ES2214593T3 - Procedimiento para producir acido graso poliinsaturado omega-9 y lipido que lo contiene. - Google Patents
Procedimiento para producir acido graso poliinsaturado omega-9 y lipido que lo contiene.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO DE PRODUCCION DE UN LIPIDO QUE CONTIENE UN ACIDO ALTAMENTE INSATURADO OMEGA-9, CULTIVANDO EN UN MEDIO UNA CEPA MUTANTE, OBTENIDA POR MUTACION DE UN MICROORGANISMO CAPAZ DE PRODUCIR ACIDO ARAQUIDONICO, PERTENECIENTE AL GENERO MORTIERELLA Y OTROS, EN EL CUAL LA ACTIVIDAD DE DESATURACION DL}12 ESTA REDUCIDA O ANULADA, PERO AL MENOS UNA DE LAS ACTIVIDADES DE DESATURACION EN DL}5, DESATURACION EN DL}6 Y ACTIVIDAD DE ALARGAMIENTO DE CADENA SE ENCUENTRA INCREMENTADA. ADEMAS, LA PRESENTE INVENCION DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO DE PRODUCCION DE ACIDO GRASO ALTAMENTE INSATURADO OMEGA-9, MEDIANTE RECUPERACION DE DICHO ACIDO GRASO A PARTIR DEL CULTIVO O DEL LIPIDO DESCRITO ANTERIORMENTE.
Description
Procedimiento para producir ácido graso
poliinsaturado \omega-9 y lípido que lo
contiene.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para producir ácido graso poliinsaturado
omega-9 y lípido que contiene el mismo mediante
fermentación utilizando un microorganismo mutante.
Los ácidos grasos poliinsaturados
omega-9, tales como el ácido
5,8,11-eicosatrienoico (denominado ácido de Mead) y
el ácido 8,11-eicosadienoico, se sabe que existen
como uno de los ácidos grasos constituyentes de tejido animal que
se ha vuelto deficiente en ácidos grasos esenciales. Sin embargo,
ha sido sumamente difícil aislarlos y purificarlos puesto que están
presentes en cantidades sumamente pequeñas. Puesto que es posible
que estos ácidos grasos altamente insaturados se vuelvan precursores
del grupo 3 de leucotrieno en el cuerpo, se han depositado
esperanzas importantes en su actividad fisiológica. Recientemente
se ha publicado su utilización para efectos antiinflamatorios,
antialérgicos y antirreumáticos
(JP-A-7/41421).
Existe por tanto un fuerte deseo de desarrollar
un método para producir ácidos grasos altamente insaturados
omega-9 en grandes cantidades. Un procedimiento
para producir ácido graso altamente insaturado
omega-9 y lípido que contiene el mismo se llevó a
cabo previamente realizando la mutación de microorganismos que
tienen la capacidad de producir ácido araquidónico y aislando
aquellos microorganismos en los que había disminuido o se había
perdido la actividad de desaturación \Delta12
(EP-A-535939 y
JP-A-5/91888). Los microorganismos
incluían Mortierella, especialmente Mortierella
alpina. J.Gen.Microbiol. vol. 138 (1992)
pp997-1002 S. Jareonkitmongkol et al.,
describe mutaciones de la cepa 1S-4 de M.
alpina que conducen a mutantes deficientes en desaturasa
\Delta12, también mutantes deficientes en desaturasa \Delta5 y
\Delta6 que se cultivaron produciendo varios PUFAs (del inglés
"poly-unsaturated fatty acids") en cantidades
variables. Anteriormente,
EP-A-252716 describía el cultivo de
especies de Mortierella salvajes para producir DGLA y EPA.
Sin embargo, aunque resulta revolucionario e importante que se
desarrollara un procedimiento para producir ácido graso altamente
insaturado omega-9 y lípido que contiene el mismo,
puesto que tal procedimiento no había existido en el pasado,
siempre se puede mejorar el rendimiento. Por consiguiente, ha habido
un fuerte deseo de desarrollar un procedimiento para producir
eficientemente una cantidad mayor de ácidos grasos altamente
insaturados omega-9, en particular un procedimiento
que haga posible producir ácido graso altamente insaturado
omega-9 o lípido que contiene el mismo en gran
cantidad por ejemplo utilizando medios económicos
convencionales.
Como resultado de varias investigaciones,
encontramos la disponibilidad y propusimos la utilización de cepas
mutantes en las que la actividad de desaturación \Delta12 ha
disminuido o se ha perdido, pero al menos una entre la actividad de
desaturación \Delta5, la actividad de desaturación \Delta6 y la
actividad de elongación de la longitud de cadena se ha elevado.
