ES2208643T3 - Clonacion y expresion del receptor beta app-c100. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A LA CLONIZACION DEL RECEPTOR (BETA)APP-C100 (C100-R), Y CELULAS HUESPEDES MODIFICADAS GENETICAMENTE POR INGENIERIA LAS CUALES EXPRESAN EL C100-R. SEMEJANTES CELULAS MODIFICADAS POR INGENIERIA PUEDEN SER USADAS PARA EVALUAR Y PROTEGER MEDICINAS Y ANALOGOS DE (BETA)-APP IMPLICADAS EN LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER.

Description

Clonación y expresión del receptor \betaAPP-C100.

1. Introducción

La presente invención se refiere al clonaje del receptor para el extremo carboxiterminal de la proteína precursora del \beta-amiloide (incluyendo el dominio amiloide), citado aquí como C100-R, y a las células hospedadoras modificadas mediante ingeniería genética las cuales expresan el C100-R. Tales células modificadas pueden usarse para evaluar e investigar fármacos y análogos de la proteína precursora del \beta-amiloide (\beta-APP) la cual se puede usar para el diagnóstico y/o tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

2. Antecedentes de la invención

La enfermedad de Alzheimer es un trastorno degenerativo que es la causa más frecuente de demencia entre individuos ancianos. La enfermedad se caracteriza por la acumulación de placas conteniendo amiloide en el cerebro, particularmente en el cortex temporal y el hipocampo y a lo largo de las paredes de la vasculatura cerebral(Roch et al., 1966, Nature 209: 109-110; Terry el al., 1981, Ann. Neurol. 10: 184-192; Glenner G.G., 1983, Arch. Pathol. Lab. Med. 107: 281-282; Katzman, R.; 1983, Banbury Report 15, Cold spring Harbor Lab., Cold Spring, N.Y.).

El péptido amiloide (\betaA4), hallado en las placas del cerebro, deriva de una proteína referida como la proteína precursora del amiloide (o \beta-amiloide) (\betaAPP). La \betaAPP se elimina normalmente dentro del dominio amiloide, el cual está situado cerca del extremo C-terminal, de forma que no se produce amiloide intacto. Una ruta de procesamiento alternativa da como resultado la eliminación de la parte N-terminal de \betaAPP al dominio amiloide, se puede producir la liberación la parte C-terminal entera del péptido amiloide intacto (\betaA4) del precursor de la proteína (Glenner and Wong, 1984, Biochem Biophys Res. Común. 120:885-890; Masters et al., c1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4245-4249).

Evidencias recientes sugieren que el procesamiento aberrante de la \betaAPP sustenta la degeneración neuronal que ocurre en la enfermedad de Alzheimer. Neve y colaboradores han propuesto que el suceso de procesamiento principal de \betaAPP en la enfermedad de Alzheimer es la eliminación del extremo aminoterminal de la secuencia de \beta/A4, lo que produce un fragmento carboxiterminal de \betaAPP de 100 residuos aminoácidos (\betaAPP-C100) el cual se expresó a partir de un secuencia de cDNA que codifica los 104 aminoácidos carboxiterminales de \betaAPP (Yankner et al., 1989, Science 245:417-420). Más adelante en este documento, este fragmento de \betaAPP-C100 se mencionará como \betaAPP-C100 sin tener en cuenta si se expresa a partir de los residuos carboxiterminales 100 ó 104 de \betaAPP. La expresión del péptido \betaAPP en células de primates ha mostrado conducir a la producción de una proteína que se agrega y se acumula dentro de estructuras similares a depósitos que dan como resultado la formación de fibrillas similares a amiloide (Wolf et al., 1990 EMBO J. 9:2079-2084). Un recombinante retroviral el cual dirige la expresión de \betaAPP-C100 también ha mostrado ser neurotóxico cuando se transfecta en células PC-12 que se han inducido para diferenciarse mediante la adición de NGF. Además, el medio condicionado de estas células transfectadas es tóxico para las células diferenciadas del neuroblastoma y neurales, y la neurotoxicidad puede eliminarse del medio por inmunoabsorción con un anticuerpo para \betaAPP-C100 (Neve et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3448-3452). Tomadas conjuntamente, las evidencias indican un papel para \betaAPP-C100 en el desarrollo de la neurodegeneración en la enfermedad de Alzheimer.

A pesar del intenso interés en el péptido \betaAPP-C100, y su papel biológico en el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer, se conoce muy poco acerca de las proteínas, receptores u otros elementos de tejido con los cuales interactúa el péptido \betaAPP-C100 para producir neurotoxicidad. Muy recientemente, la alta afinidad de unión de \betaAPP-C100 a la superficie de células PC-12 diferenciadas ha sido demostrada y correlacionada con neurotoxicidad (Kozlwsky et al., 1992. J. of Neuroscience 12: 1679-1687). Tanto la interacción de unión como el hecho de la respuesta neurotóxica tienen la misma dependencia de pH. Además, en las células PC-12, tanto la unión como la susceptibilidad a la neurotoxicidad se desarrollan con cursos temporales similares durantre la diferenciación inducida por NGF. Además, un cambio de un único aminoácido en el péptido \betaAPP-C100 (Tyr_{687} a Phe) el cual elimina el efecto neurotóxico, produce también una pérdida de potencia de unión. Sin embargo, la especie molecular responsable de la unión no se ha identificado o caracterizado. El aislamiento de un clon de cDNA para el sitio de unión del \betaAPP-C100 o el receptor facilitaría los estudios enfocados a determinar la función biológica de C100-R y su papel en el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer. Sin embargo esto hasta ahora no ha sido logrado.

3. Resumen de la invención

La presente invención se refiere a los genes y proteínas de C100-R. Los efectos neurotóxicos, que resultan de la interacción entre \betaAPP-C100 y el C100-R sugieren que las aplicaciones terapéuticas diseñadas para bloquear esta interacción ligando/receptor particular pueden ser útiles para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. Las secuencias de DNA descritas en el presente documento pueden modificarse en sistemas de expresión diseñados para la producción de C100-R y/o líneas celulares que expresen el C100-R. Tales líneas celulares pueden usarse ventajosamente para investigar e identificar análogos de \beta-APP, lo que incluye agonistas y antagonistas. De acuerdo con otro aspecto de la invención, las secuencias oligonucleotídicas de DNA antisentido de C100-R, o antagonistas, lo que incluye anticuerpos contra C100-R pueden usarse en el diagnostico y terapia de la enfermedad de Alzheimer. Los animales transgénicos que contienen el transgen C100-R pueden usarse como modelos animales para la evaluación de análogos de \betaAPP-C100 in vivo.

La invención se basa, en parte, en el descubrimiento, identificación y clonaje de un sitio de unión que se expresa en la superficie celular de las células derivadas de las neuronas. El sitio de unión, citado en este documento como

\hbox{C100-R,}

tiene características que indican que está implicado en la mediación de los efectos neutóxicos del péptido \betaAPP-C100.

La invención se basa también en el aislamiento y caracterización de un clon de cDNA que codifica para el C100-R el cual puede ser de valor terapéutico para el diagnóstico y diseño de los fármacos para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

4. Breve descripción de las figuras

Fig. 1.- Curva representativa que muestra la inhibición de la unión de ^{35}S-\betaAPP-C100 a (A) células PC12 tratadas con NGF (5d) y (B) células SK-N-MC tratadas con \betaAPP-C100.

Fig. 2.- Isoterma de saturación representativa (panel superior) y cuadro de Scarchard (panel inferior) de la unión de ^{35}S-\betaAPP-C100 a células PC12 tratadas con NGF (6d). Las líneas se generaron por ordenador y representan la mejor interpretación de los datos.

Fig. 3.- Rastreo de librerías de cDNA de ratas \lambdagt11 usando el procedimiento de Unión Directa.

Fig. 4.- Secuencia de nucleótidos del inserto de cDNA del clon de C100-R de rata, B1R. La región subrayada representa la "firma" de la SER/THR quinasa o la secuencia conservada del núcleo catalítico.

Fig. 5.- La homología de secuencia entre C100-R y (A) canales de calcio tipo "B", (B) calreticulina y (C) canal de calcio de Rianodina.

Fig. 6.- Análisis mediante prueba de bandas de Southern del cDNA de AB1R. El carril A es DNA humano digerido con EcoRI. El carril B es DNA de ratón digerido con EcoRI. El carril B es DNA de ratón digerido con HindIII. El carril D es DNA humano digerido con HindIII. Los marcadores \lambda/HindIII se corrieron para establecer los pesos moleculares.

Fig. 7.- Las autorradiografías representativas de unión específica de los cortes cerebrales de rata en (A) el nivel anterior y (B) los niveles medio a posterior. Las imágenes se digitalizaron y se mejoraron de tal forma que las áreas con altos niveles de unión son más claras. Nótese que ciertas áreas del tubérculo olfatorio (la parte más baja de los cortes en (A) y el hipocampo (parte lateral media del corte en (B) destacan contra el etiquetado relativamente uniforme del resto de la materia gris.

Fig. 8.- Autorradiografías representativas de hibridación in situ de la sonda antisentido del pABIR. Las localizaciones de los cortes y el procedimiento de la reproducción son como en la figura 7. Nótese que las áreas de alto marcaje (las áreas más claras) en el tubérculo olfatorio y en el hipocampo están de acuerdo con los resultados de la autorradiografía de unión (fig. 7).

Fig. 9.- Secuencia de nucleótidos del inserto de cDNA del clon de C100-R de rata, AB2R. El fragmento EcoRI del nucleótido 31 al nucleótido 409 se usó para investigar un biblioteca de cDNA humano del hipocampo.

Fig. 10.- Secuencia de nucleótidos del clon C100-R de rata. La secuencia descrita es el resultado de clonar y secuenciar un número de clones de rata de cDNA que se solapan. El nucleótido 686 descrito anteriormente en este documento representa el empalme con la secuencia de nucleótidos de C100-R descrita en la figura 4(nucleótido 40).

Fig. 11.- Secuencia de nucleótidos de los insertos de cDNA del clon del C100-R humano. El nucleótido designado M es o bin A o bien C y el nucleótido designado K es o bien T o G.

Fig. 12A.- Homología de secuencia entre el C100-R humano y el C100-R de rata. La secuencia humana #4.t3 se alinea con la secuencia de rata C100-R dibujada en la figura 9 empezando en el nucleótido 544.

Fig. 12B.- Homología de secuencia entre el C100-R humano y el C100-R de rata. El clon humano HABIR #1#4 se alinea con la secuencia C100-R de rata dibujada en la figura 4, empezando en el nucleótido 182.

Fig. 12C.- Homología de secuencia entre el C100-R humano y el C100-R de rata. El clon humano #1#1T3 se alinea con la secuencia C100-R de rata dibujada en la figura 4, empezando en el nucleótido 1868.

5. Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a el clonaje y la expresión del C100-R. El C100-R se caracterizó inicialmente como un sitio de unión, presente en la superficie de las células derivadas de neuronas, que se unieron específicamente al péptido amiloide \betaAPP-C100. La expresión del péptido amiloide \betaAPP-C100 ha mostrado correlacionar en modelos animales con el tipo específico de degeneración neuronal que ocurre en la enfermedad de Alzheimer. El C100-R producido en la presente solicitud puede usarse para evaluar e investigar fármacos y análogos de \beta-APP que pueden usarse en la diagnosis y/o el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

5.1. La secuencia codificante del C100-R

El clon inicial del cDNA de C100-R, designado \lambdaAB1R, se obtuvo mediante el rastreo de una biblioteca de expresión de \lambdagt11 en rata con el ligando \beta-APP-C100 etiquetado con metionina ^{35}S-metionina o una secuencia "señal" epítopo peptídica como se describe en la Sección 6, parte inferior. Se halló que el clon inicial, designado pABIR-rata, contenía un inserto de 1970 pares de bases comprendido en la secuencia codificante del nucleótido y la secuencia deducida de aminoácidos dibujada en la figura 4. Un clon de cDNA correspondiente se ha depositado con el ATCC y los números asignados descritos en la Sección 7, parte inferior. El análisis de secuencia revela que el clon abarca la sección carboxiterminal del gen y contiene 1395 pares de bases de una secuencia codificante y 575 pares de bases de la secuencia 3' no traducida (figura 4).

