ES2214593T3 - Procedimiento para producir acido graso poliinsaturado omega-9 y lipido que lo contiene. - Google Patents

Procedimiento para producir acido graso poliinsaturado omega-9 y lipido que lo contiene.

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ES2214593T3 ES97306494T ES97306494T ES2214593T3 ES 2214593 T3 ES2214593 T3 ES 2214593T3 ES 97306494 T ES97306494 T ES 97306494T ES 97306494 T ES97306494 T ES 97306494T ES 2214593 T3 ES2214593 T3 ES 2214593T3
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO DE PRODUCCION DE UN LIPIDO QUE CONTIENE UN ACIDO ALTAMENTE INSATURADO OMEGA-9, CULTIVANDO EN UN MEDIO UNA CEPA MUTANTE, OBTENIDA POR MUTACION DE UN MICROORGANISMO CAPAZ DE PRODUCIR ACIDO ARAQUIDONICO, PERTENECIENTE AL GENERO MORTIERELLA Y OTROS, EN EL CUAL LA ACTIVIDAD DE DESATURACION DL}12 ESTA REDUCIDA O ANULADA, PERO AL MENOS UNA DE LAS ACTIVIDADES DE DESATURACION EN DL}5, DESATURACION EN DL}6 Y ACTIVIDAD DE ALARGAMIENTO DE CADENA SE ENCUENTRA INCREMENTADA. ADEMAS, LA PRESENTE INVENCION DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO DE PRODUCCION DE ACIDO GRASO ALTAMENTE INSATURADO OMEGA-9, MEDIANTE RECUPERACION DE DICHO ACIDO GRASO A PARTIR DEL CULTIVO O DEL LIPIDO DESCRITO ANTERIORMENTE.

Description

Procedimiento para producir ácido graso poliinsaturado \omega-9 y lípido que lo contiene.
Fundamentos
La presente invención se refiere a un procedimiento para producir ácido graso poliinsaturado omega-9 y lípido que contiene el mismo mediante fermentación utilizando un microorganismo mutante.
Los ácidos grasos poliinsaturados omega-9, tales como el ácido 5,8,11-eicosatrienoico (denominado ácido de Mead) y el ácido 8,11-eicosadienoico, se sabe que existen como uno de los ácidos grasos constituyentes de tejido animal que se ha vuelto deficiente en ácidos grasos esenciales. Sin embargo, ha sido sumamente difícil aislarlos y purificarlos puesto que están presentes en cantidades sumamente pequeñas. Puesto que es posible que estos ácidos grasos altamente insaturados se vuelvan precursores del grupo 3 de leucotrieno en el cuerpo, se han depositado esperanzas importantes en su actividad fisiológica. Recientemente se ha publicado su utilización para efectos antiinflamatorios, antialérgicos y antirreumáticos (JP-A-7/41421).
Existe por tanto un fuerte deseo de desarrollar un método para producir ácidos grasos altamente insaturados omega-9 en grandes cantidades. Un procedimiento para producir ácido graso altamente insaturado omega-9 y lípido que contiene el mismo se llevó a cabo previamente realizando la mutación de microorganismos que tienen la capacidad de producir ácido araquidónico y aislando aquellos microorganismos en los que había disminuido o se había perdido la actividad de desaturación \Delta12 (EP-A-535939 y JP-A-5/91888). Los microorganismos incluían Mortierella, especialmente Mortierella alpina. J.Gen.Microbiol. vol. 138 (1992) pp997-1002 S. Jareonkitmongkol et al., describe mutaciones de la cepa 1S-4 de M. alpina que conducen a mutantes deficientes en desaturasa \Delta12, también mutantes deficientes en desaturasa \Delta5 y \Delta6 que se cultivaron produciendo varios PUFAs (del inglés "poly-unsaturated fatty acids") en cantidades variables. Anteriormente, EP-A-252716 describía el cultivo de especies de Mortierella salvajes para producir DGLA y EPA. Sin embargo, aunque resulta revolucionario e importante que se desarrollara un procedimiento para producir ácido graso altamente insaturado omega-9 y lípido que contiene el mismo, puesto que tal procedimiento no había existido en el pasado, siempre se puede mejorar el rendimiento. Por consiguiente, ha habido un fuerte deseo de desarrollar un procedimiento para producir eficientemente una cantidad mayor de ácidos grasos altamente insaturados omega-9, en particular un procedimiento que haga posible producir ácido graso altamente insaturado omega-9 o lípido que contiene el mismo en gran cantidad por ejemplo utilizando medios económicos convencionales.
Como resultado de varias investigaciones, encontramos la disponibilidad y propusimos la utilización de cepas mutantes en las que la actividad de desaturación \Delta12 ha disminuido o se ha perdido, pero al menos una entre la actividad de desaturación \Delta5, la actividad de desaturación \Delta6 y la actividad de elongación de la longitud de cadena se ha elevado.
