KR19990077380A

KR19990077380A - 전분합성에 사용하는 효소로 코딩된 식물내 핵산분자

Info

Publication number: KR19990077380A
Application number: KR1019980705555A
Authority: KR
Inventors: 클라우스 프로흐베르그; 젠스 코스만
Original assignee: 리이스마이어 죄르그; 플랜트테크 바이오테크날러지 게엠베하
Priority date: 1996-01-16
Filing date: 1997-01-15
Publication date: 1999-10-25
Also published as: AU1541497A; US6617495B2; CA2242398C; US6211436B1; ES2208868T3; CA2242398A1; WO1997026362A1; JP2000504937A; EP0874908B1; ATE252157T1; HUP9900977A3; DE59710862D1; HUP9900977A2; US20010011378A1; AU715054B2; EP0874908A1; DE19601365A1

Abstract

본 발명은 식물내에서 전분합성에 사용하는 효소로 코딩되는 핵산분자에 관한 것으로서,

핵산분자는 식물내 전분합성에 참여하는 효소로 코딩되며, 상기 효소는 전분 신타아제의 아이소타입이다.

그리고 본 발명은 상기 핵산분자로 형질전환된 벡터, 숙주세포, 특히 이들로부터 재생되고, 단백질 활성도가 증가되거나 감소된 식물 및 형질전환된 식물세포에 관한 것을 특징으로 한다.

Description

전분합성에 사용하는 효소로 코딩된 식물내 핵산분자

본 발명은 식물내에서 전분합성에 사용하는 효소로 코딩되는 핵산분자에 관한 것이다. 상기 효소는 전분 신타아제의 아이소타입(isotype)이다. 그리고, 본 발명은 상기 핵산분자로 형질전환된 식물세포 뿐만 아니라 벡터, 박테리아에 관한 것이며, 재생의 방법으로 상기 식물세포로부터 수득될 수 있는 식물에 관한 것이다.

그리고, 특성이 변형된 전분을 합성하는 전분 신타아제로 코딩되는 DNA 분자를 도입시키는 유전자도입 식물의 제조방법이 기술되어 있다.

재생성 원료원으로서 식물성 물질에 속하는 것으로 최근에 중요도가 증가되고 있는 것에 관해, 생물공학적 연구의 목표중 하나는 가공산업에 요구되는 식물성 원료를 적용시키는 시도이다. 가능한 많은 지역에서 재생성 원료를 사용할 수 있기 위해, 매우 다양한 물질을 얻는 것이 중요하다.

오일, 지방 및 단백질과 달리, 다당류는 식물로부터 추출되는 필수 재생성 원료를 구성한다. 셀룰로오스와 달리, 전분은 고등식물내 가장 중요한 저장물질중 하나인 다당류중에서 중요한 위치를 유지한다. 상기 중, 옥수수는 전분생성을 위한 가장 중요한 재배식물이기 때문에 가장 관심있는 식물중 하나이다.

다당류 전분은 화학적으로 균질한 기본성분, 즉 글루코스 분자로 제조된 중합체이다. 그러나, 상기 다당류 전분은 중합정도와 글루코스 사슬의 분지정도가 서로 다른 다양한 형태의 분자의 매우 복잡한 혼합물을 구성한다. 그러므로 전분은 균질한 원료가 아니다. α-1,4-글리코시드적으로 분지된 글루코스 분자로 제조된 기본적으로 비가지형 중합체인 아밀로스-전분과, 여러 분지형 글루코스 사슬의 복합 혼합물인 아밀로펙틴-전분사이에는 특별한 한가지의 다른점이 있다. 부가의 α-1,6-글리코시드적 상호연결로부터 분지가 형성된다. 옥수수 또는 감자와 같이 전분을 생성하는데 전형적으로 사용되는 식물에서, 합성된 전분은 약 25% 아밀로스-전분 및 약 75% 아밀로펙틴-전분으로 구성된다.

가능한한 전분을 널리 사용할 수 있기 위해, 특히 다양한 용도로 적당한 변형된 전분을 합성할 수 있는 식물을 제공하는 것이 바람직하다. 번식방법이 다른 상기 식물을 제공할 수 있는 가능성은 재조합 DNA 기술로 전분-생성 식물의 전분 대사의 특이 유전적 변형에 있다. 그러나 필요조건은 상기 효소로 코딩되는 각 DNA 분자를 분리할 뿐만 아니라 전분합성 및/또는 전분변형에 포함되는 효소를 특징화하고, 동정하는 것이다.

전분합성으로 이끄는 생화학적 경로는 기본적으로 공지되어 있다. 식물세포내 전분합성은 색소체내에서 발생한다. 광합성적으로 활성인 조직내에는 엽록체가 있으며, 광합성적으로 불활성인 전분-저장 조직내에는 전분체가 있다.

전분합성에 포함되는 가장 중요한 효소는 분지효소 뿐만 아니라 전분 신타아제이다. 전분 신타아제의 경우, 다양한 아이소타입은 모두 ADP-글루코스의 글루코실 잔기를 α-1,4-글루칸으로 변환시킴으로써 중합반응을 촉매하는 것으로 기술되어 있다. 분지효소는 α-1,6 분지를 선형 α-1,4-글루칸으로 도입시키는 것을 촉매한다.

전분 신타아제는 두 개의 그룹으로 나뉠 수 있다: 과립-결합 전분 신타아제(GBSS) 및 용해성 전분 신타아제(SSS). 일부 전분 신타아제는 용해성일뿐만 아니라 과립-결합성이기 때문에 상기 분류가 항상 입증되는 것은 아니다(Denyer 등, Plant J. 4 (1993), 191-198; Mu 등, Plant J. 6 (1994), 151-159). 상기 분류내에서, 여러 아이소타입은 다양한 식물종에 대해 기술되어 있다. 상기 아이소타입은 그들의 프라이머 분자에 대한 의존도에 있어서 서로 다르다(소위 "프라이머 의존도"(타입 Ⅱ) 및 "프라이머 비의존도"(타입 Ⅰ)전분 신타아제).

이제까지 아이소타입 GBSS Ⅰ의 경우에만 전분합성동안 그의 정확한 기능이 성공적으로 측정되었다. 상기 효소활성이 강하게 또는 완전히 감소된 식물은 아밀로스가 없는 전분을 합성하며(소위 "왁스형" 전분)(Shure 등, Cell 35 (1983), 225-233; Visser 등, Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 289-296; WO 92/11376); 그러므로 상기 효소는 아밀로스-전분을 합성하는데 있어서 결정적인 역할을 수행했다. 이 현상은 녹조류 클라미도모나스 라인하르드티이(reinhardtii)의 세포내에서도 또한 발견된다(Delrue 등, J. Bacteriol. 174 (1992), 3612-3620). 클라미도모나스의 경우, GBSS Ⅰ는 아밀로스 합성에 포함될 뿐만 아니라 아밀로펙틴 합성에 특정 영향을 미친다고 기술되어 있다. 어떤 GBSS Ⅰ활성도 나타내지 않는 돌연변이체에서, 긴 사슬의 글루칸을 나타내는 정상적으로 합성된 아밀로펙틴의 특정 프랙션은 소실된다.

과립-결합 전분 신타아제, 특히 GBSS Ⅱ의 다른 아이소타입 및 용해성 전분 신타아제의 기능은 지금까지도 명확하지 않다. 분지형 효소와 함께 용해성 전분 신타아제는 아밀로펙틴의 합성에 포함되고(Ponstein 등, Plant Physiol. 92 (1990), 234-241 참조), 전분합성속도를 조절하는데 중요한 역할을 하는 것으로 가정된다. 옥수수의 경우, 용해성 전분 신타아제의 둘 또는 각각 세개의 아이소타입 뿐만 아니라 전분과립-결합 전분 신타아제의 두 개의 아이소타입이 동정되었다(Hawker 등, Arch. Biochem. Biophys. 160 (1974), 530-551; Pollock 및 Preiss, Arch. Biochem. Biophys. 204 (1980), 578-588; MacDonald 및 Preiss, Plant Physiol. 78 (1985), 849-852; Mu 등, Plant J. 6 (1994), 151-159).

옥수수의 GBSS Ⅰ로 코딩되는 cDNA와 게놈성 DNA는 이미 공지되었다(Shure 등, Cell 35 (1983), 225-233; Kloesgen 등, Mol. Gen. Genet. 203 (1986), 237-244). 게다가 소위 "발현된 서열 tag"(EST)는 공지되어 있으며(Shen 등, 1994, GenBank No.: T14684); 상기로부터 유도된 아미노산 서열은 콩(Dry 등, Plant J. 2 (1992), 193-202)과 감자(Edwards 등, Plant J. 8 (1995), 283-294)의 GBSS Ⅱ로부터 유도된 아미노산 서열과 매우 유사하다. 옥수수의 다른 전분 신타아제-아이소타입으로 코딩되는 핵산서열은 아직 알려져 있지 않다. GBSSⅠ과 다른 전분 신타아제로 코딩되는 cDNA 서열은 콩(Dry 등, Plant J. 2 (1992), 193-202), 벼(Baba 등, Plant Physiol. 103 (1993), 565-573) 및 감자(Edwards 등, Plant J. 8 (1995), 283-294)에 대해서만 공지되어 있다.

용해성 전분 신타아제는 옥수수로부터 동떨어진 여러 다른 식물종에서 확인되었다. 용해성 전분 신타아제는 예를 들면, 콩(Denyer 및 Smith, Planta 186 (1992), 609-617)과 감자(Edwards 등, Plant J. 8 (1995), 283-294)로부터 균질한 형태로 분리되었다. 상기 경우, SSS Ⅱ로 확인된 용해성 전분 신타아제의 아이소타입은 과립-결합 전분 신타아제 GBSS Ⅱ와 동일하다는 것이 밝혀졌다(Denyer 등, Plant J. 4 (1993), 191-198; Edwards 등, Plant J. 8 (1995), 283-294). 일부 다른 식물종의 경우, 여러 SSS-아이소타입의 존재는 예를 들어 보리(Tyynela 및 Schulman, Physiologia Plantarum 89 (1993) 835-841; Kreis, Planta 148 (1980), 412-416) 및 밀(Rijven, Plant Physiol. 81 (1986), 448-453)의 경우에 있어서 크로마토그래피법으로 알려졌다. 그러나 상기 단백질로 코딩되는 DNA 서열은 아직 알려지지 않았다. 변형된 전분을 합성할 방법에서 바람직한 전분-저장 식물을 변형시킬 수 있는 또다른 가능성을 제공하기 위해서는, 전분 신타아제의 다른 아이소타입으로 코딩되는 각 DNA 서열이 확인되어야 한다.

