JPH10108587A - ひとインシュリン遺伝子を含むトランスジェニック・マウス - Google Patents
ひとインシュリン遺伝子を含むトランスジェニック・マウスInfo
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- JPH10108587A JPH10108587A JP9181034A JP18103497A JPH10108587A JP H10108587 A JPH10108587 A JP H10108587A JP 9181034 A JP9181034 A JP 9181034A JP 18103497 A JP18103497 A JP 18103497A JP H10108587 A JPH10108587 A JP H10108587A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ひと蛋白質の発現またはレベルに対する薬剤
の効果を評価する方法を提供すること。 【解決手段】 ひと蛋白質をコードするトランスジーン
を含んだ細胞を有する非ひとトランスジェニック哺乳動
物を提供し、これに評価すべき薬剤を投与し、当該蛋白
質の発現またはレベルをモニターする。
の効果を評価する方法を提供すること。 【解決手段】 ひと蛋白質をコードするトランスジーン
を含んだ細胞を有する非ひとトランスジェニック哺乳動
物を提供し、これに評価すべき薬剤を投与し、当該蛋白
質の発現またはレベルをモニターする。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、ひとインシュリ
ンホルモンを発現し得る組換え体トランスジェニック・
マウスの作成方法に関するものである。さらにこの発明
は、ひとインシュリンホルモンを発現するマウスに関す
るものである。さらにこの発明は、可能性のある治療剤
をトランスジェニック・マウスに導入し、ひとインシュ
リン産生の発現をモニターすることを含む、トランスジ
ェニック・ひとインシュリン産生マウスにおいて可能性
のある治療剤を評価する手段に関するものである。さら
にこの発明は、トランスジェニック動物においてひと蛋
白質に対する治療剤の効果を評価する方法に関するもの
である。
ンホルモンを発現し得る組換え体トランスジェニック・
マウスの作成方法に関するものである。さらにこの発明
は、ひとインシュリンホルモンを発現するマウスに関す
るものである。さらにこの発明は、可能性のある治療剤
をトランスジェニック・マウスに導入し、ひとインシュ
リン産生の発現をモニターすることを含む、トランスジ
ェニック・ひとインシュリン産生マウスにおいて可能性
のある治療剤を評価する手段に関するものである。さら
にこの発明は、トランスジェニック動物においてひと蛋
白質に対する治療剤の効果を評価する方法に関するもの
である。
【０００２】
【従来の技術】ほ乳類の胚のゲノムに特定遺伝子が組入
れられ得るということから、遺伝子制御および形質発現
の有用なインビボ分析システムが登場した。培養された
ほ乳類細胞の高い効率での形質転換は細胞核への特定Ｄ
ＮＡ配列の直接マイクロインジェクションにより達成さ
れた[カペッチ、「セル」、２２、４７９−４８８頁(１９
８０年)]。ゴードン等[「プロシーディングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・
オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」
７７、７３８０−７３８４頁(１９７８年)]は、ＤＮＡ
がマウス胚にマイクロインジェクションされ得、生じた
子孫において見出され得ることを立証した。すなわち、
現時点である種のトランスジェニック・マウスを製造す
ることができるということについては詳しい記載がなさ
れ、当業界においてよく知られている。
れられ得るということから、遺伝子制御および形質発現
の有用なインビボ分析システムが登場した。培養された
ほ乳類細胞の高い効率での形質転換は細胞核への特定Ｄ
ＮＡ配列の直接マイクロインジェクションにより達成さ
れた[カペッチ、「セル」、２２、４７９−４８８頁(１９
８０年)]。ゴードン等[「プロシーディングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・
オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」
７７、７３８０−７３８４頁(１９７８年)]は、ＤＮＡ
がマウス胚にマイクロインジェクションされ得、生じた
子孫において見出され得ることを立証した。すなわち、
現時点である種のトランスジェニック・マウスを製造す
ることができるということについては詳しい記載がなさ
れ、当業界においてよく知られている。
【０００３】トランスジェニック・マウスの作成に用い
られる基本的方法は、交尾したばかりの雌マウスの卵管
からの受精卵の回収を必要とする。マウスへ移植される
べき望ましい遺伝子を含むＤＮＡを各受精卵の雄性前核
にマイクロインジェクションする。次いでマイクロイン
ジェクションされた卵を、１日擬妊娠マウスの腹を借り
てその卵管に移植し、分娩させる[ワグナー等、「プロシ
ーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステー
ツ・オブ・アメリカ」、７８、６３７６−６３８０頁(１
９８１年)]。次に、マイクロインジェクションされたＤ
ＮＡの存在の検出に適した当業界における公知手段によ
り、新生マウスをマイクロインジェクションされたＤＮ
Ａの存在に関して試験する。
られる基本的方法は、交尾したばかりの雌マウスの卵管
からの受精卵の回収を必要とする。マウスへ移植される
べき望ましい遺伝子を含むＤＮＡを各受精卵の雄性前核
にマイクロインジェクションする。次いでマイクロイン
ジェクションされた卵を、１日擬妊娠マウスの腹を借り
てその卵管に移植し、分娩させる[ワグナー等、「プロシ
ーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステー
ツ・オブ・アメリカ」、７８、６３７６−６３８０頁(１
９８１年)]。次に、マイクロインジェクションされたＤ
ＮＡの存在の検出に適した当業界における公知手段によ
り、新生マウスをマイクロインジェクションされたＤＮ
Ａの存在に関して試験する。
【０００４】本質的にこの方法を用いることにより、ワ
グナー等は、うさぎＢ−グロブリンを発現し得る成熟マ
ウスの作成に成功した。このマウスは、さらにまたうさ
ぎＢ−グロブリン遺伝子を発現する子孫を生じさせるこ
とができた。さらにクローンされた免疫グロブリン遺伝
子をマウス生殖系列に導入することにより、クローンさ
れた免疫グロブリンを産生するトランスジェニック・マ
ウスを製造した。[グロスチェドル等、「セル」、３８、
６４７−６５８頁(１９８４年)、ブリンスター等、「ネ
イチャー」、３０６、３３２−３３６頁(１９８３年)]。
パーミター等[「ネイチャー」、３００、６１１−６１５
頁(１９８２年)]は、ラット成長ホルモンを作る構造遺
伝子と融合されたマウス・メタロチオネインIプロモー
ターをもつトランスジェニック・マウスを作成した。こ
れらのマウスは、高レベルのラット成長ホルモンを生産
し、劇的に向上した成長を呈することが見出された。ブ
リンスター等[「セル」、３７、３６７−３７９頁(１９８
４年)]は、本質的に上記方法を用いて、ＳＶ４０初期領
域遺伝子およびメタロチオネイン融合遺伝子をマウス受
精卵に注入した。これらの卵から成長したトランスジェ
ニック・マウスでは、高いパーセンテージで脈絡膜叢内
に腫ようが発生した。この病変組織では、ＳＶ４０ Ｔ
−抗原−mＲＮＡおよび蛋白質が容易に検出された。し
かしながら、ＳＶ４０ Ｔ−抗原遺伝子発現は、非病変
組織または明白な疾病に至る前のり患性組織においては
殆ど検出され得なかった。このことは、腫よう発生がＳ
Ｖ４０遺伝子の活性化に左右されることを示す。この実
験は、腫ようウイルスをコードする遺伝子をマウス胚へ
マイクロインジェクションすることにより、発癌素因を
有するマウスを製造することが可能であることを示し
た。スイフト等[「セル」、３８、６３９−６４６頁(１９
８４年)]は、マウスすい臓において高レベルでラットす
い臓エラスターゼIを作る遺伝子を選択的に発現するト
ランスジェニック・マウスを作成した。
グナー等は、うさぎＢ−グロブリンを発現し得る成熟マ
ウスの作成に成功した。このマウスは、さらにまたうさ
ぎＢ−グロブリン遺伝子を発現する子孫を生じさせるこ
とができた。さらにクローンされた免疫グロブリン遺伝
子をマウス生殖系列に導入することにより、クローンさ
れた免疫グロブリンを産生するトランスジェニック・マ
ウスを製造した。[グロスチェドル等、「セル」、３８、
６４７−６５８頁(１９８４年)、ブリンスター等、「ネ
イチャー」、３０６、３３２−３３６頁(１９８３年)]。
パーミター等[「ネイチャー」、３００、６１１−６１５
頁(１９８２年)]は、ラット成長ホルモンを作る構造遺
伝子と融合されたマウス・メタロチオネインIプロモー
ターをもつトランスジェニック・マウスを作成した。こ
れらのマウスは、高レベルのラット成長ホルモンを生産
し、劇的に向上した成長を呈することが見出された。ブ
リンスター等[「セル」、３７、３６７−３７９頁(１９８
４年)]は、本質的に上記方法を用いて、ＳＶ４０初期領
域遺伝子およびメタロチオネイン融合遺伝子をマウス受
精卵に注入した。これらの卵から成長したトランスジェ
ニック・マウスでは、高いパーセンテージで脈絡膜叢内
に腫ようが発生した。この病変組織では、ＳＶ４０ Ｔ
−抗原−mＲＮＡおよび蛋白質が容易に検出された。し
かしながら、ＳＶ４０ Ｔ−抗原遺伝子発現は、非病変
組織または明白な疾病に至る前のり患性組織においては
殆ど検出され得なかった。このことは、腫よう発生がＳ
Ｖ４０遺伝子の活性化に左右されることを示す。この実
験は、腫ようウイルスをコードする遺伝子をマウス胚へ
マイクロインジェクションすることにより、発癌素因を
有するマウスを製造することが可能であることを示し
た。スイフト等[「セル」、３８、６３９−６４６頁(１９
８４年)]は、マウスすい臓において高レベルでラットす
い臓エラスターゼIを作る遺伝子を選択的に発現するト
ランスジェニック・マウスを作成した。
【０００５】クローンされた遺伝子は、マウス接合体の
前核へのマイクロインジェクションによりマウス生殖系
列に移植され得る。それらのマイクロインジェクション
された遺伝子は染色体に組み込まれることが多く、成長
期間を通して保持され、メンデルの法則に従い子孫に伝
えられる。(グロスチェドル等、ワグナー等)。研究者ら
は、この方法を用いれば１０〜３０％の効率でトランス
ジェニック・マウスが製造され得ることを報告してい
る。マイクロインジェクションされた外来遺伝子は、ト
ランスジェニック・マウスにおいて形質発現される傾向
を示した(ブリンスター等、スイフト等)。しかしなが
ら、そのような発現は推測され得ない。レイシー等
[「セル」、３４、３４３−３５８頁(１９８３年)]は、
ひとＢ−グロブリン遺伝子を含むトランスジェニック・
マウス（一般にこの遺伝子を発現しない）を開示してい
る。同様に、ラットおよびひと成長ホルモン遺伝子は、
これらの遺伝子を有するトランスジェニック・マウスに
おいてそれら自身のプロモーターの制御下では発現され
ないことが見出された（ワグナー等、ハマー等)。にわ
とりトランスフェリン遺伝子の発現性は、にわとりトラ
ンスフェリン遺伝子を含むトランスジェニック・マウス
の他の組織よりも、肝臓(通常それが優先的に形質発現
される場所)において中程度ではあるが高いことが見出
された[マックナイト等、「セル」、３４、３３５−３４
１頁(１９８３年)]。すなわち、トランスジェニック・
マウスの作成方法は技術文献に既に記載されているが、
クローン化された遺伝子を正確に発現する特定のトラン
スジェニック・マウスの作成能力については依然として
明確な記載は為されていない。これらの常軌を逸した結
果は、クローン化ＤＮＡがその発現を変更するマウス染
色体の本質的領域に組み込まれたか、またはマウス染色
体への組み込みプロセスにおいて突然変異もしくは転位
が行なわれた可能性を表すことが理論化された。
前核へのマイクロインジェクションによりマウス生殖系
列に移植され得る。それらのマイクロインジェクション
された遺伝子は染色体に組み込まれることが多く、成長
期間を通して保持され、メンデルの法則に従い子孫に伝
えられる。(グロスチェドル等、ワグナー等)。研究者ら
は、この方法を用いれば１０〜３０％の効率でトランス
ジェニック・マウスが製造され得ることを報告してい
る。マイクロインジェクションされた外来遺伝子は、ト
ランスジェニック・マウスにおいて形質発現される傾向
を示した(ブリンスター等、スイフト等)。しかしなが
ら、そのような発現は推測され得ない。レイシー等
[「セル」、３４、３４３−３５８頁(１９８３年)]は、
ひとＢ−グロブリン遺伝子を含むトランスジェニック・
マウス（一般にこの遺伝子を発現しない）を開示してい
る。同様に、ラットおよびひと成長ホルモン遺伝子は、
これらの遺伝子を有するトランスジェニック・マウスに
おいてそれら自身のプロモーターの制御下では発現され
ないことが見出された（ワグナー等、ハマー等)。にわ