La presente invención proporciona un
procedimiento para producir lípido que contiene ácido graso
poliinsaturado omega-9, que comprende los pasos
de:
cultivar en un medio un mutante, derivado
mediante mutación a partir de un microorganismo que tiene la
capacidad de producir ácido araquidónico y que pertenece a un
género seleccionado entre Mortierella, Conidiobolus,
Pythium, Phytophthora, Penicillium,
Cladosporium, Mucor, Fusarium,
Aspergillus, Rhodotorula, Entomophthora,
Echinosporangium, y Saprolegnia, mutante en el cual,
relativo a la cepa salvaje correspondiente, la actividad de
desaturación \Delta12 ha disminuido o se ha perdido mediante una
primera mutación, pero al menos una entre la actividad de
desaturación \Delta5, la actividad de desaturación \Delta6 y la
actividad de elongación de la longitud de cadena ha aumentado
mediante una segunda mutación, y
recuperar el lípido que contiene ácido graso
poliinsaturado omega-9 del cultivo.
Además, la presente invención proporciona un
procedimiento para producir un ácido graso poliinsaturado
omega-9 que comprende el paso de recuperar el ácido
graso altamente insaturado omega-9 del cultivo o
lípido obtenido conforme al procedimiento descrito arriba.
En la presente invención, los microorganismos
utilizados para mutar (que se denominan como "cepa parental")
son microorganismos que tienen la capacidad de producir ácido
araquidónico y pertenecen al género Mortierella,
Conidiobolus, Pythium, Phytophthora,
Penicillium, Cladosporium, Mucor,
Fusarium, Aspergillus, Rhodotorula,
Entomophthora, Echinosporangium o
Saprolegnia,
Estos microorganismos convierten el ácido
esteárico en ácido oleico mediante la desaturasa \Delta9, el ácido
oleico en ácido linoleico mediante la desaturasa \Delta12, el
ácido linoleico en ácido \gamma-linoleico mediante
la desaturasa \Delta6, el ácido
\gamma-linoleico en ácido
dihomo-\gamma-linoleico mediante
la enzima de elongación de la longitud de cadena, y el ácido
dihomo-\gamma-linoleico en ácido
araquidónico mediante la desaturasa \Delta5. Además, estos
microorganismos biosintetizan el ácido
6,9-octadecadienoico a partir del ácido oleico
mediante la desaturasa \Delta6, el ácido
8,11-eicosadienoico a partir del ácido
6,9-octadecadienoico mediante la enzima de
elongación de la longitud de cadena, y el ácido de Mead a partir del
ácido 8,11-eicosadienoico mediante la desaturasa
\Delta5 cuando la actividad de desaturación \Delta12 está
inhibida.
Los microorganismos que pertenecen al subgénero
Mortierella en el género Mortierella, que exhibe una
productividad excelente de ácido araquidónico, se prefieren como la
cepa parental utilizada en la presente invención, ejemplos de los
cuales incluyen las cepas Mortierella elongata IFO 8570,
Mortierella exigua IFO 8571, Mortierella hygrophila
IFO 5941 y Mortierella alpina IFO 8568, ATCC 16266, ATCC
32221, ATCC 42430, CBS 219.35, CBS 224.37, CBS 250.53, CBS 343.66,
CBS 527.72, CBS 529.72, CBS 608.70 y CBS 754.68.
Todas estas cepas están disponibles sin
restricción del Instituto de Fermentación Osaka (IFO) situado en
Osaka, Japón, la Colección de Cultivos Tipo Americana (ATCC)
situada en EE.UU., o el "Centraalbureau voor Schimmelcultures"
(CBS). Además, puede utilizarse también la cepa Mortierella
elongata SAM0219 (FERM P-8703) (FERM
BP-1239), que fue aislada del suelo por los
inventores de la presente invención. Mortierella elongata
SAM0219 se depositó como una deposición internacional bajo el
Tratado de Budapest como FERM BP-1239 el 19 de
marzo de 1986 en el Instituto de Biociencia y la Agencia de
Tecnología Humana de Ciencia Industrial y Tecnología,
1-3 Higashi 1-chome,
Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305,
Japón.
Además, la cepa parental utilizada en la presente
invención puede ser una cepa mutante o recombinante derivada de un
microorganismo arriba mencionado (cepas salvajes) que tenga la
capacidad de producir ácido araquidónico, esto es, cepas diseñadas
intencionadamente de tal forma que el contenido de ácido graso
altamente insaturado omega-9, el contenido total de
lípido o ambos es mayor que la cantidad producida por la cepa
salvaje original cuando se cultiva utilizando el mismo sustrato.
Además, dicha cepa parental incluye también microorganismos
diseñados para producir una cantidad de ácido graso altamente
insaturado omega-9 igual a la de la cepa salvaje
correspondiente utilizando eficientemente un sustrato que tenga una
ventaja de coste excelente.