그러므로 본 발명의 기초가 되는 기술적인 문제는 상기 효소의 증가되거나 감소된 활성을 나타내는 유전적으로 변형된 식물이 제조되는 방법으로 전분 생합성에 포함되는 효소로 코딩되는 핵산분자를 제공하여, 상기 식물내에서 합성된 전분의 화학적 및/또는 물리적 특성에 있어서 변형을 촉진시키는 것이다.

상기 문제는 본 발명의 청구의 범위에 기술된 것으로 해결된다.

그러므로 본 발명은 전분 신타아제의 생물학적 활성을 갖는 단백질로 코딩되는 핵산분자에 관한 것으로서, 상기 분자는 서열번호 2로 기술된 아미노산 서열로 구성된 단백질로 바람직하게 코딩된다. 본 발명은 특히, 서열번호 1로 나타내는 뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부로 구성된 핵산분자, 바람직하게 서열번호 1로 나타내는 코딩부위로 구성된 분자 또는 상응하는 리보뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 유전암호의 퇴보를 야기하는 상기 분자의 뉴클레오티드 서열과 다른 서열과 전분 신타아제로 코딩되는 핵산분자도 또한 본 발명의 주제이다.

본 발명은 또한 전분 신타아제로 코딩되고, 상기 분자중 하나를 잡종화하는 핵산분자에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 핵산분자의 서열의 전체 또는 일부에 상보적인 서열을 나타내는 핵산분자에 관한 것이다.

본 발명의 핵산분자는 RNA 뿐만 아니라 DNA 분자이다. 상응하는 DNA 분자는 즉, 게놈성 또는 cDNA 분자이다. RNA 분자는 예를 들면, mRNA 또는 안티센스 RNA 분자이다.

본 발명의 골격내에서 "잡종화"라는 용어는 종래의 잡종화 조건하, 바람직하게 엄격한 조건하에서(예를 들어 Sambrook 등의 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY에 기술됨)잡종화하는 것을 의미한다. 본 발명의 핵산분자에 대해 잡종화하는 핵산분자는 상기 분자로 구성된 바람직한 종류의 유기체(즉, 원핵생물 또는 진핵생물, 특히 박테리아, 균류, 조류, 식물 또는 동물 유기체)로부터 기본적으로 유도될 수 있다. 이들은 단자엽 또는 쌍자엽 식물, 특히 유용한 식물, 더 바람직하게 전분-저장 식물, 특히 옥수수로부터 바람직하게 유도된다.

본 발명의 분자에 대해 잡종화하는 핵산분자는 여러 유기체의 게놈 또는 cDNA 라이브러리로부터 분리될 수 있다.

식물 및 다른 유기체로부터 상기 핵산분자를 확인하고, 분리하는 것은 상기 분자의 일부 또는 본 발명의 분자를 사용하여 발생할 수 있거나 경우에 따라 상기 분자의 역으로 상보적인 즉, 표준법에 따른 잡종화로 발생할 수 있다(Sambrook 등, 1989 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 참조)

잡종화를 위한 프로브로서, 예를 들어 그의 일부 또는 서열번호 1로 나타내는 뉴클레오티드 서열을 정확하게 또는 기본적으로 함유하는 핵산분자가 사용될 수 있다. 잡종화 프로브로서 사용되는 단편은 또한 종래의 합성법으로 제조되는 합성 단편 및 본 발명의 핵산분자의 서열과 기본적으로 동일한 서열이다. 본 발명의 핵산 서열에 대해 잡종화하는 유전자를 확인 및 분리후, 상기 서열은 측정되어야 하며, 상기 서열에 의해 코딩된 단백질의 특성은 분석되어야 한다.

본 발명의 핵산분자를 잡종화하는 분자는 또한 본 발명의 단백질로 코딩되는 상기 핵산분자의 대립형질 변이체, 유도체 및 단편으로 구성되어 있다. 상기에서, 단편은 상기 단백질 중 하나로 코딩되기 위해 충분히 긴 핵산분자의 일부로서 정의된다. 상기에서, 유도체라는 용어는 상기 분자의 서열이 하나이상의 위치에서 상기 핵산분자의 서열과 다르고, 상기 서열과 고도로 상동함을 보이는 것을 의미한다. 상기와 관련하여, 상동성은 적어도 40%, 특히 적어도 60%, 바람직하게 80% 이상 및 더 바람직하게 90% 이상의 서열 동일성을 의미한다. 상기 핵산분자에 비해 유도발생은 결실, 치환, 삽입 또는 재조합에 의해 일어난다.

게다가 상동성은 기능적 및/또는 구조적 등가가 그들의 코딩되는 각 핵산분자 또는 단백질 사이에 존재하는 것을 의미한다. 상기 분자와 상기 분자의 대표적인 유도체와 상동인 핵산분자는 상기 분자의 일반적인 변이체이며, 같은 생물학적 기능을 나타내는 변형물을 구성한다. 상기 변이는 다른 유기체로부터 유도된 서열변이, 또는 돌연변이를 자연적으로 발생시킬 수 있으며, 상기 돌연변이는 자연적으로 발생되거나 특이 돌연변이생성으로 도입될 수 있다. 게다가 상기 변이는 합성적으로 생성된 서열이다. 대립형질 변이체는 자연적으로 발생할 뿐만 아니라 합성적으로 생성된 변이체 또는 변이체는 재조합 DNA 기술에 의해 생성된다.

본 발명에 따른 핵산분자의 여러 변이체에 의해 코딩되는 단백질은 특정 특징을 나타낸다. 효소활성, 분자량, 면역반응, 입체배좌 등은 겔 전기영동내 유동성, 크로마토그래피 특성, 침상 계수, 용해도, 스펙트로스코피 특성, 안정성; pH-최적, 온도-최적 등과 같은 물리적 특성 뿐만 아니라 상기 특성에 속할 수 있다.

전분 신타아제의 중요한 특성은 ⅰ)식물세포의 색소체의 스트로마내 그의 위치; ⅱ)기질로서 ADP-글루코스를 사용한 선형 α-1,4-결합된 폴리글루칸을 합성할 수 있는 능력이다. 상기 활성은 Denyer 및 Smith의 문헌(Planta 186 (1992), 606-617)에 나타나 있는 바 또는 실시예에 기술되어 있는 바와 같이 측정될 수 있다.

본 발명의 핵산분자는 본래 상기 단백질을 발현하는 바람직한 유기체, 바람직하게 식물, 특히 전분합성 또는 전분저장 식물로부터 유도될 수 있다. 상기는 단자엽식물 뿐만 아니라 쌍자엽식물이다. 곡식(보리, 호밀, 귀리, 밀 등), 옥수수, 벼, 콩, 카사바 또는 감자 등이 특히 바람직하다.

본 발명의 핵산분자에 의해 코딩되는 단백질은 식물 전분 신타아제의 아직 확인되지 않고, 특징화되지 않은 아이소타입을 나타낸다. 상기 단백질은 공지된 식물로부터의 전분 신타아제에 대한 상동한 특정부위 뿐만 아니라 전분 신타아제의 효소 활성도를 나타내며; 그러나 이들은 공지된 아이소타입 중 하나로서 확실하게 분류될 수 없다.

특히, 본 발명의 핵산분자에 의해 코딩된 단백질은 E.coli 돌연변이체로 도입된후, 박테리아 콜로니를 블루염색시키면, 모든 glg 유전자가 결실 및 돌연변이되고, 폐지된 ADP 글루코스-피로포스포릴라아제를 발현하며, 상기 돌연변이체를 글루코스-함유 배지상에서 배양하고, 요오드 증기로 염색하는 특징을 가진다.

본 발명의 다른 주제는 본 발명의 핵산분자와 특이적으로 잡종화하는 올리고뉴클레오티드이다. 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게 적어도 10의 길이, 특히 적어도 15, 더 특히 적어도 50개의 뉴클레오티드를 가진다. 상기 뉴클레오티드는 본 발명의 핵산분자와 특이적으로 잡종화하는 것을, 즉 다른 단백질, 특히 다른 전분 신타아제로 코딩되는 핵산서열과 매우 제한된 정도로 잡종화하거나 하지 않는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 PCR 반응에 대한 프라이머로 사용될 수 있다. 이들은 또한 적당한 리보자임으로 코딩되는 DNA 분자 또는 안티센스 구조물의 성분이 될 수 있다.

그리고 본 발명은 상기 본 발명의 핵산분자를 함유하고, 유전공학의 벡터, 특히 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 박테리오파지 및 다른 보통의 벡터에 관한 것이다.

바람직한 실시예에서, 벡터내에 함유된 핵산분자는 원핵세포 및 진핵세포내에서 해독가능한 RNA를 전사하고 합성하는 조절인자와 결합된다.

원핵세포 즉, Escherichia coli내 본 발명의 핵산분자의 발현은 상기 분자로 코딩되는 효소의 효소적 활성의 더 정확한 특징을 가능하게 하는 한에 있어서, 관심의 대상이 된다. 특히, 식물세포의 전분 신타아제내에 포함되는 다른 효소의 부재하에서 각 효소에 의해 합성되는 생성물을 특징화할 수 있다. 이는 식물세포내에서 전분을 합성하는 동안 각 단백질이 나타내는 기능에 대해 결론을 낼 수 있게 한다.

그리고 종래의 분자-생물학적 기술(Sambrook 등의 1989 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 참조)에 의해 본 발명의 핵산분자로 여러 돌연변이를 도입할 수 있어, 변성된 생물학적 특성을 갖는 단백질의 합성이 수득될 수 있다. 상기에 의해, 결실 돌연변이체를 생성할 수 있으며, 상기 핵산분자는 코딩되는 DNA 서열의 5'- 또는 3'-말단에서 결실을 계속함으로써 제조된다. 상기 핵산분자는 상응하게 짧아진 단백질을 합성할 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 상기 5'-말단에서의 상기 결실은 예를 들어 색소체내 효소의 전위(펩티드 운반)능력이 있는 아미노산 서열을 확인할 수 있게 한다. 이는 세포기질외에 색소체내에 더 이상 각 서열의 제거로 인해 일어나지 않도록 하고, 또는 다른 구획내에 위치되어 있는 다른 시그널 서열의 첨가를 야기시키는 효소의 특이 생성을 허용한다.

한편, 점돌연변이는 아미노산 서열의 변형이 예를 들면 효소의 효소 활성 또는 조절에 영향을 미치는 위치에서 도입될 수 있다. 상기 방법에서, 예를 들면, 변형된 K_m-값을 갖는 돌연변이체가 생성될 수 있으며, 또는 돌연변이체가 세포내에서 보통 발생하는 공유 변성 또는 입체적 조절에 의한 조절기작에 들어간다.

