ES2209134T3 - Silenciamiento de genes. - Google Patents
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Abstract
Un vector para el silenciamiento de la expresión de un gen diana en una célula, que comprende una secuencia de ADN transcribible que tiene una primera secuencia de nucleótidos y una segunda secuencia de nucleótidos, donde dichas secuencias primera y segunda de nucleótidos son complementarias y los nucleótidos de la segunda secuencia están en orden inverso con respecto a la primera, donde dichas secuencias primera y segunda son capaces de proporcionar dentro de la célula un polinucleótido de doble cadena y donde dicha secuencia de ADN transcribible tiene una región de ADN para identificar el gen diana.
Description
Silenciamiento de genes.
Esta invención se refiere al control de la
expresión génica, más particularmente a la inhibición de la
expresión, denominada comúnmente "silenciamiento de
genes".
Se conocen dos métodos principales para la
modulación de la expresión génica. Éstos se denominan en la técnica
"regulación negativa antisentido" y "regulación negativa con
sentido" (también denominada "cosupresión"). Estos dos
métodos conducen a una inhibición de la expresión del gen
diana.
En la regulación negativa antisentido, un ADN que
es complementario a todo o parte de un gen diana endógeno se
inserta dentro del genoma en orientación inversa. Aunque el
mecanismo no se ha esclarecido completamente, una teoría es que la
transcripción de dicho gen antisentido produce un ARNm que es
complementario en secuencia al producto de ARNm transcrito a partir
del gen endógeno: después, ese ARNm antisentido se une con el ARNm
"con sentido" producido de forma natural para formar un dúplex
que inhibe la traducción del ARNm natural en proteínas. No es
necesario que el gen antisentido insertado sea de igual longitud
que la secuencia del gen endógeno: un fragmento es suficiente. El
tamaño del fragmento no parece ser particularmente importante. Se ha
publicado que fragmentos tan pequeños como de 42 nucleótidos o así
son eficaces. Generalmente se acepta que alrededor de 50
nucleótidos son suficientes para obtener el efecto inhibidor. Sin
embargo, tiene que decirse que pocos nucleótidos pueden funcionar
muy bien; un número mayor, hasta el equivalente de longitud
completa, simplemente funcionará. Es habitual simplemente usar una
longitud de fragmento para el que haya un sitio de escisión por
enzimas de restricción conveniente en algún lugar secuencia abajo de
cincuenta nucléotidos. El hecho de que sólo se requiera un
fragmento del gen significa que no se necesita secuenciar todo el
gen. También significa que frecuentemente será suficiente un ADNc,
evitando la necesidad de aislar la secuencia genómica completa.
El fragmento antisentido no tiene que ser
precisamente el mismo que la cadena complementaria endógena del gen
diana. Simplemente ha de ser una secuencia suficientemente similar
como para conseguir la inhibición del gen diana. Ésta es una
característica importante de la tecnología antisentido, ya que
permite el uso de una secuencia derivada de una especie de planta
que es eficaz en otra y evita la necesidad de construir vectores
antisentido para cada especie individual de interés. A pesar de que
secuencias aisladas de una especie pueden ser eficaces en otra, no
es poco frecuente encontrar excepciones donde el grado de similitud
de secuencia entre una especie y otra es insuficiente para obtener
el efecto buscado. En estos casos, puede ser necesario aislar el
homólogo específico de especie.
La tecnología de regulación negativa antisentido
es bien conocida en la técnica. Ha sido el tema de varios libros de
texto y de muchos cientos de publicaciones en revistas. La
principal patente de referencia es la Patente Europea Nº 240.208 en
nombre de Calgene Inc. No hay razones para dudar de la capacidad
operativa de la tecnología antisentido. Está bien establecida, se
usa de forma rutinaria en los laboratorios de todo el mundo y
productos en los que se usa están en el mercado.
Tanto la sobreexpresión como la regulación
negativa se consiguen por la tecnología "con sentido". Si se
inserta una copia de longitud completa del gen diana en el genoma,
se obtiene una serie de fenotipos, de los que algunos sobreexpresan
el gen diana y otros lo infraexpresan. Entonces puede estudiarse
una población de plantas producidas por este método y aislarse
fenotipos individuales. Una similitud con la tecnología antisentido
es que la secuencia insertada no necesita ser una copia de longitud
completa. La principal patente de referencia sobre cosupresión es la
patente europea 465.572, en nombre de DNA Plant Technology Inc. No
hay razón para dudar de la capacidad operativa de la tecnología con
sentido/cosupresión. Está bien establecida, se usa de forma
rutinaria en los laboratorios de todo el mundo y productos en los
que se usa están en el mercado.
La regulación génica con sentido y antisentido se
revisa por Bird y Ray en Biotechnology and Genetic Engineering
Reviews 9: 207-227 (1991). El uso de estas técnicas
para el control de genes seleccionados en tomate se ha descrito por
Gray et al., Plant Molecular Biology, 19: 67-87
(1992).
Por lo tanto, el silenciamiento de genes puede
conseguirse insertando en el genoma de un organismo diana una copia
extra de la secuencia codificante del gen diana que puede
comprender la secuencia completa o parte o ser una secuencia
truncada, y puede estar en orientación con sentido o antisentido.
Además, pueden usarse secuencias de intrones que se pueden obtener a
partir de la secuencia génica genómica para la construcción de
vectores de supresión. También se ha publicado el silenciamiento de
genes conseguido dentro de organismos del transgen y del gen
endógeno, donde la única identidad de secuencia está dentro de las
regiones promotoras.
El control génico por cualquiera de los métodos
descritos requiere la inserción de la secuencia con sentido o
antisentido, bajo control de los promotores apropiados y de
secuencias de terminación que contienen señales de poliadenilación,
en el genoma de la especie de planta diana por transformación,
seguido de la regeneración de los transformantes en plantas
completas. Probablemente es correcto decir que existen métodos de
transformación para la mayoría de las especies de plantas o que
puede obtenerse adaptando los métodos disponibles.
\newpage
El método usado más ampliamente es la
transformación mediada por Agrobacterium, principalmente
para especies de dicotiledóneas. Este es el mejor conocido, el
estudiado más ampliamente y, por lo tanto, el mejor entendido de
todos los métodos de transformación. La rizobacteria
Agrobacterium tumefaciens, o la relacionada Agrobacterium
rhizogenes, contiene ciertos plásmidos que, en la naturaleza,
ocasionan la formación de síntomas de enfermedades, agallas de
corona o tumores de los pelos radiculares en plantas que están
infectadas por la bacteria. Parte del mecanismo empleado por
Agrobacterium en la patogénesis es que una parte del ADN
plasmídico que está unida por las regiones marginales derecha e
izquierda, se transfiere de forma estable al genoma de la planta
infectada. Por lo tanto, si el ADN extraño se inserta en la región
denominada "transferida" (región-T) en
substitución de los genes normalmente presente en la misma, ese gen
extraño se transferirá al genoma de la planta. Hay cientos de
referencias en las revistas científicas, en libros de texto y en
patentes, y la metodología está bien establecida.
Se conocen varios métodos para la inserción
directa de ADN en el núcleo de células monocotiledóneas.
En el método balístico, micropartículas de
material denso, normalmente oro o tungsteno, se disparan a alta
velocidad sobre las células diana donde penetran, abriendo una
rendija en la pared de la célula por donde puede entrar el ADN. El
ADN puede estar cubriendo las micropartículas o puede añadirse al
medio de cultivo.
