ES2242961T3 - Moleculas de adn que codifican enzimas, que participan en la sintesis de almidon, vectores, bacterias, celulas de plantas transgenicas, y plantas que contienen estas moleculas. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION TRATA DE MOLECULAS DE DNA, QUE CODIFICAN ENZIMAS, QUE TOMAN PARTE EN LA SINTESIS DE ALMIDON EN LAS PLANTAS. SE TRATA EN ESTAS ENZIMAS DE DOS ISOFORMAS DIFERENTES DE LA SINTETASA SOLUBLE DEL ALMIDON ASI COMO DE UNA SINTETASA UNIDA AL GRANO DE ALMIDON. ADEMAS TRATA ESTA INVENCION DE VECTORES, BACTERIAS, ASI COMO DE CELULAS VEGETALES TRANSFORMADAS CON LA MOLECULA DESCRITA DE DNA Y PLANTAS QUE SE OBTIENEN DE ESTAS. ADEMAS TRATA LA INVENCION DE ALMIDON QUE SE PUEDE AISLAR DE PLANTAS CON LA ACTIVIDAD AUMENTADA O DISMINUIDA DE LAS PROTEINAS DESCRITAS.

Description

Moléculas de ADN que codifican enzimas, que participan en la síntesis de almidón, vectores, bacterias, células de plantas transgénicas, y plantas que contienen estas moléculas.

El presente invento se refiere a moléculas de ADN, que codifican enzimas, que participan en la síntesis de almidón en plantas. En el caso de estas enzimas se trata de dos diferentes isoformas de la sintasa de almidón soluble, así como de una sintasa de almidón fijada a granos de almidón.

Además, este invento se refiere a vectores, bacterias, así como a células de plantas transformadas con las descritas moléculas de ADN, y a plantas regenerables a partir de estas células.

Por añadidura, se describen procedimientos para la producción de plantas transgénicas, que por causa de la introducción de moléculas de ADN, que codifican sintasas de almidón solubles o fijadas a granos de almidón, sintetizan un almidón modificado en cuanto a sus propiedades.

En atención a la importancia creciente, que se atribuye en los últimos tiempos a las sustancias constituyentes de plantas como fuentes renovables de materias primas, una de las misiones de la investigación biotecnológica es una adaptación de estas materias primas vegetales a los requisitos de la industria elaboradora. Con el fin de hacer posible una utilización de materias primas renovables en el mayor número posible de sectores de empleo, es necesario, además de esto, conseguir una gran diversidad de sustancias.

Junto a los aceites, las grasas y las proteínas, los polisacáridos constituyen las materias primas renovables esenciales procedentes de plantas. Una posición central primordial entre los polisacáridos la ocupa, junto a la celulosa, el almidón, que es una las sustancias almacenadas más importantes en plantas superiores. Junto al maíz, el arroz y el trigo, la patata desempeña un importante cometido en el caso de la producción de almidón.

El polisacárido almidón es un polímero a base de eslabones fundamentales químicamente uniformes, a saber las moléculas de glucosa. Sin embargo, en este caso se trata de una mezcla muy compleja de diferentes formas moleculares, que se diferencian en lo que se refiere a su grado de polimerización y a la aparición de ramificaciones de las cadenas de glucosa. Por lo tanto, el almidón no constituye ninguna materia prima uniforme. Se establece diferencia en particular, entre el almidón de amilosa, que es un polímero esencialmente no ramificado, a base de moléculas de glucosa unidas por enlaces \alpha-1,4-glicosídicos, y el almidón de amilopectina, que por su parte constituye una mezcla compleja a base de cadenas de glucosa ramificadas de manera diversa. Las ramificaciones se establecen en este caso por la aparición de uniones por enlaces \alpha-1,6-glicosídicos adicionales. En las plantas típicas utilizadas para la producción de almidón, tales como p.ej. maíz o patata, el almidón sintetizado se compone en aproximadamente un 25% de almidón de amilosa y en aproximadamente un 75% de almidón de amilopectina.

Para hacer posible una utilización lo más amplia que sea posible de un almidón, se manifiesta como deseable poner a disposición plantas, que estén en situación de sintetizar un almidón modificado, que se adecue en particular para diferentes finalidades de utilización. Una posibilidad, de poner a disposición tales plantas, consiste - junto a las medidas de cultivación - en la modificación genética deliberada del metabolismo de almidón que presentan las plantas productoras de almidón, mediante métodos de tecnología genética. Son premisa para ello, no obstante, la identificación y la caracterización de las enzimas que participan en la síntesis y/o la modificación del almidón, así como el aislamiento de las correspondientes moléculas de ADN, que codifican estas enzimas.

Las vías de síntesis bioquímicas, que conducen a la formación de almidón son esencialmente conocidas. La síntesis de almidón en células de plantas tiene lugar en los plastidios. En tejidos activos fotosintéticamente, éstos son los cloroplastos, y en tejidos inactivos fotosintéticamente, que almacenan almidón, éstos son los amiloplastos.

Las más importantes enzimas que participan en la síntesis de almidón, son las sintasas de almidón así como las enzimas ramificadoras. En el caso de las sintasas de almidón, se han descrito ya diversas isoformas, todas las cuales catalizan una reacción de polimerización por transferencia de un resto de glucosilo desde la ADP-glucosa hasta los \alpha-1,4 -glucanos. Las enzimas ramificadoras catalizan la introducción de ramificaciones \alpha-1,6 en \alpha-1,4-glucanos lineales.

Además de esto, se discute la participación de otras actividades enzimáticas, por ejemplo, hidrolíticas o fosforolíticas, en la síntesis de almidón (Preiss en Oxford Surveys of Plant Molecular and Cell Biology, Oxford University Press, tomo 7 (1991), 59-114). En el caso de la "enzima R", la denominada enzima de desproporcionamiento, y de las fosforilasas de almidón no se puede excluir tampoco una participación en la síntesis de almidón, a pesar de que estas enzimas se llevan a vinculación hasta ahora en la mayoría de los casos con la degradación de un almidón. Las sintasas de almidón se pueden subdividir en dos clases: las sintasas de almidón fijadas a granos de almidón (del inglés "granule-bond starch synthases"; GBSS), que están fijadas predominantemente a granos de almidón, pero que también se presentan en una forma disuelta, y las sintasas de almidón solubles (del inglés "soluble starch synthases"; SSS). Para diferentes especies de plantas se han descrito dentro de estas clases, de nuevo, diferentes isoformas, que se diferencian en cuanto a su dependencia con respecto de moléculas iniciadoras (las denominadas sintasas de almidón "dependientes de cebadores" [del inglés "primer dependent"] (del tipo II) y las denominadas sintasas de almidón "independientes de cebadores" [del inglés "primer independent"] (del tipo I)).

Solamente para la isoforma GBSS I se ha conseguido hasta ahora determinar la función exacta en el caso de la síntesis de almidón. Las plantas, en las que esta actividad enzimática se ha reducido grandemente o por completo, sintetizan un almidón exento de amilosa (el denominado en inglés "waxy" = "ceroso") (Shure y colaboradores, Cell 35 (1983), 225-233; Visser y colaboradores, Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 289-296; y el documento de solicitud de patente internacional WO 92/11376), de tal manera que a esta enzima se le atribuye un cometido decisivo en el caso de la síntesis del almidón de amilosa. Este fenómeno se observa asimismo en células de la alga verde Chlamydomonas reinhardtii (Delrue y colaboradores, J. Bacteriol. 174 (1992), 3.612-3.620). En el caso de la Chlamydomonas se pudo mostrar, además de esto, que la GBSS I participa no solamente en la síntesis de la amilosa, sino que posee también una influencia sobre la síntesis de la amilopectina. En mutantes, que no tienen ninguna actividad de GBSS I, falta una determinada fracción de la amilopectina sintetizada normalmente, que tiene glucanos de cadenas más largas.

Las funciones de las otras isoformas de las sintasas de almidón fijadas a granos de almidón, en particular de la GBSS II, y de las sintasas de almidón solubles, no se han puesto en claro hasta ahora. Se supone que las sintasas de almidón solubles participan, en común con enzimas ramificadoras, en la síntesis de la amilopectina (véase p.ej. la cita de Ponstein y colaboradores, Plant Physiol. 92 (1990), 234-241), y que ellas desempeñan una función importante en la regulación del régimen de síntesis de almidón.

En el caso de la patata se identificaron las isoformas GBSS I, GbSS II, así como dos o bien tres isoformas de las sintasas de almidón solubles que hasta ahora no se habían designado más detalladamente (Ponstein y colaboradores, Plant Physiol. 92 (1990), 234-241; Smith y colaboradores, Planta 182 (1990), 599-604; Hawker y colaboradores, Phytochemistry 11 (1972), 1.287-1.293). Para el guisante se detectó asimismo una GBSS II (Dry y colaboradores, The Plant Journal 2,2 (1992), 193-202).

Ya se han descrito un ADNc que codifica una GBSS I procedente de patata, así como un ADN genómico (Visser y colaboradores, Plant Sci. 64 (1989), 185-192; van der Leij y colaboradores, Mol. Gen. Genet. 228 (1991), 240-248). Sin embargo, no se presentaban todavía hasta ahora secuencias de ácidos nucleicos que codifiquen otras sintasas de almidón fijadas a granos de almidón o una de las isoformas solubles de sintasas de almidón, procedentes de la patata.

Aparte de en el caso de la patata, se identificaron sintasas de almidón solubles también en una serie de otras especies de plantas. Se han aislado, por ejemplo hasta la homogeneidad, sintasas de almidón solubles, procedentes de guisante (Denyer y Smith, Planta 186 (1992), 609 - 617) y de maíz (documento WO 94/09144). En el caso del guisante, se puso de manifiesto que la isoforma, identificada como SSS II, de la sintasa de almidón soluble es idéntica a la sintasa de almidón fijada a granos de almidón GBSS II (Denyer y colaboradores, Plant J. 4 (1993), 191-198. Para algunas otras especies de plantas se describió con ayuda de métodos cromatográficos la presencia de varias isoformas de SSS, por ejemplo, en el caso de cebada (Tyynelä y Schulman, Physiologia Plantarum 89 (1993) 835-841; Kreis, Planta 148 (1980), 412-416), en el caso de maíz (Pollock y Preiss, Arch. Biochem. Biophys. 204 (1980), 578-588) y en el caso de trigo (Rijven, Plant Physiol. 81 (1986), 448-453). Sin embargo, hasta ahora no se describieron secuencias de ADN, que codifiquen estas proteínas,.

Una secuencia de ADNc, que codifica una sintasa de almidón soluble, se describió hasta ahora solamente para arroz (Baba y colaboradores, Plant Physiol. 103 (1993), 565-573). Para poner a disposición unas posibilidades de modificar cualesquiera plantas que almacenen almidón, de tal manera que sinteticen un almidón modificado, es necesario identificar en cada caso secuencias de ADN, que codifiquen las diferentes isoformas de las sintasas de almidón fijadas a granos de almidón o respectivamente solubles.

El presente invento está basado, por consiguiente, en la misión de poner a disposición moléculas de ADN, en particular procedentes de patata, que codifiquen enzimas que participen en la biosíntesis de almidón y con cuya ayuda sea posible producir plantas modificadas por tecnología genética, que presenten una actividad aumentada o disminuida de estas enzimas, con lo que se llegue a una modificación de las propiedades químicas y/o físicas del almidón sintetizado en estas plantas.

El problema planteado por esta misión se resuelve mediante la puesta a disposición de las formas de realización reseñadas en las reivindicaciones de esta patente.

El invento se refiere, por consiguiente, a moléculas de ADN, que codifican sintasas de almidón, en particular a las moléculas de ADN, que codifican sintasas de almidón solubles.

El invento se refiere, por consiguiente, a moléculas de ADN, que codifican proteínas con la actividad biológica de una sintasa de almidón soluble de la isoforma A (SSSA). Tales proteínas se pueden caracterizar, por ejemplo, por el hecho de son reconocidas por un anticuerpo, que está dirigido contra el péptido que tiene la secuencia de aminoácidos

NH_{2}-GTGGLRDTVENC-COOH (Seq ID No. 13).

Las propiedades enzimáticas de las proteínas de SSSA se han descrito en los Ejemplos. Un ejemplo de una molécula de ADN, que codifica una proteína de este tipo, es una molécula de ADN con la región codificadora representada en Seq ID No. 11. Esta molécula de ADN se puede utilizar con el fin de aislar moléculas de ADN, que codifican proteínas de SSSA, a partir de otros organismos, en particular a partir de plantas.

Por consiguiente, el presente invento se refiere también a moléculas de ADN, que codifican proteínas con la actividad biológica de una sintasa de almidón soluble de la isoforma A (SSSA), o un fragmento biológicamente activo de una de tales proteínas, codificando tales moléculas de manera preferida proteínas con la secuencia de aminoácidos indicada bajo Seq ID No. 12. En particular, el invento se refiere a moléculas de ADN con la secuencia de nucleótidos indicada bajo Seq ID No. 11, de manera preferida a moléculas, que abarcan la región codificadora indicada en Seq ID No. 11.

Además, el presente invento se refiere a moléculas de ADN, que codifican SSSA y que se hibridan en condiciones rigurosas con una de las moléculas de ADN más arriba descritas.

La proteína de SSSA tiene en este caso, de manera preferida en una electroforesis en gel de SDS, un peso molecular aparente de aproximadamente 120 hasta 140 kD, en particular de aproximadamente 135 kD.

El concepto de "hibridación" significa en el marco de este invento una hibridación en condiciones rigurosas, tal como se describen, por ejemplo, en la obra de Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning, A Laboratory Manual [Clonación molecular, un manual de laboratorio], 2ª edición (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Las moléculas de ADN, que se hibridan con las moléculas de ADN de acuerdo con el invento, pueden proceder en principio de cualquier organismo arbitrario (es decir, de procariotas o eucariotas, en particular de bacterias, hongos, algas, plantas u organismos animales), que posea tales moléculas de ADN. Éstas proceden, preferiblemente, de plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas, en particular de plantas útiles, y de modo especialmente preferido de plantas que almacenan almidón.

Las moléculas de ADN, que se hibridan con las moléculas de ADN de acuerdo con el invento, se pueden aislar p.ej. a partir de bibliotecas genómicas o de ADNc (ácidos desoxirribonucleicos complementarios) de diversos organismos.

La identificación y el aislamiento de tales moléculas de ADN a partir de plantas o de otros organismos, se pueden efectuar, en este caso, mediando utilización de las moléculas de ADN de acuerdo con el invento, o de partes de estas moléculas de ADN, o bien de los complementos inversos de estas moléculas, p.ej. mediante hibridación de acuerdo con procedimientos clásicos (véase p.ej. la obra de Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Como sonda de hibridación se pueden utilizar p.ej. moléculas de ADN, que tienen exactamente o en lo esencial la secuencia de nucleótidos indicada bajo Seq ID No.11, o partes de esta secuencia. En el caso de los fragmentos de ADN utilizados como sonda de hibridación se puede tratar también de fragmentos de ADN sintéticos, que se habían producido con ayuda de las técnicas habituales de síntesis de ADN, y cuya secuencia coincide en lo esencial con la de una molécula de ADN de acuerdo con el invento. Cuando se han identificado y aislado genes, que se hibridan con las secuencias de ADN de acuerdo con el invento, se necesitan una determinación de la secuencia y un análisis de las propiedades de las proteínas codificadas por esta secuencia.

