ES2229208T5 - Clonación y expresión del receptor de la hormona liberadora de gonadotropina - Google Patents

Description

Clonación y expresión del receptor de la hormona liberadora de gonadotropina

1. Introducción

La presente invención se refiere a la clonación del receptor de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH-R)murina y a células huésped modificadas por ingeniería genética que expresan el GnRH-R. Tales células modificadas pueden usarse para evaluar y realizar detecciones selectivas de fármacos y análogos de la GnRH implicados en laactivación, regulación y desacoplamiento del GnRH-R.

2. Antecedentes de la invención

El GnRH-R es un mediador clave en la integración de los sistemas neurológico y endocrino. La reproducción normal depende de la liberación pulsátil de concentraciones fisiológicas de GnRH que se une a receptores hipofisarios específicos de alta afinidad y desencadena la secreción de las gonadotropinas hormona luteinizante (LH) y hormona estimuladora del folículo (FSH). Mientras que concentraciones fisiológicas de GnRH orquestan la reproducción normal, niveles elevados de agonista conducen a una respuesta opuesta, la supresión de la secreción de gonadotropina. La capacidad de los análogos de la GnRH tanto para activar como para inhibir el eje hipotálamohipofisario-gonadal ha conducido a su utilidad clínica amplia en el tratamiento de una variedad de trastornos variables desde infertilidad a carcinoma prostático.

La sensibilidad y la capacidad del GnRH-R gonadótropo se ven influidas por los agonistas, la concentración y el patrón de exposición (Clayton, 1989, J Endocrinol. 120: 11-19). En estudios tanto in vivo como in vitro se ha demostrado que la concentración pulsátil baja de la GnRH es trófica para el receptor y que una concentración elevada de agonista induce la regulación por disminución y la desensibilización del receptor. La unión de la GnRH asu receptor estimula la fosfolipasa C y genera inositol-1,4,5-trifosfato y diacilglicerol (Huckle y Conn, 1988, Endocrine Reviews 9: 387-395). Estos segundos mensajeros, a su vez, liberan calcio desde los depósitos intracelulares yactivan la proteína cinasa C. La regulación por aumento del receptor parece implicar tanto a la proteína cinasa Ccomo al calcio (Huckle y Conn, 1988, Endocrine Reviews 9: 387-395; Huckle y col., 1988, Journal of Biological Chemistry 263: 3296-3302; Young y col., 1985, Journal of Endocrinology 107: 49-56). No está claro qué efectores subyacen a la regulación por disminución.

Sealfon S., C. y col., Molecular Endocrinology, vol. 4, n.º: 1, páginas 119-124, 1990, divulgan la caracterización deun receptor de la hormona liberadora de gonadotropina en ovocitos de Xenopus en los que se había inyectado ARN aislado de la hipófisis de rata y de una línea celular de gonadotropa: !T3, un procedimiento para el fraccionamientodel ARN total de células !T3 antes de la inyección en ovocitos de Xenopus, la fracción de ARN que, tras la inyecciónen ovocitos de Xenopus, genera la respuesta máxima a la GnRH en los ovocitos y el uso de la línea de células !T3 como una fuente adecuada para la clonación del ADNc del receptor de la hormona liberadora de gonadotropina y el uso de la expresión en ovocitos de Xenopus como bioensayo.

Aunque se han hecho muchos progresos en la comprensión de los mecanismos subyacentes a la regulación ydesensibilización del GnRH-R a través de estudios de unión al receptor, la medición directa de la transcripción del gen del GnRH-R y su biosíntesis no ha sido posible. La clonación del ADNc del GnRH-R mejoraría la evaluación de la activación regulación y desacoplamiento del GnRH-R. La determinación de la secuencia primaria del receptor facilitaría el diseño dirigido de análogos mejorados. Sin embargo, a pesar del intenso interés, hasta ahora, el gen del GnRH-R no se ha clonado ni expresado en ninguna especie.

3. Resumen de la invención

La presente invención se refiere a los genes y proteínas murinos del GnRH-R. La secuencias de ADN descritas en la presente memoria descriptiva pueden introducirse mediante ingeniería genética en sistemas de expresión diseñados para la producción del GnRH-R y/o líneas celulares que expresan el GnRH-R y preferentemente responden a laseñal de transducción inducida por la GnRH. Tales líneas celulares pueden usarse de forma ventajosa para realizar detecciones selectivas de e identificar agonistas y antagonistas de la GnRH. El ADN de la GnRH, las secuencias de oligonucleótidos antisentido, los productos de expresión de GnRH y los anticuerpos frente a tales productos pueden usarse en el diagnóstico y tratamiento de trastornos reproductivos asociados con la expresión anómala del GnRH-R;por ejemplo, la sobreexpresión, la expresión disminuida o la expresión de un receptor mutante disfuncional. Los animales transgénicos que contienen el transgén GnRH-R pueden usarse como modelos animales para la evaluación de análogos de GnRH in vivo.

La aclaración de la secuencia del GnRH-R descrito en la presente memoria descriptiva refleja un avance de importancia en la endocrinología reproductiva y revela la naturaleza compleja de la transducción de señal yregulación del GnRH-R. Al contrario de la mayoría de señales hormonales, la GnRH se libera de un modo pulsátil, con la frecuencia y la amplitud de los pulsos transportando información crucial (Weiss y col., 1990, Mol. Endocrinol.

4: 557-564; Hasenleder y col., 1991, Endocrinology 128: 509-517). La capacidad de unión al GnRH-R en sí misma se regula bien por aumento o bien por disminución mediante agonistas en función de la duración de la exposición y la concentración (Loumaye y Catt., 1982, Science 215: 983-985). La utilidad clínica de los agonistas de la GnRH, que ayuda a controlar diversas enfermedades humanas, incluidas hipertrofia prostática, cáncer de próstata,endometriosis y pubertad precoz, depende de esta inducción de desensibilización hipofisaria. La clonación del GnRH-R conducirá a una mayor comprensión de la interacción compleja de las hormonas hipotalámicas, hipofisarias y gonadales, que subyace a la farmacoterapia y la reproducción.

4. Descripción de las figuras

Figura 1. Interrupción por hibridación del receptor de serotonina (5HT) y expresión del GnRH-R por oligonucleótidos antisentido. Se introdujeron en el baño en las líneas horizontales 5HT 100 nM y GnRH 200 nM. A, respuesta a 5HT y

GnRH en ovocitos en los que previamente se había inyectado una mezcla de ARN del cerebro de ratas (para larespuesta a 5HT), ARN de !T3 (para la respuesta a GnRH) y oligonucleótido antisentido del receptor 5HT1C. 16 células mostraron respuestas idénticas. B, respuesta a GnRH y 5HT en ovocitos en los que previamente se había inyectado una mezcla de ARN de cerebro de rata, ARN de !T3 y oligonucleótido antisentido WZ7. Veinticuatro células tuvieron respuestas idénticas.

Figura 2. Caracterización del clon WZ25 expresado en ovocitos. A, respuesta electrofisiológica a GnRH de ovocitosen los que se había inyectado el transcrito WZ25 en ausencia (izquierda) o presencia (derecha) de antagonista de GnRH. Los tres trazados que se muestran proceden de células diferentes. Las líneas continuas y discontinuas indican la administración de GnRH y de antagonistas de GnRH, respectivamente. Los ovocitos que no habían recibido la inyección no mostraron respuesta a GnRH (n = 12). B, desplazamiento de 125I-GnRH-A por GnRH-A yGnRH en membranas de ovocitos en los que se había inyectado el transcrito de WZ25. También se muestra una curva comparativa del desplazamiento usando membranas de células !T3-1 combinadas con membranas de ovocitos en los que no se había inyectado nada (●). Las barras de error muestran el error típico de la media.

Figura 3. Secuencias de nucleótidos (SEC ID N.º:1) y de aminoácidos deducidas (SEC ID N.º:2) del clon WZ25. La numeración comienza con la primera metionina del marco de lectura abierto de 981 pares de bases. La secuencia de aminoácidos deducida se muestra debajo de la secuencia de nucleótidos. Las regiones transmembrana I-VII posibles están subrayadas. Los símbolos que aparecen debajo de las secuencias de aminoácidos indican los sitios potenciales de N-glucosilación (▲) y los sitios de fosforilación para la proteincinasa A (♦), la caseincinasa (●) y la proteincinasa C (*)) (Hubbard e Ivatt, 1981, Ann Rev. Biochem. 50: 555-583; Kemp y Pearson, 1990, Trends Biochem, Sci. 15: 342-346; Pearson y Kemp, 1991, Meth. Enzymol. 200: 62-81; Kennelly y Krebs, 1991, J. Biol. Chem. 266: 15555-15558).

Figura 4. Gráfico de la hidrofobicidad del GnRH-R y alineación de la secuencia de aminoácidos de: GnR, receptor de la hormona liberadora de gonadotropina de ratón; ILR, receptor de la interleucina-8 humana (Murphy y Tiffany, 1991, Science 253: 1280-1283); SPR, receptor de la sustancia P de rata (Hershey y Krause, 1990, Science 247: 958-962); ∀1R, receptor ∀1-adrenérgico Frielle y col., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4851-4855). I-VII indican regiones transmembrana posibles. Los cuadros indican residuos aminoacídicos idénticos.

Figura 5. Distribución del ARNm del GnRH-R. La autorradiografía de A, ensayo de hibridación en solución con 2 #gde ARN total de hipófisis de ratón, de GT-1, de GH3 y de AtT20 y 625 ng de ARN total de !T3-1, B, análisis por la técnica northern con 3 #g de ARN poli(A)+ !T3-1 y C-F, hibridación in situ en la adenohipófisis de rata. C,autorradiografía con película de rayos X con la sonda antisentido. D, control con sonda sentido (barra de calibración = 450 #m). E,F, fotomicrografías de campo oscuro (barra de calibración = 50 #m), de campo claro (barra de calibración = 100 #m) de sección de adenohipófisis sumergida en emulsión. Los marcadores del peso molecular sonADN X digerido con Hind III.

Las siguientes figuras no muestran materia objeto que forme parte de la invención reivindicada:

Figura 6. Expresión del ADNc de GnRH-R humano en ovocitos de Xenopus.

Figura 7. Desplazamiento de la unión del agonista de [125I]GnRH a membranas preparadas a partir de células COS-1sometidas a transfección con la construcción pSV2A-GnRHR humano.