とりトランスフェリン遺伝子の発現性は、にわとりトラ
ンスフェリン遺伝子を含むトランスジェニック・マウス
の他の組織よりも、肝臓(通常それが優先的に形質発現
される場所)において中程度ではあるが高いことが見出
された[マックナイト等、「セル」、３４、３３５−３４
１頁(１９８３年)]。すなわち、トランスジェニック・
マウスの作成方法は技術文献に既に記載されているが、
クローン化された遺伝子を正確に発現する特定のトラン
スジェニック・マウスの作成能力については依然として
明確な記載は為されていない。これらの常軌を逸した結
果は、クローン化ＤＮＡがその発現を変更するマウス染
色体の本質的領域に組み込まれたか、またはマウス染色
体への組み込みプロセスにおいて突然変異もしくは転位
が行なわれた可能性を表すことが理論化された。
【０００６】単細胞受精卵の核へ入ると、クローン化遺
伝子フラグメントはマウス染色体上の無作為部位に組み
込まれるものと信じられている。一旦クローン化ＤＮＡ
がこれらの部位に組み込まれると、一般に安定し、これ
らの遺伝子は子孫マウスへ遺伝的に伝えられる。すなわ
ち、単純性ほう疹ウイルス（１型）遺伝子をもつトラン
スジェニック・マウスにおけるチミジンキナーゼの非常
に高い可変性発現は、チミジンキナーゼ融合遺伝子がマ
ウス染色体に組み込まれた場合に生じる遺伝子転位の結
果であると信じられている[パーミター等、「セル」、３
６、８６９−８７７頁(１９８４年)]。
伝子フラグメントはマウス染色体上の無作為部位に組み
込まれるものと信じられている。一旦クローン化ＤＮＡ
がこれらの部位に組み込まれると、一般に安定し、これ
らの遺伝子は子孫マウスへ遺伝的に伝えられる。すなわ
ち、単純性ほう疹ウイルス（１型）遺伝子をもつトラン
スジェニック・マウスにおけるチミジンキナーゼの非常
に高い可変性発現は、チミジンキナーゼ融合遺伝子がマ
ウス染色体に組み込まれた場合に生じる遺伝子転位の結
果であると信じられている[パーミター等、「セル」、３
６、８６９−８７７頁(１９８４年)]。
【０００７】トランスジェニック・マウスの一般的製造
方法は、ワグナー等、ヨーロッパ特許出願第８１５７０
号(アメリカ合衆国特許出願第２７３２３９号に対応)に
記載されており、その赤血球においてうさぎベータ-グ
ロブリン遺伝子を発現するマウスが具体的に開示されて
いる。
方法は、ワグナー等、ヨーロッパ特許出願第８１５７０
号(アメリカ合衆国特許出願第２７３２３９号に対応)に
記載されており、その赤血球においてうさぎベータ-グ
ロブリン遺伝子を発現するマウスが具体的に開示されて
いる。
【０００８】ひとインシュリンを作る遺伝子をマウスへ
導入する努力は、以前に報告されている[イルメンシー
等、『ニュクリアー・アンド・ジーン・トランスプラン
テーション・イン・ザ・マウス』、ブラウン、フォック
ス編、「デベロップメンタル・バイオロジー・ユージン
グ・ピューリファイド・ジーンズ」中、アカデミック・
プレス、ニューヨーク、６０７−６２９頁(１９８１
年)、ブルキ等、「エンボ・ジャーナル」１、１２７−
１３１頁(１９８２年)、ファン・デル・プッテン等、
「モル．ジェン．ジェネティック」１９８、１２８−１
３８頁(１９８４年)]。これらの努力の結果、ひとイン
シュリンホルモン遺伝子配列を含むマウスが製造され
た。しかしながら、これらの実験により製造されたトラ
ンスジェニック・マウスは、ひとインシュリン遺伝子配
列をその子孫に伝えることができなかった。ファン・デ
ル・プッテン等は、トランスジェニック・(インシュリ
ン配列を有する)マウスから誘導された子孫マウスは、
インシュリン遺伝子配列領域の側面に位置するＤＮＡ配
列を保持してはいるが、子孫マウスはひとインシュリン
配列を全て欠いていることを示した。いかにしてインシ
ュリンを作る配列がトランスジェニック・マウスから欠
失され得、かつ側面領域がこれらのマウスにおいて保持
されているのかを説明するために、ファン・デル・プッ
テン等は、ひとインシュリン配列を特異的に除去する生
殖系列−特異的切除事象を仮定した。ファン・デル・プ
ッテン等は、ひとインシュリン遺伝子配列の切除は、ト
ランスジェニック雌性での生殖系列の形成における初期
段階中に生じる一般的現象であり得るという結論に達し
た。ファン・デル・プッテン等により使用された方法
は、マイクロインジェクション用としてひとインシュリ
ン遺伝子を含む大きい数の環状ＤＮＡ分子を用いるもの
であった。
導入する努力は、以前に報告されている[イルメンシー
等、『ニュクリアー・アンド・ジーン・トランスプラン
テーション・イン・ザ・マウス』、ブラウン、フォック
ス編、「デベロップメンタル・バイオロジー・ユージン
グ・ピューリファイド・ジーンズ」中、アカデミック・
プレス、ニューヨーク、６０７−６２９頁(１９８１
年)、ブルキ等、「エンボ・ジャーナル」１、１２７−
１３１頁(１９８２年)、ファン・デル・プッテン等、
「モル．ジェン．ジェネティック」１９８、１２８−１
３８頁(１９８４年)]。これらの努力の結果、ひとイン
シュリンホルモン遺伝子配列を含むマウスが製造され
た。しかしながら、これらの実験により製造されたトラ
ンスジェニック・マウスは、ひとインシュリン遺伝子配
列をその子孫に伝えることができなかった。ファン・デ
ル・プッテン等は、トランスジェニック・(インシュリ
ン配列を有する)マウスから誘導された子孫マウスは、
インシュリン遺伝子配列領域の側面に位置するＤＮＡ配
列を保持してはいるが、子孫マウスはひとインシュリン
配列を全て欠いていることを示した。いかにしてインシ
ュリンを作る配列がトランスジェニック・マウスから欠
失され得、かつ側面領域がこれらのマウスにおいて保持
されているのかを説明するために、ファン・デル・プッ
テン等は、ひとインシュリン配列を特異的に除去する生
殖系列−特異的切除事象を仮定した。ファン・デル・プ
ッテン等は、ひとインシュリン遺伝子配列の切除は、ト
ランスジェニック雌性での生殖系列の形成における初期
段階中に生じる一般的現象であり得るという結論に達し
た。ファン・デル・プッテン等により使用された方法
は、マイクロインジェクション用としてひとインシュリ
ン遺伝子を含む大きい数の環状ＤＮＡ分子を用いるもの
であった。
【０００９】結論として、先行技術は、クローン遺伝子
の組織特異的形質発現能力を有するある種のトランスジ
ェニック・マウスが作成され得ることを教えている。し
かしながら、先行技術はまた、ひとインシュリン遺伝子
を発現するトランスジェニック・マウスを特異的に製造
することの困難さも教えている。ひとインシュリン遺伝
子のＤＮＡ配列を有するトランスジェニック・マウスを
製造することは可能であったが、これらのマウスがひと
インシュリンを生産することは知られておらず、またこ
れらのマウスは、ひとインシュリン遺伝子を発現または
これを有する子孫を生ずることはできなかった[ファン
・デル・プッテン等、「モル．ジェン．ジェネティッ
ク」、１９８、１２８−１３８頁(１９８４年)]。
の組織特異的形質発現能力を有するある種のトランスジ
ェニック・マウスが作成され得ることを教えている。し
かしながら、先行技術はまた、ひとインシュリン遺伝子
を発現するトランスジェニック・マウスを特異的に製造
することの困難さも教えている。ひとインシュリン遺伝
子のＤＮＡ配列を有するトランスジェニック・マウスを
製造することは可能であったが、これらのマウスがひと
インシュリンを生産することは知られておらず、またこ
れらのマウスは、ひとインシュリン遺伝子を発現または
これを有する子孫を生ずることはできなかった[ファン
・デル・プッテン等、「モル．ジェン．ジェネティッ
ク」、１９８、１２８−１３８頁(１９８４年)]。
【００１０】従って、ひとホルモンまたはひとホルモン
類似体の発現能力を有し、その子孫マウスにこのホルモ
ンの発現能力を遺伝的に伝えることができるマウスの製
造方法の開発は非常に興味深いことである。
類似体の発現能力を有し、その子孫マウスにこのホルモ
ンの発現能力を遺伝的に伝えることができるマウスの製
造方法の開発は非常に興味深いことである。
【００１１】
【発明の要旨】この発明は、ひとインシュリンを発現す
るマウスの単離方法に関するものである。ひとプレプロ
インシュリン部分をコードするcＤＮＡフラグメントを
用いて、バクテリオファージ・ラムダ・チャロン４a[ロ
ーン等、「セル」、１５巻１１５７−１１７４頁(１９７
８年)に記載]においてひと遺伝子ライブラリーをプロー
ブした。ひとインシュリン遺伝子配列を含むものに関し
てハイブリダイゼーションによる組換え体ファージをス
クリーニングすることにより、１２.５キロ塩基のＥco
ＲＩフラグメントが得られた。このフラグメントの配列
決定を行うと、クローン化ひとインシュリン遺伝子の完
全なヌクレオチド配列を含むことが判った[ベル等、「ネ
イチャー」、２８４、２６−３２頁(１９８０年)]。１
２.５キロ塩基ＥcoＲＩフラグメントを単細胞マウス胚
の雄性前核にマイクロインジェクションした。次いで、
その胚を擬妊娠マウスの借り腹に移植して妊娠させた。
この方法により、サザーン・ハイブリダイゼーション分
析により検出されるひとインシュリン遺伝子配列を含む
３匹の生存し得るマウスが誕生した。これらの３匹のマ
ウスのうち１匹の雄マウスを育てて数百子孫のコロニー
を発生させた。ひとインシュリン遺伝子はメンデルの法
則に従い伝えられ、Ｆ１およびＦ２の両子孫の約５０％
が注入されたＤＮＡフラグメントを受け継いでいた。
るマウスの単離方法に関するものである。ひとプレプロ
インシュリン部分をコードするcＤＮＡフラグメントを
用いて、バクテリオファージ・ラムダ・チャロン４a[ロ
ーン等、「セル」、１５巻１１５７−１１７４頁(１９７
８年)に記載]においてひと遺伝子ライブラリーをプロー
ブした。ひとインシュリン遺伝子配列を含むものに関し
てハイブリダイゼーションによる組換え体ファージをス
クリーニングすることにより、１２.５キロ塩基のＥco
ＲＩフラグメントが得られた。このフラグメントの配列
決定を行うと、クローン化ひとインシュリン遺伝子の完
全なヌクレオチド配列を含むことが判った[ベル等、「ネ
イチャー」、２８４、２６−３２頁(１９８０年)]。１
２.５キロ塩基ＥcoＲＩフラグメントを単細胞マウス胚
の雄性前核にマイクロインジェクションした。次いで、
その胚を擬妊娠マウスの借り腹に移植して妊娠させた。
この方法により、サザーン・ハイブリダイゼーション分
析により検出されるひとインシュリン遺伝子配列を含む
３匹の生存し得るマウスが誕生した。これらの３匹のマ
ウスのうち１匹の雄マウスを育てて数百子孫のコロニー
を発生させた。ひとインシュリン遺伝子はメンデルの法
則に従い伝えられ、Ｆ１およびＦ２の両子孫の約５０％
が注入されたＤＮＡフラグメントを受け継いでいた。
【００１２】詳しくは、この発明は、その細胞がひとプ
レプロインシュリン、プロインシュリンまたはインシュ
リン遺伝子の全部または一部を作る遺伝子配列を含み、
受精の結果、その細胞に前記遺伝子配列が含まれている
子孫マウスを生産することができる標的マウスを得る方
法であって、 (a)第１雌マウスから受精卵を単離し、 (b)ひとプレプロインシュリン、プロインシュリンまた
はインシュリン遺伝子の全部または一部を含む遺伝子配
列を受精卵に注入し、 (c)前記遺伝子配列を含む受精卵を擬妊娠第２雌マウス
の子宮に移植し、 (d)第２雌マウスを、(i)前記遺伝子配列を含む受精卵由
来の胚により妊娠させ、(ii)胚を標的マウスに成長さ
せ、(iii)標的マウスを第２雌マウスから生存し得る状
態で誕 生させる（ただし、標的マウスは、ひとプレプ
ロインシュリン、プロインシュリンまたはインシュリン
の遺伝子配列を含み、受精の結果、その細胞に前記遺伝
子配列が安定して含まれる子孫マウスを生産し得るもの
とする）形で維持することにより構成される方法を包含
する。
レプロインシュリン、プロインシュリンまたはインシュ
リン遺伝子の全部または一部を作る遺伝子配列を含み、
受精の結果、その細胞に前記遺伝子配列が含まれている
子孫マウスを生産することができる標的マウスを得る方
法であって、 (a)第１雌マウスから受精卵を単離し、 (b)ひとプレプロインシュリン、プロインシュリンまた
はインシュリン遺伝子の全部または一部を含む遺伝子配
列を受精卵に注入し、 (c)前記遺伝子配列を含む受精卵を擬妊娠第２雌マウス
の子宮に移植し、 (d)第２雌マウスを、(i)前記遺伝子配列を含む受精卵由
来の胚により妊娠させ、(ii)胚を標的マウスに成長さ
せ、(iii)標的マウスを第２雌マウスから生存し得る状
態で誕 生させる（ただし、標的マウスは、ひとプレプ
ロインシュリン、プロインシュリンまたはインシュリン
の遺伝子配列を含み、受精の結果、その細胞に前記遺伝
子配列が安定して含まれる子孫マウスを生産し得るもの
とする）形で維持することにより構成される方法を包含
する。
【００１３】またこの発明は、その細胞にひとプレプロ
インシュリン、プロインシュリンまたはインシュリン遺
伝子が含まれ、前記遺伝子を有する子孫マウスを生産す
ることが可能なマウスを提供する。またこの発明は、そ
の細胞にひとプレプロインシュリン、プロインシュリン
またはインシュリン遺伝子が含まれ、前記遺伝子を有す
る子孫マウスを生産することができ、前記遺伝子が安定
して形質発現されるマウスを提供する。
インシュリン、プロインシュリンまたはインシュリン遺
伝子が含まれ、前記遺伝子を有する子孫マウスを生産す