Las moléculas que se hibridan con las moléculas de ADN de acuerdo con el invento abarcan también fragmentos, derivados y variantes alélicas de las moléculas de ADN anteriormente descritas, que codifican una de las proteínas anteriormente descritas. Por el concepto de fragmentos se entienden, en este caso, partes de las moléculas de ADN, que son lo suficientemente largas como para codificar una de las proteínas descritas. La expresión "derivado" significa, en este contexto, que las secuencias de estas moléculas se diferencian en una o varias posiciones con respecto de las secuencias de las moléculas de ADN anteriormente descritas, y que presentan un alto grado de homología con estas secuencias. El concepto de "homología" significa en este caso una identidad entre secuencias de por lo menos 60%, preferiblemente de más que 80% y de modo especialmente preferido de más que 90%. Las desviaciones con respecto a las moléculas de ADN anteriormente descritas pueden haber resultado en este caso, por deleción (supresión), sustitución, inserción o recombinación. El concepto de "homología" significa, además, que existe una equivalencia funcional y/o estructural entre las correspondientes moléculas de ADN o entre las proteínas codificadas por ellas. En el caso de las moléculas de ADN, que son homólogas con respecto a las moléculas anteriormente descritas y que constituyen derivados de estas moléculas, se trata por regla general de variaciones de estas moléculas de ADN, que constituyen unas modificaciones, que ejercen la misma función biológica. En este caso, se puede tratar tanto de variaciones que aparecen de una manera natural, por ejemplo de secuencias procedentes de otros organismos, o de mutaciones, pudiendo estas mutaciones haber aparecido de una manera natural o haber sido introducidas mediante una mutagénesis deliberada. Además de esto, en el caso de las variaciones se puede tratar de secuencias producidas por síntesis. En el caso de las variantes alélicas, se puede tratar tanto de variantes que se presentan en la naturaleza, como también de variantes producidas por síntesis o producidas mediante técnicas de ADN recombinantes.

Las proteínas codificadas por las diferentes variantes de las moléculas de ADN de acuerdo con el invento presentan determinadas características comunes. A éstas pertenecen p.ej. la actividad enzimática, el peso molecular, la reactividad inmunológica, la conformación, etc., así como propiedades físicas tales como p.ej. el comportamiento de movimiento en las electroforesis en gel, el comportamiento cromatográfico, los coeficientes de sedimentación, la solubilidad, las propiedades espectroscópicas, la estabilidad; el valor óptimo del pH, el valor óptimo de la temperatura, etc.

Características importantes de una sintasa de almidón son: i) su localización en el estroma de los plastidios de células de plantas; ii) su capacidad para la síntesis de poliglucanos unidos por enlaces en \alpha-1,4 mediando utilización de ADP-glucosa como substrato. Esta actividad puede ser determinada tal como se describió en la cita de Denyer y Smith (Planta 186 (1992), 606-617) y en los Ejemplos.

Las moléculas de ADN de acuerdo con el invento pueden proceder en principio de cualquier organismo, que exprese las proteínas descritas, preferiblemente de plantas, en particular de plantas que sintetizan almidón o respectivamente almacenan almidón. Éstas pueden ser plantas tanto monocotiledóneas como también dicotiledóneas. En este caso, se prefieren en particular p.ej. especies de cereales (tales como cebada, centeno, avena, trigo, etc.), maíz, arroz, guisante, mandioca, patata, etc.

Junto a las moléculas de ADN que codifican una SSSA se describe también el aislamiento de moléculas de ADN procedentes de patata, que codifican una GBSS II (SEQ ID NO: 7 y 8) o bien una sintasa de almidón soluble de la isoforma B (SSSB: SEQ ID NO: 9 y 10).

Además el invento se refiere a vectores, en particular plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos y otros vectores habituales en la tecnología genética, que contienen las moléculas de ADN de acuerdo con el invento, que se han descrito anteriormente.

En una forma de realización preferida, las moléculas de ADN, contenidas en los vectores, están unidas con elementos de ADN, que garantizan la transcripción y la síntesis de un ARN traducible en células procarióticas o eucarióticas.

La expresión de las moléculas de ADN de acuerdo con el invento en células procarióticas, por ejemplo en Escherichia coli, es interesante, por cuanto que de esta manera se hace posible una caracterización más exacta de las actividades enzimáticas de estas enzimas, que codifican estas moléculas. En particular, es posible caracterizar el producto que se sintetiza por las correspondientes enzimas en ausencia de otras enzimas, que participan en la síntesis de almidón en la célula de planta. Esto permite sacar conclusiones acerca de la función que ejerce la correspondiente proteína en la síntesis de almidón en la célula de planta.

Además de esto, es posible, mediante técnicas habituales de biología molecular (véase p.ej. la obra de Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), introducir mutaciones de diversos tipos en las moléculas de ADN de acuerdo con el invento, con lo que se llega a la síntesis de proteínas con propiedades biológicas eventualmente modificadas. En este caso, es posible, por una parte, la producción de mutantes por deleción, en las que se producen, mediante deleciones progresivas desde el extremo 5' ó 3' de la secuencia de ADN codificadora, moléculas de ADN que conducen a la síntesis de unas proteínas acortadas de una manera correspondiente. Mediante tales deleciones junto al extremo 5' de la secuencia de nucleótidos, es posible, por ejemplo, identificar secuencias de aminoácidos, que son responsables de la translocación de la enzima en los plastidios (péptidos de tránsito). Esto permite preparar de una manera deliberada enzimas, que, por eliminación de las correspondientes secuencias, ya no están localizadas en los plastidios, sino en el citosol, o que por causa de la adición de otras secuencias de señal, están localizadas en otros compartimientos.

Por otra parte, también es concebible la introducción de mutaciones puntuales en posiciones, en las que una modificación de la secuencia de aminoácidos tiene una influencia, por ejemplo, sobre la actividad enzimática o sobre la regulación de la enzima. De esta manera, se pueden producir, p.ej., mutantes que poseen un índice K_{m} modificado, o que ya no están sujetas a los mecanismos de regulación presentes normalmente en la célula, a través de una regulación alostérica o de una modificación covalente.

Por lo demás, se pueden producir mutantes, que tienen una especificidad modificada para el substrato o para el producto, tales como p.ej. mutantes, que como substrato utilizan ADP-glucosa-6-fosfato en lugar de ADP-glucosa. Además, se pueden producir mutantes que tienen un perfil modificado de actividad y temperatura.

Para la manipulación por tecnología genética en células procarióticas, las moléculas de ADN de acuerdo con el invento, o partes de estas moléculas, se pueden introducir en plásmidos, que permiten una mutagénesis o una modificación de las secuencias mediante recombinación de secuencias de ADN. Con ayuda de procedimientos clásicos (compárese la obra de Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloning: A laboratory manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, EE.UU) se pueden llevar a cabo intercambios de bases o se pueden añadir secuencias naturales o sintéticas. Para la unión de los fragmentos de ADN unos con otros, se pueden adosar adaptadores o engarzadores a los fragmentos. Además, se pueden emplear manipulaciones, que ponen a disposición los adecuados sitios de corte por restricción o que eliminan los superfluos ADN o sitios de corte por restricción. Donde entran en cuestión inserciones, deleciones o sustituciones, se pueden utilizar una mutagénesis in vitro, una reparación con cebadores (del inglés "primer repair"), una restricción o una ligación. Como métodos de análisis se llevan a cabo generalmente un análisis de las secuencias, un análisis por restricción y otros métodos bioquímicos y de biología molecular.

En otra forma de realización, el invento se refiere a células hospedantes, en particular a células procarióticas o eucarióticas, que contienen una molécula de ADN de acuerdo con el invento como se describió anteriormente o un vector de acuerdo con el invento. En este caso, se trata preferiblemente de células bacterianas o de células de plantas.

Son objeto del invento, además, las proteínas, que son codificadas por las moléculas de ADN de acuerdo con el invento, así como los procedimientos para su preparación, realizándose que una célula hospedante de acuerdo con el invento se cultiva en unas condiciones que permiten la síntesis de la proteína, y la proteína se aísla a partir de las células cultivadas y/o del medio de cultivo.

Se ha encontrado, por fin, que mediante la puesta a disposición de las moléculas de ADN de acuerdo con el invento es posible intervenir con ayuda de métodos de tecnología genética en el metabolismo del almidón que presentan las plantas, cosa que hasta ahora no era posible, y modificarlo de tal manera que se llegue a la síntesis de un almidón, que se haya modificado en sus propiedades físico-químicas, en particular en la relación de amilosa a amilopectina, el grado de ramificación, la longitud media de las cadenas, el contenido de fosfatos, el engrudamiento, el tamaño de los granos de almidón y/o la forma de los granos de almidón, en comparación con el almidón sintetizado en plantas de tipo silvestre. Las sintasas de almidón solubles desempeñan, por ejemplo, un cometido central primordial en la regulación del régimen de síntesis del almidón. Por lo tanto, mediante un aumento de la actividad de estas enzimas o mediante la puesta a disposición de mutantes, que ya no están sujetas a los mecanismos de regulación propios de las células y/o que poseen diferentes dependencias con respecto de la temperatura en lo que se refiere a su actividad, es posible un aumento del rendimiento en plantas modificadas correspondientemente por tecnología genética. La importancia económica de la posibilidad de intervenir en la síntesis de almidón solamente en el caso del plantas de patata es evidente: La patata es, por ejemplo, en Europa, junto al maíz y al trigo, una de las plantas más importantes para la obtención de almidón. Aproximadamente un 20% del almidón producido anualmente en Europa se obtiene a partir de patatas. Además, el almidón de la patata tiene, en comparación con el almidón procedente de maíz y trigo, algunas propiedades ventajosas, por ejemplo un bajo contenido de proteínas y lípidos así como unos granos de almidón relativamente grandes, un contenido de fosfatos, por lo que, cuando esto sea posible, se utilizará de manera preferida.

Por consiguiente, es posible la expresión de las moléculas de ADN de acuerdo con el invento en células de plantas, con el fin de aumentar la actividad de las descritas sintasas de almidón. Además, es posible modificar las moléculas de ADN de acuerdo con el invento de acuerdo con los métodos conocidos por un experto en la materia, a fin de obtener sintasas de almidón, que ya no están sujetas a los mecanismos de regulación propios de las células, o que presenten unas dependencias modificadas con respecto de la temperatura o unas especificidades modificadas para el substrato o para el producto.

Existe fundamentalmente la posibilidad de que la proteína sintetizada pueda estar localizada en cualquier compartimiento arbitrario de la célula de planta. Con el fin de conseguir una localización en un determinado compartimiento, se tiene que suprimir la secuencia que garantiza la localización en plastidios, y la región codificadora remanente se tiene que unir eventualmente con secuencias de ADN, que garantizan la localización en el respectivo compartimiento. Las secuencias de este tipo son conocidas (véanse, por ejemplo, las citas de Braun y colaboradores, EMBO J. 11 (1992), 3.219-3.227; Wolter y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald y colaboradores, Plant J. 1 (1991), 95-106).

El presente invento se refiere, por consiguiente, también a células de plantas transgénicas, que contienen una molécula de ADN de acuerdo con el invento, estando unida ésta con elementos de ADN reguladores, que garantizan la transcripción en células de plantas, es decir con un promotor, que es heterólogo con respecto a la molécula de ADN.

Las células de plantas transgénicas se pueden regenerar de acuerdo con técnicas conocidas para un experto en la materia para dar plantas enteras. Las plantas obtenibles mediante regeneración de las células de plantas transgénicas de acuerdo con el invento, son asimismo objeto del presente invento. Además, son objeto del invento plantas, que contienen las células de plantas transgénicas más arriba descritas. En el caso de las plantas transgénicas se puede tratar en principio de plantas de cualquier especie arbitraria de plantas, es decir de plantas tanto monocotiledóneas como también dicotiledóneas. De manera preferida se trata de plantas útiles, tales como p.ej. especies de cereales (centeno, cebada, avena, trigo, etc.), arroz, maíz, guisante, mandioca o patata.

El invento se refiere asimismo a un material de reproducción de las plantas de acuerdo con el invento, por ejemplo, a frutas, semillas, tubérculos, plantones, etc..

Las células de plantas y las plantas transgénicas de acuerdo con el invento sintetizan, por causa de la expresión o bien de la expresión adicional de una molécula de ADN de acuerdo con el invento, un almidón que, en comparación con el almidón procedente de plantas de tipo silvestre, es decir plantas no transformadas, está modificado, en particular en lo que se refiere a la viscosidad de soluciones acuosas de este almidón y/o al contenido de fosfatos. Se describen, por consiguiente, también los almidones obtenibles a partir de las células de plantas transgénicas y las plantas transgénicas de acuerdo con el invento.

Las moléculas de ADN de acuerdo con el invento se pueden utilizar también para producir células de plantas transgénicas, en las que se ha disminuido la actividad de una proteína de acuerdo con el invento, en comparación con plantas no transformadas. Se ha encontrado que en células de plantas con una actividad disminuida de una proteína de acuerdo con el invento se llega a la síntesis de un almidón con unas propiedades químicas y físicas modificadas, en comparación con un almidón de células de plantas de tipo silvestre.

La producción de células de plantas con una actividad disminuida de una proteína de acuerdo con el invento, se puede conseguir, por ejemplo, mediando utilización de las moléculas de ADN de acuerdo con el invento. En este caso, son posibles la expresión de un correspondiente ARN antisentido, de un ARN del mismo sentido para la consecución de un efecto de cosupresión (supresión conjunta), o la expresión de una ribozima construida de una manera correspondiente, que disocia específicamente transcritos, que codifican una de las proteínas de acuerdo con el invento.

Preferiblemente, para la reducción de la actividad de una proteína de acuerdo con el invento en células de plantas, se expresa un ARN antisentido.

Para ello, se puede utilizar, por una parte, una molécula de ADN, que abarca toda la secuencia que codifica una proteína de acuerdo con el invento, inclusive las secuencias flanqueadoras eventualmente existentes, así como también moléculas de ADN, que abarcan solamente partes de la secuencia codificadora, teniendo estas partes que ser lo suficientemente largas como para producir un efecto antisentido en las células. Por lo general, se pueden utilizar secuencias hasta con una longitud mínima de 15 pb (pares de bases), de manera preferida una longitud de 100-500 pb, y para conseguir una inhibición antisentido eficiente, en particular secuencias con una longitud de más que 500 pb. Por regla general, se utilizan unas moléculas de ADN que son más cortas que 5.000 pb, preferiblemente secuencias que son más cortas que 2.500 pb. Se utilizan preferiblemente moléculas de ADN, que son homólogas en lo que se refiere a las especies de plantas que se han de transformar.