En la microinyección, el ADN se inserta por
inyección dentro de células individuales a través de una aguja
hueca ultrafina.
Otro método, aplicable tanto a monocotiledóneas
como a dicotiledóneas, implica crear una suspensión de células
diana en un líquido, añadir material similar a agujas
microscópicas, tales como "fibras" de carburo de silicio o
nitruro de silicio, y agitar de forma que las células y las fibras
choquen y el ADN presente en el líquido entre en la célula.
En resumen, entonces, se conocen los requisitos
para silenciar genes usando la tecnología con sentido y
antisentido, y se conocen los métodos por los que se pueden
introducir las secuencias requeridas.
La presente invención se propone como objetivo,
entre otros, proporcionar un método para aumentar el control de la
expresión génica.
De acuerdo con la presente invención se
proporciona un vector para silenciar la expresión de un gen diana
dentro de una célula, que comprende una secuencia de ADN
transcribible que tiene una primera secuencia de nucleótidos y una
segunda secuencia de nucleótidos, donde dichas secuencias de
nucleótidos primera y segunda son complementarias y los nucleótidos
de la segunda secuencia están en orden inverso con respecto a la
primera, donde dichas secuencias primera y segunda son capaces de
proporcionar dentro de la célula un polinucleótido de doble cadena y
donde dicha secuencia de ADN transcribible tiene una región que
identifica el gen diana.
En el vector, las secuencias primera y segunda
pueden ser polinucleótidos sintéticos o puede derivar de una región
5' no traducida del vector. Se prefiere que las secuencias primera
y segunda estén separadas por una secuencia de nucleótidos
desapareados.
En el vector de la invención, la región 5' no
traducida puede ser contigua con dos copias en tándem de una
secuencia de nucleótidos que es complementaria a dicha región 5' no
traducida y tiene un orden de nucleótidos inverso a dicha región 5'
no traducida.
La invención también proporciona un método para
silenciar la expresión de un gen en un organismo no animal, que
comprende insertar dentro del genoma de dicho organismo el vector
de silenciamiento del gen potenciado de la invención. El organismo
preferido es una planta.
La invención además comprende el uso de un vector
de la invención para inhibir la expresión de un gen diana en una
célula aislada produciendo un polinucleótido de doble cadena,
identificándose dicho ADN diana por la región de ADN de dicho ADN
transcribible del vector.
En términos sencillos, hemos descubierto que el
efecto inhibidor de un vector para el silenciamiento de genes puede
potenciarse creando en el vector una repetición invertida de una
parte de la secuencia del vector. Como alternativa, la repetición
invertida puede ser de una secuencia sintética que puede crearse de
forma independiente del propio vector y después insertarse en la
secuencia del vector. Aunque el mecanismo por el cual se consigue
la potenciación no se entiende completamente, entendemos que el
mínimo requerido para dicho vector es una región o regiones que
identifiquen al gen diana para silenciarlo y una repetición
invertida de una parte de esta región o, como se ha explicado
anteriormente, una secuencia insertada y su repetición invertida.
La región del vector que identifica el gen diana para
silenciamiento puede ser cualquier parte de este gen endógeno que lo
caracteriza, por ejemplo, su promotor, su región 5' no traducida,
su secuencia codificante o su región 3' no traducida. También hemos
descubierto que el vector usado en esta invención silenciará la
expresión del gen diana y también cualquier miembro de la familia
de genes a la que pertenece el gen diana.
Aunque no se entiende completamente el mecanismo
por el cual opera la invención, creemos que la creación de una
repetición invertida promueve la formación de un ADN de doble
cadena entre la secuencia seleccionada y su repetición
invertida.
La repetición invertida puede situarse en
cualquier sitio del vector tal como dentro de la región promotora,
la región 5' no traducida, la región codificante o la región 3' no
traducida. Si la repetición invertida está basada en una secuencia
contigua dentro de la región del promotor, entonces se prefiere que
la repetición invertida se localice en la región de promotor. Si la
repetición invertida está basada en una secuencia contigua dentro
de la región 5' no traducida, entonces se prefiere que la
repetición invertida se localice en la región 5' no traducida. Si la
repetición invertida está basada en una secuencia contigua dentro
de la región codificante, entonces se prefiere que la repetición
invertida se localice dentro de la región codificante. Si la
repetición invertida está basada en una secuencia contigua dentro
de la región 3' no traducida, entonces se prefiere que la repetición
invertida se localice en la región 3' no traducida.
La secuencia polinucleotídica seleccionada y su
repetición invertida pueden o no estar separadas por una secuencia
polinucleotídica que permanece desapareada cuando la región 5' no
traducida y la repetición invertida estén formando un ADN de doble
cadena. Sin embargo, se prefiere que la secuencia contigua elegida
y su repetición invertida estén separadas por una secuencia
polinucleotídica que permanece desapareada cuando la región 5' no
traducida y la repetición invertida estén formando un ADN de doble
cadena.
Además se prefiere que la repetición invertida
esté basada en la secuencia 5' no traducida. También se prefiere
que la repetición invertida se sitúe secuencia arriba de la
secuencia codificante. Además se prefiere que la repetición
invertida esté situada entre la región 5' no traducida y la
secuencia codificante. Además se prefiere que la región 5' no
traducida y la repetición invertida estén separadas por una
secuencia polinucleotídica que permanece desapareada cuando la
región 5' no traducida y la repetición invertida estén formado un
ADN de doble cadena.
También se puede conseguir la supresión creando
un vector que contenga una secuencia repetida invertida que sea
capaz de formar un ADN de doble cadena dentro de la región del
promotor del gen diana. Esto evita la necesidad de incluir cualquier
información de la secuencia codificante específica acerca del gen
que se va a suprimir, ya que el vector permitiría la supresión del
promotor en el organismo y, por lo tanto, la expresión del gen
diana. Como alternativa, pueden crearse vectores en los que falte
la secuencia del promotor, pero que contengan una repetición
invertida de una secuencia dentro de la región 5' no traducida, la
región codificante o la región 3' no traducida.
Las regiones 5' ó 3' no traducidas de un vector
de supresión génica también pueden reemplazarse por regiones
sintéticas 5' ó 3' no traducidas que comprenden una parte
polinucleotídica y una repetición invertida separadas por una
secuencia polinucleotídica que permanece desapareada cuando dicha
parte polinucleotídica y la repetición invertida forman un ADN de
doble cadena. Se prefiere construir una región sintética 5' no
traducida. Además, se prefiere construir la región sintética 5' no
traducida que comprende secuencialmente, una parte polinucleotídica
de 33 bases y una repetición invertida polinucleotídica de 33 bases
separadas por un polinucleótido de 12 bases.
Cuando se desea usar una secuencia repetida
invertida dentro de la región 5' no traducida, de la secuencia
codificante o de la región 3' no traducida, los vectores de
silenciamiento de genes construidos con las repeticiones invertidas
dentro de cualquiera de estas regiones pueden permitir
adicionalmente el silenciamiento de genes que son homólogos a la
secuencia codificante presente en el vector de silenciamiento. Por
lo tanto, cuando se desea silenciar genes homólogos dentro de un
organismo, la construcción de un vector de silenciamiento que
contenga una repetición invertida dentro de la región 5' no
traducida, la secuencia codificante o la región 3' no traducida
puede permitir el silenciamiento de todos los genes que muestran
homología de secuencia con la secuencia codificante dentro de la
construcción. Homología/homólogo normalmente denota las secuencias
que son de alguna estructura ancestral común y muestran un alto
grado de similitud de secuencia en las regiones activas. Entre los
ejemplos de genes homólogos se incluyen la familia de genes del
enzima ACC-oxidasa, que incluyen ACO1 y ACO2.