La presente invención proporciona un procedimiento para producir lípido que contiene ácido graso poliinsaturado omega-9, que comprende los pasos de:
cultivar en un medio un mutante, derivado mediante mutación a partir de un microorganismo que tiene la capacidad de producir ácido araquidónico y que pertenece a un género seleccionado entre Mortierella, Conidiobolus, Pythium, Phytophthora, Penicillium, Cladosporium, Mucor, Fusarium, Aspergillus, Rhodotorula, Entomophthora, Echinosporangium, y Saprolegnia, mutante en el cual, relativo a la cepa salvaje correspondiente, la actividad de desaturación \Delta12 ha disminuido o se ha perdido mediante una primera mutación, pero al menos una entre la actividad de desaturación \Delta5, la actividad de desaturación \Delta6 y la actividad de elongación de la longitud de cadena ha aumentado mediante una segunda mutación, y
recuperar el lípido que contiene ácido graso poliinsaturado omega-9 del cultivo.
Además, la presente invención proporciona un procedimiento para producir un ácido graso poliinsaturado omega-9 que comprende el paso de recuperar el ácido graso altamente insaturado omega-9 del cultivo o lípido obtenido conforme al procedimiento descrito arriba.
Descripción detallada
En la presente invención, los microorganismos utilizados para mutar (que se denominan como "cepa parental") son microorganismos que tienen la capacidad de producir ácido araquidónico y pertenecen al género Mortierella, Conidiobolus, Pythium, Phytophthora, Penicillium, Cladosporium, Mucor, Fusarium, Aspergillus, Rhodotorula, Entomophthora, Echinosporangium o Saprolegnia,
Estos microorganismos convierten el ácido esteárico en ácido oleico mediante la desaturasa \Delta9, el ácido oleico en ácido linoleico mediante la desaturasa \Delta12, el ácido linoleico en ácido \gamma-linoleico mediante la desaturasa \Delta6, el ácido \gamma-linoleico en ácido dihomo-\gamma-linoleico mediante la enzima de elongación de la longitud de cadena, y el ácido dihomo-\gamma-linoleico en ácido araquidónico mediante la desaturasa \Delta5. Además, estos microorganismos biosintetizan el ácido 6,9-octadecadienoico a partir del ácido oleico mediante la desaturasa \Delta6, el ácido 8,11-eicosadienoico a partir del ácido 6,9-octadecadienoico mediante la enzima de elongación de la longitud de cadena, y el ácido de Mead a partir del ácido 8,11-eicosadienoico mediante la desaturasa \Delta5 cuando la actividad de desaturación \Delta12 está inhibida.
Los microorganismos que pertenecen al subgénero Mortierella en el género Mortierella, que exhibe una productividad excelente de ácido araquidónico, se prefieren como la cepa parental utilizada en la presente invención, ejemplos de los cuales incluyen las cepas Mortierella elongata IFO 8570, Mortierella exigua IFO 8571, Mortierella hygrophila IFO 5941 y Mortierella alpina IFO 8568, ATCC 16266, ATCC 32221, ATCC 42430, CBS 219.35, CBS 224.37, CBS 250.53, CBS 343.66, CBS 527.72, CBS 529.72, CBS 608.70 y CBS 754.68.
Todas estas cepas están disponibles sin restricción del Instituto de Fermentación Osaka (IFO) situado en Osaka, Japón, la Colección de Cultivos Tipo Americana (ATCC) situada en EE.UU., o el "Centraalbureau voor Schimmelcultures" (CBS). Además, puede utilizarse también la cepa Mortierella elongata SAM0219 (FERM P-8703) (FERM BP-1239), que fue aislada del suelo por los inventores de la presente invención. Mortierella elongata SAM0219 se depositó como una deposición internacional bajo el Tratado de Budapest como FERM BP-1239 el 19 de marzo de 1986 en el Instituto de Biociencia y la Agencia de Tecnología Humana de Ciencia Industrial y Tecnología, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305, Japón.
Además, la cepa parental utilizada en la presente invención puede ser una cepa mutante o recombinante derivada de un microorganismo arriba mencionado (cepas salvajes) que tenga la capacidad de producir ácido araquidónico, esto es, cepas diseñadas intencionadamente de tal forma que el contenido de ácido graso altamente insaturado omega-9, el contenido total de lípido o ambos es mayor que la cantidad producida por la cepa salvaje original cuando se cultiva utilizando el mismo sustrato. Además, dicha cepa parental incluye también microorganismos diseñados para producir una cantidad de ácido graso altamente insaturado omega-9 igual a la de la cepa salvaje correspondiente utilizando eficientemente un sustrato que tenga una ventaja de coste excelente.