그리고 기질로서 ADP-글루코스 대신에 ADP-글루코스-6-포스페이트를 사용하는 돌연변이체와 같이 변형된 기질 또는 생성물 특이성을 나타내는 돌연변이체가 생성될 수 있다. 게다가 변형된 활성도-온도-프로필을 갖는 돌연변이체가 생성될 수 있다.

원핵세포내 유전적 처리를 위해 본 발명의 핵산분자 또는 그 분자의 일부는 DNA 서열의 재조합에 의한 돌연변이생성 또는 서열을 변형시키는 플라스미드로 삽입될 수 있다. 표준법(Sambrook 등, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 참조)에 의해 염기교환이 실시될 수 있거나 자연적 또는 합성 서열이 첨가될 수 있다. DNA 단편을 연결하기 위해, 어댑터 또는 링커가 단편에 부착될 수 있다. 그리고 적당한 제한위치를 제공하거나 여분의 DNA 또는 제한위치를 제거하는 처리를 할 수 있다. 실험관내 돌연변이생성에 있어서 삽입, 결실 또는 치환을 사용하는 곳에는 "프라이머 회복", 제한 또는 연결이 사용될 수 있다. 분석하기 위해 서열 분석, 제한 분석 또는 다른 생화학-분자생물학적 방법을 사용할 수 있다.

다른 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 핵산분자 또는 본 발명의 벡터에 의해 형질전환되고 유전적으로 변형된 숙주세포, 특히 원핵세포 또는 진핵세포 뿐만 아니라 본 발명의 핵산분자 또는 벡터를 함유하는 상기 형질전환된 세포로부터 유도된 세포에 관한 것이다. 이는 박테리아 세포 또는 식물세포가 바람직하다.

그리고 본 발명의 핵산분자에 의해 코딩된 단백질 또는 그의 생물학적으로 활성인 단편 뿐만 아니라 그들의 제조방법은 본 발명의 주제가 되며, 본 발명의 숙주세포는 단백질 합성을 허용하는 조건하에서 배양되며, 그후 단백질은 배양된 세포 및/또는 배양배지로부터 분리된다.

본 발명의 핵산분자의 공급에 의해 번식으로 불가능했던 방법에 있어서 재조합 DNA 기술로 식물의 전분대사를 특이적으로 방해할 수 있다. 그럼으로써 그의 물리화학적 특징, 특히 아밀로스/아밀로펙틴 비율, 분지정도, 평균사슬길이, 포스페이트 함유량, 패스티피케이션(pastification) 행동, 전분과립의 크기 및/또는 전분과립의 형태면에서, 전분대사는 야생형 식물내에서 합성된 전분에 비해 변형된 전분이 합성되는, 즉 변형되는 방법으로 변형될 수 있다. 각 핵산분자를 과잉발현시키거나 그들의 활성에 관해 세포-특이 조절식 및/또는 다른 온도-의존도에 더 이상 속하지 않는 사용가능한 돌연변이체를 제조하는 것과 같이 본 발명의 단백질의 활성도를 증가시킴으로써 유전적으로 변형된 식물의 수득율을 증가시킬 수 있다. 옥수수 단독의 전분합성을 방해하는 일은 세계 연간 전분생산량의 80%가 옥수수 전분으로부터 생성되기 때문에 경제적으로 중요하다는 것이 명백하다.

그러므로 각 전분 신타아제의 활성도를 증가시키기 위해 식물세포내 본 발명의 핵산분자를 발현시킬 수 있다. 그리고 본 발명의 핵산분자는 세포-특이 조절기작에 들어가지 않거나 변형된 온도-의존도 또는 기질 또는 생성물 특이성을 나타내는 본 발명에 따른 전분 신타아제를 제조하기 위해 당업자들에게 공지된 방법으로 변형될 수 있다.

식물내에서 본 발명의 핵산분자를 발현하는데 있어서, 합성된 단백질은 본래 식물세포내에서 바람직한 구획내에 위치될 수 있다. 특이 구획내에 위치하기 위해 색소체내 정위를 확실히 하는 서열은 결실되어야 하며, 남은 코딩부위는 각 구획내에서 정위를 확실하게 하는 DNA 서열과 선택적으로 결합되어야 한다. 상기 서열은 공지되어 있다(Braun 등, EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolter 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald 등, Plant J. 1 (1991), 95-106 참조).

그러므로 본 발명은 또한 본 발명의 핵산분자로 유전적으로 변형되고, 형질전환된 유전자도입 식물세포에 관한 것일 뿐만 아니라 상기 방법으로 형질전환된 세포로부터 유도된 유전자도입 식물세포에 관한 것이다. 상기 세포는 본 발명의 핵산분자를 함유하며, 이는 바람직하게 조절 DNA 요소에 결합하며, 특히 프로모터와 함께 식물세포내에서 전자를 확실하게 한다. 본 발명의 유전자도입 식물세포는 게놈내 다른 위치에서와 같이 다른 게놈성 환경내 전체 또는 일부의 세포내에서 자연적으로 발생하지 않는 본 발명의 게놈 DNA 분자로 삽입되어 함유되어 있는 점에서 자연적으로 발생하는 식물세포와 다르다. 본 발명의 게놈 DNA 분자내에서 자연적으로 함유할 수 있는 식물세포는 본 발명의 식물세포가 각 자연적으로 발생하는 식물세포내에서 자연적으로 발생하는 것보다 많은 본 발명의 핵산분자의 유전자 복사본을 나타내고, 상기 추가의 복사본은 다른 유전적 위치에서 삽입된다는 점에서 본 발명의 식물세포와 다르다. 상기 특징들은 게놈성 DNA의 서던 블롯(southern blot) 분석으로 측정될 수 있다.

당업자들에게 공지된 방법으로 유전자도입 식물세포는 전체 식물로 재생될 수 있다. 그러므로 본 발명의 유전자도입 식물세포를 재생하여 수득된 식물은 또한 본 발명의 주제가 된다. 본 발명의 다른 주제는 상기 유전자도입 식물세포를 함유하는 식물이다. 유전자도입 식물은 본래 바람직한 종류의 식물이 될 수 있는데, 즉 단자엽 뿐만 아니라 쌍자엽 식물이 될 수 있다. 이들은 바람직하게 유용한 식물이며, 특히 곡식(호밀, 보리, 귀리, 밀 등), 벼, 옥수수, 콩, 카사바 또는 감자와 같은 전분-저장 식물 또는 전분-합성 식물이다.

본 발명은 또한 과실, 종자, 괴경, 대목, 모, 꺾꽂이와 같은 본 발명의 식물의 번식물질에 관한 것이다.

본 발명의 핵산분자의 발현 또는 추가의 발현으로 인해, 본 발명에 기술되는 식물과 유전자도입 식물세포는 야생형 식물에서 합성되는 전분에 비해 물리-화학적 특성, 즉 아밀로스/아밀로펙틴 비율, 분지정도, 평균 사슬-길이, 포스페이트 함유량, 패스티피케이션 행동, 전분과립의 크기 및/또는 전분 과립의 형태에 있어서 변형된 전분을 합성한다. 야생형-전분에 비해 상기 전분은 그의 점성도 및/또는 이 전분의 접착제의 겔형성 특성에 관해 특히 변형될 수 있다.

그러므로 또한 본 발명에 따른 식물과 유전자도입 식물세포로부터 수득가능한 전분도 본 발명의 주제가 된다.

본 발명의 핵산분자에 의해 본 발명의 단백질의 활성도가 감소된 식물과 식물세포를 생성할 수 있다. 이는 또한 야생형 식물세포와 비교했을 때 변형된 화학적 및/또는 물리적 특징을 가진 전분을 합성시킨다.

그러므로 형질전환되지 않은 식물에 비해 본 발명에 따른 단백질의 활성도가 감소된 유전자도입 식물세포는 본 발명의 다른 주제가 된다.

본 발명의 단백질의 감소된 활성도를 갖는 식물세포의 생성은 공억제 효과를 수득하기 위한 센스-RNA, 상응하는 안티센스-RNA의 발현 또는 제조된 리보자임의 발현에 의해 수득될 수 있으며, 이는 본 발명의 핵산분자를 사용하여 본 발명의 단백질 중 하나로 코딩되는 전사물을 분열시킨다. 본 발명의 단백질의 활성도를 감소시키기 위해 안티센스-RNA는 바람직하게 식물세포내에서 발현된다.

안티센스-RNA를 발현하기 위해 본 발명의 단백질로 코딩되고, 코딩 부위의 일부로 구성되는 DNA 분자 뿐만 아니라 플랭킹 서열을 포함하는 완전한 서열로 구성된 DNA 분자가 사용될 수 있다. 상기 부분은 세포내에서 안티센스-효과를 일으키기 위해 충분히 길어야 한다. 기본적으로 15bp의 최소길이, 바람직하게 100-500bp의 길이를 가지며, 효과적인 안티센스-저해를 위해 특히 500bp이상의 길이를 갖는 서열이 사용될 수 있다. 일반적으로 5000bp보다 짧고, 바람직하게 2500bp 이하의 길이를 갖는 서열의 DNA 분자가 사용된다.

고도로 균질한 DNA 서열을 사용할 수 있지만, 본 발명의 DNA 분자의 서열과 완전히 동일하지는 않다. 최소의 균질성은 약 65% 이상이어야 한다. 바람직하게 95 및 100%사이의 균질성을 갖는 서열을 사용해야 한다.

본 발명의 세포는 안티센스 RNA, 리보자임 또는 공억제 RNA로 코딩되는 이종성 재조합 DNA 분자를 함유하는 점에서 자연적으로 발생한 세포와 다르다. 상기 이종성 재조합 DNA 분자의 발현으로 인해, 세포내 본 발명의 단백질 합성이 감소되며, 그럼으로써 상응하는 활성도도 감소된다.

상기에서, "이종성(heterologous)" DNA는 세포내로 도입된 DNA가 상기 형태의 세포내에서 자연적으로 발생하지 않는 것을 의미한다. 한편, 상기 세포내에서 발생하지 않아도 외인성 DNA로서 다른 유전적 자리에서 삽입되고, 다른 유전적 환경내에서 위치해 있는 DNA 또는 상기 형질전환된 세포내에서 모두 자연적으로 발생하지 않는 DNA가 될 수 있다.

본 발명의 유전자도입 식물세포는 당업자에게 공지된 방법으로 전체 식물로 재생될 수 있다. 그러므로 본 발명의 유전자도입 식물세포를 함유하는 식물은 또한 본 발명의 주제가 된다. 상기 식물들은 쌍자엽 뿐만 아니라 단자엽 식물과 같은 바람직한 식물종의 식물이 될 수 있다. 바람직하게 상기는 유용한 식물이며, 즉 인간 또는 동물의 영양분 공급 또는 기술적 목적을 위해 인간에 의해 배양되는 식물이다. 특히 바람직한 것은 곡식(호밀, 보리, 귀리, 밀 등), 벼, 옥수수, 콩, 카사바 또는 감자와 같은 전분-합성 또는 전분-저장 식물이다. 본 발명은 또한 과실, 종자, 괴경, 대목, 모, 꺾꽂이와 같은 본 발명의 식물의 번식물질에 관한 것이다.