Al utilizar el RNA preparado a partir del cerebro de rata y un cebador específico para la mayoría del cebador 5' del inserto de cDNA ABIR, la síntesis de la primera hebra se llevó a cabo en una reacción con transcriptasa inversa. Al seguir la síntesis de la segunda hebra, el cDNA se insertó en el plásmido bacteriano Bluescript (Stratagene). Clones adicionales de rata se aislaron y secuenciaron (fig. 9 y fig. 10). Las nuevas secuencias se solapan con esas secuencias de rata mostradas en la figura 4 y extienden la región codificante hacia el extremo aminoterminal de la proteína C100-R (figura 10). La secuencia descrita en la figura 9 diverge cadena arriba del nucleótido 106 de la secuencia de rata mostrada en la figura 10, lo que indica que deben existir mRNAs que sufran un "splicing" alternativo para el clon C100-R.

Una búsqueda de la base de datos de la secuencia de nucleótidos de Genebank para homologías con el C100-R revela un número de coincidencias con los canales de calcio de tipo "B", el canal de calcio de rianodina, y la proteína de unión a calcio de alta afinidad, calreticulina (fig. 5). La homología compartida entre C100-R y canales de calcio es consistente con la inusual dependencia de pH de la unión y la observación de que una alteración en los niveles de calcio en las neuronas, particularmente en cortex e hipocampo, dio como resultado neurotoxicidad. La secuencia de cDNA de C100-R contiene también homologías a la firma SER/THR quinasa o secuencia conservada en el núcleo catalítico descrita por Hanks et al. (1988, Science 241:42-52) figura 4.

Como se indicó mediante la detección de un mRNA de 11 kilobases de C100-R en la prueba de bandas de Northern, la secuencia de nucleótidos dibujada en la figura 4 es sólo una representación parcial del gen de C100-R. La secuencia de cDNA de rata de C100-R en toda su longitud se puede obtener usando un número de procedimientos diferentes. Por ejemplo, sondas específicas para la mayoría de la secuencia 5' del clon de rata pueden usarse para reinvestigar las bibliotecas de cDNA de rata. Con cada ronda exitosa de rastreo se pueden diseñar nuevas sondas 5' y usarlas para volver a probar bibliotecas hasta que la secuencia completa se hubo obtenido.

La tecnología de la PCR se puede usar también para aislar el gen completo del C100-R de rata. Al usar RNA preparado a partir de una fuente apropiada de rata, un cebador específico para la mayoría del extremo 5' del inserto de cDNA de rata puede usarse para cebar la síntesis de la primera hebra en una reacción de transcriptasa inversa. El híbrido RNA/DNA puede ser después "marcado con una cola" con guaninas mediante el uso de transferasa terminal, digerido con RNAsa H, seguido por la síntesis de la segunda hebra cebada con un cebador poli-C. Mediante el uso de cebadores con sitios específicos de restricción incorporados en ellos, estos cDNAs "específicos de clon" pueden insertarse fácilmente dentro de un apropiado plásmido vector y secuenciarse.

La invención se refiere también a los genes C100-R aislados a partir de otras especies, lo que incluye a los humanos, en los cuales existe actividad C100-R. Los miembros de la familia de C100-R se definen en este documento como aquellos receptores que unen \betaAPP-C100 o fragmentos del péptido. Tales receptores pueden demostrar aproximadamente un 80% de homología a nivel de nucleótidos, e incluso un 90% de homología a nivel de aminoácidos en tramos sustanciales de la secuencia de DNA. Se investigó una biblioteca de cDNAs en bacteriófagos, bajo condiciones reducidamente estrictas, mediante el uso de un fragmento marcado radiactivamente del clon de rata C100-R. Alternativamente, la secuencia de C100-R puede usarse para diseñar sondas de oligonucleótidos degenerados o totalmente degenerados las cuales pueden usarse como sondas de PCR o para investigar librerías de cDNA de bacteriófagos. Una estrategia basada en la reacción en cadena de la polimerasa (abreviadamente en inglés PCR) puede usarse para clonar C100-R humano. Dos reservas de oligonucleótidos degenerados, correspondientes a motivos conservados entre el C100-R de rata y los canales de calcio, pueden diseñarse para servir como cebadores en una reacción de PCR. La plantilla para la reacción es cDNA obtenido mediante transcripción inversa de mRNA preparado a partir de líneas celulares o tejidos conocidos por expresar APP-R humano. El producto de PCR puede subclonarse y secuenciarse para asegurar que las secuencias amplificadas representan las secuencias C100-R. El fragmento de PCR puede usarse para aislar un clon de cDNA de C100-R completo mediante marcaje radiactivo del fragmento amplificado y rastreo de una biblioteca de cDNA de bacteriófagfos. Alternativamente, el fragmento marcado puede usarse para investigar una librería genómica. Para una revisión de las estrategias de clonación las cuales se pueden usar, véase, por ejemplo, Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Clod Springs Harbor Press, N.Y.; y Ausubel et al., 1989, current Protocols in Molecular Biology, (Green Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y.).

Una biblioteca de cDNA puede también construirse en un vector de expresión mamífero tal como pcDNA1, que contiene las secuencias del origen de replicación del SV40, las cuales permiten un alto número de copias de expresión de plásmidos cuando se transfieren en células COS. La expresión de C100-R sobre la superficie de las células COS puede detectarse en una serie de formas, incluyendo el uso de un ligando marcado tal como \betaAPP-C100 o un agonista de \betaAPP-C100 marcado con una etiqueta radiactiva, una etiqueta fluorescente o una enzima. Las células que expresan el C10-R humano pueden enriquecerse al someter a las células transfectadas a una clasificación FACS (abreviatura en inglés de clasificador de células activadas fluorescentemente).

En una realización específica descrita en el presente documento, una librería de cDNA de hipocampo de adulto se investigó con un fragmento de nucleótidos marcado del clon de C100-R de rata. El fragmento grande al cortar con EcoRI, que se extiende desde el nucleótido 31 hasta el nucleótido 409 del clon de ratra AB2R (flig. 9) se usó para sondar la biblioteca de cDNA humano. Se obtuvieron varios clones y se secuenciaron los insertos de cDNA. La secuencia de C100-R se mostró en la figura 11, y las regiones de homología entre las secuencias de C100-R de rata y humana se muestran en la fig. 12.

Cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente en este documento para el aislamiento de los clones de C100-R de rata puede usarse igualmente bien para el aislamiento de los clones de la secuencia completa de C100-R de humanos. Por ejemplo, las sondas especificas para la mayoría de la secuencia 5' del clon humano pueden usarse para reinvestigar la biblioteca de cDNA humano. Con cada ronda exitosa de secuenciación se pueden diseñar nuevas sondas 5' y usarlas para volver a probar bibliotecas hasta que se obtenga la secuencia completa.

De acuerdo con la invención, las secuencias de nucleótidos que codifican para fragmentos C100-R, proteínas de fusión o equivalentes funcionales de los mismos, pueden usarse para generar moléculas de DNA recombinantes que dirigen la expresión del C100-R, o un péptido funcionalmente activo, proteína de fusión o equivalente funcional de los mismos en células hospedadoras apropiadas. Alternativamente, las secuencias de nucleótidos las cuales se hibridan con porciones de la secuencia C100-R pueden usarse también en ensayos de hibridación de ácidos nucleicos, análisis mediante pruebas de bandas de Southern y Northern, etc.

Debido a la degeneración del código genético, otras secuencias de DNA las cuales codifican sustancialmente la secuencia de aminoácidos de C100-R, por ejemplo, tal como la secuencia de rata descrita en la figura 4 o un equivalente funcional puede usarse en la práctica de la presente invención para el clonaje y la expresión de la C100-R. Tales secuencias de DNA incluyen aquellas que son capaces de hibridar las secuencias de C100-R de rata y humano bajo condiciones restrictivas, o las cuales serían capaces de hibridar bajo condiciones restrictivas pero para la degeneración del código genético. Las condiciones restrictivas pueden ajustarse en una cantidad de formas. Por ejemplo, cuando las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) se llevan a cabo, la temperatura a la cual se forman los cebadores para que las plantillas tengan lugar o la concentración de MgCl_{2} en el tampón de reacción pueda ajustarse. Cuando se usan fragmentos de DNA marcados radiactivamente u oligonucleótidos para sondear filtros, la restrictividad puede ajustarse con cambios en la fuerza iónica de las disoluciones de lavado o mediante un control cuidadoso de la temperatura a la cual los lavados de filtro se llevan a cabo.

Las secuencias alteradas de DNA que se pueden usar con la invención incluyen deleciones, adiciones o sustituciones de diferentes residuos nucleotídicos dando como resultado una secuencia que codifica el mismo producto génico o un producto génico funcionalmente equivalente. El producto génico puede contener deleciones, adiciones o sustituciones de diferentes residuos aminoácidos dentro de la secuencia C100-R por sí mismo, lo cual da como resultado un cambio silencioso que produce así un C100-R funcionalmente equivalente. Tales sustituciones de aminoácidos pueden hacerse sobre la base de la similaridad en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o la naturaleza anfipática de los residuos implicados. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; los aminoácidos con cabezas de grupos polares no cargados que tienen valores similares de hidrofilicidad incluyen los siguientes: leucina, isoleucina, valina; glicina, anilina; asparragina, glutamina; serina, treonina; fenilalanina, tirosina. Como se usa aquí, una C100-R funcionalmente equivalente se refiere a un receptor el cual se une a \beta-APP-C100 o a fragmentos, pero no necesariamente con la misma afinidad de unión o su contrapartida nativa C100-R.

Las secuencias de DNA de la invención pueden modificarse con el fin de alterar la secuencia codificante para una variedad de fines incluyendo pero no limitado a alteraciones las cuales modifican el procesamiento y la expresión del producto génico. Por ejemplo, las mutaciones pueden introducirse mediante el uso de técnicas las cuales se conocen bien en la técnica, por ejemplo mutagénesis dirigidas a sitio para insertar nuevos sitios de restricción, para alterar los patrones de glicosilación, fosforilación, etc. Por ejemplo, en ciertos sistemas de expresión tales como bacterias, las células hospedadoras pueden sobreglicoxilar el producto génico. Cuando se usan tales sistemas de expresión puede ser preferible alterar la secuencia codificante C100-R para eliminar cualquier sitio de glicoxilación unido al extremo N-terminal. En otra realización de la invención, el C100-R o una secuencia modificada C100-R puede ligarse a una secuencia heteróloga para codificar una proteína de fusión. La proteína e usión puede modificarse para contener un sitio de corte localizado entre la secuencia C100-R y la secuencia heteróloga de la proteína, de forma que el C100-R puede eliminarse del residuo heterólogo.

En una realización alternativa de la invención, la secuencia codificante de C100-R pudo sintetizarse en todo o en parte usando procedimientos químicos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Caruthers et al., 1980, Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 7. 25-233; Crea and Horn, 180, Nuc. Acids Res. 9(10): 2331; Matteucci y Caruthers, 1980, Tetrahedron Letters 21:719; y Chow y Kempe, 1981, Nuc. Acids Res. 9(12): 2807-2817. Alternativamente, la proteína por sí misma pudo producirse mediante el uso de procedimientos químicos para sintetizar la secuencia de aminoácidos en todo o en parte. Por ejemplo, los péptidos pueden sintetizarse mediante técnicas de fase sólida, escindidos de la resina, y purificados mediante cromatografía líquida de alta resolución preparativa. (Por ejemplo, véase Creighton, 1983, Protein Structures And Molecualr Priciples, W.H.Freeman y Co., N.Y. pp. 50-60). La composición de los péptidos sintéticos puede confirmarse mediante análisis de aminoácidos o secuenciación (por ejemplo, el procedimiento de la degradación de Edman, véase Creighton, 1983, Protein Structures and Molecular Principles, W.H.Freeman y Co., N.Y. pp. 34-49).