ることが可能なマウスを提供する。またこの発明は、そ
の細胞にひとプレプロインシュリン、プロインシュリン
またはインシュリン遺伝子が含まれ、前記遺伝子を有す
る子孫マウスを生産することができ、前記遺伝子が安定
して形質発現されるマウスを提供する。
【００１４】さらにこの発明は、異種蛋白質の発現また
はレベルに対する薬剤の薬動力学的効果、治療価値また
は医薬的重要性の評価方法であって、(a)トランスジェ
ニックほ乳類に薬剤を与え（前記ほ乳類は異種蛋白質遺
伝子を含む)、(b)ほ乳類における形質発現またはレベル
をモニターすることにより、異種蛋白質の発現またはレ
ベルに対する薬剤の効果、価値または重要性を調べるこ
とを含む方法を提供する。
はレベルに対する薬剤の薬動力学的効果、治療価値また
は医薬的重要性の評価方法であって、(a)トランスジェ
ニックほ乳類に薬剤を与え（前記ほ乳類は異種蛋白質遺
伝子を含む)、(b)ほ乳類における形質発現またはレベル
をモニターすることにより、異種蛋白質の発現またはレ
ベルに対する薬剤の効果、価値または重要性を調べるこ
とを含む方法を提供する。
【００１５】またこの発明は、ひとインシュリンの発現
またはレベルに対する薬剤の薬動力学的効果、治療価値
または医薬的重要性の評価方法であって、(a)その細胞
がひとプレプロインシュリン、プロインシュリンまたは
インシュリン遺伝子を含み、かつ安定してそれを発現さ
せるマウスに薬剤を与え、(b)マウスにおける発現また
はレベルをモニターすることにより、ひとインシュリン
の発現またはレベルに対する薬剤の効果、価値または重
要性を調べることを含む方法を提供する。
またはレベルに対する薬剤の薬動力学的効果、治療価値
または医薬的重要性の評価方法であって、(a)その細胞
がひとプレプロインシュリン、プロインシュリンまたは
インシュリン遺伝子を含み、かつ安定してそれを発現さ
せるマウスに薬剤を与え、(b)マウスにおける発現また
はレベルをモニターすることにより、ひとインシュリン
の発現またはレベルに対する薬剤の効果、価値または重
要性を調べることを含む方法を提供する。
【００１６】またこの発明は、自然調節的にひとインシ
ュリンを安定して発現することができるＢ６Ｃ３Ｆ１系
統のトランスジェニック・マウスを提供する。ひとＣ−
ペプチド放射線免疫測定キット（ベーリングベルケ・ア
クチエンゲゼルシャフト、西ドイツ）を用いて、このマ
ウスおよびその子孫におけるひとインシュリン遺伝子の
発現を検出した。この測定法は、ひとＣ−ペプチドに特
異的であり、マウスＣ−ペプチドとは殆どまたは全く交
叉反応性を示さない。この測定法を用いて、数百のトラ
ンスジェニック・マウスが様々な生理学的環境下で分析
され、ひとＣ−ペプチドを生産することが示されたが、
これは即ちこれらのマウスにおけるひとインシュリンホ
ルモンの発現を示している。
ュリンを安定して発現することができるＢ６Ｃ３Ｆ１系
統のトランスジェニック・マウスを提供する。ひとＣ−
ペプチド放射線免疫測定キット（ベーリングベルケ・ア
クチエンゲゼルシャフト、西ドイツ）を用いて、このマ
ウスおよびその子孫におけるひとインシュリン遺伝子の
発現を検出した。この測定法は、ひとＣ−ペプチドに特
異的であり、マウスＣ−ペプチドとは殆どまたは全く交
叉反応性を示さない。この測定法を用いて、数百のトラ
ンスジェニック・マウスが様々な生理学的環境下で分析
され、ひとＣ−ペプチドを生産することが示されたが、
これは即ちこれらのマウスにおけるひとインシュリンホ
ルモンの発現を示している。
【００１７】これらのマウスにおいて正常なグルコース
のホメオスタシスが保存されていることが見出された
が、これはひとインシュリン遺伝子の発現が適度に調節
されていることを示す。トランスジェニック・マウスに
おけるひとインシュリンのレベルは、インシュリン発現
が、ひとにおけるひとインシュリンまたはマウスにおけ
るネズミインシュリンの場合と同じ調節および制御下に
置かれていることを示した。
のホメオスタシスが保存されていることが見出された
が、これはひとインシュリン遺伝子の発現が適度に調節
されていることを示す。トランスジェニック・マウスに
おけるひとインシュリンのレベルは、インシュリン発現
が、ひとにおけるひとインシュリンまたはマウスにおけ
るネズミインシュリンの場合と同じ調節および制御下に
置かれていることを示した。
【００１８】この発明は、ひと以外の動物におけるひと
インシュリンホルモンのエフェクターを試験するための
動物モデルを提供するという点で意義深く有用である。
インシュリンホルモンのエフェクターを試験するための
動物モデルを提供するという点で意義深く有用である。
【００１９】
【好ましい実施態様の記載】インシュリンは、有機体の
燃料ホメオスタシスの調節において支配的な生理学的役
割を演じるポリペプチドホルモンである。それは、すい
臓のランゲルハンス島のベータ細胞（以後、「島細胞」と
記する）により合成される。循環インシュリンレベル
は、幾つかの小分子、特にグルコース、アミノ酸、脂肪
酸およびある種の薬剤により調節される。インシュリン
は、当モル量の成熟インシュリンおよび結合ペプチド
（Ｃ−ペプチド）を生じるプロインシュリンの蛋白質加
水分解による開裂から誘導される２つのポリペプチド鎖
（ＡおよびＢ、ジスルフィド結合により結合されてい
る）で構成される。プロインシュリンは、プレプロイン
シュリンとして知られている前駆体により生成される。
プレプロインシュリンは細胞によりプロインシュリンに
合成され、次いで成熟ホルモン、インシュリンとして細
胞から排出される。すなわち、インシュリンホルモン発
現またはレベルは、プレプロインシュリン、プロインシ
ュリン、インシュリン、Ａ−ペプチド、Ｂ−ペプチドま
たは好ましくはＣ−ペプチドの発現またはレベルを測定
することにより検定され得る。
燃料ホメオスタシスの調節において支配的な生理学的役
割を演じるポリペプチドホルモンである。それは、すい
臓のランゲルハンス島のベータ細胞（以後、「島細胞」と
記する）により合成される。循環インシュリンレベル
は、幾つかの小分子、特にグルコース、アミノ酸、脂肪
酸およびある種の薬剤により調節される。インシュリン
は、当モル量の成熟インシュリンおよび結合ペプチド
（Ｃ−ペプチド）を生じるプロインシュリンの蛋白質加
水分解による開裂から誘導される２つのポリペプチド鎖
（ＡおよびＢ、ジスルフィド結合により結合されてい
る）で構成される。プロインシュリンは、プレプロイン
シュリンとして知られている前駆体により生成される。
プレプロインシュリンは細胞によりプロインシュリンに
合成され、次いで成熟ホルモン、インシュリンとして細
胞から排出される。すなわち、インシュリンホルモン発
現またはレベルは、プレプロインシュリン、プロインシ
ュリン、インシュリン、Ａ−ペプチド、Ｂ−ペプチドま
たは好ましくはＣ−ペプチドの発現またはレベルを測定
することにより検定され得る。
【００２０】この明細書に記載されている「Ｆ１」の語
は、マウスの第１代子孫(すなわち、その「息子および
娘」)を指す。この明細書に記載されている「Ｆ２」の語
は、マウスの第２代子孫（すなわち、その「孫」）を指
す。
は、マウスの第１代子孫(すなわち、その「息子および
娘」)を指す。この明細書に記載されている「Ｆ２」の語
は、マウスの第２代子孫（すなわち、その「孫」）を指
す。
【００２１】「ひとインシュリン」の語は、天然インシ
ュリンおよびその類似体全てを包含する。かかる類似体
の例としては、インシュリンを機能的に損なわれた形で
生成させる突然変異遺伝子を含むひとインシュリン遺伝
子、通常のひとインシュリンと構造的または機能的に類
似した天然ひと蛋白質、またはひとインシュリン遺伝子
のインビトロもしくはインビボ突然変異誘発もしくは修
飾により生じる新規インシュリンホルモンの産物があ
る。さらに「ひとインシュリン」の語は、ひとインシュ
リンの変異形を包含する。ひとインシュリンの変異形
は、自然発生または病気により発生し、集団全体の中の
部分集団に存在するひとインシュリンと分子構造的また
は機能的に類似している。
ュリンおよびその類似体全てを包含する。かかる類似体
の例としては、インシュリンを機能的に損なわれた形で
生成させる突然変異遺伝子を含むひとインシュリン遺伝
子、通常のひとインシュリンと構造的または機能的に類
似した天然ひと蛋白質、またはひとインシュリン遺伝子
のインビトロもしくはインビボ突然変異誘発もしくは修
飾により生じる新規インシュリンホルモンの産物があ
る。さらに「ひとインシュリン」の語は、ひとインシュ
リンの変異形を包含する。ひとインシュリンの変異形
は、自然発生または病気により発生し、集団全体の中の
部分集団に存在するひとインシュリンと分子構造的また
は機能的に類似している。
【００２２】「異種蛋白質」の語は、特定の種類により
通常では生産されない蛋白質を包含する。ひとインシュ
リン、うさぎＢ−グロブリンは、マウスにおいて生産さ
れ得る異種蛋白質の例である。トランスジェニックほ乳
類の特徴は、それらが異種蛋白質の遺伝子を含み、異種
蛋白質生産能力を有することである。
通常では生産されない蛋白質を包含する。ひとインシュ
リン、うさぎＢ−グロブリンは、マウスにおいて生産さ
れ得る異種蛋白質の例である。トランスジェニックほ乳
類の特徴は、それらが異種蛋白質の遺伝子を含み、異種
蛋白質生産能力を有することである。
【００２３】「クローン（化された）遺伝子」の語は、
単離された後、マウスの受精卵に注入されることによ
り、クローン遺伝子配列を含むトランスジェニック・マ
ウスの製造に使用される興味深いＤＮＡ配列を包含す
る。
単離された後、マウスの受精卵に注入されることによ
り、クローン遺伝子配列を含むトランスジェニック・マ
ウスの製造に使用される興味深いＤＮＡ配列を包含す
る。
【００２４】この明細書で使用されている「遺伝子」、
「ＤＮＡ配列」または「遺伝子配列」の語は同義語であ
り、自然状態でそのＤＮＡに伴うイントロンまたはエク
ソンを全て含むＤＮＡを包含する。遺伝子の一例として
は、ひとプレプロインシュリンおよびこのＤＮＡ配列に
伴う非翻訳介在配列をコードするＤＮＡがある[ベル
等、「ネイチャー」、２８４、２６−３１頁(１９８０
年)]。遺伝子配列が第２遺伝子配列から誘導されるとい
うことは、それが第２遺伝子配列の正確なコピーである
場合、またはそれが第２配列の変形（すなわち、突然変
異、挿入または欠失）の結果である場合を言う。遺伝子
配列が「(形質）発現」されるということは、遺伝子が
ＲＮＡに転写され、ＲＮＡが蛋白質に翻訳される場合を
言う。
「ＤＮＡ配列」または「遺伝子配列」の語は同義語であ
り、自然状態でそのＤＮＡに伴うイントロンまたはエク
ソンを全て含むＤＮＡを包含する。遺伝子の一例として
は、ひとプレプロインシュリンおよびこのＤＮＡ配列に
伴う非翻訳介在配列をコードするＤＮＡがある[ベル
等、「ネイチャー」、２８４、２６−３１頁(１９８０
年)]。遺伝子配列が第２遺伝子配列から誘導されるとい
うことは、それが第２遺伝子配列の正確なコピーである
場合、またはそれが第２配列の変形（すなわち、突然変
異、挿入または欠失）の結果である場合を言う。遺伝子
配列が「(形質）発現」されるということは、遺伝子が
ＲＮＡに転写され、ＲＮＡが蛋白質に翻訳される場合を
言う。
【００２５】クローン遺伝子またはクローン遺伝子のフ
ラグメントは、当業界でよく知られた幾つかの方法によ
り製造および精製される。すなわち、クローン遺伝子
は、合成手法、または遺伝子の転写から誘導されたmＲ
ＮＡを逆転写酵素で処理して遺伝子のcＤＮＡバージョ
ンを製造するか、または遺伝子をゲノム・バンクまたは
他の供給源から直接単離することにより製造され得る。
ラグメントは、当業界でよく知られた幾つかの方法によ
り製造および精製される。すなわち、クローン遺伝子
は、合成手法、または遺伝子の転写から誘導されたmＲ
ＮＡを逆転写酵素で処理して遺伝子のcＤＮＡバージョ
ンを製造するか、または遺伝子をゲノム・バンクまたは
他の供給源から直接単離することにより製造され得る。
【００２６】どの方法で単離されるにせよ、クローン遺
伝子は増幅され、他の潜在的汚染分子から精製される。
適当なＤＮＡ配列、例えばひとプロインシュリン遺伝
子、ひとインシュリンをコードするＤＮＡ配列、または
ひとプレプロインシュリンの遺伝子、好ましくはひとプ
レプロインシュリン遺伝子を含むプラスミドpgＨＩ １
２.５（ベル等）のＤＮＡが使用され得る。インシュリ
ン、プレプロインシュリンおよびプロインシュリンの配
列はベル等により開示された。
伝子は増幅され、他の潜在的汚染分子から精製される。
適当なＤＮＡ配列、例えばひとプロインシュリン遺伝
子、ひとインシュリンをコードするＤＮＡ配列、または
ひとプレプロインシュリンの遺伝子、好ましくはひとプ
レプロインシュリン遺伝子を含むプラスミドpgＨＩ １
２.５（ベル等）のＤＮＡが使用され得る。インシュリ
ン、プレプロインシュリンおよびプロインシュリンの配
列はベル等により開示された。
【００２７】マイクロインジェクション用のマウス受精
卵を数時間前に交尾した雌マウスの卵管から堆積状態で
（in cumulus）採取する。マウス系統Ｃ５７ＢＬ／６
Ｊ、ＳＪＬ／Ｗt、Ｃ３ＨまたはＣ５７／ＳＪＬからの
雌マウスの受精卵は使用され得るが、Ｆ１雄マウスと交
尾したＣ５７／Ｃ３Ｈ Ｆ１雌マウスの卵管から得た受
精卵を使用するのが好ましい。前核段階（すなわち、細