Figura 8. Efectos de la GnRH y del antagonista de GnRH sobre la producción de fosfato de inositol en células COS-1sometidas a transfección con pSV2A-GnRH-R humano.

Figura 9. Secuencia de nucleótidos y de aminoácidos posibles del GnRH-R humano.

Figura 10. Análisis mediante la técnica northern con ADNc de GnRH-R: carril 1 (T): ARN poli(A) de testículo humano; carril 2 (P): ARN poli(A) de hipófisis humana; carril 3 (A): ADNc de ∀-actina humana; carril 4 (R): ADNc del GnRH-R humano.

Figura 11. Esquema del GnRH-R humano.

5. Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a la clonación y expresión de GnRH-R murino. El GnRH-R, que desempeña unpapel central en el sistema reproductor, se caracteriza por siete dominios transmembrana característicos de receptores acoplados a proteína G, pero carece del extremo C-terminal intracelular típico. La estructura poco frecuente y el dominio regulador del GnRH-R son responsables de los aspectos únicos de la transducción de señal y de la regulación de señal mediadas por el receptor. El GnRH producido en la presente memoria descriptiva puede usarse para evaluar y realizar detecciones selectivas de fármacos y análogos de la GnRH implicados en laactivación, regulación y desacoplamiento del receptor. Como alternativa, el ADN del GnRH-R, los oligonucleótidos y/o las secuencias antisentido, o el GnRH-R, fragmentos peptídicos del mismo, o anticuerpos frente a él pueden usarse en el diagnóstico y/o tratamiento de trastornos de la reproducción.

Para mayor claridad del análisis, la invención se describe en las siguientes subsecciones a modo de ejemplo para elGnRH-R murino. Sin embargo, los principios se pueden aplicar de forma análoga para clonar y expresar el GnRH-Rde otras especies y para clonar y expresar otros receptores pertenecientes a la familia única de GnRH, es decir, tipos de receptores de proteína G que carecen del extremo C intracelular y se unen a la GnRH o a análogos de lamisma.

5.1. La secuencia codificadora del GnRH-R

La secuencia nucleotídica codificadora (SEC ID N.º: 1) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID N.º: 2) para el GnRH-R murino se representan en la figura 3. El marco de lectura abierto más largo codifica una proteína de 327 aminoácidos de un PM de aproximadamente 37.000. Están presentes tres sitios consenso de glucosilación unidos a N, dos en el extremo N-terminal y uno en el primer bucle extracelular (Fig. 3). El análisis de hidrofobicidad de laproteína deducida revela siete tramos de aminoácidos altamente hidrófobos con un 20-30 % de similitud de

5 secuencia con otros receptores de proteína G, con el grado de homología más elevado con el receptor de la interleucina 8 (Fig. 4).

El GnRH-R es casi el miembro más pequeño de la superfamilia de receptores de proteína G, el primer bucle citoplásmico del GnRH-R es más largo que en cualquier otro receptor de proteína G y al contrario que cualquier otro receptor de proteína G, carece de un extremo C-terminal citoplásmico polar. Aunque en el GnRH-R están presentesresiduos altamente conservados, tales como las cisteínas de cada uno de los dos primeros bucles extracelulares que estabilizan muchos receptores, varias características del GnRH-R son poco habituales. Por ejemplo, el dominio transmembrana II de aspartato/glutamato altamente conservado, que se ha encontrado que es esencial para lafunción de muchos receptores de proteína G, está sustituido con asparagina. Otra desviación de otros receptores de proteína G es la sustitución de una serina con la tirosina conservada adyacente al dominio transmembrana III. Esto

15 crea un sitio de fosforilación potencial, único para el GnRH-R, en un dominio crucial para la transducción de señales de otros receptores de proteína G. También se encuentran presentes otros posibles sitios de regulación de la fosforilación (véase la Fig. 3).

El receptor de GnRH humana, que no es parte de la invención, se clonó mediante el uso de una sonda con una biblioteca de ADNc de hipófisis humana de ∃gt10 con el inserto del receptor de GnRH de ratón que se había marcado con 32P mediante cebado hexamérico aleatorio. Para confirmar que el clon aislado codificaba un GnRH-Rhumano funcional se inyectaron transcritos de ARN sintético en ovocitos. Todos los ovocitos en los que se inyectó el ARN desarrollaron grandes corrientes de despolarización tras la exposición a GnRH lo que indica que el fragmento de ADN clonado codificaba un receptor funcional.

La secuencia nucleotídica codificadora (SEC ID N.º:3) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID N.º: 4) para

25 el GnRH-R humano se representan en la figura 9. La secuenciación del clon humano identificó un inserto de 2160 pb que contenía un marco de lectura abierto de 984 pb. El marco de lectura abierto codifica una proteína de 328 aminoácidos con un 90 % de identidad con la secuencia predicha del receptor de ratón.

Mediante análisis de hidrofobicidad se identificaron los siete dominios hidrófobos característicos de los receptores acoplados a proteína G. Como se encontró para la estructura predicha del receptor de ratón, el GnRH-R humano carece esencialmente de cualquier dominio intracelular C-terminal. Hay dos potenciales sitios de glucosilación ligada a N, uno en cada uno de los primeros dominios extracelulares. Varios residuos citoplásmicos de serina y treonina seencuentran en los dominios intracelulares y pueden servir cono sitios de regulación de la fosforilación (FIG. 11).

El análisis por la técnica northern, utilizando GnRH-R humano marcado radiactivamente como una sonda, identificó un transcrito de aproximadamente 4,7 kb en el ARN poli(A) de hipófisis humana (FIG: 10). No se detectó señal

35 alguna en el ARN poli(A) purificado de testículos humanos o con un ADNc control de ∀-actina humana.

Para determinar la extensión de los dominios sin traducir 5’ y 3’ del ARN se realizaron análisis de PCR de los aislados de fagos de la detección selectiva en la biblioteca principal. Se usó un cebador oligonucleotídico antisentidoque representaba la secuencia cerca del extremo 5’ del inserto de ADNc del GnRH-R o un cebador sentido cerca del extremo 3’ de la misma secuencia junto con cebadores diseñados contra el sitio de clonación GT1 adyacente para establecer el mapa de los clones no purificados. Los productos más largos identificados en la PCR tenían %1,3 kb desecuencia 5’ adicional y % 0,3 kb de secuencia 3’ adicional. Estos datos sugieren que el ARNm del GnRH-R contiene al menos 1,3 kb de secuencia 5’ sin traducir y 1,5 kb de secuencia 3’ sin traducir. En función de los datos obtenidos con el análisis por la técnica northern, esto sugiere que la secuencia sin traducir adicional (< 1 kb) no está contenida en ninguno de los clones aislados.

45 Los miembros de la familia de GnRH-R se definen en la presente memoria descriptiva como los receptores que se unen a la GnRH. Tales receptores pueden demostrar aproximadamente un 80 % de homología a nivel nucleotídico, e incluso una homología del 90 % a nivel de aminoácidos en tramos sustanciales de secuencias localizadas enregiones fuera de los dominios transmembrana.

La clonación de otros receptores en la familia de los GnRH-R puede llevarse a cabo de varias formas diferentes. Por ejemplo, la secuencia murina se puede usar para diseñar sondas oligonucleotídicas degeneradas o completamente degeneradas que se pueden usar como sondas de PCR o para realizar detecciones selectivas en bibliotecas deADNc derivadas de las células adecuadas que expresan el GnRH-R, o bibliotecas genómicas. El extremo N-terminaly los bucles citoplásmicos (tanto intracelulares como extracelulares) de las secuencias murinas representadas en lafigura 3 y la figura 11, respectivamente, pueden usarse de forma ventajosa para diseñar tales sondas

55 oligonucleotídicas, ya que estas regiones deberían estar relativamente conservadas en la familia de los GnRH-R.

Como alternativa, se puede realizar una detección selectiva en una biblioteca de ADNc de bacteriófagos, encondiciones de rigurosidad reducida, usando un fragmento marcado de forma radiactiva del clon de GnRH-R murino para aislar las proteínas relacionadas con el GnRH-R. Para una revisión de las estrategias de clonación que sepueden usar véanse, por ejemplo, Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press, N.Y. y Ausubel y col., 1989, Current Protocols in molecular Biology, Green Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y.

Las secuencias de nucleótidos que codifican un GnRH-R, fragmentos, proteínas de fusión o equivalentesfuncionales de los mismos, se pueden usar para generar moléculas de ADN recombinante que dirigen la expresión del GnRH-R, o de un péptido, proteína de fusión o equivalente funcional de los mismos funcionalmente activos, en65 las células huésped adecuadas. Como alternativa, las secuencias de nucleótidos que hibridan con porciones del la secuencia del GnRH-R también pueden usarse en los ensayos de hibridación de ácido nucleico, análisis por técnica

de Southern y técnica northern, etc.

Debido a la degeneración del código genético, en la práctica de la presente invención se pueden usar otras secuencias de ADN que codifican sustancialmente la secuencia de aminoácidos del GnRH-R, por ejemplo, tales como la secuencia murina (SEC ID N.º: 2) representada en la Figura 3, o un equivalente funcional para la clonación y expresión del GnRH-R. Tales secuencias de ADN incluyen aquellas que son capaces de hibridar con la secuencia del GnRH-R murino en condiciones estrictas, o que serían capaces de hibridar en condiciones estrictas pero por la degeneración del código genético. Las condiciones de rigurosidad se pueden ajustar de varios modos. Por ejemplo, cuando se realizan las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR), se puede ajustar la temperatura a la que tiene lugar la hibridación de los cebadores con el molde o la concentración del MgCl2 en el tampón de reacción. Cuando se usan fragmentos de ADN u oligonucleótidos marcados de forma radiactiva para poner en contacto los filtros con sondas la rigurosidad se puede ajustar mediante cambios en la fuerza iónica de las soluciones de lavado o con el control cuidadoso de la temperatura a la que se llevan a cabo los lavados del filtro.