Para obtener un mutante que tenga disminuida o
que haya perdido la actividad de desaturación \Delta12, pero al
menos una entre la actividad de desaturación \Delta5, la
actividad de desaturación \Delta6 y la actividad de elongación de
la longitud de cadena elevada, se realiza la mutación en el
microorganismo arriba mencionado que tiene la capacidad de producir
ácido araquidónico para obtener primero un mutante que tenga
disminuida o que haya perdido la actividad de desaturación
\Delta12. Mediante mutación adicional de esta cepa mutante, puede
obtenerse un mutante en el que ha disminuido o se ha perdido la
actividad de desaturación \Delta12, pero al menos una entre la
actividad de desaturación \Delta5, la actividad de desaturación
\Delta6 y la actividad de elongación de la longitud de cadena se
ha elevado. Un ejemplo de un mutante que puede utilizarse que tiene
disminuida o que ha perdido la actividad de desaturación \Delta12
es Mortierella alpina SAM1861 (FERM BP-3590).
Mortierella alpina SAM1861 se depositó como una deposición
internacional bajo el Tratado de Budapest como FERM
BP-3590 el 30 de septiembre de 1991 en el Instituto
de Biociencia y la Agencia de Tecnología Humana de Ciencia
Industrial y Tecnología, 1-3 Higashi
1-chome, Tsukuba-shi,
Ibaraki-ken, 305, Japón.
Utilizando un microorganismo que tenga disminuida
o que haya perdido la actividad de desaturación \Delta12, y
preferiblemente un microorganismo en el que la actividad de
desaturación \Delta12 esté ausente, como progenitor para el
mutante, puede evaluarse fácilmente la cuestión de si su actividad
de desaturación \Delta5, su actividad de desaturación \Delta6 o
su actividad de elongación de la longitud de cadena se ha elevado o
no.
Más específicamente, puesto que los ácidos grasos
insaturados omega-6 tales como ácido linoleico,
ácido \gamma-linoleico, ácido
dihomo-\gamma-linoleico y ácido
araquidónico están intrínsicamente o ausentes o presentes sólo en
cantidades muy pequeñas en células microbianas en el caso de un
microorganismo en el que la actividad de desaturación \Delta12 ha
disminuido o se ha perdido, el ácido
\gamma-linoleico se forma mediante la desaturasa
\Delta6 si las células en reposo obtenidas después de cultivar se
hacen reaccionar con ácido linoleico, el ácido araquidónico se forma
mediante la desaturasa \Delta5 si se hace reaccionar con ácido
dihomo-\gamma-linoleico, o el
ácido dihomo-\gamma-linoleico se
forma mediante la enzima de elongación de la longitud de cadena si
se hace reaccionar con ácido \gamma-linoleico.
Puesto que la actividad de cada enzima puede ensayarse fácilmente,
la actividad de desaturación \Delta5, la actividad de
desaturación \Delta6 y la actividad de elongación de la longitud
de cadena de los microorganismos obtenidos mediante mutación puede
evaluarse comparándolos con la cepa parental.
Aunque un ejemplo específico de una cepa mutante
de la presente invención que puede utilizarse es Mortierella
alpina SAM2086 (FERM P-15766) (que se depositó
como una deposición internacional bajo el Tratado de Budapest como
FERM BP-6032 el 5 de agosto de 1996 en dicho
Instituto), un microorganismo sin actividad de desaturación
\Delta12 y que tiene elevada la actividad de desaturación
\Delta6 que fue inducido por los inventores de la presente
invención a partir de Mortierella alpina SAM1861, tales
mutantes no están limitados a esta cepa, sino que pueden utilizarse
cualesquier mutantes siempre que cuando la actividad de
desaturación \Delta5, la actividad de desaturación \Delta6 o la
actividad de elongación de la longitud de cadena de la cepa
parental en la que la actividad de desaturación \Delta12 ha
disminuido o se ha perdido se exprese como "1", al menos una
de estas actividades muestre un nivel de actividad que exceda de
1.
Los mutantes eficaces pueden identificarse
mediante procedimientos de mutación, seguidos de ensayos
seleccionados apropiadamente, ambos como se expone en la
presente.
Ejemplos de ácidos grasos poliinsaturados
omega-9 obtenidos mediante la presente invención
incluyen ácido 6,9-octadecadienoico, ácido
8,11-eicosadienoico y ácido
5,8,11-eicosatrienoico.
En la presente invención, el ácido de Mead puede
producirse en gran cantidad utilizando, en particular, un mutante en
el que la actividad de desaturación \Delta12 esté ausente, y
tanto la actividad de desaturación \Delta5 como la actividad de
desaturación \Delta6 se hayan elevado.
Para inducir la mutación pueden realizarse
procedimientos típicos de mutación, tales como irradiar con
radiación (rayos-X, rayos- \gamma o haz de
neutrones), rayos ultravioleta o tratamiento con calor, o
resuspendiendo los microorganismos en un tampón adecuado, añadiendo
un mutágeno e incubando durante una cantidad de tiempo
predeterminada seguido de la dilución adecuada y crecimiento en
medio con agar para obtener colonias de la cepa mutante. Ejemplos
de mutágenos incluyen agentes de alquilación tales como mostaza
nitrogenada, metil-metano-sulfonato
(MMS) y
N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina
(NTG), análogos de bases tales como 5-bromouracilo,
antibióticos tales como mitomicina C, inhibidores de síntesis de
bases tales como 6-mercaptopurina, pigmentos tales
como proflavina (y otros derivados), ciertos tipos de carcinógenos
tales como N-óxido de 4-nitroquinolina, y otros
compuestos tales como cloruro de manganeso y formaldehído. Además,
la cepa parental puede estar en forma de células en crecimiento
(micelio) o esporas.
