ES2212802T3 - Degradacion de fibrina/fibrinogeno y lisis de coagulos mediante una metaloproteinasa de matriz fibrinolitica. - Google Patents
Degradacion de fibrina/fibrinogeno y lisis de coagulos mediante una metaloproteinasa de matriz fibrinolitica.Info
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Abstract
ESTA INVENCION PROPORCIONA UN METODO DE PROVOCACION DE LA DEGRADACION DE UN FIBRIN(OGENO) (ES DECIR, FIBRINA, FIBRINOGENO Y SUSTANCIAS RELACIONADAS) POR MEDIO DE UNA METALOPROTEINASA FIBRINOLITICA, PREFERIBLEMENTE UNA METALOPROTEINASA ENDOGENA TAL COMO MMP-3. EL METODO DE ESTA INVENCION SE PUEDE LLEVAR A CABO IN VITRO PARA PROPORCIONAR UNA INFORMACION DIAGNOSTICA QUE CARACTERIZA A LA FISIOLOGIA DE EL FIBRIN(OGENA) Y FIBRINOLITICA. ADEMAS, EL METODO SE PUEDE LLEVAR A CABO IN VITRO COMO UN METODO DE TERAPIA TROMBOLITICA EN EL QUE UNA METALOPROTEINASA FIBRINOLITICA SE ADMINISTRA A UN SUJETO PARA DEGRADAR UN TROMBO IN SITU. LA METALOPROTEINASA FIBRINOLITICA ENDOGENA SE PUEDE ADMINISTRAR JUNTO CON OTROS AGENTES ACTIVOS, PREFERIBLEMENTE CON AGENTES QUE TIENEN UNA ACTIVIDAD TROMBOLITICA PARA MEJORAR LA TERAPIA TROMBOLITICA Y FIBRINOLITICA. LA INVENCION, ADEMAS, PROPORCIONA UNAS COMPOSICIONES QUE CONTIENEN UNA METALOPROTEINASA FIBRINOLITICA PARA LA REALIZACION DE LOS PROCEDIMIENTOS FIBRINOLITICOS OTROMBOLITICOS. TAMBIEN, SE PROPORCIONAN UNOS CONJUNTOS QUE INCLUYEN UNA METALOPROTEINASA FIBRINOLITICA PARA REALIZAR LOS PROCEDIMIENTOS FIBRINOLITICOS O TROMBOLITICOS.
Description
Degradación de fibrina/fibrinógeno y lisis de
coágulos mediante una metaloproteinasa de matriz fibrinolítica.
Esta invención se refiere a un método de ruptura
de fibrinógeno y fibrina mediado por enzimas. Más particularmente,
la invención se refiere a un método para degradar fibrinógeno y
producir lisis de coágulos de fibrina mediante la mediación de una
metaloproteinasa de matriz fibrinolítica. La invención se refiere
además al uso de una metaloproteinasa fibrinolítica como un
antitrombótico para reconstruir vasos estenóticos y eliminar
depósitos de fibrina.
La coagulación sanguínea forma parte de la
respuesta natural del organismo ante la lesión o el traumatismo. La
formación de coágulos sanguíneos se deriva de una serie de
acontecimientos denominados cascada de coagulación, en la que las
etapas finales suponen la formación de la enzima trombina. La
trombina convierte el fibrinógeno circulante en fibrina, una
estructura similar a una red que forma la estructura insoluble del
coágulo sanguíneo. Como parte de la hemostasia, la formación de
coágulos a menudo es un proceso de salvamento en respuesta a un
traumatismo y sirve para detener el flujo de sangre procedente de la
vasculatura seccionada.
El proceso de salvamento de producción de
coágulos en respuesta a una lesión puede convertirse en
potencialmente mortal cuando se produce en lugares inapropiados en
el organismo. Por ejemplo, un coágulo puede obstruir un vaso
sanguíneo y detener el riego sanguíneo a un órgano o a otra parte
del organismo. Además, la acumulación de fibrina contribuye a la
estenosis parcial o completa de los vasos sanguíneos, dando como
resultado la disminución crónica del flujo sanguíneo. Igualmente son
potencialmente mortales los coágulos que llegan a desprenderse de
sus sitios originales y que fluyen a través del sistema circulatorio
produciendo bloqueos en sitios alejados. Tales coágulos se conocen
como embolias. En efecto, se ha calculado que las patologías de la
coagulación sanguínea, tales como ataques cardiacos, accidentes
cerebrovasculares y similares, ascienden a aproximadamente el
cincuenta por ciento de todas las muertes hospitalarias.
La formación de fibrina durante la inflamación,
la reparación tisular o la hemostasia, sólo desempeña un papel
temporal y debe eliminarse cuando se restaura la estructura y la
función tisular normal. Por tanto, un coágulo de fibrina que se
forme rápidamente para parar la hemorragia en un vaso sanguíneo
dañado se modifica y después se elimina para restaurar el flujo
sanguíneo normal cuando se produce la cicatrización. El sistema
responsable de la ruptura de la fibrina y la eliminación del coágulo
es el sistema fibrinolítico. La acción del sistema fibrinolítico
está estrictamente coordinada mediante la interacción de
activadores, zimógenos y enzimas, así como a través de inhibidores
de cada uno de estos componentes, para proporcionar activación local
concentrada en los sitios de acumulación de fibrina (Francis y col.,
1994; Collen 1980; Collen y col., 1991).
El principal mediador de la fibrinólisis es la
plasmina, una endopeptidasa similar a la tripsina que escinde la
fibrina para disolver los coágulos y para permitir que se regeneren
los tejidos lesionados. También se ha demostrado que la plasmina
desempeña un papel en la degradación de proteínas implicadas en las
interacciones célula-célula y
célula-matriz, así como en la activación de otras
enzimas que reconstruyen tejidos, tales como las metaloproteinasas
de matriz (Murphy y col., 1992). A su vez, el control de la
actividad de la plasmina, así como estos otros acontecimientos
extracelulares, está mediado principalmente por activadores del
plasminógeno, que convierten el zimógeno inactivo plasminógeno en la
enzima plasmática plasmina.
En la práctica clínica se desea comúnmente
activar o potenciar el sistema fibrinolítico. Esto es
particularmente necesario en casos de infarto de miocardio en los
que las arterias coronarias llegan a ocluirse y requieren
recanalización. Se ha demostrado que el cateterismo es, en cierto
modo, eficaz en tal recanalización, pero se desean agentes
farmacológicos que complementen o sustituyan tales procedimientos
invasivos para inhibir la reoclusión. El estudio del intricado
sistema de trombólisis y fibrinólisis ha sido un campo en rápido
crecimiento, que ha dado como resultado el desarrollo de una nueva
generación de agentes trombolíticos.
Los tratamientos terapéuticos anteriores para
disolver coágulos potencialmente mortales han incluido inyectar en
el sistema sanguíneo diversas enzimas que se sabe que rompen la
fibrina (Collen, 1996). Los problemas con estos tratamientos han
sido que las enzimas no eran específicas de sitio y, por tanto,
tendrían más efectos además de producir la disolución del coágulo.
Además, estas enzimas destruyen e interfieren con muchas
interacciones proteicas vitales que sirven para evitar que el
organismo sangre excesivamente debido a las muchas lesiones leves
que recibe diariamente. La destrucción de estas salvaguardias
mediante tales enzimas puede conducir a hemorragia grave y a otras
complicaciones potencialmente mortales.
En la actualidad, los agentes terapéuticos mejor
conocidos para inducir o intensificar la trombólisis son compuestos
que producen la activación del plasminógeno, los denominados
"activadores del plasminógeno" (Brakman y col., 1992). Estos
compuestos producen la hidrólisis del enlace peptídico
Arg560-Val651 en el plasminógeno. Esta hidrólisis da
lugar a la serín-proteasa activa bicatenaria, la
plasmina. Se conocen varios de tales activadores del plasminógeno,
incluyendo serín-proteasas tales como el activador
del plasminógeno tipo urocinasa (u-PA), el activador
del plasminógeno tipo tisular (t-PA), la
estreptocinasa (una proteína no enzimática) y la estafilocinasa. De
estos, la estreptocinasa es el agente trombolítico terapéutico más
ampliamente utilizado. Sin embargo, aunque la estreptocinasa y los
demás activadores del plasminógeno han demostrado ser útiles en la
recanalización de las arterias coronarias, su capacidad para mejorar
la mortalidad no carece de efectos secundarios y su uso todavía
requiere rigurosas condiciones de control para tener éxito en un
alto porcentaje de casos (Martin y col., 1994). Además, el uso de
tales compuestos puede producir complicaciones hemorrágicas en
individuos propensos. Por otra parte, uno de los inconvenientes del
uso de t-PA en ensayos clínicos ha sido la rápida
formación de nuevo del coágulo después de haberse disuelto, dando
como resultado la reoclusión trombótica en algunos pacientes.
Numerosos estudios han documentado la capacidad
de t-PA para iniciar o potenciar los fenómenos
trombolíticos (Sobel y col., 1987). Como resultado,
t-PA, específicamente su forma recombinante,
rt-PA, se está haciendo más popular como agente
farmacéutico trombolítico. No obstante, rt-PA sí que
presenta graves limitaciones, incluyendo el coste extremadamente
elevado de la dosis y la eficacia variable. Además, se han
identificado inhibidores específicos de acción inmediata de
t-PA en el plasma humano y en otros fluidos
corporales (Collen y col., 1987). Un enfoque adicional para
t-PA supone el uso potencial de la transferencia
génica de y la expresión del t-PA recombinante en
células endoteliales (Lee y col., 1993). Este procedimiento es
extremadamente complejo y no es probable que sea práctico como
tratamiento trombolítico en el futuro próximo.
También se conocen otras enzimas distintas a la
plasmina que pueden degradar fibrina/fibrinógeno en diferentes
grados. Por ejemplo, las proteasas leucocitarias endógenas
(Bilezikian y col., 1977; Plow y col., 1975), últimamente
identificadas como elastasa y catepsina G (Gramse y col., 1978;
Plow, 1980; Plow y col., 1982), pueden degradar parcialmente
fibrina/fibrinógeno. También se conocen enzimas exógenas que
degradan fibrina. Tales enzimas incluyen las enzimas hemolíticas
recogidas del veneno de ciertas serpientes, por ejemplo, de las
familias crotalidae y viperidae (Purves y col., 1987;
Retzios y col., 1992; Sánchez y col., 1991). Las enzimas
fibrinolíticas aisladas de las serpientes pueden agruparse en dos
clases diferentes (Guan y col., 1991). Estas enzimas (que degradan
preferentemente la cadena A\alpha del fibrinógeno y también las
cadenas \alpha y \beta de la fibrina, son metaloproteasas de
zinc (Guan y col., 1991) y todas pueden inhibirse mediante EDTA. Las
enzimas de la segunda clase son las
serín-proteinasas y muestran especificidad por la
cadena \beta de la fibrina (Guan y col., 1991). Una endopeptidasa
procedente del veneno de la víbora bufadora (Bitis arietans)
puede escindir en el sitio de reticulación de la cadena \gamma y
de este modo, escindir el Fragmento dímero D en un monómero similar
a D (Purves y col., 1987). También se han obtenido enzimas
fibrinolíticas de las sanguijuelas (Zavalova y col., 1993;
Budzynski, 1991), así como a partir del medio de crecimiento de una
bacteria (Aeromonas hydrophilia) que se recogió del tubo
digestivo de la sanguijuela (Loewy y col., 1993).
Las metaloproteinasas de matriz (MMP) endógenas o
"matrixinas" ("matrixins") incluyen tres clases de
enzimas: colagenasas, gelatinasas y estromelisinas. Se sabe que las
MMP tienen capacidad para degradar varias proteínas y proteoglicanos
que están asociados con la matriz extracelular (ECM) del tejido
conjuntivo. Se ha demostrado que rompen varias proteínas, incluyendo
el colágeno (tipos I-IV, VII y X), la laminina, la
fibronectina, la elastina y los proteoglicanos. Las MMP también se
han identificado en los leucocitos (Welgus y col., 1990). Se ha
demostrado que MMP-2 y MMP-9 tienen
actividad elastasa (Señor y col., 1991), a la que podría atribuirse
parte de la actividad proteolítica compleja, observada inicialmente
en los granulocitos (Sterrenberg y col., 1983). Las MMP participan
en la reconstrucción de los tejidos en procesos fisiológicos tales
como la morfogénesis y el desarrollo embrionario, así como en la
patofisiología de la cicatrización de heridas, la invasión tumoral y
la artritis (Matrisian 1992; Nagase y col., 1991; Woessner, 1991;
Werb y col., 1992).