Las secuencias de ADN alteradas que se pueden usar se incluyen deleciones, adiciones o sustituciones de distintosresiduos nucleotídicos que dan como resultado una secuencia que codifica el mismo producto génico o un producto génico funcionalmente equivalente. El propio producto génico puede contener deleciones, adiciones o sustituciones de residuos de aminoácidos en la secuencia del GnRH-R, lo que tiene como resultado un cambio silente que produce así un GnRH-R funcionalmente equivalente. Tales sustituciones de aminoácidos pueden realizarse sobre la base de similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos implicados. Por ejemplo, los aminoácidos con carga negativa incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; losaminoácidos con carga positiva se incluyen lisina y arginina; los aminoácidos con grupos de cabezas polares sin carga que tienen valores similares de hidrofilicidad incluyen los siguientes: leucina, isoleucina, valina, glicina, anilina, asparagina, glutamina, serina, treonina; fenilalanina, tirosina. Como se usa en la presente memoria descriptiva, un GnRH-R funcionalmente equivalente se refiere a un receptor que se une a la GnRH, pero no necesariamente con la misma afinidad de unión que su GnRH-R homólogo nativo.

Las secuencias de ADN de la invención pueden someterse a técnicas de ingeniería genética para alterar la secuencia codificadora del GnRH-R para una variedad de fines incluyendo pero no limitados a alteraciones que modifican el procesamiento y la expresión del producto génico. Por ejemplo, se pueden introducir mutaciones mediante técnicas bien conocidas en la materia, por ejemplo mutagénesis dirigida, para insertar nuevos sitios derestricción, para alterar los patrones de glucosilación, fosforilación, etc. Por ejemplo, en ciertos sistemas de expresión tales como levaduras, las células huésped pueden glucosilar en exceso el producto génico. Cuando seusan tales sistemas de expresión puede ser preferible alterar la secuencia codificadora del GnRH-R para eliminar los sitios de glucosilación ligada a N; por ejemplo, en la secuencia murina esto se puede llevar a cabo mediante laalteración de uno o más sitios de glucosilación indicados en la figura 3. En otra forma de realización de la invención,el GnRH-R o una secuencia del GnRH-R modificada puede estar ligada a una secuencia heteróloga para codificaruna proteína de fusión. La proteína de fusión puede someterse a ingeniería genética para que contenga un sitio de escisión localizado entre la secuencia de GnRH-R y la secuencia proteica heteróloga, de forma que el GnRH-R se pueda escindir del resto heterólogo.

La secuencia codificadora del GnRH-R podría sintetizarse en todo o en parte usando procedimientos químicos bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Caruthers y col., 1980, Nuc. Acids. Res. Symp. Ser. 7: 215-233; Creay Hornm, 180,m Nuc. Acids. Res. 9 (10):2331; Matteucci y Caruthers, 1980, Tetrahedron Letters, 21: 719; y Chow y Kempe, 1981, Nuc. Acids Res. 9 (12): 2807-2817. Como alternativa, la propia proteína podría producirse mediante procedimientos químicos para sintetizar todo o parte de la secuencia aminoacídica del GnRH-R. Por ejemplo, los péptidos se pueden sintetizar mediante técnicas de fase sólida, escindirse de la resina y purificarse mediante cromatografía líquida de alto rendimiento. (Por ejemplo, véase Creighton, 1983, Proteins Structures And Molecular Principles, W. H. Freeman y Co., N. Y.. páginas 50-60). La composición de los péptidos sintéticos puede confirmarse mediante análisis o secuenciación de los aminoácidos (por ejemplo, con el procedimiento de degradación de Edman;véase Creighton, 1983, Proteins, Structures and Molecular Principles. W. H. Freeman y Co., N. Y., páginas 34-49).

5.2. Expresión del GnRH-R

Con el fin de expresar un GnRH-R biológicamente activo, la secuencia de nucleótidos que codifica el GnRH-R, o un equivalente funcional como se ha descrito antes en la Sección 5.1, se inserta en un vector de expresión adecuado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y la traducción de la secuencia codificadora insertada. Los productos génicos GnRH-R, así como las células huésped o las líneas celulares sometidas a transfección o a transformación con vectores de expresión del GnRH-R recombinante se pueden usar para una variedad de propósitos. Estos incluyen aunque no se limitan a la generación de anticuerpos (es decir, monoclonales o policlonales) que se unen al receptor, incluidos los que inhiben de forma competitiva la unión a la GnRH y “neutralizan” la actividad de la GnRH; la detección y selección de análogos de la GnRH o fármacos que actúan a través del GnRH-R, etc.

5.2.1. Sistemas de expresión

Para construir los vectores de expresión que contengan la secuencia codificadora del GnRH-R y señales adecuadas del control de la transcripción/traducción se pueden usar procedimientos bien conocidos para los expertos en latécnica. Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas yrecombinación/recombinación genética in vivo. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis y col., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. y Ausubel y col., 1989, Current Protocols in molecular Biology, Greene Publishing Associates y Wiley Interscience, N. Y.

Se puede usar una variedad de sistemas de vectores de expresión en huéspedes para expresar la secuencia codificadora del GnRH-R. Estos incluyen pero no se limitan a microorganismos tales como bacterias transformadas con vectores de expresión de ADN recombinante de bacteriófagos, de ADN recombinante plasmídico o de ADN

recombinante de cósmidos que contienen la secuencia codificadora del GnRH-R; levaduras transformadas con vectores de expresión de levaduras recombinantes que contienen la secuencia codificadora del GnRH-R; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen la secuencia codificadora del GnRH-R; sistemas de células vegetales infectados con vectores deexpresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, VMC; virus del mosaico del tabaco, VMT) o transformadas con vectores de expresión plasmídicos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen la secuencia codificadora del GnRH-R, o sistemas de células animales infectadas con vectores deexpresión de virus recombinantes (por ejemplo, adenovirus, virus de la vacuna), incluidas las líneas celulares sometidas a ingeniería genética para que contengan múltiples copias del ADN del GnRH-R, bien amplificado deforma estable (por ejemplo, CHO/dhfr) o bien amplificado de forma inestable en minicromosomas (por ejemplo, líneas celulares murinas).

Los elementos de expresión de estos sistemas varían en sus resistencias y especificidades. En función del sistemade huésped/vector utilizado, en el vector de expresión se puede usar cualquiera de una serie de elementos de transcripción y de traducción adecuados, incluidos promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, se pueden usar promotores inducibles tales como el pL del bacteriófago &, plac, prtrp,pteo (promotor híbrido ptrp-lao) y similares; cuando se clona en sistemas de células de insectos, se pueden usar promotores tales como el promotor de polihedrina del baculovirus; cuando se clona en sistemas de células vegetales, se pueden usar promotores derivados del genoma de las células vegetales (por ejemplo, promotores del choque térmico; el promotor de la subunidad pequeña de la RUBISCO; el promotor de la proteína de unión a laclorofila a/b) o de virus vegetales (por ejemplo, el promotor del ARN 35 s del CaMV, el promotor de la proteína de la cubierta del TMV); cuando se clona en sistemas de células de mamífero, se pueden usar promotores derivados del genoma de las células de mamífero (por ejemplo, el promotor de la metalotioneína) o de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor 7,5K del virus de la vacuna); cuando se generan líneas celulares con múltiples copias del ADN del GnRH-R, se pueden usar vectores basados en los SV40, BPV y EBV con un marcador seleccionable adecuado.

En los sistemas bacterianos se puede seleccionar de forma ventajosa una serie de vectores de expresión según eluso que se pretende hacer del GnRH-R expresado. Por ejemplo, cuando se quieren producir cantidades grandes de GnRH-R para la generación de anticuerpos, pueden ser deseables los vectores que dirigen la expresión de niveles elevados de productos proteicos de fusión que se purifican con facilidad. Tales vectores incluyen, pero no están limitados al vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther y col., 1983, EMBO J., 2: 1791), en el que la secuencia codificadora de GnRH-R puede estar ligada en el vector en el marco con la región codificadora lac Z de modo que se produzca una proteína híbrida AS-kacZ; vectores pIN (Inouye e Inouye, 1985, Nucleic acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke y Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264; 5503-5509) y similares. También se pueden usar vectores pGEX para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con la glutatión-S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse con facilidad de las células lisadas mediante adsorción a perlas de glutatión-agarosa seguido por la elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX se diseñan para que incluyan sitios de escisión por la proteasa del factor Xa o de la trombina de forma que el polipéptido clonado de interés se pueda liberar desde el resto GST.

En levaduras, se puede usar una serie de vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles. Para una revisión, véanse Current Protocols in Molecular Biology, vol. 2, 1988, Ed. Ausubel y col., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, cap. 13; Grant y col., 1987, Expression and Secretion Vectors for Yeast, en Methods in Ezymology, Eds. WU y Grossman, 1987, Acad. Press., N. Y., vol. 153, páginas 516-644; Glover, 1988, DNA cloning, vol. II, IRL Press, Wash. D.C., Cap. 3 y Bitter, 1987, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods inEnzymology, Eds. Berger y Kimmel, Acad. Press., N. Y., vol. 152, páginas 673-684 y The Molecular Biology of The Yeast Saccharomyces, 1982, Eds. Strathern y col., Cold Spring Harbor Press., vol. I y II.

En los casos en los que se usan vectores de expresión en plantas, la expresión de la secuencia codificadora del GnRH-R puede impulsarse por cualquiera de una serie de promotores. Por ejemplo, se pueden usar promotores virales tales como los promotores del ARN 35 S y del ARN 19 S del CaMV (Brisson y col., 1984, Nature 310: 511514) o el promotor de la proteína de la cubierta del TMV (Takamatsu y col., 1987, EMBO J. 6: 307-311); como alternativa; se pueden usar promotores vegetales tales como el promotor de la subunidad pequeña de la RUBISCO (Coruzzi y col., 1984, EMBO J. 3: 1671-1680; Broglie y col., 1984, Science 224: 838-843); o los promotores dechoque térmico, por ejemplo, hsp 17.5-E o hsp 17.3-B de soja (Gurley y col., 1986, Mol. Cel. Biol. 8: 559-565). Estas construcciones se pueden introducir en las células vegetales usando plásmidos Ti, plásmidos RI, vectores de virus vegetales, transformación directa de ADN, microinyección, electroporación, etc. Para revisiones de tales técnicas, véanse, por ejemplo, Welssbach y Weissbach, 1988, Methods for Plan Molecular Biology, Academic Press, NY, Sección VIII, páginas 421-483 y Grierson y Corey, 1988, Plant Molecular Biology, 2ª ed., Blackie, Londres, Cap. 7-9.