胞質内で雄性および雌性前核が独立し、互いに識別可能
な段階）の受精卵を妊娠した（Ｃ５７／Ｃ３Ｈ）Ｆ１雌
マウスの卵管から採取する。単離された受精卵をＭ１６
培養培地中３７℃でインキュベーションし[ウィッティ
ンガム、「ジェイ．リプロド．ファーティル．サプ
ル．」、１４、７−２１頁(１９７１年)]、極微操作まで
２−４時間貯蔵する。ライツ・マイクロマニピュレータ
ーおよびパラフィン油充填ハミルトン注射器を用いるこ
とにより、受精卵を入れるピペットを操作してクローン
ＤＮＡの注入を行う。これらの胚に注入されるインシュ
リンＤＮＡ供給源は、０.５ミリモルのトリス（pＨ＝
８）・０.５ミリモルＥＤＴＡ中に存在すべきである。
５個または６個の受精卵を含む培養培地の小滴を顕微鏡
スライドに載せ、パラフィン油で覆う。２〜２０pl、好
ましくは５plの精製インシュリン遺伝子フラグメント、
またはインシュリン遺伝子配列を含む共有結合的に閉じ
たプラスミドを注射用ピペットに引き入れ、次いで受精
卵を含む滴下物と隣接した場所に移す。受精卵をホール
ディング・ピペット上に置くことにより、雄性前核を注
射用ピペットと並置させ、続いてインシュリン遺伝子溶
液を前核に注入する。インシュリン遺伝子配列のコピー
の有効数、６００〜２００００コピー、好ましくは１０
００コピーのインシュリン遺伝子配列を各受精卵に注入
する。１時間当たり６０−１００個の卵が注入される。
卵を数時間前に交尾した雌マウスの卵管から堆積状態で
（in cumulus）採取する。マウス系統Ｃ５７ＢＬ／６
Ｊ、ＳＪＬ／Ｗt、Ｃ３ＨまたはＣ５７／ＳＪＬからの
雌マウスの受精卵は使用され得るが、Ｆ１雄マウスと交
尾したＣ５７／Ｃ３Ｈ Ｆ１雌マウスの卵管から得た受
精卵を使用するのが好ましい。前核段階（すなわち、細
胞質内で雄性および雌性前核が独立し、互いに識別可能
な段階）の受精卵を妊娠した（Ｃ５７／Ｃ３Ｈ）Ｆ１雌
マウスの卵管から採取する。単離された受精卵をＭ１６
培養培地中３７℃でインキュベーションし[ウィッティ
ンガム、「ジェイ．リプロド．ファーティル．サプ
ル．」、１４、７−２１頁(１９７１年)]、極微操作まで
２−４時間貯蔵する。ライツ・マイクロマニピュレータ
ーおよびパラフィン油充填ハミルトン注射器を用いるこ
とにより、受精卵を入れるピペットを操作してクローン
ＤＮＡの注入を行う。これらの胚に注入されるインシュ
リンＤＮＡ供給源は、０.５ミリモルのトリス（pＨ＝
８）・０.５ミリモルＥＤＴＡ中に存在すべきである。
５個または６個の受精卵を含む培養培地の小滴を顕微鏡
スライドに載せ、パラフィン油で覆う。２〜２０pl、好
ましくは５plの精製インシュリン遺伝子フラグメント、
またはインシュリン遺伝子配列を含む共有結合的に閉じ
たプラスミドを注射用ピペットに引き入れ、次いで受精
卵を含む滴下物と隣接した場所に移す。受精卵をホール
ディング・ピペット上に置くことにより、雄性前核を注
射用ピペットと並置させ、続いてインシュリン遺伝子溶
液を前核に注入する。インシュリン遺伝子配列のコピー
の有効数、６００〜２００００コピー、好ましくは１０
００コピーのインシュリン遺伝子配列を各受精卵に注入
する。１時間当たり６０−１００個の卵が注入される。
【００２８】前核全部へのマイクロインジェクション
後、受精卵を顕微鏡スライド上の培地滴下物から除去
し、培養管に入れてワグナー等の方法に従い着床前成長
させる。Ｍ１６緩衝液中３７°で４時間培養後、１日擬
妊娠ＩＣＲマウスの腹を借りてその子宮に１個または２
個の受精卵を移植し、出産させる。擬妊娠マウスは、ホ
ッペ等、「バイオル．リプロド．」８、４２０−４２６頁
(１９７３年)の記載に従い、雌マウスを精管切除した雄
マウスと交尾させることにより得られる。これらの雌マ
ウスの借り腹から生まれた新生ほ乳類の１０−３０パー
セントはトランスジェニックとなる（すなわち、それら
の染色体内にクローン遺伝子の配列が組み込まれてい
る)。
後、受精卵を顕微鏡スライド上の培地滴下物から除去
し、培養管に入れてワグナー等の方法に従い着床前成長
させる。Ｍ１６緩衝液中３７°で４時間培養後、１日擬
妊娠ＩＣＲマウスの腹を借りてその子宮に１個または２
個の受精卵を移植し、出産させる。擬妊娠マウスは、ホ
ッペ等、「バイオル．リプロド．」８、４２０−４２６頁
(１９７３年)の記載に従い、雌マウスを精管切除した雄
マウスと交尾させることにより得られる。これらの雌マ
ウスの借り腹から生まれた新生ほ乳類の１０−３０パー
セントはトランスジェニックとなる（すなわち、それら
の染色体内にクローン遺伝子の配列が組み込まれてい
る)。
【００２９】これらの組み込まれた配列の存在は、当業
界で知られている特定クローン遺伝子の検出に適した手
段により検出される。すなわち、ポリペプチド生成物を
発現するか、または発現しない遺伝子を検出するため、
サザーン・ハイブリダイゼーション分析が行なわれる。
それらの技術および組換え体ＤＮＡ操作に必要とされる
技術は、マニアチス等、「モレキュラー・クローニン
グ：ア・ラボラトリー・マニュアル」（コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク、１９
８２年）に記載されており、以後、その内容を引用して
説明の一部とする。その存在がポリペプチド、例えばイ
ンシュリンの生成により検出可能であると予想されるク
ローン遺伝子は、クローン遺伝子産物と内在性遺伝子産
物とを識別し得る（例えば、ひとインシュリンをねずみ
インシュリンと区別し得る）手段、例えば、放射線免疫
測定、酵素測定または当業界においてよく知られている
他の手段により検出され得る。
界で知られている特定クローン遺伝子の検出に適した手
段により検出される。すなわち、ポリペプチド生成物を
発現するか、または発現しない遺伝子を検出するため、
サザーン・ハイブリダイゼーション分析が行なわれる。
それらの技術および組換え体ＤＮＡ操作に必要とされる
技術は、マニアチス等、「モレキュラー・クローニン
グ：ア・ラボラトリー・マニュアル」（コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク、１９
８２年）に記載されており、以後、その内容を引用して
説明の一部とする。その存在がポリペプチド、例えばイ
ンシュリンの生成により検出可能であると予想されるク
ローン遺伝子は、クローン遺伝子産物と内在性遺伝子産
物とを識別し得る（例えば、ひとインシュリンをねずみ
インシュリンと区別し得る）手段、例えば、放射線免疫
測定、酵素測定または当業界においてよく知られている
他の手段により検出され得る。
【００３０】任意の適当な手段を用いてトランスジェニ
ック・マウスにおけるクローン遺伝子の発現を検出する
ことはできるが、放射線免疫測定法、例えばひとＣ−ペ
プチドに特異的であり、マウスＣ−ペプチドとは殆どま
たは全く交叉反応性を示さないため、ひとインシュリン
と内在性マウスインシュリンの発現の識別に適している
ひとＣ−ペプチド放射線免疫測定キット（ベーリングベ
ルケ・アクチエン・ゲゼルシャフト(西ドイツ)から市
販）を使用するのが好ましい。
ック・マウスにおけるクローン遺伝子の発現を検出する
ことはできるが、放射線免疫測定法、例えばひとＣ−ペ
プチドに特異的であり、マウスＣ−ペプチドとは殆どま
たは全く交叉反応性を示さないため、ひとインシュリン
と内在性マウスインシュリンの発現の識別に適している
ひとＣ−ペプチド放射線免疫測定キット（ベーリングベ
ルケ・アクチエン・ゲゼルシャフト(西ドイツ)から市
販）を使用するのが好ましい。
【００３１】一旦トランスジェニック・マウスが同定さ
れると、組込まれたクローン遺伝子の安定した維持およ
び伝達は、遺伝学分野でよく知られている古典的なメン
デルの実験により確認される。マウスが別のマウスから
誘導されるということは、そのマウスが遺伝的に識別不
可能である場合、または一方のマウスが他方のマウスの
子孫である場合を言う。トランスジェニック・マウスが
安定してクローン遺伝子配列を含む、または安定してク
ローン遺伝子の遺伝子産物を発現するということは、ト
ランスジェニック・マウスの場合と実質的に類似した形
または非トランスジェニックほ乳類の場合と実質的に識
別可能な形で、トランスジェニック・マウスのＦ１また
はＦ２子孫の中にクローン遺伝子配列を含むか、または
（各々の）クローン遺伝子産物を発現するものがある場
合を言う。
れると、組込まれたクローン遺伝子の安定した維持およ
び伝達は、遺伝学分野でよく知られている古典的なメン
デルの実験により確認される。マウスが別のマウスから
誘導されるということは、そのマウスが遺伝的に識別不
可能である場合、または一方のマウスが他方のマウスの
子孫である場合を言う。トランスジェニック・マウスが
安定してクローン遺伝子配列を含む、または安定してク
ローン遺伝子の遺伝子産物を発現するということは、ト
ランスジェニック・マウスの場合と実質的に類似した形
または非トランスジェニックほ乳類の場合と実質的に識
別可能な形で、トランスジェニック・マウスのＦ１また
はＦ２子孫の中にクローン遺伝子配列を含むか、または
（各々の）クローン遺伝子産物を発現するものがある場
合を言う。
【００３２】一般的に、クローン化されたひとインシュ
リン遺伝子は、ある組織、すなわちクローンひとインシ
ュリン遺伝子がその天然宿主有機体において自然に発現
される組織に相当する組織でのみ発現されるのが望まし
い。組織特異性を立証するためには、トランスジェニッ
ク・マウスから得られた様々な組織部分を分析してこれ
らの組織がクローン遺伝子産物を発現するか否かを決定
すれば充分である。すなわち、様々な組織に由来する蛋
白質は、放射線免疫検定法またはクローン遺伝子産物の
存在の検定を目的とする他の手段により測定され得る。
別法として、ＲＮＡは幾つかの組織から製造され、当業
界で周知の手段により、32Ｐまたは他の放射能標識（ま
たはビオチニル化）したニックトランスレーションによ
るひとインシュリンcＤＮＡプローブとハイブリダイゼ
ーションされ得る（マニアチス等）。
リン遺伝子は、ある組織、すなわちクローンひとインシ
ュリン遺伝子がその天然宿主有機体において自然に発現
される組織に相当する組織でのみ発現されるのが望まし
い。組織特異性を立証するためには、トランスジェニッ
ク・マウスから得られた様々な組織部分を分析してこれ
らの組織がクローン遺伝子産物を発現するか否かを決定
すれば充分である。すなわち、様々な組織に由来する蛋
白質は、放射線免疫検定法またはクローン遺伝子産物の
存在の検定を目的とする他の手段により測定され得る。
別法として、ＲＮＡは幾つかの組織から製造され、当業
界で周知の手段により、32Ｐまたは他の放射能標識（ま
たはビオチニル化）したニックトランスレーションによ
るひとインシュリンcＤＮＡプローブとハイブリダイゼ
ーションされ得る（マニアチス等）。
【００３３】クローンひとインシュリン遺伝子配列の発
現は、好ましくはその天然宿主、ひとにおける場合と同
様、トランスジェニック・マウスにおいて同じ機構によ
り「自然調節」される。
現は、好ましくはその天然宿主、ひとにおける場合と同
様、トランスジェニック・マウスにおいて同じ機構によ
り「自然調節」される。
【００３４】「自然調節（された)」の語は、遺伝子が
生理学的に適当な方法で調節されることを意味する。そ
れ故、遺伝子の発現は構造性ではあり得ないが、トラン
スジェニック・マウスの必要条件、活性およびエフェク
ターに応じて変化する。「自然調節」は、クローンひと
インシュリン遺伝子が、マウスの全組織および器官では
なく、その天然宿主においてクローンインシュリン遺伝
子を発現させた組織および器官でのみ発現され得ること
を必要とする。さらに、かかる「自然調節」は、インシ
ュリン遺伝子配列、それらの対応するmＲＮＡ転写情報
およびこれらの転写情報から生成された蛋白質に対して
「自然プロセッシング」が行なわれることを必要とす
る。「自然プロセッシング（された)」の語は、例えばm
ＲＮＡ転写、スプライシングおよび蛋白質前駆体分子
（例えば、プレプロインシュリンまたはプロインシュリ
ン）の蛋白質加水分解開裂の段階を包含する。さらに、
「自然調節」は、インシュリン遺伝子発現レベルを異常な
範囲ではなく通常見出される生理学的範囲内に治めさせ
る。マウスにおけるインシュリン濃度の生理学的に正常
な範囲は０−１００μＵ／mlである。すなわち、例え
ば、(１)発現がマウスのすい臓の島細胞でのみ行なわれ
た場合、(２)生成されたプレプロインシュリンに対し自
然プロセッシングが行なわれてプロインシュリンとな
り、さらに自然に生成されたプロインシュリンに対し自
然プロセッシングが行なわれてインシュリンとなり、こ
れがマウスの循環系に自然に分泌された場合、(３)生成
されたプレプロインシュリン、プロインシュリンおよび
インシュリンの量が正常な生理学的範囲内に含まれた場
合、(４)インシュリン発現の作働子（例えばグルコース
またはアミノ酸）の存在により、マウスにおけるねずみ
プレプロインシュリン、プロインシュリンおよびインシ
ュリン、またはひとにおけるひとプレプロインシュリ
ン、プロインシュリンまたはインシュリンの場合と本質
的に同じ状況で、ひとプレプロインシュリン、プロイン
シュリンおよびインシュリンの量および濃度が変化する
場合、トランスジェニック・マウスにおけるひとプレプ
ロインシュリン遺伝子の発現は自然調節されていること
になる。