La expresión de las MMP y de sus inhibidores se
produce bajo control molecular y celular amplio y variado (Kleiner y
col., 1993; Matrisian, 1992; Woessner, 1991). Factores de regulación
conocidos incluyen hormonas, citocinas, protooncogenes, esteroides y
factores de crecimiento. Las MMP se bloquean por inhibidores
específicos denominados "inhibidores tisulares de
metaloproteinasas" (TIMP) que pueden bloquear la actividad de
cada elemento de la familia. Se forma un complejo enzima -inhibidor
y no tiene lugar ningún recambio del tejido conjuntivo si las MMP
están presentes en exceso. El principal enfoque de investigación
sobre la ECM ha sido limitar la degradación de la ECM mediante las
MMP para interrumpir o interferir en la progresión de los estados
patológicos. Varios grupos de investigadores están obteniendo
moléculas pequeñas que podrían inhibir las proteinasas para alterar
su actividad destructiva en la artritis y como factores
antiangiogénicos para inhibir la diseminación tumoral.
La metaloproteinasa de matriz 3
(MMP-3) pertenece a la clase de estromelisinas de
las metaloproteinasas de matriz. La MMP-3 se expresa
en los macrófagos maduros (Campbell y col., 1991), pero también en
las células endoteliales, las células del músculo liso y los
fibroblastos. Más recientemente, se ha demostrado que la
MMP-3 se expresa en células espumosas derivadas de
macrófagos procedentes del ateroma de experimentación (Galis y col.,
1995). El zimógeno inactivo,
pro-MMP-3, se activa mediante la
elastasa del neutrófilo, la calicreína plasmática, la plasmina, la
quimiotripsina, la tripsina, la catepsina G y la triptasa del
mastocito, así como mediante compuestos de mercurio, tales como
acetato 4-aminofenilmercúrico (APMA) (Nagase y col.,
1992; Kleiner y col., 1993; Nagase y col., 1990; Nagase, 1991). Se
han encontrado niveles elevados de MMP-3 en las
articulaciones de pacientes que padecen artrosis y artritis
reumatoide. En las placas ateroescleróticas hay una gran cantidad de
antígeno relacionado con fibrina/fibrinógeno (FRA) que consiste en
diferentes formas moleculares (Bini y col., 1987; Bini y col., 1989;
Smith y col., 1990; Valenzuela y col., 1992). Dos estudios muy
recientes han demostrado la presencia de la metaloproteinasa de
matriz 3 en las placas ateroescleróticas (Henney y col., 1991; Galis
y col., 1994), pero su función en este contexto sigue sin aclararse.
Además, la MMP-3 se ha visto en estos estudios como
un factor negativo
potencial.
potencial.
Los sustratos conocidos de MMP-3
incluyen proteoglicanos, colágeno tipo IV, fibronectina y laminina.
Tales sustratos son habituales de las metaloproteinasas de matriz en
general (Doolittle, 1987). Sin embargo, no se ha sugerido que
ninguna metaloproteinasa endógena pudiera participar en la
degradación de fibrinógeno o fibrina. Ni ha habido ninguna
indicación de que las metaloproteinasa pudieran utilizarse para la
fibrinólisis o la trombólisis.
A partir de la discusión anterior, está claro que
existen lagunas significativas en la comprensión de los procesos
implicados en la formación y degradación de trombos. Aunque se han
identificado ciertos enfoques que permiten una medida de control
sobre estos procesos, estos enfoques adolecen de graves deficiencias
relacionadas con el coste, la eficacia o la seguridad. También se ha
encontrado que falta el diagnóstico y el tratamiento de estados
patológicos asociados con los procesos fisiológicos en los que
participan el fibrinógeno y la fibrina.
Como resultado, existe la necesidad de
composiciones eficaces para su uso en la limitación del desarrollo
de trombos y en la inducción de trombólisis.
Son necesarios métodos para disgregar coágulos
sanguíneos y placas ateroescleróticas, tanto in vitro, tales
como para fines diagnósticos, como in vivo, tales como para
el tratamiento terapéutico de la embolia, la ateroesclerosis y otros
trastornos clínicamente importantes.
Además, existe una necesidad de materiales y
métodos de diagnóstico y experimentación para revelar más
información concerniente a los procesos físicos y químicos que
participan en la formación y la degradación de trombos.
Además, existe una necesidad de tratamiento
eficaz para restaurar al menos parte de la integridad de una pared
de vaso dañada, para estimular la regresión de las placas
ateroescleróticas y para ayudar en la angioplastia y la cirugía de
bypass (revascularización quirúrgica) para evitar la reoclusión.
La presente invención proporciona un método para
degradar fibrina, fibrinógeno y sustancias relacionadas (es decir,
"fibrina/fibrinógeno") mediante una metaloproteinasa
fibrinolítica (FMP). La metaloproteinasa fibrinolítica es una
estromelisina, preferiblemente, estromelisina endógena. Más
preferiblemente, la metaloproteinasa fibrinolítica incluye la
metaloproteinasa de matriz 3 (MMP-3). La
metaloproteinasa fibrinolítica escinde o degrada preferiblemente
fibrina/fibrinógeno en el enlace peptídico designado como
\gammaGly404-Ala405.
El método inventivo puede realizarse in
vitro. In vitro, el método supone poner en contacto una
muestra de tejido, tal como sangre o plasma, con al menos una
metaloproteinasa de matriz fibrinolítica. En este método, la fibrina
puede degradarse como un constituyente de los coágulos y/o las
placas ateroescleróticas con el fin de investigar la estructura de
tales materiales, así como para la investigación adicional de los
mecanismos de la fibrinólisis y la trombólisis. El fibrinógeno puede
degradarse para fines de experimentación o diagnóstico relacionados
con la formación de fibrina o para evitar el crecimiento potencial
de una red de fibrinógeno-fibrina.
En un método de diagnóstico preferido, el método
incluye poner en contacto una muestra que contiene
fibrina/fibrinógeno con al menos una metaloproteinasa fibrinolítica
endógena para proporcionar productos de degradación.
Preferiblemente, el método incluye analizar los productos de
degradación para caracterizar la fibrina/fibrinógeno. Tal análisis
incluye normalmente separar diferencialmente los diversos productos
de degradación. Los productos de degradación pueden identificarse o
medirse mediante varios medios. Por ejemplo, los fragmentos pueden
detectarse mediante anticuerpos que se unen o se asocian
específicamente con una región(es) particular(es) de
fibrina/fibrinógeno o que no se asocian con ellos debido a la
pérdida del epítopo inducida por la degradación enzimática.
Preferiblemente, tales anticuerpos son monoespecíficos, más
preferiblemente monoclonales. Pueden utilizarse anticuerpos
sintéticos y/o quiméricos, como también regiones de unión al
antígeno, tal como Fab y F(ab')_{2}. La medida de la
asociación específica entre tales anticuerpos y los fragmentos de
degradación puede proporcionar información cualitativa o
cuantitativa acerca de la muestra de fibrina/fibrinógeno que se está
analizando. Tales anticuerpos pueden marcarse de manera que se
puedan detectar para ayudar en la medición de los tipos y las
cantidades de los productos de degradación. Alternativamente, pueden
emplearse anticuerpos fijados a un sustrato para ayudar en la
separación o la purificación de los fragmentos de degradación
producidos por una metaloproteinasa fibrinolítica.
La invención también proporciona el uso de una
estromelisina para la fabricación de un medicamento para realizar un
tratamiento trombolítico, embolítico o aterolítico en un sujeto
vertebrado, preferiblemente un primate, más preferiblemente un ser
humano. Normalmente, la metaloproteinasa fibrinolítica ha de
administrarse en una composición terapéutica que comprende la
metaloproteinasa y un vehículo o diluyente farmacológicamente
aceptable. Opcionalmente, la composición administrada puede incluir
además uno o más de otros principios activos, como un complemento a
la actividad fibrinolítica de la metaloproteinasa. Compuestos
complementarios adecuados incluyen compuestos que tienen actividad
trombolítica o fibrinolítica. Por ejemplo, tales compuestos
complementarios pueden ser un activador del plasminógeno, la
hirudina, un inhibidor enzimático, un anticoagulante, un anticuerpo
o un péptido sintético específico del receptor plaquetario
gpIIb/IIIa, o una combinación de los mismos.
La estromelisina puede utilizarse para evitar o
mejorar las complicaciones asociadas con la ateroesclerosis (es
decir, para degradar el fibrinógeno y la fibrina en placas antes de
que se produzca la oclusión), así como para evitar la reoclusión
tras el tratamiento trombolítico, por ejemplo con
t-PA, tras el infarto de miocardio. De hecho,
t-PA es de acción inmediata, mientras que una
metaloproteinasa MMP3 preferida tiene una acción más lenta y
progresiva. Por tanto, los compuestos pueden usarse beneficiosamente
en combinación, incluyendo el uso secuencial o concurrente. La
estromelisina también puede utilizarse como un agente profiláctico
para inhibir la reestenosis tras una intervención quirúrgica, tal
como cirugía de bypass o angioplastia. Alternativamente, la
estromelisina puede usarse en el tratamiento aterolítico, para
inhibir la formación inicial, o para estimular la regresión, de las
placas ateroescleróticas.
Además, la invención proporciona equipos
diagnósticos y terapéuticos que incluyen una metaloproteinasa de
matriz fibrinolítica. La metaloproteinasa fibrinolítica es
preferiblemente endógena. La metaloproteinasa incluye una
estromelisina, más preferiblemente, MMP-3. También
se prefiere que la metaloproteinasa escinda o hidrolice
fibrina/fibrinógeno en el enlace peptídico
\gammaGly404-Ala405. Tales equipos pueden incluir
uno o más envases, así como reactivo(s) adicional(es)
y/o principio(s) activo(s) y/o inerte(s) para
realizar cualquier variación en el método inventivo. Reactivos de
ejemplo incluyen, sin limitación, sustratos sintéticos para probar
la actividad enzimática, y anticuerpos (preferiblemente
monoespecíficos, por ejemplo, monoclonales) para medir el aumento o
la disminución del nivel de antígeno. Equipos preferidos incluyen al
menos una dosis unitaria terapéuticamente eficaz de una
metaloproteinasa fibrinolítica. También se prefieren los equipos que
incluyen medios para administrar, preferiblemente por vía
parenteral, más preferiblemente por vía intravenosa, una composición
que contiene una metaloproteinasa fibrinolítica. Los equipos pueden
incluir uno o más de otros principios activos como complementos,
tales como activadores del plasminógeno, hirudina o anticoagulantes,
tales como heparina o aspirina. Estos otros componentes pueden
incluirse en composiciones separadas, en envases de reactivos
separados, o pueden incluirse todos juntos y/o con la
metaloproteinasa fibrinolítica en un único envase de reactivo. Los
equipos también pueden incluir instrucciones para mezclar o combinar
los componentes y/o para usar el equipo según la invención.
La invención proporciona además un método para
controlar la formación de trombos producidos por aparatos
relacionados con la medicina. En esta realización, el método incluye
poner en contacto un aparato relacionado con la medicina con una
composición que incluya una metaloproteinasa de matriz
fibrinolítica, preferiblemente MMP-3. La
metaloproteinasa se adhiere o se une deseablemente a una superficie
del aparato. El método puede usarse para modificar las superficies
de contacto con la sangre de dispositivos protésicos implantables,
tales como cánulas, catéteres, injertos, stents (endoprótesis),
filtros, dispositivos intrauterinos, válvulas y similares, para
proporcionar superficies que inhiban la formación de coágulos o
placas. Alternativamente, el método permite la modificación
fibrinolítica de aparatos tales como agujas, tubos de recogida de
sangre, matraces de cultivo, placas de prueba, pipetas, envases de
reactivos, tubos, membranas y similares, para estimular la
fibrinólisis y para inhibir la polimerización del fibrinógeno y la
formación de trombos que, en caso contrario, podrían interferir con
los protocolos de experimentación. Asimismo, la invención
proporciona aparatos relacionados con la medicina, tales como
dispositivos implantables, material de laboratorio y otros
dispositivos para usos in vivo e in vitro, aparatos
que se han modificado para que incluyan metaloproteinasa
fibrinolítica adherida.
Éstas y otras ventajas de la presente invención
se apreciarán a partir de la descripción detallada y de los ejemplos
que se explican a continuación en el presente documento. La
descripción detallada y los ejemplos mejoran la comprensión de la
invención, pero no están destinados a limitar el alcance de la
invención.