Un sistema de expresión alternativo que podría usarse para expresar GnRH-R es un sistema en insectos. En uno de tales sistemas, el virus de la polihidrosis nuclear Autographa californica (AcNPV) se usa como un vector para expresar genes extraños. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia que codifica el GnRH-Rpuede clonarse en regiones no esenciales (por ejemplo en el gen de polihedrina) del virus y situarse sometida al control de un promotor de AcPNV (por ejemplo el promotor de polihedrina). La inserción satisfactoria de la secuenciacodificadora de GnRH-R tendrá como resultado la inactivación del gen de la polihedrina y la producción de virus recombinante no ocluido (es decir, virus que carece de la cubierta proteinácea codificada por el gen de la polihedrina). A continuación, estos virus recombinantes se usan para infectar células de Spodoptera frugiperda en las que se expresa el gen insertado. (Por ejemplo, véase Smith y col., 1983, J. Virol. 46: 584; Smith, patente de EE.UU. n.º: 4.215.051).

En células huésped de mamíferos se puede utilizar una serie de sistemas de expresión con base viral. En los casos en los que se usa un adenovirus como vector de expresión, la secuencia que codifica el GnRH-R se puede ligar a un complejo de control de transcripción/traducción de adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Después este gen quimérico se puede insertar en el genoma del adenovirus mediante recombinación in

vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, la región E1 o E3) dará lugar a un virus recombinante que es viable y capaz de expresar GnRH-R en huéspedes infectados. (Por ejemplo, véase Logan y Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81: 3655-3659). Como alternativa, se puede usar el promotor 7,5K del virus de la vacuna. (Por ejemplo, véase Mackett y col., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79: 7415-7419; Mackett y col., 1984, J. Virol. 49: 857-864; Panicall y col., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 4927-4931).

Para una traducción eficaz de secuencias codificadoras de GnRH-R insertadas también se pueden requerir señales de iniciación específicas. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y las secuencias adyacentes. En los casos en los que la totalidad del gen de GnRH-R, incluido su propio codón de iniciación y las secuencias adyacentes, se inserta en el vector de expresión adecuado, puede que no sean necesarias señales adicionales de control de la traducción. Sin embargo, en los casos en los que se inserta solo una porción de la secuencia codificadora del GnRH-R, deberán proporcionarse señales exógenas de control de la traducción, incluido el codón de iniciación ATG. Además, el codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia codificadora de GnRH-R para garantizar la traducción de todo el inserto. Estas señales exógenas de control de latraducción y los codones de iniciación pueden tener una diversidad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de la expresión puede intensificarse mediante la inclusión de los adecuados elementos intensificadores de latranscripción, terminadores de la transcripción, etc. véase, Bitter y col., 1987, Methods in Enzymol, 153: 516-544).

Además, puede seleccionarse una cepa de células huésped que modifica la expresión de las secuencias insertadas,

o modifica y procesa el producto génico del modo específico deseado. Tales modificaciones (por ejemplo, glucosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de los productos proteicos pueden ser importantes para lafunción de la proteína. Diferentes células huésped poseen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y la modificación postraduccionales de las proteínas. Se pueden escoger líneas celulares o sistemas de huésped adecuados para garantizar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína extraña expresada. Para este fin, se pueden usar las células huésped eucarióticas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento adecuado del transcrito primario, glucosilación y fosforilación del producto génico. Tales células huésped de mamífero incluyen, aunque no se limitan a, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, W138, etc.

Para la producción a largo plazo, con rendimiento elevado de proteínas recombinantes se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, se pueden someter a ingeniería genética las líneas celulares que expresan de forma estable el GnRH-R. En lugar de usar vectores de expresión que contienen orígenes de replicación virales, las células huésped se pueden transformar con el ADN del GnRH-R controlado por elementos de control de la expresión adecuados (por ejemplo, promotor, intensificador, secuencias, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y unmarcador seleccionable. Tras la introducción de ADN extraño, pueden dejarse crecer las células sometidas aingeniería genética durante 1-2 días en un medio enriquecido y después se cambian a un medio selectivo. Elmarcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células seintegren de forma estable en los cromosomas del plásmido y crezcan para formar focos que a su vez puedanclonarse y expandirse en las líneas celulares. Este procedimiento puede usarse de forma ventajosa para someter aingeniería genética las líneas celulares que expresan el GnRH-R en la superficie celular y que responden a la señal de transducción mediada por GnRH. Tales líneas celulares producidas por ingeniería genética son particularmente útiles en la detección selectiva de análogos de la GnRH.

Se puede usar una serie de sistemas de selección, incluyendo pero no limitados a los genes de la timidincinasa del virus del herpes simple (Wigler y col., 1977, Cell, 11:223), la hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026) y la adenina fosforribosiltransferasa (Lowy y col., 1980, Cell

22: 817) se pueden emplear en células tk-, hgprt-o aprt-, respectivamente. Asimismo, se puede usar resistencia a antimetabolitos como base de selección de los genes dhfr, que confieren resistencia a metotrexato (Wigler y col., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O´Hare y col., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); gpt, que confiere resistencia a ácido micofenólico (Mulligan y Berg, 1981), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G-418 (Colberre-Garapin y col., 1981, J. Mol. Biol., 150:1); e higro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre y col., 1984, Gene 30: 147). Recientemente se han descrito genesseleccionables adicionales, a saber trpB, que permite que las células usen indol en lugar de triptófano; hisD, que permite que las células usen histinol en lugar de histidina (Hartman y Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047) y ODC (ornitina descarboxilasa), que confiere resistencia al inhibidor de la ornitina descarboxilasa, 2(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue L., 1987, En: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.).

En un ejemplo, descrito en el presente documento, que no forma parte de la invención, el ADNc de GnRH-R humano se subclonó en un vector de expresión, pSV2A, que contiene el promotor temprano SV40. Células COS-1 se sometieron a transfección de forma transitoria con la construcción pSV2A-GnRH-R humano usando el procedimiento de DEAE-dextrano de transfección (Keown, W. A. y col., 1990, en Methods of Enzymology, V1, 185 (Goeddel, D. V., ed.), páginas 527-537 Academic Press, Nueva York). Experimentos, usando membranas de células transfectadas COS-1, indicaron que el receptor expresado de forma heteróloga era capaz de unirse a la GnRH. También se encontró que la unión del ligando estaba acoplada al metabolismo del fosfato de inositol indicando que las células COS-1 sometidas a transfección expresaban un GnRH-R humano funcional.

5.2.2. Identificación de transfectantes y transformantes que expresan GnRH-R

Las células huésped que contienen la secuencia codificadora y que expresan el producto génico biológicamente activo pueden identificarse mediante al menos cuatro abordajes generales: (a) hibridación ADN-ADN o ADN-ARN;

(b) la presencia o ausencia de funciones génicas “marcadoras”; (c) valorar el nivel de transcripción según se midepor la expresión de los transcritos de ARNm del GnRH-R en la célula huésped; y (d) detección del producto génico según se mide mediante inmunoensayo o mediante su actividad biológica.

En el primer abordaje, la presencia de la secuencia codificadora de GnRH-R insertada en el vector de expresión se puede detectar mediante hibridación ADN-ADB o ADN-ARN usando sondas que comprenden secuencias de

nucleótidos que son homólogas a la secuencia codificadora del GnRH-R, respectivamente, o a sus porciones o derivados.

En el segundo abordaje, el sistema huésped/vector de expresión recombinante se puede identificar y seleccionar en base a la presencia o la ausencia de ciertas funciones génicas “marcadoras” (por ejemplo, actividad timidina cinasa,resistencia a antibióticos, resistencia a metotrexato, fenotipo de transformación, formación de cuerpos de oclusión enbaculovirus, etc.). Por ejemplo, si la secuencia codificadora de GnRH-R se inserta dentro de una secuencia génica marcadora del vector, los recombinantes que contienen la secuencia codificadora de GnRH-R se pueden identificar por la ausencia de la función génica marcadora. Como alternativa, se puede colocar un gen marcador en tándem con la secuencia de GnRH-R sometida al control del mismo promotor o de otro distinto usado para controlar laexpresión de la secuencia codificadora de GnRH-R. La expresión del marcador en respuesta a la inducción oselección indica la expresión de la secuencia codificadora de GnRH-R.

En el tercer abordaje, la actividad transcripcional de la región codificadora de GnRH-R se puede valorar mediante ensayos de hibridación. Por ejemplo, el ARN se puede aislar y analizar mediante técnica northern con una sonda homóloga a la secuencia codificadora de GnRH-R o a porciones concretas de la misma. Como alternativa, se puede extraer el total de ácidos nucleicos de la célula huésped y analizar mediante hibridación a tales sondas.

En el cuarto abordaje, la expresión del producto proteico del GnRH-R se puede valorar inmunológicamente, por ejemplo mediante técnicas western, inmunoensayos tales como radioinmunoprecipitación, inmunoensayos ligados a enzimas y similares. Sin embargo, la última prueba del éxito del sistema de expresión implica la detección del producto génico GnRH-R biológicamente activo. Se puede usar una serie de ensayos para detectar la actividad del receptor incluyendo pero no limitados a ensayos de unión a GnRH y ensayos biológicos de GnRH usando líneas celulares producidas mediante ingeniería genética como el sustrato de la prueba.

En un ejemplo descrito en la presente memoria descriptiva, que no forma parte de la invención, se prepararon membranas celulares a partir de células COS-1 sometidas a transfección con un vector de expresión recombinante que contenía el ADNc del GnRH-R humano. La expresión del GnRH-R humano se detectó usando un análogo de laGnRH marcado con 125I. Además, la expresión de GnRH-R biológicamente activo se podría detectar en células sometidas a transfección midiendo los niveles de producción de fosfato de inositol (IP) estimulados por GnRH como se describe en la sección 7.1.5.

5.2.3. Recuperación del GnRH-R

Una vez que se ha identificado un clon que produce niveles elevados de GnRH-R biológicamente activo, el clon sepuede expandir y usar para producir cantidades grandes del receptor, que puede purificarse con técnicas bien conocidas en la materia incluyendo, pero no limitadas a purificación por inmunoafinidad, procedimientos cromatográficos que incluyen la cromatografía líquida de alto rendimiento, la cromatografía de afinidad con ligando inmovilizado tal como GnRH o análogos de la misma unidos a perlas, purificación por inmunoafinidad usandoanticuerpos y similares.