生理学的に適当な方法で調節されることを意味する。そ
れ故、遺伝子の発現は構造性ではあり得ないが、トラン
スジェニック・マウスの必要条件、活性およびエフェク
ターに応じて変化する。「自然調節」は、クローンひと
インシュリン遺伝子が、マウスの全組織および器官では
なく、その天然宿主においてクローンインシュリン遺伝
子を発現させた組織および器官でのみ発現され得ること
を必要とする。さらに、かかる「自然調節」は、インシ
ュリン遺伝子配列、それらの対応するmＲＮＡ転写情報
およびこれらの転写情報から生成された蛋白質に対して
「自然プロセッシング」が行なわれることを必要とす
る。「自然プロセッシング（された)」の語は、例えばm
ＲＮＡ転写、スプライシングおよび蛋白質前駆体分子
（例えば、プレプロインシュリンまたはプロインシュリ
ン）の蛋白質加水分解開裂の段階を包含する。さらに、
「自然調節」は、インシュリン遺伝子発現レベルを異常な
範囲ではなく通常見出される生理学的範囲内に治めさせ
る。マウスにおけるインシュリン濃度の生理学的に正常
な範囲は０−１００μＵ／mlである。すなわち、例え
ば、(１)発現がマウスのすい臓の島細胞でのみ行なわれ
た場合、(２)生成されたプレプロインシュリンに対し自
然プロセッシングが行なわれてプロインシュリンとな
り、さらに自然に生成されたプロインシュリンに対し自
然プロセッシングが行なわれてインシュリンとなり、こ
れがマウスの循環系に自然に分泌された場合、(３)生成
されたプレプロインシュリン、プロインシュリンおよび
インシュリンの量が正常な生理学的範囲内に含まれた場
合、(４)インシュリン発現の作働子（例えばグルコース
またはアミノ酸）の存在により、マウスにおけるねずみ
プレプロインシュリン、プロインシュリンおよびインシ
ュリン、またはひとにおけるひとプレプロインシュリ
ン、プロインシュリンまたはインシュリンの場合と本質
的に同じ状況で、ひとプレプロインシュリン、プロイン
シュリンおよびインシュリンの量および濃度が変化する
場合、トランスジェニック・マウスにおけるひとプレプ
ロインシュリン遺伝子の発現は自然調節されていること
になる。
【００３５】ひとインシュリンホルモンを産生するトラ
ンスジェニック・マウスは製薬業界にとって特に有用で
ある。それらのマウスは、まず、ひとインシュリンレベ
ルに対する薬品または他の薬剤の効果を評価するための
インビボ非ひと動物モデルを提供する。一般に、そのよ
うな評価をする作業は全てボランティアまたは患者を必
要とする。ひと対象を用いる研究において遭遇する倫理
的制約により、ひとインシュリン−治療剤相互作用の研
究の性質および範囲は大きく制限されている。
ンスジェニック・マウスは製薬業界にとって特に有用で
ある。それらのマウスは、まず、ひとインシュリンレベ
ルに対する薬品または他の薬剤の効果を評価するための
インビボ非ひと動物モデルを提供する。一般に、そのよ
うな評価をする作業は全てボランティアまたは患者を必
要とする。ひと対象を用いる研究において遭遇する倫理
的制約により、ひとインシュリン−治療剤相互作用の研
究の性質および範囲は大きく制限されている。
【００３６】薬剤をトランスジェニックほ乳類に投与
し、トランスジェニックほ乳類により生成された異種蛋
白質の発現およびレベルに対する薬剤の潜在的効果を評
価することにより、正確に類似した状況で薬剤の薬理効
果、治療価値および医薬的重要性を測定することができ
る。すなわち、例えば、主に脈絡膜叢において異種蛋白
質を生産するトランスジェニックほ乳類を作成した場合
（スイフト等が行った）、異種蛋白質の発現を検査する
ことにより、脈絡膜叢に対する薬剤の作用または薬剤の
脈絡膜叢に入る能力を評価することができる。それ故こ
の発明は、インシュリン発現の研究に対するトランスジ
ェニックほ乳類の使用以上のことを教えている。この発
明は、薬理および医薬の一般研究におけるトランスジェ
ニックほ乳類および特にトランスジェニック・マウスの
利用を開示するものである。
し、トランスジェニックほ乳類により生成された異種蛋
白質の発現およびレベルに対する薬剤の潜在的効果を評
価することにより、正確に類似した状況で薬剤の薬理効
果、治療価値および医薬的重要性を測定することができ
る。すなわち、例えば、主に脈絡膜叢において異種蛋白
質を生産するトランスジェニックほ乳類を作成した場合
（スイフト等が行った）、異種蛋白質の発現を検査する
ことにより、脈絡膜叢に対する薬剤の作用または薬剤の
脈絡膜叢に入る能力を評価することができる。それ故こ
の発明は、インシュリン発現の研究に対するトランスジ
ェニックほ乳類の使用以上のことを教えている。この発
明は、薬理および医薬の一般研究におけるトランスジェ
ニックほ乳類および特にトランスジェニック・マウスの
利用を開示するものである。
【００３７】ひとインシュリンの類似体を発現するトラ
ンスジェニック・マウスの作成が可能であれば、インシ
ュリンホルモンの構造および機能の研究が行える。以前
なら、それらの類似体を発現する個体が稀であり、また
それらの対象または患者において生産されるホルモンの
量が非常に限られているため、それらの研究の実施は困
難であった。反対に、ひとインシュリン類似体を発現す
るトランスジェニック・マウスの作成ができれば、それ
らの類似体の精製および特性分析も可能となる。入手可
能な天然類似体の量は、研究で使用されるマウスのコロ
ニーの大きさによってのみ制限される。さらに、インシ
ュリン遺伝子配列をインビトロ操作し、それらの配列を
マウスに導入することにより新規インシュリンホルモン
を発現するトランスジェニック・マウスを作成すること
ができるということは、ホルモン構造および機能間の関
係を研究するための異例の手段が提供されるということ
である。
ンスジェニック・マウスの作成が可能であれば、インシ
ュリンホルモンの構造および機能の研究が行える。以前
なら、それらの類似体を発現する個体が稀であり、また
それらの対象または患者において生産されるホルモンの
量が非常に限られているため、それらの研究の実施は困
難であった。反対に、ひとインシュリン類似体を発現す
るトランスジェニック・マウスの作成ができれば、それ
らの類似体の精製および特性分析も可能となる。入手可
能な天然類似体の量は、研究で使用されるマウスのコロ
ニーの大きさによってのみ制限される。さらに、インシ
ュリン遺伝子配列をインビトロ操作し、それらの配列を
マウスに導入することにより新規インシュリンホルモン
を発現するトランスジェニック・マウスを作成すること
ができるということは、ホルモン構造および機能間の関
係を研究するための異例の手段が提供されるということ
である。
【００３８】プラスミドpgＨＩ １２.５を含むエシェリ
ヒア・コリ株は、ベル等により記載されている。以上、
この発明を総括的に記載したが、一層この発明に関する
理解は深めるため、次に具体的実施例を提供する。それ
らの実施例は説明を目的としているだけで、特記しない
限りこの発明を限定する意図はないものとする。
ヒア・コリ株は、ベル等により記載されている。以上、
この発明を総括的に記載したが、一層この発明に関する
理解は深めるため、次に具体的実施例を提供する。それ
らの実施例は説明を目的としているだけで、特記しない
限りこの発明を限定する意図はないものとする。
【００３９】実施例１ クローン化されたインシュリンフラグメントの製造。 インシュリンmＲＮＡをすい臓細胞から単離し、cＤＮＡ
プローブの製造に使用した（ローン等、ベル等)。バク
テリオファージ・ラムダ・チャロン４Ａにおけるひと遺
伝子ライブラリーをcＤＮＡプローブの存在下でインキ
ュベーションした。約１０6個のうち２個のファージを
プローブとハイブリダイゼーションした。これらのクロ
ーンの１個は、クローン化ひとプレプロインシュリン遺
伝子の完全なヌクレオチド配列を含む１２.５キロ塩基
ＥcoＲＩフラグメントを含んでいた。この１２.５キロ
塩基フラグメントをプラスミドpＢＲ３２２中にサブク
ローンし、pgＨＩ１２.５（と名付けた）を細菌エシェ
リヒア・コリ、ＤＫ１株に導入することにより、増幅し
た。増幅後、１２.５キロ塩基フラグメントをプラスミ
ドから切除し、精製した。このフラグメントの約１００
０のコピーを単細胞マウス胚の雄性前核にマイクロイン
ジェクションし、次いで擬妊娠マウスの借り腹に移植し
て出産させた。一連の注入後に生まれた４６匹のマウス
のうち３匹（約７％）は、サザーン・ハイブリダイゼー
ション分析による検出結果としてひとインシュリン遺伝
子配列を含んでいた。１匹の雄マウスは、１単相ゲノム
当たり５〜１０のひとインシュリン遺伝子フラグメント
コピーを含むことが見出され、さらに特性分析がなされ
た。このマウスを育てて数百子孫から成るコロニーを発
生させると、ひとインシュリン遺伝子配列がメンデルの
法則に従い伝えられ、Ｆ１およびＦ２の両子孫の約５０
％が注入されたＤＮＡフラグメントを受け継いでいるこ
とが判った。トランスジェニック・ひとインシュリン産
生マウスであることが判明したマウス１６番をＢ６Ｃ３
Ｆ１系統の雌マウスと交尾させて妊娠マウスを製造し
た。これらのマウスにおけるひとインシュリン生産を測
定し、選択的にひとインシュリン−産生きょうだい（si
bling）をかけ合わせることにより、ホモ接合ひとイン
シュリン産生マウスのコロニーが得られた。ホモ接合ひ
とインシュリン産生マウスをＢ６Ｃ３Ｆ１／ヒューミン
グと名付けた。
プローブの製造に使用した（ローン等、ベル等)。バク
テリオファージ・ラムダ・チャロン４Ａにおけるひと遺
伝子ライブラリーをcＤＮＡプローブの存在下でインキ
ュベーションした。約１０6個のうち２個のファージを
プローブとハイブリダイゼーションした。これらのクロ
ーンの１個は、クローン化ひとプレプロインシュリン遺
伝子の完全なヌクレオチド配列を含む１２.５キロ塩基
ＥcoＲＩフラグメントを含んでいた。この１２.５キロ
塩基フラグメントをプラスミドpＢＲ３２２中にサブク
ローンし、pgＨＩ１２.５（と名付けた）を細菌エシェ
リヒア・コリ、ＤＫ１株に導入することにより、増幅し
た。増幅後、１２.５キロ塩基フラグメントをプラスミ
ドから切除し、精製した。このフラグメントの約１００
０のコピーを単細胞マウス胚の雄性前核にマイクロイン
ジェクションし、次いで擬妊娠マウスの借り腹に移植し
て出産させた。一連の注入後に生まれた４６匹のマウス
のうち３匹（約７％）は、サザーン・ハイブリダイゼー
ション分析による検出結果としてひとインシュリン遺伝
子配列を含んでいた。１匹の雄マウスは、１単相ゲノム
当たり５〜１０のひとインシュリン遺伝子フラグメント
コピーを含むことが見出され、さらに特性分析がなされ
た。このマウスを育てて数百子孫から成るコロニーを発
生させると、ひとインシュリン遺伝子配列がメンデルの
法則に従い伝えられ、Ｆ１およびＦ２の両子孫の約５０
％が注入されたＤＮＡフラグメントを受け継いでいるこ
とが判った。トランスジェニック・ひとインシュリン産
生マウスであることが判明したマウス１６番をＢ６Ｃ３
Ｆ１系統の雌マウスと交尾させて妊娠マウスを製造し
た。これらのマウスにおけるひとインシュリン生産を測
定し、選択的にひとインシュリン−産生きょうだい（si
bling）をかけ合わせることにより、ホモ接合ひとイン
シュリン産生マウスのコロニーが得られた。ホモ接合ひ
とインシュリン産生マウスをＢ６Ｃ３Ｆ１／ヒューミン
グと名付けた。
【００４０】トランスジェニック・マウスの特徴分析を
図１Ａに示す。幾つかのマウスから得られた染色体ＤＮ
Ａを試験して、マウスがひとインシュリンＤＮＡ配列を
有するか否かを調べた。ＤＮＡ試料をＰvuIIにより消化
し、プローブとして放射能標識１５９４bp ＰvuIIフラ
グメント（１２.５キロ塩基ひとインシュリンＤＮＡフ
ラグメント内に含まれる）を用いてサザーン・ハイブリ
ダイゼーション分析（マニアチス等）により分析した。
レーン１、２および５は、プローブおよびトランスジェ
ニック・マウスのゲノム配列間のハイブリダイゼーショ
ンを示す。レーン３は、プローブおよび非トランスジェ
ニックきょうだいマウスのゲノム配列間のハイブリダイ
ゼーションの非存在を示す。レーン４は、プローブおよ
びひと対照のゲノムＤＮＡ間のハイブリダイゼーション
を示す。サザーン・ブロット分析の場合、各マウスにお
ける全ゲノムＤＮＡ８μgをＰvuIIにより消化し、０.９
％アガロースゲルによる電気泳動を行い、ニトロセルロ
ースに移した。次いでフィルターを一夜前ハイブリダイ
ゼーションし、32Ｐ標識ゲノムひとインシュリンプロー
ブとハイブリダイゼーションし、洗浄し、エックス線フ
ィルムに晒した。ゲノムインシュリンプローブは、ひと
インシュリン遺伝子の転写開始部位に関して−１６９の
Ｂgl II部位から＋６４４のＡvaＩ部位に及ぶフラグメ
ントであった。プロモーター配列に加えて、このフラグ
メントは、第１介在配列、第１エクソン（シグナルペプ
チド、Ｂ−ペプチドおよびＣ−ペプチドの一部をコード
する配列を含む）および第２介在配列の一部を含んでい
た。ゲノムひとインシュリンプローブは、内在性マウス
インシュリン遺伝子との限られたクロス・ハイブリダイ
ゼーションを示した。
図１Ａに示す。幾つかのマウスから得られた染色体ＤＮ
Ａを試験して、マウスがひとインシュリンＤＮＡ配列を
有するか否かを調べた。ＤＮＡ試料をＰvuIIにより消化
し、プローブとして放射能標識１５９４bp ＰvuIIフラ
グメント（１２.５キロ塩基ひとインシュリンＤＮＡフ