Las realizaciones preferidas de la invención se
han escogido a modo de ilustración y descripción, pero no están
destinadas en modo alguno a restringir el alcance de la presente
invención. Las realizaciones preferidas de ciertos aspectos de la
invención se muestran en los dibujos adjuntos, en los que:
La figura 1 muestra un análisis electroforético
de fibrinógeno tratado con MMP-2 o
MMP-3, que muestra la degradación diferencial del
fibrinógeno por cada una de las enzimas.
La figura 2A es un gráfico que muestra la lisis
comparativa de un coágulo de fibrina por MMP y plasmina, medida
mediante el porcentaje de radiactividad en los sobrenadantes de la
muestra.
La figura 2B es un gráfico que muestra la lisis
comparativa de un coágulo de fibrina por MMP y plasmina, medida
mediante el porcentaje de radiactividad en los coágulos
residuales.
La figura 3 muestra un análisis electroforético
de fibrina tratada con MMP-2, MMP-3
y plasmina, que muestra la degradación diferencial del fibrinógeno
por cada una de las enzimas.
La figura 4A muestra un inmunoblot
(inmunotransferencia) de los productos de degradación de la
digestión de fibrina por MMP-3 y plasmina, medido
con MoAb/4-5 (\gamma392-406).
La figura 4B muestra un inmunoblot
(inmunotransferencia) de los productos de degradación de la
digestión de fibrina por MMP-3 y plasmina, medido
con MoAb/45 (\gamma397-411).
La figura 5 muestra un inmunoblot de los
productos de degradación de la digestión de fibrina por
MMP-3, medido con MoAb/T2G1
(B\beta15-42) y MoAb/1D4
(A\alpha349-406).
La figura 6A muestra un análisis electroforético
(condiciones no reductoras) del dímero D tratado con
MMP-3, que muestra la degradación dependiente del
tiempo y de la concentración del dímero D por
MMP-3.
La figura 6B muestra un análisis electroforético
(condiciones reductoras) del dímero D tratado con
MMP-3, que muestra la degradación dependiente del
tiempo y de la concentración del dímero D por
MMP-3.
La figura 7 es un diagrama esquemático que
muestra la región de reticulación en la fibrina reticulada, que
muestra los sitios de escisión de MMP-3 y CNBr.
La figura 8 muestra un análisis electroforético
de los productos de degradación del fibrinógeno y la fibrina
reticulada por MMP-3.
Tal como se observó anteriormente, dos estudios
muy recientes han identificado la presencia de MMP-3
en placas ateroescleróticas (Henney y col., 1991; Galis y col.,
1994). Estos estudios han considerado la presencia de las MMP en las
placas como un factor negativo que podría favorecer la formación de
fisuras en las placas. Sin embargo, la presente invención concuerda
con una interpretación completamente diferente de la función de
MMP-3. La invención se refiere al papel inesperado
que se ha descubierto que desempeña MMP-3 en la
degradación del fibrinógeno y la fibrina.
Para una mayor claridad y exactitud en la
descripción de la invención en el presente documento, se han
adoptado ciertos convenios terminológicos en la discusión siguiente.
Estos convenios están destinados a proporcionar un medio práctico
para mejorar la descripción de la invención, pero no están
destinados a ser limitantes, y el experto en la técnica apreciará
que pueden incluirse otras interpretaciones adicionales, aunque no
contradictorias.
Por ejemplo, la invención se refiere al uso de
una metaloproteinasa de matriz para degradar fibrina y fibrinógeno.
Las metaloproteinasas de matriz útiles según la invención deben
mostrar alguna actividad enzimática frente a fibrina, fibrinógeno
y/o proteínas, polipéptidos u oligopéptidos relacionados.
Metaloproteinasas de matriz que muestran esta actividad se denominan
"metaloproteinasas de matriz fibrinolíticas" o "MMP
fibrinolíticas".
La metaloproteinasa de matriz fibrinolítica puede
ser exógena o endógena. Se prefiere que la metaloproteinasa
fibrinolítica sea endógena. Tal como se usa en el presente
documento, el término "endógeno" significa que la
metaloproteinasa fibrinolítica tiene como origen la especie en la
que ha de realizarse la invención. La especie puede ser cualquier
vertebrado, preferiblemente, un mamífero y más preferiblemente un
primate, más preferiblemente un sujeto humano. De acuerdo con esto,
cuando la invención se emplea en un sujeto humano, se prefiere que
la metaloproteinasa activa sea endógena para seres humanos, es
decir, de origen humano, ya se emplee como una composición
farmacéutica o como resultado del tratamiento diseñado para mejorar
el control interno del sistema fibrinolítico del sujeto. Para los
procedimientos in vitro, el origen de la metaloproteinasa
fibrinolítica es menos crítico, pero se prefiere que la
metaloproteinasa tenga un origen lo más próximo posible al origen de
la especie de la muestra biológica que se está examinando. En tales
métodos, la metaloproteinasa es endógena para la muestra si se
deriva de la especie a la que pertenece la muestra probada.
Las metaloproteinasas fibrinolíticas endógenas
incluyen cualquiera de la clase de estromelisina de las
metaloproteinasas. Las estromelisinas preferidas incluyen
MMP-3 (estromelisina-1),
MMP-10 (estromelisina-2) y
MMP-11 (estromelisina-3). Una MMP
fibrinolítica endógena sumamente preferida es MMP-3.
Se ha encontrado que MMP-3 hidroliza
fibrina/fibrinógeno en el enlace peptídico
\gammaGly404-Ala405 en la región de reticulación
de la cadena gamma.
Se sabe que, debido a la fluidez y la complejidad
de la fisiología de la formación y la degradación de fibrina, muchas
formas de fibrina y fibrinógeno están presentes en la sangre
circulante, así como en las lesiones trombóticas y
ateroescleróticas. Las muchas formas de estas moléculas resultan del
ataque continuo por enzimas proteolíticas que escinden de manera
diversa las moléculas. El método de la invención se realiza mediante
una MMP fibrinolítica que tiene actividad al menos frente a un
compuesto relacionado con fibrinógeno o fibrina. Si una molécula
derivada de fibrinógeno se ha escindido o modificado previamente
para eliminar todos los sitios de escisión de MMP, entonces esa
molécula ya no puede actuar como sustrato para una MMP
fibrinolítica. Ahora se ha encontrado inesperadamente que los
sustratos para MMP-3 incluyen, entre otros,
fibrinógeno y fibrina naturales y también se esperaría que
incluyeran formas modificadas, sintéticas y semisintéticas de estos
compuestos, así como un gran número de productos de escisión de
estos compuestos. La clase de sustancias que se derivan del
fibrinógeno y/o de la fibrina o que están relacionadas con ellos
puede denominarse "fibrina/fibrinógeno". Por tanto, el método
de la invención puede llevarse a cabo utilizando cualquier MMP que
actúe para degradar un resto de fibrina/fibrinógeno. Aunque tales
enzimas se denominan generalmente "fibrinolíticas", también
pueden denominarse de manera más precisa MMP
"fibrin(ogen)olíticas".
Se sabe que el fibrinógeno (también abreviado en
el presente documento como "Fg") es una proteína homodimérica,
en la que cada monómero incluye tres cadenas polipeptídicas
sustancialmente homólogas, identificadas como cadenas \alpha
(alfa), \beta (beta) y \gamma (gamma). Para una revisión, véase
Doolittle (1987). Por tanto, el fibrinógeno tiene la estructura
(\alpha\beta\lambda)_{2}. Las tres subunidades del
fibrinógeno tienen dominios enrollados que permiten que las
subunidades se ajusten entre sí para formar una región de "espiral
enrollada" en el monómero de fibrinógeno. Además, las cadenas
beta y gamma tienen cada una un dominio globular, mientras que la
cadena alfa está presente en dos formas; una forma predominante que
no tiene dominio globular correspondiente (\alpha) y una forma
menos frecuente en la que está presente un dominio globular
(\alpha_{E})(Fu y col., 1994). De acuerdo con esto, debido a que
el fibrinógeno es homodimérico y debido a que se han identificado
dos formas de la subunidad alfa, se conocen dos formas principales
de fibrinógeno: (\alpha\beta\gamma)_{2} y
(\alpha_{E}\beta\gamma)_{2}. Ambas formas de fibrinógeno
se consideran sustratos de las MMP fibrinolíticas según la
invención. Los heterodímeros artificiales del fibrinógeno, así como
las formas recombinantes, también están dentro de la clase de los
sustratos de la MMP fibrinolítica.
Tal como se ha mencionado, la fibrina (también
abreviada en el presente documento como "Fb") se genera
mediante una polimerización inducida y controlada de fibrinógeno (Fu
y col., 1994). Dado que se conocen varias formas de fibrinógeno en
la sangre circulante, se sabe que pueden producirse varias
estructuras de polimerización para la fibrina. La estructura de la
fibrina puede afectar a los procesos de fibrinólisis (Gabriel y
col., 1992). Ahora se ha encontrado que una metaloproteinasa
fibrinolítica lisa eficazmente la fibrina. Por tanto, parece que las
metaloproteinasas fibrinolíticas son activas frente a la fibrina sin
estar sustancialmente limitadas por las peculiaridades de
reticulación de la fibrina. De acuerdo con esto, se considera que la
fibrina es un sustrato de MMP según la invención. Por tanto, la
fibrina que se produce naturalmente en un sujeto es adecuada para la
degradación según la invención, como lo es la fibrina inducida in
vitro. Por tanto, los coágulos que se inducen en la sangre ex
vivo, por ejemplo, en una muestra de sangre, pueden degradarse
según la invención. En tales aplicaciones in vitro, puede
emplearse una metaloproteinasa fibrinolítica como un recubrimiento
de un envase, tal como un tubo de recogida de sangre. Además, la
fibrina artificial, formada a partir de fibrinógeno natural,
sintético, semisintético, recombinante y/o de otros tipos, también
puede degradarse mediante el método descrito en el presente
documento.
En condiciones fisiológicas, la plasmina es la
enzima principal que actúa para degradar la fibrina. La acción de la
plasmina se limita al sitio de acumulación de la fibrina mediante
mecanismos de control plasmáticos que evitan la proteolisis de las
proteínas circulantes. Sin embargo, en condiciones patológicas, se
sabe que la plasmina degrada las proteínas plasmáticas,
especialmente el fibrinógeno.
El fibrinógeno degradado puede separarse mediante
cromatografía de intercambio iónico en cinco fracciones (A, B, C, D
y E), de las que los fragmentos D y E son los productos finales
principales de la molécula original. La identificación y la
caracterización de los fragmentos X e Y intermedios y transitorios
hizo que se llegara a comprender el desarrollo de un esquema
asimétrico de degradación del fibrinógeno (Francis y col.,
1994).
Clásicamente, la estructura del fibrinógeno es
bilateralmente simétrica, incluyendo un dominio E globular central
que es un "nudo" constituido por las regiones
N-terminales de las seis cadenas en la molécula de
fibrinógeno. Desde E se extienden dos espirales enrolladas,
conteniendo cada una de ellas partes de un conjunto de las cadenas
\alpha, \beta y \gamma. En los otros extremos de las espirales
enrolladas hay dominios D globulares. Extendiéndose desde los
dominios D, hay extensiones de la cadena A\alpha, que, únicamente
en la subunidad \alpha_{E}, terminan en otro dominio globular.
Con el ataque proteolítico mediante plasmina, las
escisiones iniciales liberan el extremo polar carboxilo terminal de
la cadena A\alpha y un péptido de la parte
N-terminal de la cadena B\beta
(B\beta1-42). El principal fragmento restante es
el Fragmento X. Las escisiones de las tres cadenas polipeptídicas a
lo largo de una espiral enrollada que conecta el nudo (E) central
N-terminal y un dominio (D) terminal del fragmento X
lo dividen asimétricamente. El resultado es una molécula de
fragmento D, que consiste en partes carboxilo terminales de las tres
cadenas y un resto de fragmento Y, que consiste en los dominios
central y terminal todavía conectados mediante una espiral
enrollada. La escisión posterior de la espiral enrollada del
fragmento Y produce un segundo fragmento D y un resto de fragmento
E. El fragmento X se puede coagular lentamente mediante trombina,
pero los fragmentos Y y D tienen potentes efectos
antipolimerizantes, debido principalmente a la disgregación del
alineamiento apropiado y a la continuación de la acumulación de
protofibrillas de fibrina.
El conocimiento de la fragmentación convencional
del fibrinógeno ayuda a proporcionar un marco conceptual con el que
comparar la actividad de otras enzimas fibrinolíticas potenciales.