5.2 Expresión del C100-R

Con el fin de expresar un C100-R biológicamente activo, la secuencia de nucleótidos que codifica para C100-R, o un equivalente funcional como se describe en la Sección 5.1, parte superior, se inserta dentro de un vector de expresión apropiado, es decir, un vector el cual contiene los elementos necesarios para la transcripción y traslación de la secuencia codificante insertada. Los productos del gen C100-R, de la misma manera que las células hospedadoras o las líneas celulares transfectadas o transformadas con los vectores de expresión C100-R recombinantes pueden usarse para una variedad de propósitos. Estos incluyen, pero no están limitados a, generar anticuerpos (por ejemplo, monoclonales o policlonales) que se unen al receptor, incluyendo aquellos que inhiben competitivamente la unión y "neutralizan" la actividad \beta-APP de \beta-APP o de los fragmentos de \beta-APP, y el rastreo y selección de los análogos de \beta-APP o fármacos que actúan por medio del C100-R; etc.

5.2.1. Sistemas de expresión

Los procedimientos que son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica pueden usarse para construir vectores de expresión que contienen la secuencia codificante C100-R y las apropiadas señales de control transcripcionales/traduccionales. Estos procedimientos incluyen técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación in vivo/recombianción genética. Véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring harbor Laboratory, N.Y. y Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y.

Una variedad de sistemas de expresión de un vector en un hospedador pueden utilizarse para expresar la secuencia codificante C100-R. Esto incluye pero no se limita a microorganismos tales como bacterias transformadas con vectores de expresión bacteriófagos de DNA recombinante, plásmidos de DNA o cósmidos de DNA que contienen la secuencia codificante de C100-R; levaduras transformadas con vectores recombinantes de expresión en levaduras que contienen la secuencia codificante C100-R; sistemas de células de insectos infectadas con virus recombinantes vectores de expresión (por ejemplo, baculovirus) que contienen la secuencia codificante C100-R; sistemas celulares vegetales que infectados con virus recombinantes vectores de expresión (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, abreviadamente en inglés CaMV; virus del mosaico del tabaco, abreviadamente en inglés TMV) o transformados con plásmidos recombinantes vectores de expresión (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen la secuencia codificante C100-R; o sistemas de células animales infectados con virus recombinantes vectores de expresión (por ejemplo, adenovirus, virus vaccinia) lo que incluye líneas celulares modificadas para contener copias múltiples del DNA de C100-R o bien amplificado establemente (por ejemplo, CHO/dhfr) o bien amplificado inestablemente en cromosomas doble diminutos (por ejemplo, en líneas celulares murinas).

Los elementos de expresión de estos sistemas varían en su fuerza y especificidades. Dependiendo del sistema hospedador/vector utilizado, cualquiera de un número de elementos adecuados de transcripción y traducción, incluyendo promotores constitutivos e inducibles, pueden usarse en el vector de expresión. Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, pueden usarse los promotores inducibles tales como pL del bacteriófago \lambda, plac, ptrp, ptac (promotor híbrido ptrp-lac) y similares; cuando se clona en sistemas celulares de insectos, se pueden usar promotores tales como el promotor de polihedrina de baculovirus; cuando se clona en sistemas celulares vegetales, se pueden usar promotores derivados del genoma de las células vegetales (por ejemplo, promotores de respuesta a golpe de calor; el promotor de la subunidad pequeña de RUBISCO; el promotor para la proteína de unión a clorofila a/b) o de virus de plantas (por ejemplo, el promotor de RNA 35S del CaMV; el promotor de la proteína de la cubierta de TMV); cuando se clona en sistemas de células de mamífero, se pueden usar los promotores derivados del genoma de las células de mamífero (por ejemplo, el promotor de la metalotioneína) o de virus de mamíferos (por ejemplo el promotor tardío de adenovirus; el promotor de 7,5K del virus vaccinia); cuando se generan las líneas celulares que contienen copias múltiples del DNA de C100-R, se pueden usar con un apropiado marcador de selección los vectores basados en SV40, BPV y EBV.

En sistemas bacterianos un número de vectores de expresión puede seleccionarse ventajosamente dependiendo del uso deseado para el C100-R expresado. Por ejemplo, cuando se producen grandes cantidades de C100-R para la generación de anticuerpos, pueden ser deseables los vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteínas de fusión que son purificados fácilmente. Tales vectores incluyen, pero no están limitados a, el vector de expresión pUR278 de E. coli (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2: 1791), en el cual la secuencia codificante C100-R puede estar ligada dentro del vector formando una estructura con la región codificante lacZ de tal forma que se produce una proteína híbrida C100-R/lacZ: vectores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol.. Chem. 264:5503-5509); y similares. Los vectores pGEX pueden usarse también para expresar los polipéptidos ajenos como proteínas de fusión con glutation S-transferasa (abreviadamente GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden ser purificadas fácilmente a partir de células lisadas por cromatografía de afinidad, por ejemplo, adsorción a perlas de glutation-agarosa seguida por elusión en presencia de glutation libre. Los vectores pGEX se diseñan para incluir sitios de corte con proteasa de trombina o factor Xa, de tal forma que el polipéptido de interés clonado puede liberarse del residuo GST. Véase también Booth et al., 1988, Inmunol. Lett. 19: 65-70; y Gardella et al., 1990, J. Biol. Chem,. 265: 15854-15859; Pritchett et al., 1989, Biotechniques 7:580.

En levaduras, puede usarse un número de vectores que contienen promotores constitutivos e inducibles. Para una revisión véase Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 1988, Ed. Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13; Grant et al., 1987, Expression and Secretion Vectors in Yeast, in Methods in Enzimology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y., Vol. 153, pp. 516-544; Glover, 1986, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash. , D.C., Ch. 3; y Bitter, 1987, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzimology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y., Vol. 152, pp. 673-684; y The Moilecular Biology of the Yeast Saccaromyces, 1982, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vol. I y II.

En los casos donde se usan los vectores de expresión en vegetales, la expresión de la secuencia codificante C100-R puede dirigirse por cualquiera de un número de promotores. Por ejemplo, se pueden usar promotores virales tales como los promotores del RNA 35S y el RNA 19S del CaMV (Brisson et al., Nature 310: 511-514), o el promotor de la proteína de cubierta del TMV (Takamatsu et al., 1987, EMBO J. 6: 307-311); alternativamente se pueden usar promotores vegetales tales como el de la subunidad pequeña de RUBISCO (Coruzzi et al., 1984, EMBO J. 3: 1671-1680; Broglie et al., 1984, Science 224: 838-843); o promotores de respuesta a golpe de calor, por ejemplo, hsp17.5-E o hsp17.3-B de soja (Gurley et al., 1986, Mol. Cell. Biol.. 6: 559-565). Estas construcciones pueden introducirse dentro de las células vegetales usando plásmidos Ti, plásmidos Ri, vectores víricos vegetales, transformación directa con DNA, microinyección, electroporación, etc. Para revisiones de estas técnicas véase, por ejemplo, Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, N.Y. Sección VIII, pp. 421-463; y Grierson & Corey, 1988, Plant Molecular Biology, segunda Ed., Blackie, London, Ch. 7-9.

Un sistema de expresión alternativo el cual se puede usar para expresar C100-R es un sistema entomológico. En uno de tales sistemas, el virus de la polihidrosis nuclear de la Autographa californica (abreviadamente en inglés AcNPV) se usa como un vector para expresar genes ajenos. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia codificante de C100-R puede clonarse dentro de regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de polihedrina) del virus y situarse bajo control de un promotor de AcNPV (por ejemplo, el promotor de polihedrina). La inserción exitosa de la secuencia codificante C100-R resultará en la inactivación del gen de polihedrina y la producción del virus recombinante no ocluido (es decir, el virus que carece de la cubierta proteica que codifica el gen de polihedrina). Estos virus recombinantes se usan entonces para infectar células de Spodoptera frugiperda en las cuales se expresa el gen insertado. (Por ejemplo, véase Smith et al., 1983, J. Viol. 46: 584; U.S. Patente Nº 4.215.051 cedida a Smith).

En células hospedadoras de mamífero, se puede usar un número de sistemas de expresión basados en virus. En los casos en que un adenovirus se usa como un vector de expresión, la secuencia codificante puede ligarse a un complejo de control de transcripción/traducción de un adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico puede insertarse entonces en el genoma de adenovirus mediante recombinación in vivo o in vitro. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, la región E1 o E3) resultará en un virus recombinante que es viable y capaz de expresar C100-R en hospedadores infectados. (Por ejemplo, véase Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81: 3655-3659). Alternativamente, se puede usar el promotor de 7,5 K. (Por ejemplo, véase Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79: 7415-7419; Mackett et al., 1984; J. Virol. 49: 857-864; Panicali et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 4927-4931).

Las señales de iniciación específicas pueden requerirse también para la traslación eficiente de las secuencias codificantes insertadas de C100-R. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. En los casos donde el gen completo C100-R, incluyendo su propio codón de iniciación y secuencias adyacentes, se inserta en el apropiado vector de expresión, no se pueden necesitar señales de control traduccionales adicionales. Sin embargo, en los casos donde sólo se inserta una parte de la secuencia codificante de C100-R, deben proporcionarse señales exógenas de control traduccional, incluyendo el codón de iniciación ATG. Además, el codón de iniciación debe estar en fase con la estructura de lectura de la secuencia codificante de C100-R, para asegurar la traducción del inserto entero. Estas señales exógenas de control traduccional y codones de iniciación pueden tener una variedad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de la expresión puede mejorarse mediante la inclusión de los apropiados elementos de mejora de la transcripción, terminadores de transcripción, etc. (véase Bitter et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: 516-544).

Además, se puede elegir una cepa de células hospedadoras las cuales modulan la expresión de las secuencias insertadas, o se modifica y procesa el producto génico en la forma específica deseada. Tales modificaciones (por ejemplo, glicoxilación) y procesado (por ejemplo, escisión) de los productos proteicos pueden ser uimportantes para la función de la proteína. Diferentes células hospedadoras tienen mecanismos específicos y característicos para el procesado y modificación postraduccionales de las proteínas. Se pueden escoger las líneas celulares o los sistemas hospedadores apropiados para asegurar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína ajena expresada. Con este fin, se pueden usar las células eucariotas que poseen la maquinaria celular para el apropiado procesamiento de lo que se transcribe primariamente, y la glicoxilación y fosforilación del producto génico. Tales células hospedadoras de mamífero incluyen, pero no están limitadas a, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, WI38, etc.

Para la producción elevada a largo plazo de las proteínas recombinantes, es preferible la expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan establemente el C100-R pueden modificarse. Más que mediante el uso de vectores de expresión los cuales contienen orígenes de replicación virales, las células hospedadoras se pueden transformarcon el DNA de C100-R controlado por los apropiados elementos de control de expresión (por ejemplo, promotor, secuencias de incremento de transcripción, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador de selección. Tras la introducción de DNA ajeno, se puede permitir que las células modificadas crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido, y entonces se trasladen a un medio selectivo. El marcador de selección en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite a las células integrar establemente el plásmido dentro de sus cromosomas y crecer para formar focos los cuales sucesivamente pueden clonarse y expandirse en líneas celulares. Este procedimiento puede usarse ventajosamente para modificar las líneas celulares que expresan el C100-R en la superficie de la célula, y las cuales responden a la transducción de señales mediada por \betaAPP-C100. Tales líneas celulares modificadas son particularmente útiles en el rastreo de análogos de \betaAPP-C100.