Donde la secuencia codificadora del GnRH-R se somete a ingeniería genética para que codifique una proteína de fusión escindible, la purificación se puede llevar a cabo con facilidad usando técnicas de purificación por afinidad. Por ejemplo, una secuencia consenso de reconocimiento de la escisión de colagenasa se puede introducir mediante ingeniería genética entre el extremo carboxiterminal del GnRH-R y la proteína A. La proteína de fusión resultante se puede purificar con facilidad mediante una columna de IgG que se une al resto de proteína A. El GnRH-R sin condensar se puede liberar fácilmente de la columna mediante tratamiento con colagenasa. Otro ejemplo sería eluso de vectores pGEX que expresan polipéptidos extraños como proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST). La proteína de fusión se puede someter a técnicas de ingeniería genética bien con sitios de escisión de trombina o bien con sitios de escisión del factor Xa entre el gen clonado y el resto GST. La proteína de fusión puede purificarse con facilidad a partir de extractos celulares mediante adsorción a perlas de glutatión agarosa seguida por elución en presencia de glutatión. En este aspecto de la invención, cualquier sitio de escisión o sustrato enzimático de escisión se puede introducir mediante ingeniería genética entre la secuencia de GnRH-R y un segundo péptido o proteína que tenga un par de unión que podría usarse para la purificación, por ejemplo, cualquier antígeno para el que se pueda preparar una columna de inmunoafinidad.

5.3. Generación de anticuerpos que definen el GnRH-R

Para la producción de anticuerpos frente a epítopos del GnRH-R producido de forma recombinante se pueden usar diversos procedimientos conocidos en la técnica. Los anticuerpos neutralizantes es decir, aquellos que compiten porel sitio de unión a la GnRH del receptor se prefieren especialmente para productos diagnósticos y terapéuticos. Los anticuerpos que definen marcadores serológicos virales se preferirían para usos diagnósticos. Tales anticuerpos incluyen pero no se limitan a policlonales, monoclonales, quiméricos, de cadena sencilla, fragmentos Fab y fragmentos producidos mediante una biblioteca de expresión de Fab.

Para la producción de anticuerpos, se pueden inmunizar diversos animales huésped mediante inyección con elGnRH-R, incluyendo pero no limitados a conejos, ratones, ratas, etc. Se pueden usar varios adyuvantes para aumentar la respuesta inmunitaria, dependiendo de las especies huésped, incluyendo pero no limitados a adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias activas desuperficie tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianina delapa de california, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilos de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.

Los anticuerpos monoclonales frente a GnRH-R se pueden preparar mediante el uso de cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante cultivos continuos de líneas celulares. Estas incluyen, pero no se limitan a la técnica del hibridoma descrita en un principio por Kohler y Millstain (Nature, 1975,

256: 495-497), la técnica del hibridoma de células B humanas (Kosbor y col., 1983, Immunology Today, 4: 72; Cote ycol., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci., 80: 2026-2030) y la técnica del hibridoma–EBV (Cole y col., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., páginas 77-96). Como alternativa, se pueden adaptar las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (patente de los EE.UU. 4.946.778) para producir anticuerpos de cadena sencilla específicos del GnRH-R.

Los fragmentos de anticuerpos que contienen sitios de unión específica de GnRH-R se pueden generar mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen pero no están limitados a: los fragmentos F(ab’)2 que sepueden producir mediante digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos Fab que se pueden generar reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab’)2. Como alternativa, se pueden construir genotecas de expresión de Fab (Huse y col., 1989, Science, 246: 1275-1281) para permitir la identificación rápida y fácil defragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada a GnRH-R.

5.4 Usos de GnRH-R, ADN y líneas celulares producidas por ingeniería genética

El ADN del GnRH-R, los oligonucleótidos antisentido, los productos de la expresión de GnRH-R, los anticuerpos ylas líneas celulares producidas por ingeniería genética descritos antes tienen una serie de usos para el diagnóstico y el tratamiento de trastornos de la reproducción y en el diseño y descubrimiento de fármacos.

Por ejemplo, la secuencia de ADN del GnRH-R puede usarse en los ensayos de hibridación de biopsias para diagnosticar anomalías de la expresión de GnRH-R; por ejemplo, análisis por técnicas de Southern o técnicas northern, incluyendo ensayos de hibridación in situ. En aplicaciones terapéuticas, las moléculas antisentido o de ribozima diseñadas sobre la base de la secuencia de ADN del GnRH-R puede usarse para bloquear el transporte y la expresión del producto génico GnRH-R. A este respecto, se prefieren los oligonucleótidos derivados del sitio deiniciación de la traducción, por ejemplo entre las regiones -10 y +10 de la secuencia nucleotídica del GnRH-R. Como alternativa, se podría usar el ADN del GnRH-R en el enfoque de terapia génica para introducir el gen recombinante normal en las células defectivas de un individuo o para corregir una mutación endógena con el fin de reconstituir elGnRH-R y su función.

Se pueden usar anticuerpos específicos para GnRH-R para determinar el patrón de expresión del receptor en tejido de biopsia, o para técnicas de imagen diagnósticas in vivo; en tales aplicaciones se pueden preferir los anticuerpos “neutralizantes”. Por ejemplo, se podría administrar a un paciente un anticuerpo conjugado con un compuesto de deformación de imágenes para “realizar el mapa” de las localizaciones y la distribución del GnRH-R in vivo.

El propio GnRH-R, o un fragmento que contiene su sitio de unión a GnRH, podrían administrarse in vivo. El GnRH-R libre o el fragmento peptídico podrían unirse de forma competitiva a la GnRH e inhibir su interacción con el receptornativo in vivo.

La estimulación de una respuesta de anticuerpos, específica para el GnRH-R, puede usarse como medio anticonceptivo. Por ejemplo, se pueden inmunizar varios animales huésped mediante inyección con GnRH-R o proteína de fusión de GnRH-R, lo que conduce a la estimulación de su sistema inmunitario y la producción de anticuerpos antiGnRH-R circulantes.

Las líneas celulares producidas por ingeniería genética que expresan el GnRH-R y responden a la transducción deseñales pueden utilizarse para detectar de forma selectiva e identificar análogos de GnRH biológicamente activos, es decir, bien agonistas o bien antagonistas. Se pueden producir mediante ingeniería genética animales transgénicos que contengan el ADN de GnRH-R como transgén para poner a prueba los efectos de tales agonistas

o antagonistas in vivo.

Recientemente, se han desarrollado modelos generados por ordenador de las interacciones ligando-receptor y enuna forma de realización preferida de la invención la información derivada de la realización de modelos por ordenador de GnRH-R se puede usar para diseñar agonistas o antagonistas del receptor. Se han publicado más de74 secuencias distintas de GPR (receptores acoplados a proteína G) y las alineaciones de la secuencia con secuencias de GnRH-R pueden facilitar la comprensión del papel de ciertas secuencias proteicas en la determinación de la unión al ligando y la regulación. Los cambios realizados en las secuencias de GnRH-R, usando por ejemplo técnicas para mutagénesis dirigida a sitio y la expresión de receptores mutantes en líneas celulares sepueden usar para definir adicionalmente el papel funcional de regiones y residuos particulares de receptor.

6. Ejemplo: clonación de un GnRH-R murino funcional

Las subsecciones siguientes describen la clonación de un ADN complementario que representa el GnRH-R de ratón y confirma su identidad usando expresión en ovocitos de Xenopus. La inyección de transcrito de ARN sentido conduce a la expresión de un GnRH-R funcional, de alta afinidad. Sin embargo, la expresión de GnRH-R usando ARN de línea celular gonadotropa se bloquea por un oligonucleótido antisentido. La hibridación in situ en la adenohipófisis de rata revela una distribución característica del GnRH-R. La secuencia de nucleótidos codifica una proteína de 327 aminoácidos que tiene los siete dominios transmembrana teóricos característicos de los receptores acoplados a proteína G, pero que carece de un extremo C-terminal intracelular típico. La estructura poco habitual y el dominio regulador potencial novedoso del GnRH-R pueden explicar aspectos únicos de su transducción yregulación de señales.

6.1 Materiales y procedimientos

Los fármacos se obtuvieron de las siguientes fuentes: el antagonista de GnRH [D-Phe2,6,Pro3]-GnRH (Bachern, Torrance, CA), buserelina (D-Ser(But)6,Pro9-N-etilamida GnRH) Hoerchst-Roussel Pharmaceuticals (Somerville, NJ). Todos los demás productos químicos se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Todo el cuidado de los animales estaba de acuerdo con la Guía NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

6.1.1.Microinyección y registro en ovocitos

Hembras adultas de Xenopus laevis (Nasco, Ft. Atkinson, WI) se mantuvieron a 18-20 ºC y en un ciclo de día/noche de 15 h/9 h. Los ovocitos se prepararon para la inyección y las respuestas se registraron como se ha descrito antes (Sealfon y col., 1990, Mol. Endocrinol. 4: 119-124). Las células se colocaron en 0,5 ml de baño y pinzamiento devoltaje a -70 mV mediante la técnica estándar de dos electrodos (Dascal, 1987, CRC Crit. Rev. Biochem. 417: 4761). Se diluyeron ligandos peptídicos en el tampón de perfusión y se introdujeron en el baño. La corriente pinzada se registró usando un registrador de gráficos. Los potenciales inversos se determinaron mediante desnivel continuo de 70 a +10 mV durante 2 segundos con y sin agonista por un sistema AT de PC IBM usando la interfase TL-1 y elsoftware pCLAMP de Axon Instruments (Burlingame, CA).

