ES2208868T3 - Moleculas de acidos nucleicos procedentes de plantas, que codifican enzimas, que participan en la sintesis de almidon. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICAN ENZIMAS Y QUE PARTICIPAN EN LA SINTESIS DEL ALMIDON EN PLANTAS. LAS ENZIMAS REPRESENTAN UNA NUEVA ISOFORMA DE LA SINTESIS DEL ALMIDON. LA INVENCION TRATA ADEMAS DE VECTORES Y CELULAS HUESPED QUE HAN SIDO TRANSFORMADAS CON LAS MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO DESCRITAS, EN ESPECIALES CELULAS DE PLANTAS TRANSFORMADAS Y PLANTAS REGENERABLES DE ESTAS QUE MUESTRAN UNA ACTIVIDAD INCREMENTADA O REDUCIDA DE LA PROTEINA DESCRITA.

Description

Moléculas de ácidos nucleicos procedentes de plantas, que codifican enzimas, que participan en la síntesis de almidón.

El presente invento se refiere a moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una enzima, que participa en la síntesis de almidón en plantas. En el caso de esta enzima se trata de una nueva isoforma de la sintasa de almidón.

Además, este invento se refiere a vectores, bacterias, así como a células de plantas transformadas con las descritas moléculas de ácidos nucleicos, y a plantas regenerables a partir de estas células.

Por lo demás, se describen procedimientos para la producción de plantas transgénicas, que por causa de la introducción de moléculas de ADN, que codifican una sintasa de almidón, sintetizan un almidón modificado en cuanto a sus propiedades.

En atención a la importancia creciente, que se atribuye en los últimos tiempos a las sustancias constituyentes de plantas como fuentes renovables de materias primas, una de las misiones de la investigación biotecnológica es una adaptación de estas materias primas vegetales a los requisitos de la industria elaboradora. Con el fin de hacer posible una utilización de materias primas renovables en el mayor número posible de sectores de empleo, es necesario, además de esto, conseguir una gran diversidad de sustancias.

Junto a los aceites, las grasas y las proteínas, los polisacáridos constituyen las materias primas esencialmente renovables procedentes de plantas. Una posición central primordial entre los polisacáridos la ocupa, junto a la celulosa, el almidón, que es una las sustancias almacenadas más importantes en plantas superiores. En este contexto, el maíz es una de las plantas más interesantes, puesto que es la planta cultivada mundialmente más importante para la producción de almidón.

El polisacárido almidón es un polímero a base de eslabones fundamentales químicamente uniformes, a saber las moléculas de glucosa. Sin embargo, en este caso se trata de una mezcla muy compleja de diferentes formas moleculares, que se diferencian en lo que se refiere a su grado de polimerización y a la aparición de ramificaciones de las cadenas de glucosa. Por tanto, el almidón no constituye ninguna materia prima uniforme. Se diferencia en particular, el almidón de amilosa, un polímero esencialmente no ramificado, a base de moléculas de glucosa unidas por enlaces \alpha-1,4-glicosídicos, con respecto al almidón de amilopectina, que por su parte constituye una mezcla compleja a base de cadenas de glucosa ramificadas de manera diversa. Las ramificaciones se realizan en este caso por medio de la aparición de uniones por enlaces \alpha-1,6-glicosídicos adicionales. En plantas típicas utilizadas para la producción de almidón, tales como p.ej. maíz o patata, el almidón sintetizado se compone en aproximadamente un 25% de almidón de amilosa y en aproximadamente un 75% de almidón de amilopectina.

Para hacer posible una utilización lo más amplia que sea posible del almidón, es deseable poner a disposición plantas, que estén en situación de sintetizar un almidón modificado, que se adecue en particular para diferentes finalidades de utilización. Una posibilidad de poner a disposición tales plantas, consiste -junto a las medidas de cultivación- en la modificación genética deliberada del metabolismo de almidón que presentan las plantas productoras de almidón mediante métodos de tecnología genética. Una premisa para ello es, no obstante, la identificación y la caracterización de las enzimas que participan en la síntesis y/o la modificación del almidón, así como el aislamiento de las correspondientes moléculas de ADN, que codifican estas enzimas.

Las vías de síntesis bioquímicas, que conducen a la formación de almidón son esencialmente conocidas. La síntesis de almidón en células de plantas tiene lugar en los plastidios. En tejidos activos fotosintéticamente, éstos son los cloroplastos, y en tejidos inactivos fotosintéticamente, que almacenan almidón, éstos son los amiloplastos.

Las enzimas más importantes, que participan en la síntesis de almidón, son las sintasas de almidón así como las enzimas ramificadoras. En el caso de las sintasas de almidón, se han descrito ya diversas isoformas, todas las cuales catalizan una reacción de polimerización por transferencia de un resto de glucosilo desde la ADP-glucosa a \alpha-1,4-glucanos. Las enzimas ramificadoras catalizan la introducción de ramificaciones \alpha-1,6 en \alpha-1,4-glucanos lineales.

Las sintasas de almidón se pueden subdividir en dos clases: las sintasas de almidón fijadas a granos de almidón (del inglés "granule-bond starch synthases"; GBSS) y las sintasas de almidón solubles (del inglés "soluble starch synthases"; SSS). Esta diferenciación no puede realizarse inequívocamente en todos los casos, puesto que algunas de las sintasas de almidón se presentan tanto fijadas a granos de almidón como también en una forma soluble (Denyer y colaboradores, Plant J. 4 (1993), 191-198; Mu y colaboradores, Plant J. 6 (1994), 151-159). Para diversas especies de plantas se describen, dentro de estas clases, a su vez, diversas isoformas, que se diferencian en lo que se refiere a su dependencia con respecto de moléculas iniciadoras (las denominadas sintasas de almidón "dependientes de cebadores" [del inglés "primer dependent"] (del tipo II) y las denominadas sintasas de almidón "independientes de cebadores" [del inglés "primer independent"] (del tipo I)).

Solamente para la isoforma GBSS I se ha conseguido hasta ahora determinar la función exacta en el caso de la síntesis de almidón. Las plantas, en las que esta actividad enzimática está reducida de un modo grande o total, sintetizan un almidón exento de amilosa (el denominado en inglés "waxy" = "ceroso") (Shure y colaboradores, Cell 35 (1983), 225-223; Visser y colaboradores, Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 289-296; documento de patente internacional WO 92/11376), de tal manera que a esta enzima se le atribuye un cometido decisivo en el caso de la síntesis de almidón de amilosa. Este fenómeno se observa asimismo en células de la alga verde Chlamydomonas reinhardtii (Delrue y colaboradores, J. Bacteriol. 174 (1992), 3.612-3.620). En el caso de la Chlamydomonas se pudo mostrar, además de esto, que la GBSS I no sólo participa en la síntesis de la amilosa, sino que tiene también una influencia sobre la síntesis de la amilopectina. En mutantes, que no tienen ninguna actividad de GBSS I, falta una determinada fracción de la amilopectina sintetizada normalmente, que tiene glucanos de cadenas más largas.

Las funciones de las otras isoformas de las sintasas de almidón fijadas a granos de almidón, en particular la GBSS II, y de las sintasas de almidón solubles, no se han puesto en claro hasta ahora. Se supone que las sintasas de almidón solubles participan, en común con enzimas ramificadoras, en la síntesis de la amilopectina (véase p.ej. la cita de Ponstein y colaboradores, Plant Physiol. 92 (1990), 234-241), y que ellas desempeñan una función importante en la regulación del régimen de síntesis del almidón.

En el caso de maíz se identificaron dos isoformas de las sintasas de almidón fijadas a granos de almidón, así como dos o tres isoformas de las sintasas de almidón solubles (Hawker y colaboradores, Arch. Biochem. Biophys. 160 (1974), 530-551; Pollock y Preiss, Arch. Biochem. Biophys. 204 (1980), 578-588; MacDonald y Preiss, Plant Physiol. 78 (1985), 849-852; Mu y colaboradores, Plant J. 6 (1994), 151-159).

Ya se han descrito un ADNc que codifica una GBSS I procedente de maíz, así como un ADN genómico (Shure y colaboradores, Cell 35 (1983), 225-233; Kloesgen y colaboradores, Mol. Gen. Genet. 203 (1986), 237-244). Además, se ha descrito una denominada marca de secuencia expresada [en inglés "Expressed Sequence Tag"] (= EST) (Shen y colaboradores, 1994, nº del GenBank'' = Banco de genes: T14684), cuya deducida secuencia de aminoácidos presenta una gran similitud con la deducida secuencia de aminoácidos de las GBSS II procedentes de guisante (Dry y colaboradores, Plant J. 2 (1992), 193-202) y de patata (Edwards y colaboradores, Plant J. 8 (1995), 283-294). Las secuencias de ácidos nucleicos, que codifican otras isoformas de sintasas de almidón procedentes de maíz, no estaban todavía a disposición hasta ahora. Secuencias de ADNc, que codifican otras sintasas de almidón diferentes de la GBSS I, se describieron hasta ahora solamente para guisante (Dry y colaboradores, Plant J. 2 (1992), 193-202), arroz (Baba y colaboradores, Plant Physiol. 103 (1993), 565-573) y patata (Edwards y colaboradores, Plant J. 8 (1995), 283-294).

Aparte de en el maíz, se identificaron sintasas de almidón solubles también en una serie de otras especies de plantas. Se han aislado sintasas de almidón solubles, por ejemplo hasta la homogeneidad, procedentes de guisante (Denyer y Smith, Planta 186 (1992), 609-617) y de patata (Edwards y colaboradores, Plant J. 8 (1995), 283-294). En estos casos, se puso de manifiesto que la isoforma identificada como SSS II de la sintasa de almidón soluble es idéntica a la sintasa de almidón fijada a granos de almidón GBSS II (Denyer y colaboradores, Plant J. 4 (1993), 191-198; Edwards y colaboradores, Plant J. 8 (1995), 283-294). Para algunas otras especies de plantas se describió con ayuda de métodos cromatográficos la presencia de varias isoformas de SSS, por ejemplo, en el caso de cebada (Tyynelä y Schulman, Physiologia Plantarum 89 (1993) 835-841; Kreis, Planta 148 (1980), 412-416) y en el caso de trigo (Rijven, Plant Physiol. 81 (1986), 448-453). Secuencias de ADN, que codifiquen estas proteínas, no han sido descritas sin embargo hasta ahora.

Para poner a disposición otras posibilidades de modificar cualesquiera plantas que almacenan almidón, de tal manera que sinteticen un almidón modificado, es necesario identificar en cada caso secuencias de ADN, que codifiquen otras isoformas de las sintasas de almidón.

El presente invento está basado, por consiguiente, en la misión de poner a disposición moléculas de ácidos nucleicos que codifiquen enzimas que participen en la biosíntesis de almidón y con cuya ayuda sea posible producir plantas modificadas por tecnología genética, que presenten una actividad aumentada o reducida de estas enzimas, con lo que se llegue a una modificación de las propiedades químicas y/o físicas del almidón sintetizado en estas plantas.