본 발명의 단백질의 활성도 감소로 인해 본 발명의 유전자도입 식물세포와 식물은 야생형 식물내에서 합성된 전분에 비해 물리-화학적 특성, 특히 아밀로스/아밀로펙틴 비율, 분지정도, 평균사슬-길이, 포스페이트 함유량, 패스티피케이션 행동, 전분과립의 크기 및/또는 전분 과립의 형태에 있어서 변형된 전분을 합성한다. 상기 전분은 야생형 식물로부터 유도된 전분과 비교했을 때 접착제의 겔형성 특성 및/또는 변형된 점성도를 나타낸다. 그러므로 상기 유전자도입 식물세포로 및 식물로부터 수득가능한 전분은 또한 본 발명의 주제가 된다.

본 발명의 전분은 당업자에게 공지된 기술에 따라 변형될 수 있으며; 변형되지 않았을 뿐만 아니라 변형된 형태에 있어서, 식료품 및 비식료품으로서 사용되기에 적당하다.

기본적으로 전분용도의 가능성은 두 개의 주요 분야로 나뉘어질 수 있다. 한 분야는 효소적 또는 화학적 방법으로 수득된 글루코스 성분 글루칸 및 전분의 가수분해 생성물로 구성된다. 발효와 같은 화학적 변형 및 처리를 위한 개시물질로 사용될 수 있다. 상기에서, 가수분해 방법은 간단하고 비용이 저렴하게 실시될 수 있다는 점에서 중요하다. 현재 아밀로글루코시다아제를 사용하여 효소적으로 실시된다. 사용된 효소에 대해 접근할 수 있는 정도를 제한하는 감소된 분지 또는 입체구조로 인해 향상된 소화능, 과립표면적을 증가시키는 것과 같은 전분구조에 있어서 변화로 인한 가수분해를 위해 소량의 효소를 사용하여 비용을 낮출 수 있다고 생각할 수 있다.

소위 천연 전분으로서 그의 중합체 구조 때문에 전분이 사용되는 다른 분야는 두 개의 영역으로 나뉠 수 있다:

1. 식료품으로서의 용도

수성 첨가제를 결합시키기 위해 필수적으로 제공하고, 또는 증가된 점성도 또는 증가된 겔 형성을 야기시키는 다양한 식료품용 전통 첨가제이다. 중요한 특징적 특성은 미끈하고 수착 행동, 팽윤 및 패스티피케이션 온도, 점성도 및 농화완성도, 전분 용해도, 투명도 및 페이스트 구조, 열, 전단력 및 산 저항도, 소급 경향, 막 형성 능력, 동결/해빙에 대한 저항도, 소화성 뿐만 아니라 무기 또는 유기이온과의 복합체 형성 능력이다.

천연 전분을 사용하는 바람직한 범위는 베이커리-상품 및 파스타 분야이다.

2. 비식료품으로서의 용도

사용하는 다른 주 분야는 다양한 생성방법에 있어서 보조제 또는 기술적인 제조물에 있어서 첨가제로서 전분을 사용하는 것이다. 보조제로서 전분을 사용하기 위한 사용의 주 분야는 우선 종이 및 판지 산업이다. 상기 분야에서, 전분은 물질을 고화시킬 때 충진제 및 미세한 과립의 크기를 측정하고 탈수시키기 위해 보유(고체를 소유)하기 위해 주로 사용된다. 그리고 단단함, 경도, 안전함, 통제력, 광택, 파열강도 뿐만 아니라 표면의 관점에서 전분의 유리한 특성이 이용된다.

2.1 종이 및 판지 산업

종이 제조방법에서, 4개의 사용분야, 즉 표면, 코팅, 매스 및 분무로 나뉠 수 있다.

표면처리면에서 전분에 필요한 것은 고도의 밝기, 상응하는 점성도, 높은 점성도 안정성, 우수한 막 형성 뿐만 아니라 낮은 먼지 형성도이다. 코팅에 사용될 때, 고체 함유량, 상응하는 점성도, 높은 결합능력 뿐만 아니라 높은 색소 친화성이 중요한 역할을 한다. 매스 래피드(mass rapid)에 대한 첨가제로서, 균일하고, 손실이 없는 분산, 높은 기계적 안정성 및 종이 펄프내 완전한 보유력이 중요하다. 분무에 전분을 사용할 때 상응하는 고체의 함량, 높은 점성도 뿐만 아니라 높은 결합능력도 또한 중요하다.

2.2 접착제 산업

사용하는 주요 분야는 예를 들어 접착제 산업에 있어서, 사용분야는 순수한 전분 접착제로서의 용도, 특정 화학물로 제조된 전분 접착제에 있어서의 용도, 합성수지 및 중합체 분산물에 대한 첨가제로서 전분의 용도 뿐만 아니라 합성 접착제용 확장제로서의 전분의 용도의 네 분야로 나뉜다. 모든 전분계 접착제의 90%는 골판지, 종이가방 및 백, 종이 및 알루미늄용 조성물질, 박스 및 봉투, 스탬프 등을 위한 습윤 접착제를 제조하는데 사용된다.

2.3 직물 및 직물 보호 산업

보조제 및 첨가제로서 다른 가능한 용도는 직물 및 직물보호 생성물을 제조하는 것이다. 직물 산업에서, 용도는 다음과 같은 네 개의 분야로 나뉠 수 있다: 직조동안 마모저항성의 증가시키기 위한 것뿐만 아니라 직조시 장력 활성에 대한 보호를 위한 돌발행동을 부드럽게 하고 강화하기 위한 보조제와 같은 풀재료로서의 용도, 표백, 건조 등과 같은 질-퇴화 전처리후 직물향상제로서의 용도, 염료 확산을 저해하기 위한 염료 페이스트의 제조시 농화제로서의 용도 및 실을 뜨기 위한 와아핑제용 첨가제로서의 전분의 용도

2.4 건축산업

전분을 사용하는 네 번째 영역은 건축재에 있어서 첨가제로서의 용도이다. 한 예로는 석고 회반죽 보드의 제조인데, 얇은 회반죽 페이스트내에서 물과 혼합된 전분은 석고 보드의 표면에서 퍼지고, 판지에서 보드로 결합한다. 용도의 다른 분야는 회반죽과 광물 섬유로 혼합시키는 것이다. 미리 혼합된 콘크리트에서 전분은 풀칠공정의 속도를 감소시키는데 사용될 수 있다.

2.5 지반 안정화

그리고 전분은 인공 지반 상승시, 물에 대해 땅의 입자를 임시로 보호하기 위해 사용되는 지반 안정화방법으로 생성되는 장점이 있다. 공지된 기술에 따라 전분과 중합체 에멀션으로 구성된 조합생성물은 지금까지 사용된 생성물로서 같은 침식-감소 효과 및 피막-감소 효과를 가지는 것을 간주될 수 있으며; 그러나 비용이 적게 든다.

2.6 식물 보호제 및 비료에 있어서 전분의 용도

용도의 다른 분야는 상기 제조물의 특정 특징의 변형을 위한 식물 보호제에 있어서 전분의 용도이다. 예를 들어 전분은 식물 보호제 및 비료의 습윤도를 향상시키고, 활성성분의 투여된 방출, 액체의 휘발성 및/또는 향기나는 활성성분을 미세결정의 안정하고 변형가능한 물질로 전환시키고, 서로 맞지 않는 조성물을 혼합하고, 감소된 분해로 인한 효과의 지속연장을 위해 사용된다.

2.7 약물, 약품 및 화장품 산업

전분은 또한 약물, 약품 및 화장품 산업의 분야에도 사용될 수 있다. 의약품 산업에서, 전분은 캡슐내 결합제의 희석 또는 정제용 결합제로서 사용될 수 있다. 그리고 전분은 삼킨후 정제용 분산제로서 적당하며, 유액을 흡수하며, 단시간후에 많은 활성성분이 방출되도록 한다. 질적인 이유로서는 의약 유동성과 먼지같은 분말은 용도의 다른 분야이다. 화장품 분야에서, 전분은 향수 및 살리실산과 같은 분말 첨가제의 운반체로서 사용될 수 있다. 전분의 용도에 있어서 상대적으로 넓은 분야는 치약이다.

2.8 석탄 및 연탄에 있어서 첨가제로서의 전분

석탄 및 연탄에 있어서 첨가제로서의 전분의 용도도 또한 생각할 수 있다. 전분을 첨가함으로써 석탄은 정량적으로 집적되고, 또는 높은 질로 연탄화될 수 있으며, 연탄의 전제조 분해를 방해한다. 바베큐 석탄은 4% 내지 6% 사이의 첨가된 전분, 칼로리화된 석탄 0.1 내지 0.5%를 함유한다. 그리고 전분은 석탄 및 연탄에 첨가함으로써 독성 물질의 방출을 감소시키기 때문에 결합제로서 적당하다.

2.9 광석 및 석탄 슬러리 공정

그리고 전분은 광석 및 석탄 슬러리 공정에 있어서 응집제로서 사용될 수 있다.

2.10 주조시 첨가제로서의 전분

용도의 다른 분야는 주조시 물질을 처리하기 위한 첨가제로서 사용하는 것이다. 다양한 주조를 위해 결합제와 혼합된 모래로부터 생성된 석탄을 처리하는 것이 필요하다. 오늘날, 가장 통상적으로 사용되는 결합제는 변형된 전분, 대부분 팽윤 전분과 혼합된 벤도나이트이다.

전분을 첨가하는 목적은 유동 저항성을 증가시킬 뿐만 아니라 결합강도를 향상시키는 것이다. 그리고 팽윤 전분은 냉수내 분산능, 재수화능, 모래내 양호한 혼합능 및 높은 물 결합능력과 같은 제조공정을 위한 필요조건을 만족시킨다.

2.11 고무산업에 있어서 전분의 용도

고무산업에 있어서 전분은 기술적 및 광학적 질을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 그 이유는 향상된 표면광택, 통제력 및 외양이다. 상기 목적을 위해 냉 가황전에 고무물질의 끈적거리는 고무화 표면상에 전분이 분산된다. 또한 고무의 인쇄능력을 향상시키는데 사용될 수 있다.

2.12 가죽 대용품의 제조

변형된 전분을 사용하는 다른 분야는 가죽 대용품을 제조하는 것이다.