Para obtener un mutante que tenga disminuida o que haya perdido la actividad de desaturación \Delta12, pero al menos una entre la actividad de desaturación \Delta5, la actividad de desaturación \Delta6 y la actividad de elongación de la longitud de cadena elevada, se realiza la mutación en el microorganismo arriba mencionado que tiene la capacidad de producir ácido araquidónico para obtener primero un mutante que tenga disminuida o que haya perdido la actividad de desaturación \Delta12. Mediante mutación adicional de esta cepa mutante, puede obtenerse un mutante en el que ha disminuido o se ha perdido la actividad de desaturación \Delta12, pero al menos una entre la actividad de desaturación \Delta5, la actividad de desaturación \Delta6 y la actividad de elongación de la longitud de cadena se ha elevado. Un ejemplo de un mutante que puede utilizarse que tiene disminuida o que ha perdido la actividad de desaturación \Delta12 es Mortierella alpina SAM1861 (FERM BP-3590). Mortierella alpina SAM1861 se depositó como una deposición internacional bajo el Tratado de Budapest como FERM BP-3590 el 30 de septiembre de 1991 en el Instituto de Biociencia y la Agencia de Tecnología Humana de Ciencia Industrial y Tecnología, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305, Japón.
Utilizando un microorganismo que tenga disminuida o que haya perdido la actividad de desaturación \Delta12, y preferiblemente un microorganismo en el que la actividad de desaturación \Delta12 esté ausente, como progenitor para el mutante, puede evaluarse fácilmente la cuestión de si su actividad de desaturación \Delta5, su actividad de desaturación \Delta6 o su actividad de elongación de la longitud de cadena se ha elevado o no.
Más específicamente, puesto que los ácidos grasos insaturados omega-6 tales como ácido linoleico, ácido \gamma-linoleico, ácido dihomo-\gamma-linoleico y ácido araquidónico están intrínsicamente o ausentes o presentes sólo en cantidades muy pequeñas en células microbianas en el caso de un microorganismo en el que la actividad de desaturación \Delta12 ha disminuido o se ha perdido, el ácido \gamma-linoleico se forma mediante la desaturasa \Delta6 si las células en reposo obtenidas después de cultivar se hacen reaccionar con ácido linoleico, el ácido araquidónico se forma mediante la desaturasa \Delta5 si se hace reaccionar con ácido dihomo-\gamma-linoleico, o el ácido dihomo-\gamma-linoleico se forma mediante la enzima de elongación de la longitud de cadena si se hace reaccionar con ácido \gamma-linoleico. Puesto que la actividad de cada enzima puede ensayarse fácilmente, la actividad de desaturación \Delta5, la actividad de desaturación \Delta6 y la actividad de elongación de la longitud de cadena de los microorganismos obtenidos mediante mutación puede evaluarse comparándolos con la cepa parental.
Aunque un ejemplo específico de una cepa mutante de la presente invención que puede utilizarse es Mortierella alpina SAM2086 (FERM P-15766) (que se depositó como una deposición internacional bajo el Tratado de Budapest como FERM BP-6032 el 5 de agosto de 1996 en dicho Instituto), un microorganismo sin actividad de desaturación \Delta12 y que tiene elevada la actividad de desaturación \Delta6 que fue inducido por los inventores de la presente invención a partir de Mortierella alpina SAM1861, tales mutantes no están limitados a esta cepa, sino que pueden utilizarse cualesquier mutantes siempre que cuando la actividad de desaturación \Delta5, la actividad de desaturación \Delta6 o la actividad de elongación de la longitud de cadena de la cepa parental en la que la actividad de desaturación \Delta12 ha disminuido o se ha perdido se exprese como "1", al menos una de estas actividades muestre un nivel de actividad que exceda de 1.
Los mutantes eficaces pueden identificarse mediante procedimientos de mutación, seguidos de ensayos seleccionados apropiadamente, ambos como se expone en la presente.
Ejemplos de ácidos grasos poliinsaturados omega-9 obtenidos mediante la presente invención incluyen ácido 6,9-octadecadienoico, ácido 8,11-eicosadienoico y ácido 5,8,11-eicosatrienoico.
En la presente invención, el ácido de Mead puede producirse en gran cantidad utilizando, en particular, un mutante en el que la actividad de desaturación \Delta12 esté ausente, y tanto la actividad de desaturación \Delta5 como la actividad de desaturación \Delta6 se hayan elevado.
Para inducir la mutación pueden realizarse procedimientos típicos de mutación, tales como irradiar con radiación (rayos-X, rayos- \gamma o haz de neutrones), rayos ultravioleta o tratamiento con calor, o resuspendiendo los microorganismos en un tampón adecuado, añadiendo un mutágeno e incubando durante una cantidad de tiempo predeterminada seguido de la dilución adecuada y crecimiento en medio con agar para obtener colonias de la cepa mutante. Ejemplos de mutágenos incluyen agentes de alquilación tales como mostaza nitrogenada, metil-metano-sulfonato (MMS) y N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), análogos de bases tales como 5-bromouracilo, antibióticos tales como mitomicina C, inhibidores de síntesis de bases tales como 6-mercaptopurina, pigmentos tales como proflavina (y otros derivados), ciertos tipos de carcinógenos tales como N-óxido de 4-nitroquinolina, y otros compuestos tales como cloruro de manganeso y formaldehído. Además, la cepa parental puede estar en forma de células en crecimiento (micelio) o esporas.