También es posible la utilización de secuencias de ADN, que presentan un alto grado de homología con las secuencias de las moléculas de ADN de acuerdo con el invento, pero que no son totalmente idénticas. La homología mínima debería ser mayor que aproximadamente 65%. Se ha de preferir la utilización de secuencias con unas homologías situadas entre 95 y 100%.

Tales células de plantas transgénicas se pueden regenerar de acuerdo con técnicas conocidas para un experto en la materia para formar plantas enteras.

En el caso de las plantas se puede tratar en principio de plantas de cualquier especie arbitraria de plantas, es decir, de plantas tanto monocotiledóneas como también dicotiledóneas. De manera preferida, se trata de plantas útiles, en particular de plantas que sintetizan almidón o almacenan almidón, tales como p.ej. especies de cereales (centeno, cebada, avena, trigo, etc.), arroz, maíz, guisante, mandioca o patata. El invento se refiere asimismo a materiales de reproducción de las plantas de acuerdo con el invento, por ejemplo, a frutas, semillas, tubérculos, plantones, etc.

Tales células de plantas transgénicas sintetizan, debido a la disminución de la actividad de una proteína de acuerdo con el invento, un almidón que, en comparación con un almidón procedente de células de plantas, o respectivamente de plantas, no transformadas, tiene unas propiedades químicas y/o físicas modificadas. Este almidón muestra, por ejemplo, una viscosidad modificada de sus soluciones acuosas y/o un contenido modificado de fosfatos.

Los almidones obtenibles a partir de las células de plantas y de las plantas de acuerdo con el invento se pueden modificar de acuerdo con procedimientos conocidos para un experto en la materia, y se adecuan, en una forma no modificada o modificada, para diversas utilizaciones en el sector de la alimentación o en un sector que no es de alimentación.

La posibilidad de empleo del almidón se puede subdividir fundamentalmente en dos grandes sectores. Uno de los sectores abarca los productos de hidrólisis del almidón, principalmente glucosa y eslabones de glucanos, que se pueden obtener por medio de procedimientos enzimáticos o químicos. Éstos sirven como sustancias de partida para otras modificaciones químicas adicionales y para procesos, tales como los de fermentación. Puede ser importante, en este caso, la sencillez y la realización barata de un procedimiento de hidrólisis, tal como el que se lleva a cabo actualmente en lo esencial por vía enzimática mediando utilización de la amiloglucosidasa. Sería concebible un ahorro de costes mediante un empleo de una menor cantidad de enzimas. Una modificación de la estructura del almidón, p.ej. un aumento del tamaño de la superficie de los granos, una digestibilidad más fácil por medio de un menor grado de ramificación, o una estructura estérica que limite la accesibilidad para las enzimas empleadas, podría producir este ahorro.

El otro sector, en el que se utiliza el almidón, a causa de su estructura polimérica como el denominado almidón natural, se clasifica en otros dos sectores adicionales de empleo:

1. La industria alimentaria

El almidón es un aditivo clásico para muchos alimentos, en los cuales toma a su cargo esencialmente la función de la aglutinación de aditivos acuosos o provoca un aumento de la viscosidad o también una gelificación elevada. Importantes características de propiedades son los comportamientos de fluencia y sorción, las temperaturas de hinchamiento y engrudamiento, la viscosidad y el rendimiento de espesamiento, la solubilidad del almidón, la transparencia y la estructura del engrudo, la estabilidad frente al calor, a la cizalladura y a los ácidos, la tendencia a la retrogradación, la capacidad para la formación de películas, la estabilidad en procesos de congelación y descongelación, la digestibilidad, así como la capacidad para la formación de complejos p.ej. con iones inorgánicos u orgánicos.

2. La industria no alimentaria

En este gran sector, el almidón se emplea como sustancia auxiliar para diversos procesos de fabricación o bien como aditivo para productos técnicos. En el caso de la utilización de un almidón como sustancia auxiliar, se ha de citar aquí en particular la industria del papel y del cartón. El almidón sirve, en este caso, en primer término para la retardación (retención de materiales sólidos), la aglutinación de partículas de materiales de carga y relleno y de partículas finas, como material de consolidación y para la deshidratación. Además de esto, se aprovechan las ventajosas propiedades del almidón en lo que se refiere a la rigidez, la dureza, el sonido o tono, el tacto, el brillo, la lisura, la resistencia a la formación de fisuras, así como a las superficies.

2.1 Industria del papel y del cartón

Dentro del proceso de fabricación de papel se han de diferenciar cuatro sectores de aplicación, a saber la superficie, el estucado, la masa y la proyección.

Las exigencias planteadas al almidón en lo que se refiere al tratamiento de superficies, son esencialmente un alto grado de blancura, una viscosidad adaptada, una alta estabilidad de la viscosidad, una buena formación de películas, así como una escasa formación de polvo fino. En el caso de la utilización en el estucado, desempeñan un cometido importante el contenido de materiales sólidos, una viscosidad adaptada, una alta capacidad de aglutinación, así como una alta afinidad para los pigmentos. Como adición a la masa son importantes una distribución rápida, uniforme, exenta de pérdidas, una alta estabilidad mecánica y una completa retención en el flujo de papel. En el caso del empleo del almidón en el sector de la proyección, son importantes asimismo un contenido adaptado de materiales sólidos, una alta viscosidad, así como una alta capacidad de aglutinación.

2.2 Industria de los pegamentos

Un gran sector de empleo de los almidones consiste en la industria de los pegamentos, en donde las posibilidades de empleo se clasifican en cuatro sectores parciales: la utilización como una cola pura de almidón, la utilización de colas de almidón tratadas con agentes químicos especiales, la utilización de un almidón como aditivo para resinas sintéticas y dispersiones de polímeros, así como la utilización de almidones como agentes extendedores para pegamentos sintéticos. Un 90% de los pegamentos a base de almidón se emplean en los sectores de la fabricación de cartón ondulado, de la fabricación de sacos, bolsas y cucuruchos de papel, de la fabricación de materiales compuestos para papel y aluminio, de la fabricación de cartonajes y de cola rehumedecible para sobres, sellos de correo, etc.

2.3 Industria textil y de agentes para el cuidado de materiales textiles

Un gran sector de empleo para los almidones como agentes auxiliares y aditivos es el sector de la fabricación de materiales textiles y de agentes para el cuidado de materiales textiles. Dentro de la industria textil hay que establecer diferencia entre los siguientes cuatro sectores de empleo: El empleo de un almidón como agente de apresto, es decir, como sustancia auxiliar para el alisamiento y el reforzamiento del comportamiento de trepa con el fin de proteger contra las fuerzas de tracción que atacan al tejer, así como para aumentar la resistencia a la abrasión al tejer, el empleo de un almidón como agente para el apresto de materiales textiles, sobre todo después de tratamientos previos que empeoran la calidad, tales como el blanqueo, la tinción, etc., el empleo de un almidón como agente de espesamiento para la evitación de difusiones de los colorantes, así como el empleo de almidón como aditivo a agentes de encadenamiento o urdimbre para hilos de costura.

2.4 Industria de los materiales de construcción

El cuarto sector de empleo es la utilización de los almidones como aditivos en materiales de construcción. Un ejemplo de esto es la fabricación de planchas de cartón yeso, en la que el almidón mezclado en la papilla de yeso se engruda con el agua, se difunde junto a la superficie de la plancha de yeso y allí fija el cartón a la plancha. Otros sectores de empleo son la adición a fibras de revoque y minerales. En el caso de un hormigón transportable los productos de almidón se emplean para retardar el fraguado.

2.5 Estabilización de suelos

Un mercado adicional para el almidón se recomienda en la preparación de agentes para la estabilización de suelos, que se emplean en el caso de movimientos artificiales de tierras para la protección provisional de las partículas del suelo frente al agua. Los productos combinados a base de almidón y de emulsiones de polímeros han de equipararse, de acuerdo con los conocimientos actuales, a los productos empleados hasta ahora, en cuanto a su efecto de disminución de la erosión y de la formación de costras, pero se encuentran manifiestamente por debajo de éstos en cuanto al precio.

2.6 Empleo en los casos de agentes fitoprotectores y fertilizantes

Un sector de empleo está situado en la utilización de almidón en agentes fitoprotectores con el fin de modificar las propiedades específicas de las formulaciones. Así, se emplean almidones para mejorar la humectación y mojadura de agentes fitoprotectores y fertilizantes, para la liberación dosificada de las sustancias activas, para la transformación de sustancias activas líquidas, volátiles y/o malolientes en sustancias moldeables, estables y microcristalinas, para la mezcladura de compuestos incompatibles y para la prolongación de la duración de la acción por disminución de la descomposición.

2.7 Industrias de fármacos, medicinas y productos cosméticos

Otro sector de empleo consiste en el sector de las industrias de fármacos, medicinas y productos cosméticos. En la industria farmacéutica, se emplean almidones como agentes aglutinantes para tabletas o para la dilución de agentes aglutinantes en cápsulas. Además, los almidones sirven como agentes disgregantes para tabletas, puesto que ellos, después de haber tragado las tabletas, absorben líquido y después de un breve periodo de tiempo se hinchan hasta tal punto que la sustancia activa es puesta en libertad. Los polvos medicinales para espolvorear deslizantes y sobre heridas están basados, por motivos cualitativos, en un almidón. En el sector de la cosmética, los almidones se emplean, por ejemplo, como vehículos o soportes de materiales aditivos a polvos para espolvorear, tales como perfumes, aromas y ácido salicílico. Un sector de utilización relativamente grande para un almidón se encuentra en las pastas
dentífricas.

2.8 Adición de almidón a carbones y briquetas

El almidón ofrece un sector de empleo como material aditivo a carbones y briquetas. Un carbón puede ser aglomerado o bien briqueteado con una adición de almidón de manera cuantitativa para dar un producto de alto valor, con lo que se impide una descomposición prematura de las briquetas. La cantidad añadida de almidón está situada, en el caso de carbón para barbacoas, entre 4 y 6%, y, en el caso de carbón aumentado en calorías, entre 0,1 y 0,5%. Por lo demás, los almidones están ganando en importancia como agentes aglutinantes, puesto que mediante su adición a carbones y briquetas, se puede reducir manifiestamente la expulsión de sustancias nocivas y dañinas.

2.9 Tratamiento de lodos de minerales y carbones

El almidón se puede emplear además en el tratamiento de lodos de minerales y carbones como agente de floculación.

2.10 Agente auxiliar para moldeo por colada o fundición

Otro sector de empleo es como aditivo a agentes auxiliares para el moldeo por colada o la fundición. En diversos procedimientos de moldeo por colada o fundición se requieren núcleos o machos, que se producen a partir de arenas mezcladas con agentes aglutinantes. Como agente aglutinante se emplea actualmente de manera predominante una bentonita, que se ha mezclado con almidones modificados, en la mayor parte de los casos almidones hinchables.

La finalidad de la adición de un almidón es la de aumentar la resistencia a la fluencia así como la de mejorar la resistencia de aglutinación. Además de esto, los almidones hinchables pueden presentar otros requisitos técnicos de producción, tales como los de ser dispersables en agua fría, ser rehidratables, ser bien miscibles en arena, y tener una alta capacidad de fijación de agua.

2.11 Empleo en la industria del caucho

En la industria del caucho, el almidón se puede emplear para mejorar la calidad técnica y óptica. Las razones de ello son, en este caso, el mejoramiento del brillo superficial, el mejoramiento del tacto y del aspecto; para esto, un almidón se esparce, antes de la vulcanización en frío, sobre las superficies recauchutadas pegajosas de los materiales de caucho, así como el mejoramiento de la capacidad del caucho para la estampación e impresión.

2.12 Preparación de materiales sustitutivos del cuero

Otra posibilidad de utilización de los almidones modificados consiste en la preparación de materiales sustitutivos del cuero.

2.13 Almidón en polímeros sintéticos

En el sector de los materiales sintéticos y plásticos se destacan los siguientes sectores de empleo: la inclusión de productos de transformación del almidón en el proceso de elaboración (el almidón es solamente un material de relleno y carga, no existe ninguna unión directa entre el polímero sintético y el almidón) o, alternativamente, la inclusión de productos de transformación del almidón en la preparación de polímeros (el almidón y el polímero pasan a formar una unión firme).

La utilización de los almidones como un material de carga puro no es competitiva, en comparación con la de otras sustancias tales como talco. Se establece un cuadro diferente, cuando pasan a tener importancia las propiedades específicas de los almidones y se modifica con ello manifiestamente el perfil de propiedades de los productos finales. Un ejemplo de esto es la utilización de productos de almidón en el caso de la elaboración de materiales termoplásticos, tales como un polietileno. En este caso, el almidón y el polímero sintético se combinan mediante coexpresión en la relación de 1 : 1 para dar una "tanda patrón" [en inglés "master batch"], a partir de la que se producen diversos productos con un polietileno granulado mediando utilización de tecnologías de procesos habituales. Mediante la inclusión de un almidón en láminas de polietileno se puede conseguir una permeabilidad aumentada de sustancias en el caso de cuerpos huecos, una permeabilidad mejorada al vapor de agua, un comportamiento antiestático mejorado, un comportamiento anti-apelmazante mejorado, así como una capacidad de impresión mejorada con tintas acuosas. Las desventajas actuales conciernen a una transparencia insuficiente, a la resistencia disminuida a la tracción así como una alargabilidad o dilatabilidad disminuida.

Otra posibilidad es la utilización del almidón en espumas de poliuretanos. Con la adaptación de los derivados de almidón, así como mediante la optimización técnica de los procesos es posible controlar deliberadamente la reacción entre polímeros sintéticos y los grupos hidroxi de los almidones. El resultado de ello son láminas de poliuretanos, que, mediante la utilización de un almidón, adquieren los siguientes perfiles de propiedades: una disminución del coeficiente de dilatación térmica, una disminución del comportamiento de contracción, un mejoramiento del comportamiento bajo presión y tensión, un aumento de la permeabilidad al vapor de agua sin que se modifique la absorción de agua, una disminución de la inflamabilidad y de la densidad de desgarramientos, ningún escurrimiento de partes combustibles, ausencia de halógenos y envejecimiento disminuido. Las desventajas, que actualmente están todavía presentes, son una resistencia reducida a la compresión, así como una resistencia disminuida a los impactos.

Entre tanto, el desarrollo de productos ya no se limita solamente a las láminas. También se pueden producir productos sólidos de materiales sintéticos, tales como cacerolas, macetas, planchas y cubetas, con un contenido de almidón de más que 50%. Por lo demás, se han de valorar favorablemente las mezclas de almidones y polímeros, puesto que tienen una degradabilidad biológica muchísimo más alta.