2.13 합성 중합체에 있어서의 전분

플라스틱 시장에 있어서, 다음의 용도분야는 최근에 생겨난 것이다: 전분으로부터 유도된 생성물을 처리공정으로 도입(전분은 단지 충진제이며, 합성 중합체와 전분사이에는 직접적인 결합이 없음) 또는 선택적으로 전분으로부터 유도된 생성물을 중합체 생성으로 삽입(전분 및 중합체는 안정한 결합을 형성함).

순수한 충진제로서 전분의 용도는 활석과 같은 다른 물질과 필적할 수 없다. 상기 상황은 특이 전분특성이 효과적이고, 최종 생성물의 특성 프로필이 명확하게 변경될 때 다르다. 한 실시예는 폴리에틸렌과 같은 열가소성 물질의 처리시 전분생성물을 사용한다. 그럼으로써 전분과 합성 중합체는 '마스터 배치'를 형성하는 공발현의 방법으로 1:1의 비율로 결합되며, 상기로부터 다양한 생성물은 과립화 폴리에틸렌을 사용한 기술로 제조된다. 폴리에틸렌 막 내 전분의 삽입은 중공체에서 증가된 물질 투과능, 향상된 수증기 투과능, 향상된 항안정성 행동, 향상된 항블록 행동 뿐만 아니라 향상된 수성 염료와의 인쇄능을 야기할 수 있다. 다른 가능성은 폴리우레탄 거품내에서 전분의 용도이다. 전분 유도체의 적응 뿐만 아니라 처리기술의 최적화로 인해 합성 중합체와 전분의 히드록시기사이의 반응을 특이적으로 조절할 수 있다. 그 결과로서 전분을 사용함으로 인한 하기의 특징 프로필을 갖는 폴리우레탄 막이 있다: 감소된 열팽창 계수, 감소된 수축행동, 향상된 압력/장력 행동, 물흡수에 있어서 변화없이 증가된 수증기 투과능, 감소된 인화성 및 균열밀도, 가연성 부품의 비고갈, 무할로겐화물 및 감소된 노화. 여전히 존재하는 단점은 감소된 압력 및 충격강도이다.

필름 제품개발은 선택인 것만은 아니다. 또한 도자기, 접시 및 사발과 같은 고체 플라스틱 제품은 50% 이상의 전분 함유량으로 제조될 수 있다. 그리고 전분/중합체 혼합물은 생분해하기에 더 쉬운 장점을 제공한다.

게다가 물과 결합하는 극단적인 능력으로 인해 전분 그래프트 중합체는 수득된 최대한의 중요성을 가진다. 이들은 라디칼 사슬 기작의 원칙에 따라 그래프트된 합성 단량체의 측방 격자와 전분의 백본을 가진 제품이다. 오늘날 사용가능한 전분 그래프트 중합체는 높은 점성도에서 전분 1g당 1000g 이하의 물 수용능력 및 결합이 향상되는 것에 의해 특징화된다. 상기 고급 흡수제는 기저귀 및 종이와 같은 제품에서 위생 분야 뿐만 아니라 종자 펠릿과 같은 농업 분야에서도 주로 사용된다.

재조합 DNA 기술에 의해 변형된 새로운 전분의 용도에 결정적인 것은 구조, 물 함유량, 단백질 함유량, 액체 함유량, 섬유 함유량, 재/인산 함유량, 아밀로스/아밀로펙틴 비율, 상대적 몰부피의 분포, 분지정도, 과립 크기 및 형태 뿐만 아니라 결정화이며, 한편 하기 특징에서 수득되는 특성이다: 미끈하고 수착 행동, 패스티피케이션 온도, 점성도, 농화완성도, 용해도, 페이스트 구조, 투명도, 열, 전단력 및 산 저항도, 소급 경향, 겔형성 능력, 동결/해빙에 대한 저항도, 복합체 형성능력, 요오드 결합, 막 형성, 접착제 강도, 효소 안정성, 소화성 및 반응성.

유전자도입 식물과 유전적으로 작업함으로써 변형된 전분 생성물은 불필요한 화학적 또는 물리적 방법으로 변형하게 하는 방법으로 식물로부터 수득된 전분의 특성을 변형시킬 수 있다. 한편, 재조합 DNA 기술로 변형된 전분은 부가의 화학적 변형에 가해지고, 상기 사용분야의 질을 향상시킬 것이다. 상기 화학적 변형물은 당업자들에게 주로 공지되어 있다. 이들은 특히 열처리, 산처리, 산화 및 에스테르화의 처리로 변형되며, 인산염, 질산염, 황산염, 크산틴산염, 아세트산염 및 시트르산염 전분의 형성을 야기한다. 다른 유기산은 에스테르화를 위해 사용될 수 있다:

- 전분 에테르 형성

전분 알킬 에테르, O-알릴 에테르, 히드록실알킬 에테르, O-카르복시메틸 에테르, N-함유 전분 에테르, P-함유 전분 에테르 및 S-함유 전분 에테르

- 분지된 전분의 형성

- 전분 그래프트 중합체 형성

식물세포내에서 센스-배향 또는 안티센스-배향으로 본 발명의 핵산분자를 발현하기 위해, 상기들은 식물세포내 전사를 확실하게 하는 조절 DNA 요소에 결합된다. 상기 조절 DNA 요소들은 특히 프로모터이다. 기본적으로 식물세포내에서 활성인 프로모터는 발현을 위해 사용된다.

프로모터는 구성적으로 또는 특정 조직에서만, 식물발달의 특정 시점에서 또는 외부인자에 의해 결정되는 시점에서 일어나는 방법으로 선택될 수 있다. 식물에 관해 프로모터는 상동성 또는 이종성일 수 있다. 구성적인 발현을 위한 적당한 프로모터는 예를 들어 꽃양배추 모자이크 비루스의 35S RNA 프로모터 및 옥수수로부터의 유비퀴틴 프로모터이다. 감자내에서 괴경-특이 발현을 위해 파타틴(patatin) 유전자 프로모터 B33(Rocha-Sosa 등, EMBO J. 8 (1989), 23-29)이 사용될 수 있으며, 또는 ST-LS1 프로모터(Stockhaus 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus 등, EMBO J. 8 (1989), 2445-2451)와 같이 광합성적으로 활성인 조직에서만 발현을 하는 프로모터가 사용될 수 있다. 배유-특이 발현을 위해 밀로부터의 HMG 프로모터, USP 프로모터, 페이스올린(phaseolin) 프로모터 또는 옥수수의 제인 유전자로부터의 프로모터가 적당하다.

그리고 말단 서열이 존재하며, 이들은 전사를 정확하게 끝내게 하고, 전사물을 안정화하기 위해 전사물에 폴리-A-꼬리를 첨가하게 한다. 상기 요소는 문헌(Gielen 등, EMBO J. 8 (1989), 23-29)에 기술되어 있으며, 바람직하게 변형될 수 있다.

본 발명은 옥수수에서 확인된 전분 신타아제의 아이소타입으로 코딩되는 핵산분자를 제공한다. 이는 상기 효소의 활성이 변형된 유전적으로 변형된 식물의 제조를 위해서 뿐만 아니라 전분 생합성에 있어서 상기 아이소타입의 기능을 확인시킨다. 이는 변형된 구조를 갖는 전분을 합성할 수 있게 하며, 그럼으로써 식물내 변형된 물리-화학적 성질을 상기 방법으로 처리하였다.

원칙적으로 본 발명의 핵산분자는 본 발명의 전분 신타아제의 활성이 높아지거나 감소되고, 동시에 전분생합성내 포함된 다른 효소의 활성이 변형된 식물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 그럼으로써 모든 종류의 조합물과 교환물을 생각할 수 있다. 식물내에서 전분 신타아제의 하나이상의 아이소타입의 활성을 변형시킴으로써 그의 구조에 있어서 변형된 전분의 합성이 일어난다. 옥수수 또는 밀의 배유 또는 감자 괴경내와 같은 형질전환된 식물의 전분-저장 조직의 세포내에서 전분 신타아제의 하나이상의 아이소타입의 활성을 증가시킴으로써 수득율이 증가될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 단백질로 코딩되는 핵산분자 또는 상응하는 안티센스-구조물은 내생 GBSS Ⅰ-단백질, SSS-단백질 또는 GBSS Ⅱ-단백질의 합성이 이미 저해되어 안티센스-효과 또는 돌연변이를 일으키고, 또는 분지 효소의 합성이 저해되는(ae 돌연변이체(Shannon 및 Garwood, 1984, in Whistler, BeMiller and Paschall, Starch: Chemistry and Technology, Academic Press, London, 2^ndedition: 25-86)와 연관되거나 WO92/14827에 기술된 바와 같음) 식물세포내로 도입될 수 있다.

형질전환된 식물내에서 여러 전분 신타아제의 합성이 저해된다면, DNA 분자들은 형질전환을 위해 사용될 수 있으며, 동시에 적당한 프로모터에 의해 조절되고, 상응하는 전분 합성효소로 코딩되는 안티센스-배향내 여러 부위를 포함한다. 상기 구조물에서, 각 서열은 그의 프로모터에 의해 선택적으로 조절되며, 그 외의 서열은 보통의 프로모터로부터 융합물로서 전사될 수 있다. 후자는 각 단백질의 합성이 대략 같은 정도로 저해되는 경우에 일반적으로 바람직할 것이다.

그리고 전분 신타아제로 코딩되는 DNA 서열과 달리 전분합성 또는 변형에 포함되고, 안티센스 배향에서 적당한 프로모터에 결합되는 다른 단백질로 코딩되는 다른 DNA 서열이 존재하는 DNA 분자를 구조할 수 있다. 즉, 상기 서열은 시리즈로 연결될 수 있으며, 보통의 프로모터로부터 전사될 수 있다. 상기 구조물에 사용된 각 코딩부위의 길이에 있어서, 안티센스-구조물의 제조에 관련된 상기 사실은 또한 사실이다. 상기 DNA 분자내 프로모터로부터 전사되는 안티센스 단편의 수에 대해서는 상한선이 없다. 그러나 수득되는 전사물은 10kb, 바람직하게 5kb 이상 길지 않다.

다른 코딩부위와 조합시 상기 DNA 분자내 적당한 프로모터 뒤에 안티센스-배향으로 위치되어 있는 코딩부위는 하기 단백질로 코딩되는 DNA서열로부터 유도될 수 있다: 과립-결합 전분 신타아제(GBSS Ⅰ 및 Ⅱ), 다른 용해성 전분 신타아제(SSS Ⅰ 및 Ⅱ), 분지 효소, 탈분지 효소, 불균등화 효소 및 전분 인산화효소. 상기 열거물들은 주로 예로서 제공한다. 상기 조합물의 골격내 다른 DNA 서열의 용도도 또한 생각할 수 있다.