Además, se han desarrollado anticuerpos que son reactivos
específicamente o que se unen específicamente sólo a algunos de los
fragmentos, permitiéndose de ese modo la identificación molecular de
los fragmentos con gran exactitud y precisión (Kudryk y col.,
1989a). Usando este conocimiento, ahora se ha identificado
inesperadamente la actividad fibrinolítica de una metaloproteinasa
endógena, permitiéndose de ese modo el desarrollo del método de la
invención.
La invención proporciona, entre otros, un método
de degradación de fibrina/fibrinógeno. Generalmente, el método
requiere el uso de una metaloproteinasa de matriz endógena que tenga
actividad enzimática, es decir, que pueda hidrolizar la fibrina y/o
el fibrinógeno. El método incluye poner en contacto la fibrina o el
fibrinógeno con una cantidad eficaz de una metaloproteinasa de
matriz fibrinolítica, preferiblemente MW-3.
El método incluye normalmente poner en contacto
el fibrinógeno o la fibrina con una metaloproteinasa de matriz. Las
composiciones que incluyen una metaloproteinasa fibrinolítica
también pueden incluir otros principios activos y/o inertes. Otros
principios activos pueden incluir componentes tales como inhibidores
de las MMP, activadores del plasminógeno, otras enzimas
fibrinolíticas, reactivos de anticoagulación, etc. Si se emplea otro
principio activo, se prefiere incluir en la composición un activador
del plasminógeno. Se ha encontrado que la metaloproteinasa de matriz
3, en particular, no compite sustancialmente ni inhibe
sustancialmente el t-PA ni la plasmina. De acuerdo
con esto, el método de la invención puede incluir activadores del
plasminógeno, tales como u-PA, t-PA,
estafilocinasa, estreptocinasa o formas recombinantes, sintéticas o
semisintéticas de los mismos.
La invención también permite ahora la
investigación de la interacción de MMP-3 con
activadores del plasminógeno, inhibidores de activadores del
plasminógeno (por ejemplo, PAI-1) y plasminógeno
natural. Por ejemplo, aunque se sabe que la plasmina puede activar
MMP-3, no se sabe si MMP-3 activa
t-PA o u-PA, o si por el contrario,
podría activarse por ellos. Tampoco se sabe si MMP-3
podría activar el plasminógeno natural.
También puede ser deseable incluir un agente de
anticoagulación, tal como heparina, para inhibir o evitar una nueva
coagulación. Tales medidas serían menos críticas en las aplicaciones
in vitro, pero podrían ser significativamente útiles en
aplicaciones in vivo. La combinación de t-PA
con heparina para definir una composición trombolítica de doble
función se muestra en la patente de los EE.UU. número 5.130.143.
En una realización preferida, la invención
permite el tratamiento fibrinolítico de un mamífero, preferiblemente
de un sujeto humano. En esta realización, el método incluye la
administración a un sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz
de una metaloproteinasa de matriz que degrada fibrina/fibrinógeno.
La metaloproteinasa incluye preferiblemente una estromelisina
endógena y, más preferiblemente MMP-3. El uso
terapéutico puede emplearse para la trombólisis, o para evitar la
progresión y para facilitar de la regresión de las placas
ateroescleróticas. Por tanto, el método puede llevarse a cabo para
el tratamiento de dosis única o de urgencia o para el tratamiento de
mantenimiento o prolongado para reducir la posibilidad o para
inhibir el desarrollo de placas ateroescleróticas, embolia o trombos
anómalos.
Los modos de administración de tal composición se
conocen en la técnica y están relacionados con aquellas técnicas
empleadas en la administración de agentes trombolíticos
convencionales. Tales métodos incluyen, sin limitación, métodos
parenterales, preferiblemente métodos intravasculares, tales como la
inyección intravenosa, inyección intraarterial y administración
mediante catéter.
La determinación de la cantidad eficaz de una
composición de la invención depende del criterio del médico experto.
Las dosis terapéuticas o profilácticas específicas y las horas de
administración pueden seleccionarse dependiendo de las condiciones
imperantes para lograr el tratamiento clínicamente aceptable. El
médico experto tendrá en cuenta factores tales como la edad, el
sexo, el peso y el estado del sujeto, así como la vía de
administración. El médico experto también reconocerá que la
actividad fibrinolítica de las MMP puede intensificarse mediante la
administración colateral (es decir, la coadministración o la
administración secuencial) de otros principios activos y/o inertes.
Por ejemplo, puede ser deseable administrar agentes complementarios
que tengan actividad trombolítica. Estos agentes pueden tener
actividad fibrinolítica directa o pueden ser reguladores o
moduladores de la fibrinólisis en el sistema en el que se emplean.
Por ejemplo, agentes que tienen actividad trombolítica incluyen
activadores del plasminógeno, hirudina, enzimas (por ejemplo,
proteasas derivadas del veneno de serpiente), inhibidores
enzimáticos, anticoagulantes (por ejemplo, heparina, aspirina),
anticuerpos (preferiblemente anticuerpos monoclonales) o péptidos
sintéticos específicos para el receptor plaquetario gpIIb/IIIa, o
una combinación de los mismos. Varios de tales agentes trombolíticos
se describen en Collen (1996). Estos agentes pueden administrarse
junto con, o de manera auxiliar a la administración de una
composición que contenga MMP. Por tanto, tal otro agente o agentes
pueden incluirse en la composición que contiene metaloproteinasa o
pueden administrarse como parte de otra composición.
En otra realización, la invención incluye
metaloproteinasas fibrinolíticas dirigidas, es decir,
metaloproteinasas que se unen a restos que tienen especificidad por
una molécula biológica diana. Por ejemplo, una metaloproteinasa
puede unirse a un anticuerpo mediante métodos conocidos en la
técnica para la unión de proteínas a anticuerpos. De esta forma, una
metaloproteinasa puede dirigirse preferentemente a un sustrato de
fibrina (fibrinógeno) para mejorar la eficacia de
fibrin(ogen)olítica. Por tanto, una metaloproteinasa
fibrinolítica tal como MMP-3 puede unirse a
anticuerpos que tienen especificidad por fibrina o por un producto
de degradación de la misma, a plaquetas, específicamente a la
P-selectina, a lipoproteínas oxidadas, etc.
La invención también proporciona un método de
diagnóstico para la caracterización del fibrinógeno. En este método,
la fibrina/fibrinógeno se pone en contacto con una metaloproteinasa
de matriz endógena, preferiblemente MMP-3, para
producir productos de degradación. Los productos de degradación se
analizan después para determinar los tipos y las cantidades de los
productos de escisión generados por la actividad de la MMP.
Normalmente, el método supone la separación
diferencial de los productos de degradación, tal como la separación
de los productos mediante electroforesis en gel. Los productos se
miden después tal como mediante tinción no específica para revelar
las cantidades de productos de tamaños diferentes. Alternativamente,
los productos pueden identificarse poniendo en contacto los
productos con anticuerpos que son específicamente reactivos o que se
asocian específicamente con uno o más dominios de la
fibrina/fibrinógeno (Kudryk y col., 1989a). Preferiblemente, tales
anticuerpos son específicamente reactivos con un único producto de
degradación, permitiendo así la caracterización del producto en
relación con otros productos.
Nuevos anticuerpos, útiles según el método de
diagnóstico de la invención, pueden desarrollarse y marcarse de
manera que se puedan detectar con cualquier grupo marcador
detectable. Tales grupos marcadores adecuados incluyen, por ejemplo,
marcadores fluorescentes, marcadores enzimáticos y marcadores
radiactivos. Los grupos detectores útiles según la invención
incluyen, por ejemplo, fluoresceína como marcador fluorescente,
peroxidasa de rábano picante como marcador enzimático y
yodo-125 (^{125}I) como marcador radiactivo.
Marcadores fluorescentes adicionales que pueden utilizarse en la
invención incluyen, pero no se limitan a, rodamina, ficoeritrina y
compuestos adicionales que emitan energía fluorescente. Marcadores
enzimáticos adicionales que pueden utilizarse en esta invención
incluyen, pero no se limitan a, glucosa oxidasa y fosfatasa
alcalina. Marcadores radiactivos adicionales que pueden utilizarse
en esta invención incluyen, pero no se limitan a,
yodo-131 (^{131}I) e indio-111
(^{111}In).
Los marcadores detectables adecuados pueden
seleccionarse de entre los conocidos en la técnica, tal como
marcadores radiactivos, enzimas, componentes de pares de unión
específica, sustancias colorantes coloidales, fluorocromos,
sustancias reductoras, látex, digoxigenina, metales, materiales
particulados, dansil-lisina, anticuerpos, proteína
A, proteína G, materiales densos en electrones, cromóforos y
similares. Puede emplearse eficazmente cualquier marcador adecuado,
ya pueda detectarse directa o indirectamente. Un experto en la
técnica reconocerá claramente que estos marcadores expuestos
anteriormente son meramente ilustrativos de los diferentes
marcadores que podrían utilizarse en el método de diagnóstico de la
invención.
Los anticuerpos reactivos con las subunidades del
fibrinógeno también pueden derivatizarse mediante conjugación con
biotina y usarse, con la adición de especies de avidinas que se han
convertido en detectables mediante la conjugación con marcadores
fluorescentes, marcadores enzimáticos, marcadores radiactivos,
marcadores densos en electrones, etc., en una multiplicidad de
aplicaciones inmunoquímicas e inmunohistológicas.
Alternativamente, el método de la invención puede
llevarse a cabo utilizando anticuerpos que se han ligado o unido a
materiales sustrato según métodos conocidos por los expertos en la
técnica. Tales materiales son en general sustancialmente sólidos y
relativamente insolubles, confiriendo estabilidad a la disgregación
física y química de los anticuerpos y permitiendo que los
anticuerpos se dispongan en distribuciones espaciales específicas.
Entre los materiales sustrato, los materiales pueden escogerse según
los fines deseados por el experto e incluir materiales tales como
geles, hidrogeles, resinas, perlas, nitrocelulosa, filtros de nylon,
placas de microtítulo, matraces de cultivo, materiales poliméricos y
similares, sin limitación.
El método de la presente invención puede incluir
ensayos inmunológicos para determinar la presencia de productos de
ruptura de fibrina/fibrinógeno en muestras de tejidos procedentes de
sujetos humanos o animales. Muestras de biopsia y autopsia de
sujetos, así como muestras de librerías de tejidos o bancos de
sangre, pueden evaluarse para determinar la presencia de fragmentos
de ruptura mediante MMP de fibrina/fibrinógeno utilizando
anticuerpos anti-fibrinógeno. Además, pueden
idearse preparaciones adecuadas para su uso in vivo, tales
como para la visualización de fibrinógeno o de sustancias y
estructuras que contengan fibrinógeno en un sujeto vivo. De esta
forma puede evaluarse in situ la progresión de la
fibrinólisis inducida por las MMP.
En una realización tal, una MMP fibrinolítica
endógena, preferiblemente MMP-3, se une a un
material sustrato tal como una membrana, tubo de recogida de sangre,
placa de microtítulo, matraz de cultivo o similar. De esta forma, el
método de la invención puede llevarse a cabo en ausencia de MMP
soluble, para inducir fibrin(ogen)ólisis en una muestra de
fluido corporal. Alternativamente, este enfoque es útil en membranas
de recubrimiento y en dispositivos protésicos.
En efecto, en otra realización, la invención
proporciona un método para controlar la formación de coágulos o
placas producidos o inducidos por aparatos relacionados con la
medicina. En esta realización, el método incluye poner en contacto
un aparato relacionado con la medicina con una composición que
incluya una metaloproteinasa de matriz fibrinolítica,
preferiblemente MMP-3. Este método puede usarse para
hacer que una metaloproteinasa se una o se adhiera a una superficie.
Se cree que cualquier aparato que pueda entrar en contacto con la
sangre puede modificarse así mediante métodos conocidos en la
técnica, lo que permite la unión de proteínas a materiales sustrato.
Por ejemplo, el método puede usarse para modificar las superficies
de contacto con la sangre de dispositivos protésicos implantables,
tales como cánulas, catéteres, injertos, stents, filtros,
dispositivos intrauterinos y válvulas, para proporcionar superficies
que inhiban la formación de trombos. Alternativamente, el método
permite la modificación fibrinolítica de aparatos tales como tubos
de recogida de sangre, matraces de cultivo, placas de prueba,
pipetas, envases de reactivos, tubos y membranas, para estimular la
fibrinólisis y para inhibir la formación de trombos que, en caso
contrario, podrían interferir con los protocolos de experimentación.