Se puede usar un número de sistemas de selección, incluyendo pero no limitados a los genes de la timidina quinasa del virus herpes simplex (Wigler, et al., 1977, Cell 11: 223), la hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026), y la adenina fosforibosiltransferasa (Lowy, et al., 1980, Cell 22: 817) que se pueden usar en células tk^{-}, hgprt o aptr, respectivamente. También, la resistencia antimetabolito se puede usar como la base de selección para los genes: dhfr, el cual confiere resistencia a metotrexato (Wigler, et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); gpt, el cual confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); neo, el cual confiere resistencia al aminoglicóxido G-418 (Colberre-Garapin, et al., 1981, J. Mol. Biol.. 150:1), e hygro, el cual confiere resistencia a higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147). Recientemente, se han descrito genes de selección adicionales, llamados trpB, el cual permite a las células usar indol en lugar de triptófano; hisD, el cual permite a las células usar histinol en lugar de histidina (Hartman & Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8047), y ODC (abreviatura de ornitina descarboxilasa) el cual confiere resistencia al inhibidor de ornitina descarboxilasa, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue L., 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbos Laboratory ed.).

5.2.2. Identificación de transfectantes y transformantes que expresan el C100-R

Las células hospedadoras que contienen la secuencia codificante y las cuales expresan el producto génico biológicamente activo se pueden identificar mediante al menos cuatro aproximaciones generales; (a) hibridación DNA-DNA o DNA-RNA; (b) la presencia o ausencia de funciones genéticas "marcador"; (c) valoración del nivel de la transcripción como se mide mediante la expresión de los RNA mensajeros transcritos a partir de C100-R en la célula hospedadora; y (d) detección del producto del gen según se mide mediante inmunoensayo o por su actividad biológica.

En la primera aproximación, la presencia de la secuencia codificante de C100-R insertada en el vector de expresión puede detectarse mediante hibridación DNA-DNA o DNA-RNA usando sondas que comprenden secuencias de nucleótidos que son homólogas a la secuencia codificante C100-R, respectivamente, o partes o derivados de las mismas.

En la segunda aproximación, el sistema vector de expresión recombinante/hospedador se puede identificar y seleccionar basándonos en la presencia o ausencia de ciertas funciones "marcadoras" de gen (por ejemplo, actividad timidina quinasa, resistencia a antibióticos, resistencia a metotrexato, fenotipo de transformación, formación de cuerpo de oclusión en baculovirus, etc.). Por ejemplo, si la secuencia codificante C100-R se inserta dentro de una secuencia marcadora del vector, los recombinantes que contienen la secuencia codificante C100-R se pueden identificar por la ausencia de la función del gen marcador. Alternativamente, un gen marcador puede situarse conjuntamente con la secuencia codificante C100-R bajo el control del mismo o diferente promotor usado para controlar la expresión de la secuencia codificante C100-R. La expresión del marcador en respouesta a la inducción o la selección indica la expresión de la secuencia codificante C100-R.

En la tercera aproximación, la actividad transcripcional de la región codificante de C100-R se puede valorar mediante ensayos de hibridación. Por ejemplo, RNA puede aislarse y analizarse mediante prueba de bandas de Northern por el uso de una sonda homóloga a la secuencia codificante de C100-R o a partes particulares de la misma. Alternativamente, los ácidos nucleicos totales de la célula hospedadora se pueden extraer y ensayar para su hibridación a tales sondas.

En la cuarta aproximación, la expresión del producto proteico C100-R puede valorarse inmunológicamente, por ejemplo mediante pruebas de bandas de Western, inmunoensayos tales como radioinmunoprecipitación, inmunoensayos de unión a enzima y similares. La prueba definitiva del éxito de un sistema de expresión, sin embargo, implica la detección del producto del gen C100-R biológicamente activo. Un número de ensayos se puede usar para detectar la actividad del receptor, lo que incluye, pero no se limita a, ensayos de unión a \beta-APP que usan líneas celulares modificadas como el sustrato de prueba.

5.2.3. Recuperación del C100-R

Una vez que se identifica un clon que produce altos niveles de C100-R biológicamente activo, el clon se puede expandir y usar para producir grandes cantidades del receptor el cual se puede purificar usando técnicas bien conocidas en la técnica, lo que incluye, pero no se limita a, purificación por inmunoafinidad, procedimientos cromatográficos incluyendo cromatografía líquida de alta resolución, cromatografñia de afinidd usando ligando inmobilizado tal como \beta-APP-C100 o análogos del mismo unidos a perlas, purificación de inmunoafinidad usando anticuerpos y similares.

En donde la secuencia codificante C100-R se modifica para codificar una proteína de fusión escindible, la purificación puede lograrse fácilmente usando técnicas de purificación por afinidad. Por ejemplo, una secuencia consenso de escisión reconocida por colagenaza puede modificarse entre el extremo carboxiterminal de C100-R y la proteína A. La proteína de fusión resultante puede purificarse fácilmente mediante el uso de cuna columna IgG que une el resto de la proteína A. El C100-R no fusionado puede liberarse de la columna fácilmente mediante tratamiento con colagenasa. Oto ejemplo sería el empleo de los vectores pGEX que expresan polipéptidos ajenos como proteínas de fusión con la glutationina-S-transferasa (abreviadamente GST). La proteína de fusión puede modificarse o bien con los sitios de escisión de trombina o bien con los del factor Xa entre el gen clonado y el motivo GST. La proteína de fusión puede purificarse fácilmente a partir de extractos celulares mediante la adsorción a perlas de glutation agarosa seguida por elusión en presencia de glutation. En este aspecto de la invención, cualquier sitio de escisión o sustrato de escisión de enzima puede modificarse entre la secuencia C100-R y un segundo péptido o proteína que tiene un compañero de unión el cual puede usarse para la purificación, por ejemplo, cualquier antígeno para el cual se pueda preparar una columna de inmunoafinidad.

5.3. Generación de anticuerpos que definen el C100-R

Se pueden usar varios procedimientos conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos a epítopos del C100-R producido recombinantemente. Los anticuerpos neutralizantes, es decir, aquellos que compiten por el sitio de unión de \betaAPP-C100 del receptor son especialmente preferidos para diagnósticos y terapéuticas. Tales anticuerpos incluyen, pero no están limitados a, policlonales, monoclonales, quiméricos, de cadena simple, fragmentos de Fab y fragmentos producidos por una biblioteca de expresión Fab.

Para la producción de anticuerpos, varios animales hospedadores pueden inmunizarse mediante inyección con el C100-R, lo que incluye, pero no se limita, a: conejos, ratones, ratas, etc. Varios coadyuvantes pueden usarse para incrementar la respuesta inmunológica, lo que depende de las especies hospedadoras, incluyendo, pero no limitados, a: coadyuvante de Feund (completo o incompleto), geles minerales como hidróxido de aluminio, sustancias activas de superficie tales como isolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de la lapa californiana, dinitrofenol, y coadyuvantes potencialmente útiles en humanos tales como BCG (abreviatura de bacilo de Calemtte-Guerin) y Corynebacterium parvum, mediante el uso de cualquier técnica la cual facilite la producción de moléculas de anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo. Esto incluye, pero no está limitado a, la técnica de hibridoma descrita originalmente por Kohler y Milstein, (Nature, 1975, 256: 495-497), la técnica de hibridoma de las células B humanas (Kosbor et al., 1983, Inmunology Today, 4:72; Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci., 80: 2026-2030) y la técnica de hibridoma de EBV (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Además, se pueden usar las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., 184, Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851-6855; Neuberguer et al., 1984, Nature, 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314: 452-454) mediante el proceso de "splicing" de los genes a partir de una molécula de anticuerpo de ratón de la especificidad de antígeno apropiada conjuntamente con los genes de una molécula de anticuerpo humano con la apropiada actividad biológica.

Los fragmentos de anticuerpo los cuales contienen sitios de unión específicos de C100-R pueden generarse mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen pero no están limitados a: los fragmentos F(ab')_{2} los cuales pueden producirse por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos Fab los cuales pueden generarse mediante reducción de los puentes disulfuro de los fragmentos de F(ab')_{2}. Alternativamente, las librerías de expresión de Fab se pueden construir (Huse et al., 1989, Science, 246: 1275-1281) para permitir la identificación rápida y fácil de fragmentos de Fab monoclonales con la especificidad deseada a C100-R.

5.4. RNA y ribozimas antisentido

También dentro del ámbito de la invención están las secuencias de oligoribonucleótido, que incluyen moléculas de RNA y DNA antisentido que actúan bloqueando directamente la traducción de mRNA mediante unión del mRNA al que van dirigidas y así previenen la traducción de las proteínas. Con respecto al DNA antisentido, se prefieren los oligorribonucleótidos derivados del sitio de iniciación de la traducción, por ejemplo, la región entre -10 y +10 de la secuencia de nucleótidos C100-R.

Las ribozimas son moléculas de RNA enzimático capaces de catalizar el corte específico de DNA. El mecanismo de acción de la ribozima implica la hibridación específica de secuencia de la molécula de ribozima al RNA complementario al cual va dirigida, seguido por una escisión endonucleolítica. Dentro del ámbito de la invención están las moléculas de ribozima modificadas en la zona en forma de cabeza de martillo que catalizan específicamente y eficientemente la escisión endonucleolítica de las secuencias de RNA de C100-R.

Los sitios específicos de escisión por ribozimas dentro de un RNA diana potencial se identifican inicialmente mediante exploración de la molécula diana en busca de sitios de escisión por ribozima los cuales incluyen las siguientes secuencias: GUA, GUU y GUC. Una vez identificadas, las secuencias cortas de DNA de entre 15 y 20 nucleótidos correspondientes a la región del gen diana que contiene el sitio de escisión deben evaluarse para predecir las características estructurales tales como la estructura secundaria que puede volver no adecuada la secuencia de oligonucleótidos. La adecuabilidad de las dianas candidatas también puede evaluarse mediante probar su accesibilidad a hibridación con oligonucleótidos complementarios, mediante el uso de ensayos de protección de ribonucleasa.

Tanto las moléculas de RNA y DNA antisentido como las ribozimas de la invención se pueden preparar por cualquier procedimiento conocido en la técnica para la síntesis de moléculas de RNA. Estas incluyen técnicas para sintetizar químicamente oligodeoxiribonucleótidos bien conocidas en la técnica tales como por ejemplo síntesis química de fosforamidita en fase sólida. Alternativamente, las moléculas de RNA se pueden generar mediante transcripción in vivo e in vitro de secuencias de DNA que codifican la molécula de DNA antisentido. Tales secuencias de DNA pueden incorporarse en una amplia variedad de vectores los cuales incorporan promotores adecuados de la RNA polimerasa tales como los promotores de polimerasa T7 o SP6. Alternativamente, las construcciones de cDNA antisentido que sintetizan RNA antisentido constitutivamente o induciblemente, dependiendo del promotor usado, se pueden introducir en líneas celulares de forma estable.

Se pueden introducir varias modificaciones a las moléculas de DNA como un medio de incrementar la vida media y estabilidad intracelular. Las modificaciones posibles incluyen, pero no se limitan a, la adición de secuencias flanqueantes de ribonucleótidos o desoxinucleótidos de los extremos 5' y 3' de la molécula o el uso de forforotioato o 2'O-metil más que los anclajes de la fosfodiesterasa en el armazón de oligodesoxirroibonucleótidos.

5.5 Usos del C100-R, DNA y líneas celulares modificadas

El DNA C100-R, oligonucleótidos antisentido y ribozimas, productos de expresión APP-R, anticuerpos y líneas célulares modificadas descritas anteriormente en este documento tienen un número de usos para el diagnóstico y el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

Por ejemplo, la secuencia de DNA C100-R se puede usar en ensayos de hibridación de biopsias y autopsias para diagnosticar anormalidades de expresión de C100-R; por ejemplo, análisis mediante Southern o Northern, incluyendo ensayos de hibridación in situ. En aplicaciones terapéuticas, las moléculas antisentido o ribozimas diseñadas sobre la base de la secuencia de DNA de C100-R, pueden usarse para bloquear la transcripción y expresión del producto del gen C100-R. Alternativamente, el DNA de C100-R puede usarse en aproximación a la terapia génica para introducir el gen recombinante normal dentro de las células defectivas de un individuo o para corregir una mutación endógena para reconstitutir en C100-R y su función.