Para cultivar un mutante en el procedimiento de producción de la presente invención, las esporas, el micelio o el líquido precultivado obtenido cultivando por adelantado se inoculan en un medio líquido o sólido. En caso de utilizar un medio líquido, aunque pueden utilizarse cualesquier sustancias típicamente utilizadas para la fuente de carbono, ejemplos de las cuales incluyen glucosa, fructosa, xilosa, sacarosa, maltosa, almidón soluble, melaza, glicerol, manitol y ácido cítrico, se prefieren particularmente glucosa, maltosa, melaza y glicerol.
Además, pueden utilizarse para la fuente de nitrógeno fuentes de nitrógeno orgánico tales como extracto de levadura, extracto de germen de trigo, extracto de carne, casaminoácidos, licor de maíz empapado y urea, o fuentes de nitrógeno inorgánico tales como nitrato de sodio, nitrato de amonio y sulfato de amonio. Además, pueden utilizarse también fosfatos tales como fosfato de potasio y fosfato de dihidrógeno y potasio, sales inorgánicas tales como sulfato de amonio, sulfato de sodio, sulfato de magnesio, sulfato de hierro, sulfato de cobre, cloruro de magnesio y cloruro de calcio, así como vitaminas según se necesite como nutrientes traza.
No existen limitaciones particulares para las concentraciones de estos componentes del medio siempre que no inhiban el crecimiento de los microorganismos. En términos prácticos, la fuente de carbono debería utilizarse típicamente entre el 0,1 y el 30% en peso, y preferiblemente entre el 1 y el 15% en peso, y la fuente de nitrógeno entre el 0,01 y el 10% en peso, y preferiblemente entre el 0,1 y el 5% en peso.
La temperatura del cultivo es preferiblemente de 5 a 40ºC, más preferiblemente de 20 a 30ºC. Después de que los microorganismos han crecido mediante cultivo entre 20 y 30ºC, los ácidos grasos poliinsaturados omega-9 pueden producirse también mediante cultivo subsiguiente entre 5 y 20ºC. Mediante tal control de la temperatura puede aumentarse la cantidad de ácidos grasos poliinsaturados omega-9 formados en los ácidos grasos resultantes. El valor del pH del medio debería estar entre 4 y 10, y preferiblemente entre 5 y 8, y el cultivo se realiza mediante cultivo en agitación aireado, cultivo en agitación o cultivo estacionario. El cultivo se realiza normalmente entre 2 y 20 días, preferiblemente entre 5 y 20 días y más preferiblemente entre 5 y 15 días.
En caso de utilizar un medio sólido, el cultivo se realiza entre 3 y 14 días a una temperatura entre 5 y 40ºC, y preferiblemente entre 20 y 30ºC, utilizando salvado de trigo, granzas de arroz o salvado de arroz que contiene entre un 50 y un 100% en peso de agua relativo al peso de las sustancias sólidas. En este caso, las fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas y nutrientes traza pueden añadirse según sea necesario. Además, en la presente invención, la acumulación de ácidos grasos poliinsaturados omega-9 puede fomentarse añadiendo un precursor de ácidos grasos poliinsaturados omega-9 al medio durante el cultivo.
Ejemplos de precursores incluyen hidrocarburos, por ejemplo, n-alcanos tales como tetradecano, hexadecano y octadecano, ácidos grasos, sus sales (por ejemplo, sales de sodio o sales de potasio) o sus ésteres tales como ácido tetradecanoico, ácido hexadecanoico y ácido octadecanoico, o aceites que contienen ácidos grasos como sus ingredientes constituyentes (por ejemplo, aceite de oliva, aceite de coco y aceite de palma). Este precursor no está limitado a estos ejemplos, sin embargo. La cantidad totaldel sustrato añadido es entre el 0,001 y el 10% en peso, y preferiblemente entre el 0,5 y el 10% en peso relativo a la cantidad de medio. Además, el cultivo puede realizarse también utilizando tal precursor como única fuente de carbono.
Estas fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas, vitaminas o sustratos pueden añadirse antes o inmediatamente después de la inoculación con un microorganismo productor, o pueden añadirse después de que se haya iniciado el cultivo. Alternativamente, pueden añadirse en alguno de esos momentos o en ambos. La adición inmediatamente después del inicio del cultivo puede realizarse toda de una vez o intermitentemente dividiéndose en varias adiciones. Alternativamente, la adición puede realizarse de forma continua.