Además, debido a su extremada capacidad para fijar agua, los polímeros por injerto de almidón han adquirido una importancia extraordinaria. Éstos son productos con una cadena principal a base de almidón y un retículo lateral a base de un monómero sintético, que se ha injertado de acuerdo con el principio del mecanismo de encadenamiento por radicales. Los polímeros por injerto de almidón, disponibles hoy en día, se distinguen por una mejor capacidad de fijación y retención de hasta 1.000 g de agua por gramo de almidón, en el caso de una alta viscosidad. Los sectores de utilización para estos agentes superabsorbentes se han ampliado grandemente en los últimos años y se encuentran en el sector de la higiene, con productos tales como pañales y sábanas bajeras, así como en el sector agrícola, p.ej. en formaciones de gránulos de semillas.

Son de carácter decisivo para el empleo de los nuevos almidones modificados por tecnología genética, por una parte, la estructura, el contenido de agua, el contenido de proteínas, el contenido de lípidos, el contenido de fibras, el contenido de cenizas y fosfatos, la relación de amilosa a amilopectina, la distribución de las masas molares, el grado de ramificación, el tamaño y la forma de los granos, así como la cristalización y, por otra parte, también las propiedades que desembocan en las siguientes características: el comportamiento de fluencia y de sorción, la temperatura de engrudamiento, la viscosidad, el rendimiento de espesamiento, la solubilidad, la estructura y la transparencia de los engrudos, la estabilidad frente al calor, a la cizalladura y a los ácidos, la tendencia a la retrogradación, la gelificación, la estabilidad frente a procesos de congelaciones y descongelaciones, la formación de complejos, la fijación de yodo, la formación de películas, la fuerza de pegamiento, la estabilidad frente a las enzimas, la digestibilidad y la reactividad.

La producción de almidones modificados mediante intervenciones por tecnología genética en una planta transgénica puede modificar, por una parte, las propiedades de los almidones obtenidos a partir de la planta, de tal manera que ya no aparezcan como necesarias otras modificaciones adicionales mediante procedimientos químicos o físicos. Por otra parte, los almidones modificados mediante procedimientos de tecnología genética pueden ser sometidos a otras modificaciones químicas, lo que conduce a otros mejoramientos adicionales de la calidad para determinados sectores de empleo entre los que se han citado anteriormente. Estas modificaciones químicas son fundamentalmente conocidas. En particular, en este caso, se trata de modificaciones mediante

- tratamiento por calor

- tratamiento con ácidos

- oxidación y

- esterificaciones

que conducen a la formación de los fosfato-, nitrato-, sulfato-, xantato-, acetato- y citrato-almidones. Otros ácidos orgánicos se pueden emplear asimismo para la esterificación:

-

producción de éteres de almidones

alquil-éteres, O-alil-éteres, hidroxialquil-éteres,

O-carboximetil-éteres de almidones, éteres de almidones que contienen N,

éteres de almidones que contienen P, éteres de almidones que contienen S

-

producción de almidones reticulados

-

producción de polímeros por injerto de almidón.

Para la expresión de las moléculas de ADN de acuerdo con el invento en una orientación del mismo sentido o antisentido en células de plantas, se unen éstas con elementos de ADN reguladores, que garantizan la transcripción en células de plantas. Entre éstos se cuentan en particular los promotores.

El promotor se puede escoger, en este caso, de tal manera que la expresión se efectúe de una manera constitutiva o solamente en un determinado tejido, en un determinado momento del desarrollo de las plantas o en un momento determinado por influencias externas. En lo que se refiere a la planta, el promotor puede ser homólogo o heterólogo. Promotores convenientes son p.ej. el promotor de ARN 35S del virus de mosaico de coliflor (Cauliflower Mosaic Virus) para una expresión constitutiva, el promotor de Patatingen B33 (Rocha-Sosa y colaboradores, EMBO J. 8 (1989), 23-29) para una expresión específica para los tubérculos en patatas, o un promotor que asegura una expresión solamente en tejidos que son activos en fotosíntesis, p.ej. el promotor ST-LS1 (Stockhaus y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7.943-7.947; Stockhaus y colaboradores, EMBO J. 8 (1989), 2.445-2.451) o, para una expresión específica para endospermas, el promotor de HMG procedente de trigo o promotores de genes de zeína procedentes de maíz.

Además, puede estar presente una secuencia de terminación, que sirve para la terminación correcta de la transcripción, así como para la adición de una cola de poli-A junto al transcrito, a la que se le atribuye una cierta función en la estabilización de los transcritos. Tales elementos han sido descritos en la bibliografía (compárese la cita de Gielen y colaboradores, EMBO J. 8 (1989), 23-29) y son intercambiables de una manera arbitraria.

En principio es posible producir unas plantas, en las que sólo se ha modificado la actividad de la SSSA, pero también unas plantas, en las que se han modificado simultáneamente las actividades de varias formas de sintasas de almidón. En este caso, son concebibles todas las combinaciones y permutaciones.

Mediante la modificación de las actividades de una o varias isoformas de las sintasas de almidón en plantas se llega a la síntesis de un almidón modificado en su estructura.

Por medio del aumento de la actividad de una o varias isoformas de las sintasas de almidón en las células de los tejidos, que almacenan almidón, de plantas transformadas, tales como p.ej. en el tubérculo en el caso de la patata o en el endospermo de maíz o trigo, se puede llegar, además de esto, a un aumento del rendimiento.

Puesto que ya se conoce la secuencia de ADN que codifica la GBSS I procedente de patata (Visser y colaboradores, Plant Sci. 64 (1989), 185-192), están a disposición, por consiguiente, las secuencias de ADN que codifican todas las sintasas de almidón identificadas en la patata. Esto permite, por fin, tanto la identificación de la función de las isoformas individuales en la biosíntesis del almidón, así como también la producción de plantas modificadas por tecnología genética, en las que se han modificado las actividades de una o varias de estas enzimas. Esto hace posible la síntesis de un almidón con una estructura modificada y, por consiguiente, unas propiedades físico-químicas modificadas en las plantas manipuladas de tal manera.

Las moléculas de ADN de acuerdo con el invento se pueden utilizar por lo tanto también para producir plantas, en las que se ha aumentado o disminuido la actividad de las mencionadas sintasas de almidón, y al mismo tiempo se han modificado las actividades de otras enzimas que participan en la biosíntesis de almidón. En este caso son concebibles todas las combinaciones posibles. Por ejemplo, de acuerdo con el procedimiento descrito, se pueden introducir unas secuencias de ADN, que codifican proteínas de SSS o la GBSS II, en células de plantas, en las que se había inhibido ya la síntesis de proteínas endógenas de GBSS I debido a un efecto antisentido (tal como se describió en la cita bibliográfica de Visser y colaboradores, Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 289-296) o la síntesis de la enzima ramificadora (tal como se describió en el documento WO92/14827).

Si se debe de conseguir la inhibición de la síntesis de varias sintasas de almidón en plantas transformadas, entonces se pueden utilizar para la transformación unas moléculas de ADN, que contienen simultáneamente varias regiones, que codifican las correspondientes sintasas de almidón, en una orientación antisentido, bajo el control de un promotor apropiado. En este caso, alternativamente, cada secuencia puede estar puesta bajo el control de un promotor propio, o las secuencias se pueden transcribir como una fusión de un promotor común. Se ha de preferir, por regla general, la última alternativa, puesto que en este caso la síntesis de las correspondientes proteínas se debería inhibir en una medida aproximadamente igual.

Además, es posible la construcción de moléculas de ADN, en las que, junto a las secuencias de ADN, que codifican sintasas de almidón, otras secuencias de ADN, que codifican otras proteínas, que participan en la síntesis o modificación de un almidón, están acopladas en una orientación antisentido con un promotor apropiado. En este caso, las secuencias pueden estar conectadas a su vez unas tras de otras y pueden ser transcritas por un promotor común. Para la longitud de las regiones codificadoras individuales, que se utilizan en una estructura artificial (construcción) de este tipo, es válido lo que ya se ha expuesto anteriormente para la producción de estructuras artificiales antisentido. No hay ningún límite superior para el número de los fragmentos antisentido transcribibles a partir de un promotor en una molécula de ADN de este tipo. El transcrito resultante no debería sobrepasar en general, no obstante, una longitud de 10 kb, ni preferiblemente una longitud de 5 kb.

Las regiones codificadoras, que están localizadas en tales moléculas de ADN en combinación con otras regiones codificadoras en una orientación antisentido detrás de un promotor apropiado, pueden proceder de secuencias de ADN, que codifican las siguientes proteínas: sintasas de almidón fijadas a granos de almidón (GBSS I y II) y sintasas de almidón solubles (SSS I y II), enzimas ramificadoras (Ko\betamann y colaboradores, Mol. Gen. Genet. 230 (1991), 39-44), enzimas desramificadoras [en inglés "debranching"] (enzimas R), enzimas de desproporcionamiento (Takaha y colaboradores, J. Biol. Chem. 268 (1993), 1.391-1.396) y fosforilasas de almidón. Ésta es sólo una enumeración dada a modo de ejemplo. También se puede concebir la utilización de otras secuencias de ADN en el marco de una combinación de este tipo.

Con ayuda de tales estructuras artificiales es posible además inhibir simultáneamente la síntesis de varias enzimas en células de plantas, que habían sido transformadas con éstas.

Con el fin de efectuar la preparación previa para la introducción de genes ajenos en plantas superiores, están a disposición un gran número de vectores de clonación, que contienen una señal de replicación para E. coli y un gen marcador para la selección de células bacterianas transformadas. Ejemplos de tales vectores son pBR322, las series pUC, las series M13mp, pACYC184, etc. La secuencia deseada se puede introducir junto a un sitio de corte por restricción oportuno en el vector. El plásmido obtenido se utiliza para la transformación de células de E. coli. Las células de E. coli transformadas se cultivan en un medio apropiado, y seguidamente se cosechan y se lisan. El plásmido se recupera. Como método de análisis para la caracterización del ADN plasmídico obtenido se emplean, por regla general, análisis por restricción, electroforesis en gel así como otros métodos bioquímicos y de biología molecular. Después de cada manipulación, el ADN plasmídico se puede disociar y los fragmentos de ADN obtenidos se pueden unir con otras secuencias de ADN. Cada secuencia de ADN plasmídico se puede clonar en los mismos plásmidos o en otros distintos.

Para la introducción de un ADN en una célula hospedante vegetal, están a disposición un gran número de técnicas. Estas técnicas abarcan la transformación de células de plantas con un ADN-T (de transformación), mediando utilización de Agrobacterium tumefaciens o de Agrobacterium rhizogenes como agente de transformación, la fusión de protoplastos, la inyección, la electroporación de ADN, la introducción de ADN mediante el método biolístico, así como otras posibilidades.

En el caso de la inyección y la electroporación de ADN en células de plantas, no se plantean de por sí exigencias especiales de ningún tipo en cuanto a los plásmidos utilizados. Se pueden utilizar plásmidos sencillos, tales como p.ej. derivados de pUC. Sin embargo, si a partir de las células transformadas de esta índole se deben de regenerar plantas enteras, es necesaria la presencia de un gen marcador seleccionable.

Según sea el método de introducción de los genes deseados en la célula de planta, pueden ser necesarias otras secuencias de ADN adicionales. Si, p.ej. para la transformación de la célula de planta se utilizan el plásmido Ti o el Ri, por lo menos la delimitación derecha, pero frecuentemente las delimitaciones derecha e izquierda del ADN T de los plásmidos Ti y Ri se deberán unir con los genes que se han de introducir como una zona de flanco.

Si se utilizan agrobacterias para la transformación, el ADN que se ha de introducir debe ser clonado en plásmidos especiales, y ciertamente o bien en un vector intermedio o en un vector binario. Los vectores intermedios pueden ser integrados mediante recombinación homóloga en el plásmido Ti o Ri de las agrobacterias, a causa de secuencias, que son homólogas con respecto a secuencias existentes en el ADN T. Éste contiene además la región vir, que es necesaria para la transferencia del ADN T. Los vectores intermedios no pueden replicarse en agrobacterias. Mediante un plásmido cooperante se puede transferir el vector intermedio a Agrobacterium tumefaciens (lo que se denomina conjugación). Los vectores binarios pueden replicarse tanto en E. coli como también en agrobacterias. Ellos contienen un gen marcador de selección y un engarzador o poliengarzador, los cuales son enmarcados por las regiones límites derecha e izquierda del ADN T. Éstas pueden ser transformadas directamente en las agrobacterias (Holsters y colaboradores, Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187). La agrobacteria que sirve como célula hospedante debe contener un plásmido, que lleva una región vir. La región vir es necesaria para la transferencia del ADN T a la célula de planta. Puede estar presente un ADN T adicional. La agrobacteria transformada de esta manera es utilizada para la transformación de células de plantas.

La utilización de un ADN T para la transformación de células de plantas se ha investigado intensamente y se describió de una manera suficiente en el documento de patente europea EP 120.516; y en la cita de Hoekema, en: The Binary Plant Vector System [El sistema de vectores binarios de plantas] Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), capítulo V; Fraley y colaboradores, Crit. Rev. Plant Sci., 4, 1-46 y An y colaboradores EMBO J. 4 (1985), 277-287.

Para la transferencia del ADN a la célula de planta se pueden cultivar conjuntamente (cocultivar) explantes de plantas, convenientemente con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes. A partir del material vegetal infectado (p.ej. trocitos de hojas, segmentos de tallos, raíces, pero también protoplastos o células de plantas cultivadas en suspensión), se pueden regenerar entonces de nuevo plantas enteras en un medio apropiado, que puede contener antibióticos o biocidas para la selección de células transformadas. Las plantas obtenidas de esta manera se pueden investigar entonces en cuanto a la presencia del ADN introducido. Se conocen otras posibilidades para la introducción de un ADN ajeno mediando utilización del procedimiento biolístico o mediante transformación de los protoplastos (compárese p.ej. la cita de Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants [Plantas transgénicas]. En: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, coordinadores de edición), tomo 2, 627-659, VCH Weinheim-Nueva York-Basilea-Cambridge).

Una vez que el ADN introducido se ha integrado en el genoma de la célula de planta, éste es, por regla general, estable allí y permanece conservado también en los descendientes de la célula transformada originalmente. Este ADN contiene normalmente un marcador de selección, que confiere a las células de plantas transformadas resistencia frente a un biocida o a un antibiótico tal como kanamicina, G 418, bleomicina, higromicina o fosfinotricina, entre otros. El marcador elegido individual debería permitir, por lo tanto, la selección de células transformadas frente a células, a las que les falta el ADN introducido. Las células transformadas crecen dentro de la planta de la manera usual (véase también la cita de McCormick y colaboradores, Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). Las plantas resultantes se pueden cultivar de manera normal y cruzar con plantas, que poseen el mismo material hereditario transformado u otros materiales hereditarios. Los individuos híbridos resultantes a partir de esto tienen las correspondientes propiedades fenotípicas. Se deberían cultivar dos o más generaciones, a fin de asegurar que la característica fenotípica se conserve de manera estable y sea heredada. También se deberían cosechar semillas, a fin de asegurar que se han conservado el correspondiente fenotipo u otras propiedades.