Asimismo, la invención proporciona aparatos relacionados con la
medicina, tales como dispositivos implantables, material de
laboratorio y otros dispositivos para usos in vivo e in
vitro, que tienen la capacidad de inhibir la formación de
trombos estimulando la degradación de fibrina/fibrinógeno. La
metaloproteinasa puede adherirse a un aparato permanente o
reversiblemente, de manera que se administre la metaloproteinasa de
un aparato a una disolución.
La invención también proporciona un método para
intensificar la regulación de la fibrinólisis en un sujeto con
necesidad de tal tratamiento. En esta realización, el método de la
invención incluye inducir la intensificación de la regulación de una
metaloproteinasa de matriz fibrinolítica endógena en un sujeto.
Preferiblemente, el método incluye aumentar o disminuir la actividad
o la expresión de una metaloproteinasa de matriz fibrinolítica
endógena tratando al sujeto con tratamiento de transferencia génica
de células somáticas. Puede emplearse cualquier enfoque de
tratamiento génico según esta realización. Por tanto, puede llevarse
a cabo la regulación por incremento de la expresión de MMP mediante
la introducción de un gen para una MMP fibrinolítica mediante
técnicas de trasferencia génica ex vivo o in vivo.
Alternativamente, puede llevarse a cabo la regulación por incremento
de una MMP mediante la inhibición de la expresión de un inhibidor de
la MMP mediante tecnología antisentido. Puede llevarse a cabo la
regulación por disminución de la actividad de la MMP mediante estas
técnicas, cuyo diseño y puesta en práctica están dentro de las
aptitudes de los expertos en la técnica. En Glick y col. (1994) se
facilita una breve visión general de varios métodos de tratamiento
génico. Pueden emplearse otros enfoques terapéuticos que incluyan
composiciones farmacéuticas para estimular o inhibir la actividad o
la expresión de una metaloproteinasa de matriz fibrinolítica
endógena. Dada la complejidad del sistema de regulación
fibrinolítico y dado el inesperado papel de las MMP en este esquema
de regulación, a los expertos en la técnica les parecería que
existen muchas posibilidades potenciales para el ajuste del estado
de regulación fibrinolítica de un sujeto.
Los ejemplos siguientes están dirigidos a ayudar
en una mayor comprensión de la invención. Los materiales y
condiciones particulares empleados están dirigidos a ilustrar
adicionalmente la invención y no son limitantes del alcance
razonable de la misma.
En los ejemplos siguientes, se describen los
experimentos que han revelado el papel que desempeñan las MMP,
particularmente MMP-3, en la degradación del
fibrinógeno (Fg) y la fibrina reticulada (XL-Fb). Se
han estudiado los siguientes aspectos: 1) degradación del Fg; 2)
efecto de la digestión del Fg mediante las MMP en su capacidad
posterior de coagulación con trombina; 3) lisis de
XL-Fb y Fragmento dímero D purificado (DD); 4)
análisis en el extremo NH_{2}-terminal de los
fragmentos de cadena de los digestos seleccionados; 5) reactividad
de los fragmentos escindidos con varios anticuerpos monoclonales
específicos. Se muestra la capacidad de MMP-3 para
degradar el Fg y para lisar coágulos de XL-Fb.
Basándose en este trabajo, se concluye que tanto la metaloproteinasa
de matriz 1 (MMP-1) como la metaloproteinasa de
matriz 2 (MMP-2) pueden degradar parcialmente el Fg
y que MMP-2 tiene una capacidad limitada para
degradar XL-Fb. También se determina que, en
XL-Fb, el enlace
\gammaGly404-Ala405 es un sitio de escisión
principal de MMP-3, que conduce a la formación de un
monómero similar al Fragmento D. Esto indica un mecanismo específico
de degradación de la fibrina, diferente del de la plasmina, mediante
una enzima endógena.
Los siguientes procedimientos experimentales son
relevantes para los ejemplos 1-9, más adelante:
Se adquirió Fg sin plasminógeno y sin
fibronectina (Fg \geq 95% de capacidad de coagulación) o Fg
humano liofilizado (American Diagnostica Inc., Greenwich, CT). Se
eliminó el plasminógeno y la fibronectina mediante cromatografía de
afinidad en lisina-Sepharosa y
gelatina-Sepharosa, esencialmente tal como describen
otros autores (Deutsch y col., 1970; Engvall y col., 1977; Procyk y
col., 1985). La cantidad del Factor XIII en estas preparaciones es
de 0,1-0,2 unidades Loewy/mg de Fg según el
fabricante. Las disoluciones madre de Fg (12 mg/mL en tampón TNE
(Tris-HCl 0,05 M (pH 7,4)), que contenía NaCl 0,1 M,
EDTA 0,001 M y aprotinina 100 KIU/mL)) se almacenaron a -70ºC hasta
su utilización. La concentración de Fg se midió
espectrofotométricamente en disolución alcalina-urea
utilizando el coeficiente de extinción (1%, 1 cm) = 16,5 a 282 nm.
El Glu-plasminógeno humano (1 U/0,5 mg) procedía de
Imco (Stockholm, Suecia). La estreptocinasa (450 U/mg sólido), la
albúmina sérica bovina (BSA, Fracción V, grado RIA), el acetato
4-aminofenilmercúrico (APMA) y EDTA procedían de
Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). La aprotinina procedía de
Mobay Chemical Corp (Nueva York, NY). La
\alpha-trombina humana (2300 U/mg) fue un generoso
obsequio del Dr. J. Fenton. El ^{125}I -Fg, marcado con el método
del yodógeno (actividad específica 1,5 x 10^{6} cpm/\mug
proteína) fue un generoso obsequio de los Drs. M. Nag y D. Banerjee,
Laboratory of Membrane Biochemistry II, The New York Blood Center.
Pro-MMP-1,
pro-MMP-2 y
pro-MMP-3 se purificaron tal como
han descrito anteriormente otros autores (Okada y col., 1986; Okada
y col., 1990; Suzuki y col., 1990). El resto de los reactivos fueron
de calidad analítica y se adquirieron en Fisher Scientific
(Springfield, NJ).
Muestras de Fg y XL-Fb degradadas
con plasmina o MMP se sometieron a SDS-PAGE usando
condiciones reductoras y no reductoras. Las muestras reducidas se
prepararon en tampón Tris 62,5 mM, pH 6,8, que contenía SDS al 4%,
urea 8 M, DTT al 5%, glicerol al 10% y azul de bromofenol al 1%. Las
muestras no reducidas se prepararon en el mismo tampón sin DTT.
SDS-PAGE se realizó utilizando un gradiente del
5-15% o geles de poliacrilamida al 12,5% en tampón
Tris-glicina (Laemmli 1970) o con minigeles al 5% y
al 7,5% en tampón fosfato (McDonagh y col., 1972) siguiendo
procedimientos generales. Los patrones de peso molecular previamente
teñidos utilizados fueron miosina (200 kDa), fosforilasa B (97,4
kDa), BSA (68 kDa), ovoalbúmina (43 kDa),
\alpha-quimiotripsinógeno (25,7 kDa),
\beta-lactoglobulina (18,4 kDa) y lisozima (14,3
kDa) (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD). La
transferencia a membranas de nitrocelulosa para los análisis de
inmunotransferencia se realizó tal como describen Towbin y col.
(1979) con pocas modificaciones (Kudryk y col., 1989b). En algunos
experimentos, las membranas se tiñeron con oro coloidal antes de la
inmunotransferencia (Colloidal Gold Total Protein Stain, BioRad,
Hercules, CA). Las membranas se bloquearon con leche en polvo al 5%
(Carnation, Nestle, Glendale, CA) o con BSA al 5%, se incubaron
durante toda la noche con un anticuerpo primario seleccionado (tabla
I) y después se sondaron con un segundo anticuerpo. La peroxidasa de
rábano picante anti-ratón de conejo
(RAM-HRPO) se preparó tal como describe Goding
(1986) usando RAM adquirido en Dako (Carpinteria, CA) y HRPO (tipo
VI) de Sigma. Los complejos de peroxidasa unida se detectaron
utilizando sustrato quimioluminiscente Luminol (sistema de detección
de Western blotting ECL, Amersham Life Science, Arlington Heights,
IL). Se expuso la película facilitada (Kodak
\chi-Omat RP, Eastman Kodak Company, Rochester,
NY) a la luz emitida a partir de la hidrólisis del sustrato Luminol
añadido en de 10 a 30 segundos.
Se realizó un experimento para evaluar si las MMP
tienen actividad fibrin(ogen)olítica. Se incubó
fibrinógeno (Fg) (120 \mug, 3,5 \muM) con MMP-2
o MMP-3 (6 \mug/mL o razón E:S de 1:20) a 37ºC
durante diferentes intervalos de tiempo. Se activaron
pro-MMP-2 y pro-MMP3
(en Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 0,15 M, Brij 35 al
0,05%, NaN_{3} al 0,05%) con APMA 1 mM a 37ºC durante 45 min y 24
h, respectivamente, antes de la adición de las disoluciones de Fg.
Todas las reacciones se realizaron en presencia de CaCl_{2} 10 mM
a 37ºC. Las digestiones se terminaron mediante la adición de EDTA
(concentración final de 25 mM). Los productos de reacción se
mezclaron con tampón reductor o no reductor y se sometieron a
separación en SDS-PAGE (12,5%). Los geles se
tiñeron para la determinación de proteínas con azul de
Coomassie.
La figura 1 muestra la digestión dependiente del
tiempo del fibrinógeno mediante MMP-2 y
NEAP-3 por comparación con el fibrinógeno no
digerido. Las enzimas se usaron a E:S = 1:20 (p/p) y la incubación
fue durante 1, 2, 4 y 24 h. La leyenda para la figura 1 es la
siguiente:
A partir de la figura 1 está claro que, usando
MMP-2 y MMP-3 en cantidades
comparables (6 \mug/120 \mug Fg), tanto las cadenas A\alpha
como las B\beta del Fg se degradaron ampliamente en 1 h (bandas 2
y 6). Una incubación más larga (24 h) dio como resultado una
escisión adicional de ambas cadenas (bandas 5 y 9). La degradación
de las cadenas \gamma del Fg con MMP-3 fue amplia
a las 24 h (figura 8, banda 9) y diferente de la producida con
MMP-2 (banda 5). También se obtuvo degradación
significativa con MMP-2 y MMP-3 a
una concentración inferior de la enzima (0,2-0,6
\mug/120 \mug Fg, datos no mostrados). También se probó
MMP-1 usando este protocolo y, en la concentración
superior (6 \mug/120 \mug Fg), mostró cadenas B\beta y
\gamma aparentemente intactas y sólo degradación parcial de las
cadenas A\alpha (datos no
mostrados).
mostrados).
Los digestos (1, 5 y 3 h) del fibrinógeno con
MMP-2 y MMP-3 se prepararon tal como
se describió anteriormente. Se usó un digesto del Fg obtenido con
plasmina (18-20 h) (G\ring{a}rdlund y col., 1972)
como control. El Fg intacto y los digestos del Fg se hicieron
coagular con trombina, tal como describen Bini y col., (1994). En
resumen, 1,2 mg Fg/mL o cualquiera de los digestos anteriores del
fibrinógeno obtenidos mediante MMP-2 y
MMP-3, se hicieron coagular con trombina (0,4 U
NIH/mL) en presencia de CaCl_{2} 20 mM. El tiempo de coagulación
se determinó como un aumento en la turbidez y se leyó a 350 nm
(Blombäck y col., 1982). La capacidad de coagulación se determinó a
partir de la representación de la turbidez frente al tiempo. Se
trazó una tangente en la parte de más pendiente de la curva; su
intersección con el eje del tiempo se define como tiempo de
coagulación (Blombäck y col., 1994). En todos los casos, se formaron
los geles sin que se observara ninguna precipitación. Los
sobrenadantes de coágulos se corrieron en HPLC (Kudryk y col.,
1989b) con el fin de determinar la liberación de los fibrinopéptidos
A (FPA) y B (FPB). Estos resultados se muestran en la tabla I, a
continuación.
El Fg digerido con MMP-2 (1,5 y 3
h) no coaguló en el plazo de 10 min (tomado arbitrariamente como el
tiempo máximo), pero todavía pudo formar un gel de fibrina tras la
incubación durante toda la noche con trombina, tal como se muestra
por los datos de turbidez (tabla I). Por el contrario, tanto los
digestos producidos por MMP-3 como por plasmina, en
tiempo y concentración comparables, no tuvieron capacidad de
coagulación, ni siquiera tras la incubación durante toda la noche.