Para cultivar un mutante en el procedimiento de
producción de la presente invención, las esporas, el micelio o el
líquido precultivado obtenido cultivando por adelantado se inoculan
en un medio líquido o sólido. En caso de utilizar un medio líquido,
aunque pueden utilizarse cualesquier sustancias típicamente
utilizadas para la fuente de carbono, ejemplos de las cuales
incluyen glucosa, fructosa, xilosa, sacarosa, maltosa, almidón
soluble, melaza, glicerol, manitol y ácido cítrico, se prefieren
particularmente glucosa, maltosa, melaza y glicerol.
Además, pueden utilizarse para la fuente de
nitrógeno fuentes de nitrógeno orgánico tales como extracto de
levadura, extracto de germen de trigo, extracto de carne,
casaminoácidos, licor de maíz empapado y urea, o fuentes de
nitrógeno inorgánico tales como nitrato de sodio, nitrato de amonio
y sulfato de amonio. Además, pueden utilizarse también fosfatos
tales como fosfato de potasio y fosfato de dihidrógeno y potasio,
sales inorgánicas tales como sulfato de amonio, sulfato de sodio,
sulfato de magnesio, sulfato de hierro, sulfato de cobre, cloruro
de magnesio y cloruro de calcio, así como vitaminas según se
necesite como nutrientes traza.
No existen limitaciones particulares para las
concentraciones de estos componentes del medio siempre que no
inhiban el crecimiento de los microorganismos. En términos
prácticos, la fuente de carbono debería utilizarse típicamente
entre el 0,1 y el 30% en peso, y preferiblemente entre el 1 y el 15%
en peso, y la fuente de nitrógeno entre el 0,01 y el 10% en peso, y
preferiblemente entre el 0,1 y el 5% en peso.
La temperatura del cultivo es preferiblemente de
5 a 40ºC, más preferiblemente de 20 a 30ºC. Después de que los
microorganismos han crecido mediante cultivo entre 20 y 30ºC, los
ácidos grasos poliinsaturados omega-9 pueden
producirse también mediante cultivo subsiguiente entre 5 y 20ºC.
Mediante tal control de la temperatura puede aumentarse la cantidad
de ácidos grasos poliinsaturados omega-9 formados
en los ácidos grasos resultantes. El valor del pH del medio debería
estar entre 4 y 10, y preferiblemente entre 5 y 8, y el cultivo se
realiza mediante cultivo en agitación aireado, cultivo en agitación
o cultivo estacionario. El cultivo se realiza normalmente entre 2 y
20 días, preferiblemente entre 5 y 20 días y más preferiblemente
entre 5 y 15 días.
En caso de utilizar un medio sólido, el cultivo
se realiza entre 3 y 14 días a una temperatura entre 5 y 40ºC, y
preferiblemente entre 20 y 30ºC, utilizando salvado de trigo,
granzas de arroz o salvado de arroz que contiene entre un 50 y un
100% en peso de agua relativo al peso de las sustancias sólidas. En
este caso, las fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas y nutrientes
traza pueden añadirse según sea necesario. Además, en la presente
invención, la acumulación de ácidos grasos poliinsaturados
omega-9 puede fomentarse añadiendo un precursor de
ácidos grasos poliinsaturados omega-9 al medio
durante el cultivo.
Ejemplos de precursores incluyen hidrocarburos,
por ejemplo, n-alcanos tales como tetradecano,
hexadecano y octadecano, ácidos grasos, sus sales (por ejemplo,
sales de sodio o sales de potasio) o sus ésteres tales como ácido
tetradecanoico, ácido hexadecanoico y ácido octadecanoico, o aceites
que contienen ácidos grasos como sus ingredientes constituyentes
(por ejemplo, aceite de oliva, aceite de coco y aceite de palma).
Este precursor no está limitado a estos ejemplos, sin embargo. La
cantidad totaldel sustrato añadido es entre el 0,001 y el 10% en
peso, y preferiblemente entre el 0,5 y el 10% en peso relativo a la
cantidad de medio. Además, el cultivo puede realizarse también
utilizando tal precursor como única fuente de carbono.
Estas fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno,
sales inorgánicas, vitaminas o sustratos pueden añadirse antes o
inmediatamente después de la inoculación con un microorganismo
productor, o pueden añadirse después de que se haya iniciado el
cultivo. Alternativamente, pueden añadirse en alguno de esos
momentos o en ambos. La adición inmediatamente después del inicio
del cultivo puede realizarse toda de una vez o intermitentemente
dividiéndose en varias adiciones. Alternativamente, la adición
puede realizarse de forma continua.