Cultivando de esta manera, se formarán lípidos que contienen una gran cantidad de ácidos grasos poliinsaturados omega-9 y se acumularán intracelularmente. En el caso del cultivo líquido, el lípido que contiene los ácidos grasos poliinsaturados omega-9 se recupera a partir del medio de cultivo o medio de cultivo esterilizado de un paso intermedio en la producción de aceite por los microorganismos cultivados, a partir del medio de cultivo o medio de cultivo esterilizado una vez completado el cultivo, o a partir de las células cultivadas o su producto seco recogido de cualquiera de los medios de cultivo anteriores. Por ejemplo, el lípido que contiene los ácidos grasos poliinsaturados omega-9 puede recuperarse a partir de las células cultivadas y el lípido que contiene los ácidos grasos poliinsaturados omega-9 puede aislarse de la manera descrita a continuación.
Una vez completado el cultivo, las células cultivadas se obtienen a partir del medio de cultivo mediante centrifugación y/o cualquier técnica de separación sólido-líquido convencional tal como filtración. Las células preferiblemente se lavan, se trituran y se secan. El secado puede realizarse mediante liofilización o secado al aire. Las células secas se someten a extracción preferiblemente con disolventes orgánicos en presencia de gas nitrógeno fluyente. Ejemplos de disolventes orgánicos que pueden utilizarse incluyen éter etílico, hexano, metanol, etanol, cloroformo, diclorometano y éter de petróleo, aunque alternar la extracción con metanol y éter de petróleo, y la extracción utilizando un disolvente de fase única de cloroformo, metanol y agua da buenos resultados. El disolvente orgánico se elimina a continuación por destilación del extracto a presión reducida para obtener el lípido que contiene una alta concentración de ácidos grasos poliinsaturados omega-9.
Además, la extracción puede realizarse también utilizando células húmedas en lugar del método descrito arriba. En este caso, puede utilizarse un disolvente tal como metanol o etanol que sea miscible con agua, o mezclas de disolventes que comprendan estos disolventes, agua y/u otros disolventes que sean miscibles con agua. Las otras partes del procedimiento son las mismas que las descritas arriba.
Los ácidos grasos poliinsaturados omega-9 están presentes en el lípido obtenido de la manera arriba mencionada como un triglicérido, o como un compuesto unido a fosfatidil-colina, fosfatidil-etanolamina o fosfatidil-inositol. La purificación del triglicérido que contiene los ácidos grasos poliinsaturados omega-9 del lípido que contiene los ácidos grasos poliinsaturados omega-9 recuperado del cultivo puede realizarse conforme a métodos rutinarios tales como extracción con hexano seguida de la retirada del ácido libre, decoloración, desodorización, tratamiento de desengomado o separación mediante enfriamiento.
Además, los ácidos grasos poliinsaturados omega-9 están contenidos en el lípido obtenido de la manera descrita arriba en forma de un compuesto lipídico, tal como el componente constituyente de una grasa. Aunque éstos pueden separarse directamente, es preferible separarlos en forma de un éster o un alcohol inferior, ejemplos de los cuales incluyen 8,11-eicosadienoato de metilo, 6,9-octadecadienoato de metilo y el éster metílico del ácido de Mead. Convirtiéndolos en ésteres de esta manera estos componentes pueden separarse fácilmente de otros componentes lipídicos. Además, pueden separarse también fácilmente de otros ácidos grasos formados durante el cultivo, tales como ácido palmítico y ácido oleico (estos se esterifican también durante la esterificación de los ácidos grasos poliinsaturados omega-9). Por ejemplo, para obtener el éster metílico de los ácidos grasos poliinsaturados omega-9, es preferible tratar el lípido extraído mencionado arriba entre 1 y 24 horas a temperatura ambiente con ácido clorhídrico metanólico a una concentración del 5 al 10% o BF3-metanol a una concentración del 10 al 50%.
Para recuperar los ácidos grasos poliinsaturados omega-9 a partir de la solución de tratamiento arriba mencionada, es preferible extraer con un disolvente orgánico tal como hexano, éter etílico o acetato de etilo. A continuación, secando este extracto sobre sulfato de sodio anhidro, etcétera, y eliminando por destilación el disolvente orgánico preferiblemente a presión reducida, se obtiene una mezcla que consta principalmente de ésteres de ácidos grasos. Esta mezcla contiene palmitato de metilo, estearato de metilo, oleato de metilo y otros ésteres metílicos de ácidos grasos además de los ésteres metílicos de los ácidos grasos poliinsaturados omega-9 diana. Para aislar los ésteres metílicos de los ácidos grasos poliinsaturados omega-9 de la mezcla de ésteres metílicos de ácidos grasos, puede utilizarse cromatografía en columna, cristalización a baja temperatura, inclusión de urea o cromatografía de distribución a contracorriente líquido-líquido, etcétera, solo o en combinación.