El plásmido pBinARHyg utilizado en el marco del presente invento se presentó el día 20.10.1994 bajo el número DSM 9505, en la Colección Alemana de Microorganismos (DSM, en alemán "Deutsche Sammlung von Mikroorganis- men"), en Braunschweig, República Federal Alemana, que es reconocida como el lugar internacional de presentación, correspondientemente a los requisitos del Convenio de Budapest para el reconocimiento internacional de la presentación de microorganismos con la finalidad de patentarlos.

\vskip1.000000\baselineskip

Abreviaturas utilizadas

pb

par de bases

GBSS

granule bound starch synthase (sintasa de almidón fijada a granos de almidón)

IPTG

isopropil-\beta-tiogalacto-piranósido

SSS

soluble starch synthase (sintasa de almidón soluble)

PMSF

fluoruro de fenil-metil-sulfonilo

VK

clon de plena longitud

\vskip1.000000\baselineskip

Medios y soluciones que se utilizan en los Ejemplos

20 x SSC

175,3 g de NaCl

\quad

88,2 g de citrato de sodio

\quad

hasta 1.000 ml con ddH_{2}O

\quad

pH 7,0 con NaOH 10 N

\vskip1.000000\baselineskip

Tampón A

Tris-HCl 50 mM, de pH 8,0

\quad

DTT 2,5 mM

\quad

EDTA 2 mM

\quad

PMSF 0,4 mM

\quad

10% de glicerol

\quad

0,1% de ditionito de sodio

\vskip1.000000\baselineskip

Tampón B

Tris-HCl 50 mM, de pH 7,6

\quad

DTT 2,5 mM

\quad

EDTA 2 mM

\newpage

Tampón C

citrato de sodio 0,5 M, de pH 7,6

\quad

Tris-HCl 50 mM, de pH 7,6

\quad

DTT 2,5 mM

\quad

EDTA 2 mM

\vskip1.000000\baselineskip

10 x TBS

Tris-HCl 0,2 M, de pH 7,5

\quad

NaCl 5,0 M

\vskip1.000000\baselineskip

10 x TBST

10 x TBS

\quad

0,1% (vol/vol) de Tween 20

\vskip1.000000\baselineskip

Tampón para elución

Tris 25 mM, de pH 8,3

\quad

glicina 250 mM

\vskip1.000000\baselineskip

Tampón para diálisis

Tris-HCl 50 mM, de pH 7,0

\quad

NaCl 50 mM

\quad

EDTA 2 mM

\quad

\beta-mercaptoetanol 14,7 mM

\quad

PMSF 0,5 mM

\vskip1.000000\baselineskip

Tampón para proteínas

tampón de fosfato de sodio 50 mM, de pH 7,2

\quad

EDTA 10 mM

\quad

PMSF 0,5 mM

\quad

\beta-mercaptoetanol 14,7 mM.

\vskip1.000000\baselineskip

La Figura 1 muestra el plásmido pSSSA

La línea continua fina corresponde a la secuencia de pBluescript II SK(-). La línea gruesa representa el ADNc, que codifica la isoforma SSS A procedente de Solanum tuberosum. Se indican los sitios de corte por restricción. La inserción de ADNc está ligada entre los sitios de corte con EcoR I y Xho I del poliengarzador del plásmido. La secuencia de ADN de la inserción de ADNc se indica bajo Seq ID No. 1.

La Figura 2 muestra el plásmido pSSSB

La línea continua fina corresponde a la secuencia de pBluescript II SK(-). La línea gruesa representa el ADNc, que codifica la isoforma SSS B procedente de Solanum tuberosum. Se indican los sitios de corte por restricción. La inserción de ADNc está ligada entre los sitios de corte con EcoR I y Xho I del poliengarzador del plásmido. La secuencia de ADN de la inserción de ADNc se indica bajo Seq ID No. 2.

La Figura 3 muestra el plásmido p35S-anti-SSSA

Estructura del plásmido

A =

fragmento A: promotor CaMV 35 S, nt (nucleótidos) 6.909-7.437

\quad

(Franck y colaboradores, Cell 21 (1980), 285-294)

B =

fragmento B: ADNc procedente de Solanum tuberosum que codifica la sintasa de almidón soluble; isoforma SSSA;

\quad

fragmento de Xba I / Asp 718 de pSSSA, de aproximadamente 2,1 kb

\quad

orientación hacia el promotor: antisentido

C =

fragmento C: nt 11.748-11.939 del ADN T del plásmido Ti pTiACH5

\quad

(Gielen y colaboradores, EMBO J. 3 (1984), 835-846)

La Figura 4 muestra el plásmido p35S-anti-SSSB

Estructura del plásmido

A =

fragmento A: promotor CaMV 35 S, nt 6.909-7.437

\quad

(Franck y colaboradores, Cell 21 (1980), 285-294)

B =

fragmento B: ADNc procedente de Solanum tuberosum que codifica la sintasa de almidón soluble; isoforma SSSB;

\quad

fragmento de Xho I / Spe I de pSSSB, de aproximadamente 1,8 kb

\quad

orientación hacia el promotor: antisentido

C =

fragmento C: nt 11.748-11.939 del ADN T del plásmido Ti pTiACH5

\quad

(Gielen y colaboradores, EMBO J. 3 (1984), 835-846)

La Figura 5 muestra el plásmido pGBSSII

La línea continua fina corresponde a la secuencia de pBluescript II SK(-). La línea gruesa representa el ADNc, que codifica la isoforma GBSS II procedente de Solanum tuberosum. Se han indicado los sitios de corte por restricción. La inserción de ADNc está ligada entre los sitios de corte con EcoR I y Xho I del poliengarzador del plásmido. La secuencia de ADN de la inserción de ADNc se indica bajo Seq ID No. 3.

La Figura 6 muestra el plásmido p35S-anti-GBSSII

Estructura del plásmido

A =

fragmento A: promotor CaMV 35 S, nt 6.909-7.437

\quad

(Franck y colaboradores, Cell 21 (1980), 285-294)

\quad

fragmento B: ADNc procedente de Solanum tuberosum que codifica la sintasa de almidón fijada a granos de almidón; isoforma GBSS II;

\quad

fragmento de Sma I / Asp 718 de pGBSS, de aproximadamente 1,9 kb

\quad

orientación hacia el promotor: antisentido

C =

fragmento C: nt 11.748-11.939 del ADN T del plásmido Ti pTiACH5

\quad

(Gielen y colaboradores, EMBO J. 3 (1984), 835-846)

La Figura 7 muestra una comparación parcial entre las secuencias de aminoácidos de sintasas de glicógeno procarióticas, sintasas de almidón fijadas a granos de almidón y sintasas de almidón solubles procedentes de diferentes organismos.

a:

sintasa de glicógeno procedente de E. coli

b:

GBSS I procedente de cebada

c:

GBSS I procedente de trigo

d:

GBSS I procedente de maíz

e:

GBSS I procedente de arroz

f:

GBSS I procedente de mandioca

g:

GBSS I procedente de patata

h:

GBSS II procedente de guisante

i:

GBSS II procedente de patata

k:

SSS procedente de arroz

l:

SSS A procedente de patata

m:

SSS B procedente de patata

Las regiones marcadas (I), (II) y (III) indican tres secuencias de péptidos, que están grandemente conservadas entre las diferentes sintasas de almidón o respectivamente sintasas de glicógeno.

La Figura 8 muestra los geles de actividad de las isoformas solubles de una sintasa de almidón procedente de extractos de tubérculos de plantas de patata de tipo silvestre y de plantas de patata con sintasas de almidón "antisentido".

A) Planta con GBSS II "antisentido", linajes 14 y 35, K = planta de tipo silvestre

B) Planta con SSS A "antisentido", linajes 25 y 39, K = planta de tipo silvestre

C) Planta SSS B "antisentido", linajes 1 y 4, K = planta de tipo silvestre

En cada caso 50 \mug del extracto de proteínas se separaron sobre un gel natural al 7,5%, y se determinaron las actividades de las isoformas de la sintasa en la tanda estimulada con citrato, con 0,1% de amilopectina como "cebador". Los glucanos sintetizados se tiñeron con una solución de Lugol.

Los ejemplos ilustran el invento

En los Ejemplos se utilizaron los siguientes métodos:

1. Procedimiento de clonación

Para la clonación en E. coli se utilizó el vector pBluescript II SK (de Stratagene).

Para la transformación de las plantas se clonaron las construcciones de genes en el vector binario pBinAR Hyg (DSM 9505).

2. Cepas de bacterias

Para el vector Bluescript y para las construcciones pBinAR Hyg se utilizó la cepa DH5\alpha de E. coli (de Bethesda Research Laboratories, Gaithersburgh, EE.UU.). Para la excisión in vivo se utilizó la cepa XL1-Blue de E. coli.

La transformación de los plásmidos en la plantas de patata se llevó a cabo con ayuda de la cepa C58C1 pGV2260 de Agrobacterium tumefaciens (Deblaere y colaboradores, Nucl. Acids Res. 13 (1985), 4.777-4.778).

3. Transformación de Agrobacterium tumefaciens

La transferencia del ADN se efectuó mediante transformación directa de acuerdo con el método de Höfgen & Willmitzer (Nucl. Acids Res. 16 (1988), 9.877). El ADN plasmídico de las agrobacterias transformadas se aisló de acuerdo con el método de Birnboim & Doly (Nucl. Acids Res. 7 (1979), 1.513-1.523) y, después de una apropiada disociación por restricción, se analizó por electroforesis en gel.

4. Transformación de patatas

Diez pequeñas hojas heridas con un bisturí de un cultivo estéril de patata (Solanum tuberosum L.cv Desiree) se colocaron en 10 ml de un medio MS (Murashige & Skoog, Physiol. Plant. 15 (1962), 473) con 2% de sacarosa, que contenía 50 \mul de un cultivo durante la noche de Agrobacterium tumefaciens, que había crecido bajo selección. Después de un ligero sacudimiento durante 3-5 minutos, se efectuó una incubación adicional durante 2 días en la oscuridad. Después de esto las hojas se colocaron para la inducción de callos sobre un medio MS con 1,6% de glucosa, 5 mg/l de ácido naftil-acético, 0,2 mg/l de bencil-amino-purina, 250 mg/l de claforán, 50 mg/l de kanamicina, y 0,80% de Bacto-agar. Después de una incubación durante una semana a 25ºC y 3.000 Lux, las hojas se colocaron para la inducción de los brotes sobre un medio MS con 1,6% de glucosa, 1,4 mg/ml de zeatina-ribosa, 20 mg/l de ácido naftil-acético, 20 mg/l de ácido giberélico, 250 mg/l de claforán, 50 mg/l de kanamicina, y 0,80% de bacto-agar.

5. Marcación radiactiva de fragmentos de ADN

La marcación radiactiva de fragmentos de ADN se llevó a cabo con ayuda de un estuche de marcación de ADN con cebadores aleatorios [DNA-Random Primer Labelling Kit] de Boehringer (Alemania) de acuerdo con los datos del fabricante.

6. Determinación de la actividad de una sintasa de almidón

La determinación de la actividad de una sintasa de almidón se efectuó por determinación de la incorporación de ^{14}C-glucosa procedente de ADP[^{14}C-glucosa] en un producto insoluble en metanol/KCl tal como se describió en la cita de Denyer y Smith (Planta 186 (1992), 609-617).

7. Detección de sintasas de almidón solubles en el gel natural

A fin de detectar la actividad de sintasas de almidón solubles mediante electroforesis no desnaturalizante en gel se disgregaron muestras de tejidos de tubérculos de patata en Tris-HCl 50 mM, pH 7,6, DTT 2 mM, EDTA 2,5 mM, 10% de glicerol y PMSF 0,4 mM. La electroforesis se llevó a cabo en una cámara MiniProtean II (de BioRAD). La concentración de monómeros de los geles de 1,5 mm de espesor fue de 7,5% (peso / volumen), y como tampón tanto para el gel así como también para la elución sirvió Tris-glicina 25 mM, de pH 8,4. Se aplicaron las mismas cantidades de extracto de proteínas y se separaron durante 2 h con 10 mA por cada gel.

A continuación, se efectuó la incubación de los geles para la medición de la actividad en Tricina-NaOH 50 mM, pH 8,5, acetato de potasio 25 mM, EDTA 2 mM, DTT 2 mM, ADP-glucosa 1 mM, amilopectina al 0,1% (peso / volumen) y citrato de sodio 0,5 M. Los glucanos formados se tiñeron con una solución de Lugol.

8. Analítica del almidón

El almidón formado por las plantas transgénicas de patata se caracterizó por los siguientes métodos:

a) Determinación del contenido de fosfatos

En el almidón de patata pueden estar fosforiladas algunas unidades de glucosa junto a los átomos de carbono en las posiciones C3 y C6. A fin de determinar el grado de fosforilación en la posición C6 de la glucosa, se hidrolizaron 100 mg de almidón en 1 ml de HCl 0,7 M durante 4 horas a 95ºC (Nielsen y colaboradores, Plant Physiol. 105 (1994), 111-117). Después de la neutralización con KOH 0,7 M, para la determinación de glucosa-6-fosfato se sometieron 50 \mul del material hidrolizado a un ensayo óptico-enzimático. La modificación de la absorción de la tanda de ensayo (imidazol / HCl 100 mM; MgCl_{2} 10 mM; NAD 0,4 mM; 2 unidades de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa procedente de Leuconostoc mesenteroides; a 30ºC) se vigiló a 334 nm.

b) Análisis de la distribución de las longitudes de las cadenas laterales

Para el análisis de las cadenas laterales de la molécula de almidón se digirió 1 ml de una solución de almidón al 0,1% con aproximadamente 1 unidad de isoamilasa durante una noche a 37ºC en un tampón de citrato de Na 100 mM, pH 4,0 (Y.C. Lee, Analytical Biochemistry 189 (1990), 151-162). La separación de las cadenas individuales de glucanos se efectuó con ayuda de un gradiente complejo por medio de una HPLC [cromatografía en fase líquida de alto rendimiento] (columna PA1; agente eluyente NaOH 150 mM con un gradiente de acetato de sodio).

c) Determinación del tamaño de granos

La determinación del tamaño de granos se llevó a cabo con un foto-sedimentómetro del tipo "Lumosed" de Retsch GmbH, Alemania. A este fin se suspendieron 0,2 g de almidón en aproximadamente 150 ml de agua y se midieron inmediatamente. El programa suministrado conjuntamente por el fabricante calculó el diámetro medio de los granos de almidón basándose en la suposición de un densidad promedia del almidón de 1,5 g/l.

d) Propiedades de engrudamiento

Las curvas de engrudamiento del almidón se registraron con un viscógrafo E de Brabender oHG, Alemania, o con un Rapid Visco Analyser de Newport Scientific Pty ltd, Investment Support Group, Warriewood NSW 2102, Australia. En el caso de la utilización del viscógrafo E, una suspensión de 30 g de almidón en 450 ml de agua se sometió al siguiente programa de calentamiento: calentar de 50ºC a 96ºC con 3º/min., mantener la temperatura constante durante 30 minutos, enfriar a 30ºC con 3º/min., y mantener la temperatura constante nuevamente durante 30 minutos. El perfil de temperaturas proporcionó unas propiedades características de engrudamiento.