6.1.2. Clonación por PCR y detección selectiva por interrupción por hibridación

La preparación del ARN y la síntesis del ADNc se llevaron a cabo como se ha descrito antes (Sealfon y col., 1990, Mol. Endocrinol 4: 119-124; Snyder y col., 1991, Neurosci Lett 122: 37-40). Los subclones para la detección selectiva por interrupción por hibridación se aislaron mediante PCR con una diversidad de oligonucleótidos degenerados correspondientes a los dominios transmembrana conservados de la superfamilia GPR. Los oligonucleótidos usados para aislar el grupo de subclones, incluido el WZ7, modificados de las secuencias de oligómeros publicados (Zhou y col., 1990, Nature 347: 76-80) correspondían a los dominios transmembrana III (5’-GAGTCGACCTGTG(CT)G(CT)(AG)CNNT(GT)GAC(AC)G(CG)TAC-3’) y transmembrana VI (5’CAGAATTCAG(AT)AGGGCANCCAGCAGAN(CG)(AG)(CT)GAA-3’). La PCR se llevó a cabo en condiciones de rigurosidad baja. Una porción de la reacción se reamplificó en condiciones de rigurosidad elevada, se digirió con enzimas de restricción, se subclonó en pBluescript II KS+ (Stratagene) y se secuenció. Para el ensayo de interrupción por hibridación, se sintetizaron un oligonucleótido antisentido correspondiente al dominio transmembrana II del receptor 5HT10 (5’-ATCAGCAATGGCTAG-3’) (Julius y col., 1988, Science 241: 558-564) y un oligonucleótido correspondiente a WZ7 (5’AGCATGATGAGGAGG-3’). Una mezcla de ARN de !T3-1 (1 mg/ml) y ARN total de cerebro de rata (1 mg/ml) se preincubó con oligonucleótido antisentido (100 #g/ml) durante 10 minutosa 37 ºC en un tampón con NaCl 200 mM y Tris 5 mM, a pH 7,4 en un volumen de 3 #l. Se inyectaron 50 ml de la mezcla a los ovocitos de Xenopus y se incubaron durante 48 horas antes de registrar.

6.1.3. Detección selectiva de la biblioteca y secuenciación

Se sometieron 106 placas de una biblioteca de ADNc de !T3-1 de UniZap (Stratagene) a detección selectiva con el inserto de WZ7, que se había marcado con 32P con cebadores hexaméricos aleatorios. Se identificaron 40 placas positivas y 7 se purificaron en detección selectiva secundaria y terciaria. El WX25 se subclonó en pBlueSript II SK+ mediante escisión del fago auxiliar y ambas cadenas se secuenciaron mediante el procedimiento didesoxi de terminación de cadena con la ADN polimerasa Secuenasa T7 (USB). La secuencia se confirmó adicionalmente mediante resecuenciación de ambas cadenas usando marcaje con polimerasa taq y un secuenciador automático de Applied Biosystems. Para excluir la posibilidad de que el extremo C-terminal citoplasmático predicho se escindiera acausa de una mutación en WZ25, la secuencia 3’ se confirmó en dos clones independientes adicionales. Las secuencias nucleotídica y de aminoácidos se analizaron usando un paquete Wisconsin GCG en un ordenador VAX y MacVector (IBI) en un microprocesador.

6.1.4. Caracterización del transcrito de ARN de WZ25

El WZ25 en el pBluescript II SK+ (Stratagene) se hizo lineal y el transcrito de ARN con caperuza se sintetizó usando la ARN polimerasa T3 (Stratagene). En los ovocitos se inyectaron 1,25 ng del transcrito resultante y se incubaron durante 48 horas antes de registrar. Los ovocitos se trataron previamente con tampón o con un antagonista de laGnRH (antagonista 6: [Ac-D-NaI(2’),D,!-Me-pCl-Phe2,D-Trp3,D-Arg6,D-Ala10]GnRH; antagonista 27: [Ac-D-NaI(2)1,D!-Me-pCl-Phe2,D-Trp3,N-∋-Ipr-Lys5,D-Tyr6,D-Ala10]GnRH; ref. (Can der Spuy y col., 1987, En: Vickery B. H. y Nestor

J. J. (editores) LHRH and its Analogs: Contraceptive and Therapeutic Applicationes. NTP Press, Lancaster, Inglaterra) durante 3 minutos antes de la administración de GnRH. Se volvió a exponer los ovocitos a GnRH después de un lavado de tres minutos de antagonista, para confirmar la expresión del receptor.

6.1.5. Ensayo de unión a ligando radiactivo

Para la preparación de membranas, en cada uno de 500 ovocitos se inyectaron 2,5 ng de ARN sintético de WZ25. Tras 48 horas, se prepararon membranas de ovocitos como se ha descrito (Koblika y col., 1987, J. Biol. Chem. 262: 15796-15802) y se resuspendieron en tampón de unión conteniendo HEPES 10 mM, EDTA 1 mM y 0,1 % de seroalbúmina bovina dando una concentración final de 20 ovocitos/ml. El ensayo de unión al receptor usando 125I-[D-Ala6, NaMe-Leu7,Pro9-NHEt]GnRH (GnRH-A) se basó en el descrito antes para membranas hipofisarias de rata y de oveja (Millar y col., 1989, J. Biol. Chem. 264: 21007-21013). La unión en presencia de análogo de GnRH 10-6 M se consideró que representaba la unión inespecífica. La Bo media (unión máxima) y los valores de unión inespecífica fueron 1429 y 662 cpm, respectivamente. La constante de disociación (Kd) para GnRH-A y GnRH se determinó usando Enzfitter (Elsevier-BIOSOFT).

6.1.6. Hibridación en solución, análisis por técnica northern e hibridación in situ

Un GnRH-R de 399 nucleótidos marcado con 32P y una sonda de ARNc antisentido 1B15 (estándar interno de ciclofilina) de 117 nucleótidos se sintetizaron e hibridaron a ARN en solución usando los procedimientos descritos (Autelitano y col., 1989, Mol. Cell. Endo. 67: 101-105). El análisis por técnica northern usando ARN poli(A)+ de !T3-a se llevó a cabo como se ha descrito (Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). La hibridación in situ con ARNc marcado con 35S-UTP se realizó en secciones hipofisarias independientes siguiendo los procedimientos publicados (Gall y Isackson, 1989, Science

245: 758-761). Las secciones se montaron y expusieron a una película Betamax de Amersham durante 3 días o se sumergieron en emulsión radiactiva y se desarrollaron después de 17 días.

6.2. Resultados

6.2.1. Clonación de ADNc de un GnRH-R funcional murino

Se usó ARN de la línea celular gonadotropa de ratón, !T3-1 [5], que dirige la expresión de un GnRH-R en ovocitos de Xenopus (Sealfon y col., 1990, Mol. Endocrinol. 4: 119-124), sintetizando ADNc mediante PCR con oligonucleótidos degenerados correspondientes a motivos conservados de los receptores acoplados a proteína G (GPR); véase Probst y col., 1992, DNA y Cell Biol. 11; 1-20). Los productos de la PCR se subclonaron ysecuenciaron y se sintetizaron oligómeros antisentido para un ensayo de interrupción por hibridación (Kawashi, 1985, Nuc. Acids Res. 13: 4991-5004). Un oligonucleótido correspondiente al clon WZ7, cuando se co-inyectó conARN de !-T3-1 y de cerebro de rata, abolió por completo la expresión del GnRH-R en ovocitos pero no afectó a laexpresión del receptor 5HT10 cerebral (fig. 1). Un segundo oligonucleótido antisentido, que representa un segmento diferente de WZ7 también eliminó, del todo y de forma específica la expresión de GnRH-R en todos los ovocitos probados (n = 16). El clon Wz7 se usó como sonda detectando selectivamente una biblioteca de ADNc de bacteriófago !T3-1 y se purificaron siete placas positivas.

Para probar si el clon con el inserto más largo de 1,3 kb, WZ25, codifica un GnRH-R funcional, se subclonó para la síntesis de ARN y la expresión en ovocitos. Se demostró que en todos los ovocitos en los que se había inyectado ARN sintético (n > 50), cuando se expusieron a GnRH, presentaban una gran respuesta despolarizante característica de la expresión de GnRH-R (fig. 2). El potencial inverso (Vi) y la dependencia de calcio de la respuesta a la inducción con GnRH en ovocitos por el transcrito de ARN de WZ25 fueron similares a los obtenidos anteriormente usando ARN de !T3-1 (Sealfon y col., 1990, Mol. Endocrinol 4: 119-124). El Vr de la corriente provocada por la GnRH fue -27 ( 0,79 mV (n = 7), consistente con el del ion cloruro en ovocitos (Barish, 1983, J. Physiol. 342: 309-325). La respuesta provocada por GnRH se abolió por completo mediante la precarga del ovocito con EGTA 5 mM una hora antes del registro (n = 4), pero no se vio significativamente afectada por la ausencia de Ca2+ en el perfundido (n = 7). Por tanto el receptor expresado del clon WZ25 exhibió una respuesta mediada a través de la activación de la corriente de cloruro dependiente de calcio del ovocito por el calcio intracelular, como escaracterístico de los receptores que causan la hidrólisis de fosfatidilinositol (véase Dascal, 1987, CRC Critt. Rev. Biochem. 417: 47-61). La farmacología de la respuesta obtenida fue acorde con la expresión de GnRH-R de mamífero. El agonista de GnRH [D-Ser(t-Bu)6,Pro9-NH Et]GnRH (buserelina 100 nM, n = 6) provocó una corriente despolarizante en los ovocitos en los que se había inyectado ARN. En presencia del antagonista de GnRH en una semana equimolar [D-Phe2,5,Pro3]GnRH, hubo una reducción del 60 % en la respuesta a GnRH en comparación con la respuesta a GnRH solo (1880 ( 551 nA, n = 5 y 4758 ( 1082 nA, n = 4, respectivamente). Dos potentes antagonistas de GnRH eliminaron por completo la corriente provocada por la GnRH (fig. 2A).

Para caracterizar más el receptor codificado por este clon de ADNc, se llevaron a cabo ensayos de unión a ligando radiactivo sobre membranas purificadas de ovocitos en los que se había inyectado el transcrito de ARN de WZ25. El agonista de GnRH [D-Ala6, NaMe-Leu7,Pro9-NHEt]GnRH (GnRH-A) se unió con afinidad elevada a membranas deovocitos en los que se había inyectado ARN sintético (fig. 2B). El desplazamiento de la 125I-GnRH-A por la GnRH-A reveló Kd similares de 4,5 y 2,9 nM en membranas de ovocitos en los que se había inyectado ARN de WZ25 y enmembranas de celulares de !T3-1, respectivamente. El desplazamiento por la GnRH de la GnRH-A unida al receptor clonado fue un orden de magnitud menos eficaz, como se ha comunicado antes para las membranas de !T3-1 (Horn y col., 1991, Mol. Endocrinol. 5: 347-355). Por tanto, los datos de la interrupción por hibridación y de expresión confirman que el clon WZ25 representa el GnRH-R de ratón.