Cualquiera de las secuencias de la presente
invención puede producirse y manipularse usando técnicas de
biología molecular convencionales. Las secuencias pueden obtenerse a
partir del organismo de procedencia deseado tal como de plantas y
modificarse cuando se requiera o sintetizarse ab initio
usando técnicas convencionales de síntesis de oligonucleótidos.
Sin el deseo de limitarse por ninguna teoría
particular sobre cómo puede actuar, a continuación se presenta una
discusión de nuestra invención. Un 96% de las plantas de tomate
transformadas con un gen con sentido de ACC-oxidasa
que contenía dos copias invertidas adicionales secuencia arriba de
su región 5' no traducida, mostraba la actividad
ACC-oxidasa substancialmente reducida en comparación
con las plantas de tipo silvestre. Sólo el 15% de las plantas
transformadas con una construcción similar, sin la repetición
invertida, tenían la actividad ACC-oxidasa reducida.
Ambas poblaciones tenían números medios similares de transgenes por
planta. El tratamiento de hojas de tomate con cicloheximida causó un
incremento fuerte y reproducible de la abundancia de los
transcritos de ACC-oxidasa y se usó en el estudio de
supresión por los transgenes con sentido de
ACC-oxidasa antes que la inducción de heridas usada
en estudios previos. La abundancia relativa de transcritos de
ACC-oxidasa no procesados y procesados en plantas
sometidas a supresión y no sometidas a supresión se ensayó por
ensayos de protección de ribonucleasa, proporcionando una medida
indirecta de la transcripción y acumulación de ARNm que no dependía
del ensayo de los núcleos aislados. Este análisis indicó que la
supresión de la expresión génica de ACO1 era principalmente
postranscripcional. Usando el mismo tipo de ensayo de RPA se
obtuvieron resultados similares a partir de plantas que contenían
transgenes supresores con sentido de poligalacturonasa o antisentido
de ACO.
Ahora se dispone de numerosos ejemplos de la
inactivación de secuencias homólogas en plantas. La expresión
"silenciamiento génico dependiente de homología" (HDGS)
describe mejor todo esto, aunque debe tenerse en cuenta que en la
mayoría de los ejemplos, el "silenciamiento" no es completo y
permanece un bajo nivel de expresión génica. A lo largo de esta
memoria descriptiva usaremos la clasificación indicada más
recientemente por Matzke y Matzke, Plant Physiol. 107:
679-685 (1995) en la que los diferentes ejemplos de
HDGS se dividieron en tres grupos principales: inactivación en cis,
inactivación en trans y supresión con sentido. La regulación
negativa por genes antisentido tiene muchas similitudes con el
último de éstos y se ha sugerido que opera por el mismo mecanismo
(Grierson et al. Trends Biotechnol. 9: 122-123
(1991)). Los transgenes con sentido y antisentido se han usado
ampliamente para reducir la expresión de genes endógenos homólogos
en plantas. Aunque siguen sin esclarecerse los mecanismos
subyacentes del HDGS, esta tecnología ha encontrado numerosas
aplicaciones no sólo en investigación fundamental, sino también en
empresas biotecnológicas comerciales y, de hecho, ya están en el
mercado productos alimentarios nuevos.
Actualmente, la obtención de una gran cantidad de
líneas transgénicas fuertemente suprimidas es más una cuestión de
suerte que de criterio. Se ha detectado una correlación positiva
entre la presencia de secuencias transgénicas repetidas y la
incidencia de HDGS. Sin embargo, también se han publicado
inserciones de transgenes de un solo locus asociadas con HDGS.
Hay un consenso emergente sobre que los
diferentes ejemplos de HDGS pueden clasificarse basándose en si se
ve afectada o no la transcripción del gen diana. Se han descrito
ejemplos de supresión transcripcional. Se ha demostrado que HDGS es
un efecto postranscripcional cuando la homología entre los genes
que interactúan reside en las secuencias transcritas. A pesar de
esta demarcación aparentemente precisa, existen varias similitudes
entre algunos ejemplos de las dos categorías diferentes. Éstas
incluyen patrones variables de silenciamiento, incremento de
metilación de los genes participantes en el silenciamiento y la
observación frecuente de que los loci silenciados contienen
secuencias repetidas.
Aunque el silenciamiento transcripcional debe
darse en el núcleo, el silenciamiento postranscripcional puede
producirse en el núcleo, en el citoplasma o en ambos. Hay
evidencias de que la abundancia de ARN nuclear procesado de genes
silenciados no se veía afectada y se sugiere un efecto sobre el
transporte o la degradación en el citoplasma. Una evidencia más
convincente de que el HDGS postranscripcional se produce fuera del
núcleo es la relación entre el silenciamiento del gen que implica a
transgenes nucleares y la resistencia a virus de ARN de replicación
citoplasmática. Las plantas transgénicas que contienen transgenes
que suprimen la actividad de otros transgenes (por ejemplo, GUS) o
de genes endógenos (por ejemplo, PG) también son resistentes a virus
de ARN que han sido sometidos a ingeniería genética para incluir
secuencias de dichos genes. Sin embargo, se descubrió que ciertas
características nucleares tales como la metilación del transgen y
la complejidad de los loci transgénicos estaban relacionadas
positivamente con la resistencia al virus. En casi todas los casos
de HDGS, la fuente de silenciamiento es nuclear (incluso si la
manifestación es citoplásmica). Sin embargo, se ha demostrado
silenciamiento de un gen nuclear por un elemento citoplasmático por
la supresión de la fitoeno desaturasa en plantas infectadas por un
virus recombinante que contiene secuencias de dicho gen.
Aunque ahora se dispone de numerosos ejemplos de
supresión postranscripcional de genes de plantas por HDGS, hasta
ahora no hay ninguna información de si el incremento de la
renovación del pre-ARNm está relacionado o es
distinto de otros procesos de renovación de ARN celulares. Se sabe
poco sobre la degradación de ARN en plantas, pero hay evidencias de
que está implicada la traducción. Por ejemplo, las vidas medias tan
cortas (alrededor de 10 minutos) de los ARN de pequeñas auxinas
(SAURS) pueden prolongarse notablemente por tratamiento con
cicloheximida.
Esta invención proporciona un incremento
llamativo en la frecuencia de HDGS tras la inclusión de una región
corta repetida en un transgen. En tomate, la expresión del gen diana
que codifica el enzima biosintético del etileno terminal
ACC-oxidasa se suprimió por dicha construcción,
principalmente de forma postranscripcional. Se demostró que esto era
cierto para otros ejemplos de supresión con sentido y antisentido
en tomate. Se descubrió que la cicloheximida era un inductor potente
y fiable de la expresión génica de ACO, pero no mejoraba el
silenciamiento.
A continuación, la invención se describirá, a
modo ilustrativo, en los siguientes ejemplos y con referencia a las
figuras adjuntas de las que:
(A) vector de silenciamiento del gen ACO1
(B) vector de silenciamiento del gen ACO1 que
contiene repeticiones invertidas en tándem de la región 5' no
traducida.
Ilustra la actividad relativa de
ACC-oxidasa en los dos tipos de plantas
transgénicas en relación con los valores del tipo silvestre donde C
= plantas transgénicas que contienen la construcción C (figura 1A)
y V = plantas transgénicas que contienen la construcción V (figura
1B).