Cultivando de esta manera, se formarán lípidos
que contienen una gran cantidad de ácidos grasos poliinsaturados
omega-9 y se acumularán intracelularmente. En el
caso del cultivo líquido, el lípido que contiene los ácidos grasos
poliinsaturados omega-9 se recupera a partir del
medio de cultivo o medio de cultivo esterilizado de un paso
intermedio en la producción de aceite por los microorganismos
cultivados, a partir del medio de cultivo o medio de cultivo
esterilizado una vez completado el cultivo, o a partir de las
células cultivadas o su producto seco recogido de cualquiera de los
medios de cultivo anteriores. Por ejemplo, el lípido que contiene
los ácidos grasos poliinsaturados omega-9 puede
recuperarse a partir de las células cultivadas y el lípido que
contiene los ácidos grasos poliinsaturados omega-9
puede aislarse de la manera descrita a continuación.
Una vez completado el cultivo, las células
cultivadas se obtienen a partir del medio de cultivo mediante
centrifugación y/o cualquier técnica de separación
sólido-líquido convencional tal como filtración. Las
células preferiblemente se lavan, se trituran y se secan. El secado
puede realizarse mediante liofilización o secado al aire. Las
células secas se someten a extracción preferiblemente con
disolventes orgánicos en presencia de gas nitrógeno fluyente.
Ejemplos de disolventes orgánicos que pueden utilizarse incluyen
éter etílico, hexano, metanol, etanol, cloroformo, diclorometano y
éter de petróleo, aunque alternar la extracción con metanol y éter
de petróleo, y la extracción utilizando un disolvente de fase única
de cloroformo, metanol y agua da buenos resultados. El disolvente
orgánico se elimina a continuación por destilación del extracto a
presión reducida para obtener el lípido que contiene una alta
concentración de ácidos grasos poliinsaturados
omega-9.
Además, la extracción puede realizarse también
utilizando células húmedas en lugar del método descrito arriba. En
este caso, puede utilizarse un disolvente tal como metanol o etanol
que sea miscible con agua, o mezclas de disolventes que comprendan
estos disolventes, agua y/u otros disolventes que sean miscibles
con agua. Las otras partes del procedimiento son las mismas que las
descritas arriba.
Los ácidos grasos poliinsaturados
omega-9 están presentes en el lípido obtenido de la
manera arriba mencionada como un triglicérido, o como un compuesto
unido a fosfatidil-colina,
fosfatidil-etanolamina o
fosfatidil-inositol. La purificación del
triglicérido que contiene los ácidos grasos poliinsaturados
omega-9 del lípido que contiene los ácidos grasos
poliinsaturados omega-9 recuperado del cultivo
puede realizarse conforme a métodos rutinarios tales como extracción
con hexano seguida de la retirada del ácido libre, decoloración,
desodorización, tratamiento de desengomado o separación mediante
enfriamiento.
Además, los ácidos grasos poliinsaturados
omega-9 están contenidos en el lípido obtenido de la
manera descrita arriba en forma de un compuesto lipídico, tal como
el componente constituyente de una grasa. Aunque éstos pueden
separarse directamente, es preferible separarlos en forma de un
éster o un alcohol inferior, ejemplos de los cuales incluyen
8,11-eicosadienoato de metilo,
6,9-octadecadienoato de metilo y el éster metílico
del ácido de Mead. Convirtiéndolos en ésteres de esta manera estos
componentes pueden separarse fácilmente de otros componentes
lipídicos. Además, pueden separarse también fácilmente de otros
ácidos grasos formados durante el cultivo, tales como ácido
palmítico y ácido oleico (estos se esterifican también durante la
esterificación de los ácidos grasos poliinsaturados
omega-9). Por ejemplo, para obtener el éster
metílico de los ácidos grasos poliinsaturados
omega-9, es preferible tratar el lípido extraído
mencionado arriba entre 1 y 24 horas a temperatura ambiente con
ácido clorhídrico metanólico a una concentración del 5 al 10% o
BF3-metanol a una concentración del 10 al 50%.
Para recuperar los ácidos grasos poliinsaturados
omega-9 a partir de la solución de tratamiento
arriba mencionada, es preferible extraer con un disolvente orgánico
tal como hexano, éter etílico o acetato de etilo. A continuación,
secando este extracto sobre sulfato de sodio anhidro, etcétera, y
eliminando por destilación el disolvente orgánico preferiblemente a
presión reducida, se obtiene una mezcla que consta principalmente
de ésteres de ácidos grasos. Esta mezcla contiene palmitato de
metilo, estearato de metilo, oleato de metilo y otros ésteres
metílicos de ácidos grasos además de los ésteres metílicos de los
ácidos grasos poliinsaturados omega-9 diana. Para
aislar los ésteres metílicos de los ácidos grasos poliinsaturados
omega-9 de la mezcla de ésteres metílicos de ácidos
grasos, puede utilizarse cromatografía en columna, cristalización a
baja temperatura, inclusión de urea o cromatografía de distribución
a contracorriente líquido-líquido, etcétera, solo o
en combinación.