En el caso de una medición mediante el Rapid Visco Analyser, una suspensión de 2 g de almidón en 25 ml de agua se sometió al siguiente programa de calentamiento: suspender durante 50 s a 50ºC, calentar de 50ºC a 95ºC con 12º/min., mantener constante la temperatura durante 2,5 minutos, enfriar a 50ºC con 16,4º/min., y mantener la temperatura constante nuevamente durante 2 minutos. El perfil de temperaturas proporcionó la viscosidad máxima y la viscosidad final, así como la temperatura de engrudamiento.

Ejemplo 1

Identificación, aislamiento y caracterización de dos ADNc=s, que codifican las isoformas SSS B y GBSS II de las sintasas de almidón procedentes de Solanum tuberosum

Ciertamente ya se detectaron proteínas de SSS en toda una serie de especies de plantas, entre otras en plantas de patata, y se describieron secuencias de ADNc para proteínas de SSS procedentes de arroz (Baba y colaboradores, véase más arriba), pero hasta ahora no se ha conseguido la purificación de estas proteínas a partir de plantas de patata o de otras plantas, ni tampoco la identificación de las correspondientes secuencias de ADNc. La problemática en el caso del aislamiento de tales secuencias de ADN consiste en que la purificación homogénea de sintasas de almidón solubles no ha tenido éxito hasta ahora por motivos técnicos, a pesar de que los numerosos intentos. Las sintasas solubles se purifican concomitantemente en todas las etapas de purificación con la enzima ramificadora y otras impurezas. Por lo tanto, estas proteínas no son accesibles hasta ahora para la determinación de secuencias parciales de aminoácidos. Por consiguiente es muy difícil identificar secuencias de ADNc por hibridación con oligonucleótidos degenerados, deducidos a partir de la secuencia de aminoácidos. Asimismo, por los mismos motivos, no existe la posibilidad de desarrollar anticuerpos que reconozcan específicamente a estas enzimas y que, por consiguiente, se pudieran emplear para el examen minucioso de bancos de expresión.

El aislamiento de secuencias de ADN, que codifican proteínas de SSS procedentes de patata, con ayuda de la hibridación con muestras heterólogas, que codifican sintasas de almidón solubles procedentes de otras especies de plantas, presupone que exista una homología lo suficientemente alta y al mismo tiempo que no se presenten homologías significativas con otras secuencias de ADN codificadoras. En el caso de la única secuencia heteróloga de ADN que está a disposición procedente de arroz (Baba y colaboradores, véase más arriba), se sabía, sin embargo, que ésta tiene altas homologías con las sintasas de almidón fijadas a granos de almidón procedentes de arroz, así como con la GBSS I, y por lo tanto presuntamente también con la GBSS II, procedentes de patata. A causa de estas altas homologías con las GBSS I y II, al escrutar a fondo los bancos de ADNc se llega a una hibridación cruzada con los ADNc's de las GBSS I y II. Por lo tanto, la identificación de ADNc's, que codifican proteínas de SSS sólo se puede conseguir por medio de un escrutinio diferencial. Esto presupone, sin embargo, que estén a disposición secuencias de ADNc para las proteínas de GBSS I y II procedentes de patata. Sin embargo, las secuencias de ADNc, que codifican la GBSS II procedente de patata, no estaban accesibles hasta ahora.

A continuación, se describe el aislamiento de un ADNc que codifica una sintasa de almidón soluble procedente de patata.

Para esto, se amplificó primeramente un fragmento de ADN de un ADNc procedente de arroz, que codifica una sintasa de almidón soluble (Baba y colaboradores, Plant Physiol. 103 (1993): 565-573), con ayuda de la "reacción en cadena de la polimerasa" (PCR, en inglés "Polymerase chain reaction"). Como cebadores se utilizaron en este caso los siguientes oligonucleótidos:

Oligonucleótido 1: 5'-ACAGGATCCTGTGCTATGCGGCGTGTGAAG-3' (Seq ID No. 14)

Oligonucleótido 2: 5'-TTGGGATCCGCAATGCCCACAGCATTTTTTTC-3' (Seq ID No. 15)

El fragmento que resultó de la PCR tenía una longitud de 1.067 pb. Este fragmento de ADN se utilizó más tarde como muestra heteróloga para la identificación de secuencias de ADNc que codifican sintasas de almidón solubles procedentes de patata.

Para la producción de una biblioteca de ADNc, se aisló un poli(A^{+})-ARNm a partir de tubérculos de patata de la variedad de patata "Berolina". Partiendo del poli(A^{+})-ARNm, se produjo un ADNc de acuerdo con el método de Gubler y Hoffmann (1983, Gene 25:263-269), mediando utilización de un cebador Xho I-oligo d(t)_{18},. Después de una adición del engarzador EcoR I, se cortó posteriormente con Xho I y se ligó de manera orientada en un vector Lambda ZAP II (de Stratagene) cortado con EcoR I y Xho I.

500.000 calvas de una biblioteca de ADNc construida de esta manera, se investigaron con ayuda de la muestra heteróloga procedente de arroz para descubrir secuencias de ADN, que son homólogas con ésta. Puesto que la muestra utilizada procedente de arroz tiene una fuerte hibridación cruzada con diferentes secuencias procedentes de patata, no era posible una identificación directa de moléculas de ADNc, que codifican sintasas de almidón solubles. A partir de comparaciones de homología se sabía que la secuencia de ADNc, que codifica la proteína de SSS de arroz, tiene una alta homología con el ADNc de GBSS I ya aislado desde la patata. Puesto que las GBSS I y GBSS II tienen fuertes homologías en otros organismos, se tenía que suponer que la muestra procedente de arroz tiene también una alta homología con las secuencias de GBSS II procedentes de patata. A fin de hacer posible una identificación de secuencias de ADNc, que codifican una sintasa de almidón soluble procedente de patata, era necesario, por lo tanto, disponer de unas secuencias, que codifiquen las GBSS I y II procedentes de patata. Ya se habían descrito secuencias de ADN, que codifican la GBSS I procedente de patata, pero no se había descrito ninguna que codifique la GBSS II procedente de patata. Por lo tanto, se aisló primeramente un ADNc que codifica GBSS II procedente de patata.

Para ello, se aislaron proteínas fijadas a granos de almidón a partir de almidón de patata. El aislamiento se efectuó mediante electroelución en un dispositivo de elución, que estaba construido análogamente al aparato eluyente "Model 422 Electro-Eluter" (de BIORAD Laboratories Inc., EE.UU.), pero que tenía un volumen esencialmente mayor (de aproximadamente 200 ml). Se recogieron 25 g de un almidón seco en el tampón de elución (volumen final 80 ml). La suspensión se calentó a 70-80ºC en un baño de agua. A continuación, se añadieron 72,07 g de urea (concentración final 8 M) y se completó el volumen con tampón de elución hasta 180 ml. El almidón se disolvió mediando agitación constante y adquirió una consistencia a modo de engrudo. Las proteínas se electroeluyeron durante una noche desde la solución con ayuda del dispositivo de elución (100 V; 50-60 mA). Las proteínas eluidas se extrajeron cuidadosamente desde el aparato. Los materiales en suspensión se eliminaron mediante una breve centrifugación. El material sobrenadante se dializó 2-3 veces, cada vez durante una hora, a 4ºC frente a un tampón de diálisis. A continuación, se determinó el volumen de la solución de proteínas. Las proteínas se precipitaron por adición de sulfato de amonio (concentración final 90%). La adición se efectuó mediando agitación constante a 0ºC. Las proteínas precipitadas se sedimentaron por centrifugación y se recogieron en un tampón para proteínas.

Las proteínas aisladas se utilizaron para la producción de anticuerpos policlonales de conejos, que reconocen específicamente a proteínas fijadas a granos de almidón. Con ayuda de tales anticuerpos se examinó minuciosamente a continuación, de acuerdo con métodos clásicos, una biblioteca de expresión de ADNc para descubrir secuencias, que codifiquen las proteínas fijadas a granos de almidón. La biblioteca de expresión se produjo como ya se describió más arriba.

Los clones de fagos positivos se purificaron aún más mediando aplicación de procedimientos clásicos. Con ayuda del método de excisión in vivo se obtuvieron a partir de clones de fagos positivos unos clones de E. coli, que contienen un plásmido pBluescript bicatenario con la respectiva inserción de ADNc. Después de haber comprobado el tamaño y el modelo de restricción de las inserciones, se analizaron adicionalmente unos clones apropiados. Un clon cGBSSII se identificó en este caso como un clon, que codifica la proteína de GBSSII.

A partir de este clon se aisló el plásmido pGBSSII (véase la Figura 5) y se determinó su inserción de ADNc mediante procedimientos clásicos por medio del método de didesoxi (Sanger y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5.463-5.467). La inserción tiene una longitud de 1.925 pb y constituye solamente una secuencia parcial de ADNc. La secuencia de nucleótidos se indica bajo Seq ID No. 5. Las comparaciones de secuencias mostraron que también esta secuencia de ADN tenía en diferentes zonas una fuerte homología con el ADNc procedente de arroz, que codifica la sintasa de almidón soluble. Por lo tanto, estas secuencias también se hibridan al examinar minuciosamente una biblioteca de ADNc con la muestra procedente de arroz.

La inserción de este plásmido se utilizó más tarde en el examen minucioso de una biblioteca de ADNc procedente de tubérculos de patata como muestra, a fin de identificar secuencias que codifiquen proteínas de GBSS II.

Junto al clon cGBSSII, al realizar el examen minucioso de la biblioteca de expresión con los anticuerpos policlonales, que están dirigidos contra proteínas fijadas a granos de almidón, se aislaron unos clones, que tenían las inserciones de ADNc, que codifican la GBSS I de patata. De uno de estos clones, el cGBSSI, se aisló el plásmido pGBSSI, y se determinó la secuencia de la inserción de ADNc. Ésta coincidía ampliamente con las secuencias de ADN ya conocidas, que codifican la GBSS I procedente de patata (Visser y colaboradores, Plant Sci. 64 (1989), 185-192; van der Leij y colaboradores, Mol. Gen. Genet. 228 (1990), 240-248). Esta inserción de ADNc, contenida en el plásmido pGBSS I, se utilizó, por lo tanto, más tarde como muestra en el examen minucioso de una biblioteca de ADNc procedente de tubérculos de patata, a fin de identificar secuencias, que codificasen proteínas de GBSS I.

La biblioteca antes descrita de ADNc procedente de patata se examinó minuciosamente primeramente para descubrir secuencias, que codifiquen la GBSS I o GBSS II procedente de patata. A este fin, las calvas de fagos se transfirieron a filtros de nitrocelulosa, el ADN se desnaturalizó por tratamiento con NaOH, los filtros se neutralizaron y el ADN se fijó sobre los filtros mediante tratamiento en caliente. Los filtros se hibridaron previamente en NaHPO_{4} 0,25 M, de pH 7,2, NaCl 0,25 M, 7% de SDS, EDTA 1 mM, 25% de formamida, 10% de PEG, durante 2 horas a 42ºC. A continuación, los filtros se hibridaron en NaHPO_{4} 0,25 M, de pH 7,2, NaCl 0,25 M, 7% de SDS, EDTA 1 mM, 25% de formamida, 10% de PEG, después de haber añadido la correspondiente muestra marcada radiactivamente durante una noche a 42ºC. Como muestra se utilizó, por una parte, la inserción de ADNc procedente del plásmido pGBSSII, y por otra parte, la inserción de ADN procedente del plásmido pGBSSI.

Los filtros se lavaron a continuación 2 veces durante 30 min en 0,1 x SSC, 0,5 % de SDS, a 65ºC y se expusieron sobre películas de rayos X.

Paralelamente, filtros de la misma biblioteca de ADNc se hibridaron con la muestra de ADNc procedente de arroz, marcada radiactivamente, que se había producido tal como se describió más arriba, en las mismas condiciones que se han descrito para las GBSS I y II. El lavado de los filtros se efectuó en este caso 2 veces durante 30 min a 40ºC con 2 x SSC, SDS al 0,5%. Los clones de fagos, que no se hibridaron con la GBSS I o GBSS II procedente de patata, pero sí con el ADNc procedente de arroz, se purificaron adicionalmente mediando aplicación de procedimientos clásicos. Con ayuda del método de excisión in vivo se obtuvieron a partir de clones de fagos positivos unos clones de E. coli, que contienen un plásmido pBluescript bicatenario con la respectiva inserción de ADNc. Después de haber comprobado el tamaño y el modelo de restricción de las inserciones, los clones apropiados se sometieron a un análisis de secuencias.

\newpage

Ejemplo 2

Análisis de la secuencia de la inserción de ADNc del plásmido pSSSB

A partir de un clon de E. coli obtenido correspondientemente al Ejemplo 1 se aisló el plásmido pSSSB (véase la Figura 2), y se determinó su inserción de ADNc por procedimientos clásicos mediante el método de didesoxinucleótidos (Sanger y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5.463-5.467). La inserción tiene una longitud de 1.758 pb y constituye un ADNc parcial. La secuencia de nucleótidos se indica bajo Seq ID No. 3. La correspondiente secuencia de aminoácidos se representa bajo Seq ID No. 4.

Ejemplo 3

Aislamiento del ADNc de plena longitud, que codifica la isoforma GBSS II de la sintasa de almidón fijada a granos de almidón procedente de Solanum tuberosum

Un banco de expresión de ADNc específico para las hojas, procedente de Solanum tuberosum L. cv. Désirée (Ko\betamann y colaboradores, Planta 186 (1992), 7-12) se examinó minuciosamente de acuerdo con procedimientos clásicos mediante hibridación con un fragmento 5' de la inserción de ADNc del plásmido pGBSS II (de 1,9 kb) para descubrir clones de plena longitud. Seguidamente se pudo aislar el plásmido pGBSS II-VK, que contiene una inserción de ADNc con una longitud de aproximadamente 2,8 kb.

Ejemplo 4

Análisis de la secuencia de la inserción de ADNc del plásmido pGBSS II-VK

A partir de un clon de E. coli, obtenido correspondientemente al Ejemplo 3, se aisló el plásmido pGBSS II-VK y se determinó su inserción de ADNc de acuerdo con procedimientos clásicos mediante el método de didesoxinucleótidos (Sanger y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5.463-5.467). La inserción tiene una longitud de 2,8 kb. La secuencia de nucleótidos se indica bajo Seq ID No. 7 y abarca, junto a zonas flanqueadoras, la región total que codifica la proteína de GBSSII de patata. El peso molecular de la proteína, deducido a partir de la secuencia de aminoácidos, es de aproximadamente 85,1 kD.