\newpage
Actividad ACC-oxidasa en la
planta de tomate de transformantes transgénicos que contienen
pHIR-ACO (como se ilustra en la SEC ID Nº 10). La
gráfica también incluye C12ACO (control de sobreexpresión), un tipo
silvestre no transformado y el control silenciado de gen
antisentido fuerte de TOM13.
Ejemplo
1.0
La construcción V (figura 1) se hizo de la
siguiente forma: se amplificaron por PCR 79 pares de bases de la
región 5' no traducida del ADNc de ACO1 del tomate y se unieron dos
copias en tándem en la orientación inversa inmediatamente secuencia
arriba del ADNc de ACO1 que contiene su propia señal de
poliadenilación en su región 3' no traducida (construcción C). Se
unieron ambas secuencia abajo del promotor 35S de CaMV y después se
transfirieron al vector binario Bin19. La figura 1 muestra los
detalles básicos de las construcciones "C" y "V". Éstas se
usaron para transformar plantas de tomate (Ailsa Graig) por
transferencia de ADN mediada por Agrobacterium. Se obtuvieron
13 y 28 callos individuales resistentes a kanamicina con las
construcciones "C" y "V" respectivamente y éstos se
regeneraron en plantas.
La secuencia de nucleótidos del promotor y de la
región 5' no traducida del gen ACO1 se proporciona, de aquí en
adelante, como SEC ID Nº 1. Las 79 pb mencionadas anteriormente
comienzan en la base número 1874 y acaban en la base inmediatamente
precedente al codón de inicio de la traducción (ATG) en el número
1952.
Ejemplo
1.1
Para analizar en la población cualquier efecto
sobre la expresión del gen ACO, se midió la actividad relativa de
ACO en plantas no transformadas y transformadas. Se midió la
producción de etileno en discos de hojas complementados con el
precursor de etileno, el ácido
1-aminociclopropano-1-carboxílico,
al menos tres veces para cada planta. El corte de los discos con un
taladro de corcho daña las hojas y estimula la expresión del gen
ACO1. La actividad ACC-oxidasa en los dos tipos de
plantas transgénicas en relación con los valores del tipo silvestre
se muestran en la figura 2. Hubo una diferencia espectacular en la
actividad ACO entre las dos poblaciones, mostrando las plantas que
contenían la repetición invertida (línea V) una supresión muy
fuerte. La mayoría de las plantas (11 de 13) de la línea C no
mostraron supresión de la actividad ACO, sino sobreexpresión, en
comparación con las plantas de tipo silvestre, como era de esperar
puesto que esta construcción contenía una secuencia codificante de
ACO1 traducible.
Para ensayar la presencia de la secuencia de ACO
transgénica, se analizó por PCR el ADN de las plantas usando dos
oligonucleótidos homólogos y complementarios con el principio y el
final de la secuencia codificante de ACO1, respectivamente. Esta
combinación coamplifica 1500 pb del gen endógeno de ACO1 (que actúa
como un control interno positivo) y el transgen con sentido de ACO1
como un fragmento de 1000 pb (puesto que procedía de un ADNc y, por
lo tanto, no tenía intrones). La región amplificada no incluía la
región repetida del transgen de tipo V. Los dos fragmentos se
separaron por electroforesis en gel y se detectaron por tinción con
bromuro de etidio. Esto mostró la presencia del transgen en todas
las plantas de la línea C y todas las plantas de la línea V excepto
una (V2), que tampoco tenía reducida la actividad
ACC-oxidasa (figura 2).
Ejemplo
1.2
Se consideró posible que la región repetida en el
transgen pudiera haber afectado al número de transgenes que se
integraron en el genoma y que fuera la fuente real de
silenciamiento de alta frecuencia. El ensayo de PCR descrito
anteriormente puede usarse para estimar el número de copias del
transgen si se hacen las siguientes suposiciones:
- 1)
- que no haya variación en ninguna planta transgénica en el número de genes endógenos de ACO1 por genoma;
- 2)
- que la relación de eficiencia de amplificación (ADN de ACO1 endógeno: ADN de ACO1 transgénico) sea constante;
- 3)
- la reacción se muestrea a baja concentración de ADN para minimizar la rehibridación del producto. Como sólo estábamos interesados en la estimación del número de transgenes en las dos líneas entre sí y no en la cuantificación absoluta del número de copias del transgen, no hemos empleado combinaciones sintéticas de ADN de "transgen" y "gen endógeno" como patrones.
Después de 20 ciclos de amplificación,
electroforesis en gel, transferencia de Southern e hibridación con
un ADNc de ACO1 marcado radiactivamente, las señales de ADN de ACO1
endógeno y transgénico se visualizaron y cuantificaron por análisis
de imágenes por la señal radiactiva del fósforo. La relación media
de transgen:gen endógeno fue de 0,96 para la línea C y de 1,08 para
la línea V, lo que indica que la región repetida en la construcción
V no hace que se integren más ADN-T durante la
transformación.
Ejemplo
1.3
El ARNm de ACO1 aumentó en abundancia tras dañar
y/o tratar las hojas con cicloheximida, pero la acumulación fue
aproximadamente cinco veces mayor tras el tratamiento con
cicloheximida que tras el daño mecánico que previamente habíamos
usado como estímulo. El daño de las hojas tratadas con
cicloheximida no sirvió para inducir un incremento adicional de la
cantidad de ARNm de ACO1. Descubrimos que la cicloheximida es un
inductor de acumulación de ARNm de ACO1 más reproducible que el
daño mecánico y por eso hemos usado éste de forma preferente durante
la última parte de este estudio. No se observó ningún incremento
adicional en la abundancia del ARNm de ACO1 cuando se incrementó la
concentración de cicloheximida de 50 a 250 \mug/ml (datos no
mostrados).
Ejemplo
1.4
El extremo 5' del ARNm de ACO1 extraído de
plantas es heterogéneo, pero consta de dos especies principales que
difieren en 2 bases. La región 5' no traducida (tanto la secuencia
con sentido como la antisentido duplicada) en ambas construcciones
(C y V) se hizo aproximadamente 10 pares de bases más corta que las
del gen endógeno. Esto permitió la discriminación ente el gen
endógeno y los transcritos derivados del transgen por ensayos de
protección de ribonucleasa usando una sonda transcrita a partir de
una secuencia genómica de ACO1 que se extendía desde el inicio del
extremo 3' de la región 5' no traducida a un sitio Acc1, en el
promotor de ACO1, 222 bases secuencia arriba. En el ARN de las
hojas del tipo silvestre, había varias bandas que podrían proceder
de distintas especies de ARN o deberse a la rotura de los ARN de
doble cadena durante la digestión. Algunas de las bandas parecen más
susceptibles a los efectos de la supresión antisentido que otras
(aunque la tendencia general sigue siendo la supresión).
En hojas de las líneas V4, V11 y V28 (todas con
una actividad de ACO < 10%), hubo cosupresión extensiva de los
transcritos endógenos (en relación con el tipo silvestre) y de los
transcritos del transgen (en relación con los de un transgen de
control (línea C1)). V4, V11 y V28 mostraron mayor supresión que la
línea antisentido de ACO homocigótica (Hamilton et al. Nature
346, 248-287 (1990)).
El uso del inhibidor de la síntesis de proteínas,
cicloheximida, como un estimulante de la acumulación de ARN de ACO1
obviamente no alivió la supresión de este ARN por los transgenes
con sentido en las líneas V4, V11 o V28.