En otra realización de la invención, los anticuerpos específicos para la C100-R pueden usarse para determinar el patrón de expresión del receptor en tejido de biopsia, o para diagnostico in vivo por reflejo; en tales aplicaciones, los anticuerpos "neutralizantes" pueden preferirse. Por ejemplo, un anticuerpo conjugado con un compuesto reflejo puede administrarse a un paciente para "mapear" la localización y distribución del C100-R in vivo.

En otra realización de la invención, el APR-R por sí mismo, o un fragmento que contiene su sitio de unión al \betaAPP-C100, se pudo administrar in vivo. El C100-R libre del fragmento peptídico puede unirse competitivamente al \beta-APP e inhibir su interacción con el receptor nativo in vitro.

En otra realización más de la invención, las líneas celulares modificadas que expresan la C100-R entera o sus dominios de unión a ligando pueden utilizarse para investigar e identificar agonistas o antagonistas activos de J3APP-C100. Alternativamente, las líneas celulares de que expresan endógenamente el C100-R pueden usarse para este propósito; por ejemplo, se pueden usar las líneas celulares de neuroblastoma tales como SK-N-MC como se ponen de ejemplo aquí. Los péptidos derivados de \betaAPP, otros péptidos, compuestos sintéticos, productos naturales, y otras fuentes de materiales potencialmente activos biológicamente pueden investigarse de las siguientes maneras. La habilidad de un compuesto prueba para inhibir la unión de \betaAPP-C100 (el cual se puede marcar por ejemplo, con ^{35}Met o una secuencia "señal" o detectada con anticuerpos al péptido) al C100-R, y así se puede medir su potencial para actuar o bien como agonista o bien como antagonista. Se pueden usar como una fuente del receptor o bien los homogenados de células completas que expresan C100-R o bien fracciones subcelulares. La unión puede medirse mediante el uso de técnicas de unión estándar a receptor, tales como aquellas descritas en la Sección 6.1.3. La habilidad de los agentes para prevenir, o imitar, los efectos de \betaAPP-C100 en las respuestas de transducción de señales en las células que expresan C100-R se puede medir. Por ejemplo, las respuestas tales como cambios en las concentraciones citosólicas de calcio, activación de las proteínquinasas específicas, secreción alterada de hormonas o neurotransmisores, modulación de la producción de segundos mensajeros, o cambios en el metabolismo celular pueden monitorizarse. Estos ensayos pueden llevarse a cabo en células completas o preparaciones de membrana mediante el uso de técnicas convencionales desarrolladas para esos propósitos. En las células o líneas celulares modificadas que responden a los efectos tóxicos \betaAPP-C100, la habilidad de las sustancias para inducir o prevenir la toxicidad se puede medir. La toxicidad puede monitorizarse como se describe en la literatura (Yankner et al., 1989, Science 245: 417-420), o mediante otras técnicas establecidas.

Los animales transgénicos que contienen el DNA C100-R como el gen transferido pueden modificarse para determinar los efectos in vivo de los agonistas o antagonistas encontrados en el rastreo anteriormente mencionado en este documento o en otras, o para hacer un perfil de otros agentes que son potencialmente terapéuticos para la enfermedad de Alzheimer.

Recientemente, se han desarrollado modelos de compuestos generados por ordenador para las interacciones ligando-receptor, y en una realización específica de la invención, la información derivada de la realización de modelos por ordenador de C100-R se puede usar para diseñar agonistas o antagonistas del receptor. Los cambios hechos en las secuencias de C100-R, mediante el uso de técnicas de ejemplo para la mutagénesis dirigida a sitio, y la expresión de receptores mutantes en las líneas celulares, se pueden usar para definir además el papel funcional de las regiones y residuos particulares del receptor.

6. Ejemplos

La subsección a continuación describe la caracterización inicial de una proteína de unión APP expresada en las células derivadas de neuronas y el clonaje y secuenciación de un DNA complementario que representa parte del

\hbox{C100-R}

de rata. La secuencia de aminoácidos deducida de C100-R revela varios residuos compartidos en común entre los canales de calcio de tipo "B", los canales de calcio de rianodina, la calreticulina y las proteínquinasas Serina/Threonina quinasas. 6.1. Materiales y métodos 6.1.1. Traducción in vitro de señal-BAPP-100

La siguiente secuencia "señal" que contiene oligonucleótido se sintetizó e insertó dentro de pGEM7, ACC ATG GAC TAC AAA GAC GAT GAC GAT AAA TGC AT MET ASP TYR LYS ASP ASP ASP ASP LYS SER, (Inmunex: Prickett et al., 1989 BioTechniques 7: 580). Además, antes del codón MET, el triplete ACC proporciona una secuencia consenso para el comienzo de la traducción en eucariotas y en sitio CLAI después de la secuencia señal se añadió para el clonaje de tal forma que fue un ligando de HindIII en el extremo 5' del oligo. La construcción señal se cortó con SmaI y CLAI y el sitio CLAI se rellenó. El fragmento BgII/SmaI de \betaAPP-695 se clonó dentro de esta construcción. Se seleccionaron los clones con la orientación adecuada. Este recombinante se usó para fabricar el péptido ^{35}S- \betaAPP-C100 de dos maneras. Primero, en el sistema acoplado transcripción/traducción, Sistema Acoplado Lisado de Reticulocitos TNT (Promega Corp.). Se añadió un plásmido circular de DNA al lisado marcado en toda su longitud con ^{35}S-metionina (6 \muC_{1}) al seguir el procedimiento recomendado. Segundo, en reacciones no acopladas, el recombinante se linealizó con Spe I, y se utilizaron 5 \mug de DNA para producir RNA in vitro (\approx 20-30 \mug) seguido por el protocolo del fabricante (Promega Corp.). 1-5 \mug de este RNA se tradujeron o bien en el sistema de traducción del germen de trigo o bien en el sistema de traducción del reticulocito de conejo de acuerdo con el protocolo del fabricante (Promega Corp.). Las traducciones in vitro tienen cualquiera de las dos añadida una décima parte de su volumen de 100 mM de N-acetilglucosamina (Sigma), y se alicuotaron y congelalor a -80ºC, y se dializaron antes de usar; se alicuotaron y dializaron directamente, después se dializaron y se purificaron mediante una columna giratoria antes de usar (Boehringer-Mannheim); o se purificaron por afinidad usando el Anticuerpo Señal comercialmente disponible (de unión al anticuerpo M1 dependiente de Ca^{++}, IBI) acoplado a Affigel 10 (Biorad). La cromatografía de afinidad se llevó a cabo pasando las traducciones in vitro por la columna de Affigel 10 acoplado al anticuerpo M1 (1ml de volumen de lecho) equilibrada en PBS (120 mM de NaCl, 2,7 mM de KC1, 10 mM de tampón fosfato, pH 7,4) con 0,5 mM de CaCl_{2}. Después de un lavado concienzudo (5-10 volúmenes de columna), el péptido se eluyó de la columna con PBS con Na_{2}EDTA (2 mM). El péptido eluyó como un pico agudo de 0,7 ml. El EDTA se eliminómediante diálisis para su uso en unión o autorradiografía. La construcción señal-\betaAPP-C100 se secuenció y el producto peptídico de la traducción in vitro se analizó para averiguar su composición de aminoádcidos mediante técnicas de espectroscopia de masas para confirmar su identidad.

6.1.2. Cultivo celular

Las células PC12 (ATCC) para los ensayos de uniones dejaron crecer en RPMI1640 suplementado con un 10% de suero de caballo inactivado con calor y un 5% de suero bovino fetal. Matraces de T-175 se sembraron con 5 x 10^{5} células células/ml en 60 ml de medio de crecimiento que contiene 10 ng/ml de NGF. Una parte adicional de 60 ml de este medio se añadieron cada 2 días hasta que las células se cosecharon (usualmente a 6 días). Donde se indicó, las células PC12 se cultivaron como se ha dicho anteriormente en este documento excepto en ausencia de NGF. Las células se recogieron por centrifugación a 138 X g durante 8 minutos. El sobrenadante se descartó y el sedimento se resuspendió en 5 ml del medio de crecimiento. Las células se trituraron 3 veces a través de una aguja de 23 g acoplada a una jeringuilla de 10 cc para proporcionar una única suspensión celular o, en la mayoría de los casos, pequeños agregados celulares. La tinción de exclusión con Trypan blue indicó que por encima del 99% de las células fueron viables.

Las células SK-N-MC (ATCC) se dejaron crecer en DME suplementado con un 10% de suero de ternero. Las células SK-N-MC que se cultivaron como se describió para las células PC-12 excepto NGF no se incluyen.

6.1.3. Unión a las células

Para los experimentos de unión a \betaAPP-C100, las células PC-12 o SK-N-MC se crecieron y prepararon como se describió anteriormente en este documento, se contaron, se recogieron por centrifugación a baja velocidad (138xg), y se resuspendieron en tampón fosfato salino (PBS, pH 7,4) con un 1% de BSA y un 1% de glucosa (PGB). Un volumen de 0,08 ml de la suspensión celular, que contienen 2 x 10^{6} células, se mezclaron con 0,01 ml de ^{35}S-\betaAPP-C100 y 0,01 ml de PGB, o PGB que contiene tanto \betaAPP-C100 no marcado como su transportador. Para experimentos cinéticos y de inhibición, la concentración de ^{35}S-\betaAPP-C100 fue o bien 25 pM o bien 50 pM. Para los experimentos de saturación, la concentración de ligando varía de 15 pM a 6 nM. La mezcla se incubó a 4ºC durante 3 horas, a no ser que se indique otra cosa. Al final del periodo de incubación, las células se sedimentaron por centrifugación a 138 X g durante 90 segundos, el sobrenadante (que contiene el ligando no unido) se removió, y se añadieron 0,2 ml de PGB helado recién preparado. Las células y el tampón recién preparado se agitaron brevemente, y de nuevo se centrifugaron y suspendieron en tampón helado recién preparado como se indicó anteriormente en este documento. Finalmente, las células se sedimentaron por centrifugación, se filtraron a través de filtros (0,1%) tratados con BSA y se lavaron con enjuagues de 4-1 ml de PBS helado con un 0,1% de BSA. La duración del periodo entre la resuspensión de las células en tampón helado recién preparado y la filtración de las células fue menor de 10 minutos. En los experimentos de disociación, y para recoger una muestra de ligando unido, las células se incubaron en el tampón añadido como segundo lavado durante hasta 3 horas para permitir disociarse al ligando unido. Las células se sedimentaron entonces mediante centrifugación y el sobrenadante (que contiene el ligando unido que se ha disociado) se eliminó. Las células se relavaron y recogieron después como se describió anteriormente en este documento. La radioactividad retenida por filtros se midió mediante contaje de centelleo. La unión no específica se tomó como la que ocurrió en presencia de exceso (de 3,2 nM a 18 nM) de \betaAPP-C100. Los datos de saturación se analizaron por ordenador usando software comercialmente disponible. El modelo de unión que mejor encaja en los datos experimentales se determinó mediante la prueba F (p<0,05).