Ejemplo 5

Aislamiento del ADNc de plena longitud, que codifica la isoforma SSS B de la sintasa de almidón soluble procedente de Solanum tuberosum

Un banco de expresión de ADNc específico para las hojas, procedente de Solanum tuberosum L. cv. Désirée (Ko\betamann y colaboradores, Planta 186 (1992), 7-12) se examinó minuciosamente de acuerdo con procedimientos clásicos mediante hibridación con un fragmento 5' de la inserción de ADNc del plásmido pSSS B (de 1,6 kb) para descubrir clones de plena longitud. Seguidamente se pudo aislar el plásmido pSSS B-VK, que contiene una inserción de ADNc con una longitud de aproximadamente 2,3 kb.

Ejemplo 6

Análisis de la secuencia de la inserción de ADNc del plásmido pSSS B-VK

A partir de un clon de E. coli, obtenido correspondientemente al Ejemplo 5, se aisló el plásmido pSSS B-VK y se determinó su inserción de ADNc por procedimientos clásicos mediante el método de didesoxinucleótidos (Sanger y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5.463-5.467). La inserción tiene una longitud de 2,3 kb. La secuencia de nucleótidos se indica bajo Seq ID No. 9 y abarca, junto a secuencias flanqueadoras, toda la región que codifica la isoforma B de la sintasa de almidón soluble procedente de patata. El peso molecular de la proteína, deducido a partir de la secuencia de aminoácidos, es de aproximadamente 78,6 kD.

Ejemplo 7

Identificación, aislamiento y caracterización de un ADNc, que codifica la isoforma SSS A de la sintasa de almidón soluble procedente de Solanum tuberosum

A partir de una comparación de secuencias entre las secuencias conocidas hasta ahora, que codifican sintasas de almidón solubles y fijadas a granos de almidón, procedentes de plantas (véase la Figura 7), se podía observar que hay tres zonas fuertemente conservadas entre las diferentes proteínas (zonas (I), (II) y (III) en la Figura 7).

A fin de aislar una sintasa de almidón soluble a partir de patata, se escogieron estas tres zonas, a fin de producir anticuerpos peptídicos policlonales. Para ello se produjeron los tres polipéptidos sintéticos con las siguientes secuencias de aminoácidos:

\newpage

péptido 1:	NH_{2}-PWSKTGGLGDVC-COOH	(Seq ID No. 16)
péptido 2:	NH_{2}-PSRFFEPCGLNQLY-COOH	(Seq ID No. 17)
péptido 3:	NH_{2}-GTGGLRDTVENC-COOH	(Seq ID No. 13)

Estos péptidos se acoplaron al vehículo (en inglés "carrier") de la KLH (hemocianina de lapa de bocallave, en inglés Akeyhole limpet hemocyanin) y a continuación se utilizaron para la producción de anticuerpos policlonales en conejos (de Eurogentec, Seraing, Bélgica).

Los anticuerpos resultantes se designaron de la siguiente manera:

anti-SS1	anticuerpo policlonal contra el péptido 1
anti-SS2	anticuerpo policlonal contra el péptido 2
anti-SS3	anticuerpo policlonal contra el péptido 3.

Los anticuerpos se investigaron en cuanto a su especificidad con sintasas de almidón solubles purificadas, procedentes de patata.

La purificación de las sintasas de almidón solubles se efectuó en este caso de la siguiente manera:

2,5 kg de patatas se trataron en 2 litros de un tampón A. Después de haber separado el almidón mediante centrifugación a 1.000 g durante 5 min., el extracto de proteínas se fijó a un material de columna DEAE-FastFlow (de Pharmacia LKB) (equilibrado con un tampón B). Después de haber lavado la columna con un volumen de tampón B 5 veces mayor que el de la columna, se eluyeron las proteínas fijadas con NaCl 300 mM en el tampón B. Las proteínas eluidas se recogieron en fracciones, y las fracciones con una alta actividad de sintasa de almidón se reunieron. Las fracciones reunidas se desalinizaron por cromatografía a través de una columna de filtración en gel (G25), que se había equilibrado con el tampón B. El material eluido se mezcló con 1 volumen de citrato de sodio 1 M, Tris-HCl 50 mM, pH 7,6, DTT 2,5 mM, EDTA 2 mM. La solución de proteínas se aplicó sobre una columna de amilosa y resina (columna AR) equilibrada con un tampón C. La columna se lavó con un volumen de tampón C 20 veces mayor que el de la columna. Las proteínas fijadas se eluyeron a continuación con el tampón B.

Las fracciones, que tenían una alta actividad de sintasa de almidón, se reunieron y se desalinizaron de nuevo con ayuda de una filtración a través de gel a través de una columna G25.

A continuación, las fracciones con una alta actividad de sintasa de almidón se aplicaron sobre una columna MonoQ equilibrada con el tampón B. La columna se lavó con un volumen de tampón B 5 veces mayor que el de la columna. Las proteínas fijadas se eluyeron con ayuda de un gradiente lineal de NaCl de 0 - 300 mM y se recogieron en fracciones.

El análisis de las fracciones en lo que se refiere a la actividad de sintasa de almidón y al peso molecular se efectuó con ayuda de diferentes métodos:

a)

análisis de las fracciones sobre un gel de poli(acrilamida) natural

b)

análisis de las fracciones sobre un gel desnaturalizador de SDS-poli(acrilamida) y una subsiguiente tinción con plata

c)

determinación de la actividad de sintasa de almidón mediante incorporación de ADP-glucosa marcada radiactivamente (de Amersham, Reino Unido) en un almidón neosintetizado.

d)

Análisis de las fracciones en un borrón de transferencia Western.

Para un análisis por borrón de transferencia Western, 50 \mug, 5 \mug y 0,5 \mug de proteínas de un extracto bruto de proteínas, junto a 15 \mug de proteínas de las fracciones, que se habían eluido desde la columna DEAE-FastFlow, 10 \mug de proteínas de las fracciones, que se habían eluido desde la columna AR y 3 \mug de proteínas de las fracciones, que se habían eluido desde la columna MonoQ, se separaron por electroforesis sobre un gel de SDS-poli(acrilamida), Las proteínas se transfirieron con ayuda del método de borrón de transferencia eléctrica semiseca (en inglés "Semidry-Elektroblot") a una membrana de nitrocelulosa.

La identificación de las proteínas, que se habían reconocido por los anticuerpos anti-SS1, anti-SS2 o anti-SS3, se efectuó con ayuda del "Blotting detection kit for rabbit antibodies RPN 23" (estuche de detección por transferencia de borrón para anticuerpos de conejo RPN 23) (de Amersham, Reino Unido) de acuerdo con los datos del fabricante.

Se llevaron a cabo paralelamente tres análisis por transferencia de borrón Western con los anticuerpos policlonales anti-SS1, anti-SS2 y anti-SS3 más arriba descritos. En este caso, se puso de manifiesto que el anticuerpo anti-SS1 reconocía específicamente a las GBSS I y GBSS II, y que el anticuerpo anti-SS2 no tenía ninguna especificidad. Solamente el anticuerpo anti-SS3 reconocía junto a las GBSS I y GBSS II, en el borrón de transferencia Western, específicamente a nuevas proteínas, en particular proteínas con unos pesos moleculares de 120-140 kd.

El anticuerpo anti-SS3 se utilizó a continuación, a fin de examinar minuciosamente una biblioteca de ADNc procedente de tubérculos de patata para descubrir secuencias, que codifiquen sintasas de almidón solubles procedentes de patata. Para ello se utilizó una biblioteca de ADNc, que se había producido tal como se describe en el Ejemplo 1. Para el análisis de las calvas de fagos, éstas se transfirieron a filtros de nitrocelulosa, que se habían incubado previamente durante 30-60 min. en una solución de IPTG 10 mM, y a continuación se secaron sobre un papel de filtro. La transferencia se efectuó durante 3 h a 37ºC. A continuación, los filtros se incuban durante 30 min a la temperatura ambiente en un reactivo de bloqueo y se lavan dos veces durante 5-10 min. en un tampón TBST. Los filtros se agitaron con el anticuerpo policlonal anti-SS3 en una dilución apropiada durante 1 h a la temperatura ambiente o durante 16 h a 4ºC. La identificación de las calvas, que expresaron una proteína, que era reconocida por el anticuerpo anti-SS3, se efectuó con ayuda del ABlotting detection kit for rabbit antibodies RPN 23'' (de Amersham, Reino Unido) de acuerdo con los datos del fabricante.

Los clones de fagos de la biblioteca de ADNc, que expresaron una proteína, que había sido reconocida por el anticuerpo anti-SS3, se purificaron adicionalmente mediando aplicación de procedimientos clásicos. Con ayuda del método de excisión in vivo (de Stratagene) se obtuvieron a partir de clones de fagos positivos unos clones de E. coli, que contienen un plásmido pBluescript II SK bicatenario, con la respectiva inserción de ADNc entre el sitio de corte con EcoRI y con Xho I del poliengarzador. Después de haber comprobado el tamaño y el modelo de restricción de las inserciones, un clon apropiado se sometió a un análisis de la secuencia.

Ejemplo 8

Análisis de la secuencia de la inserción de ADNc del plásmido pSSSA

A partir de un clon de E. coli, obtenido correspondientemente al Ejemplo 7, se aisló el plásmido pSSSA (véase la Figura 1), y se determinó su inserción de ADNc por procedimientos clásicos mediante el método de didesoxinucleótidos (Sanger y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5.463-5.467). La inserción tiene una longitud de 2.303 pb. La secuencia de nucleótidos se indica bajo Seq ID No. 1. La correspondiente secuencia de aminoácidos se representa bajo Seq ID No. 2.

Un análisis de secuencias y una comparación entre secuencias con secuencias de ADN conocidas mostró que la secuencia representada bajo Seq ID No. 1 es nueva, y que abarca una región codificadora parcial, que codifica una proteína que tiene una homología con sintasas de almidón procedentes de diversos organismos. La proteína codificada por esta inserción de ADNc o por secuencias hibridantes se designa en el marco de esta solicitud como SSSA.

Esta secuencia de ADN se diferencia de la secuencia de ADN representada bajo Seq ID No. 2, la cual codifica asimismo una sintasa de almidón soluble de patata, y no se pudo aislar con el método descrito dentro del Ejemplo 1 desde una biblioteca de ADNc de tubérculos de patata.

Ejemplo 9

Aislamiento del ADNc de plena longitud, que codifica la isoforma SSSA de la sintasa de almidón soluble procedente de Solanum tuberosum

Un banco de expresión de ADNc específico para las hojas, procedente de Solanum tuberosum L. cv. Désirée (Ko\betamann y colaboradores, Planta 186 (1992), 7-12) se examinó minuciosamente de acuerdo con procedimientos clásicos mediante hibridación con un fragmento 5' de la inserción de ADNc del plásmido pSSSA (de 2,3 kb) para descubrir clones de plena longitud. Como consecuencia de ello, se pudo aislar un clon, que contenía una inserción de ADNc más larga en aproximadamente 1,86 kb en la región 5'. La inserción de ADNc tiene una longitud total de aproximadamente 4,16 kb.

Ejemplo 10

Análisis de la secuencia de la inserción de ADNc del plásmido pSSSA-VK

A partir de un clon de E. coli, obtenido correspondientemente al Ejemplo 9, se aisló el plásmido pSSSA-VK y se determinó su inserción de ADNc por procedimientos clásicos con ayuda del método de didesoxinucleótidos (Sanger y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5.463-5.467). La inserción tiene una longitud de 4,16 kb. La secuencia de nucleótidos se indica bajo Seq ID No. 11. La correspondiente secuencia de aminoácidos se indica bajo Seq ID No. 12. El peso molecular de la proteína de SSSA, deducido a partir de la secuencia de aminoácidos es de aproximadamente 135 kD.

Ejemplo 11

Construcción del plásmido p35S-anti-SSSA e introducción del plásmido en el genoma de plantas de patata

A partir del plásmido pSSSA, con ayuda de las endonucleasas de restricción Xba I y Asp 718 se aisló un fragmento de ADN con un tamaño de 2,1 kb, que abarca la región que codifica la la isoforma A de la sintasa de almidón soluble de patata, y se ligó en el vector pBinAR Hyg (DSM 9505) cortado con Xba I y Asp 718.

Por medio de la inserción del fragmento de ADNc resulta una casete de expresión, que está constituida por los fragmentos A, B y C de la siguiente manera (véase la Figura 3):

El fragmento A (de 529 pb) contiene el promotor 35 S del virus de mosaico de coliflor (CaMV del inglés Cauliflower Mosaic Virus ). El fragmento abarca los nucleótidos 6.909 hasta 7.437 del CaMV (Franck y colaboradores, Cell 21 (1980), 285-294).

El fragmento B contiene, junto a zonas flanqueadoras, la región codificadora de proteínas de la isoforma A de la sintasa de almidón soluble procedente de Solanum tuberosum. Ésta se aisló, tal como se describió más arriba, como un fragmento de Xba I y Asp718 a partir de pSSSA, y se fusionó en la orientación antisentido junto al promotor 35 S en pBinAR Hyg.

El fragmento C (de 192 pb) contiene la señal de poliadenilación del gen 3 del ADN T del plásmido Ti pTiACH5 (Gielen y colaboradores, EMBO J. 3 (1984), 835-846).

El tamaño del plásmido p35S-anti-SSSA es de aproximadamente 13 kb.

El plásmido se transfirió, con ayuda de una transformación mediada por agrobacterias, a plantas de patata, tal como se describió más arriba. A partir de las células transformadas se regeneraron plantas enteras.

Como resultado de la transformación, las plantas de patatas transgénicas mostraron una disminución de la actividad de la isoforma A de la sintasa de almidón soluble (compárese la Figura 8).

El almidón formado por estas plantas se diferencia del almidón sintetizado en plantas de tipo silvestre, en su contenido de fosfatos, en la viscosidad de las soluciones acuosas, en las propiedades de engrudamiento y en el tamaño medio de los granos de almidón. Los resultados se representan en la Tabla I.

El contenido de fosfatos del almidón producido en las plantas transgénicas está situado en por lo menos un 30%, de manera preferida en un 50%, en particular en un 70%, por encima de los valores del almidón sintetizado en plantas de tipo silvestre.

La viscosidad final del almidón procedente de plantas con SSS A "antisentido" muestra unos valores más bajos en por lo menos un 10%, de manera preferida en un 20%, en particular en un 30%, en comparación con plantas de tipo silvestre.

La temperatura de engrudamiento, la viscosidad máxima y el tamaño medio de los granos de almidón del almidón modificado, están situados manifiestamente por debajo de los valores del almidón formado por plantas de tipo silvestre (véase la Tabla I).

TABLA I

Características del almidón procedente de plantas de patata de tipo silvestre y de plantas de patata con SSS A antisentido

	Tipo silvestre	Linaje 25	Linaje 39
Contenido de fosfatos [nmol mg^{-1} almidón^{-1}]	8,50 \pm 0,4	14,61 \pm 0,3	14,54 \pm 0,2
Temperatura de engrudamiento [ºC]	69,5	67,4	66,2
Viscosidad máxima [cP]	4.044	3.720	3.756
Viscosidad final a 50ºC [cP]	3.312	2.904	2.400
Tamaño medio de los granos de almidón	29	24	27

Ejemplo 12

Construcción del plásmido p35S-anti-SSB e introducción del plásmido en el genoma de plantas de patata

A partir del plásmido pSSSB, con ayuda de las endonucleasas de restricción Xho I y Spe I se aisló un fragmento de ADN con un tamaño de 1,8 kb, que abarca la región que codifica la isoforma B de la sintasa de almidón soluble de patata, y se ligó en el vector pBinAR Hyg (DSM 9505) cortado con SmaI.