El problema planteado por esta misión se resuelve mediante la puesta a disposición de las formas de realización reseñadas en las reivindicaciones.

El presente invento se refiere, por consiguiente, a moléculas de ácidos nucleicos, que codifican proteínas con la actividad biológica de una sintasa de almidón, codificando tales moléculas preferentemente proteínas, que abarcan la secuencia de aminoácidos indicada bajo SEQ ID NO:2. En particular, el invento se refiere a moléculas de ácidos nucleicos que contienen la secuencia de nucleótidos indicada bajo SEQ ID NO:1 o una parte de ésta, preferentemente moléculas que abarcan la región codificadora indicada en SEQ ID NO:1 o secuencias de ribonucleótidos correspondientes.

Son objeto del invento asimismo moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una sintasa de almidón y cuya secuencia se desvía, a causa de la degeneración del código genético, de las secuencias de nucleótidos que se han descrito anteriormente.

Además, el presente invento se refiere a moléculas de ácidos nucleicos que codifican una sintasa de almidón y que se hibridan con una de las moléculas descritas anteriormente en condiciones rigurosas. El invento se refiere también a moléculas de ácidos nucleicos, que tienen una secuencia que es complementaria con la totalidad o con una parte de la secuencia de las moléculas de ácidos nucleicos anteriormente citadas.

En el caso de las moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con el invento se puede tratar de moléculas tanto de ADN como también de ARN. Las correspondientes moléculas de ADN son, por ejemplo, moléculas genómicas o de ADNc. Las moléculas de ARN pueden ser, por ejemplo, moléculas de ARNm (ácidos ribonucleicos mensajeros) o moléculas de ARN antisentido.

El concepto de "hibridación" significa en el marco de este invento una hibridación en condiciones rigurosas, tal como ha sido descrita, por ejemplo, en la obra de Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Las moléculas de ácidos nucleicos, que se hibridan con las moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con el invento, pueden proceder en principio de cualquier organismo arbitrario (es decir, de procariotas o eucariotas, en particular de bacterias, hongos, algas, plantas u organismos animales), que posea tales moléculas. Éstas proceden, preferiblemente, de plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas, en particular de plantas útiles, y de modo especialmente preferido de plantas que almacenan almidón, en particular de maíz.

Las moléculas de ácidos nucleicos, que se hibridan con las moléculas de acuerdo con el invento, se pueden aislar p.ej. a partir de bibliotecas genómicas o de ADNc (ácidos desoxirribonucleicos complementarios) de diversos organismos.

La identificación y el aislamiento de tales moléculas de ácidos nucleicos a partir de plantas o de otros organismos se puede efectuar, en este caso, mediando utilización de las moléculas de acuerdo con el invento, o de partes de estas moléculas, o bien de los complementos inversos de estas moléculas, p.ej. mediante hibridación de acuerdo con procedimientos clásicos (véase p.ej. la obra de Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Como sonda de hibridación se pueden utilizar p.ej. moléculas de ácidos nucleicos, que tienen exactamente o en lo esencial la secuencia de nucleótidos indicada bajo SEQ ID NO:1, o partes de esta secuencia. En el caso de los fragmentos utilizados como sonda de hibridación se puede tratar también de fragmentos sintéticos, que se habían producido con ayuda de las técnicas de síntesis habituales y cuya secuencia coincide en lo esencial con la de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el invento. Cuando se han identificado y aislado genes, que se hibridan con las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con el invento, es necesario llevar a cabo una determinación y un análisis de las propiedades de las proteínas codificadas por esta secuencia.

Las moléculas que se hibridan con las moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con el invento abarcan también fragmentos, derivados y variantes alélicas de las moléculas de ADN anteriormente descritas, que codifican una proteína de acuerdo con el invento. Por fragmentos se entienden, en este caso, partes de las moléculas de ácidos nucleicos, que son lo suficientemente largas como para codificar una de las proteínas descritas. La expresión "derivado" significa, en este contexto, que las secuencias de estas moléculas se diferencian en una o varias posiciones con respecto de las secuencias de las moléculas de ácidos nucleicos anteriormente descritas, y que presentan un alto grado de homología con estas secuencias. "Homología" significa en este caso una identidad entre secuencias de por lo menos 60%, preferiblemente de más que 80% y en particular de más que 90%. Las desviaciones con respecto a las moléculas de ácidos nucleicos anteriormente descritas pueden haber resultado en este caso, por deleción (supresión), sustitución, inserción o recombinación.

"Homología" significa, además, que existe una equivalencia funcional y/o estructural entre las correspondientes moléculas de ácidos nucleicos o entre las proteínas codificadas por ellas. En el caso de las moléculas de ácidos nucleicos, que son homólogas con las moléculas anteriormente descritas y que constituyen derivados de estas moléculas, se trata por regla general de variaciones de estas moléculas, que constituyen modificaciones, que ejercen la misma función biológica. En este caso, se puede tratar tanto de variaciones que aparecen de una manera natural, por ejemplo de secuencias de otros organismos, o de mutaciones, pudiendo estas mutaciones haber aparecido de una manera natural o haber sido introducidas mediante mutagénesis deliberada. Además de esto, en el caso de las variaciones, se puede tratar de secuencias producidas por síntesis. En el caso de las variantes alélicas, se puede tratar tanto de variantes que se presentan en la naturaleza, como también de variantes producidas por síntesis o producidas mediante técnicas de ADN recombinantes.

Las proteínas codificadas por las diferentes variantes de las moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con el invento presentan determinadas características comunes. A éstas pertenecen p.ej. la actividad enzimática, el peso molecular, la reactividad inmunológica, la conformación, etc., así como propiedades físicas tales como p.ej. el comportamiento de movimiento en las electroforesis en gel, el comportamiento cromatográfico, los coeficientes de sedimentación, la solubilidad, las propiedades espectroscópicas, la estabilidad; el valor óptimo del pH, el valor óptimo de la temperatura, etc.

Características importantes de una sintasa de almidón son: i) su localización en el estroma de los plastidios de células de plantas; ii) su capacidad para la síntesis de poliglucanos unidos por enlaces en \alpha-1,4 mediando utilización de ADP-glucosa como substrato. Esta actividad puede ser determinada tal como se ha descrito en la cita de Denyer y Smith (Planta 186 (1992), 606-617), o como se ha descrito en los Ejemplos. Las moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con el invento pueden proceder en principio de cualquier organismo, que exprese las proteínas descritas, preferiblemente de plantas, en particular de plantas que sintetizan almidón o almacenan almidón. Éstas pueden ser plantas tanto monocotiledóneas como también dicotiledóneas. En este caso, se prefieren en particular especies de cereales (tales como cebada, centeno, avena, trigo, etc.), maíz, arroz, guisante, mandioca, patata, etc.

En el caso de las proteínas codificadas por las moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con el invento, se trata de una isoforma, que hasta ahora no ha sido identificada ni caracterizada, de una sintasa de almidón de procedencia vegetal. Estas proteínas presentan la actividad enzimática de una sintasa de almidón, así como también ciertas zonas de homología con sintasas de almidón procedentes de plantas, conocidas hasta ahora, pero no pueden ser coordinadas inequívocamente con ninguna de las isoformas conocidas hasta ahora.

Las proteínas codificadas por las moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con el invento tienen en particular la propiedad de que ellas, después de su introducción en una mutante de E. coli, en la que se han delecionado (suprimido) todos los genes glg y que expresa una ADP-glucosa-pirofosforilasa mutada, desregulada, de la cultivación de esta mutante en un medio que contiene glucosa, y del tratamiento con vapor de yodo conduce a una coloración de azul de las colonias de bacterias.

Son objeto del invento también oligonucleótidos que se hibridan específicamente con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el invento. Tales oligonucleótidos tienen preferiblemente una longitud de por lo menos 10, en particular de por lo menos 15, y de manera especialmente preferida de por lo menos 50 nucleótidos. Estos oligonucleótidos están caracterizados porque se hibridan específicamente con las moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con el invento, es decir, que no se hibridan, o sólo se hibridan en muy pequeña medida, con secuencias de ácidos nucleicos que codifican otras proteínas, en particular otras sintasas de almidón. Los oligonucleótidos de acuerdo con el invento se pueden utilizar como cebadores para una reacción de PCR (de Polymerase Chain Reaction = reacción en cadena de polimerasa). Asimismo, éstos se pueden utilizar como componentes de estructuras (construcciones) artificiales antisentido o de moléculas de ADN, que codifican ribozimas apropiadas.

Además de esto, el invento se refiere a vectores, en particular a plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos y otros vectores habituales en la tecnología genética, que contienen las moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con el invento, que se han descrito anteriormente.

En una forma de realización preferida, las moléculas de ácidos nucleicos, contenidas en los vectores, están unidas con elementos reguladores, que garantizan la transcripción y la síntesis de un ARN traducible en células procarióticas o eucarióticas. La expresión de las moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con el invento en células procarióticas, por ejemplo en Escherichia coli, es interesante por cuanto que de esta manera se hace posible una caracterización más exacta de las actividades enzimáticas de las enzimas, para las que codifican estas moléculas. En particular, es posible caracterizar el producto que es sintetizado por las correspondientes enzimas en ausencia de otras enzimas, que participan en la síntesis de almidón en la célula vegetal. Esto permite sacar conclusiones acerca de la función que ejerce la correspondiente proteína en la síntesis de almidón en la célula vegetal.

Además de esto, es posible, mediante técnicas de biología molecular habituales (véase p.ej. la obra de Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), introducir mutaciones de diversos tipos en las moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con el invento, con lo que se llega a una síntesis de proteínas con propiedades biológicas eventualmente modificadas. En este caso, es posible, por una parte, la producción de mutantes por deleción, en las que se producen, mediante deleciones progresivas desde el extremo 5' o 3' de la secuencia de ADN codificadora, moléculas de ácidos nucleicos que conducen a la síntesis de unas proteínas acortadas de una manera correspondiente. Mediante tales deleciones en el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos es posible, por ejemplo, identificar secuencias de aminoácidos que son responsables de la translocación de la enzima en los plastidios (péptidos de tránsito). Esto permite preparar de una manera deliberada enzimas, que por eliminación de las correspondientes secuencias, ya no están localizadas en los plastidios, sino en el citosol, o que por causa de la adición de otras secuencias de señal, están localizadas en otros compartimientos.

Por otra parte, también es concebible la introducción de mutaciones puntuales en posiciones, en las que una modificación de la secuencia de aminoácidos tiene una influencia, por ejemplo, sobre la actividad enzimática o sobre la regulación de la enzima. De esta manera, se pueden producir por ejemplo, mutantes que poseen un índice K_{m} modificado, o que ya no están sujetas a los mecanismos de regulación presentes normalmente en la célula, a través de una regulación alostérica o de una modificación covalente.

Por lo demás, se pueden producir mutantes, que tienen una especificidad modificada para el substrato o para el producto, tales como p.ej. mutantes, que como substrato utilizan ADP-glucosa-6-fosfato en lugar de ADP-glucosa. Además, se pueden producir mutantes que tienen un perfil modificado de actividad y temperatura.