Aunque incuestionablemente se suprime el
transcrito de genes endógenos, es posible que la repetición
invertida dentro del extremo 5' del transcrito del transgen V
excluya la sonda y cause infraexpresión de la señal del ARN
transgénico. Esto parece poco probable por la siguiente razón.
Cuando se usó una sonda no excluida por la repetición invertida
para analizar el ARN de la línea V, la señal de ARNm (que, usando
estas sonda, realmente es la suma de los ARN endógeno y
transgénico), seguía siendo mucho menor que en el tipo silvestre.
Los datos demuestran que en ausencia de silenciamiento, es
comparable la abundancia del ARN endógeno y transgénico.
Ejemplo
1.5
Elegimos medir la abundancia de transcritos no
procesados en extractos de ARN total como medida indirecta de la
transcripción, mientras simultáneamente medimos la cantidad de ARNm
procesado. Esto se consiguió usando sondas de ARN transcritas a
partir de los intrones que espacian las secuencias genómicas en
ensayos de protección de ribonucleasa. Como el ARN analizado
procedía de hojas congeladas en nitrógeno líquido y luego se
extrajo en condiciones fuertemente desnaturalizantes de proteínas
(fenol y detergente), habría poca oportunidad para cualquier
reinicio de la transcripción durante el proceso. Hubo una mayor
abundancia de ARNm tras el tratamiento con cicloheximida a pesar de
que la cantidad total de ARNm en las plantas ACO-AS
se había reducido. En la línea ACO-con sentido, V11,
hubo un pequeño o ningún aumento en la señal de ARNm. Es probable
que esta señal de ARNm proceda principalmente del transgen que se
transcribe por el promotor 35S que no es inducible por
cicloheximida. Por el contrario, la abundancia del transcrito
primario de todas las muestras de ARN se incrementaba tras el
tratamiento con cicloheximida. Esta especie de ARN se origina sólo a
partir del gen endógeno de ACO1, ya que el transgen no tiene
intrones. En todos los casos, la supresión del transgen tuvo poco o
ningún efecto sobre la abundancia del transcrito primario.
Ejemplo
1.6
La cicloheximida estimulaba fuertemente la
acumulación tanto del transcrito primario de ACO1 como del ARNm
maduro. La cuantificación de la señal procedente de transcritos
primarios y de ARN maduro de ACO1 en las hojas del tipo silvestre
antes y después del tratamiento con cicloheximida demostró que
había un incremento de 6 veces en la abundancia del ARN de ACO1 no
procesado, pero había un incremento de 13 veces en la cantidad de
ARN de ACO1 procesado. La abundancia del ARN de ACO1 transgénico
(transcrito desde el promotor 35S) en la línea C también se elevó
tras el tratamiento con cicloheximida.
Se enfrentaron dos copias de la 5' UTR unidas en
tándem (cada unidad = 79 pb; 74,7% (A+T)) en orientación invertida
entre el promotor 35S de CaMV y un ADNc de ACO1 de longitud casi
completa (figura 1). Cualquier unidad de esta repetición directa
tenía la capacidad de formar una gran estructura cruciforme con la
región 5' no traducida inmediatamente secuencia abajo. Tras la
transformación mediada por Agrobacterium con esta
construcción, 26 de 28 plantas recuperadas a partir del cultivo de
tejidos mostraban supresión de la actividad ACO. Se observó una
frecuencia de supresión mucho más baja (2/15) con una construcción
de control que carecía del duplicado de 5' UTR, pero que por lo
demás era igual.
Se obtuvieron más plantas transgénicas con la
construcción V que con la construcción de control (además de exhibir
la alta frecuencia de HDGS). Es probable que esto sea un resultado
directo de la reducción de la síntesis de etileno como resultado de
la supresión del gen de ACO. Los resultados previos han demostrado
que puede lograrse que la regeneración de callos mejore mucho
después de la transformación con construcciones que contienen un
gen de ACO antisentido.
De las dos plantas transformadas con la
construcción repetida que no mostraron supresión, puede ser que
una, la V2, tuviera un ADN-T truncado o que fuera un
escape sin transformar, ya que no se pudo amplificar la secuencia
transgénica de ACO1. Como la repetición ya contenía secuencias de
ADN en el gen, parece poco probable que sea esta secuencia per
se la que induce el efecto de silenciamiento del gen. Es mucho
más probable que sea la estructura del ADN repetido (o del ARN
transcrito) la que dé origen a la alta frecuencia de silenciamiento
observada. La repetición en la construcción V era similar a la de
la construcción de control.
La mayoría de los casos de HDGS están asociados
con loci transgénicos complejos que contiene ADN-T
repetidos, completos o partes en lugar de inserciones simples
sencillas, pero no se sabe si esto es un determinante principal de
supresión o un efecto indirecto. Hay ejemplos en los que transgenes
aparentemente sencillos están asociados con el silenciamiento de
genes, pero son una minoría y al menos en algunos de estos ejemplos
los ADN-T contienen repeticiones internas. Los datos
presentados aquí sugieren que la introducción deliberada de
pequeñas repeticiones en un transgen puede incrementar el número de
líneas transgénicas en las que se han suprimido genes homólogos
prácticamente al 100%. La supresión con sentido podría obtenerse
con la construcción de control pero en mucha menor frecuencia. La
introducción deliberada de ADN repetitivo en un transgen puede
substituir el requisito de la inserción de unidades de
ADN-T repetitivas para producir silenciamiento.
Aunque el ensayo de PCR usado aquí no es absolutamente
cuantitativo, sugiere que la dosis media de transgen es
aproximadamente 2, lo que implica que algunas de las líneas que
muestran supresión tienen inserciones simples. En varias de nuestras
líneas, la supresión obtenida es profunda (figura 2), lo que hace
que esta estrategia sea incluso más atractiva para los interesados
específicamente en cortar la expresión génica. Hay una publicación
previa sobre la combinación deliberada de ADN repetitivo con un gen
indicador que aumenta el HDGS: Lohuis et al., Plant Journal, 8,
919-932 (1995) insertaron una copia de una
secuencia genómica repetitiva aislada (RPS) aleatoriamente secuencia
arriba del gen indicador GUS y descubrieron que este elemento
incrementaba la frecuencia de variabilidad de la expresión del
transgen. Éste es un ejemplo de inactivación en cis que
probablemente actúa a nivel transcripcional, y los autores lo
consideraron distinto de los fenómenos de cosupresión/supresión con
sentido. Curiosamente, el elemento RPS no aumentaba la frecuencia
de silenciamiento completo del transgen. En nuestro ejemplo, aunque
el nivel de supresión es agudo en muchas líneas, no es posible decir
si el grado de supresión es igual en todas las células que expresan
el gen diana o si la repetición simplemente aumenta mucho la
proporción de células que experimentan supresión.
Ejemplo
1.8
El ADNc de ACO1 de tomate, pTOM13, se liberó a
partir de su vector de clonación original, pAT153, (Promega),
creando pG31. pG31 se digirió con EcoRI y el vector se unió de
nuevo para crear pTRD. Esto eliminó el extremo 5' del ADNc que
contenía aproximadamente 90 pares de bases de la región 3' no
traducida en la orientación antisentido en su extremo 5', que puede
haberse introducido como un artefacto durante la clonación original
del ADNc de pTOM13. La secuencia remanente de ACO1 se cortó de pTRD
con EcoRI y HindIII, y se unió a pT_{7}-T_{3
\alpha }18 (BRL) digerido con EcoRI y los extremos se rellenaron
con el enzima Klenow. La región 5' no traducida del transcrito de
ACO1 (menos aproximadamente 10 bases en el extremo 5') se amplificó
con la Taq polimerasa a partir del ADNc cebado con oligo dT de
hojas de tomate dañadas, con los cebadores 5' CATTCATCTCTTCAATCTTTTG
3' (SEC ID Nº 2) y 5' CTTAATTTCTTGGTAAAGTGTTTTCC 3' (SEC ID Nº 3).
