o Ar, donde Ar es arilo insustituido o sustituido, donde arilo es fenilo, naftilo, un anillo heterocíclico aromático de 5 ó 6 miembros, insustituido o sustituido, que tiene uno o dos heteroátomos que son iguales o diferentes y que se seleccionan de entre azufre, oxígeno y nitrógeno, o un grupo heterocíclico aromático bicíclico condensado insustituido o sustituido de 9 ó 10 miembros, que tiene uno o dos heteroátomos que son iguales o diferentes y que se seleccionan de entre azufre, oxígeno y nitrógeno;

R^{y} es -CH_{2}-, -O-, -S-, o -NH; y

-G-R es -C(O)-NH-(CH_{2})_{s}-R, -CH_{2}-NH-(CH_{2})_{s}-R, -CH_{2}-NH-C(O)-R o (CH_{2})_{t}-O-R, donde s es 1 ó 2 y t es 1, 2 ó 3; y donde f es 0, 1, 2 ó 3;

o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.