Para la manipulación por tecnología genética en células procarióticas, las moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con el invento, o partes de estas moléculas, se pueden introducir en plásmidos, que permiten una mutagénesis o una modificación de las secuencias mediante recombinación de secuencias de ADN. Con ayuda de procedimientos clásicos (compárese la obra de Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloning: A laboratory manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, EE.UU) se pueden llevar a cabo intercambios de bases o se pueden añadir secuencias naturales o sintéticas. Para la unión de los fragmentos de ADN unos con otros se pueden adosar adaptadores o engarzadores a los fragmentos. Además, se pueden emplear manipulaciones, que ponen a disposición los adecuados sitios de corte por restricción o que eliminan los ADN o sitios de corte por restricción superfluos. Donde entran en cuestión inserciones, deleciones o sustituciones, se pueden utilizar una mutagénesis in vitro, una reparación con cebadores (del inglés "primer repair"), una restricción o una ligación. Como método de análisis se llevan a cabo generalmente un análisis de las secuencias, un análisis por restricción y otros métodos bioquímicos y de biología molecular.

En otra forma de realización, el invento se refiere a células hospedantes, en particular a células procarióticas o eucarióticas, que son transformadas y modificadas genéticamente con una molécula de ácido nucleico como se ha descrito anteriormente o con un vector de acuerdo con el invento, así como a células, que se derivan de células transformadas de tal modo y que contienen una molécula de ácido nucleico o un vector de acuerdo con el invento. En este caso, se trata preferiblemente de células bacterianas o de células de plantas.

Son objeto del invento, además, las proteínas o los fragmentos biológicamente activos de éstas, que son codificados por las moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con el invento, así como los procedimientos para su preparación, realizándose que una célula hospedante de acuerdo con el invento se cultiva en condiciones que permiten la síntesis de la proteína, y a continuación la proteína se aísla a partir de la célula cultivada y/o del medio de cultivo.

Mediante la puesta a disposición de las moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con el invento es posible, por fin, intervenir con ayuda de métodos de tecnología genética en el metabolismo de almidón que presentan las plantas, cosa que hasta ahora no era posible, y modificarlo de tal manera que se llegue a la síntesis de un almidón modificado, que se haya modificado, por ejemplo, en sus propiedades físico-químicas, en particular en la relación de amilosa a amilopectina, el grado de ramificación, la longitud media de las cadenas, el contenido de fosfatos, el comportamiento de engrudado, el tamaño de los granos de almidón y/o la forma de los granos de almidón, en comparación con el almidón sintetizado en plantas de tipo silvestre. Mediante un aumento de la actividad de las proteínas de acuerdo con el invento, por ejemplo mediante una sobreexpresión de correspondientes moléculas de ácidos nucleicos, o mediante la puesta a disposición de mutantes, que ya no están sujetas a los mecanismos de regulación propios de las células y/o que poseen diferentes dependencias respecto de la temperatura en lo que se refiere a su actividad, existe la posibilidad de aumentar el rendimiento en plantas modificadas correspondientemente por tecnología genética. La importancia económica de la posibilidad de intervenir en la síntesis de almidón solamente en el caso del maíz es evidente: el maíz es mundialmente la planta más importante para la obtención de almidón. Aproximadamente un 80% del almidón producido anualmente en todo el mundo se obtiene a partir de maíz.

Por consiguiente, es posible la expresión de las moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con el invento en células vegetales, con el fin de aumentar la actividad de la correspondiente sintasa de almidón. Además, es posible modificar las moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con el invento de acuerdo con los métodos conocidos por un experto en la materia, a fin de obtener sintasas de almidón de acuerdo con el invento, que ya no están sujetas a los mecanismos de regulación propios de las células, o que presenten unas dependencias modificadas con respecto de la temperatura o unas especificidades modificadas para el substrato o para el producto.

En el caso de la expresión de las moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con el invento en plantas existe fundamentalmente la posibilidad de que la proteína sintetizada pueda estar localizada en un compartimiento arbitrario de la célula de planta. Con el fin de conseguir una localización en un determinado compartimiento, se tiene que suprimir la secuencia que garantiza la localización en los plastidios y se tiene que unir la región codificadora remanente eventualmente con secuencias de ADN, que garantizan la localización en el respectivo compartimiento. Las secuencias de este tipo son conocidas (véanse, por ejemplo, las citas de Braun y colaboradores, EMBO J. 11 (1992), 3.219-3.227; Wolter y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald y colaboradores, Plant J. 1 (1991), 95-106).

El presente invento se refiere, por consiguiente, también a células de plantas transgénicas, que habían sido transformadas y modificadas genéticamente con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el invento, así como a células de plantas transgénicas, que proceden de células transformadas de tal modo. Las células de tales tipos contienen una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el invento, estando unida ésta, preferiblemente, con elementos de ADN reguladores, que garantizan la transcripción en células vegetales, en particular con un promotor. Las células de plantas transgénicas de acuerdo con el invento se pueden diferenciar, con respecto de las células de plantas que se presentan en la naturaleza, porque contienen integrada en su genoma una molécula de ADN de acuerdo con el invento, la cual, o bien no está presente en absoluto en las células de un modo natural, o por el contrario está presente en otro entorno genético, a saber en otro lugar del genoma. Las células de plantas, que contienen eventualmente por naturaleza en su genoma una molécula de ADN de acuerdo con el invento, se diferencian de las células de plantas de acuerdo con el invento en el hecho de que las citadas en último lugar contienen más copias de genes de las moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con el invento que las respectivas células de plantas que se presentan en la naturaleza, y en el hecho de que estas copias adicionales están integradas en otros sitios (loci) genéticos. Las características anteriormente mencionadas se pueden determinar, por ejemplo, mediante un análisis por transferencia de borrón Southern del ADN genómico.

Las células de plantas transgénicas se pueden regenerar según técnicas conocidas por un experto en la materia para formar plantas enteras. Las plantas que se pueden obtener mediante regeneración de las células de plantas transgénicas de acuerdo con el invento son asimismo un objeto del presente invento. Además, son objeto del invento las plantas que contienen las células de plantas transgénicas anteriormente descritas. En el caso de las plantas transgénicas se puede tratar en principio de plantas de cualquier especie arbitraria de plantas, es decir, de plantas tanto monocotiledóneas como también dicotiledóneas. De manera preferida, se trata de plantas útiles, en particular de plantas que sintetizan almidón o almacenan almidón, tales como p.ej. especies de cereales (centeno, cebada, avena, trigo, etc.), arroz, maíz, guisante, mandioca o patata.

El invento se refiere asimismo a materiales de multiplicación o reproducción de las plantas de acuerdo con el invento, por ejemplo, a frutas, semillas, tubérculos, rizomas, arbolitos nacidos de semillas, plantones, etc..

Las células vegetales y las plantas transgénicas de acuerdo con el invento sintetizan, por causa de la expresión o bien de la expresión adicional de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el invento, un almidón, que está modificado por ejemplo en sus propiedades físico-químicas, en particular en la relación de amilosa a amilopectina, en el grado de ramificación, en la longitud media de las cadenas, en el contenido de fosfato, en el comportamiento de engrudado, en el tamaño de los granos de almidón y/o en la forma de los granos de almidón, en comparación con el almidón sintetizado en plantas de tipo silvestre. En particular, un almidón de este tipo puede estar modificado en lo que se refiere a la viscosidad y/o a las propiedades de gelificación (= formación de geles) de engrudos de este almidón en comparación con un almidón de tipo silvestre.

Es objeto del presente invento, por consiguiente, también el almidón obtenible a partir de las células de plantas y las plantas transgénicas de acuerdo con el invento.

Además, es posible producir, con ayuda de las moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con el invento, células vegetales y plantas en las que se ha disminuido la actividad de una proteína de acuerdo con el invento. Esto conduce asimismo a la síntesis de un almidón con propiedades químicas y/o físicas modificadas en comparación con el almidón de células de plantas de tipo silvestre.

Un objeto adicional del invento son, por consiguiente, también células de plantas transgénicas, en las que se ha disminuido la actividad de una proteína de acuerdo con el invento, en comparación con las plantas no transformadas.

La producción de células de plantas con una actividad disminuida de una proteína de acuerdo con el invento, se puede conseguir, por ejemplo, mediante la expresión de un correspondiente ARN antisentido, de un ARN del mismo sentido para conseguir un efecto de cosupresión (supresión conjunta), o mediante la expresión de una ribozima construida de una manera correspondiente, que disocia específicamente transcritos, que codifican una de las proteínas de acuerdo con el invento, mediando utilización de las moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con el invento.

Preferiblemente, para la reducción de la actividad de una proteína de acuerdo con el invento en células de plantas, se expresa un ARN antisentido.

Para ello, se puede utilizar, por una parte, una molécula de ADN, que abarca toda la secuencia que codifica una proteína de acuerdo con el invento, inclusive las secuencias flanqueadoras eventualmente existentes, así como también moléculas de ADN, que abarcan solamente partes de la secuencia codificadora, teniendo estas partes que ser lo suficientemente largas como para producir un efecto antisentido en las células. Por lo general, se pueden utilizar secuencias hasta con una longitud mínima de 15 pb (pares de bases), preferiblemente una longitud de 100-500 pb, y para conseguir una inhibición antisentido eficiente, en particular secuencias con una longitud de más que 500 pb. Por regla general, se utilizan moléculas de ADN que son más cortas que 5.000 pb, preferiblemente secuencias que son más cortas que 2.500 pb. Se utilizan preferiblemente moléculas de ADN, que son homólogas en lo que se refiere a las especies de plantas que se han de transformar.

También es posible la utilización de secuencias de ADN, que presentan un alto grado de homología con las secuencias de las moléculas de ADN de acuerdo con el invento, pero que no son totalmente idénticas. La homología mínima debería ser mayor que aproximadamente 65%. Se ha de preferir la utilización de secuencias con unas homologías situadas entre 95 y 100%.

Las células de acuerdo con el invento se pueden diferenciar, por lo tanto, con respecto de las células que se presentan en la naturaleza, en el hecho de que contienen una molécula de ADN recombinante heteróloga, que codifica un ARN antisentido, una ribozima o un ARN de cosupresión (supresión conjunta). A causa de la expresión de esta molécula de ADN recombinante heteróloga, se llega a la disminución de la síntesis de una proteína de acuerdo con el invento en las células y, por consiguiente, a la disminución de la actividad correspondiente.

Un ADN "heterólogo" significa, en este contexto, que en el caso del ADN introducido en las células se trata de un ADN que de un modo natural no se presenta en esta forma en las células. En este caso, se puede tratar, por un lado, de un ADN, que no se presenta en absoluto de un modo natural en estas células transformadas, o también de un ADN, que, incluso cuando se presenta de un modo natural en estas células, está integrado como ADN exógeno en otros sitios (loci) genéticos y, por consiguiente, se encuentra en otro entorno genético distinto.