6.1.4. Autorradiografía de unión

Ratas Sprague-Dawley se sacrificaron mediante hipercapnia y se situaron en hielo hasta que sus cerebros pudieron retirarse (menos de una hora). Los cerebros se congelaron rápidamente en isopentano helado a -20ºC con hielo seco y o bien se usaron inmediatamente o bien se almacenaron a -80ºC hasta su uso. Los cerebros se añadieron al receptor de especimenes de un criostato y se recogieron 25 \muM de cortes anteroposteriores partiendo de la zona de la coronilla sobre portaobjetos de microscopio recubiertos de gelatina. Los cortes se congelaron durante toda una noche a -80ºC o se usaron inmediatamente. Los cortes se secaron por aire a 4 grados y después se preincubaron con el tampón de unión (PBS, con 1% de BSA) durante 30 minutos a 4ºC. Este tampón se reemplazó por tampón recién preparado que contenía o bien el ligando solo (0,01 nM de ^{35}S-\betaAPP-C100) o bien el ligando con \betaAPP-C100 no unido o su portador con un exceso de hasta 10 veces. La incubación se continuó durante 3 horas a 4ºC. El tampón conteniendo ligando se eliminó entonces y los cortes se lavaron dos veces con tampón recién preparado (15 minutos y 1 minuto, a 4 grados). Los cortes se sumergieron dentro de agua destilada helada 10 veces y se secaron bajo una corriente de aire a temperatura ambiente. Los cortes se situaron después contra una lámina de película de rayos X durante un periodo de 1 a 14 días y la película se reveló. Algunos cortes se tiñeron con Cresyl violeta para la identificación de la región cerebral. Las densidades ópticas de las regiones de las autorradiografías se determinaron cuantitativamente usando un sistema de análisis de imagen.

6.1.5. Rastreo para hallar el cDNA de C100-R mediante expresión de clones

El cDNA se construyó a partir de mRNA de cerebro de embrión de rata de 18 días de acierdo con el protocolo de Neve et al. (1986; delineado en detalle por Klicstein y Neve en Current Protocols in Molecular Biology). Las bibliotecas de \lambdag11 (biblioteca de cDNA del cerebro de rata, R.L. Neve; librería de cDNA del cerebro humano, Clontech) se plaquearon en células de E. coli Y1090 a 150.000 pfu/150 mm de placa. Las placas se incubaron a 42ºC durante 3 horas, tiempo justamente al cual las placas fueron visibles. Las placas se cubrieron con filtos de nitrocelulosa de 132 mm de Schleicher y Schuell los cuales se han saturado con 10 mM de IPTG (isopropil-\beta,D-tiogalactosidasa) y se han secado ligeramente al aire. Las placas se dejaron a 37ºC durante 3 horas, y el primer filtro se eliminó y se puso en TBS (50 mM de Tris, pH 7,7, 150 mM de NaCl). Un segundo filtro de nitrocelulosa duplicado empapado con IPTG se situó en la superficie de la placa y se dejó durante 2 horas. El segundo filtro se eliminó y se situó en TBS. Se permitió a los filtros situarse en TBS sin agente bloqueante durante al menos 12 horas y hasta 4 días para permitir su repliegue. Los filtros se bloquearon en TBS con un 5% de leche desnatada no grasa durante periodos que varían entre dos horas y toda una noche. Los filtros se lavaron en tampón de unión (50 mM de Tris-HCl, pH 7,7, 50 mM de NaCl, 2 mM de MgCl_{2}, 1mM de ditiotreitol). Los filtros se incubaron con ^{35}S-\betaAPP-C100 traducido in vitro a 3 nM durante dos horas a 4ºC. Se usaron tres lavados de tres minutos (a 4ºC) para eliminar el péptido marcado no unido: (i) tampón de unión olo, (ii) tampón de unión + NP40 al 0,1%, y (iii) tampón de unión. Los filtros se eliminaron inmediatamente del lavado y se secaron al aire. Los filtros procesados se expusieron a una película X-OMAT RP con una pantalla a -70ºC durante de 6 días a dos semanas. Se halló que las placas húmedas fueron necesarias para conseguir suficiente proteína/placa para lograr una señal significativa. Además, durante todo el procedimiento fue necesario plaquear muchos más fagos de los que se requieren rutinariamente en la etapa de purificación comparable de purificación de sondas para ácidos nucleicos. Incluso cuando una población de fagos pura de "placa" que contiene el sitio de unión a proteína de \betaAPP-C100 se plaqueó como se describió anteriormente en este documento, sólo un pequeño porcentaje de las placas unieron al \betaAPP-C100, debido posiblemente al requerimiento de un plegamiento apropiado para la unión.

Los filtros duplicados se compararon para identificar placas que expresan proteína la cual se une al ^{35}S-\betaAPP-C100. Las placas positivas se escogieron y tomaron a lo largo de muchas rondas de unión y purificación. Se requirieron 6 rondas de aislamiento para obtener un único clon positivo a partir de una biblioteca de cDNA de cerebro de rata. Este clon de rata se designa como \lambdaAB1R. Se requirieron cinco rondas de aislamiento para aislar cinco clones positivos de una biblioteca de cDNA de cerebro humano.

\newpage

El inserto de \lambdaAB1R se subclonó mediante amplificación con PCR usando cebadores de secuenciación \lambdagt11 los cuales incluyen sitios de enzimas de restricción (Sal I y Not I). El fragmento amplificado se purificó, se cortó por las enzimas de restricción por las instrucciones del fabricante y se subclonó en Bluescript cortado con Sal I/Not I (SK+, Stratagene). El subclon de rata se designó pAB1R-rata.

Se desarrolló una segunda estrategia de clonaje usando el anticuerpo disponible comercialmente frente a la marca "señal". Las bibliotecas se plaquearon, los transportes de filtros se produjeron, procesaron, sondaron, y lavaron como se describió anteriormente en este documento con la excepción de que el \betaAPP-C100 no se marcara con ^{35}S-metionina. Los filtros se examinaron después con un anticuerpo antiseñal comercial a 10 \mug/ml (M2, IBI) en TBS. El exceso de anticuerpo se eliminó mediante tres lavados de 10 minutos en TBS (a 4ºC), con la disolución del medio de lavado suplementada con 0,1% de NP40. Los filtros se incubaron con un seguindo anticuerpo, anticuerpo de cabra anti IgG de ratón (cadena pesada y ligera) conjugado con biotina (NEN) de la misma manera que con el primer anticuerpo. Después del lavado, los filtros se incubaron con [^{125}I]-avidina (NEN) a 0,5 \muCi/ml en tampón de unión como se describió anteriormente en este documento. Los tres últimos lavados fueron en TBS con el medio de lavado que incluye 0,1% de NP40. Los filtros se secaron al aire, y se expusieron a una película XOMAT-RP con pantalla a -70ºC durante de 6 d a tres semanas. Las autorradiografías de los filtros se compararon a los duplicados. Las placas positivas se escogieron y se llevaron a través de muchas rondas de rastreo.

Fagos que contenían la parte conocida de la proteína de unión a \betaAPP-C100 se clonaron tanto mediante el procedimiento directo como mediante el procedimiento anticuerpo-señal. Estos cDNAs se han subclonado y se secuencian.

6.1.6. Caracterización de cDNA

Los cDNAs se subclonaron o bien dentro de vectores plásmidos de un gran número de copias y se transformaron dentro de bacterias o bien se amplificaron directamente a partir de los fagos recombinantes mediante la reacción en cadena de la polimerasa. En el caso antiguo, una "miniprep" de DNA de doble cadena se secuenció usando Sequenase (U.S. Biochemicals); en el último caso, los productos de PCR se purificaron y secuenciaron con el sistema de purificación de femtomole (Promega).

La secuenciación de los clones se hizo mediante metodología dideoxi estándar (Sequenasa; USBiochem). El análisis por ordenador se hizo principalmente con GenePro (Riverside Scientific Enterprises) y PCGene (Intelligenics).

Transferencias Southern de DNA humano o DNA de rata (PC12) se probaron con un fragmento de 260 bp marcado por ^{32}P (EcoRI/ScaI) que representa el extremo 5' del cDNA del AB1R. Se cortaron 8 \mug de DNA con varias enzimas de restricción, corridas en un gel de agarosa al 0,8%, y se transfirió a nylon o nitrocelulosa.

El análisis de Northern se llevó a cabo sobre el total del RNA aislado con el procedimiento de tiacianato de guanidio (Chirgwin et al., 1979, Biochemistry, 18, 5294). Los geles de gloxal, los geles de agarosa-formaldehído y las "transferencias por puntos" se utilizaron para cuantificar y evaluar el RNA bajo diferentes condiciones y a partir de diferentes fuentes (Tanzi et al., 1987, Science 235: 880-884; Tanzi et al., 1988, Nature, 331: 528-530). Se corrió en el gel el RNA de las células PC12 tratadas con factor de crecimiento nervioso durante varios periodos de tiempo, el RNA de cerebros de pacientes con enfermedad de Alzheimer o síndrome de Down, el RNA de subregiones cerebrales, el RNA de varios estados de desarrollo, etc. Las muestras de cerebros de pacientes con enfermedad de Alzheimer o síndrome de Down se obtuvieron del Departamenteo de Patología del Children's Hospital (Boston) y de los Recursos de Tejidos Cerebrales del McLean Hospital.

Un lisógeno del cDNA AB1R de 1985 pares de bases en \lambdagt11 se construyó en Y1089 mediante infección de las bacterias Y1089 con el fago recombinante a una relación molar de 10.000:1 e identificación de clones sensibles a temperatura de las bacterias no lisadas. El lisógeno se indujo con calor e IPTG, y la célula lisada resultante se resuspendió en tampón de muestras del gel Laemmil. Una parte de la muestra se sometió a electroforesis en PAGE al 10%, se transfirió a nitrocelulosa, y se incubó a concentraciones sucesivamente más diluidas de urea en PBS-Tritón-X a 4ºC a dos días tras el procedimiento de Kageyama y Pastan (1989, Cell 59: 815). La unión a ^{35}S-\betaAPP-C100 se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo que se usa para aislar el clon AB1R de las bibliotecas de cDNA, con el cambio de que se usó PBS en vez de TBS.

El inserto de cDNA de \lambdaABR1R se subclonó en el vector de expresión de mamíferos pCDNA1 en orientación antisentido, y las células PC12 se transfectaron por electroporación. Estas células pasajeras se dejaron crecer en medio DME durante 3 días, se trataron con NGF y se sometieron a pruebas sobre su capacidad para unir \betaAPP-C100 marcada con ^{35}S. Las células transfectantes estables se seleccionaron mediante la inclusión de G418 en el medio y las células resistentes a neomicina se probaron subsiguientemente en el ensayo de unión para determinar su capacidad de unir \betaAPP-C100 marcado tras el tratamiento con NGF.

6.1.7. Hibridación in situ mediante el uso de una sonda de la proteína de unión \betaAPP-C100

Las sondas de hibridación se prepararon mediante el marcado de la construcción pAB1R de rata linealizada en varios sitios de restricción. Las sondas de RNA antisentido se hicieron a partir del plásmido linealizado en el sitio BamHI usando el promotor T7 de Bluescript. Las sondas se fabricaron de varias formas. La transcripción in vitro se usó para producir sondas de RNA. El RNA se marcó o bien con ^{35}S-UTP (reactivos Promega) o UTP-Digoxigenina (reactivos Boehringer-Mannheim). Las sondas de DNA marcadas con digoxigenina se produjeron mediante PCR (Lanzillo<, 1991; M. McKenna y J. Carson, comunicación personal); los cebadores de PCR se fabricaron para producir los fragmentos apropiados (Genosys Biotechnologies, Inc.).