Los datos de turbidez indicaron que la formación del gel se obtuvo
sólo a partir de las mezclas de reacción del Fg digerido con
MMP-2 y con la concentración de plasmina inferior.
Además, los valores de turbidez de las mismas preparaciones medidos
al día siguiente mostraron que las mezclas de reacción de Fg y
MMP-2 fueron similares al control, mientras que los
digestos del Fg generados por MMP-3 o plasmina
tuvieron turbidez baja o ausencia de la misma (tabla I). Los
perfiles de HPLC de los sobrenadantes de todos los digestos
mostraron liberación normal de los fibrinopéptidos A y B con
trombina (no mostrados).
Se obtuvieron coágulos de fibrina a partir de
fibrinógeno purificado según el método de Bini y col. (1994) y de
las referencias citadas en el mismo. Se obtuvieron coágulos
radiomarcados con 0,1 mL de Fg purificado (1,2 mg/mL en tampón TNE)
que contenía ^{125}I-Fg (20.000 cpm) en presencia
de CaCl_{2} 20 mM. Se añadió trombina (1,5 U NIH/mL, concentración
final) y las muestras se incubaron a 37ºC durante
18-20 h (Bini y col., 1994). Se añadió
MMP-1, MMP-2 o MMP-3
activas en diferentes cantidades (2-60 \mug/mL,
que corresponde a la razón E:S de 1:600-1:20) en
presencia de CaCl_{2} 10 mM. Se generó plasmina añadiendo
plasminógeno (50 \mug/mL) y estreptocinasa (1080 U/mL) a los
coágulos de fibrina (aproximadamente 0,02-0,5 U/mL
de plasmina, concentración final, que corresponde a E:S de
1:1200-1:48). Los coágulos se separaron suavemente
de la pared del tubo de ensayo con una varilla de madera y el
contenido se sometió a vórtex suavemente tras la adición de cada
enzima. Los tiempos de incubación fueron de 1-48 h a
37ºC. Los digestos con MMP se terminaron mediante la adición de EDTA
(concentración final de 25 mM) y los de plasmina se terminaron con
aprotinina 5.000 KIU/mL. Los coágulos se separaron de los
sobrenadantes mediante centrifugación a 13.000 rpm durante 20 min en
una Sorval RCL-B (rotor SS-34). La
fibrinólisis se midió tanto mediante la liberación de radiactividad
en el sobrenadante (A) como mediante la radiactividad residual en
cada coágulo (B). Las muestras se contabilizaron en un Contador
Gamma Automático Packard Serie \gamma-5000. Los
coágulos de fibrina control, con y sin digestión con las diferentes
enzimas, se obtuvieron al mismo tiempo para utilizarse para
SDS-PAGE. Los datos representan los valores medios
de 2-4 experimentos
separados.
separados.
Los resultados de este experimento se presentan
en las figuras 2A y 2B, que muestran el porcentaje de radiactividad
en los sobrenadantes (figura 2A) y en los coágulos residuales
(figura 2B). Tal como se muestra, tras 24 horas de incubación, tanto
las muestras de MMP-3 (6\mug/120 \mug Fg) como
de plasmina (0,02 IU/mL) mostraron liberación de más del 80% de la
radiactividad en los sobrenadantes (media de tres experimentos)
(figura 2A). La radiactividad residual en los coágulos a las 24
horas fue inferior al 10% (figura 2B) y los coágulos parecieron
disolverse tanto mediante MMP-3 como mediante
plasmina. Véanse las figuras 2A y 2B. La concentración de plasmina
utilizada en los experimentos de lisis se escogió partiendo de la
base de la obtención de una lisis lenta (Liu y col., 1986). En los
experimentos preliminares, se midió una liberación similar de
radiactividad en los sobrenadantes usando plasmina a 1:240 y 1:1200
(E:S, p/p), lo que se usó durante todo el estudio. La degradación
con MMP-2 en la concentración superior a 24 h, fue
similar a la obtenida con MMP-3 a 1:200. La
degradación con MMP-1 a la concentración superior,
tras 48 h, fue similar a la obtenida con MMP-3 a
1:1200. También se muestran los controles, sin adición de enzima,
así como un digesto de XL-Fb obtenido
con plasmina.
con plasmina.
La incubación con una mezcla de
MMP-3 y plasmina en la muestra produjo resultados
similares a los producidos por cualquiera de las enzimas solas
(datos no mostrados). Esto indica que las dos enzimas no interfieren
entre sí. Se realizaron experimentos idénticos usando coágulos
obtenidos a partir del plasma y se obtuvieron resultados similares
(datos no mostrados).
Se analizó la digestión de la fibrina reticulada
mediante plasmina, MMP-2 y MMP-3.
Las muestras de la degradación de fibrina mediante cada una de las
enzimas se redujeron y se sometieron a SDS-PAGE
(gradiente del 5-15%) (Laemmli y col., 1973;
McDonagh y col., 1972). Tras la electroforesis, las proteínas
resueltas se transfirieron a nitrocelulosa. La proteína se tiñó con
oro coloidal en la membrana de nitrocelulosa. Los patrones de la
degradación de fibrinógeno y fibrina dependiente de la dosis y
dependiente del tiempo mediante MMP-2,
MMP-3 y plasmina se muestran en la figura 3.
La leyenda de la figura 3 es la siguiente:
La figura 3 muestra la degradación mediante
plasmina de la cadena dimérica \gamma de la fibrina reticulada (94
kDa) en la cadena dimérica \gamma DD (76 kDa) en la razón E:S
superior (bandas 1 y 2). No se observó degradación del dímero
\gamma de la fibrina reticulada con MMP-2, en la
razón E:S superior (1:20) (banda 4). Se obtuvo degradación
significativa de la cadena \gamma con MMP-3 (E:S =
1:20) a las 24 h (banda 7) y se obtuvo la degradación completa
aumentando dos veces la razón E:S (banda 8). El patrón de
degradación de la cadena dimérica \gamma de la fibrina reticulada
mediante MMF-3 es diferente del obtenido con la
plasmina. De hecho, la plasmina disminuye el peso molecular del
dímero \gamma, pero no lo convierte en monómero (bandas 1, 2) ni
siquiera a la razón de E:S superior
(1:240).
(1:240).
Los coágulos de XL-Fb se
degradaron gradualmente mediante MMP-3 y dieron como
resultado una lisis casi completa a las 24 h. La cantidad de
degradación con MMP-3 (1:20) a las 24 h fue
comparable a la producida por plasmina (1:1200). Por tanto,
MMP-3 es una enzima fibrinolítica más lenta que la
plasmina. Las tasas de solubilización del coágulo con
MMP-1 y MMP-2 fueron mucho más
lentas: a la misma razón E:S (1:20), sólo se solubilizó el 34% y el
58%, respectivamente, tras 24 h, mientras que se degradó el 84%
mediante MMP-3. En los digestos obtenidos con
MMP-3 y plasmina, la radiactividad residual del
coágulo fue \leq 10%. Estos resultados indicaron que la digestión
de XL-Fb con MMP-3 progresó
adicionalmente, posiblemente con un mecanismo diferente y más
específico que el obtenido con MMP-1 o
MMP-2. Sin embargo, la actividad más débil de
MMP-2 puede deberse a la rápida autólisis de la
enzima tras la activación por APMA (Okada y col., 1990).
Se realizaron inmunotransferencias llevadas a
cabo utilizando técnicas estándar con digestos de fibrina
obtenidos con plasmina y metaloproteinasa, con un panel de
anticuerpos monoclonales (MoAbs) (véase la tabla II) para
identificar cómo se escinden las tres cadenas de fibrina mediante
MMP-3, en comparación con la plasmina. Los
anticuerpos monoclonales se prepararon según técnicas conocidas en
la técnica.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Las muestras se incubaron con o sin enzima
durante 24 ó 48 h. Las muestras incubadas se sometieron después a
SDS-PAGE (geles al 7%) en condiciones reductoras.
Tras la electroforesis, las muestras se transfirieron a membranas de
nitrocelulosa y las membranas se sometieron a inmunotransferencia
con anticuerpos seleccionados. Las cadenas de fibrina/fibrinógeno
unidas a anticuerpos específicos se detectaron usando
RAM-HRPO y el sustrato quimioluminiscente, tal como
se describió anteriormente. Los resultados se ilustran en las
figuras 4-5.
La figura 4A muestra las inmunotransferencias de
los productos de degradación de la digestión de fibrina mediante
MMP-3 y plasmina con MoAb/4-2. Este
anticuerpo es específico para un epítopo en la cadena \gamma:
\gamma392-406. Este anticuerpo reacciona con
fibrinógeno y los fragmentos D y dímero D sólo tras la
desnaturalización.
La fibrina reticulada y el fibrinógeno se
incubaron cada uno sin enzima a 37ºC, durante 24 h. Además,
XL-Fb se incubó con plasmina (24 h) y con
MMP-3 (24 h y 48 h). Los digestos se examinaron en
condiciones reductoras. La leyenda para la figura 4A es la
siguiente:
Tal como se observa en la figura 4A,
MoAb/4-2
(anti-\gamma392-406) reaccionó
tanto con el dímero \gamma de XL-Fb no digerido
(94 kDa, banda 1) como con la cadena \gamma de Fg no digerida (47
kDa, banda 2). El monómero residual de la cadena \gamma en la
preparación de fibrina reticulada también reaccionó con
MoAb/4-2 (banda 1). En el digesto obtenido mediante
plasmina de XL-Fb, el dímero \gamma DD (76 kDa) y
el monómero de la cadena \gamma Fragmento D (que se sabe que
resulta de los digestos obtenidos mediante plasmina de Fg y
XL-Fb (Siebenlist y col., 1992)) también
reaccionaron igualmente con MoAb/4-2 (banda 3). Un
digesto a las 24 h de XL-Fb generado por
MMP-3 mostró una cadena de dímero \gamma DD
reducida en el coágulo residual, pero cantidades significativas de
la cadena \gamma similar al monómero Fragmento D (36 kDa, banda
4). Una incubación más larga (48 h) sólo mostró la cadena \gamma
similar al monómero Fragmento D en el digesto total. Los digestos
obtenidos con ambas enzimas se unieron a
MoAb/4-2.
También se examinó la fibrina reticulada mediante
inmunotransferencia con MoAb/4A5, que es específico para la cadena
\gamma en \gamma397-411, un epítopo cercano al
que es reactivo con MoAb/4-2. Como punto de
referencia, el coágulo de XL-Fb se incubó sin enzima
a 37ºC durante 48 h. XL-Fb también se incubó con
MMP-3 o plasmina durante 24 h. Los resultados de
esta inmunotransferencia se muestran en la figura 4B. La leyenda
para la figura 4B es la siguiente:
Por tanto, tal como se observa en la figura 4B,
MoAb/4A5 (anti-\gamma397-411)
mostró reactividad sólo con la banda del dímero \gamma tanto a
partir de XL-Fb intacto como digerido con plasmina
(bandas 1, 5) y con el dímero \gamma DD residual obtenido a partir
de los digestos generados por MMP-3 (bandas 2, 4).
La cadena \gamma similar al monómero Fragmento D (36 kDa),
completamente reactivo con MoAb/4-2 (figura 4A,
bandas 4, 5), no se unió a MoAb/4A5 (figura 4B, bandas 2, 4). El
análisis de inmunotransferencia de las mismas muestras en
condiciones no reductoras mostró una pérdida similar de
inmunorreactividad con MoAb/4A5 (datos no mostrados).
Estos experimentos muestran que el patrón de
degradación de XL-Fb con MMP-3 es
diferente del obtenido con plasmina. En los digestos obtenidos con
MMP-3 (1:20), sólo quedan cantidades muy pequeñas
del dímero \gamma. A niveles superiores de esta misma enzima, no
pueden detectarse dímeros. MMP-2 no parece afectar a
la degradación del dímero \gamma significativamente. Se usaron dos
anticuerpos monoclonales, MoAb/4-2 y MoAb/4A5,
reactivos con diferentes epítopos en la secuencia
\gamma392-411, para definir las regiones de
escisión de XL-Fb mediante MMP-3, en
comparación con plasmina. Este segmento de la cadena contiene
residuos (\gammaGln398 y \gammaLys406) que participan en las
reticulaciones covalentes (formando enlaces isopeptídicos
\varepsilon-(\gammaGlu)-Lys) en las moléculas
vecinas, lo que conduce a la estabilización de la fibrina mediada
por el Factor XIIIa (Chen y col., 1971). MoAb/4A5 reconoce un
epítopo en la región COOH-terminal de este péptido
(\gamma397-411), mientras que
MoAb/4-2 reacciona con su extremo
NH_{2}-terminal (\gamma392-406).