Las células de plantas transgénicas de acuerdo con el invento pueden ser regeneradas según técnicas conocidas por un experto en la materia para formar plantas enteras. Son objeto del invento, por consiguiente, también plantas que contienen las células de plantas transgénicas de acuerdo con el invento. En el caso de estas plantas se puede tratar, en principio, de plantas de cualquier especie arbitraria de plantas, es decir, plantas tanto monocotiledóneas como también dicotiledóneas. Preferiblemente, se trata de plantas útiles, es decir de plantas que son cultivadas por los seres humanos para la alimentación de seres humanos o de animales, o para finalidades técnicas. En particular, éstas son preferiblemente plantas que sintetizan almidón o bien almacenan almidón, tales como p.ej. especies de cereales (centeno, cebada, avena, trigo, etc.), arroz, maíz, guisante, mandioca o patata. El invento concierne asimismo a materiales de multiplicación y reproducción de las plantas de acuerdo con el invento, tales como p.ej. frutas, semillas, tubérculos, rizomas, arbolitos nacidos de semillas, plantones, etc..

Las células vegetales y las plantas transgénicas de acuerdo con el invento sintetizan, debido a la disminución de la actividad de una de las proteínas de acuerdo con el invento, un almidón que está modificado, por ejemplo, en sus propiedades físico-químicas, en particular en la relación de amilosa a amilopectina, el grado de ramificación, la longitud promedia de la cadena, el contenido de fosfato, el comportamiento de engrudado, el tamaño de los granos de almidón y/o la forma de los granos de almidón, en comparación con el almidón sintetizado en plantas de tipo silvestre. Este almidón puede mostrar, por ejemplo, modificadas viscosidades y/o propiedades de gelificación de sus engrudos en comparación con un almidón procedente de plantas de tipo silvestre.

Objeto del invento es, por consiguiente, también el almidón obtenible a partir de las células de plantas transgénicas y de las plantas anteriormente descritas.

Los almidones de acuerdo con el invento pueden ser modificados según procedimientos conocidos por un experto en la materia y se adecuan en una forma modificada o no modificada para diversas utilizaciones en el sector alimentario o no alimentario.

Fundamentalmente, la posibilidad de empleo del almidón se puede subdividir en dos grandes sectores. Uno de los sectores abarca los productos de hidrólisis del almidón, principalmente glucosa y eslabones de glucano, que se pueden obtener por medio de procedimientos enzimáticos o químicos. Éstos sirven como sustancias de partida para otras modificaciones químicas adicionales y para procesos, tales como los de fermentación. Para conseguir una reducción de los costes, puede ser importante, en este caso, la sencillez y la realización barata de un procedimiento de hidrólisis. Actualmente, éste se lleva a cabo esencialmente por vía enzimática mediando utilización de la amiloglucosidasa. Sería concebible un ahorro de costes mediante un menor empleo de enzimas. Una modificación de la estructura del almidón, p.ej. un aumento del tamaño de la superficie de los granos, una digestibilidad más fácil por medio de un menor grado de ramificación, o una estructura estérica que limite la accesibilidad para las enzimas empleadas, podría producir este ahorro.

El otro sector, en el que se utiliza el almidón, a causa de su estructura polimérica como el denominado almidón natural, se clasifica en otros dos sectores de empleo:

1. La industria alimentaria

El almidón es un aditivo clásico para muchos alimentos, en los que toma a su cargo esencialmente la función de la aglutinación de aditivos acuosos o provoca un aumento de la viscosidad o también una gelificación elevada. Importantes características de propiedades importantes son los comportamientos de fluencia y sorción, las temperaturas de hinchamiento y engrudado, la viscosidad y el rendimiento de espesamiento, la solubilidad del almidón, la transparencia y la estructura del engrudo, la estabilidad frente al calor, a la cizalladura y a los ácidos, la tendencia a la retrogradación, la capacidad para la formación de películas, la estabilidad en procesos de congelación y descongelación, la digestibilidad, así como la capacidad para la formación de complejos p.ej. con iones inorgánicos u orgánicos.

2. La industria no alimentaria

En este gran sector, el almidón se emplea como sustancia auxiliar para diversos procesos de fabricación o como aditivo para productos técnicos. En el caso de la utilización del almidón como sustancia auxiliar, se ha de citar aquí en particular la industria del papel y del cartón. El almidón sirve, en este caso, en primer término para la retardación (retención de materiales sólidos), la aglutinación de partículas de materiales de carga y relleno y de partículas finas, como material de consolidación y para la deshidratación. Además de esto, se aprovechan las ventajosas propiedades del almidón en lo que se refiere a la rigidez, la dureza, el sonido o tono, el tacto, el brillo, la lisura, la resistencia a la formación de fisuras, así como a las superficies.

2.1 Industria del papel y del cartón

Dentro del proceso de fabricación de papel se han de diferenciar cuatro sectores de aplicación, a saber la superficie, el estucado, la masa y la proyección.

Las exigencias planteadas al almidón en lo que se refiere al tratamiento de superficies son esencialmente un alto grado de blancura, una viscosidad adaptada, una alta estabilidad de la viscosidad, una buena formación de películas, así como una escasa formación de polvo fino. En el caso de la utilización en el estucado, el contenido de materiales sólidos, una viscosidad adaptada, una alta capacidad de aglutinación así como la alta afinidad para los pigmentos, desempeñan un cometido importante. Como adición a la masa son importantes una distribución rápida, uniforme, exenta de pérdidas, una alta estabilidad mecánica y una completa retención en el flujo de papel. En el caso del empleo del almidón en el sector de la proyección son importantes asimismo un contenido adaptado de materiales sólidos, una alta viscosidad, así como una alta capacidad de aglutinación.

2.2 Industria de los pegamentos

Un gran sector de empleo de los almidones consiste en la industria de los pegamentos, en donde las posibilidades de empleo se clasifican en cuatro sectores parciales: la utilización como cola pura de almidón, la utilización de colas de almidón tratadas con agentes químicos especiales, la utilización de almidón como aditivo para resinas sintéticas y dispersiones de polímeros, así como la utilización de almidones como agentes extendedores para pegamentos sintéticos. Un 90% de los pegamentos a base de almidón se emplean en los sectores de la fabricación de cartón ondulado, de la fabricación de sacos, bolsas y cucuruchos de papel, de la fabricación de materiales compuestos para papel y aluminio, de la fabricación de cartonajes y de cola rehumedecible para sobres, sellos de correo, etc.

2.3 Industria textil y de agentes para el cuidado de materiales textiles

Un gran sector de empleo para los almidones como agentes auxiliares y aditivos es el sector de la fabricación de materiales textiles y de agentes para el cuidado de materiales textiles. Dentro de la industria textil hay que diferenciar los siguientes cuatro sectores de empleo: El empleo de almidón como agente de apresto, es decir, como sustancia auxiliar para el alisamiento y el reforzamiento del comportamiento de trepa con el fin de proteger contra las fuerzas de tracción que atacan al tejer, así como para aumentar la resistencia a la abrasión al tejer, el empleo de almidón como agente para activar materiales textiles, sobre todo después de tratamientos previos que empeoran la calidad, tales como el blanqueo, la tinción, etc., el empleo de almidón como agente de espesamiento para la evitación de difusiones de los colorantes, así como el empleo de almidón como aditivo a agentes de encadenamiento para hilos de costura.

2.4 Industria de los materiales de construcción

El cuarto sector de empleo es la utilización de los almidones como aditivos en materiales de construcción. Un ejemplo de esto es la fabricación de planchas de cartón yeso, en la que el almidón entremezclado en la papilla de yeso se engruda con el agua, se difunde junto a la superficie de la plancha de yeso y allí fija el cartón a la plancha. Otros sectores de empleo son la adición a fibras de revoque y minerales. En el caso de hormigón transportable los productos de almidón se emplean para retardar el fraguado.

2.5 Estabilización de suelos

Un mercado adicional para el almidón se recomienda en la preparación de agentes para la estabilización de suelos, que se emplean en el caso de movimientos artificiales de tierras para la protección provisional de las partículas del suelo frente al agua. Los productos combinados a base de almidón y de emulsiones de polímeros son, según los conocimientos actuales, equiparables en su efecto reductor de la erosión y de la encostradura a los productos empleados hasta ahora, pero en cuanto al precio se encuentran manifiestamente por debajo de éstos.

2.6 Empleo en agentes fitoprotectores y fertilizantes

Un sector de empleo está situado en la utilización de almidón en agentes fitoprotectores con el fin de modificar las propiedades específicas de las formulaciones. Así, el almidón se puede emplear para mejorar la humectación y mojadura de agentes fitoprotectores y fertilizantes, para la liberación dosificada de las sustancias activas, para la transformación de sustancias activas líquidas, volátiles y/o malolientes en sustancias moldeables, estables y microcristalinas, para la mezcladura de compuestos incompatibles y para la prolongación de la duración de la actividad mediante disminución de la descomposición.

2.7 Industrias de fármacos, medicinas y productos cosméticos

Otro sector de empleo consiste en el sector de las industrias de fármacos, medicinas y productos cosméticos. En la industria farmacéutica, el almidón se puede emplear como agente aglutinante para tabletas o para diluir agentes aglutinantes en cápsulas. Además, el almidón puede servir como agente disgregante para tabletas, puesto que, después de haberlas tragado, éstas absorben líquido y después de un breve periodo de tiempo se hinchan hasta tal punto que la sustancia activa es puesta en libertad. Los polvos medicinales para espolvorear deslizantes, lubricantes y sobre heridas están basados, por motivos cualitativos, en almidón. En el sector de la cosmética, los almidones se emplean, por ejemplo, como vehículos o soportes de aditivos a polvos para espolvorear, tales como perfumes, aromas y ácido salicílico. Un sector de utilización relativamente grande para el almidón se encuentra en las pastas dentífricas.

2.8 Adición de almidón a carbones y briquetas

El almidón ofrece un sector de empleo como aditivo a carbones y briquetas. Un carbón puede ser aglomerado o briqueteado con una adición de almidón de manera cuantitativa para dar un producto de alto valor, con lo que se impide una descomposición prematura de las briquetas. La cantidad añadida de almidón está situada, en el caso de carbón para barbacoas, entre 4 y 6%, y en el caso de carbón calorificado, entre 0,1 y 0,5%. Por lo demás, los almidones están ganando importancia como agentes aglutinantes, puesto que mediante su adición a carbones y briquetas, se puede reducir manifiestamente la emisión de sustancias nocivas.

2.9 Tratamiento de lodos de minerales y carbones

El almidón se puede emplear además en el tratamiento de lodos de minerales y carbones como agente de floculación.

2.10 Agente auxiliar para moldeo por colada o fundición

Otro sector de empleo consiste en como aditivo a agentes auxiliares para moldeo por colada o fundición. En diversos procedimientos de moldeo por colada o fundición se requieren núcleos o machos, que se producen a partir de arenas mezcladas con agentes aglutinantes. Como agente aglutinante se emplea actualmente de manera predominante una bentonita, que se ha mezclado con almidones modificados, mayormente almidones hinchables.