6.2.2. Caracterización de la secuencia codificadora del GnRH-R murino

La secuencia de nucleótidos (SEC ID N.º:1) y la correspondiente secuencia predicha de aminoácidos (SEC ID N.º: 2) del clon WZ25 se muestran en la figura 3. El marco de lectura abierto más largo codifica una proteína de 327 aminoácidos (masa molecular relativa, Mr = 37.683). El tamaño mayor comunicado para la subunidad de unión del GnRH-R solubilizado de rata, M, 50.000-60.000 (Hazum y col., 1986, J. Biol. Chem. 261: 13043-13048; Iwashita y col., 1988, J. Mol. Endocrinol. 1: 187-196) puede deberse a la glucosilación del receptor. Están presentes tres secuencias consenso de glucosilación ligada a N, dos en el extremo N-terminal y una en el primer bucle extracelular posible. Se cree que el primer ATG representa el sitio de iniciación de la traducción porque se aproxima mucho a la secuencia consenso Kozak (Kozak, 1987, Nuc. Acids. Res. 15: 8125-8148) y un segundo clon de ADNc con una secuencia adicional en 5’ contiene dos codones sin sentido en este marco de lectura en las posiciones -54 y -57. Por tanto la iniciación de la traducción en cualquiera de los sitios de inicio aguas arriba terminaría antes de alcanzar el marco de lectura abierto correcto. No hay señal de poliadenilación y es lo más probable que la cola de poli(A) patente represente el cebado con oligo(dT) en la región 3’ sin traducir durante la construcción de la biblioteca. El ADNc del GnRH-R funcional aislado es de 1,3 kb mientras que el ARNm que contiene esta secuencia es de aproximadamente 4,6 kb como se ha determinado mediante gradiente de sacarosa (Sealfon y col., 1990, Mol. Endocrinol. 4: 119-124) y análisis por la técnica northern (fig. 5B). El análisis de PCR de 40 placas positivas identificadas mediante detección selectiva de la biblioteca principal sugiere que el ARNm de GnRH-R contiene ambas secuencias sin traducir adicionales, en 5’ y en 3’.

El análisis de hidrofobicidad de la proteína deducida demuestra siete tramos de aminoácidos altamente hidrófobos con un 20-30 % de similitud de secuencia con otros GPR con el grado más elevado de homología con el receptor de la interleucina 8 (fig. 4). Aunque se han observado varios residuos altamente conservados en el GnRH-R, tales como las cisteínas presentes en cada uno de los primeros dos bucles extracelulares que estabilizan muchos receptores, varias de las características del GnRH-R son poco habituales. Por ejemplo, el aspartato/glutamato del dominio transmembrana II altamente conservado, que se ha descubierto que es esencial para la función de muchos GPR, está sustituido con una asparagina. El GnRH-R es casi el miembro más pequeño de la superfamilia de GPR y al contrario que muchos otros GPR, carece de un extremo C-terminal polar citoplasmático. El primer bucle citoplasmático teórico es más largo que cualquier otro GPR. Único entre los GPR, el GnRH-R puede activarse através de dimerización (Conn y col., 1982, Nature 296, 653-655; Gregory y Taylor, 1982, Nature 300: 269-271). Su estructura poco frecuente puede facilitar este mecanismo de activación propuesto.

Otra desviación de otros GPR es la sustitución de serina por la tirosina conservada localizada adyacente al dominio transmembrana III. Esto crea un potencial sitio de fosforilación, único del GnRH-R, en un dominio crucial para latransducción de señal de otros GPR. La fosforilación del extremo C-terminal, que está ausente en el GnRH-R,contribuye a la desensibilización de varios GPR (véase Probst y col., 1992, DNA and Cell Biology 11: 1-20). Será interesante determinar si el nuevo sitio de fosforilación del GnRH-R media la desensibilización del receptor. También están presentes otros sitios de fosforilación reguladora potenciales (fig. 3).

La presencia de ARNm de GnRH-R en una diversidad de líneas de células neuroendocrinas se estudió mediante ensayo de hibridación en solución/protección de nucleasa (fig. 5A). El ARNm de GnRH se detectó en células !T3-1 y en hipófisis de ratón, pero no en líneas celulares de GnRH derivadas de neuronas (GT-1), corticotropas (AtT20) osomatolactotropas (GH3) en los límites de detección del ensayo. La ausencia de ARNm de GnRH-R detectable en las líneas celulares AtT-20 y GT-1 se ha confirmado usando concentraciones más elevadas de ARN en el ensayo de hibridación en solución/protección de nucleasa (Dr. Andrea C. Gore, datos no publicados). La figura 5C muestra la distribución del ARNm de GnRH-R en la adenohipófisis de rata. El marcaje se distribuyó de forma heterogénea en toda la glándula, un patrón ya observado mediante autorradiografía del GnRH-R (Badr y Pelletier, 1988, Neuropeptides 11: 7-11). La microscopia de campo claro y de campo oscuro revela la acumulación de las células que expresan el ARNm de GnRH-R. (fig. 5 E, F).

El siguiente ejemplo no forma parte de la invención.

7. Ejemplo: clonación y caracterización de GnRH-R humano

Las siguientes subsecciones describen la clonación de ADN complementario que representa el GnRH-R humano y confirman su identidad usando expresión en ovocitos de Xenopus. Además, el GnRH-R humano se expresó en células COS-1 y se mostró que era funcionalmente activo.

7.1. Materiales y procedimientos

7.1.1. Clonación de GnRH-R humano

En condiciones de elevada rigurosidad se pusieron en contacto 1,2 millones de placas de una biblioteca de ADNc de hipófisis humana GT10 (Clontech) con una sonda (Sambrook y col., 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.) con el inserto de GnRH-R de ratón (Tsutsumi y col., 1992, Mol. Endocrinol. 6: 1163-1169) que se había marcado con 32P por medio de cebado hexamérico aleatorio. Se identificaron treinta y dos placas positivas en filtros por duplicado; diez se seleccionaron para su caracterización adicional y seis se purificaron con éxito mediante la subguiente detección selectiva. El clon con el inserto más largo se subclonó en el sitio EcoRI de pBluescript II SK+ (construcción LC27-4) y ambas cadenas se secuenciaron repetidamente en un secuenciador automático de Applied Biosystems (Foster City, CA. EE.UU.) usando cebadores oligonucleotídicos sintéticos. La secuencia se analizó usando el paquete Wisconsin GCG en un ordenador VAX.

7.1.2. Expresión en ovocitos de Xenopus

La construcción LC27-4 se hizo lineal y el transcrito de ARN con caperuza se sintetizó con la ARN polimerasa T3. Lapreparación de los ovocitos y la electrofisiología se llevaron a cabo como se ha descrito anteriormente (Sealfon y col., 1990, Mol. Endocrinol. 4: 119-124). Se inyectó a las células 1-10 ng de transcrito sintético y la electrofisiología se registró a través de pinzamiento de voltaje de dos electrodos 48 horas después. Todos los agonistas y antagonistas se aplicaron a una concentración de 0,2 #M. Los antagonistas se introdujeron en el baño 3 minutos antes de la exposición a GnRH.

Se usaron los siguientes análogos de GnRH: GnRH-A: [D-Ala6,N-Me-Leu7, Pro4-NHRt]GnRH; antagonista 5: [DpGlu1,D-Phe2,D-Trp3,6]GnRH; antagonista 6: [Ac-D-Na(2)’,D-!-Me-pCl-Phe2,D-Trp3,D-Arg6,D-Ala10]GnRH;antagonista 13: [Ac-D-NaI1,D-!-4ClPhe2,D-Pal3,D-Arg6,D-Ala10]GnRH; antagonista 27: [Ac-D-NaI(2)1,D-!-Me-pCl-Phe2,D-Trp3,N-∋-lpr-Lys5,D,Tyr6,D-Ala10]GnRH (Van der Spuy y col., 1987, en LHRH and its Analogs: Contraceptive and Therapeutic Applications (Vickery, B. H. y Nestor, J. J. eds) NTP Press, Lancaster). Buserelina [DSer(But)6,Pro9]GnRH fue un regalo generoso de Hoerchst-Roussel Pharmaceuticals (Somerville, NJ, EE.UU.).

7.1.3. Transfección de células COS-1

El ADNc de GnRH-R humano se subclonó en un vector de expresión, pSV2A, que contenía un promotor temprano de SV40. Las células COS-1 se sometieron a transfección transitoria con la construcción pSV2A-GnRH-R humano usando el procedimiento de DEAE-dextrano (Keown y col., 1990, en Methods in Enzimology, VI. 185 (Goeddel, D.V., ed.) pág. 527-537, Academic Press, Nueva York). En estudios sobre unión de GnRH, 3 x 106 células/10 cm de placa se sometieron a transfección con 15 #g de ADN. Para los estudios sobre la producción de fosfato de inositol, 1,8 105 células/pocillo (placas de 12 pocillos) se sometieron a transfección con 1,5 #g de ADN. Las células seanalizaron 48 horas después de la transfección.

7.1.4. Unión al receptor

Se prepararon membranas celulares de células sometidas a transfección con una única etapa de centrifugación, como se ha descrito para las hipófisis de rata (Millar y col., 1989, J. Biol. Chem. 264: 21007-21013). El ensayo deunión al receptor se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente (Tsutsumi y col., 1992, Mol. Endocrinol. 6: 11631169) usando 125I-GnRH-A. Para estimar la unión inespecífica se usó GnRH-A 10-7 M.

7.1.5. Estimulación de producción de fosfato de inositol

La producción de fosfato de inositol (IP) estimulada por GnRH se determinó como se ha descrito (Davidson y col., 1990, Endocrinology 126: 80-87). La acumulación de [3H]IP en presencia de LiCl se usó como un índice del

recambio de fosfato de inositol. Brevemente, las células sometidas a transfección se marcaron durante la noche con [3H[inositol y se estimularon con GnRH 1,0 #M en presencia de LiCl. La reacción se detuvo mediante la adición deuna solución de ácido perclórico y ácido fítico. Tras neutralizar con KOH, los fosfatos de inositol se separaron en una columna de intercambio iónico Dowex y se contaron.