Por medio de la inserción del fragmento de ADNc resulta una casete de expresión, que está constituido por los fragmentos A, B y C (véase la Figura 4):

El fragmento A (de 529 pb) contiene el promotor 35 S del virus de mosaico de coliflor (CaMV). El fragmento abarca los nucleótidos 6.909 hasta 7.437 del CaMV (Franck y colaboradores, Cell 21 (1980), 285-294).

El fragmento B contiene, junto a las zonas flanqueadoras, una parte de la región codificadora de proteínas de la isoforma B de la sintasa de almidón soluble procedente de Solanum tuberosum. Ésta se aisló, tal como se describió más arriba, como un fragmento de Xho I y Spe I a partir de pSSSB, y se fusionó en una orientación antisentido con el promotor 35 S en pBinAR Hyg.

El fragmento C (de 192 pb) contiene la señal de poliadenilación del gen 3 del ADN T del plásmido Ti pTiACH5 (Gielen y colaboradores, EMBO J. 3 (1984), 835-846).

El tamaño del plásmido p35S-anti-SSSA es de aproximadamente 13 kb.

El plásmido se transfirió, con ayuda de una transformación mediada por agrobacterias, a plantas de patata, tal como se describió más arriba. A partir de las células transformadas se regeneraron plantas enteras.

Como resultado de la transformación, las plantas de patata transgénicas mostraron una disminución de la actividad de la isoforma A de la sintasa de almidón soluble (compárese la Figura 8).

Ejemplo 13

Construcción del plásmido p35S-anti-GBSS II e introducción del plásmido en el genoma de plantas de patata

A partir del plásmido pGBSS II, con ayuda de las endonucleasas de restricción Asp 718 y Sma I se aisló un fragmento de ADN con un tamaño de 1,9 kb, que abarca la región que codifica la la isoforma GBSS II de la sintasa de almidón soluble de patata. Los extremos de los fragmentos se alisaron con la polimerasa de T4 y el fragmento se ligó en el vector pBinAR Hyg (DSM 9505) cortado con SmaI.

Por medio de la inserción del fragmento de ADNc resulta una casete de expresión, que está constituida por los fragmentos A, B y C (véase la Figura 6):

El fragmento A (de 529 pb) contiene el promotor 35 S del virus de mosaico de coliflor (CaMV). El fragmento abarca los nucleótidos 6.909 hasta 7.437 del CaMV (Franck y colaboradores, Cell 21 (1980), 285-294).

El fragmento B contiene, junto a zonas flanqueadoras, una parte de la región codificadora de proteínas de la isoforma GBSS II de la sintasa de almidón soluble procedente de Solanum tuberosum. Ésta se aisló, tal como se describió más arriba, como un fragmento de Asp 718 y Sma I a partir de pSSSB, y después de haber alisado los extremos de los fragmentos, se fusionó en la orientación antisentido con el promotor 35 S en pBinAR Hyg.

El fragmento C (de 192 pb) contiene la señal de poliadenilación del gen 3 del ADN T del plásmido Ti pTiACH5 (Gielen y colaboradores, EMBO J. 3 (1984), 835-846).

El tamaño del plásmido p35S-anti-GBSS II es de aproximadamente 13 kb.

El plásmido se transfirió, con ayuda de una transformación mediada por agrobacterias, a plantas de patata, tal como se describió más arriba. A partir de las células transformadas se regeneraron plantas enteras.

Como resultado de la transformación, las plantas de patatas transgénicas mostraron una disminución de la actividad de la isoforma GBSS II de la sintasa de almidón soluble (compárese la Figura 8).

El almidón producido por estas plantas se diferencia del almidón sintetizado en plantas de tipo silvestre en su contenido de fosfatos, en la viscosidad de las soluciones acuosas, en las propiedades de engrudamiento y en el tamaño medio de los granos de almidón. Los resultados se representan en la Tabla II.

TABLA II

Características del almidón procedente de plantas de patata de tipo silvestre y de plantas de patata con GBSS II "antisentido"

	Tipo silvestre	Linaje 14	Linaje 35	Linaje 44
Contenido de fosfatos [nmol mg^{-1} almidón^{-1}]	6,99 \pm 0,19	4,52 \pm 0,2	4,13 \pm 0,06	3,76 \pm 0,12
Temperatura de engrudamiento [ºC]	64,1	62,55	63,25	63,55
Viscosidad máxima [cP]	4.057	2.831	2.453	2.587
Viscosidad final a 50ºC [cP]	2.849	2.816	2.597	2.587
Tamaño medio de los granos de almidón	37	32	31	32

\newpage

El contenido de fosfatos del almidón formado en las plantas transgénicas está situado en por lo menos un 35%, de manera preferida en un 40%, en particular en un 45%, por debajo los valores del almidón sintetizado en plantas de tipo silvestre.

La viscosidad final del almidón procedente de plantas con GBSS II "antisentido" muestra unos valores más bajos en por lo menos un 30%, de manera preferida en un 35%, en particular en un 40%, en comparación con plantas de tipo silvestre.

La temperatura de engrudamiento y la viscosidad final del almidón modificado están situadas manifiestamente por debajo de los valores del almidón formado por plantas de tipo silvestre. El tamaño medio de los granos de almidón del almidón formado en las plantas transgénicas es manifiestamente menor que el del almidón de tipo silvestre.

Ejemplo 14

Sobreexpresión de las sintasas de almidón solubles SSS A y SSS B en E. coli

Para la sobreexpresión de sintasas de almidón solubles en E. coli se cultivó cepa G6MD2. En este caso, se trata de una mutante, en la que se ha deletado (suprimido), junto al operón glg, también el operón mal. Por lo tanto, éste no posee ni la sintasa de glicógeno (glgA), ni la enzima ramificadora (glgB) ni la AGPasa (glgC), ni tampoco la amilomaltasa (malQ) ni la maltodextrina-fosforilasa (malP), así como tampoco otras proteínas que participan en la metabolización de maltosa. Por este motivo, la mutante G6MD2 no es capaz de sintetizar glicógeno por la vía de la ADP-glucosa ni \alpha-1,4-glucanos partiendo de maltosa.

Las células de esta mutante se transformaron con los clones de ADNc pSSSA-VK o pSSSB-VK. Las células de E. coli que expresan las sintasas de almidón se disgregaron, después de una inducción durante 2 h con IPTG, en Tris-HCl 50 mM, de pH 7,6, 10% de glicerol, EDTA 2 mM, DTT 2 mM, y PMSF 0,4 mM, por medio de ultrasonidos. Como testigo sirvieron células transformadas con pBluescript. La separación de células intactas y del material de las paredes celulares se efectuó mediante una centrifugación durante 10 minutos a 13.000 g, y a continuación se determinó la concentración de proteínas del material sobrenadante. 100 \mug de un extracto de proteínas se añadieron al tampón de reacción (concentración final: tricina-NaOH 50 mM, de pH 8,5, acetato de potasio 25 mM, EDTA 2 mM y DTT 2 mM, ADP-glucosa 1 mM). Para la investigación de la reacción estimulada por citrato (independiente de un "cebador"), se encontraba en el tampón de reacción adicionalmente citrato de sodio 0,5 M, mientras que la reacción dependiente de un "cebador" se ensayó en presencia de 0,02% (peso / volumen) de oligosacáridos de maltosa (Glucidex 19; 1-30 unidades de glucosa). La reacción se llevó a cabo a la temperatura ambiente durante una noche. Los glucanos sintetizados se detectaron con una solución de Lugol y se investigaron por fotometría espectral para la caracterización adicional.

Tanto la isoforma SSS A com también la isoforma SSS B sintetizaron glucanos en la reacción dependiente de un "cebador" (en ausencia de citrato). El valor máximo de absorción del glucano sintetizado por SSS B estaba situado en 614 nm, lo que corresponde a un glucano con aproximadamente 150 unidades de glucosa. El glucano producido por SSS A absorbía a 575 nm, lo que corresponde a la síntesis de glucanos de cadena corta con un grado de polimerización de aproximadamente 50 unidades de glucosa.

En la reacción independiente de un "cebador", es decir la reacción estimulada por citrato, solamente la isoforma SSS B proporcionó un glucano, que absorbía a 612 nm después de tinción con una solución de Lugol. La isoforma SSS A no mostró ninguna actividad en el caso de la reacción independiente de un "cebador" y no sintetizó ningún glucano.

Los extractos proteínicos procedentes de las células transformadas con pBluescript no proporcionaron ningún tipo de productos en las tandas de reacción.

(1) DATOS GENERALES:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Institut fuer Genbiologische Forschung Berlin GmbH

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Ihnestrasse 63

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

LOCALIDAD: Berlín

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Alemania

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

NÚMERO DE CÓDIGO POSTAL: 14195

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TELÉFONO: (030) 8300070

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

TELEFAX: (030) 830000736

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

DESIGNACIÓN DEL INVENTO: Moléculas de ADN que codifican enzimas, que participan en la síntesis de almidón, vectores, bacterias, células de plantas transgénicas y plantas que contienen estas moléculas

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE LAS SECUENCIAS: 17

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

REDACCIÓN LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

SOPORTE DE DATOS: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATORIO: PC-DOS / MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SISTEMA LÓGICO - SOFTWARE: PatentIn Release n1 1.0, versión n1 1.30 (EPA)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2.303 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPÓTESIS: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

PROCEDENCIA ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Solanum tuberosum

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LINAJE: cv Berolina

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: Tejido de tubérculo

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

PROCEDENCIA INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

BIBLIOTECA: Biblioteca de ADNc en pBluescriptSKII+

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 3..2033

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTROS DATOS: /función = "Polimerización de almidón"

\hskip5.3cm

/producto = "Sintasa de almidón"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

1

2

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 677 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2

5

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1758 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc para ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPÓTESIS: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

PROCEDENCIA ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Solanum tuberosum

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LINAJE: cv Berolina

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: Tejido de tubérculo

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

PROCEDENCIA INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

BIBLIOTECA: Biblioteca de ADNc en pBluescriptSKII+

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1..1377

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTROS DATOS: /función = "Polimerización de almidón"

\hskip5.3cm

/producto = "Sintasa de almidón"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3

9

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 459 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1926 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc para ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPÓTESIS: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

PROCEDENCIA ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Solanum tuberosum

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LINAJE: cv Berolina

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: Tejido de tubérculo

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

PROCEDENCIA INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

BIBLIOTECA: Biblioteca de ADNc en pBluescriptSK+

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 2..1675

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTROS DATOS: /función = "Polimerización de almidón"

\hskip5.3cm

 /producto = "Sintasa de almidón"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

14

15

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 558 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

18

19

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2793 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc para ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

PROCEDENCIA ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Solanum tuberosum

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LINAJE: cv Désirée

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: Tejido de hoja

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

PROCEDENCIA INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

BIBLIOTECA: Biblioteca de ADNc en Lambda ZAPII

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 242..2542

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

21

22

23

24

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 767 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

26

27

28

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2360 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

PROCEDENCIA ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Solanum tuberosum

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LINAJE: cv Désirée

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: Tejido de hoja

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

PROCEDENCIA INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

BIBLIOTECA: Biblioteca de ADNc en Lambda ZAPII

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 68..1990

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9

30

32

33

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 641 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

35

36

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4168 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc para ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

PROCEDENCIA ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Solanum tuberosum

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LINAJE: cv Désirée

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: Tejido de hoja

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

PROCEDENCIA INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

BIBLIOTECA: Biblioteca de ADNc en Lambda ZAPII

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 307..3897

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

38

39

40

41

42

43

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1197 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

45

46

47

48

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Thr Gly Gly Leu Arg Asp Thr Val Glu Asn Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: ácido nucleico de otro tipo

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACAGGATCCT GTGCTATGCG GCGTGTGAAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: ácido nucleico de otro tipo

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGGGATCCG CAATGCCCAC AGCATTTTTT TC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Trp Ser Lys Thr Gly Gly Leu Gly Asp Val Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Asn Gln Leu Try}

100

Claims (16)

1. Molécula de ADN que codifica una proteína con la actividad biológica de una sintasa de almidón soluble de la isoforma A (SSSA), seleccionada entre el grupo que consta de

(a)

moléculas de ADN, que codifican una proteína, que abarca la secuencia de aminoácidos representada bajo SEQ ID NO:12;

(b)

moléculas de ADN, que abarcan la secuencia de nucleótidos representada bajo SEQ ID NO:11;

(c)

moléculas de ADN, que se hibridan en condiciones rigurosas con las moléculas de ADN citadas en (a) o (b); y

(d)

moléculas de ADN, que tienen una identidad de secuencias de por lo menos 60% con la molécula de ADN de acuerdo con (b).

2. Molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 1(d), que tiene una identidad de secuencias de más que 80% con una molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 1(a) ó (b).

3. Molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 1(d), que tiene una identidad de secuencias de más que 90% con una molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 1(a) ó (b).

4. Molécula de ADN de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, siendo reconocida la proteína codificada por la molécula de ADN, por un anticuerpo, que está dirigido contra el péptido

NH_{2}-GTGGLRDTVENC-COOH (SEQ ID No. 13).

5. Vector que contiene una molécula de ADN de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Vector de acuerdo con la reivindicación 5, estando unida la molécula de ADN en la orientación del mismo sentido con unos elementos de ADN, que garantizan la transcripción y la síntesis de un ARN traducible en células pro- y eucarióticas.

7. Células hospedantes que contienen un vector de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6.

8. Proteína o fragmento biológicamente activo de ésta, que se ha codificado por una molécula de ADN de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4.

9. Procedimiento para la producción de una proteína de acuerdo con la reivindicación 8 o de un fragmento biológicamente activo de ésta, en el que una célula hospedante de acuerdo con la reivindicación 7 se cultiva en unas condiciones, que permiten la síntesis de la proteína, y la proteína se aísla a partir de las células cultivadas y/o del medio de cultivo.

10. Célula de plantas que contiene una molécula de ADN de acuerdo con una de la reivindicaciones 1 a 4 en combinación con un promotor heterólogo.

11. Planta que contiene células de plantas de acuerdo con la reivindicación 10.

12. Planta de acuerdo con la reivindicación 11, que es una planta útil.

13. Planta de acuerdo con la reivindicación 12, que es una planta que almacena almidón.

14. Planta de acuerdo con la reivindicación 13, que es una planta de patata.

15. Material de reproducción de una planta de acuerdo con una de las reivindicaciones 11 a 14, que contiene células de plantas de acuerdo con la reivindicación 10.

16. Procedimiento para la producción de un almidón, aislándose el almidón a partir de una planta de acuerdo con una de las reivindicaciones 11 a 14.