La finalidad de la adición de un almidón es la de aumentar la resistencia a la fluencia así como la de mejorar la resistencia de aglutinación. Además de esto, los almidones hinchables pueden presentar otros requisitos técnicos de producción, tales como los de ser dispersables en agua fría, rehidratables, bien miscibles en arena y tener una alta capacidad de fijación de agua.

2.11 Empleo en la industria del caucho

En la industria del caucho, el almidón se puede emplear para mejorar la calidad técnica y óptica. Las razones de ello son, en este caso, el mejoramiento del brillo superficial, el mejoramiento del tacto y del aspecto; para ello un almidón se esparce, antes de la vulcanización en frío, sobre las superficies recauchutadas pegajosas de los materiales de caucho, así como el mejoramiento de la capacidad del caucho para la estampación e impresión.

2.12 Preparación de materiales sustitutivos del cuero

Otra posibilidad de utilización de los almidones modificados consiste en la preparación de materiales sustitutivos del cuero.

2.13 Almidón en polímeros sintéticos

En el sector de los materiales sintéticos y plásticos se destacan los siguientes sectores de empleo: la inclusión de productos de transformación del almidón en el proceso de elaboración (el almidón es solamente un material de relleno y carga, no existe ninguna unión directa entre el polímero sintético y el almidón) o, alternativamente, la inclusión de productos de transformación del almidón en la preparación de polímeros (el almidón y el polímero pasan a formar una unión firme).

La utilización del almidón como material de carga puro no es competitiva, en comparación con las otras sustancias tales como talco. Se establece un cuadro diferente cuando pasan a tener importancia las propiedades específicas del almidón y se modifica con ello manifiestamente el perfil de propiedades de los productos finales. Un ejemplo de esto es la utilización de productos de almidón en el tratamiento y la elaboración de materiales termoplásticos, tales como polietileno. En este caso, el almidón y el polímero sintético se combinan mediante coexpresión en la relación de 1:1 para dar una "tanda patrón" [en inglés "master batch"], a partir de la que se fabrican diversos productos con polietileno granulado mediando utilización de tecnologías de procesos habituales. Mediante la inclusión de un almidón en láminas de polietileno se puede conseguir una permeabilidad aumentada de sustancias en el caso de cuerpos huecos, una permeabilidad mejorada al vapor de agua, un comportamiento antiestático mejorado, un comportamiento anti-apelmazante mejorado, así como una capacidad de impresión mejorada con tintas acuosas.

Otra posibilidad es la utilización de almidón en espumas de poliuretanos. Con la adaptación de los derivados de almidón, así como mediante la optimización técnica de los procesos es posible controlar deliberadamente la reacción entre polímeros sintéticos y los grupos hidroxi de los almidones. El resultado de ello son láminas de poliuretanos, que, mediante la utilización de almidón, adquieren los siguientes perfiles de propiedades: una disminución del coeficiente de dilatación térmica, una disminución del comportamiento de contracción, un mejoramiento del comportamiento bajo presión y tensión, un aumento de la permeabilidad al vapor de agua sin que se modifique la absorción y recepción de agua, una disminución de la inflamabilidad y de la densidad de desgarramientos, ningún escurrimiento de partes combustibles, ausencia de halógenos y envejecimiento disminuido. Las desventajas, que actualmente están todavía presentes, son una resistencia reducida a la compresión, así como una resistencia reducida a los impactos.

Entre tanto, el desarrollo de productos ya no se limita solamente a las láminas. También se pueden fabricar productos sólidos de materiales sintéticos, tales como cacerolas, macetas, planchas y cubetas, con un contenido de almidón de más que 50%. Por lo demás, se han de valorar favorablemente las mezclas de almidones y polímeros, puesto que tienen una degradabilidad biológica muchísimo más alta.

Además, debido a su extremada capacidad para fijar agua, los polímeros por injerto de almidón han adquirido una importancia extraordinaria. Éstos son productos con una cadena principal a base de almidón y un retículo lateral a base de un monómero sintético, injertado según el principio del mecanismo de encadenamiento por radicales. Los polímeros por injerto de almidón, disponibles hoy en día, se distinguen por una mejor capacidad de fijación y retención de hasta 1.000 g de agua por gramo de almidón, en el caso de una alta viscosidad. Los sectores de utilización para estos agentes superabsorbentes se han ampliado grandemente en los últimos años y se sitúan en el sector de la higiene, con productos tales como pañales y sábanas bajeras, así como en el sector agrícola, p.ej. en formaciones de gránulos de semillas.

Son decisivos para el empleo de los nuevos almidones modificados por tecnología genética, por una parte, la estructura, el contenido de agua, el contenido de proteínas, el contenido de lípidos, el contenido de fibras, el contenido de cenizas y fosfatos, la relación de amilosa a amilopectina, la distribución de masas molares, el grado de ramificación, el tamaño y la forma de granos, así como la cristalinidad y, por otra parte, también las propiedades que conducen a las siguientes características: el comportamiento de fluencia y de sorción, la temperatura de engrudado, la viscosidad, el rendimiento de espesamiento, la solubilidad, la estructura y la transparencia de los engrudos, la estabilidad frente al calor, a la cizalladura y a los ácidos, la tendencia a la retrogradación, la gelificación, la estabilidad frente a procesos de congelaciones y descongelaciones, la formación de complejos, la fijación de yodo, la formación de películas, la fuerza de pegamiento, la estabilidad frente a las enzimas, la digestibilidad y la reactividad.

La producción de almidones modificados mediante intervenciones por tecnología genética en una planta transgénica puede modificar, por una parte, las propiedades de los almidones obtenidos a partir de la planta, de tal manera que ya no aparezcan como necesarias otras modificaciones adicionales mediante procedimientos químicos o físicos. Por otra parte, los almidones modificados mediante procedimientos de tecnología genética pueden ser sometidos a otras modificaciones químicas, lo que conduce a otros mejoramientos adicionales de la calidad para determinados sectores de empleo entre los que se han citado anteriormente. Estas modificaciones químicas son fundamentalmente conocidas. En particular, en este caso, se trata de modificaciones mediante

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tratamiento por calor

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tratamiento con ácidos

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oxidación y

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esterificaciones

que conducen a la formación de los fosfato-, nitrato-, sulfato-, xantato-, acetato- y citrato-almidones. Otros ácidos orgánicos se pueden emplear asimismo para la esterificación:

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producción de éteres de almidones

almidón-alquil-éteres, O-alil-éteres, hidroxialquil-éteres,

O-carboximetil-éteres, almidón-éteres que contienen N,

almidón-éteres que contienen P, almidón-éteres que contienen S

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producción de almidones reticulados

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producción de polímeros por injerto de almidón

Para la expresión de las moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con el invento en una orientación del mismo sentido o antisentido en células de plantas, se unen éstas con elementos de ADN reguladores, que garantizan la transcripción en células de plantas. A éstos pertenecen en particular los promotores. Por regla general, para la expresión entra en cuestión cualquier tipo de promotor activo en células de plantas.

El promotor se puede escoger, en este caso, de tal manera que la expresión se efectúe de manera constitutiva o solamente en un determinado tejido, en un determinado momento del desarrollo de las plantas o en un momento determinado por influencias externas. En lo que se refiere a la planta, el promotor puede ser homólogo o heterólogo. Promotores convenientes son p.ej. el promotor de ARN 35S del virus de mosaico de coliflor (Cauliflower Mosaic Virus) y el promotor de ubiquitina procedente de maíz para una expresión constitutiva, el promotor de Patatingen B33 (Rocha-Sosa y colaboradores, EMBO J. 8 (1989), 23-29) para un expresión específica para los tubérculos en patatas, o un promotor que asegura una expresión solamente en tejidos que son activos fotosintéticamente, p.ej. el promotor ST-LS1 (Stockhaus y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7.943-7.947; Stockhaus y colaboradores, EMBO J. 8 (1989), 2.445-2.451) o, para una expresión específica para endospermas, el promotor de HMG procedente de trigo, el promotor de USP, el promotor de faseolina o promotores de genes de zeína procedentes de maíz.

Además, puede estar presente una secuencia de terminación, que sirve para la terminación correcta de la transcripción, así como la adición de una cola de poli-A junto al transcrito, a la que se le atribuye una cierta función en la estabilización de los transcritos. Tales elementos han sido descritos en la bibliografía (compárese la cita de Gielen y colaboradores, EMBO J. 8 (1989), 23-29) y son intercambiables de manera arbitraria.

El presente invento pone a disposición moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una nueva isoforma identificada en maíz de una sintasa de almidón. Esto permite, por fin, tanto la identificación de la función de esta isoforma en la biosíntesis de almidón, como también la producción de plantas modificadas por tecnología genética, en las que ha sido modificada la actividad de esta enzima. Esto hace posible la síntesis de un almidón con una estructura modificada y, por consiguiente, unas propiedades físico-químicas modificadas en plantas manipuladas de tal manera.

Las moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con el invento se pueden utilizar, en principio, también para producir plantas, en las que ha aumentado o disminuido la actividad de la sintasa de almidón de acuerdo con el invento, y al mismo tiempo se han modificado las actividades de otras enzimas que participan en la biosíntesis de almidón. En este caso son concebibles todas las combinaciones y permutaciones. Mediante la modificación de las actividades de una o varias isoformas de las sintasas de almidón en plantas, se llega a la síntesis de un almidón modificado en cuanto a su estructura. Mediante el aumento de la actividad de una o varias isoformas de las sintasas de almidón en las células de los tejidos almacenadores de almidón en las plantas transformadas, tales como p.ej. en el endospermo de maíz o de trigo, o en el tubérculo en el caso de la patata, se puede llegar además a un aumento del rendimiento. Por ejemplo, moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una proteína de acuerdo con el invento o las correspondientes estructuras artificiales antisentido, se pueden introducir en células de plantas, en las que ya se ha inhibido la síntesis de proteínas GBSS I, SSS o GBSS II endógenas a causa de un efecto antisentido o de una mutación, o se ha inhibido la síntesis de la enzima ramificadora (tal como se ha descrito p.ej. en el documento de solicitud de patente internacional WO92/14827) o el mutante ae (Shannon y Garwood, 1984, en la obra de Whistler, BeMiller y Paschall, Starch: Chemistry and Technology [almidón: química y tecnología], Academic Press, Londres, 2ª edición: 25-86).

Si se ha de conseguir la inhibición de la síntesis de varias sintasas de almidón en plantas transformadas, entonces se pueden utilizar para la transformación moléculas de ADN, que contienen simultáneamente varias regiones, que codifican las correspondientes sintasas de almidón, en una orientación antisentido, bajo el control de un promotor apropiado. En este caso, alternativamente, cada secuencia puede estar puesta bajo el control de un promotor propio, o las secuencias se pueden transcribir como una fusión de un promotor común. Se ha de preferir, por regla general, la alternativa citada en último lugar, puesto que en este caso la síntesis de las correspondientes proteínas se debería inhibir aproximadamente en la misma medida.