Los cortes para la hibridación in situ se prepararon de la misma manera que para una autorradiografía de unión, usando sólo condiciones libres de RNAsa. De forma previa a la hibridación, se proporcionó a los cortes dos lavados de 3m con tampón fosfato (0,1 M) que contienen glicina (0,75 g/ml) seguidos por dos lavados de 15 m sólo con tampón fosfato. Después se trataron con proteasa K (1 \mug/ml en 15 mM de Tris-HCl, pH 7,5 y 15 mM de EDTA) durante 30 m a 37ºC y se lavaron con anhídrido acético (0,25% en 0,1 M de trietanolamina, pH 7,5) durante 10 m. Esto se siguió por dos lavados de 15 m con SSC (0,15 M de NaCl, 0,015 de citrato de sodio, pH 7,0) a dos veces su concentración normal (2X), mediante la eliminación de las grasas con EtOH y cloroformo, y secado al aire. La sonda de hibridación, preparada como se describió anteriormente en este documento, se situó entonces sobre los cortes y la disolución de hibridación y se unió a los cubreobjetos con cemento de goma. La hibridación se llevó a cabo durante toda una noche a 60ºC. Los cubreobjetos se eliminaron entonces y los cortes se lavaron dos veces durante 30 m a 60ºC con 4X SSC suplementado con 300 mM de BME. Al continuar con esto, se trataron con RNAsa (20 \mug/ml en SSC 2X, 20 m BME) durante 30 m a 45ºC. Los cortes se lavaron entonces cuatro veces con SSC 2X (60 m, 30 m, 30 m, y 30 m a 60ºC), se lavaron una vez con SCC 1X (30 m, 60ºC), y se dejaron reposar durante 1 noche en 2X SCC. El día siguiente los cortes fueron rápidamente enjuagados en 0,05 M de tampón fosfato y después en agua destilada. Se secaron al aire y se pusieron en contacto con película de rayos X. Las películas se revelaron entre 1 d y dos semanas después, y se usaron para establecer la distribución de la sonda hibridada de forma general. La localización más precisa de la sonda se consiguió recubriendo los cortes con una fotoemulsión y procediendo después a revelar la emulsión y medir las densidades de grano sobre los cuerpos celulares en varias regiones cerebrales.

6.1.8. Clonación del APP-4 de rata en toda su longitud

Con el fin de obtener el C100-R en toda su longitud, las bibliotecas de rata se investigan con varias sondas fabricadas a partir de pAB1R de rata. Estas sondas son específicas para la mayoría de la secuencia 5' del clon de rata. Después de que está disponible más secuencia de rata, las rondas subsiguientes de rastreo utilizarán sondas específicas para la mayoría de la secuencia 5' disponible a cada ronda de rastreo. Además, se construyó una segunda biblioteca de cDNA de cerebro de rata en \lambdaZAP (Stratagene) con un cebador específico para la región 5' del inserto de CDNA. La biblioteca se construyó usando el protocolo RACE (abreviatura en inglés de amplificación rápida de extremos de cDNA) (Frohmann et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998-9002) con las siguientes modificaciones: (1) la síntesis de cDNA se cebó con AB1RT3-1 o con AB1RT3-3, específicos para el 3' UTR del mRNA de AB1R, en lugar del oligo(dT); (2) el mRNA se desnaturalizó con hidróxido de metil-mercurio antes de la síntesis de DNA; (3) la transcriptasa inversa de MMLV ("Superscript", Bethesda Research Labs) se usó en lugar de la transcriptasa inversa de AMV; (4) no se anclaron adaptadores en vez de ligandos de EcoRI a los extremos de los cDNAs de forma que no fue necesaria ninguna digestión subsiguiente antes de la clonación. Los cDNAs se clonaron dentro de los Notl digeridos, y se rellenaron parcialmente en \lambdaZAP II, para fabricar dos bibliotecas de aproximadamente 10^{5} clones de cDNA cada una. Esta biblioteca se investigará con sondas específicas para la mayoría de la secuencia 5' disponible a cada ronda de clonación.

Otra aproximación para clonar en toda su longitud el gen será usar tecnología PCR. Mediante el uso de RNA mensajero de hipocampo usaremos un cebador específico para el extremo 5' del inserto de cDNA y llevaremos a cabo la reacción de la transcriptasa inversa. Después, el híbrido RNA/DNA se "prolongará en una cola" con guaninas mediante la transferasa terminal, el RNA se digerirá con RNAsa H y la segunda hebra se cebará con un cebador de poli-C. Mediante el uso de cebadores con sitios de restricción incorporados dentro de ellos, estos cDNAs específicos de clon se clonarán y secuenciarán. El procedimiento se repetirá a través de múltiples rondas hasta que la secuencia entera de 11 kb se haya conseguido (Frohmann et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 85: 8998-9002).

6.2. Resultados 6.2.1 Unión de radioligando

Debido a que \betaAPP-C100 es tóxico para las células PC12 diferenciadas mediante NGF, probaremos la unión del fragmento de \betaAPP-C100 sintetizado in vitro en las uperficie de células PC12 que han sido tratadas con NGF (Kozlowski et al., 1992, J. Neuroscience 12: 1679). La unión de ^{35}S-\betaAPP- C100 a las células PC12 diferenciadas fue inhibible por \betaAPP-C100 no marcado (fig. 1A). Se obtuvieron resultados similares con la línea celular del neuroblastoma , SK-N-MC (véase fig. 1B).

En las células PC12 tratadas con NGF, la fracción inhibible fue 1,7 \pm 0,7 nM (n=5). La unión inhibible alcanzó un máximo después de tres horas de incubación y fue completamente disociable (fig. 2). Los experimentos de saturación indicaron la presencia de una sola clase de sitios de unión con un valor de K_{d} de 0,81 \pm 0,37 nM, en concordancia aproximada con el valor IC_{50} determinado anteriormente en este documento, y un valor de B_{máx} de 0,37 \pm 0,05 fmoles/10^{6} células. La unión de ^{35}S-\betaAPP-C100 a las células PC12 diferenciadas no se inhibió significativamente por otros péptidos, incluyendo un número de tachiquininas. En cortes de cerebro de rata, los niveles más altos de unión específica se hallaron en regiones del hipocampo y el tubérculo olfatorio.

La cantidad de unión inhibible de ^{35}S-\betaAPP-C100 fue dependiente de la duración de la exposición de las células PC12 al NGF. Las células PC12 que no se expusieron al NGF mostraron menos unión inhibible, mientras que aquellas cultivadas en presencia de NGF durante 4 ó 6 días mostraron progresivamente mayores cantidades de unión. Otra variable que afectó a la unión fue el pH. La cantidad máxima de unión ocurrió a pH 7. La unión fue sólo el 25% del máximo a pH 6 y sólo el 52% del máximo a pH 8,5.

Para evaluar la estabilidad de ^{35}S-\betaAPP-C100 en las condiciones de ensayo, se examinaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (PAGE) muestras tanto de ligando libre al final del periodo de incubación (no ligado) como de ligando que se ha unido a las células y ha sido liberado. Antes de añadirse al ensayo, la mayoría de la radiactividad estaba contenida en una única banda con un peso molecular aparente de 15 kDa. Esto representa el monómero \betaAPP-C100. Una pequeña cantidad de material estuvo presente también en dos bandas adicionales difusas. Una cantidad migró a aproximadamente dos veces el peso molecular de la banda principal y posiblemente representa un dímero de \betaAPP-C100. La otra banda tuvo un peso molecular mucho más elevado y puede ser un agregado. El perfil en el gel del ligando no unido al final del periodo de incubación fue idéntico a aquel del ligando antes de la incubación, lo que indica que el ligando no se ha degradado. De forma similar, el ligando liberado de la unión tuvo el mismo perfil que el ligando añadido originalmente, con la posible excepción de una ligera reducción en la cantidad de material de alto peso molecular. Estos datos muestran que la unión del ligando \betaAPP-C100 no causa su modificación.

Una mutación de la tirosina en \betaAPP-C100, hecha para examinar la importancia de una secuencia consenso para fosfotirosina (Tyr_{687} a Phe), produjo un péptido que no fue tóxico para las células PC12 diferenciadas. Phe_{687}- \betaAPP-C100 no inhibe significativamente la unión a concentraciones de hasta 14 nM (n=3), lo que lo hace un ligando al sitio de unión de \betaAPP-C100 al menos 20 veces menos potente que la forma nativa.

6.2.2. Clonaje y caracterización del C100-R

Las señales autorradiográficas de la unión del ^{35}S-\betaAPP-C100 a las placas de \lambdagt11 inducidas a expresar proteína en el ciclo lítico tardío fueron atípicas y variables. Usamos la película de alta resolución XOMAT-RP y exposiciones largas con el fin de establecer duplicados claros en las autorradiografías (figura 3).

El tamaño del inserto de cDNA en el clon de rata, \lambdaAB1R, fue de 1970 pares de bases. La secuencia completa se da en la figura 4 (SEQ. ID. Nº^{s}: 1-2). La secuencia dada incluye una parte del gen \beta-gal derivado de los vectores \lambdagt11 y Bluescript. El marco de lectura abierto del clon no está en el mismo registro que el gen \beta-Gal, de tal forma que el clon está expresándose como una proteína de no fusión. El ATG en la posición 175 tiene una secuencia adyacente ocho pares de bases más adelante que serviría como un sitio de unión ribosomal de E. coli, -AGAAA (el sitio canónico es AGGA). La traslación de la iniciación del marco de lectura abierto en esa metionina produciría una proteína de 407 aminoácidos con un peso molecular de 45.253 D. Tal expresión probablemente sería un producto de reiniciación y se ha destacado previamente durante la expresión de una proteína de no fusión de 100 kD (Yang, C.H., Lambie, E.J. y Zinder, M. J. de Cell Biology 116: 1303-1317). El análisis de secuencia ha revelado que el clon contiene 1349 pares de bases de la sección carboxiterminal del gen (1395 menos la secuencia \beta-Gal) y 575 pares de bases de la región 3' no traducida. El análisis de secuencia de ácidos nucleicos muestra homología con los canales de calcio de tipo "B", el canal de calcio de rianodina, y una proteína de unión a calcio de alta afinidad, la calreticulina (figura 5). El análisis de la proteína de secuencia traducida revela varios sitios potenciales de fosforilación (varios sitios diana de quinasas, incluyendo proteínquinasas dependientes de cAMP y cGMP, proteínquinasa C, caseína quinasa II), sitios potenciales de N-.glicoxilación, sitios potenciales de N-myr-istoilación, sitios de sulfatación de tirosina, y una firma específica de serina/treonina proteínquinasa. Esta "firma" de la ser/thr quinasa o secuencia de núcleo catalítico conservada se halla en el clon AB1R de 246-258 en la secuencia traducida figura 4). La firma se adecua al patrón consenso -[LIVMFYC]-x-[HY]-D[LIVMFY]K-X(2)-n-[LIVMFC] hallado por Hunter y sus colegas (Hanks, S.K., Quinn, A.M., y Hunter, T. (1988), Science, 241, 42-52). En el clon de rata AB1R la secuencia es V-I-H-R-D-I-K-S-D-N-I-L-L. (Figura 4).

Un número de clones de cDNA adicionales de rata se aislaron y secuenciaron (fig. 9). La nueva información de secuencia abarca, en la región 5', la región codificante de C100-R representada en la figura 4. El nucleótido 686 mencionado anteriormente en este documento en la figura 9 representa el empalme con la secuencia de rata dibujada en la figura 4 en el nucleótido 40.

Análisis de Northern demostraron que el RNA mensajero correspondiente a este cDNA se expresa altamente por todo el cerebro. El cDNA se híbrida a una banda prominente a 11 kb y más débilmente a bandas a aproximadamente 3 kb. Hay una banda de hibridación inducible por NGF en las células PC12 a 9,5 kb. También hay una banda de 4,4 kb en las células PC12 que aparece con el cultivo prolongado, de la misma forma que con tratamiento con NGF. Estas bandas más débilmente hibridadas de menor peso molecular pueden representar hibridación cruzada de los RNAs mensajeros que codifican para moléculas como calreticulina las cuales demuestran homología a nivel de ácidos nucleicos. El análisis de Northern de RNA de cerebros con la enfermedad de Alzheimer indican que la proteína de unión \betaAPP-C100 no se expresa a más alto o más bajo nivel que en controles.

El análisis de Southern de DNA genómico de ratas y humanos demostró que el cDNA AB1R híbrida a un pequeño número de bandas, lo cual es consistente con el AB1R representando un gen de copia única (figura 6). Una banda fuertemente hibridada 3,0 kb se observó de igual forma que dos bandas hibridadas más débilmente, una a 8,5 kb y una banda de alto peso molecular entre 25 y 30 kb, dependiendo de la especie.

6.2.3. Hibridación in situ

En un corte de cerebro de rata, los niveles de hibridación mayores que los antecedentes fueron obvios sólo en el hipocampo y en el tubérculo olfatorio (figura 8). Esto está de acuerdo con la distribución de sitios de unión como se determinó autorradiográficamente (fig. 7).