Para obtener los ácidos grasos poliinsaturados omega-9 a partir de los distintos tipos de ésteres metílicos de los ácidos grasos poliinsaturados omega-9 aislados de la manera descrita arriba, después de la hidrólisis en presencia de álcali, la mezcla debería someterse a extracción con un disolvente orgánico tal como éter etílico o acetato de etilo.
Además, para recuperar los ácidos grasos poliinsaturados omega-9 sin pasar por sus ésteres metílicos, después de la hidrólisis del lípido extraído arriba mencionado con álcali (mediante, por ejemplo, tratamiento entre 2 y 3 horas a temperatura ambiente con solución de hidróxido sódico al 5%), los ácidos grasos poliinsaturados omega-9 pueden someterse a extracción y purificarse a partir del hidrolizado mediante métodos normalmente utilizados para la extracción y purificación de ácidos grasos.
Ejemplos
Los siguientes Ejemplos proporcionan una explicación detallada de la presente invención.
Ejemplo 1
Mortierella alpina SAM1861, un mutante sin actividad de desaturación \Delta12, se inoculó en medio Czapek con agar (NaNO_{3} al 0,2%, K_{2}HPO_{4} al 0,1%, MgSO_{4} al 0,05%, KCl al 0,05%, FeSO_{4} al 0,001%, sacarosa al 3%, agar al 2%, pH 6,0) para formar esporas para preparar una solución de esporas (tampón Tris/malato 50 mM (pH 7,5), 1 x 10^{6} esporas/ml).
Se añadieron 0,5 ml de tampón Tris/malato 100 mM (pH 7,5) a 1,0 ml de la solución de esporas resultante seguido de la adición de 500 \mul de solución de NTG (5 mg de N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina/1 ml de agua desionizada) e incubación durante 15 minutos a 28ºC para realizar el tratamiento de mutación.
La suspensión de esporas tratada con NTG se diluyó hasta aproximadamente entre 10^{-3} y 10^{-4} y se aplicó a una placa de agar GY (glucosa al 1%, extracto de levadura al 0,5%, Triton X-100 al 0,005%, agar al 1,5%, pH 6,0). Aquellas colonias que aparecieron durante el cultivo a 28ºC se escogieron al azar y se transfirieron a una placa nueva.
Las colonias de almacenamiento escogidas se cultivaron durante 2 días a 28ºC y 2 días a 12ºC en una placa de agar GY y a continuación se cortaron cuando todavía estaban unidas al agar y se secaron a 100ºC.
Las células secas resultantes se colocaron en un tubo de ensayo con tapón de rosca (16,5 mm de diámetro) seguido de su esterificación metílica mediante tratamiento durante 3 horas a 50ºC añadiendo 1 ml de cloruro de metileno y 2 ml de HCl metanólico al 10%. Después de añadir 4 ml de n-hexano y 1 ml de agua, extraer dos veces, y eliminar el disolvente por destilación del extracto utilizando un evaporador por centrifugación (40ºC, 1 hora), los ésteres metílicos de ácidos grasos resultantes se analizaron por cromatografía de gases capilar. Como resultado del escrutinio, se obtuvo la cepa Mortierella alpina SAM2086 (FERM P-15766) que tiene mayor productividad de ácido de Mead que la cepa parental, Mortierella alpina SAM1861. Mortierella alpina SAM2086 se depositó como FERM P-15766 el 5 de agosto de 1996 en el Instituto de Biociencia y la Agencia de Tecnología Humana de Ciencia Industrial y Tecnología, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305, Japón. Además, se obtuvo la cepa Mortierella alpina SAM2104 realizando un tratamiento de mutación similar al descrito arriba utilizando SAM2086 como cepa parental.
Ejemplo 2
Se colocaron 5 l de medio (pH 6,0) que contenía glucosa al 4% y extracto de levadura al 1% en un fermentador de cuba de 10 l y se esterilizó durante 30 minutos a 120ºC. El medio se inoculó a continuación con 100 ml de un precultivo del mutante SAM1861 o SAM2086 de Mortierella alpina seguido del cultivo aireado con agitación durante 8 días con aireación a 1 volumen/volumen/min y agitación a 300 rpm. La temperatura del material de cultivo al inicio del cultivo fue de 28ºC y a continuación se bajó a 20ºC en el segundo día de cultivo. Se añadió glucosa al 1% diariamente del primer al cuarto día de cultivo. Una vez completado el cultivo, las células se recuperaron mediante filtración y después del lavado adecuado, las células húmedas resultantes se liofilizaron para obtener 99,7 g y 92,5 g de células secas de cada cepa, respectivamente.