Además, es posible la construcción de moléculas de ADN, en las que, junto a las secuencias de ADN que codifican las sintasas de almidón, otras secuencias de ADN, que participan en la síntesis o modificación de un almidón, están acopladas en una orientación antisentido con un promotor apropiado. En este caso, las secuencias pueden estar conectadas a su vez unas tras de otras y pueden ser transcritas por un promotor común. Para la longitud de las regiones codificadoras individuales, que se utilizan en una estructura artificial de este tipo, es válido lo que ya se ha expuesto anteriormente para la producción de estructuras artificiales antisentido. No hay ningún límite superior para el número de fragmentos antisentido transcritos a partir de un promotor en una molécula de ADN de este tipo. El transcrito resultante no debería sobrepasar, no obstante, en general, una longitud de 10 kb, y preferiblemente una de 5 kb.

Las regiones codificadoras, que están localizadas en tales moléculas de ADN en combinación con otras regiones codificadoras en una orientación antisentido detrás de un promotor apropiado, pueden proceder de secuencias de ADN, que codifican las siguientes proteínas: sintasas de almidón fijadas a granos de almidón (GBSS I y II) y sintasas de almidón solubles (SSS I y II), enzimas ramificadoras, enzimas desramificadoras [en inglés "debranching"], enzimas de desproporcionamiento y fosforilasas de almidón. Ésta es sólo una enumeración dada a modo de ejemplo. También se puede concebir la utilización de otras secuencias de ADN en el marco de una combinación de este tipo.

Con ayuda de tales estructuras artificiales es posible además inhibir simultáneamente la síntesis de varias enzimas en células de plantas, que habían sido transformadas con éstas.

Además, las estructuras artificiales se pueden introducir en mutantes clásicas, que están en defecto para uno o varios genes de la biosíntesis de almidón (Shannon y Garwood, 1984, en la obra de Whistler, BeMiller y Paschall, Starch: Chemistry and Technology, Academic Press, Londres, 2ª edición: 25-86). Estos defectos pueden referirse a las siguientes proteínas: las sintasas de almidón fijadas a granos de almidón (GBSS I y II) y las sintasas de almidón solubles (SSS I y II), las enzimas ramificadoras (BE I y II), las enzimas desramificadoras (enzimas R), las enzimas de desproporcionamiento y las fosforilasas de almidón. Ésta es sólo una enumeración dada a modo de ejemplo.

Con ayuda de un modo de proceder de esta índole es posible, además, inhibir simultáneamente la síntesis de varias enzimas en células de plantas, que habían sido transformadas con éstas.

Con el fin de preparar para la introducción de genes ajenos en plantas superiores, están a disposición un gran número de vectores de clonación, que contienen una señal de replicación para E. coli y un gen marcador para la selección de células bacterianas transformadas. Ejemplos de tales vectores son pBR322, las series pUC, las series M13mp, pACYC184, etc. La secuencia deseada se puede introducir en un sitio de corte por restricción oportuno en el vector. El plásmido obtenido se utiliza para la transformación de células de E. coli. Las células de E. coli transformadas se cultivan en un medio apropiado, seguidamente se cosechan y se lisan. El plásmido se recupera. Como método de análisis para la caracterización del ADN plasmídico obtenido se emplean, por regla general, análisis por restricción, electroforesis en gel así como otros métodos bioquímicos y de biología molecular. Después de cada manipulación, el ADN plasmídico se puede disociar y los fragmentos de ADN obtenidos se pueden unir con otras secuencias de ADN. Cada secuencia de ADN plasmídico se puede clonar en los mismos plásmidos o en otros distintos.

Para la introducción de un ADN en una célula hospedante vegetal, están a disposición un gran número de técnicas. Estas técnicas abarcan la transformación de células vegetales con un ADN-T (de transformación), mediando utilización de Agrobacterium tumefaciens o de Agrobacterium rhizogenes como agente de transformación, la fusión de protoplastos, la inyección, la electroporación de ADN, la introducción de ADN mediante el método biolístico, así como otras posibilidades.

En el caso de la inyección y la electroporación de ADN en células de plantas, no se plantean de por sí exigencias especiales de ningún tipo en cuanto a los plásmidos utilizados. Se pueden utilizar plásmidos sencillos, tales como p.ej. derivados de pUC. Sin embargo, si a partir de las células transformadas de esta índole se tengan que regenerar plantas enteras, es necesaria la presencia de un gen marcador seleccionable.

Según sea el método de introducción de los genes deseados en la célula de planta, pueden ser necesarias otras secuencias de ADN adicionales. Si, p.ej. para la transformación de la célula de planta se utilizan el plásmido Ti o el Ri, por lo menos la delimitación derecha, no obstante, pero frecuentemente las delimitaciones derecha e izquierda del ADN T de los plásmidos Ti y Ri deberán ser unidas con los genes que se han de introducir como una zona de flanco.

Cuando se utilizan agrobacterias para la transformación, el ADN que se ha de introducir debe ser clonado en plásmidos especiales, y ciertamente o bien en un vector intermedio o en un vector binario. Los vectores intermedios pueden ser integrados mediante recombinación homóloga en el plásmido Ti o Ri de las agrobacterias, a causa de secuencias, que son homólogas a secuencias existentes en el ADN T. Éste contiene además la región vir, que es necesaria para la transferencia del ADN T. Los vectores intermedios no pueden replicarse en agrobacterias. Mediante un plásmido cooperante se puede transferir el vector intermedio a Agrobacterium tumefaciens (lo que se denomina conjugación). Los vectores binarios pueden replicarse tanto en E. coli como también en agrobacterias. Ellos contienen un gen marcador de selección y un engarzador o poliengarzador, los cuales son enmarcados por las regiones límites derecha e izquierda del ADN T (Holsters y colaboradores, Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187). La agrobacteria que sirve como célula hospedante debe contener un plásmido, que lleva la región vir. La región vir es necesaria para la transferencia del ADN T a la célula de planta. Puede estar presente un ADN T adicional. La agrobacteria transformada de esta manera es utilizada para la transformación de células de plantas.

La utilización de un ADN T para la transformación de células de plantas se ha investigado intensamente y se ha descrito de una manera suficiente en el documento de patente europea EP 120.516; y en la cita de Hoekema, en: The Binary Plant Vector System [El sistema de vectores vegetales binarios] Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), capítulo V; Fraley y colaboradores, Crit. Rev. Plant Sci., 4, 1-46 y An y colaboradores EMBO J. 4 (1985), 277-287.

Para la transferencia del ADN a la célula de planta se pueden cultivar conjuntamente (cocultivar) explantes de plantas convenientemente con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes. A partir del material vegetal infectado (p.ej. trocitos de hojas, segmentos de tallos, raíces, pero también protoplastos o células vegetales cultivadas en suspensión), se pueden regenerar entonces de nuevo plantas enteras en un medio apropiado, que puede contener antibióticos o biocidas para la selección de células transformadas. Las plantas obtenidas de esta manera se pueden investigar entonces en cuanto a la presencia del ADN introducido. Se conocen otras posibilidades para la introducción de un ADN ajeno mediando utilización del procedimiento biolístico o mediante transformación de los protoplastos (compárese p.ej. Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. En: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, coordinadores de edición), tomo 2, 627-659, VCH Weinheim-Nueva York-Basilea-Cambridge).

Mientras que la transformación de plantas dicotiledóneas a través de sistemas de vectores con el plásmido Ti con ayuda de Agrobacterium tumefaciens se ha consagrado y establecido bien, trabajos más recientes apuntan a que también las plantas monocotiledóneas son asimismo bien accesibles a la transformación mediante vectores basados en Agrobacterium (Chan y colaboradores, Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hiei y colaboradores, Plant J. 6 (1994), 271-282).

Sistemas alternativos para la transformación de plantas monocotiledóneas son la transformación mediante el enfoque biolístico, la transformación de protoplastos, la electroporación de células parcialmente permeabilizadas, la introducción de ADN por medio de fibras de vidrio.

Específicamente, la transformación de maíz se describe de diferentes maneras en la bibliografía (compárense p.ej. los documentos WO95/06128, EP 0.513.849; y EP 0.465.875). En el documento EP 292.435 se describe un procedimiento, con cuya ayuda se pueden obtener plantas fértiles, partiendo de callos de maíz granulosos, blandos (friables), libres de mucosas. Shillito y colaboradores (en Bio/Technology 7 (1989), 581) han observado en este contexto que, además, para la capacidad de regeneración a fin de formar plantas fértiles, es necesario partir de cultivos de suspensiones de callos, a partir de los cuales se puede preparar un cultivo de protoplastos que se subdividen, con la capacidad de regenerarse para formar plantas. Después de un periodo de tiempo de cultivación in vitro de 7 a 8 meses, Shillito y colaboradores obtuvieron plantas con descendientes capaces de vivir, las cuales tienen, no obstante, anormalidades en la morfología y en la reproducibilidad.

Prioli y Söndahl (en Bio/Technology 7 (1989), 589) describen la regeneración y la obtención de plantas fértiles a partir de protoplastos de maíz del linaje consanguíneo de maíz Cateto Cat 100-1. Los autores suponen que la regeneración de los protoplastos para formar plantas es dependiente de un cierto número de factores diferentes, tal como p.ej. del genotipo, del estado fisiológico de las células donantes y de las condiciones de cultivación.

Una vez que el ADN introducido se ha integrado en el genoma de la célula vegetal, éste es por regla general estable allí y permanece conservado también en los descendientes de la célula transformada originalmente. Este ADN contiene normalmente un marcador de selección, que confiere a las células vegetales transformadas resistencia frente a un biocida o a un antibiótico tal como kanamicina, G 418, bleomicina, higromicina o fosfinotricina, entre otros. El marcador elegido individualmente debería permitir, por tanto, la selección de células transformadas frente a células, a las que les falta el ADN introducido.

Las células transformadas crecen dentro de la planta de la manera usual (véase también la cita de McCormick y colaboradores, Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). Las plantas resultantes se pueden cultivar de manera normal y se pueden cruzar con plantas, que poseen el mismo factor hereditario transformado u otros factores hereditarios. Los individuos híbridos que se forman a partir de esto tienen las correspondientes propiedades fenotípicas. A partir de las células vegetales pueden obtenerse semillas.

Se deberían cultivar dos o más generaciones, a fin de asegurar que la característica fenotípica se conserve de manera estable y sea heredada. También se deberían cosechar semillas, a fin de asegurar que se han conservado el correspondiente fenotipo u otras propiedades.

Los Ejemplos ilustran el invento.

Abreviaturas utilizadas

pb	par de bases
BGSS	granule bound starch synthase (sintasa de almidón fijada a granos de almidón)
IPTG	isopropil-\beta-tiogalacto-piranósido
SS	starch synthase (sintasa de almidón)
SSS	soluble starch synthase (sintasa de almidón soluble)

Medios y soluciones que se utilizan en los Ejemplos:

20 x SSC	175,3 g de NaCl
	88,2 g de citrato de sodio
	hasta 1.000 ml de ddH_{2}O
	pH 7,0 con NaOH 10 N
YT	8 g de extracto de bacto-levadura
	5 g de bacto-triptona
	5 g de NaCl
	hasta 1.000 ml de ddH_{2}O

Medio para el aislamiento de protoplastos (100 ml)

Celulasa Onozuka R S (Meiji Seika, Japón)	800 mg
Pectoliasa Y 23	40 mg
KNO_{3}	200 mg
KH_{2}PO_{4}	136 mg
K_{2}HPO_{4}	47 mg
CaCl_{2} 2H_{2}O	147 mg
MgSO_{4} 7H_{2}O	250 mg
Albúmina de suero bovino (BSA)	20 mg
Glucosa	4.000 mg
Fructosa	4.000 mg
Sacarosa	1.000 mg
Valor del pH	5,8
Osmolaridad	660 mosm.