Los extremos del ADN se dejaron al ras con la ADN polimerasa de T4
y se unió con el relleno en pTRF para crear pMI1. Esto reconstituyó
el sitio EcoRI en el extremo 5' y produjo un ADNc de ACO1 traducible
ligeramente más corto que el ARNm de ACO1 de tipo silvestre. La
secuenciación confirmó que la secuencia amplificada de ACO1 no
estaba mutada. Se digirió pMI1 con HindIII y parcialmente con EcoRI,
y el fragmento que contenía la secuencia de ADNc de ACO1 se rellenó
con el enzima Klenow, y se unió con pDH51 digerido con SmaI para
crear pDHC1. Éste se digirió con XbaI y HindIII, el relleno y el
fragmento que contenía el vector, el promotor 35S y el ADNc de ACO1
se unieron de nuevo para crear pMI5. pMI7 contiene dos copias de la
5' UTR de ACO1 unidas en tándem e insertadas en pMI5 en orientación
antisentido secuencia arriba de la 5' UTR de ACO1. Esto se hizo
amplificando la 5' UTR del ADNc de la hoja de tomate (véase
anteriormente) con los oligonucleótidos 5' CATTCATCTCTTCAATCTTTTG
3' (SEC ID Nº 2) y 5' CTTAATTTCTTG GAAAGTGTTTTCC 3' (SEC ID Nº 3),
puliendo el ADN con ADN polimerasa de T4 y uniéndolo en un relleno
en el sitio Acc651 de pMI5 secuencia arriba de la 5' UTR de la
secuencia ACO1 Acc651 (un isosquizómero de KpnI que proporciona un
saliente 5'). La construcción se confirmó por secuenciación.
pDHC1 y pMI7 se digirieron con BamHI, BglI y
PvuII, y los fragmentos BamHI-PvuII que contenían
las secuencias de ADNc CamV35S-ACO1 se clonaron en
Bin19 que se había cortado con HindIII, rellenado y cortado después
con BamHI. Los recombinantes resultantes se denominaron pBC1 y
pBM17, respectivamente. Estos plásmidos se utilizaron para
transformar A. tumefaciens LBA4404 y éste se usó para
transformar cotiledones de tomate (Lycopersicon esculentum
var Ailsa Craig). Se regeneraron plantas a partir del crecimiento
del callo con kanamicina a 50 \mug.ml^{-1}.
\newpage
Ejemplo
1.9
La actividad ACC-oxidasa se midió
como la capacidad de los tejidos de la planta para convertir el
ácido
1-aminociclopropano-1-carboxílico
(ACC) exógeno en etileno. Se cortaron discos de la lámina de la
hoja con un taladro de corcho afilado y se pusieron en contacto con
0,5 ml de NaH_{2}PO_{4}/Na_{2}HPO_{4} (pH 7) 10 mM, y ACC
10 mM (Sigma) en frascos de vidrio de 5 ml que después se sellaron
con tapones de vacunas "Subaseal" (Fisons). Después de 1 hora
a temperatura ambiente, se midió el etileno del espacio superior
por cromatografía de gases como describieron Smith et al., 1986.
También se midió el etileno en los frascos que contenían la
solución pero sin el tejido de hoja. Estos valores se restaron de
los valores obtenidos en los frascos que contenían los discos de
hoja.
Ejemplo
1.10
Se extrajo ADN de hojas individuales de plantas
de tipo silvestre, de plantas homocigóticas para un gen de ACO
antisentido y de las plantas transformadas con las construcciones
de pBC1 y pBM17. Las hojas se congelaron en nitrógeno líquido, se
trituraron brevemente en tubos eppendorf con una punta de pipeta
desechable, se trituraron adicionalmente después de la adición de
200 \mul de tampón de extracción de ADN (laurilsarcosina al 1%,
CTAB al 0,8%, NaCl 0,8 M, EDTA 0,02 M, Tris/HCl 0,2 M (pH 8)), se
calentaron a 65ºC durante 15 minutos, se extrajeron una vez con
fenol/cloroformo y el ADN se precipitó de la fase acuosa añadiendo
0,6 volúmenes de isopropanol. El ADN se recuperó por
centrifugación, los sedimentos se lavaron con etanol al 70%, se
secaron y se redisolvieron en 200 \mul de tampón TE. Se usó 1
\mul de esto como molde para la amplificación simultánea por PCR
del gen ACO1 endógeno y del transgen usando los cebadores ACO1.1
(ATGGAGAACTTCCCAATTATTAACTTGGAAAAG SEC ID Nº 4) y ACO1.2
(CTAAGCACTTGCAATTGGATCACTTTCCAT SEC ID Nº 5) durante 21 ciclos de 30
segundos a 95ºC, 30 segundos a 65ºC y 1 minuto a 72ºC. El ADN
amplificado se separó por electroforesis en un gel de agarosa al
0,8%/TBE x 1 y se transfirió a HybondN+ en NaOH 0,4 M durante 6
horas. Para detectar las secuencias amplificadas de ACO, el ADN del
filtro se hibridó con ADNc de ACO1 marcado por el método de
iniciador aleatorio. El filtro se lavó en SSPE x 0,02/SDS al 1% a
65ºC seguido del análisis de imágenes por la señal radiactiva del
fósforo.
Ejemplo
1.11
Se cortaron hojas compuestas con una cuchilla de
bisturí afilada e inmediatamente se pusieron bajo una solución
acuosa de cicloheximida a 50 \mul.ml^{-1} (Sigma). Se cortaron
otros 3 cm del pedúnculo a partir de la rama bajo la solución y
después, el conjunto se dejó en una cabina de flujo laminar durante
seis horas para permitir que la cicloheximida entrara en las
hojas.
Para dañar el tejido de la hoja, se situaron
hojas sueltas en una superficie dura y se cortaron en dados con una
cuchilla de bisturí afilada aproximadamente 10 veces en sentido
transversal y 5 veces en sentido longitudinal.