Para obtener los ácidos grasos poliinsaturados
omega-9 a partir de los distintos tipos de ésteres
metílicos de los ácidos grasos poliinsaturados
omega-9 aislados de la manera descrita arriba,
después de la hidrólisis en presencia de álcali, la mezcla debería
someterse a extracción con un disolvente orgánico tal como éter
etílico o acetato de etilo.
Además, para recuperar los ácidos grasos
poliinsaturados omega-9 sin pasar por sus ésteres
metílicos, después de la hidrólisis del lípido extraído arriba
mencionado con álcali (mediante, por ejemplo, tratamiento entre 2 y
3 horas a temperatura ambiente con solución de hidróxido sódico al
5%), los ácidos grasos poliinsaturados omega-9
pueden someterse a extracción y purificarse a partir del
hidrolizado mediante métodos normalmente utilizados para la
extracción y purificación de ácidos grasos.
Los siguientes Ejemplos proporcionan una
explicación detallada de la presente invención.
Mortierella alpina SAM1861, un mutante sin
actividad de desaturación \Delta12, se inoculó en medio Czapek
con agar (NaNO_{3} al 0,2%, K_{2}HPO_{4} al 0,1%, MgSO_{4}
al 0,05%, KCl al 0,05%, FeSO_{4} al 0,001%, sacarosa al 3%, agar
al 2%, pH 6,0) para formar esporas para preparar una solución de
esporas (tampón Tris/malato 50 mM (pH 7,5), 1 x 10^{6}
esporas/ml).
Se añadieron 0,5 ml de tampón Tris/malato 100 mM
(pH 7,5) a 1,0 ml de la solución de esporas resultante seguido de la
adición de 500 \mul de solución de NTG (5 mg de
N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina/1
ml de agua desionizada) e incubación durante 15 minutos a 28ºC para
realizar el tratamiento de mutación.
La suspensión de esporas tratada con NTG se
diluyó hasta aproximadamente entre 10^{-3} y 10^{-4} y se aplicó
a una placa de agar GY (glucosa al 1%, extracto de levadura al
0,5%, Triton X-100 al 0,005%, agar al 1,5%, pH 6,0).
Aquellas colonias que aparecieron durante el cultivo a 28ºC se
escogieron al azar y se transfirieron a una placa nueva.
Las colonias de almacenamiento escogidas se
cultivaron durante 2 días a 28ºC y 2 días a 12ºC en una placa de
agar GY y a continuación se cortaron cuando todavía estaban unidas
al agar y se secaron a 100ºC.
Las células secas resultantes se colocaron en un
tubo de ensayo con tapón de rosca (16,5 mm de diámetro) seguido de
su esterificación metílica mediante tratamiento durante 3 horas a
50ºC añadiendo 1 ml de cloruro de metileno y 2 ml de HCl metanólico
al 10%. Después de añadir 4 ml de n-hexano y 1 ml de agua,
extraer dos veces, y eliminar el disolvente por destilación del
extracto utilizando un evaporador por centrifugación (40ºC, 1
hora), los ésteres metílicos de ácidos grasos resultantes se
analizaron por cromatografía de gases capilar. Como resultado del
escrutinio, se obtuvo la cepa Mortierella alpina SAM2086
(FERM P-15766) que tiene mayor productividad de
ácido de Mead que la cepa parental, Mortierella alpina
SAM1861. Mortierella alpina SAM2086 se depositó como FERM
P-15766 el 5 de agosto de 1996 en el Instituto de
Biociencia y la Agencia de Tecnología Humana de Ciencia Industrial
y Tecnología, 1-3 Higashi 1-chome,
Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305,
Japón. Además, se obtuvo la cepa Mortierella alpina SAM2104
realizando un tratamiento de mutación similar al descrito arriba
utilizando SAM2086 como cepa parental.
Se colocaron 5 l de medio (pH 6,0) que contenía
glucosa al 4% y extracto de levadura al 1% en un fermentador de cuba
de 10 l y se esterilizó durante 30 minutos a 120ºC. El medio se
inoculó a continuación con 100 ml de un precultivo del mutante
SAM1861 o SAM2086 de Mortierella alpina seguido del cultivo
aireado con agitación durante 8 días con aireación a 1
volumen/volumen/min y agitación a 300 rpm. La temperatura del
material de cultivo al inicio del cultivo fue de 28ºC y a
continuación se bajó a 20ºC en el segundo día de cultivo. Se añadió
glucosa al 1% diariamente del primer al cuarto día de cultivo. Una
vez completado el cultivo, las células se recuperaron mediante
filtración y después del lavado adecuado, las células húmedas
resultantes se liofilizaron para obtener 99,7 g y 92,5 g de células
secas de cada cepa, respectivamente.