Solución para el lavado de protoplastos 1: igual que la solución para el aislamiento de protoplastos, pero sin celulasa, pectoliasa ni BSA

Tampones para transformación

a)	Glucosa	0,5 M
	MES	0,1%
	MgCl_{2} 6H_{2}O	25 mM
	pH	5,8
	se ha de ajustar a 600 mosm.
b)	Solución de PEG 6000
	Glucosa	0,5 M
	MgCl_{2} 6H_{2}O	100 mM
	Hepes	20 mM
	pH	6,5

Al tampón anteriormente citado como b) se le añade PEG 6000 poco antes del uso de la solución (40% en peso de PEG). La solución se filtra a través de un filtro estéril de 0,45 \mum.

Solución de W5

CaCl_{2}	125 mM
NaCl	150 mM
KCl	5 mM
Glucosa	50 mM

Medio para cultivo de protoplastos (datos en mg/l)

KNO_{3}	3.000
(NH_{4})_{2}SO_{4}	500
MgSO_{4} 7H_{2}O	350
KH_{2}PO_{4}	400
CaCl_{2} 2H_{2}O	300

Fe-EDTA y oligoelementos (traza) tal como en el medio de Murashige-Skoog (Physiol. Plant, 15 (1962), 473).

m-Inosita	100
Tiamina HCl	1,0
Amida de ácido nicotínico	0,5
Piridoxina HCl	0,5
Glicina	2,0
Ácido glucurónico	750
Ácido galacturónico	750
Galactosa	500
Maltosa	500
Glucosa	36.000
Fructosa	36.000
Sacarosa	30.000
Asparagina	500
Glutamina	100
Prolina	300
Hidrolizado de caseína	500
Ácido 2,4-dicloro-fenoxi-acético	0,5
pH	5,8
Osmolaridad	600 mosm.

En los Ejemplos se utilizan los siguientes métodos:

1. Procedimiento de clonación

Para la clonación en E. coli se utilizó el vector pBluescript II SK (de Stratagene).

2. Cepas de bacterias

Para el vector Bluescript y para las estructuras artificiales de pUSP se utilizó la cepa de E. coli DH5a (de Bethesda Research Laboratories, Gaithersburgh, EE.UU.). Para la excisión in vivo se utilizó la cepa de E. coli XL1-Blue.

3. Transformación de maíz (a) Producción de protoplastos del linaje celular DSM 6009 Aislamiento de los protoplastos

2-4 días, preferiblemente 3 días, después del último cambio del medio de un cultivo de una suspensión de protoplastos, se filtra con succión el medio líquido y las células remanentes se enjuagan con 50 ml de la solución para lavado de protoplastos 1 y de nuevo se filtra con succión hasta sequedad. En cada caso a 2 g de la masa celular cosechada se le añaden 10 ml del medio para el aislamiento de protoplastos. Las células y los agregados celulares, que se han resuspendido, se incuban a 27 \pm 2ºC mediando ligera agitación (a 30 hasta 40 rpm) durante 4 hasta 6 h en la oscuridad.

Purificación de los protoplastos

Tan pronto como se haya producido la liberación de por lo menos 1 millón de protoplastos/ml (observación con microscopio), se tamiza la suspensión a través de un tamiz de acero inoxidable y de nilón con unos valores de mallas de 200 ó 45 \mum respectivamente. La combinación de un tamiz de 100 \mum y de un tamiz de 60 \mum hace posible igual de bien la separación de los agregados celulares. El material filtrado que contiene los protoplastos se valora con un microscopio. Usualmente, éste contiene 98-99% de protoplastos. El resto son células individuales no digeridas. Las preparaciones de protoplastos con este grado de pureza se utilizan sin ninguna centrifugación en gradiente adicional para experimentos de transformación. Mediante centrifugación (con 100 rpm) en el rotor de impulso ascendente (100 x g, 3 min) se sedimentan los protoplastos. El material sobrenadante se desecha y los protoplastos se vuelven a suspender en la solución de lavado 1. Se repite la centrifugación y después de esto los protoplastos se vuelven a suspender en el tampón para transformación.

(b) Transformación de los protoplastos

Los protoplastos resuspendidos en el tampón de transformación se introducidos, con un título de 0,5-1 x 10^{6} protoplastos/ml, en porciones de 10 ml en tubitos de polialómeros con una capacidad de 50 ml. El ADN utilizado para la transformación se disuelve en un tampón de Tris-EDTA (TE). Por cada ml de suspensión de protoplastos se añaden 20 \mug de ADN plasmídico. Como vector se utiliza en este caso un plásmido que confiere una resistencia a la fosfinotricina (compárese p.ej. el documento EP 0.513.849). Después de haber añadido el ADN, la suspensión de protoplastos se agita con precaución, a fin de distribuir el ADN de una manera homogénea en la solución. Inmediatamente después de esto, se añaden gota a gota 5 ml de una solución de PEG.

Mediante una basculación cuidadosa de los tubitos se distribuye homogéneamente la solución de PEG. Después de esto se añaden de nuevo 5 ml la de solución de PEG y se repite la entremezcladura homogénea. Los protoplastos permanecen durante 20 minutos en la solución de PEG a \pm 2ºC. Después de esto, se sedimentan los protoplastos por centrifugación durante 3 minutos (a 100 x g; 1.000 rpm). Se desecha el material sobrenadante. Los protoplastos se lavan mediante agitación cuidadosa en 20 ml de una solución de W5 y, después de esto, se centrifugan de nuevo. A continuación, éstos se vuelven a suspender en 20 ml de un medio de cultivo de protoplastos, se centrifugan otra vez y se vuelven a suspender de nuevo en un medio de cultivo. El título se ajusta a 6-8 x 10^{5} protoplastos/ml y los protoplastos se cultivan en porciones de 3 ml en cápsulas de Petri (\diameter 60 mm, altura 15 mm). Las cápsulas de Petri selladas con Parafilm son colocadas en la oscuridad a 25 \pm 2ºC.

(c) Cultivación de los protoplastos

Durante las primeras 2-3 semanas después del aislamiento y de la transformación de los protoplastos, los protoplastos se cultivan sin adición de un medio de nueva aportación. Tan pronto como las células regeneradas a partir de los protoplastos se han desarrollado para formar agregados celulares con más de 20-50 células, se añade 1 ml de medio de cultivo de protoplastos de nueva aportación, que contiene sacarosa (90 g/l) como agente osmótico.

(d) Selección de células de maíz transformadas y regeneración de las plantas

A los 3-10 días después de la adición de medio de nueva aportación, los agregados celulares resultantes a partir de los protoplastos se siembran en placas con 100 mg/l de L-fosfinotricina. El medio N6 con las vitaminas del medio de cultivo de protoplastos, 90 g/l de sacarosa y 1,0 mg/l de 2,4-D, es tan apropiado como un medio análogo, por ejemplo con las sales macro- y micro-nutritivas del medio MS (Murashige y Skoog (1962), véase más arriba).

Los callos, que se han desarrollado a partir de los protoplastos transformados establemente, pueden crecer sin obstáculos en el medio selectivo. Después de 3 a 5 semanas, preferiblemente 4 semanas, los callos transgénicos se pueden transferir a un medio de selección de nueva aportación, que contiene asimismo 100 mg/l de L-fosfinotricina, pero ya no contiene nada de auxina. En el transcurso de 3-5 semanas se diferencian aproximadamente un 50% de los callos de maíz transgénico, que tienen el gen para la L-fosfinotricina-acetil-transferasa integrado en su genoma, sobre este medio, en presencia de L-fosfinotricina, para dar unas primeras plantas.

(e) Cultivación de plantas regeneradas transgénicas

El tejido de maíz transformado, embriogénico, se cultiva sobre un medio N6 exento de hormonas (Chu C.C. y colaboradores, Sci. Sin. 16 (1976), 659) en presencia de L-fosfinotricina 5 x 10^{-4} M. Sobre este medio se desarrollan embriones de maíz, que expresan el gen para la fosfinotricina-acetil-transferasa (gen de PAT) de una manera lo suficientemente fuerte, como para dar plantas. Los embriones no transformados, o los que tienen solamente una muy débil actividad de PAT, se mueren. Tan pronto como las hojas de las plantas cultivadas in vitro han alcanzado una longitud de 4-6 mm, éstas se pueden transferir a tierra. Después de haber lavado hasta ausencia de restos de agar junto a las raíces, las plantas se plantan en una mezcla de légamo, arena, vermiculita y tierra unitaria en la relación 3:1:1:1 y se adaptan al cultivo en tierra durante los primeros 3 días después de su trasplantación con una humedad relativa del aire de 90-100%. La cultivación se efectúa en una cámara climática con un período de tiempo con luz de aproximadamente 25.000 Lux de 14 h, a la altura de las plantas, a unas temperaturas de día y noche de 23 \pm 1ºC y 17 \pm 1ºC respectivamente. Las plantas adaptadas se cultivan con una humedad del aire de 65 \pm 5%.

4. Marcación radiactiva de fragmentos de ADN

La marcación radiactiva de fragmentos de ADN se llevó a cabo con ayuda de un estuche de marcación de ADN con cebadores aleatorios [DNA-Random Primer Labelling Kit] de la entidad Boehringer (Alemania) de acuerdo con los datos del fabricante.

Ejemplo 1 Identificación, aislamiento y caracterización de un ADNc, que codifica una nueva isoforma de una sintasa de almidón procedente de Zea mays

Para la identificación de un ADNc, que codifica una nueva sintasa de almidón procedente de maíz, se escogió la estrategia de la expresión funcional en un apropiado mutante de E. coli. El E. coli sintetiza en determinados medios nutritivos (medio entero con 1% de glucosa), como hidrato de carbono de almacenamiento, glicógeno, es decir un polisacárido, que es muy similar en su estructura a la amilopectina, pero que está más intensamente ramificado (7-10% de puntos de ramificación frente a 4-5%) y que tiene normalmente un peso molecular más alto. El grado de ramificación más alto condiciona también una coloración diferente con yodo. Con yodo, el glicógeno se colorea de parduzco, la amilopectina de lila y la amilosa de azul.

En E. coli son responsables para la síntesis de glicógeno esencialmente tres genes, glgA, glgB y glgC, que codifican la sintasa de glicógeno, la enzima ramificadora y la ADP-glucosa-pirofosforilasa. Este sistema es análogo al de la biosíntesis de almidón en plantas. Si se expresa una sintasa de almidón vegetal en células de E. coli de tipo salvaje, la influencia de la enzima sobre las propiedades del glicógeno sólo se puede detectar muy difícilmente, o no se puede detectar en absoluto, mediante coloración con yodo, puesto que los glucanos producidos por la sintasa de almidón son ramificados por la enzima ramificadora exactamente igual que los glucanos producidos por la sintasa de glicógeno.