Ambos anticuerpos se unen a placas de microtítulo recubiertas con
productos de digestión derivados de la plasmina, los Fragmentos D y
DD. Sólo MoAb/4A5 compite con tales fragmentos mientras están cada
uno en disolución (Kudryk y col., 1991). En una digestión de 24 h de
XL-Fb con MMP-3, tanto la cadena de
dímero \gamma DD residual como la cadena \gamma similar al
monómero Fragmento D fueron reactivos con MoAb/4-2.
Digestiones más largas (48 h) dieron como resultado únicamente la
cadena \gamma similar al monómero Fragmento D, que todavía fue
reactiva con MoAb/4-2. El análisis de estos mismos
digestos con MoAb/4A5
(anti-\gamma397-411) mostró que
sólo la banda del dímero \gamma DD era reactiva. La cadena
\gamma similar al monómero Fragmento D no se unió a MoAb/4A5.
Estos resultados indicaron que había un sitio de escisión principal
para MMP-3 dentro del dominio de reticulación de la
cadena \gamma, dando como resultado la degradación del dímero
\gamma. El Fragmento DD purificado también se escindió con
MMP-3 hasta obtener un fragmento similar al monómero
D.
También se realizó la inmunotransferencia de los
productos de degradación de la digestión de fibrina mediante
MMP-3 y plasmina utilizando MoAb/T2G1 y MoAb/1D4 en
condiciones reductoras, tal como se muestra en la figura 5. El
protocolo de experimentación fue tal como se describió anteriormente
para los otros anticuerpos. La leyenda para la figura 5 es la
siguiente:
Tal como se indica en la figura 5, las bandas
1-3 se sometieron a inmunotrasferencia con
MoAb/T2G1, mientras que las bandas 4-7 se sometieron
a inmunotransferencia con MoAb/1D4.
MoAb/T2G1 es específico para
B\beta15-42, pero sólo de fibrina II, no de
fibrinógeno/fibrina I. MoAb/1D4 es específico para
A\alpha349-406 en fibrinógeno y fibrina, así como
en sus digestos por plasmina. Tal como se muestra en la figura 5, la
inmunorreactividad de MoAb/T2G1 se perdió en los digestos de fibrina
obtenidos mediante MMP-3, tanto en la concentración
inferior (1:200) como en la superior (1:20) (bandas 4, 5), mientras
que está presente en la fibrina intacta (banda 6). La
inmunorreactividad de MoAb/1D4 todavía se conserva parcialmente en
el digesto de fibrina en la concentración inferior de
MMP-3 (banda 1), pero se pierde completamente en los
digestos en la concentración superior de MMP-3,
tanto a las 24 h (banda 2) como a las 48 horas (no mostrado),
mientras que está claramente presente en la muestra control (banda
3).
En consecuencia, los productos de degradación de
XL-Fb obtenidos mediante MMP-3 se
sondaron con MoAbs, T2G1 (anti- B\beta15-42) y 1D4
(anti-A\alpha349-406),
respectivamente. Ambos epítopos están presentes en
XL-Fb. En los digestos de XL-Fb
obtenidos mediante plasmina, muchas bandas de tamaños diferentes
(\geq20 kDa) reaccionan con MoAb/1D4, mientras que se pierde toda
la reactividad de MoAb/T2G1. Incluso concentraciones relativamente
bajas de MMP-3 (1:200) dieron como resultado
digestos que no reaccionaron con estos anticuerpos en la
inmunotransferencia. Este resultado significa que
A\alpha349-406 se ha escindido de la fibrina
mediante MMP-3. No pudo detectarse
inmunorreactividad con MoAb/1D4 en los digestos de
XL-Fb obtenidos con MMP-3 mediante
ELISA de competencia. Este anticuerpo reacciona de manera idéntica
con A\alpha349-406 y con Hi2-DSK
(A\alpha241-476) antes y después de la digestión
completa con tripsina.
Se llevaron a cabo experimentos para comprobar si
MMP-3 escindiría el dímero D purificado (DD)
convirtiéndolo en el monómero D. El fragmento D purificado y el
dímero D se incubaron a 37ºC durante 4 y 24 h con la concentración
inferior (1:20) y superior (1:200) de MMP-3. Las
reacciones se terminaron con EDTA 25 mM. Los digestos se resolvieron
en PAGE (fosfato al 7%). Las muestras se transfirieron a membranas
de nitrocelulosa y se tiñeron con azul de Coomassie. Los resultados
se muestran en la figura 6. Las muestras se corrieron en condiciones
no reductoras (figura 6A) y reductoras (figura 6B). La leyenda para
las figuras 6A y 6B es la siguiente:
Tal como se muestra en las figuras 6A y 6B, la
degradación progresiva (dependiente del tiempo) del dímero D (186
kDa) da lugar a un fragmento similar al monómero D (bandas 4,5). El
tamaño del monómero resultante fue ligeramente mayor que el del
fragmento D (93 kDa), obtenido durante la degradación con plasmina
del Fg (banda 1). Además, dado que este gel se obtuvo 2 meses
después de la preparación de estas muestras, esto prueba que la
reacción se ha detenido eficazmente y que ya no ha progresado más.
Los resultados indican que la monomerización se produce incluso a
las 4 horas con la cantidad inferior de enzima (1:200) (banda 3). El
incremento de la cantidad de enzima diez veces aumenta la
monomerización a las 4 horas (banda 4) y convierte casi
completamente el sustrato a las 24 horas (banda 5). Esto se apoya en
la figura 6B, que muestra la conversión del dímero \gamma (78 kDa)
en la cadena \gamma similar al monómero (38 kDa).
Se llevaron a cabo ensayos de unión ELISA
utilizando métodos generalmente aceptados. Se cubrieron placas de
microtítulo de polivinilo con diluciones apropiadas de diferentes
digestos y se sometieron a ensayo para determinar la unión a
anticuerpos (Kudryk y col., 1984). De acuerdo con los resultados
mostrados en la figura 4, los digestos con concentraciones
crecientes de MMP-3 no se unieron a MoAb/4A5
(anti-\gamma397-411). Esto
significa que el sitio de escisión de MMP-3 para el
fibrinógeno está en la región de este epítopo (la reticulación de la
fibrina se produce en la región
\gammaGly397-Lys406). Este tipo de escisión no se
produce con plasmina. Sin embargo, se encontró que los digestos eran
reactivos con MoAb/4-2
(\gamma349-406). No pudo detectarse
inmunorreactividad con MoAb/1D4 en los digestos de
XL-Fb obtenidos con MMP mediante ELISA de
competencia, lo que sugiere que el epítopo reactivo de 1D4 se
destruye en tales digestos. MoAb/1D4 se une por igual a los digestos
de Fg y XL-Fb obtenidos mediante plasmina.
Por tanto, el ELISA (unión directa) realizado en
los digestos de Fg y XL-Fb con MMP-3
demostró que el epítopo \gamma392-406 de secuencia
lineal (reactivo con MoAb/4-2), pero no
\gamma397-411 (reactivo con MoAb/4A5), podía
detectarse mediante este método. Esto confirmó los resultados
obtenidos con inmunotransferencia y además sugirió que
MMP-3 escinde dentro de la secuencia
\gamma397-411. El análisis de la secuencia
NH_{2}-terminal del dipéptido (aislado de la
degradación mediante CNBr de XL-fibrina digerida con
MMP-3) indicó que \gammaAla405 es el primer
residuo de la segunda secuencia (véanse los ejemplos
8-9, a continuación). Se observa que
MoAb/4-2 también se une a un péptido sintético cuya
secuencia corresponde a \gamma392-400. MoAb/4A5
reacciona con péptidos sintéticos que corresponden a
\gamma392-411 y \gamma397-411,
que se pierde cuando el péptido se escinde con tripsina en
\gammaLys406-Gln407. Esta característica concuerda
con la falta de reactividad observada de MoAb/4A5 observada con el
dipéptido.
El Fg y la XL-Fb digeridos con
MMP-3 se separaron en condiciones reductoras en un
SDS-PAGE al 12,5% (Laemmil, 1970) y se sometieron a
electroinmunotransferencia hasta una membrana de
poli(difluoruro de vinilideno) (PVDF) (Matsudaira, 1987). La
parte de la membrana que contenía el fragmento de la cadena \gamma
se escindió y se sometió a secuenciación automatizada en un
secuenciador en fase líquida mediante impulsos modelo 447A de
Applied Biosystems Inc con un analizador de aminoácidos de
feniltiohidantoína (PTH) on line modelo 120A.
Los digestos de Fg y XL-Fb dieron
una secuencia
Leu-Lys-Ser-Arg-Lys
(SEQ ID NO:1) de la cadena \gamma, lo que indica que
MMP-3 escinde tanto Fg como XL-Fb en
el enlace \gammaThr83-Leu84. Sin embargo, esta
misma banda del digesto de XL-Fb también dio una
segunda secuencia
Ala-X-Gln-Ala-Gly-Asp
(SEQ ID NO:2) de la cadena \gamma, lo que indica que
MMP-3 indujo hidrólisis en el enlace
\gammaGly404-Ala405, en la región de reticulación
de la cadena \gamma.
Para confirmar los resultados obtenidos de la
secuenciación de la cadena \gamma de XL-Fb
degradada con MMP-3, se trató el mismo digesto con
CNBr (Blomback y col., 1968) y se aisló el fragmento reactivo con
MoAb/4-2
(anti-\gamma392-406), tal como
sigue. Los fragmentos escindidos por MMP-3 se
purificaron mediante HPLC en fase inversa usando una columna Vydac
C-4 (1,0 x 25 cm, The Sep/a/ra/tions Group,
Hesperia, CA). La columna se desarrolló a temperatura ambiente
usando el siguiente gradiente construido con ácido trifluoroacético
al 0,05% (TFA, disolvente A) y acetonitrilo al 50% en A (disolvente
B): con B al 5%/0,5 min; con B a del 5 al 50%/50 min; con B a del 50
al 100%/7 min; con B al 100%/75 min. La velocidad de flujo de la
columna fue de 1,0 mL/min y se monitorizaron las fracciones (1 mL)
para determinar la reactividad con MoAb/4-2
(anti-\gamma392-406). La fracción
reactiva con el anticuerpo se purificó adicionalmente mediante FPLC
utilizando la columna Superdex Peptide HR 10/30 (1,0 x
30-31 cm, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). La
columna se desarrolló a temperatura ambiente utilizando tampón
fosfato 20 mM (pH 7,2), que contenía adicionalmente NaCl 0,25 M. La
fracción que reaccionó con MoAb/4-2 se reunió, se
desalinizó haciéndola pasar sobre Sep-Pak®
(Millipore Corp., Milford, MA) y se sometió a análisis de la
secuencia.
El fragmento secuenciado correspondió a un
dipéptido reticulado con dos extremos
NH_{2}-terminales distintos: \gammaLys385, que
resulta de la escisión con CNBr, y \gammaAla405 (figura 7). Las
dos secuencias se recuperaron en cantidades molares comparables. Los
análisis de extremo NH_{2}-terminal en el ciclo 3
no mostraron residuos de PTH (debido a un error de la máquina), pero
la evidencia de Gln e Ile en el ciclo 3 se observó en el ciclo 4
como intervalo. Estos datos apoyan la conclusión de que
MMP-3 escinde en
\gammaGly404-Ala405 dentro de la región de
reticulación de la cadena \gamma de fibrina.
La tabla III muestra la secuencia parcial para el
dipéptido reticulado aislado de XL-Fb digerido con
MMP-3 tras la degradación con CNBr. El dominio de
reticulación \gamma, con los sitios de digestión de
MMP-3 y de escisión por CNBr, se muestra
esquemáticamente en la figura 7. El dipéptido resultante contiene un
único enlace \varepsilon-(\gammaGlu)-Lys), con
un extremo NH_{2}-terminal como \gammaLys385,
que resulta de la escisión por CNBr en
\gammaMet384-Lys385. La presencia del segundo
extremo NH_{2}-terminal, \gammaAla405, apoyó la
conclusión de que MMP-3 escinde en
\gammaGly404-Ala405 en la región de reticulación
de la cadena \gamma.
Los datos obtenidos del análisis de la secuencia
de los digestos de Fg y XL-Fb obtenidos mediante
MMP-3 mostraron la proximidad de los sitios de
escisión por plasmina en estos mismos sustratos. La plasmina escinde
en \gammaLys62-Ala63 y más lentamente en
\gammaLys85-Ser86 (Collen y col., 1975). Por
tanto, el fibrinógeno digerido mediante plasmina da como resultado
dos clases de Fragmento D, es decir,
\gammaAla63-Val411 y
\gammaSer86-Val411. Por el contrario,
MMP-3 escinde tanto el Fg como la
XL-Fb en \gammaThr83-Leu84.