Ejemplo
1.12
Se extrajo ARN de las hojas tratadas con
cicloheximida como se indica a continuación. El tejido se congeló
en nitrógeno líquido y se pulverizó en un molinillo de café (para el
pericarpio del fruto, véase más adelante) o en un mortero (para las
hojas). Se añadieron 5ml por gramo de peso húmedo^{-1} de tampón
de extracción de ARN (de Kirby) y la pasta congelada se trituró
adicionalmente en tubos de centrífuga de polipropileno desechables
con una varilla de vidrio. Una vez descongelada, la mezcla se
extrajo dos veces con fenol/cloroformo y los ácidos nucleicos se
precipitaron por la adición de 2,5 volúmenes de etanol, 1/10 de
volumen de acetato sódico 3 M (pH 5) y refrigeración a 20ºC durante
1 hora. Después de la centrifugación a 3000 x g durante 10 minutos
(40 minutos para una extracción de fruta), los sedimentos se
redisolvieron rápidamente en agua (aproximadamente 1 ml por gramo de
tejido) y un volumen igual de tampón de extracción de ADN x 2 (NaCl
1,4 M, CTAB al 2%, Tris/HCl 100 mM (pH 8)). Se añadieron dos
volúmenes de tampón de precipitación (CTAB al 1%, Tris/HCl 50 mM (pH
8)) para precipitar los ácidos nucleicos (30 minutos a temperatura
ambiente es suficiente) y el precipitado se recogió por
centrifugación (3000 x g/15 minutos). Este paso se repitió, excepto
porque los sedimentos se disolvieron en tampón de extracción de ADN
x 1. Después de recoger la segunda precipitación, los sedimentos se
redisolvieron en 0,5 ml de NaCl 1 M e inmediatamente se precipitaron
otra vez con 2,5 volúmenes de etanol (-20ºC/30 minutos). Después de
la centrifugación (10000 x g/10 minutos), los sedimentos se
redisolvieron en 400 \mul de agua y se extrajeron dos veces con
fenol/cloroformo. Los ácidos nucleicos se precipitaron y se
recogieron como anteriormente, redisolviéndose en 400 \mul de
agua. Se añadieron 46 \mul de tampón
One-Phor-All x 10 (Pharmacia) con 50
unidades de ADNasa sin ARNasa (Promega) y las soluciones se
incubaron a 37ºC durante 30 minutos. Se extrajeron dos veces con
fenol/cloroformo, se precipitaron los ARN y se recogieron como
anteriormente y finalmente se redisolvieron en
100-500 \mul de agua. Hemos descubierto que es
necesaria esta purificación relativamente extensiva si han de
detectarse transcritos raros por RPA. Además, el ARN se redisuelve
fácilmente, lo que reduce en gran medida el tiempo de manipulación
cuando se manipula esta mezcla de ARN con una sonda de ARN
radiactiva.
Se mezclaron 50 \mug de ARN de hoja con un
volumen igual de solución de desnaturalización/carga (formamida al
50%; fosfato sódico 25 mM (pH 6,5); EDTA 10 mM; formaldehído al
6,2%; bromuro de etidio 200 \mug.ml^{-1}) y se separaron por
electroforesis en un gel de agarosa al 1,5%/fosfato sódico 25 mM
(pH 6,5)/formaldehído al 3,7% en fosfato sódico 10 mM (pH
6,5)/formaldehído al 3,7% con recirculación continua de tampón. El
ARN separado se transfirió a membranas de hibridación Genescreen
(Dupont) en fosfato sódico 10 mM (pH 6,5). El autoentrecruzamiento
establecido en un Stratalinker (Stratagene) se usó para unir
covalentemente el ARN al filtro. El filtro se prehibridó y después
se hibridó con una sonda de ADNc de ACO1 marcada por el método de
iniciador aleatorio con ^{32}P. El filtro se lavó con SSPE x
0,2/SDS al 1% a 65ºC y después se expuso a una película de Kodak
X-omat entre dos pantallas intensificadoras a -70ºC
durante 24 horas. Posteriormente, la radiactividad en cada banda se
midió por análisis de imágenes por la señal radiactiva del
fósforo.
Ejemplo
1.13
Se extrajo ARN de las hojas y los frutos tratados
con cicloheximida descritos anteriormente.
Se transcribieron sondas de ARN con la ARN
polimerasa de T7 a 20ºC con UTP a-^{32}P (400
Ci.mmol^{-1}) como la única fuente de UTP. Tras una hora de
incubación, se usó una ADNasa sin ARNasa para eliminar el molde, y
la sonda se purificó adicionalmente en geles de poliacrilamida al
6%/urea 8M/TBE x 1. La banda que contenía la sonda de longitud
completa se visualizó por autorradiografía. La porción de gel que
contenía este ARN se cortó y se situó en 1 ml de tampón de elución
de la sonda (acetato amónico 0,5 M; EDTA 1 mM; SDS al 0,2%) entre 6
y 24 horas a 37ºC. Típicamente, se coprecipitaron entre 20 y 100
\mul de esto con entre 20 ó 100 \mug del ARN a ensayar más dos
controles de ARN de levadura. Los ARN precipitados se redisolvieron
en 30 \mul de solución de hibridación (formamida al 80%;
PIPES/NaOH 40 mM; acetato sódico 0,4 M; EDTA 1 mM, el pH debería ser
6,4), se calentaron a 65ºC durante 10 minutos y se hibridaron a
42ºC durante un periodo comprendido entre 2 y 14 horas. Los tiempos
de hibridación más largos fueron simplemente por conveniencia, ya
que fácilmente detectamos incluso transcritos raros después de sólo
dos horas de hibridación. Se añadieron 300 \mul de tampón de
digestión de ARNasa (EDTA 5 mM; acetato sódico 200 mM; Tris/HCl
10mM. El pH final de la solución debería ser de 7,5) que contenía
RNAaseONE (Promega) o RNAase T1 (Ambion) a cada tubo, con la
excepción de uno que contenía ARN de levadura, que recibió tampón
de digestión de ARNasa sin ninguna ribonucleasa. La incubación de
la digestión de ARN se hizo a 25ºC (RNAaseONE) o a 37ºC (RNAase T1)
durante un periodo de 2 a 4 horas. La RNAaseONE se inactivó por la
adición de SDS al 0,5% y los ARN protegidos de doble cadena se
precipitaron con etanol y acetato sódico. La RNAase T1 se inactivó y
los ARN de doble cadena se precipitaron por la adición de la
solución de inactivación/precipitación proporcionada con el kit de
protección de ARNasa de Ambion. Los ARN protegidos se redisolvieron
en 5 a 10 \mul de solución de desnaturalización/carga (formamida
al 80%; EDTA 10 mM; azul de bromofenol al 0,1 %; xileno cianol al
0,1%; SDS al 0,1%), se calentaron a 95ºC durante 5 minutos y después
se separaron por electroforesis en geles de poliacrilamida al
6-8%/urea 8 M/TBE x 1 (dependiendo la concentración
de poliacrilamida de los tamaños de los fragmentos a separar).
Después de la electroforesis, los geles se secaron y se expusieron
a una película Kodak x-omat entre dos pantallas
intensificadoras a -70ºC durante el tiempo indicado. La
radiactividad se midió por análisis de imágenes por la señal
radiactiva del fósforo.
Ejemplo
2.0
Se construyó una repetición invertida de ADN
heterólogo sintético (SEC ID Nº 11) por hibridación de dos series
de oligonucleótidos sintéticos (HIR1 SEC ID Nº 12, HIR2 SEC ID Nº
13, HIR3 SEC ID Nº 14 y HIR4 SEC ID Nº 15) y cada serie se unió a
pSK-(bluescript, Stratagene) independientemente, para crear pHIRA y
pHIRB, respectivamente. La estructura repetida invertida se creó
digiriendo los vectores pHIRA/B con XhoI y NcoI y uniendo el
fragmento de 42 pb de pHIRB a pHIRA. La estructura repetida
invertida se aisló del vector pSK usando KpnI y se clonó en el
sitio KpnI inmediatamente secuencia abajo del promotor 35S de CaMV
en el cassette de expresión de planta pSIN para crear
pHIR-SIN.
La secuencia codificante de ADNc de ACO1 de
tomate (pTOM13) se amplificó a partir de su vector de clonación
original pAT153 (Promega) usando dos oligonucleótidos cebadores, 5'
CTTTACCAAGAAGTGCACATGGAGAACTTCC C 3' SEC ID Nº 6, y 5'
GAATTGGGCCCTAAGCACTTGCAATTGG 3' SEC ID Nº 7 que ceban los lados de
la secuencia codificante TOM13 introduciendo los sitios ApaLI y
ApaI, respectivamente. El producto de PCR se digirió con ApaLI y
ApaI y los extremos se hicieron romos usando la polimerasa Pfu
(Stratagene). El fragmento de PCR romo se unió al sitio SmaI
secuencia abajo de la estructura repetida inversa de
pHIR-SIN para crear
pSIN-HIR-ACO.