상기 구조물에 의해 상기 분자로 형질전환된 식물세포내에서 동시에 여러 효소의 합성을 저해할 수 있다.

그리고 구조물은 하나이상의 전분 생합성 유전자에 대해 방어적인 전통 돌연변이체로 도입될 수 있다(Shannon 및 Garwood, 1984, in Whistler, BeMiller and Paschall, Starch: Chemistry and Technology, Academic Press, London, 2^ndedition: 25-86). 상기 결점은 하기 단백질에 관련된 것이다: 과립-결합(GBSS Ⅰ 및 Ⅱ) 및 용해성 전분 신타아제(SSS Ⅰ 및 Ⅱ), 분지효소(BE Ⅰ 및 Ⅱ), 탈분지효소(R-효소), 불균등화 효소 및 전분 인산화효소. 상기 열거물들은 주로 예로서 제공한다.

상기 방법으로 상기 분자들로 형질전환된 식물 세포내에서 동시에 여러 효소의 합성을 저해할 수 있다.

고급식물로 외부유전자를 도입시키기 위해 E.coli에 대한 복제시그널 및 형질전환된 박테리아 세포 선별용 마커 유전자를 함유하는 다수의 클로닝 벡터가 처리된다. 상기 벡터들의 예로서는 pBR322, pUC 시리즈, M13mp 시리즈, pACYC184 등이 있다. 바람직한 서열은 적당한 제한위치에서 벡터내로 삽입될 수 있다. 수득된 플라스미드는 E.coli 세포의 형질전환에 사용된다. 형질전환된 E.coli 세포는 적당한 배지내에서 배양되며, 연속적으로 수확되고, 분해된다. 상기 플라스미드는 회수된다. 수득된 플라스미드 DNA의 특징화를 위한 분석법은 일반적으로 제한분석, 겔 전기영동 및 다른 생화학-분자생물학적 방법을 사용한다. 각 처리후, 플라스미드 DNA는 제거되며, 수득된 DNA 단편은 다른 DNA 서열에 결합된다. 각 플라스미드 DNA는 같거나 다른 플라스미드로 클론된다. 식물 숙주세포내로 DNA를 도입하기 위해 광범위한 기술이 처리된다. 상기 기술은 형질전환배지로서 아그로박테리아 종양인자(tumefacine) 또는 아그로박테리아 뿌리유전자(rhizogene)를 사용함으로써 T-DNA로 식물세포를 형질전환하고, 엽록체를 융합시키고, DNA를 주입 및 전기영동하고, 다른 가능한 것뿐만 아니라 생분해적 방법(biolistic method)으로 DNA를 도입하는 것으로 구성된다.

식물세포내 DNA를 주입하고 전기영동하는 경우, 특별히 요구되는 플라스미드가 없다. pUC 유도체와 같은 간단한 플라스미드는 사용될 수 있다. 그러나 전체 식물이 상기 방법으로 형질전환된 세포로부터 재생될 경우, 선별가능한 마커 유전자는 존재해야 한다.

식물세포로 바람직한 유전자를 도입하는 방법에 의존하여, 다른 DNA 서열이 필요하다. Ti-플라스미드 또는 Si-플라스미드가 사용된다면, 식물세포의 형질전환을 위해 Ti-플라스미드 및 Ri-플라스미드 T-DNA의 적어도 우측의 가장자리, 더 바람직하게 우측과 죄측의 가장자리가 플랭킹부로서 도입된 외부유전자에 연결되어야 한다.

아그로박테리아가 형질전환을 위해 사용된다면, 삽입된 DNA는 특정 플라스미드, 즉 매개벡터 또는 2원체 벡터로 클론되어야 한다. T-DNA내 서열과 상동한 서열로 인해 매개벡터는 상동한 재조합으로 인한 아그로박테리아의 Ti-플라스미드 또는 Ri-플라스미드로 삽입될 수 있다. 이는 또한 T-DNA의 이동에 필요한 vir-부위를 함유한다. 매개벡터는 아그로박테리아에서 복제할 수 없다. 헬퍼 플라스미드로 매개벡터는 아그로박테리아 종양인자(접합)로 전달될 수 있다. 2원체 벡터는 아그로박테리아 뿐만 아니라 E.coli내에서 복제할 수 있다. 이들은 우측 및 좌측 T-DNA 가장자리 부위에 의해 제조된 링커 또는 폴리링커 뿐만 아니라 선별가능한 마커 유전자를 함유한다. 이들은 아그로박테리아(Holsters 등, Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187)로 직접 형질전환될 수 있다. 숙주세포로 활동하는 아그로박테리아는 vir-부위를 운반하는 플라스미드를 함유하여야 한다. vir-부위는 T-DNA를 식물세포로 전달하기 위해 필요하다. 부가의 T-DNA는 존재할 수 있다. 상기 방법으로 형질전환된 아그로박테리아는 식물세포의 형질전환에 사용된다.

식물세포의 형질전환을 위한 T-DNA의 용도는 EP 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter Ⅴ; Fraley 등, Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46 및 An 등 EMBO J. 4 (1985), 277-287에 충분히 기술되어 있으며, 자세하게 조사되어 있다.

DNA를 식물세포로 전달하기 위해, 식물외식편은 아그로박테리아 뿌리유전자 또는 아그로박테리아 종양인자와 함께 적당하게 공배양된다. 감염된 식물물질(예를 들면, 잎조각, 줄기단편, 뿌리, 엽록체 또는 서스펜션-배양된 식물세포)로부터 전체 식물은 형질전환된 세포의 선별을 위해 항생제 또는 바이오지드(biozid)를 함유할 수 있는 적당한 배지에서 재생될 수 있다. 상기 방법으로 수득된 식물은 도입된 DNA의 존재여부에 대해 조사된다. 생분해적 방법을 사용하거나 엽록체를 형질전환시킴으로써 외부 DNA를 도입하기 위한 다른 가능성은 당업자에게 공지되어 있다(예를 들면, Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H. J. Rehm, G. Reed, A. Puhler, P. Stadler, editors), Vol.2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge).

반면에, 아그로박테리아 종양인자로 하는 Ti-플라스미드 벡터 시스템을 통한 쌍자엽 식물의 형질전환은 잘 실시되며 최근의 연구는 또한 단자엽 식물이 아그로박테리아에 근거한 벡터로 형질전환하는데 적당할 수 있다는 것을 나타낸다(Chan 등, Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hiei 등, Plant J. 6 (1994). 271-282).

단자엽 식물의 형질전환용 선택적인 시스템에는 생분해성 접근, 엽록체 형질전환, 부분적 투과형 세포의 전기영동, 유리섬유로 하는 DNA 도입이 있다.

옥수수의 형질전환을 특히 다룬 관련 문헌에는 여러 참고문헌이 있다(예를 들어 WO95/06128, EP 0 513 849; EP 0 465 875 참조). EP 292 435에는 임성식물이 비점액질의 푸슬한 과립성 옥수수 유합조직으로부터 개시하여 수득될 수 있는 방법이 기술되어 있다. 상기 문헌에서는 임성식물을 재생하기 위해서 엽록체를 분열시키는 배양하여 식물로 재생할 수 있는 유합조직-서스펜션 배양으로부터 시작할 필요가 있다는 것이 (Shillito)등(Bio/Technology 7 (1989), 581)에 의해 관찰되었다. 7 내지 8개월의 실험관내 배양기간후, 쉴리토 등은 형태학 및 생식면에서 비정상을 나타내는 관찰가능한 후손을 갖는 식물을 수득한다.

Prioli 및 Sondahl(Bio/Technology 7 (1989), 589)은 생식시키는 방법 및 Cateto 옥수수 자식 계통 Cat 100-1의 옥수수 엽록체로부터 임성 식물을 얻는 방법을 기술하고 있다. 상기 관찰자들은 엽록체의 임성식물로의 재생이 유전자타입, 주개세포의 생리학적 상태 및 배양조건과 같은 다수의 여러요인에 의존한다고 가정한다.

도입된 DNA가 한 번 식물세포의 게놈내에 삽입되면, 보통 안정되게 유지하며, 또한 원래 형질전환된 세포의 후손내에 남는다. 보통 바이오지드 또는 식물세포로 형질전환되는 카나마이신, G 418, 블레오마이신, 히그로마이신 또는 포스피노트리신 등과 같은 항생제에 대해 저항성을 제공하는 분별가능한 마커를 함유한다. 그러므로 각각 선별되는 마커는 도입된 DNA가 없는 세포에 대해 형질전환된 세포를 선별하도록 해야한다.

형질전환된 세포는 식물내에서 보통의 방법으로 성장한다(또한 McCormick 등, Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84 참조). 수득된 식물은 보통의 방법으로 배양될 수 있으며, 같은 형질전환된 유전적 유산 또는 다른 유전적 유산을 갖는 식물과 교잡할 수 있다. 수득된 잡종 개체는 상응하는 표현형 성질을 가진다.

두 개이상의 세대는 표현형 특징이 안정하게 유지되는 지의 여부 및 전달되는지의 여부를 확실하기 하기 위해 성장해야 한다. 그러므로 종자는 상응하는 표현형 또는 다른 특징이 남는지를 확인하기 위해 수확되어야한다.

하기의 실시예는 본 발명을 설명할 것이다.

사용된 약어

bp 염기쌍

GBSS 과립 결합 전분 신타아제

IPTG 이소프로필 β-D-티오갈락토 피라노시드

SS 전분 신타아제

SSS 용해성 전분 신타아제

실시예에서 사용된 배지 및 용액:

20 × SSC: 175.3g NaCl

88.2g 시트르산 나트륨

ddH₂O로 1000㎖까지

10N NaOH로 ph 7.0

YT 8g 박토-효모 추출물

5g 박토-트립톤

5g NaCl

ddH₂O로 1000㎖까지

엽록체 분리 배지(100㎖)

셀룰라아제 오노즈카 R S (메이지 세이카(Meiji Seika), 일본) 800㎎

펙토리아제 Y 23 40㎎

KNO₃200㎎

KH₂PO₄136㎎

K₂HPO₄47㎎

CaCl₂2H₂O 147㎎

MgSO₄7H₂O 250㎎

소 혈청 알부민 (BSA) 20㎎

글루코스 4000㎎

프룩토스 4000㎎

수크로스 1000㎎

pH 5.8

삼투물 농도 660mosm.

엽록체 세척용액 1: 엽록체 분리 용액과 유사, 그러나 셀룰라아제, 펙토리아제 및 BSA는 없다.

형질전환 버퍼:

a) 글루코스 0.5M

MES 0.1%

MgCl₂6H₂O 25mM

pH 5.8

600mosm.으로 조정

b) PEG 6000-용액

글루코스 0.5M

MgCl₂6H₂O 100mM

Hepes 20mM

pH 6.5

용액(40% w/v PEG)을 사용하기 전에 바로 b)에 기술된 버퍼에 PEG 6000을 첨가한다. 상기 용액을 0.45㎛ 멸균 필터로 여과한다.