Por lo tanto se estableció una cepa de E. coli, que permite un escrutinio sencillo mediante coloración con yodo, en cuanto a una expresión funcional de una sintasa de almidón. Para ello, el mutante HfrG6MD2 (Schwartz, J. Bacteriol. 92 (1966), 1.083-1.089), en el que se habían suprimido todos los genes glg, se transformó con el plásmido pACAC. Este plásmido contiene un fragmento de ADN, que codifica la ADP-glucosa-fosforilasa (AGPasa) procedente de E. coli, bajo el control del promotor lac Z. El fragmento se había aislado como un fragmento de DraI/HaeII con un tamaño de aproximadamente 1,7 kb a partir del vector pEcA-15 (véase B. Müller-Röber (1992), tesis, FU (Universidad Libre) de Berlín) y, después de haber alisado los extremos, se había clonado en un vector pACYC184 linealizado con HindIII. Este plásmido media en la expresión de una ADP-glucosa-pirofosforilasa desregulada y mutada procedente de la cepa de E. coli LCB 618, que acumula elevadas cantidades de glicógeno, debido a la mutación de esta enzima (Preiss y Romeo en Advances in Microbial Physiology, Academic Press, Londres, tomo 30, 183-238). Esto garantiza la puesta a disposición de suficientes cantidades de ADP-glucosa, que es el substrato de las sintasas de almidón, y, con una expresión funcional simultánea de sintasas de almidón, debe de garantizar la síntesis en E. coli HfrG6MD2 de \alpha-1,4-glucanos lineales, que pueden ser coloreados de azul con yodo. Además, el plásmido pACAC, como derivado del vector pACYC184, es compatible con plásmidos tales como el pBluescript SK (-).

Esta cepa se transformó con una biblioteca de ADNc, que estaba contenida en el vector pBluescript SK (-) y que se había producido a partir de un ARN procedente de hojas de Zea mays, linaje B73. Ésta se estableció transformando primeramente en fágmidos mediante una excisión in vivo aproximadamente 10^{6} fagos de una biblioteca de ADNc a partir de un ARN procedente de hojas de Zea Mays, linaje B73, contenido en el vector Uni-ZAPTMXR (de Stratagene GmbH, Heidelberg). Células de E. coli XL1 Blue se infectaron con estos fágmidos y 3 x 10^{5} transformantes se sembraron en placas sobre un medio nutritivo sólido, selectivo (que contiene ampicilina). Después del crecimiento, las células se separaron por anegamiento y a partir de éstas se preparó un ADN plasmídico. La transferencia del ADN plasmídico a las células bacterianas se efectuó según el método de Hanahan (J. Mol. Biol. 166 (1983), 557-580). Aproximadamente 4 x 10^{5} células de E. coli transformadas se extendieron como un frote sobre medios de cultivo de agar con la siguiente composición:

Medio YT con:

1,5% de bacto-agar

1% de glucosa

10 mg/l de cloramfenicol

50 mg/l de ampicilina

IPTG 1 mM

ácido diamino-pimélico 2 mM

Después de haber incubado durante una noche a 37ºC, las células se trataron con vapor de yodo. Se obtuvo una colonia que se coloreaba de azul. A partir de ésta se aisló un ADN plasmídico, y éste se empleó para la renovada transformación. Los transformantes obtenidos se extendieron como un frote sobre placas de réplicas. Una de las placas de réplica se coloreó de nuevo. Los clones que se coloreaban de azul se cultivaron para la preparación de mayores cantidades del ADN plasmídico.

Después de haber comprobado el tamaño del fragmento de ADNc, se analizó adicionalmente el clon pSSZm.

Ejemplo 2 Análisis de secuencias de la inserción de ADNc del plásmido pSSZm

A partir de un clon de E. coli, obtenido de una manera correspondiente al Ejemplo 1, se aisló el plásmido pSSZm y se determinó su inserción de ADNc mediante procedimientos clásicos con ayuda del método de didesoxinucleótidos (Sanger y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5.463-5.467). La inserción tiene una longitud de 2.651 pb y constituye un ADNc parcial. La secuencia de nucleótidos se indica bajo SEQ ID NO:1. La correspondiente secuencia de aminoácidos se representa bajo SEQ ID NO:2. Un análisis de las secuencias y una comparación entre secuencias con secuencias conocidas, puso de manifiesto que la secuencia representada bajo SEQ ID NO:1 es nueva y abarca una región parcial codificadora, que presenta ciertas homologías con sintasas de almidón procedentes de diversos organismos. Además, la proteína codificada constituye una nueva isoforma de sintasas de almidón, que no puede ser coordinada inequívocamente con las clases descritas hasta ahora. La proteína codificada por esta inserción o por secuencias que se hibridan es designada en el marco de esta solicitud como SSZm. Con ayuda de esta secuencia de ADNc parcial, es posible para una persona experimentada en la biología molecular, sin necesidad de más consideraciones, aislar clones de plena longitud, que contienen toda la región codificadora y determinar su secuencia. Para ello, p.ej. un banco de expresión de ADNc específico para las hojas, procedente de Zea mays, linaje B73 (Stratagene GmbH, Heidelberg), según procedimientos clásicos, se escruta y muestrea a fondo, mediante hibridación con un fragmento 5' de la inserción de ADNc del plásmido pSSZM (de 200 pb), en cuanto a los clones de plena longitud. Los clones obtenidos de esta manera se secuencian seguidamente. Otra posibilidad para la obtención de las secuencias situadas en el terminal 5', que faltan todavía, consiste en la aplicación del método 5'-Race (fabricante Stratagene, o uno comparable).

(1) DATOS GENERALES:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Jens Ko\betamann

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CALLE: Golmer Fichten 9

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

LOCALIDAD: Golm

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

PAÍS: Alemania

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

NÚMERO DE CÓDIGO POSTAL: 14476

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

DESIGNACION DEL INVENTO: Moléculas de ácidos nucleicos procedentes de plantas que codifican enzimas, que participan en la síntesis de almidón

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE LAS SECUENCIAS: 2

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(iv)

REDACCIÓN LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

SOPORTE DE DATOS: Disquete

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATORIO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

SISTEMA LÓGICO-SOFTWARE:

Patentin Release nº 1.0, versión nº 1.30 (EPA)

\vskip0.666000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2652 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc para ARNm

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPÓTESIS: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

PROCEDENCIA ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Zea mays

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LINAJE: B73

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(C)

TIPO DE TEJIDO: Tejido de hoja

\vskip0.666000\baselineskip

(vii)

PROCEDENCIA INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

BIBLIOTECA: Biblioteca de ADNc en pBluescriptSK-

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CLON (E): pSSZm

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 9..2213

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

1

2

3

4

\vskip0.666000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 735 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: Proteína

\vskip0.333000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

5

6

7

8

Claims (23)

1. Molécula de ácido nucleico que codifica una proteína con la actividad biológica de una sintasa de almidón seleccionada entre el grupo que consta de

(a)

moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una proteína, que abarca la secuencia de aminoácidos indicada bajo SEQ ID NO:2;

(b)

moléculas de ácidos nucleicos, que abarcan la secuencia de nucleótidos representada bajo SEQ ID NO:1 o una correspondiente secuencia de ribonucleótidos;

(c)

moléculas de ácidos nucleicos, que se hibridan en condiciones rigurosas con las moléculas de ácidos nucleicos citadas en (a) o (b), y codifican una proteína con actividad de sintasa de almidón; y

(d)

moléculas de ácidos nucleicos, cuya zona codificadora tiene una identidad de secuencias de por lo menos 60% con respecto a la zona codificadora representado en SEQ ID NO:1, y codifican una proteína con actividad de sintasa de almidón;

así como la cadena complementaria de una de tales moléculas de ácidos nucleicos.

2. Molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, que es una molécula de ADN.

3. Molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 2, que es una molécula de ADNc.

4. Molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, que es una molécula de ARN.

5. Oligonucleótido, que se hibrida específicamente con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Vector que contiene una molécula de ADN de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4.

7. Vector de acuerdo con la reivindicación 6, realizándose que la molécula de ADN está unida en orientación del mismo sentido con elementos reguladores, que garantizan la transcripción y la síntesis de un ARN traducible en células procarióticas o eucarióticas.

8. Células hospedantes, que han sido transformadas y modificadas genéticamente con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, o con un vector de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7.

9. Proteína codificada por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4.

10. Procedimiento para la preparación de una proteína de acuerdo con la reivindicación 9, en el que una célula hospedante de acuerdo con la reivindicación 8 se cultiva condiciones, que permiten la síntesis de la proteína, y la proteína se aísla a partir de las células cultivadas y/o del medio de cultivo.

11. Célula de planta transgénica, que había sido transformada con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, o con un vector de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, o que procede de tal célula, realizándose que la molécula de ácido nucleico, que codifica la proteína con la actividad biológica de una sintasa de almidón, está puesta bajo el control de elementos reguladores, que permiten la transcripción de un ARNm traducible en células vegetales.

12. Planta que contiene células de planta de acuerdo con la reivindicación 11.

13. Planta de acuerdo con la reivindicación 12, que es una planta útil.

14. Planta de acuerdo con la reivindicación 13, que es una planta que almacena almidón.

15. Planta de acuerdo con la reivindicación 14, que es una planta de maíz.

16. Material de reproducción de una planta de acuerdo con una de las reivindicaciones 12 a 15, que contiene células de plantas de acuerdo con la reivindicación 11.

17. Célula de planta transgénica, caracterizada porque en esta célula de planta se ha disminuido la actividad de una proteína de acuerdo con la reivindicación 9, debido a la expresión de una molécula de ADN recombinante, heteróloga, que

(a)

codifica un ARN antisentido para dar transcritos de genes que se presentan endógenamente en la célula, los cuales codifican una proteína de acuerdo con la reivindicación 9; y/o

(b)

codifica una ribozima, que disocia específicamente transcritos de genes que se presentan endógenamente en la célula, los cuales codifican una proteína de acuerdo con la reivindicación 9; y/o

(c)

codifica un ARN, que a causa de un efecto de cosupresión en las células, inhibe la síntesis de una proteína de acuerdo con la reivindicación 9.

18. Célula de planta de acuerdo con la reivindicación 17, realizándose que la reducción de la actividad en esta célula se consigue mediante la expresión de un ARN antisentido para dar transcritos de una molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 1.

19. Planta que contiene células de planta de acuerdo con la reivindicación 17 ó 18.

20. Planta de acuerdo con la reivindicación 19, que es una planta útil.

21. Planta de acuerdo con la reivindicación 20, que es una planta que almacena almidón.

22. Planta de acuerdo con la reivindicación 21, que es una planta de maíz.

23. Material de reproducción de una planta de acuerdo con una de las reivindicaciones 19 a 22, que contiene células de acuerdo con la reivindicación 17 ó 18.