ラグメント内に含まれる）を用いてサザーン・ハイブリ
ダイゼーション分析（マニアチス等）により分析した。
レーン１、２および５は、プローブおよびトランスジェ
ニック・マウスのゲノム配列間のハイブリダイゼーショ
ンを示す。レーン３は、プローブおよび非トランスジェ
ニックきょうだいマウスのゲノム配列間のハイブリダイ
ゼーションの非存在を示す。レーン４は、プローブおよ
びひと対照のゲノムＤＮＡ間のハイブリダイゼーション
を示す。サザーン・ブロット分析の場合、各マウスにお
ける全ゲノムＤＮＡ８μgをＰvuIIにより消化し、０.９
％アガロースゲルによる電気泳動を行い、ニトロセルロ
ースに移した。次いでフィルターを一夜前ハイブリダイ
ゼーションし、32Ｐ標識ゲノムひとインシュリンプロー
ブとハイブリダイゼーションし、洗浄し、エックス線フ
ィルムに晒した。ゲノムインシュリンプローブは、ひと
インシュリン遺伝子の転写開始部位に関して−１６９の
Ｂgl II部位から＋６４４のＡvaＩ部位に及ぶフラグメ
ントであった。プロモーター配列に加えて、このフラグ
メントは、第１介在配列、第１エクソン（シグナルペプ
チド、Ｂ−ペプチドおよびＣ−ペプチドの一部をコード
する配列を含む）および第２介在配列の一部を含んでい
た。ゲノムひとインシュリンプローブは、内在性マウス
インシュリン遺伝子との限られたクロス・ハイブリダイ
ゼーションを示した。
【００４１】実施例２ マウスにおけるクローンひとインシュリンホルモン遺伝
子の発現の確認。 ひとインシュリン遺伝子配列を含むＤＮＡの存在は、サ
ザーン・ハイブリダイゼーション分析の使用によりマウ
スＢ６Ｃ３Ｆ１／ヒューミングにおいて検出された。ト
ランスジェニック・マウスにおけるひとインシュリン遺
伝子発現の組織特異性を測定するために、ＲＮＡ分析お
よびすい臓「島」機能試験の両方を行った。幾つかの組
織から得られた全ＲＮＡは、トランスジェニック・マウ
スおよび非トランスジェニックきょうだいから製造され
た。１.２％アガロース-ホルムアルデヒド電気泳動によ
りこのＲＮＡを分離し、ニトロセルロースに移し、32Ｐ
標識ニック翻訳ひとインシュリンcＤＮＡプローブとハ
イブリダイゼーションした。この実験の結果を図１Ｂに
示す（レーン１、非トランスジェニック・マウスの肝臓
由来のＲＮＡ；レーン２、非トランスジェニック・マウ
スのすい臓由来のＲＮＡ：レーン３、トランスジェニッ
ク・マウスの肝臓由来のＲＮＡ；レーン４、トランスジ
ェニック・マウスのすい臓由来のＲＮＡ)。ただし、ト
ランスジェニックおよび対照マウスの両者由来のすい臓
ＲＮＡはひとインシュリンcＤＮＡプローブとハイブリ
ダイゼーションし、トランスジェニックおよび対照マウ
スの肝臓、ひ臓、脳、腎臓、心臓、腸、肺および筋肉由
来のＲＮＡはハイブリダイゼーションを示さなかった。
マウスインシュリンcＤＮＡも遺伝子配列も共に検出さ
れなかったが、ラットおよびひとインシュリンmＲＮＡ
のコード領域は８１％の配列相同性を示すため（ベル
等）、トランスジェニックおよび対照のすい臓ＲＮＡは
共にひとプローブとハイブリダイゼーションすることが
予想された。これらの結果は、ひとインシュリン遺伝子
がＢ６Ｃ３Ｆ１／ヒューミング系統のトランスジェニッ
ク・マウスのすい臓においてのみ発現され、試験された
他の組織では一切発現されないことを示した。すい臓以
外のトランスジェニック組織では検出可能なレベルのイ
ンシュリンＲＮＡの発現は見出されなかったため、トラ
ンスジェニックおよび対照の両すい臓におけるインシュ
リンの発現を試験することにより、トランスジェニック
すい臓がひとインシュリン発現部位であるか否かを調べ
た。６匹のトランスジェニック・マウスおよび６匹の対
照マウスから得られたすい臓ランゲルハンス島をコラゲ
ナーゼ消化により単離し[レイシー等、「ダイアベー
ツ」、１６、３５−３９頁(１９６７年)]、約８０−１０
０「島」細胞／組織培養ウェルの群で培養した。翌日、培
地のアリコートを採取し、ひとＣ−ペプチドレベルを測
定した。トランスジェニック・マウスのすい臓由来の
「島」細胞を含む組織培養ウェルから得られた試料は、
２５０−６５０ng／mlのひとＣ−ペプチドを含んでいた
が、対照マウスのすい臓由来の「島」細胞を含む組織培
養ウェルは検出可能なひとＣ−ペプチドを含んでいなか
った。培養されたトランスジェニック「島」細胞は数日
間ひとＣ−ペプチドの発現を続けた。これらの実験か
ら、Ｂ６Ｃ３Ｆ１／ヒューミング系統のトランスジェニ
ック・マウスにおける主なひとインシュリン発現部位
は、内分泌器官のすい臓であることが決定された。
子の発現の確認。 ひとインシュリン遺伝子配列を含むＤＮＡの存在は、サ
ザーン・ハイブリダイゼーション分析の使用によりマウ
スＢ６Ｃ３Ｆ１／ヒューミングにおいて検出された。ト
ランスジェニック・マウスにおけるひとインシュリン遺
伝子発現の組織特異性を測定するために、ＲＮＡ分析お
よびすい臓「島」機能試験の両方を行った。幾つかの組
織から得られた全ＲＮＡは、トランスジェニック・マウ
スおよび非トランスジェニックきょうだいから製造され
た。１.２％アガロース-ホルムアルデヒド電気泳動によ
りこのＲＮＡを分離し、ニトロセルロースに移し、32Ｐ
標識ニック翻訳ひとインシュリンcＤＮＡプローブとハ
イブリダイゼーションした。この実験の結果を図１Ｂに
示す（レーン１、非トランスジェニック・マウスの肝臓
由来のＲＮＡ；レーン２、非トランスジェニック・マウ
スのすい臓由来のＲＮＡ：レーン３、トランスジェニッ
ク・マウスの肝臓由来のＲＮＡ；レーン４、トランスジ
ェニック・マウスのすい臓由来のＲＮＡ)。ただし、ト
ランスジェニックおよび対照マウスの両者由来のすい臓
ＲＮＡはひとインシュリンcＤＮＡプローブとハイブリ
ダイゼーションし、トランスジェニックおよび対照マウ
スの肝臓、ひ臓、脳、腎臓、心臓、腸、肺および筋肉由
来のＲＮＡはハイブリダイゼーションを示さなかった。
マウスインシュリンcＤＮＡも遺伝子配列も共に検出さ
れなかったが、ラットおよびひとインシュリンmＲＮＡ
のコード領域は８１％の配列相同性を示すため（ベル
等）、トランスジェニックおよび対照のすい臓ＲＮＡは
共にひとプローブとハイブリダイゼーションすることが
予想された。これらの結果は、ひとインシュリン遺伝子
がＢ６Ｃ３Ｆ１／ヒューミング系統のトランスジェニッ
ク・マウスのすい臓においてのみ発現され、試験された
他の組織では一切発現されないことを示した。すい臓以
外のトランスジェニック組織では検出可能なレベルのイ
ンシュリンＲＮＡの発現は見出されなかったため、トラ
ンスジェニックおよび対照の両すい臓におけるインシュ
リンの発現を試験することにより、トランスジェニック
すい臓がひとインシュリン発現部位であるか否かを調べ
た。６匹のトランスジェニック・マウスおよび６匹の対
照マウスから得られたすい臓ランゲルハンス島をコラゲ
ナーゼ消化により単離し[レイシー等、「ダイアベー
ツ」、１６、３５−３９頁(１９６７年)]、約８０−１０
０「島」細胞／組織培養ウェルの群で培養した。翌日、培
地のアリコートを採取し、ひとＣ−ペプチドレベルを測
定した。トランスジェニック・マウスのすい臓由来の
「島」細胞を含む組織培養ウェルから得られた試料は、
２５０−６５０ng／mlのひとＣ−ペプチドを含んでいた
が、対照マウスのすい臓由来の「島」細胞を含む組織培
養ウェルは検出可能なひとＣ−ペプチドを含んでいなか
った。培養されたトランスジェニック「島」細胞は数日
間ひとＣ−ペプチドの発現を続けた。これらの実験か
ら、Ｂ６Ｃ３Ｆ１／ヒューミング系統のトランスジェニ
ック・マウスにおける主なひとインシュリン発現部位
は、内分泌器官のすい臓であることが決定された。
【００４２】モルモット抗ぶたインシュリン抗体および
やぎ抗ひとＣ−ペプチド抗体を用いて、トランスジェニ
ックおよび対照のすい臓に免疫ペルオキシダーゼ染色を
行った。抗ぶたインシュリン抗体は、ひとおよびマウス
インシュリンの両方と交差反応し、トランスジェニック
・マウスおよび対照マウスの両者から得られた「島」細胞
を染色する。「島」細胞の大きさ、分布および数は、ト
ランスジェニックおよび対照の両マウスの場合と本質的
に同じであった。重要なことに、対照マウスの「島」細
胞ではなくトランスジェニック・マウスの「島」細胞の
みが抗ひとＣ−ペプチド抗体により染色された。これ
は、抗ひとＣ−ペプチド抗体がマウスＣ−ペプチドと殆
どまたは全く交差反応しないという事実を示す。免疫組
織化学データはノーザン分析および上記「島」機能試験
と一致し、Ｂ６Ｃ３Ｆ１／ヒューミング系統のトランス
ジェニック・マウスの「島」細胞がひとインシュリンを
特異的に発現していることを立証した。
やぎ抗ひとＣ−ペプチド抗体を用いて、トランスジェニ
ックおよび対照のすい臓に免疫ペルオキシダーゼ染色を
行った。抗ぶたインシュリン抗体は、ひとおよびマウス
インシュリンの両方と交差反応し、トランスジェニック
・マウスおよび対照マウスの両者から得られた「島」細胞
を染色する。「島」細胞の大きさ、分布および数は、ト
ランスジェニックおよび対照の両マウスの場合と本質的
に同じであった。重要なことに、対照マウスの「島」細
胞ではなくトランスジェニック・マウスの「島」細胞の
みが抗ひとＣ−ペプチド抗体により染色された。これ
は、抗ひとＣ−ペプチド抗体がマウスＣ−ペプチドと殆
どまたは全く交差反応しないという事実を示す。免疫組
織化学データはノーザン分析および上記「島」機能試験
と一致し、Ｂ６Ｃ３Ｆ１／ヒューミング系統のトランス
ジェニック・マウスの「島」細胞がひとインシュリンを
特異的に発現していることを立証した。
【００４３】実施例３ トランスジェニック・マウスにおけるグルコースおよび
ひとインシュリンレベルの生理学的調節の試験。 Ｂ６Ｃ３Ｆ１／ヒューミング系統のトランスジェニック
・マウスにおけるグルコースおよびひとＣ−ペプチドレ
ベルを様々な生理学的条件下で試験することにより、正
常なグルコースホメオスタシスが保たれているか否か、
およびひとインシュリン遺伝子の発現がこれらのマウス
において適当に調節されているか否かを調べた。血液グ
ルコース調節を研究するため、グルコース寛容性試験を
行った。マウス１６番のトランスジェニック子孫および
非トランスジェニックきょうだいを一夜絶食させ、グル
コースの腹腔内注射（１mg／g(体重)）を行い、注射後
様々な時点で採血して血清グルコースレベルを測定し
た。トランスジェニック・マウスによるグルコース寛容
性曲線は、対照マウスの場合と類似している（図２）。
(各マウスは、注射実施の５、１０、２０、３０、４
５、６０または９０分後のうち一時点で血清試料用とし
て任意に選ばれた(実線で示す)。４匹のマウスにはグル
コースを与えずに採血して絶食血清グルコースレベルを
測定した(点線)。市販されているキット（ベーリングベ
ルケ・アクチエン・ゲゼルシャフト、西ドイツ）を用い
て製造会社の薦める条件下で、これらのマウスの血清に
おけるひとＣ−ペプチドレベルを測定した。これらのト
ランスジェニック・マウスの血清ひとＣ−ペプチドレベ
ルを図３に実線で示す。対照マウスの場合は点線で示
す）。特に重要なのは、絶食中および最大限に刺激され
たグルコースレベル並びに基底グルコースレベルへのリ
ターン反応速度がトランスジェニックおよび対照動物の
場合と類似していることである。さらに、グルカゴンの
静脈内投与により１５分以内でトランスジェニックおよ
び対照マウスの両方における血清グルコースレベルが約
５０％増加した。結局、これらの結果は、血清グルコー
スレベルがトランスジェニック・マウスにおいて適当に
変調されることを強く示唆している。トランスジェニッ
ク・マウスの体重、成長速度、食物摂取行動、生殖能力
および長命性は正常である。
ひとインシュリンレベルの生理学的調節の試験。 Ｂ６Ｃ３Ｆ１／ヒューミング系統のトランスジェニック
・マウスにおけるグルコースおよびひとＣ−ペプチドレ
ベルを様々な生理学的条件下で試験することにより、正
常なグルコースホメオスタシスが保たれているか否か、
およびひとインシュリン遺伝子の発現がこれらのマウス
において適当に調節されているか否かを調べた。血液グ
ルコース調節を研究するため、グルコース寛容性試験を
行った。マウス１６番のトランスジェニック子孫および
非トランスジェニックきょうだいを一夜絶食させ、グル
コースの腹腔内注射（１mg／g(体重)）を行い、注射後
様々な時点で採血して血清グルコースレベルを測定し
た。トランスジェニック・マウスによるグルコース寛容
性曲線は、対照マウスの場合と類似している（図２）。
(各マウスは、注射実施の５、１０、２０、３０、４
５、６０または９０分後のうち一時点で血清試料用とし
て任意に選ばれた(実線で示す)。４匹のマウスにはグル
コースを与えずに採血して絶食血清グルコースレベルを
測定した(点線)。市販されているキット（ベーリングベ
ルケ・アクチエン・ゲゼルシャフト、西ドイツ）を用い
て製造会社の薦める条件下で、これらのマウスの血清に
おけるひとＣ−ペプチドレベルを測定した。これらのト
ランスジェニック・マウスの血清ひとＣ−ペプチドレベ
ルを図３に実線で示す。対照マウスの場合は点線で示
す）。特に重要なのは、絶食中および最大限に刺激され
たグルコースレベル並びに基底グルコースレベルへのリ
ターン反応速度がトランスジェニックおよび対照動物の
場合と類似していることである。さらに、グルカゴンの
静脈内投与により１５分以内でトランスジェニックおよ