W5 용액

CaCl₂125mM

NaCl 150mM

KCl 5mM

글루코스 50mM

엽록체 배양배지(㎎/ℓ)

KNO₃3000

(NH₄)₂SO₄500

MgSO₄7H₂O 350

KH₂PO₄400

CaCl₂2H₂O 300

뮤라쉬게-스쿠그(Murashige-Skoog) 배지내 Fe-EDTA 및 추적 요소(Physiol. Plant, 15 (1962), 473)

m-이노사이트 100

티아민 HCl 1.0

니코틴산 아미드 0.5

피리독신 HCl 0.5

글리신 2.0

글루코론산 750

갈락트론산 750

갈락토스 500

말토스 500

글루코스 36.000

프룩토스 36.000

수크로스 30.000

아스파라긴 500

글루타민 100

프롤린 300

카제인히드롤리세이트 500

2,4 디클로로페녹시 아세트산(2,4-D) 0.5

pH 5.8

삼투물 농도 600mosm.

실시예에서는 하기의 방법이 사용되었다:

1. 클로닝

E.coli에서 클로닝하기 위해 벡터 pBluescript Ⅱ SK(Stratagene)을 사용하였다.

2. 박테리아 균주

Bluescript 벡터 및 pUSP 구조물용 E.coli 균주 DH5α(미국 게이더스버그 베데스다 연구실험실)를 사용하였다. 생체내 절단용 E.coli 균주 XL1-Blue를 사용하였다.

3. 옥수수의 형질전환

(a)세포계통 DSM 6009의 엽록체 제조

엽록체 분리

엽록체 서스펜션 배양시 배지를 마지막으로 교환한후 2-4일, 바람직하게 3일후에 액체 배지를 빼내고, 남은 세포는 50㎖ 엽록체 세척용액 1로 세척하고, 한 번더 남김없이 물기를 빼냈다. 10㎖ 엽록체 분리배지를 수득된 세포덩어리 2g에 첨가하였다. 재현탁된 세포와 세포 집합물을 천천히 진탕(shaking)(30 내지 40rpm)하면서 어두운 곳에서 4 내지 6시간동안 27±2℃에서 배양하였다.

엽록체 정제

㎖당 적어도 1백만개의 엽록체가 방출(현미경 조사)되자마자, 현탁액을 메쉬 크기가 200 또는 45㎛인 나일론 체 또는 스테인레스 스틸을 통해 체쳤다. 100㎛ 및 60㎛ 체의 결합으로 세포 집합물을 분리하였다. 엽록체-함유 여과물을 현미경적으로 조사하였다. 보통 98-99% 엽록체를 함유한다. 나머지는 소화되지 않은 단일세포였다. 상기 정도의 정제를 한 엽록체 제조물은 부가의 구배 원심분리하지 않고 형질전환실험에 사용되었다. 엽록체는 원심분리(스윙-아웃 로터에서 100UpM(100×g, 3분))로 침전되었다. 상층액은 부어내고, 엽록체를 세척용액 1에서 재현탁하였다. 원심분리를 반복하고, 엽록체를 계속해서 형질전환 버퍼에서 재현탁하였다.

(b) 엽록체 형질전환

형질전환 버퍼에서 재현탁된 엽록체를 0.5-1×10⁶엽록체/㎖의 적정기로 50㎖ 폴리알로머 튜브로 10㎖ 일부를 채운다. 형질전환에 사용된 DNA를 Tris-EDTA(TE) 버퍼 용액에 용해시킨다. 플라스미드 DNA 20㎍을 각㎖ 엽록체 현탁액에 첨가한다. 포스피노트리신에 대한 저항성을 제공하는 플라스미드는 벡터로 사용한다(예를 들면 EP 0 513 849 참조). DNA 첨가후, 용액내에 DNA를 균질하게 분포시키기 위해 엽록체 현탁액을 조심스럽게 진탕한다. 즉시후, 5㎖ PEG 용액을 적상하여 첨가한다.

조심스럽게 튜브를 진탕함으로써 PEG 용액은 균질하게 분포된다. 후에 5㎖ PEG 용액을 더 첨가하고 균질한 혼합을 반복한다. 엽록체는 ±2℃에서 20분동안 PEG 용액내에 남는다. 후에 엽록체를 3분동안 원심분리(100g; 1000UpM)함으로써 침전시킨다. 상층액을 따라낸다. 엽록체는 20㎖ W5 용액내에서 진탕함으로써 세척하고, 다시 원심분리한다. 그리고나서 이들을 20㎖ 엽록체 배양배지내에서 현탁하고, 원심분리하고, 다시 배양배지내에서 현탁한다. 적정기는 6-8×10⁵엽록체로 조정하고, 엽록체는 페트리 접시(○ 60㎜, 높이 15㎜)내 3㎖ 일부에서 배양한다. 페트리 접시는 파라필름으로 밀봉하고, 25±2℃의 어두운 곳에서 저장한다.

(c) 엽록체 배양

엽록체 분리 및 형질전환후 첫 2-3주동안 엽록체는 신선한 배지의 첨가없이 배양한다. 엽록체로부터 세포가 재생되자마자 20 내지 50개의 세포를 갖는 세포 집합물로 발전시키고, 삼투압제로서 수크로오스(90g/ℓ)를 함유하는 1㎖ 신선한 엽록체 배양배지를 첨가한다.

(d) 형질전환된 옥수수 세포와 식물 재생의 선별

신선한 배지를 첨가한지 3-10일후 엽록체로부터 발전한 세포 집합물을 100㎎/ℓ L-포스피노트리신을 갖는 아가 배지상에 덮는다. 엽록체 배양배지의 비타민, 90g/ℓ 수크로오스 및 1.0㎎/ℓ 2,4D를 갖는 N6-배지는 MS 배지의 마크로-영양염 및 마이크로-영양염을 갖는 배지와 같은 유사한 배지로서 적당하다(Murashige and Skoog (1962), 상기 참조).

안정적으로 형질전환된 엽록체로부터 발전한 유합조직은 선별배지상에서 더 성장한다. 3 내지 5주, 바람직하게 4주 후 유전자도입 유합조직을 100㎎/ℓ L-포스피노트리신을 함유하나 옥신은 더 이상 함유하지 않는 신선한 선별배지에 옮긴다. 3 내지 5주 내에 포스피노트리신-아세틸-트랜스퍼라아제 유전자를 그들의 게놈으로 삽입시킨 유전자도입 옥수수 유합조직의 약 50%가 L-포스피노트리신의 존재하에서 상기 배지상에서 식물로 분화하기 시작한다.

(e) 유전자도입 재생 식물의 성장

배유 형질전환된 옥수수 조직은 5×10^-4M L-포스피노트리신의 존재하에서 호르몬이 없는 N6-배지(Chu C.C. 등, Sci. Sin. 16 (1975), 659)상에서 배양한다. 상기 배지에서 충분히 강한 방법으로 포스피노트리신-아세틸-트랜스퍼라아제 유전자(PAT 유전자)를 발현하는 옥수수 배유는 식물로 발전한다. 비형질전환된 배유 또는 매우 약한 PAT 활성만 가지는 상기는 점점 작아진다. 실험관내 식물의 입이 4 내지 6㎜의 길이에 달하자마자 그들을 흙으로 옮긴다. 뿌리의 아가 잔여물을 씻어낸후 식물을 진흙, 모래, 질석 및 화분흙 3:1:1:1 비율의 혼합물로 심고, 심고 첫 3일동안 상대대기습도 90-100%에서 흙배양으로 적응시켰다. 23±1/17±1℃의 낮/밤 온도에서 식물 높이에서 약 25000lux의 14시간 광주기를 갖는 토지 챔버에서 성장을 실시한다. 적응된 식물은 65±5% 대기습도에서 배양한다.

4. DNA 단편의 방사성 표지

DNA 단편의 방사성 표지는 제조자의 소개에 따른 보에링거(Boeringer(독일))에 의한 DNA-무작위 프라이머 표지 킷으로 실시하였다.

실시예 1

Zea 메이스(mays)로부터 전분 신타아제의 아이소타입으로 코딩되는 cDNA의 동종, 분리 및 특징화

옥수수로부터 전분 신타아제로 코딩되는 cDNA를 동종하기 위해, 적당한 E.coli 돌연변이체내 기능적 발현계획을 실행한다. 저장 카르보하이드레이트로서, E.coli는 특이 영양배지(1% 글루코스 갖는 완전배지)상에서 아밀로펙틴의 구조와 유사한 다당류를 합성하나, 더 높은 분지정도(4-5%에 대해 7-10% 분지점) 및 보통 더 높은 분자량을 나타낸다. 더 높은 분지정도는 또한 다른 요오드 염색을 야기한다. 요오드는 글리코겐에 갈색염색, 아밀로펙틴에 보라색 염색 및 아밀로스에 청색 염색을 제공한다.

E.coli에 있어서 세 개의 유전자, 즉 글리코겐 합성효소로 코딩되는 glgA, glgB 및 glgC, 분지효소 및 ADP 글루코스 피로포스포릴라아제가 글리코겐 합성에 필수적으로 참여한다. 상기 시스템은 식물내 전분 생합성 시스템과 유사하다. 식물 전분 신타아제가 야생형 E.coli 세포내에서 발현된다면, 분지효소가 글리코겐 합성효소에 의해 생성된 글루칸으로의 경로와 같은 경로로 전분 신타아제에 의해 생성된 글루칸내 분지점을 도입시키기 때문에, 요오드 염색의 도움으로 글리코겐의 특성에 효소가 미치는 영향을 측정할 수 없거나 어렵게 된다.