Cuando se extrajo el lípido de estas células
secas conforme al método de extracción de Bligh & Dyer
utilizando un disolvente de fase única de cloroformo, metanol y
agua, los lípidos se obtuvieron en cantidades de 48,92 g y 44,17 g,
respectivamente. Para confirmar la composición de ácidos grasos de
estos lípidos, se colocaron 10 mg de lípido en tubos de ensayo con
tapón de rosca y se sometieron a esterificación metílica mediante
tratamiento durante 3 horas a 50ºC añadiendo 1 ml de cloruro de
metileno y 2 ml de HCl metanólico al 10%. Después de añadir 4 ml de
n-hexano y 1 ml de agua, extraer 2 veces, y eliminar el
disolvente por destilación del extracto utilizando un evaporador por
centrifugación (40ºC, 1 hora), los ésteres metílicos de ácidos
grasos resultantes se analizaron por cromatografía de gases. Los
resultados se muestran en la Tabla 1.
SAM2086, inducida por mutación a partir de
SAM1861, demostró claramente poseer tanto una productividad como una
relación de contenido excelentes de ácido de Mead.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
- ^{+}:
- LA: ácido linoleico, 18:2 (\omega9): ácido 6,9-octadecadienoico, GLA: ácido \gamma-linoleico, 20:2 (\omega9): ácido 8,11-eicosadienoico, 20:3 (\omega9): ácido de Mead, DGLA: ácido dihomo-\gamma-linoleico, Ara: ácido araquidónico, EPA: ácido eicosapentenoico
- \text{*}:
- Peso de células secas por litro de medio
- \text{**}:
- Peso de ácidos grasos insaturados omega-9 por litro de medio
Se añadieron 1 ml de tampón fosfato 0,1 M (pH
7,4), 30 mg de células húmedas obtenidas en el Ejemplo 2 del mutante
SAM1861 o SAM2086 de Mortierella alpina y 100 \mul de
solución de sustrato resuspendido en BSA (preparada mezclando 20 mg
de ácido linoleico, ácido \gamma-linoleico o ácido
dihomo-\gamma-linoleico en 2 ml
de albúmina de suero bovino al 5% (BSA libre de ácidos grasos,
Sigma) y resuspendiendo mediante sonicación durante aproximadamente
20 minutos) a tubos de ensayo con tapón de rosca (16,5 mm de
diámetro), después de lo cual los tubos de ensayo se taparon con un
tapón de silicona y se agitaron a 28ºC y 120 rpm. La reacción se
paró después de 0, 2, 6 ó 20 horas añadiendo 4 ml de etanol.
Después de secar con un evaporador por
centrifugación (40ºC, 1 hora), se realizó la esterificación metílica
de la misma manera que en el Ejemplo 2, y los ésteres metílicos de
ácidos grasos resultantes (sustratos y productos de reacción) se
analizaron mediante cromatografía de gases capilar. En este
análisis, se utilizó la misma cantidad de solución de BSA al 5% como
control. De este modo, si se utiliza ácido
dihomo-\gamma-linoleico como
sustrato, la actividad de desaturación \Delta5 se determina a
partir de la cantidad de producto de reacción, esto es, ácido
araquidónico; si se utiliza ácido
\gamma-linoleico como sustrato, la actividad de
elongación de la longitud de cadena se determina a partir de la
cantidad de producto de reacción, esto es, ácido
dihomo-\gamma-linoleico, y la
actividad de desaturación \Delta5 se determina a partir de la
cantidad de ácido araquidónico; y si se utiliza ácido linoleico como
sustrato, la actividad de desaturación \Delta6 se determina a
partir de la cantidad de producto de reacción, esto es, ácido
\gamma-linoleico, la actividad de elongación de la
longitud de cadena se determina a partir de la cantidad de ácido
dihomo-\gamma-linoleico, y la
actividad de desaturación \Delta5 se determina a partir de la
cantidad de ácido araquidónico. Estos resultados se muestran en la
Tabla 2.
En caso de considerar la actividad de SAM1861
como 1 para la actividad de desaturación \Delta5 utilizando ácido
dihomo-\gamma-linoleico como
sustrato, la actividad de SAM2086 fue 1,74. En caso de considerar
la actividad de SAM1861 como 1 para la actividad de desaturación
\Delta6 utilizando ácido linoleico como sustrato, la actividad de
SAM2086 fue 1,42. Los aumentos en la productividad y relación de
ácido de Mead de SAM2086 inducida por mutación a partir de SAM1861
del Ejemplo 2 fueron claramente el resultado del aumento en la
actividad de desaturación \Delta5 y actividad de desaturación
\Delta6.