7.1.6. Análisis por técnica northern blot y por PCR

Se preparó ARN a partir de seis hipófisis humanas (cinco machos, una hembra, edad 30-45) y testículos humanos (edad 80) mediante extracción con tiocianato de guanidinio seguida por centrifugación en cloruro de cesio (Sambrook y col., 1989, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). El ARN poli(A) de hipófisis (1,6 #g) y de testículo (0,9 #g) preparado usando el sistema de aislamiento de ARNm Promega PolyA Tract se sometió a electroforesis a través de un gel de agarosa al 1 %, formaldehído 2,2M, se transfirió a una membrana de nitrocelulosa (HYbond-C extra, Amersham) en 20 x SSC y sefijó al vacío a 80 ºC. El inserto de la construcción LC27-4 se marcó a una actividad específica de 7,2 x 106 cpm/#gcon el Kit de marcaje Amersham Megaprime. Las transferencias se hibridaron previamente (2 h) y se hibridaron (durante la noche) en Pipes 2x, formamida al 50 %, SDS al 0,5 %, 100 #g/ml de ADN de esperma de arenque a 42ºC, seguido por lavado (lavado final SSC 0,2x, SDS al 0,1 % a 60 ºC durante 10 minutos). Con el fin de delinear la extensión de la secuencia sin traducir en 5’ y 3’ en el ARN humano, los clones identificados en filtros duplicados enla detección selectiva en la biblioteca principal que no se purificaron se usaron como moldes para la PCR con pares de cebadores dirigidos contra el sitio de clonación GT10 y el inserto GnRH-R humano conocido. Los productos de la reacción de PCR obtenidos se compararon con los obtenidos usando el clon LC27-4 como el molde para la PCR en geles de agarosa al 1 %.

7.2. Resultados

7.2.1. Clonación y caracterización de GnRH-R humano

La secuenciación del clon LC-27-4 identificó un inserto de 2160 pb (fig. 9). El marco de lectura abierto más largo (1008 pb) se extiende hacia el extremo 5’ del clon. El sitio de iniciación de la traducción se asigna al primer ATG en parte por la presencia de una secuencia consenso Kozak (Kozak, 1987 Nucleic Acids Res. 15: 8125-8148). Dado que el clon caracterizado permanece en el marco de lectura en la totalidad de su extensión 5’, no se puede excluir laexistencia de sitios de iniciación adicionales aguas arriba. Sin embargo, la presencia de otra región codificadora adicional en 5’ se considera poco probable a causa de la elevada homología con el receptor de ratón del que el sitio de iniciación de la traducción se puede asignar con mayor certeza (Tsutsumi y col., 1992). Por tanto el ADNc del receptor humano contiene un marco de lectura de 984 pb que codifica una proteína de 328 aminoácidos con un 90 % de identidad con la secuencia predicha del receptor de ratón. La región larga en 3’ sin traducir no contiene señalde poliadenilación.

El análisis por técnica northern se llevó a cabo determinando el tamaño del ARN del GnRH-R humano de longitud completa. La sonda reveló una única banda de %4,7 kb en ARN poli(A) de hipófisis humana (Fig.10). No se detectóseñal alguna en ARN poli(A) purificado a partir de testículo humano o con un control de ADNc de ∀-actina. Para determinar la extensión de los dominios 5’ y 3’ sin traducir del ARN se realizó un análisis de PCR de los aislamientos de fago de la selección de la biblioteca principal. Se usó un cebador oligonucleotídico antisentido que representaba la secuencia cercana al extremo 5’ del inserto LC27-4 o un cebador sentido cerca del extremo 3’ de la misma secuencia junto con cebadores diseñados contra el sitio de clonación GT1 adyacente formando el mapa de los clones no purificados. Los productos de la PCR más largos identificados tenían 1,3 kb de secuencia 5’ adicional y 0,3 kb de secuencia 3’ adicional (no se muestra). Estos datos sugieren que el ARNm de GnRH-R contiene al menos 1,3 kb de secuencia sin traducir en 5’ y 1,5 kb de secuencia sin traducir en 3’. En base a los datos de la técnica northern, esto sugiere que no está contenida secuencia adicional sin traducir (< 1kb) en ninguno de los clones aislados.

Mediante análisis de hidrofobicidad (Kyte-Dolittle) se identificaron los siete dominios hidrófobos característicos de los receptores acoplados a proteína G (véase la fig. 9). Como se descubrió en la estructura predicha del receptor deratón, el GnRH-R humano carece esencialmente de cualquier dominio intracelular C-terminal. Están presentes dos sitios de glucosilación ligados a N potenciales, uno en cada uno de los dos primeros dominios extracelulares. En los dominios intracelulares se encuentran varios residuos citoplásmicos de serina y treonina y pueden servir como sitios de regulación de la fosforilación.

7.2.2. Inyecciones en ovocitos de Xenopus

El clon aislado más largo, LC27-4, contenía un inserto de %2,2 kb. Para comprobar si este clon codificaba un GnRH-R funcional humano, se inyectó transcrito de ARN sintético en ovocitos de Xenopus. Todos los ovocitos en los que se inyectó ARN desarrollaron grandes corrientes despolarizantes tras la exposición a GnRH 2 x 10-7 M (n = 17) o a burserelina 2 x 10-7 M (n = 6; fig. 1), que eran indistinguibles de las respuestas obtenidas después de la expresión de GnRH-R de mamífero en ovocitos usando ARN tisular o de la línea celular (Sealfon y col., 1990, Mol. Endocrinol. 4: 119-124). Estas respuestas se bloquearon por completo por concentraciones equimolares de dos potentesantagonistas del receptor de GnRH (n = 5 para cada uno; fig. 6).

7.2.3. Expresión de GnRH-R humano en células COS-1

Para caracterizar más el GnRH-R humano clonado, el receptor se expresó en células COS-1. Los datos de unión obtenidos usando membranas de células COS-1 sometidas a transfección con la construcción de GnRH-R humano se presentan en la figura 7. El desplazamiento de la GnRH-A por GnRH-A, GnRH y antagonista 5 tenía constantes de disociación de 0,97 nM, 2,8 nM y 8,4 nM respectivamente, valores similares a los obtenidos anteriormente con membranas de hipófisis humana (Wronald y col., 1985, J. Clin. Endocrinol. Metab. 61: 1190-1198).

El receptor expresado en las células COS-1 fue funcional y se descubrió que estaba acoplado al metabolismo del fosfato de inositol. Se logró un incremento de 8 veces en el metabolismo de fosfoinositol a estimulación máxima y la la CE50 de GnRH fue -3 nM. La estimulación del recambio de PI inducido por GnRH (10-8 M) se inhibió por unantagonista de GnRH de un modo dependiente de concentración (fig. 8). La producción de fosfato de inositol (10-8 M)estimulada con GnRH se inhibió por el antagonista 13 con una CI50 de 6,7 x 10-9 M y por el antagonista 5 con una CI50 de 1,05 x 10-7 M (datos no mostrados), lo que da valores de Kd de 2,1 x 10-10 M y de 3,6 x 10-9 M, respectivamente (Leslie F.M. 1987 Pharmacol. Rev. 39: 197-247).

Debe entenderse que todas las longitudes de pares de bases dadas para los nucleótidos son aproximadas y se usancon el propósito de describir.

Listado de secuencias

(1)

INFORMACIÓN GENERAL:

(i)

SOLICITANTE: Sealfon, Stuart C.

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Clonación y expresión del receptor de la hormona liberadora de gonadotropina

(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 4

(iv)

DIRECCIÓN POSTAL:

(v)

FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release n.º: 1, versión n.º: 1.25.

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: pendiente de asignación

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 21 de junio de 1993

(C)

CLASIFICACIÓN:

(A)

DESTINATARIO: Pennie y Edmons

(B)

CALLE: 1155 Avenue of Americas

(C)

CIUDAD: Nueva York

(D)

ESTADO: Nueva York

(E)

PAÍS: EE.UU.

(F)

CÓDIGO POSTAL: 10036-2711

(viii) INFORMACIÓN ABOGADO/AGENTE

(A)

NOMBRE: Misrock, S. Leslie

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 18.872

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 6923-035

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

(A)

TELÉFONO: 212 790-9090

(B)

TELEFAX: 212 869-8864/9741

(C)

TÉLEX: 66141 PENNIE

(2)

INFORMACIÓN DE LA SEC ID N.º: 1:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1227 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 43..1023

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º: 1:

(2)

INFORMACIÓN DE LA SEC ID N.º: 2:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 327 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º: 2:

(2)

INFORMACIÓN DE LA SEC ID N.º: 3:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 2160 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 25..1008

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º: 3:

(2)

INFORMACIÓN DE LA SEC ID N.º: 4:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 328 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º: 4:

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una molécula de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica:

   (a)

   un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos SEC ID N.º: 2; o

   (b)

   el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a)

   5 2. La molécula de ADN aislada de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende la secuencia de nucleótidosde la SEC ID N.º: 1.

2. 3.

   Un vector recombinante que comprende la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1, o 2.

3. 4.

   Un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1, o 2 asociada

   operativamente con una secuencia de nucleótidos reguladora que contiene información de regulación de la 10 transcripción y de la traducción que controla la expresión de la secuencia de nucleótidos en una célula huésped.
4. 5. Un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1, o 2, asociada operativamente con una secuencia de nucleótidos reguladora que contiene información de regulación de la transcripción y de la traducción que controla la expresión de la secuencia de nucleótidos en una célula huésped.
5. 6. Una célula que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende la secuencia de 15 nucleótidos de la reivindicación 1.

6. 7.

   Una célula sometida a ingeniería genética que comprende el vector de expresión de la reivindicación 5.

7. 8.

   Un receptor aislado de GnRH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2.

8. 9.

   Un procedimiento para producir receptor recombinante de GnRH, o proteína de fusión de receptor recombinante de GnRH, que comprende:

   20 (a) cultivar una célula huésped transformada con el vector de expresión de la reivindicación 5 y que expresa el receptor de GnRH; y

   (b) recuperar el receptor de GnRH.
9. 10. Un oligonucleótido antisentido complementario a un gen que codifica el receptor de GnRH de la reivindicación 8 que inhibe la transcripción del gen en una célula.

   25 11. El oligonucleótido de la reivindicación 10 que es complementario a una secuencia de nucleótidos que codifica la región transmembrana del receptor de GnRH de la reivindicación 8.
10. 12. Un anticuerpo monoclonal que se une de forma inmunoespecífica a un epítopo del receptor de GnRH de lareivindicación 8.
11. 13. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 12 que inhibe de forma competitiva la unión de GnRH al30 receptor de GnRH de la reivindicación 8.