그러므로 E.coli 균주는 요오드 염색의 방법으로 전분 신타아제의 기능적 발현후 간단한 분별을 위해 제조한다. 상기 목적을 위해, 모든 glg 유전자가 결실된 돌연변이체 HfrG6MD2(Schwartz, J. Bacteriol. 92 (1966), 1083-1089)를 플라스미드 pACAC로 형질전환시켰다. 상기 플라스미드는 lac Z 프로모터의 조절하에서 E.coli로부터 ADP 글루코스 피로포스포릴라아제(AGPase)로 코딩되는 DNA 단편을 함유한다. 단편은 약 1.7kb의 크기를 갖는 DraⅠ/HaeⅡ 단편으로서 pEcA-15 벡터(예를 들면 Muller-Rober (1992), 논문, FU 베를린 참조)로부터 분리되고, 끈적이는 말단에서 채운후, HindⅢ로 선형화된 pACAC184 벡터로 클론되었다. 상기 플라스미드는 상기 효소의 돌연변이를 일으키는 글리코겐의 상대량을 축적시키는 E.coli 균주 LCB 618로부터 돌연변이되고, 탈조절된 ADP 글루코스 피로포스포릴라아제의 발현을 매개한다(Preiss and Romeo in advances in Microbiol Physiology, Academic Press, London, Vol. 30, 183-238). 이로서 충분한 양의 ADP 글루코스의 제공, 전분 신타아제의 기질을 확인할 수 있으며, 전분 신타아제를 동시에 기능적으로 발현할 때 요오드에 의해 청색으로 염색될 수 있는 E.coli HfrG6MD2내 선형 α-1,4-글루칸의 합성을 확인할 수 있는 것으로 가정된다. 그리고 벡터 pACYC184의 유도체로서 플라스미드 pACAC는 pBluescript SK(-)와 같은 플라스미드와 호환가능하다.

상기 균주는 pBluescript SK(-) 벡터내에 함유된 cDNA 라이브러리로 형질전환되며, Zea 메이스의 잎, 계통 B73으로부터의 RNA으로부터 제조된다. 이는 Uni-ZAPTMXR 벡터(Stratagene GmbH, 하이델베르그)내에 함유된 Zea 메이스의 잎의 RNA, 계통 B73으로부터의 cDNA 라이브러리의 약 10⁶파지를 생체내 절단으로 파그미드로 처음 전환시킴으로써 제조하였다. E.coli XL1-Blue 세포는 상기 파그미드로 감염되며, 3×10⁵형질전환체를 고체 선별성(암피실린-함유) 영양배지상에 놓았다. 성장후, 상기 세포를 세척하고, 플라스미드 DNA를 그로부터 제조하였다. 플라스미드 DNA의 박테리아 세포로의 이동은 하나한(Hanahan)(J. Mol. Biol. 166 (1983), 557-580)의 방법에 따라 실시하였다. 약 4×10⁵의 형질전환된 E.coli 세포는 하기의 조성을 갖는 아가 배양배지상에 폈다:

YT 배지:

1.5% 박토 아가

1% 글루코스

10㎎/ℓ 클로람페니콜

50㎎/ℓ 암피실린

1mM IPTG

2mM 디아미노피멜린산

37℃에서 밤새 배양한후, 상기 세포들을 요오드 증기로 처리하였다. 청색으로 염색된 콜로니들을 얻었다. 상기 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 분리해냈고, 반복된 형질전환을 위하여 사용하였다. 수득된 형질전환체는 레플리카 플레이트상에 폈다. 레플리카 플레이트 중 하나를 다시 염색하였다. 청색으로 염색된 클론은 다량의 플라스미드 DNA의 제조를 위해 성장시켰다.

cDNA 단편의 크기를 조사한후, 클론 pSSZm을 더 분석하였다.

실시예 2

플라스미드 pSSZm의 cDNA 삽입 서열분석

실시예 1에 따라 수득된 E.coli로부터 플라스미드 pSSZm를 분리하고, 그의 cDNA 삽입을 디데옥시뉴클레오티드 방법을 사용한 표준경로로 측정하였다(Sanger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467). 삽입하여 2651bp의 길이를 가지고, 부분적 cDNA를 구성한다. 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1의 서열하에서 나타나 있다. 상응하는 아미노산 서열은 서열번호 2의 서열하에 나타나 있다.

서열분석 및 공지된 서열과의 서열비교는 서열번호 1의 서열하에 나타낸 서열은 새로우며, 여러 유기체로부터 전분 신타아제에 상동성을 나타내는 부분적 코딩부위로 구성된다는 것을 나타낸다. 그리고 코딩된 단백질은 지금까지 기술된 분류중에서 확실하게 분리되지 않은 전분 신타아제의 아이소타입을 구성한다. 상기 적용의 골격내에서 상기 cDNA 삽입 또는 서열 잡종화로 코딩된 단백질은 SSZm으로 나타낸다. 상기 부분적 cDNA 서열로 완전한 코딩부위를 함유하는 완전한 길이의 클론을 분리하는 것은 그의 서열을 측정하는 수고로움없이 분자생물학적 분야에 기술을 가진자들에게 있어서 가능하다. 상기 목적을 위해, 예를 들면 Zea mays 계통 B73(stratagene GmbH, 하이델베르그)으로부터의 잎-특이 cDNA 발현 라이브러리는 플라스미드 pSSZm(200bp)의 cDNA 삽입의 5'-단편으로 잡종화하여 완전한 길이의 클론으로 선별된다. 소실된 5'-말단 서열을 수득하는 다른 가능한 방법은 5'-레이스 방법(Stratagene cf. 제조사)을 사용하는 것이다.

서열 목록

(1)일반적 정보

(ⅰ)출원인 :

(A)성명 : 젠스 코스만

(B)주소 : 골메르 피히텐 9

(C)도시 : 골름

(E)국가 : 독일

(F)우편번호 : 14476

(ⅱ)발명의 명칭 : 전분합성에 사용하는 효소로 코딩된 식물내 핵산분자

(ⅲ)서열수 : 2

(ⅳ)컴퓨터 해독 형태 :

(A)매개형태 : 플로피 디스크

(B)컴퓨터 : IBM PC 호환형

(C)운용체계 : PC-DOS/MS-DOS

(D)소프트웨어 : Patent In Release #1.0, Version #1.30(EPA)

(2)서열번호 1의 정보

(ⅰ)서열 특성 :

(A)길이 : 2652 염기쌍

(B)형 : 뉴클레오티드

(C)쇄의 수 : 1 본쇄

(D)형태 : 직쇄상

(ⅱ)서열의 종류 : cDNA 내지 mRNA

(ⅲ)추정서열 : 없음

(ⅳ)안티센스 : 없음

(ⅵ)기원 :

(A)생물명 : Zea mays

(B)주명 : B73

(C)조직의 종류 : 잎조직

(ⅶ)직접적인 기원 :

(A)라이브러리명 : pBluescriptSK- 내 cDNA 라이브러리

(B)클론명 : pSSZm

(ⅸ)서열의 특징 :

(A)이름/키이 : CDS

(B)위치 : 9..2213

(ⅹⅰ)서열 : 서열번호 1:

(2)서열번호 2의 정보

(ⅰ)서열 특성 :

(A)길이 : 735 아미노산

(B)형 : 아미노산

(D)형태 : 직쇄상

(ⅱ)서열의 종류 : 단백질

(ⅹⅰ)서열 : 서열번호 2:

Claims

(a)서열번호 2로 나타낸 아미노산 서열로 구성된 단백질로 코딩되는 핵산분자;

(b)서열번호 1로 나타내는 뉴클레오티드 서열 또는 상응하는 리보뉴클레오티드 서열로 구성된 핵산분자; 및

(c)(a) 또는 (b)로 나타낸 핵산분자를 잡종화하고, 전분 신타아제 활성을 갖는 단백질로 코딩되는 핵산분자로 구성된 그룹으로부터 선택된 전분 신타아제의 생물학적 활성 및 상기 핵산분자의 각 상보적 가닥을 갖는 단백질로 코딩되는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
제 1 항에 있어서,

상기 핵산분자는 DNA 분자인 것을 특징으로 하는 핵산분자.
제 2 항에 있어서,

상기 DNA 분자는 cDNA 분자인 것을 특징으로 하는 핵산분자.
제 1 항에 있어서,

상기 핵산분자는 RNA 분자인 것을 특징으로 하는 핵산분자.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 핵산분자와 특이적으로 잡종화되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 DNA 분자로 구성된 것을 특징으로 하는 벡터.
제 6 항에 있어서,

상기 DNA 분자는 원핵세포 또는 진핵세포내에서 해독가능한 RNA의 전사 및 합성을 확실하게 하는 조절요소로 센스-배향으로 결합되는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 핵산분자 또는 제 6 항 또는 제 7 항에 따른 벡터로 형질전환되고, 유전적으로 변형되는 것을 특징으로 하는 숙주세포.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 핵산분자에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 단백질.
단백질 합성에 허용되는 조건하에서 제 8 항의 숙주세포가 배양되고, 배양된 세포 및/또는 배양배지로부터 단백질이 분리되는 것을 특징으로 하는 제 9 항의 단백질 제조방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 핵산분자 또는 제 6 항 또는 제 7 항의 벡터로 형질전환되고, 또는 상기 세포로부터 유도되며, 전분 신타아제의 생물학적 활성을 갖는 단백질로 코딩되는 핵산분자는 식물세포내에서 해독가능한 mRNA의 전사를 위해 조절요소의 조절에 사용되는 것을 특징으로 하는 유전자도입 식물세포.
제 11 항의 식물세포로 구성된 것을 특징으로 하는 식물.
제 12 항에 있어서,

상기 식물은 유용한 식물인 것을 특징으로 하는 식물.
제 13 항에 있어서,

상기 식물은 전분-저장 식물인 것을 특징으로 하는 식물.
제 14 항에 있어서,

상기 식물은 옥수수 식물인 것을 특징으로 하는 식물.
제 11 항의 식물세포를 함유하는 것을 특징으로 하는 제 12 항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 식물의 번식물.
제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 식물로부터 수득가능한 것을 특징으로 하는 전분.
(a)본 발명의 단백질로 코딩되고, 세포내에서 내생으로 발생하는 유전자의 전사물로의 안티센스 RNA로 코딩되고; 및/또는

(b)본 발명의 단백질로 코딩되고, 세포내에서 내생으로 발생하는 유전자의 전사물을 특이적으로 제거하는 리보자임으로 코딩되고; 및/또는

(c)세포내에서 공억제 효과로 인해 본 발명의 단백질의 합성을 저해하는 RNA인 이종성 재조합 DNA 분자의 발현으로 인해 상기 식물세포내에서 제 9 항의 단백질 활성도가 감소되는 것을 특징으로 하는 유전자도입 식물세포.
제 18 항에 있어서,

상기 세포내 활성도 감소는 제 1 항의 DNA 분자의 전사물로의 안티센스-RNA의 발현에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는 식물세포.
제 18 항 또는 제 19 항의 식물세포를 함유하는 것을 특징으로 하는 식물.
제 20 항에 있어서,

상기 식물은 유용한 식물인 것을 특징으로 하는 식물.
제 21 항에 있어서,

상기 식물은 전분-저장 식물인 것을 특징으로 하는 식물.
제 22 항에 있어서,

상기 식물은 옥수수 식물인 것을 특징으로 하는 식물.
제 18 항 또는 제 19 항의 세포를 함유하는 것을 특징으로 하는 제 20 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 따른 식물의 번식물.
제 20 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 따른 식물로부터 수득가능한 것을 특징으로 하는 전분.