び対照マウスの両方における血清グルコースレベルが約
５０％増加した。結局、これらの結果は、血清グルコー
スレベルがトランスジェニック・マウスにおいて適当に
変調されることを強く示唆している。トランスジェニッ
ク・マウスの体重、成長速度、食物摂取行動、生殖能力
および長命性は正常である。
【００４４】トランスジェニック・マウスでの血液グル
コースレベルの調節におけるひとインシュリンの役割に
ついては、トランスジェニックおよび対照マウスに対す
るグルコース寛容性試験を実施することにより研究した
（図４）。ひとＣ−ペプチドは、絶食トランスジェニッ
ク・マウスの血清では検出され得なかった。しかしなが
ら、グルコースの腹腔内投与後１０分以内に、ひとＣ−
ペプチドが血清に現れ、ピーク・レベルは約２０分で得
られる。グルコース注射の４５分後までに、ひとＣ−ペ
プチドレベルは刺激前または基底レベルに近い値に下が
った。ひとＣ−ペプチド発現のこのパターンは、前記グ
ルコース寛容性曲線と密接に相関し、Ｂ６Ｃ３Ｆ１／ヒ
ューミング系統のトランスジェニック・マウスでは、血
清ひとインシュリンレベルがグルコースにより適度に調
節されたことを示している。さらに、これらのデータ
は、マウスおよびひとに関して以前に報告されたグルコ
ース寛容性結果[ラーキンズ、「ダイアベーツ」、２２、
２５１−２５５頁(１９７３年)、ルーベンスタイン、
「エンドクライノロジー」、第２巻(編集者デグルート等)
９５１−９５７頁(グルーンおよびストラットン、出版
１９７９年)]と類似していた。対照マウスは検出可能な
ひとＣ−ペプチドを一切発現しなかったが、これはひと
遺伝子がトランスジェニック・マウスにおけるひとＣ−
ペプチドの供給源でなければならないことを示してい
る。
コースレベルの調節におけるひとインシュリンの役割に
ついては、トランスジェニックおよび対照マウスに対す
るグルコース寛容性試験を実施することにより研究した
（図４）。ひとＣ−ペプチドは、絶食トランスジェニッ
ク・マウスの血清では検出され得なかった。しかしなが
ら、グルコースの腹腔内投与後１０分以内に、ひとＣ−
ペプチドが血清に現れ、ピーク・レベルは約２０分で得
られる。グルコース注射の４５分後までに、ひとＣ−ペ
プチドレベルは刺激前または基底レベルに近い値に下が
った。ひとＣ−ペプチド発現のこのパターンは、前記グ
ルコース寛容性曲線と密接に相関し、Ｂ６Ｃ３Ｆ１／ヒ
ューミング系統のトランスジェニック・マウスでは、血
清ひとインシュリンレベルがグルコースにより適度に調
節されたことを示している。さらに、これらのデータ
は、マウスおよびひとに関して以前に報告されたグルコ
ース寛容性結果[ラーキンズ、「ダイアベーツ」、２２、
２５１−２５５頁(１９７３年)、ルーベンスタイン、
「エンドクライノロジー」、第２巻(編集者デグルート等)
９５１−９５７頁(グルーンおよびストラットン、出版
１９７９年)]と類似していた。対照マウスは検出可能な
ひとＣ−ペプチドを一切発現しなかったが、これはひと
遺伝子がトランスジェニック・マウスにおけるひとＣ−
ペプチドの供給源でなければならないことを示してい
る。
【００４５】インシュリンは、アミノ酸およびある種の
薬剤を含む幾つかの他の要素により調節される。静脈内
アミノ酸注入試験を絶食トランスジェニック・マウスお
よび対照マウスにおいて実施し、血清中のひとＣ−ペプ
チドレベルを測定した。ピークひとＣ−ペプチドレベル
はアミノ酸注入後５分以内に見られ、次の４０分間に亙
って徐々に下降した。Ｂ６Ｃ３Ｆ１／ヒューミング系統
のトランスジェニック・マウスおよび対照マウスを一夜
絶食させ、０.５mgのアルギニンおよび０.５mgのロイシ
ンを注入と、ひとＣ−ペプチド測定に関して定められた
時点で採血した。この実験の結果を図４に示す。各時点
は、４動物から得られた平均値を表す。実線はトランス
ジェニック・マウスから得られたデータを示す。点線は
対照マウスから得られたデータを示す。同様に、血清ひ
とＣ−ペプチドレベルは、トルブタミド、すなわちイン
シュリン放出を促すことが知られているスルホニル尿素
誘導体にも応答する[ガンダ等、「ダイアベーツ」、２
４、３５４−３６１頁(１９７５年)]。トランスジェニ
ック・マウスおよび対照マウスを一夜絶食させ、０.５m
gのトルブタミド（ジ・アップジョン・カンパニー、ミ
シガン）を注入し、ひとＣ−ペプチド測定に関して定め
られた時点で採血した（図５）。各時点は２動物から得
られた平均値を表す。トランスジェニック・マウスによ
るデータは実線で示す。対照マウスによるデータは点線
で示す。
薬剤を含む幾つかの他の要素により調節される。静脈内
アミノ酸注入試験を絶食トランスジェニック・マウスお
よび対照マウスにおいて実施し、血清中のひとＣ−ペプ
チドレベルを測定した。ピークひとＣ−ペプチドレベル
はアミノ酸注入後５分以内に見られ、次の４０分間に亙
って徐々に下降した。Ｂ６Ｃ３Ｆ１／ヒューミング系統
のトランスジェニック・マウスおよび対照マウスを一夜
絶食させ、０.５mgのアルギニンおよび０.５mgのロイシ
ンを注入と、ひとＣ−ペプチド測定に関して定められた
時点で採血した。この実験の結果を図４に示す。各時点
は、４動物から得られた平均値を表す。実線はトランス
ジェニック・マウスから得られたデータを示す。点線は
対照マウスから得られたデータを示す。同様に、血清ひ
とＣ−ペプチドレベルは、トルブタミド、すなわちイン
シュリン放出を促すことが知られているスルホニル尿素
誘導体にも応答する[ガンダ等、「ダイアベーツ」、２
４、３５４−３６１頁(１９７５年)]。トランスジェニ
ック・マウスおよび対照マウスを一夜絶食させ、０.５m
gのトルブタミド（ジ・アップジョン・カンパニー、ミ
シガン）を注入し、ひとＣ−ペプチド測定に関して定め
られた時点で採血した（図５）。各時点は２動物から得
られた平均値を表す。トランスジェニック・マウスによ
るデータは実線で示す。対照マウスによるデータは点線
で示す。
【００４６】正常対象では、血清インシュリン（または
Ｃ−ペプチド）レベルはトルブタミド誘発性ピークから
正常値に急速に戻るが、インスリノーマ患者では、高い
インシュリンレベルが維持されるため[ファジャンズ
等、「ジェイ．ラボ．クリン．メド．」、５４、８１１頁
(１９５９年)]、トルブタミドはインスリノーマの診断
に臨床的に使用されている。トルブタミドの静脈内投与
後２０分以内に、血清ひとＣ−ペプチドレベルはピーク
に達し、次の１０分間に亙って急速に低下した。
Ｃ−ペプチド）レベルはトルブタミド誘発性ピークから
正常値に急速に戻るが、インスリノーマ患者では、高い
インシュリンレベルが維持されるため[ファジャンズ
等、「ジェイ．ラボ．クリン．メド．」、５４、８１１頁
(１９５９年)]、トルブタミドはインスリノーマの診断
に臨床的に使用されている。トルブタミドの静脈内投与
後２０分以内に、血清ひとＣ−ペプチドレベルはピーク
に達し、次の１０分間に亙って急速に低下した。
【００４７】Ｂ６Ｃ３Ｆ１／ヒューミング系統のトラン
スジェニック・マウスが基底血清ひとＣ−ペプチドレベ
ルを迅速に回復するという事実は、それらのインシュリ
ン発現がしっかりと調節されたという結論を立証してい
る。上述のトルブタミドによる結果は、インシュリン薬
理学者にとって重要な含蓄を有する。現在ひとインシュ
リン合成、分泌、作用またはクリアランスに作用すると
考えられる薬剤をインビボ動物系で試験することができ
る。ひと遺伝子発現および蛋白質機能に対する様々な薬
剤のインビボ効果をひと以外の設定で評価することが可
能である。
スジェニック・マウスが基底血清ひとＣ−ペプチドレベ
ルを迅速に回復するという事実は、それらのインシュリ
ン発現がしっかりと調節されたという結論を立証してい
る。上述のトルブタミドによる結果は、インシュリン薬
理学者にとって重要な含蓄を有する。現在ひとインシュ
リン合成、分泌、作用またはクリアランスに作用すると
考えられる薬剤をインビボ動物系で試験することができ
る。ひと遺伝子発現および蛋白質機能に対する様々な薬
剤のインビボ効果をひと以外の設定で評価することが可
能である。
【００４８】この発明についてその実施態様と関連させ
て記載したが、さらに修正が可能であること、および、
総じて発明の原理に従い、この発明が属し、前述の本質
的特徴に該当し得、後記請求の範囲に従う当技術分野内
における周知または慣用的実践範囲内に入るこの開示か
らの新たな進展を含めて、この発明の変形、用途または
適用が全てこの出願に包含されるべきであることは明ら
かである。
て記載したが、さらに修正が可能であること、および、
総じて発明の原理に従い、この発明が属し、前述の本質
的特徴に該当し得、後記請求の範囲に従う当技術分野内
における周知または慣用的実践範囲内に入るこの開示か
らの新たな進展を含めて、この発明の変形、用途または
適用が全てこの出願に包含されるべきであることは明ら
かである。
【図１】 図１Ａは、トランスジェニック・マウスの染
色体ＤＮＡ内のひとインシュリン遺伝子配列の存在を示
す電気泳動図である。図１Ｂは、トランスジェニックお
よび対照マウスの組織におけるひとおよびマウスインシ
ュリンmＲＮＡの存在を示す電気泳動図である。
色体ＤＮＡ内のひとインシュリン遺伝子配列の存在を示
す電気泳動図である。図１Ｂは、トランスジェニックお
よび対照マウスの組織におけるひとおよびマウスインシ
ュリンmＲＮＡの存在を示す電気泳動図である。
【図２】 図２は、グルコース腹腔内注射後のトランス
ジェニックおよび対照マウスにおける血清グルコースレ
ベルを示す。
ジェニックおよび対照マウスにおける血清グルコースレ
ベルを示す。
【図３】 図３は、トランスジェニックおよび対照マウ
スに対する静脈内アミノ酸寛容性試験中におけるひとＣ
−ペプチドレベルを示す。
スに対する静脈内アミノ酸寛容性試験中におけるひとＣ
−ペプチドレベルを示す。
【図４】 図４は、トランスジェニックおよび対照マウ
スに対する腹腔内グルコース寛容性試験中におけるひと
Ｃ−ペプチドレベルを示す。
スに対する腹腔内グルコース寛容性試験中におけるひと
Ｃ−ペプチドレベルを示す。
【図５】 図５は、トランスジェニックおよび対照マウ
スに対する静脈内トルブタミド注入試験中におけるひと
Ｃ−ペプチドレベルを示す。
スに対する静脈内トルブタミド注入試験中におけるひと
Ｃ−ペプチドレベルを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (20)
- 【請求項１】 自然調節されたトランスジーン（transg
ene）によりコードされているひと蛋白質の発現または
レベルに対する薬剤の効果を評価する方法であって、 (a)その細胞が前記蛋白質をコードするトランスジーン
を含んでいる、非ひとトランスジェニック哺乳動物に前
記薬剤を与え、 (b)当該動物における前記蛋白質の発現またはレベルを
モニターすることにより、当該発現またはレベルに対す
る前記薬剤の効果を試験することを含む方法。 - 【請求項２】 薬剤が医薬的試剤である、請求項１に記
載の方法。 - 【請求項３】 非ひとトランスジェニック哺乳動物が齧
歯類である、請求項１〜２のいずれかに記載の方法。 - 【請求項４】 ひと蛋白質がポリペプチドである、請求
項１〜３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】 ひと蛋白質がひとホルモンまたはその類
似物である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項６】 蛋白質がヒトプレプロインシュリン、プ
ロインシュリンおよびインシュリンから選択された異種
（heterologous）蛋白質であり、薬剤が医薬的、薬理学
的または治療的試剤である、請求項１〜５のいずれかに
記載の方法。 - 【請求項７】 薬剤がインシュリンの合成、分泌、活性
またはクリアランスに影響を及ぼすものである、請求項
６に記載の方法。 - 【請求項８】 薬剤がスルホニルウレアインシュリン放
出プロモータである、請求項６〜は７に記載の方法。 - 【請求項９】 ランスジーンが哺乳動物の膵臓の島細胞
においてのみ発現される、請求項６〜８のいずれかに記
載の方法。 - 【請求項１０】 トランスジーンがプロインシュリンイ
ン、次いでインシュリンに変換され得るプレプロインシ
ュリンをコードするものであり、当該インシュリンが動
物の循環系へ自然に分泌されるものである、請求項９に
記載の方法。 - 【請求項１１】 トランスジーンによってコードされる
異種蛋白質が自然に処理され、インシュリン発現レベル
が通常見いだされる生理学的範囲内にある、請求項６〜
１０のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１２】 膵臓細胞におけるＣ−ペプチドのレベ
ルが２５０から６５０ng／mlである、請求項１１に記載
の方法。 - 【請求項１３】 インシュリン発現作用因子の存在がプ
レプロインシュリン、プロインシュリンおよびインシュ
リンの量および濃度をひとの場合と実質的に同様な方法
で変化させる原因となる、請求項６〜１２のいずれかに
記載の方法。 - 【請求項１４】 非ひとトランスジェニック哺乳動物が
マウスである、請求項６〜１３のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項１５】 トランスジェニック哺乳動物がＢ６Ｃ
３ＤＦ１／ヒューミング系に由来するマウスである、請