Cuando se extrajo el lípido de estas células secas conforme al método de extracción de Bligh & Dyer utilizando un disolvente de fase única de cloroformo, metanol y agua, los lípidos se obtuvieron en cantidades de 48,92 g y 44,17 g, respectivamente. Para confirmar la composición de ácidos grasos de estos lípidos, se colocaron 10 mg de lípido en tubos de ensayo con tapón de rosca y se sometieron a esterificación metílica mediante tratamiento durante 3 horas a 50ºC añadiendo 1 ml de cloruro de metileno y 2 ml de HCl metanólico al 10%. Después de añadir 4 ml de n-hexano y 1 ml de agua, extraer 2 veces, y eliminar el disolvente por destilación del extracto utilizando un evaporador por centrifugación (40ºC, 1 hora), los ésteres metílicos de ácidos grasos resultantes se analizaron por cromatografía de gases. Los resultados se muestran en la Tabla 1.
SAM2086, inducida por mutación a partir de SAM1861, demostró claramente poseer tanto una productividad como una relación de contenido excelentes de ácido de Mead.
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TABLA 1
1
2
^{+}:
LA: ácido linoleico, 18:2 (\omega9): ácido 6,9-octadecadienoico, GLA: ácido \gamma-linoleico, 20:2 (\omega9): ácido 8,11-eicosadienoico, 20:3 (\omega9): ácido de Mead, DGLA: ácido dihomo-\gamma-linoleico, Ara: ácido araquidónico, EPA: ácido eicosapentenoico
\text{*}:
Peso de células secas por litro de medio
\text{**}:
Peso de ácidos grasos insaturados omega-9 por litro de medio
Ejemplo 3
Se añadieron 1 ml de tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4), 30 mg de células húmedas obtenidas en el Ejemplo 2 del mutante SAM1861 o SAM2086 de Mortierella alpina y 100 \mul de solución de sustrato resuspendido en BSA (preparada mezclando 20 mg de ácido linoleico, ácido \gamma-linoleico o ácido dihomo-\gamma-linoleico en 2 ml de albúmina de suero bovino al 5% (BSA libre de ácidos grasos, Sigma) y resuspendiendo mediante sonicación durante aproximadamente 20 minutos) a tubos de ensayo con tapón de rosca (16,5 mm de diámetro), después de lo cual los tubos de ensayo se taparon con un tapón de silicona y se agitaron a 28ºC y 120 rpm. La reacción se paró después de 0, 2, 6 ó 20 horas añadiendo 4 ml de etanol.
Después de secar con un evaporador por centrifugación (40ºC, 1 hora), se realizó la esterificación metílica de la misma manera que en el Ejemplo 2, y los ésteres metílicos de ácidos grasos resultantes (sustratos y productos de reacción) se analizaron mediante cromatografía de gases capilar. En este análisis, se utilizó la misma cantidad de solución de BSA al 5% como control. De este modo, si se utiliza ácido dihomo-\gamma-linoleico como sustrato, la actividad de desaturación \Delta5 se determina a partir de la cantidad de producto de reacción, esto es, ácido araquidónico; si se utiliza ácido \gamma-linoleico como sustrato, la actividad de elongación de la longitud de cadena se determina a partir de la cantidad de producto de reacción, esto es, ácido dihomo-\gamma-linoleico, y la actividad de desaturación \Delta5 se determina a partir de la cantidad de ácido araquidónico; y si se utiliza ácido linoleico como sustrato, la actividad de desaturación \Delta6 se determina a partir de la cantidad de producto de reacción, esto es, ácido \gamma-linoleico, la actividad de elongación de la longitud de cadena se determina a partir de la cantidad de ácido dihomo-\gamma-linoleico, y la actividad de desaturación \Delta5 se determina a partir de la cantidad de ácido araquidónico. Estos resultados se muestran en la Tabla 2.
En caso de considerar la actividad de SAM1861 como 1 para la actividad de desaturación \Delta5 utilizando ácido dihomo-\gamma-linoleico como sustrato, la actividad de SAM2086 fue 1,74. En caso de considerar la actividad de SAM1861 como 1 para la actividad de desaturación \Delta6 utilizando ácido linoleico como sustrato, la actividad de SAM2086 fue 1,42. Los aumentos en la productividad y relación de ácido de Mead de SAM2086 inducida por mutación a partir de SAM1861 del Ejemplo 2 fueron claramente el resultado del aumento en la actividad de desaturación \Delta5 y actividad de desaturación \Delta6.