7. Ejemplo

Clonaje de C100-R humano

Una biblioteca de cDNA del hipocampo de humano adulto en lambda ZAP 11 (Stratagene) se investigó mediante el uso de un fragmento marcado del inserto del cDNA de C100-R de rata. El fragmento marcado está representado como el fragmento EcoRI, del nucleótido 31 al 409, en la figura 9. El fragmento EcoRI de C100-R de rata se marcó usando una reacción de iniciación aleatoria, y la biblioteca se investigó bajo condiciones restrictivas usando procedimientos empleados rutinariamente por alguien experto en la técnica. Para una revisión de estrategias de rastreo, véase por ejemplo Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y. Se obtuvieron varios clones que variaban entre las 600 y las 1500 pares de bases en longitud. Los resultados de la secuenciación parcial del clon de 1500 pares de bases se muestran en la figura 11. Las regiones de homología de secuencia entre la secuencia humana de C100-R y la secuencia de rata de C100-R se dibujan en la figura 12.

8. Depósito de microorganismos

Los siguientes microorganismos se han depositado en la American Type Culture Collection, (abreviadamente ATCC), Rocville, Maryland, y se les han asignado los siguientes números de acceso:

Microorganismo	Fecha de depósito	Número de acceso
pABIR-rata	Agosto 7, 1992	69047

La presente invención no se ve limitada en su ámbito por los microorganismos depositados dado que las realizaciones depositadas se desean como ilustraciones de aspectos concretos de la invención, y cualesquiera microorganismos que sean funcionalmente equivalentes están dentro del ámbito de la invención.

La presente invención no se ve limitada en su ámbito por las realizaciones ejemplificadas, las cuales se desean como ilustraciones de aspectos concretos de la invención, y cualesquiera clones, secuencias de DNA o aminoácidos los cuales son funcionalmente equivalentes están dentro del ámbito de la invención. De hecho, además están dentro del ámbito de la invención varias modificaciones de la invención para aquellos expertos en la técnica realizadas a partir de la descripción precedente y dibujos acompañantes. Tales modificaciones se desea que entren dentro del ámbito de las reivindicaciones adjuntas.

También se entiende que todos los tamaños de pares de bases dados para los nucleótidos son aproximados y se usan para los propósitos de la invención.

(Formulario pasa a página siguiente)

1

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Manly, S., et al.

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Clonación y Expresión Del Receptor de BAPP-C100 (C100-R)

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 2

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(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: Pennie & Edmonds

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(B)

CALLE: 1155 Avenue of the Americas

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(C)

CIUDAD: New York

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(D)

ESTADO: New York

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(E)

PAÍS: U.S.A.

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(F)

ZIP: 10036-2711

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(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

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(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: Patente En Publicación #1.0. Versión #1.25

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUALES:

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(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD:

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE ARCHIVO:

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

INFORMACIÓN DEL NOTARIO/FUNCIONARIO:

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(A)

NOMBRE: Misrock, S. Leslie

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 18.872

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

REFERENCIA/NÚMERO DEL CERTIFICADO: 6013-094

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

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(A)

TELÉFONO: 212 790-9090

\vskip0.333000\baselineskip

(U)

TELEFAX: 212 869-9741

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TELEX: 66141 PENNIE

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

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(A)

LONGITUD: 1971 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B)

LOCALIZACIÓN: 1..1395

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 1:

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2

3

4

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

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(A)

LONGITUD: 465 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(C)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 2:

5

6

Claims (40)

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína C100-R que comprende el ácido nucleico de la SEQ ID Nº: 1 (figura 4).

2. Un ácido nucleico aislado y purificado en cual es capaz de hibridar bajo condiciones restrictivas con el ácido nucleico C100-R de la SEQ ID Nº: 1, y el cual codifica para un péptido o polipéptido C100-R que se une al péptido \beta-APP-C100, en el que dichas condiciones estrictas de hibridación son una fuerza iónica controlada y/o una temperatura controlada.

3. Un ácido nucleico aislado y purificado que comprende cualquiera de los ácidos nucleicos HABIR #1 #4, #1 #1 T3, o #4.t3 de la figura 11.

4. Un vector recombinante que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1, 2 ó 3.

5. Un vector recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión C100-R, dicho ácido nucleico comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1, 2 ó 3 unido a un ácido nucleico heterólogo.

6. El vector recombinante de la reivindicación 4 en el cual el ácido nucleico C100-R está operativamente asociado con una secuencia regulatoria que controla la expresión génica en una célula hospedadora.

7. El vector recombinante de la reivindicación 5 en el cual el ácido nucleico de la proteína de fusión C100-R está operativamente asociado con una secuencia regulatoria que controla la expresión génica en una célula hospedadora.

8. El ácido nucleico de la reivindicación 1, 2, 4, 5, ó 6 en el cual la secuencia C100-R se codifica de forma natural en células de ratas o células derivadas de ratas.

9. El ácido nucleico de la reivindicación 2, 4, 5, ó 6 en el cual la secuencia C100-R se codifica de forma natural en células humanas o células derivadas de humanos.

10. Una célula hospedadora modificada por ingeniería que contiene el vector de DNA recombinante de la reivindicación 4, 5, 6 ó 7.

11. Una línea celular modificada por ingeniería que contiene el vector de expresión del DNA recombinante de la reivindicación 6 y expresa un péptido o polipéptido C100-R que se une al péptido \betaAPP-C100.

12. La línea celular modificada por ingeniería de la reivindicación 11, la cual expresa el C100-R sobre la superficie de la célula.

13. La línea celular modificada por ingeniería de la reivindicación 11 ó 12 la cual expresa el C100-R humano.

14. Una línea celular modificada por ingeniería que contiene el vector de expresión de DNA recombinante de la reivindicación 7 y expresa una proteína de fusión C100-R que se une al péptido \betaAPP-C100.

15. La línea celular modificada por ingeniería de la reivindicación 14 que expresa la proteína de fusión C100-R sobre la superficie de la célula.

16. La línea celular modificada por ingeniería de la reivindicación 14 ó 15 la cual expresa una proteína de fusión C100-R en la que el ácido nucleico que codifica la proteína C100-R de la proteína de fusión se codifica de forma natural en células humanas o en células derivadas de humanos.

17. Un procedimiento para producir C100-R recombinante, que comprende:

a)

cultivo de una célula hospedadora transformada con el vector de expresión de DNA recombinante de la reivindicación 6 y el cual expresa un péptido o polipéptido C100-R que se une al péptido \betaAPP-C100; y

b)

recuperación del producto del gen C100-R del cultivo celular.

18. El procedimiento de la reivindicación 17 en el cual se produce un C100-R que se codifica de forma natural en unas células humanas o derivadas de humanos.

19. Un procedimiento para producir una proteína recombinante de fusión C100-R, que comprende:

a)

cultivo de una célula hospedadora transformada con el vector de expresión de DNA recombinante de la reivindicación 7 y el cual expresa una proteína de fusión C100-R que se une al péptido \betaAPP-C100; y

b)

recuperación del producto del gen C100-R del cultivo celular.

20. El procedimiento de la reivindicación 17 en el cual se produce una proteína de fusión C100-R en la que el ácido nucleico que codifica la proteína C100-R de la proteína de fusión se codifica de forma natural en células humanas o células derivadas de humanos.

21. Una C100-R aislada y purificada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2 (figura 4).

22. Una proteína C100-R aislada y purificada que se da de forma natural en mamíferos que se codifica mediante un ácido nucleico que hibrida bajo condiciones restrictivas con el ácido nucleico de la SEQ ID Nº 1 y une al péptido \betaAPP-C100.

23. Un péptido o polipéptido C-100R de mamífero aislado y purificado que se codifica mediante un ácido nucleico de secuencia SEQ ID Nº 1 y se une al péptido \betaAPP-C100.

24. Una proteína de fusión que comprende un péptido o polipéptido C100-R que se codifica mediante un ácido nucleico que hibrida bajo condiciones restrictivas con el ácido nucleico de la SEQ ID Nº: 1 y se une al péptido \betaAPP-C100, unido a un polipéptido heterólogo.

25. Una proteína de fusión que comprende un péptido o polipéptido C100-R de mamífero que se codifica mediante un ácido nucleico que hibrida bajo condiciones restrictivas con el ácido nucleico de la SEQ ID Nº: 1 y se une al péptido \betaAPP-C100, unido a un polipéptido heterólogo.

26. Una proteína aislada y purificada que contiene una secuencia del núcleo catalítico conservado de serina/treonina quinasa de C100-R que comprende los siguientes aminoácidos: VIHRDIKSDNILL (aminoácidos 304-316 de la SEQ ID Nº 2); proteína que une al péptido \betaAPP-C100.

27. Un péptido o polipéptido C100-R aislado y purificado que contiene una secuencia del núcleo catalítico conservado de serina/treonina quinasa de C100-R que comprende los siguientes aminoácidos: VIHRDIKSDNILL (aminoácidos 304-316 de la SEQ ID Nº 2); proteína que une al péptido \betaAPP-C100.

28. Una proteína de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 2 unida a un polipéptido heterólogo.

29. Una proteína de fusión que comprende un polipéptido C100-R aislado que comprende los siguientes aminoácidos: VIHRDIKSDNILL (aminoácidos 304-316 de la SEQ ID Nº 2); unida a un polipéptido heterólogo, proteína de fusión que une al péptido \betaAPP-C100.

30. Un oligonucleótido que codifica una secuencia antisentido complementaria con una parte del ácido nucleico de C100-R de la reivindicación 1, 2, ó 3 de tal forma que la secuencia antisentido inhibe la traducción del gen

\hbox{C100-R}

en una célula.

31. El oligonucleótido de la reivindicación 30 el cual es complementario con un ácido nucleico que codifica la región aminoterminal del C100-R.

32. Un anticuerpo monoclonal que une al C100-R de las reivindicaciones 21 a 28.

33. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 32 el cual inhibe competitivamente la unión de \betaAPP-C100 al C100-R.

34. El anticuerpo monoclonal de las reivindicaciones 32 ó 33 el cual se une al C100-R que se codifica de forma natural en células humanas o células derivadas de humanos.

35. Un procedimiento para buscar e identificar antagonistas del ligando \betaAPP-C100, que comprende:

a)

comprometer una línea celular que expresa un péptido o polipéptido C100-R de acuerdo con las reivindicaciones 21 a 25 con un compuesto prueba en presencia del ligando \betaAPP-C100; y

b)

determinar si el compuesto prueba inhibe la unión y los efectos citotóxicos del ligando \betaAPP-C100 en la línea celular,

en el cual los antagonistas se identifican como aquellos compuestos que inhiben tanto los efectos de unión como los citotóxicos del ligando \betaAPP-C100 en la línea celular.

36. Un procedimiento para buscar e identificar agonistas del ligando \betaAPP-C100, que comprende:

a)

comprometer una línea celular que expresa un péptido o polipéptido C100-R de acuerdo con las reivindicaciones 21 a 25 con un compuesto prueba en presencia del ligando \betaAPP-C100;

\newpage

b)

determinar si el compuesto prueba inhibe la unión y los efectos citotóxicos del ligando \betaAPP-C100 en la línea celular; y

c)

determinar si, en ausencia del ligando \betaAPP-C100, el compuesto prueba imita los efectos citotóxicos del ligando \betaAPP-C100 en la línea celular,

en el cual los antagonistas se identifican como aquellos compuestos que inhiben tanto los efectos de unión como los citotóxicos del ligando \betaAPP-C100 en la línea celular.

37. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 35 ó 36 en el cual la línea celular es una línea celular modificada por ingeniería mediante ingeniería genética.

38. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 35 ó 36 en el cual la línea celular expresa de forma endógena el C100-R.

39. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 35 ó 36 en el cual la línea celular es una línea celular de neuroblastoma.

40. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 39 en el cual la línea celular de neuroblastoma es

\hbox{SK-N-MC.}