\newpage
Velocidades de reacción de SAM1861 y
SAM2086
(nmol/30 mg de células
húmedas/hora)
- LA:
- ácido linoleico, GLA: ácido \gamma-linoleico, DGLA: ácido dihomo-\gamma-linoleico,
- Ara:
- ácido araquidónico
- DS
- \Delta5: actividad de desaturación \Delta5
- DS
- \Delta6: actividad de desaturación \Delta6
- EL:
- actividad de elongación de la longitud de cadena
Se colocaron 2 ml de medio (pH 6,0) que contenía
glucosa al 2%, extracto de levadura al 1% y 0,5% de cada precursor
de los ácidos grasos altamente insaturados omega-9
indicados en la Tabla 3, o aceites que contenían los mismos, en
matraces Erlenmeyer de 10 ml y se esterilizaron durante 20 minutos a
120ºC. Los matraces se inocularon cada uno con células del mutante
SAM2086 de Mortierella alpina seguido del cultivo durante 8
días a 28ºC utilizando un agitador alternativo (110 rpm). Los
resultados se muestran en la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
- 18:2;
- ácido 6,9-octadecadienoico
- 20:2;
- ácido 8,11-eicosadienoico
- 20:3;
- ácido 5,8,11-eicosatrienoico (ácido de Mead)
Se colocaron 5 l de medio (pH 6,0) que contenía
glucosa al 2%, extracto de levadura al 1%, aceite de oliva al 0,1% y
Adecanol (agente desespumante; Marca Comercial) al 0,01% en un
fermentador de cuba de 10 l seguido de su esterilización durante 30
minutos a 120ºC. Se inocularon 100 ml de un precultivo de
Mortierella alpina SAM2104. El cultivo se llevó a cabo
durante 8 días con aireación a 1 volumen/volumen/min y agitación a
300 rpm.
La temperatura del material de cultivo fue de
28ºC al inicio del cultivo y a continuación se bajó a 20ºC
comenzando en el segundo día de cultivo. Se añadió glucosa al 1,5%
en el segundo y tercer días de cultivo. Una vez finalizado el
cultivo, se obtuvieron 15,80 g de células secas por litro de medio
siguiendo el mismo procedimiento que el del Ejemplo 2. El lípido se
extrajo de la misma manera que en el Ejemplo 2, dichos lípidos se
sometieron a esterificación metílica, los ésteres metílicos de
ácidos grasos resultantes se analizaron mediante cromatografía de
gases. Las cantidades producidas y porcentajes de ácido de Mead,
ácido 8,11-eicosadienoico y ácido
6,9-octadecadienoico relativas a la cantidad total
de ácidos grasos fueron 1,76 g/l y 23,76% para el ácido de Mead,
0,35 g/l y 4,75% para el ácido 8,11-eicosadienoico,
y 0,84 g/l y 11,35% para el ácido
6,9-octadecadienoico, respectivamente.
Claims (8)
1. Un procedimiento para producir lípido que
contiene ácido graso poliinsaturado omega-9, que
comprende los pasos de:
cultivar en un medio un mutante, derivado
mediante mutación a partir de un microorganismo que tiene la
capacidad de producir ácido araquidónico y que pertenece a un
género seleccionado entre Mortierella, Conidiobolus,
Pythium, Phytophthora, Penicillium,
Cladosporium, Mucor, Fusarium,
Aspergillus, Rhodotorula, Entomophthora,
Echinosporangium y Saprolegnia, mutante en el cual,
relativo a la cepa salvaje correspondiente, la actividad de
desaturación \Delta12 ha disminuido o se ha perdido mediante una
primera mutación, pero al menos una entree la actividad de
desaturación \Delta5, la actividad de desaturación \Delta6 y la
actividad de elongación de la longitud de cadena ha aumentado
mediante una segunda mutación, y
recuperar el lípido que contiene ácido graso
poliinsaturado omega-9 del cultivo.
2. Un procedimiento conforme a la reivindicación
1, en el que el microorganismo que tiene la capacidad de producir
ácido araquidónico se selecciona entre Mortierella elongata,
Mortierella exigua, Mortierella hygrophila y
Mortierella alpina.
3. Un procedimiento conforme a la reivindicación
2, en el que la Mortierella elongata es Mortierella
elongata SAM 0219 (FERM BP-1239).
4. Un procedimiento conforme a la reivindicación
1 en el que el mutante utilizado es uno derivado de Mortierella
alpina SAM 1861 (FERM BP-3590) mediante
mutación para aumentar la actividad de desaturación \Delta5, la
actividad de desaturación \Delta6 o la actividad de elongación de
la longitud de cadena.
5. Un procedimiento conforme a la reivindicación
4, en el que el mutante es Mortierella alpina SAM 2086 (FERM
BP-6032).
6. Un procedimiento conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el microorganismo mutante se
cultiva a una temperatura entre 20ºC y 30ºC para su crecimiento, y
subsiguientemente a una temperatura inferior entre 5ºC y 20ºC para
la producción de ácido graso poliinsaturado
omega-9.
7. Un procedimiento conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 en el que dicho ácido graso poliinsaturado
omega-9 es al menos uno entre el ácido
6,9-octadecadienoico, el ácido
8,11-eicosadienoico y el ácido
5,8,11-eicosatrienoico.
8. Un procedimiento para producir ácido graso
poliinsaturado omega-9 que comprende el paso de
recuperar ácido graso poliinsaturado omega-9 a
partir de un cultivo o lípido producido conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7.
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