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TABLA 2
Velocidades de reacción de SAM1861 y SAM2086 (nmol/30 mg de células húmedas/hora)
3
LA:
ácido linoleico, GLA: ácido \gamma-linoleico, DGLA: ácido dihomo-\gamma-linoleico,
Ara:
ácido araquidónico
DS
\Delta5: actividad de desaturación \Delta5
DS
\Delta6: actividad de desaturación \Delta6
EL:
actividad de elongación de la longitud de cadena
Ejemplo 4
Se colocaron 2 ml de medio (pH 6,0) que contenía glucosa al 2%, extracto de levadura al 1% y 0,5% de cada precursor de los ácidos grasos altamente insaturados omega-9 indicados en la Tabla 3, o aceites que contenían los mismos, en matraces Erlenmeyer de 10 ml y se esterilizaron durante 20 minutos a 120ºC. Los matraces se inocularon cada uno con células del mutante SAM2086 de Mortierella alpina seguido del cultivo durante 8 días a 28ºC utilizando un agitador alternativo (110 rpm). Los resultados se muestran en la Tabla 3.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 3
4
18:2;
ácido 6,9-octadecadienoico
20:2;
ácido 8,11-eicosadienoico
20:3;
ácido 5,8,11-eicosatrienoico (ácido de Mead)
Ejemplo 5
Se colocaron 5 l de medio (pH 6,0) que contenía glucosa al 2%, extracto de levadura al 1%, aceite de oliva al 0,1% y Adecanol (agente desespumante; Marca Comercial) al 0,01% en un fermentador de cuba de 10 l seguido de su esterilización durante 30 minutos a 120ºC. Se inocularon 100 ml de un precultivo de Mortierella alpina SAM2104. El cultivo se llevó a cabo durante 8 días con aireación a 1 volumen/volumen/min y agitación a 300 rpm.
La temperatura del material de cultivo fue de 28ºC al inicio del cultivo y a continuación se bajó a 20ºC comenzando en el segundo día de cultivo. Se añadió glucosa al 1,5% en el segundo y tercer días de cultivo. Una vez finalizado el cultivo, se obtuvieron 15,80 g de células secas por litro de medio siguiendo el mismo procedimiento que el del Ejemplo 2. El lípido se extrajo de la misma manera que en el Ejemplo 2, dichos lípidos se sometieron a esterificación metílica, los ésteres metílicos de ácidos grasos resultantes se analizaron mediante cromatografía de gases. Las cantidades producidas y porcentajes de ácido de Mead, ácido 8,11-eicosadienoico y ácido 6,9-octadecadienoico relativas a la cantidad total de ácidos grasos fueron 1,76 g/l y 23,76% para el ácido de Mead, 0,35 g/l y 4,75% para el ácido 8,11-eicosadienoico, y 0,84 g/l y 11,35% para el ácido 6,9-octadecadienoico, respectivamente.

Claims (8)

1. Un procedimiento para producir lípido que contiene ácido graso poliinsaturado omega-9, que comprende los pasos de:
cultivar en un medio un mutante, derivado mediante mutación a partir de un microorganismo que tiene la capacidad de producir ácido araquidónico y que pertenece a un género seleccionado entre Mortierella, Conidiobolus, Pythium, Phytophthora, Penicillium, Cladosporium, Mucor, Fusarium, Aspergillus, Rhodotorula, Entomophthora, Echinosporangium y Saprolegnia, mutante en el cual, relativo a la cepa salvaje correspondiente, la actividad de desaturación \Delta12 ha disminuido o se ha perdido mediante una primera mutación, pero al menos una entree la actividad de desaturación \Delta5, la actividad de desaturación \Delta6 y la actividad de elongación de la longitud de cadena ha aumentado mediante una segunda mutación, y
recuperar el lípido que contiene ácido graso poliinsaturado omega-9 del cultivo.
2. Un procedimiento conforme a la reivindicación 1, en el que el microorganismo que tiene la capacidad de producir ácido araquidónico se selecciona entre Mortierella elongata, Mortierella exigua, Mortierella hygrophila y Mortierella alpina.
3. Un procedimiento conforme a la reivindicación 2, en el que la Mortierella elongata es Mortierella elongata SAM 0219 (FERM BP-1239).
4. Un procedimiento conforme a la reivindicación 1 en el que el mutante utilizado es uno derivado de Mortierella alpina SAM 1861 (FERM BP-3590) mediante mutación para aumentar la actividad de desaturación \Delta5, la actividad de desaturación \Delta6 o la actividad de elongación de la longitud de cadena.
5. Un procedimiento conforme a la reivindicación 4, en el que el mutante es Mortierella alpina SAM 2086 (FERM BP-6032).
6. Un procedimiento conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el microorganismo mutante se cultiva a una temperatura entre 20ºC y 30ºC para su crecimiento, y subsiguientemente a una temperatura inferior entre 5ºC y 20ºC para la producción de ácido graso poliinsaturado omega-9.
7. Un procedimiento conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el que dicho ácido graso poliinsaturado omega-9 es al menos uno entre el ácido 6,9-octadecadienoico, el ácido 8,11-eicosadienoico y el ácido 5,8,11-eicosatrienoico.
8. Un procedimiento para producir ácido graso poliinsaturado omega-9 que comprende el paso de recuperar ácido graso poliinsaturado omega-9 a partir de un cultivo o lípido producido conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
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