Además, dado que MMP-3 hidroliza la unión peptídica
\gammaGly404-Ala405, la cadena \gamma tiene un
peso molecular que es sustancialmente similar al de la cadena
\gamma del Fragmento D generado por plasmina. Sin embargo, en los
digestos de XL-Fb obtenidos con MMP3, este producto
no es un monómero real, dado que el dominio
\gamma405-411 se reticula a la cadena \gamma
adyacente que tiene la secuencia
\gammaLeu84-Gly404. Debe observarse que la
recuperación de cantidades similares de las dos secuencias de las
cadenas \gamma del dipéptido generado por CNBr indicó que, aunque
lenta, la degradación de XL-Fb mediante
MMP-3, dio como resultado la formación del fragmento
similar al monómero D, que fue casi completa.
MMP-3 también genera otros
productos de escisión de Fg y XL-Fb, cortando
específicamente, no sólo la cadena \gamma, sino también las
cadenas \alpha y \beta. El Fg y la XL-Fb se
sometieron a digestión usando MMP-3 (E:S = 1:20)
durante 24 h, se separaron y se secuenciaron usando los métodos
descritos en el ejemplo 9. Tal como se indica en la figura 8, tanto
el Fg (banda 1) como la XL-Fb (banda 2) se
escindieron específicamente. En la figura 8, se encontró que la
banda 1 incluía dos fragmentos: un fragmento de la cadena \gamma
que tenía una secuencia NH_{2}-terminal de
Leu-Lys-Ser-Arg-Lys
(SEQ ID NO:1), que corresponde de nuevo a la escisión \gamma84; y
un fragmento de la cadena \beta (\beta_{1}) que tenía una
secuencia NH_{2}-terminal de
Lys-Arg-Gln-Lys-Gln
(SEQ ID NO:3) que corresponde a la escisión en \beta127. Se
encontró que la banda 2 contenía otro fragmento de la cadena \beta
(\beta_{2}) que tenía una secuencia
NH_{2}-terminal de
Tyr-Ser-Ser-Glu-Leu
(SEQ ID NO:4) que corresponde a la escisión en \beta142. La banda
3 es la enzima MMP-3 que permanece en la preparación
de digesto. Se encontró que la banda 4 contenía un fragmento de la
cadena \alpha que tenía una secuencia en el extremo
NH_{2}-terminal de
Asn-Arg-Asp-Asn-Thr
(SEQ ID NO:5), que corresponde a la escisión en \alpha103.
(También se encontró que la banda 4 contenía fragmentos escindidos
en \gamma1 y \alpha414, tanto en los digestos de fibrinógeno
como en los fibrina). La banda 5 contenía fragmentos escindidos en
\beta51 y \beta52, tanto en los digestos de fibrina como en los
de fibrinógeno, obtenidos con MMP-3.
En consecuencia, la evidencia presentada en los
ejemplos 1-10 anteriores establece que el
fibrinógeno se vuelve incapaz de coagulación con trombina cuando se
trata con metaloproteinasa de matriz 3 (MMP-3,
estromelisina 1), pero no cuando se trata con metaloproteinasa de
matriz 2 (MMP-2, gelatinasa A). La incubación de
coágulos de XL-Fb (realizada con
^{125}I-Fg) obtenidos con MMP-3
dio como resultado la lisis completa tras 24 h. Se genera un
fragmento similar al monómero D mediante la degradación por
MMP-3 de fibrinógeno, XL-Fb y
Fragmento DD. La inmunorreactividad con el anticuerpo monoclonal
MoAb/4-2
(anti-\gamma392-406), pero no con
MoAb/4A5 (anti-\gamma397-411),
sugirió que un sitio principal de escisión estaba dentro de la
secuencia que participa en la reticulación de dos cadenas \gamma.
La secuencia NH_{2}-terminal de la cadena \gamma
del fragmento similar al monómero D y de un dipéptido aislado del
digesto de XL-fibrina obtenido mediante
MMP-3, identificó la hidrólisis del enlace peptídico
\gammaGly404-Ala405. Estos datos indican que la
degradación de Fg y XL-Fb mediante
MMP-3 es específica y diferente de la de plasmina.
Este mecanismo de fibrinólisis es importante en la cicatrización de
heridas, la inflamación, la ateroesclerosis, el cáncer, la
enfermedad renal y otros procesos patofisiológicos.
Puesto que MMP-3 escinde cerca
del sitio en el que se produce la reticulación de la fibrina, se
puede dar fácilmente un fuerte argumento teleológico de que
MMP-3 desempeña un papel singular en la
fibrinólisis. Por tanto, la regulación coordinada de las
metaloproteinasas y los activadores del plasminógeno podrían dar
como resultado efectos sinérgicos y la degradación completa de la
matriz extracelular y de la red de fibrina que resulta de la
cicatrización de heridas, la inflamación, la trombosis, el cáncer,
la enfermedad renal y otros procesos patofisiológicos. En
consecuencia, se considera que la coadministración de
MMP-3 con otros agentes trombolíticos, tales como
t-PA, también lograría un efecto terapéutico
complementario, en el que cada componente complemente o potencie al
otro.
Por tanto, aunque se han descrito las que en la
actualidad se cree que son las realizaciones preferidas de la
presente invención, los expertos en la técnica comprenderán que
pueden realizarse realizaciones adicionales y otras sin apartarse
del espíritu de la invención, y se pretende incluir todas estas
modificaciones y cambios adicionales dentro del verdadero alcance de
las reivindicaciones expuestas en el presente documento.
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Claims (33)
1. Uso de una metaloproteinasa fibrinolítica para
la fabricación de un medicamento para su uso en un método de
tratamiento fibrinolítico, en el que dicha metaloproteinasa
fibrinolítica es una estromelisina.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha
estromelisina es una estromelisina endógena.
3. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha
estromelisina es MMP-3.
4. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha
estromelisina escinde fibrina/fibrinógeno en el enlace peptídico
\gammaGly404-Ala405.
5. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho
método de tratamiento fibrinolítico incluye la administración de
estromelisina junto con un compuesto complementario que tiene
actividad trombolítica.
6. Uso según la reivindicación 5, en el que dicho
compuesto complementario que tiene actividad trombolítica se
selecciona del grupo que consiste en un activador del plasminógeno,
la hirudina, un inhibidor enzimático, una enzima, un anticoagulante,
un anticuerpo o un péptido sintético específico del receptor
plaquetario gpIIb/IIIa, o una combinación de los mismos.
7. Uso según la reivindicación 6, en el que dicho
activador del plasminógeno se selecciona del grupo que consiste en
u-PA, t-PA, estreptocinasa,
estafilocinasa y combinaciones de los mismos.
8. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho
método de tratamiento fibrinolítico ha de realizarse tras el
tratamiento trombolítico para inhibir la reoclusión vascular.
9. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho
método de tratamiento fibrinolítico ha de realizarse tras la
intervención quirúrgica para inhibir la reestenosis.
10. Uso según la reivindicación 1, en el que
dicho método de tratamiento fibrinolítico ha de realizarse para
inhibir la formación inicial, o estimular la regresión, de placas
ateroescleróticas.
11. Composición para el tratamiento trombolítico
que comprende una metaloproteinasa fibrinolítica que es una
estromelisina, un compuesto complementario que tiene actividad
trombolítica y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
12. Composición según la reivindicación 11, en la
que dicha estromelisina es una estromelisina endógena.
13. Composición según la reivindicación 11, en la
que dicha estromelisina es MMP-3.
14. Composición según la reivindicación 11, en la
que dicha estromelisina escinde fibrina/fibrinógeno en el enlace
peptídico \gammaGly404-Ala405.
15. Composición según la reivindicación 11, en la
que dicho compuesto complementario que tiene actividad trombolítica
se selecciona del grupo que consiste en un activador del
plasminógeno, la hirudina, un inhibidor enzimático, una enzima, un
anticoagulante, un anticuerpo o un péptido sintético específico del
receptor plaquetario gpIIb/IIIa, o una combinación de los
mismos.
16. Composición según la reivindicación 15, en la
que dicho activador del plasminógeno se selecciona del grupo que
consiste en u-PA, t-PA,
estreptocinasa, estafilocinasa y combinaciones de los mismos.
17. Equipo para llevar a cabo el tratamiento
trombolítico, que comprende una composición que comprende una
metaloproteinasa fibrinolítica que es una estromelisina, un
compuesto complementario que tiene actividad trombolítica y un
envase.
18. Equipo según la reivindicación 17, en el que
dicha estromelisina es MMP-3.
19. Equipo según la reivindicación 17, en el que
dicho compuesto complementario que tiene actividad trombolítica se
selecciona del grupo que consiste en un activador del plasminógeno,
la hirudina, un inhibidor enzimático, una enzima, un anticoagulante,
un anticuerpo o un péptido sintético específico del receptor
plaquetario gpIIb/IIIa, o una combinación de los mismos.
20. Equipo según la reivindicación 17, que
comprende además medios para administrar una cantidad
terapéuticamente eficaz de dicha composición.
\newpage
21. Equipo según la reivindicación 20, en el que
dichos medios de administración incluyen medios para administrar
dicha composición por vía parenteral.
22. Método de degradación de fibrina/fibrinógeno
que comprende poner en contacto fibrina/fibrinógeno in vitro
con una cantidad de una metaloproteinasa fibrinolítica eficaz para
escindir fibrina/fibrinógeno, en el que dicha metaloproteinasa
fibrinolítica es una estromelisina.
23. Método según la reivindicación 22, en el que
dicha estromelisina es MMP-3.
24. Método según la reivindicación 23, en el que
dicha estromelisina escinde fibrina/fibrinógeno en el enlace
peptídico \gammaGly404-Ala405.
25. Método de diagnóstico para
caracterizar fibrina/fibrinógeno que comprende poner en
contacto fibrina/fibrinó-
geno in vitro con una metaloproteinasa fibrinolítica para proporcionar productos de degradación característicos de dicha fibrina/fibrinógeno, en el que dicha metaloproteinasa fibrinolítica es una estromelisina.
geno in vitro con una metaloproteinasa fibrinolítica para proporcionar productos de degradación característicos de dicha fibrina/fibrinógeno, en el que dicha metaloproteinasa fibrinolítica es una estromelisina.
26. Método de diagnóstico según la reivindicación
25, en el que dicha estromelisina es MMP-3.
27. Método de diagnóstico según la reivindicación
25, en el que dicho método comprende además poner en contacto dichos
productos de degradación con al menos un anticuerpo que se asocie
específicamente con un dominio de la fibrina/fibrinógeno y medir la
asociación específica de dicho anticuerpo con dichos productos de
degradación separados.
28. Método de diagnóstico según la reivindicación
27, en el que dicho anticuerpo se marca de manera que se pueda
detectar con un resto de marcador detectable.
29. Método de diagnóstico según la reivindicación
27, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoespecífico.
30. Método para inhibir la formación de trombos
mediante un aparato relacionado con la medicina que comprende poner
en contacto un aparato relacionado con la medicina con una
composición que comprende una metaloproteinasa fibrinolítica, para
proporcionar una superficie de inhibición de trombos sobre dicho
aparato relacionado con la medicina, en el que dicha
metaloproteinasa fibrinolítica es una estromelisina.
31. Método según la reivindicación 30, en el que
dicho aparato relacionado con la medicina se selecciona del grupo
que consiste en tubos de recogida de sangre, matraces de cultivo,
placas de prueba, pipetas, envases de reactivos, tubos, membranas,
agujas, cánulas, catéteres, injertos, stents, filtros, dispositivos
intrauterinos, válvulas y similares.
32. Aparato relacionado con la medicina que tiene
propiedades de inhibición de trombos que comprende un dispositivo
relacionado con la medicina al que se ha proporcionado una cantidad
para inhibir trombos de una composición que comprende una
metaloproteinasa fibrinolítica, en el que dicha metaloproteinasa
fibrinolítica es una estromelisina.
33. Aparato relacionado con la medicina según la
reivindicación 32, en el que dicho aparato relacionado con la
medicina se selecciona del grupo que consiste en tubos de recogida
de sangre, matraces de cultivo, placas de prueba, pipetas, envases
de reactivos, tubos, membranas, agujas, cánulas, catéteres,
injertos, stents, filtros, dispositivos intrauterinos, válvulas y
similares.
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