求項６〜１４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１６】 自然調節されたトランスジーンにより
コードされているひと蛋白質の発現またはレベルに対す
る薬剤の効果を評価する方法であって、 (a)その細胞が前記蛋白質をコードするトランスジーン
を含んでいる、非ひとトランスジェニック哺乳動物に前
記薬剤を与え、 (b)当該動物における前記蛋白質の発現またはレベルを
モニターすることにより、当該発現またはレベルに対す
る前記薬剤の効果を試験することを含む方法において使
用される、非ひとトランスジェニック哺乳動物。 - 【請求項１７】 薬剤が医薬的試剤である、請求項１６
に記載の動物。 - 【請求項１８】 非ひとトランスジェニック哺乳動物が
齧歯類である、請求項１６〜１７のいずれかに記載の動
物。 - 【請求項１９】 ひと蛋白質がポリペプチドである、請
求項１６〜１８のいずれかに記載の動物。 - 【請求項２０】 ひと蛋白質がひとホルモンまたはその
類似物である、請求項１６〜１９のいずれかに記載の動
物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US86512086A | 1986-05-20 | 1986-05-20 | |
| US865120 | 1986-05-20 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62503395A Division JPH01502716A (ja) | 1986-05-20 | 1987-05-20 | ひとインシュリン遺伝子を含むトランスジェニック・マウス |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10108587A true JPH10108587A (ja) | 1998-04-28 |
Family
ID=25344768
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62503395A Pending JPH01502716A (ja) | 1986-05-20 | 1987-05-20 | ひとインシュリン遺伝子を含むトランスジェニック・マウス |
| JP9181034A Pending JPH10108587A (ja) | 1986-05-20 | 1997-07-07 | ひとインシュリン遺伝子を含むトランスジェニック・マウス |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62503395A Pending JPH01502716A (ja) | 1986-05-20 | 1987-05-20 | ひとインシュリン遺伝子を含むトランスジェニック・マウス |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6018097A (ja) |
| EP (2) | EP0247494B1 (ja) |
| JP (2) | JPH01502716A (ja) |
| AT (2) | ATE140846T1 (ja) |
| DE (2) | DE3752347T2 (ja) |
| ES (2) | ES2171401T3 (ja) |
| GR (1) | GR3021288T3 (ja) |
| WO (1) | WO1987007298A1 (ja) |
Families Citing this family (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4873316A (en) * | 1987-06-23 | 1989-10-10 | Biogen, Inc. | Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals |
| EP0370813A3 (en) * | 1988-11-25 | 1991-06-19 | Exemplar Corporation | Rapid screening mutagenesis and teratogenesis assay |
| FR2646438B1 (fr) * | 1989-03-20 | 2007-11-02 | Pasteur Institut | Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration |
| US6689610B1 (en) | 1989-08-22 | 2004-02-10 | University Of Utah Research Foundation | Cells and non-human organisms containing predetermined genomic modifications and positive-negative selection methods and vectors for making same |
| US5464764A (en) * | 1989-08-22 | 1995-11-07 | University Of Utah Research Foundation | Positive-negative selection methods and vectors |
| GB9003791D0 (en) * | 1990-02-20 | 1990-04-18 | Ludwig Inst Cancer Res | Transgenic animals,cell lines therefrom,and their use |
| US5744327A (en) * | 1990-02-20 | 1998-04-28 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods for producing insulin in response to non-glucose secretagogues |
| US5427940A (en) * | 1991-06-03 | 1995-06-27 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Engineered cells producing insulin in response to glucose |
| US5648597A (en) * | 1990-04-20 | 1997-07-15 | University Of South Carolina | Alpha-1-acid glycoprotein transgenic mice |
| US5614396A (en) * | 1990-06-14 | 1997-03-25 | Baylor College Of Medicine | Methods for the genetic modification of endogenous genes in animal cells by homologous recombination |
| US5569824A (en) * | 1991-01-04 | 1996-10-29 | Baylor College Of Medicine | Transgenic mice containing a disrupted p53 gene |
| US5866759A (en) * | 1991-02-20 | 1999-02-02 | Ludwig Institute For Cancer Research | Transgenic mice expressing TSSV40 large T antigen |
| US5792656A (en) * | 1991-06-03 | 1998-08-11 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods of preparing genetically engineered cells that produce insulin in response to glucose |
| DE4126968A1 (de) * | 1991-08-14 | 1993-02-18 | Detlev Prof Dr Med Ganten | Transgene ratten, die in ihrem genom mindestens ein menschliches gen enthalten, das an der blutdruckregulation beteiligt ist |
| WO1993004171A1 (en) * | 1991-08-19 | 1993-03-04 | Symbicom Aktiebolag | Human beta-casein, process for producing it and use thereof |
| DK8892D0 (da) | 1992-01-23 | 1992-01-23 | Symbicom Ab | Humant proteingen |
| US5602307A (en) * | 1992-08-12 | 1997-02-11 | Baylor College Of Medicine | Non-human animal having predefined allele of a cellular adhesion gene |
| ATE221575T1 (de) * | 1993-05-10 | 2002-08-15 | Univ Michigan | Gentransfer zu den pankreatischen epithelzellen |
| US6310034B1 (en) | 1993-05-21 | 2001-10-30 | Ut-Battelle, Llc | Agouti polypeptide compositions |
| US5789651A (en) * | 1993-05-21 | 1998-08-04 | Martin Marietta Energy Systems, Inc. | Isolation and characterization of Agouti: a diabetes/obesity related gene |
| US5907080A (en) * | 1995-11-30 | 1999-05-25 | Nexia Biotechnologies, Inc. | Method for development of transgenic dwarf goats |
| US5891717A (en) * | 1996-01-19 | 1999-04-06 | Betagene, Inc. | Methods and compositions for inhibiting hexokinase |
| US5854067A (en) * | 1996-01-19 | 1998-12-29 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Hexokinase inhibitors |
| US6077697A (en) | 1996-04-10 | 2000-06-20 | Chromos Molecular Systems, Inc. | Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes |
| US20030033617A1 (en) | 1996-04-10 | 2003-02-13 | Gyula Hadlaczky | Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes |
| US20030013081A1 (en) | 2001-06-26 | 2003-01-16 | Olson William C. | Uses of DC-SIGN and DC-SIGNR for inhibiting hepatitis C virus infection |
| US20090214482A1 (en) * | 2005-04-13 | 2009-08-27 | Ximerex, Inc. | Transgenic Mammals Expressing Human Preproinsulin |
| WO2014209553A1 (en) | 2013-06-04 | 2014-12-31 | Virginia Commonwealth University | Use of a truncated ccn1 promoter for cancer diagnostics, therapeutics and theranostics |
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| US4564517A (en) * | 1984-02-22 | 1986-01-14 | Fudenberg Herman H | Method for evaluating parameters related to the therapeutic and/or prophylactic treatment of solid neoplasms in humans |
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