El cassette de expresión de planta procedente de
pHIR-ACO se aisló usando AgeI y se unió al sitio
AgeI del vector binario pVB6 para crear pHIR-ACO SEC
ID Nº 10. El inserto se orientó usando un análisis de restricción
para asegurar que todas las ORF (fase de lectura abierta) que
serían activas en la planta fueran unidireccionales.
pHIR-ACO se utilizó para transformar A.
tumefaciens LBA4404 y éste se usó para transformar cotiledones
de tomate (Lycopersicum esculentum var. Ailsa Craig). Las
plantas se regeneraron a partir de callos.
Ejemplo
2.1
Se extrajo ADN a partir de hojas individuales y
se extrajo como se ha descrito previamente. Las plantas que
contenían la inserción HIR-ACO ADN-T
se identificaron por PCR usando un cebador con sentido interno de
TOM13 (5' GCTGGACTCAAGTTTCAAGCCAAAG 3' SEC ID Nº 8) y un cebador
antisentido específico de 3' UTR (región no traducida) de NOS (5'
CCATCTCATAAATAACGTCATGC 3' SEC ID Nº 9).
Ejemplo
2.2
La actividad ACC-oxidasa se midió
por la capacidad de los tejidos de la planta para convertir ácido
1-aminociclopropano-1-1-carboxílico
(ACC) exógeno en etileno. Se retiraron hojas pequeñas de los brotes
y se dañaron con un bisturí antes de ponerlas en un vial sellable de
2 ml, y se dejaron durante 30 minutos. Después, los viales se
sellaron y se dejaron durante una hora a temperatura ambiente, tras
lo cual se midió el etileno en el espacio superior por cromatografía
de gases como describieron Smith et al. 1986. El etileno también se
midió en el material de la planta de tipo silvestre, sobreexpresado
(C12) y regulado negativamente antisentido.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: ZENECA LIMITED
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 15 STANHOPE GATE
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: LONDRES
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: LONDRES
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAIS: REINO UNIDO
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): W1Y 6LN
\vskip0.333000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 01344 414521
\vskip0.333000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 01344 481112
\vskip0.333000\baselineskip
- (I)
- TELEX: 847556
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: SILENCIAMIENTO DE GENES
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 15
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- CLASE DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SORTWARE: PatentIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1.30 (EPO)
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD
- NÚMERO DE APLICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3681 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleido
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN"
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: SEC ID Nº1
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleido
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR DE PCR"
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: CEBADOR DE PCR SEC ID Nº 2
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATTCATCTC TTCAATCTTT TG
\hfill22
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleido
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR DE PCR"
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: CEBADOR DE PCR SEC ID Nº 3
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTAATTTCT TGGTAAAGTG TTTTCC
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleido
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR DE PCR"
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: CEBADOR DE PCR SEC ID Nº 4
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGGAGAACT TCCCAATTAT TAACTTGGAA AAG
\hfill33
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleido
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR DE PCR"
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: CEBADOR DE PCR SEC ID Nº 5
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTAAGCACTT GCAATTGGAT CACTTTCCAT
\hfill30
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleido
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR DE PCR"
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: CEBADOR DE PCR SEC ID Nº 6
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTTACCAAG AAGTGCACAT GGAGAACTTC CC
\hfill32
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleido
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR DE PCR"
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: CEBADOR DE PCR SEC ID Nº 7
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAATTGGGCC CTAAGCACTT GCAATTGG
\hfill28
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleido
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR DE PCR"
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: CEBADOR DE PCR SEC ID Nº 8
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTGGACTCA AGTTTCAAGC CAAAG
\hfill25
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleido
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR DE PCR"
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: CEBADOR DE PCR SEC ID Nº 9
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCATCTCATA AATAACGTCA TGC
\hfill23
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1949 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleido
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN"
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: PHIR-ACO SEC ID Nº 10
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº: 10:
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleido
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR DE PCR"
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: REPETICIÓN INVERTIDA SINTÉTICA SEC ID Nº11
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGGCACGGC CAGCCACGCC GCTGAGCCCG CAGTTTCTCG AGTTTCTGCG GGTCAGCGG
\hfill60
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGTGGCTGGC CGTGCCGC
\hfill78
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 75 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleido
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: CEBADOR DE PCR SEC ID Nº 12
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGGGTACCG CGGCACGGCC AGCCACGCCG CTGAGCCCGC AGTTTCTCGA GGATGGGTTG
\hfill60
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTCCATGGG CGGCG
\hfill75
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 75 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleido
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR DE PCR"
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: CEBADOR DE PCR SEC ID Nº 13
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCCGCCCAT GGAGCCAACC CATCCTCGAG AAACTGCGGG CTCAGCGGCG TGGCTGGCCG
\hfill60
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGCCGCGGTA CCCGC
\hfill75
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleido
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR DE PCR"
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: CEBADOR DE PCR SEC ID Nº 14
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGCGCCGC TCGAGTTTCT GCGGGCTCAG CGGCGTGGCT GGCCGTGCCG CCCATGGCGC
\hfill60
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCGGG
\hfill66
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleido
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR DE PCR"
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: CEBADOR DE PCR SEC ID Nº15
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCTAGGCGC CATGGGCGGC ACGGCCAGCC ACGCCGCTGA GCCCGCAGAA ACTCGAGCGG
\hfill60
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCCCC
\hfill66
Claims (7)
1. Un vector para el silenciamiento de la
expresión de un gen diana en una célula, que comprende una
secuencia de ADN transcribible que tiene una primera secuencia de
nucleótidos y una segunda secuencia de nucleótidos, donde dichas
secuencias primera y segunda de nucleótidos son complementarias y
los nucleótidos de la segunda secuencia están en orden inverso con
respecto a la primera, donde dichas secuencias primera y segunda
son capaces de proporcionar dentro de la célula un polinucleótido
de doble cadena y donde dicha secuencia de ADN transcribible tiene
una región de ADN para identificar el gen diana.
2. Un vector de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que dichas secuencias primera y segunda son polinucleótidos
sintéticos.
3. Un vector de acuerdo con la reivindicación 1 o
la reivindicación 2, en el que las secuencias primera y segunda
están separadas por una secuencia de nucleótidos desapareados.
4. Un vector de acuerdo con la reivindicación 1,
2 ó 3, caracterizado porque la región 5' no traducida del
vector es contigua a dos copias en tándem de una secuencia de
nucleótidos que es complementaria y con el orden de los nucleótidos
invertido a dicha región 5' no traducida.
5. Un método de silenciamiento de la expresión de
un gen en un organismo no animal, que comprende insertar en el
genoma de dicho organismo un vector que aumenta el silenciamiento
del gen de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a
4.
6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5,
en el que el organismo es una planta.
7. El uso de un vector de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 6 para inhibir la expresión de un gen
diana en una célula aislada por medio de la producción de un
polinucleótido de doble cadena, identificándose dicho gen diana por
dicha región de ADN de dicho ADN transcribible del vector.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9710475.6A GB9710475D0 (en) | 1997-05-21 | 1997-05-21 | Gene silencing |
| GB9710475 | 1997-05-21 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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