ES2219670T3 - Utilizacion de compuestos de pirazola para el tratamiento de la glomerulonefritis, cancer, ateroesclerosis o restenosis. - Google Patents

Abstract

SE MUESTRA UN METODO PARA INHIBIR SELECTIVAMENTE UNA QUINASA, QUE SUPONE LA PUESTA EN CONTACTO DE UNA COMPOSICION QUE CONTIENE UNA QUINASA CON UN COMPUESTO DE LA FORMULA (I), DONDE: R{SUB,1} ES ALQUIL REBAJADO, HIDROCARBIL REBAJADO , ALQUIL REBAJADO CON ARIL, ALQUIL REBAJADO CON HETEROARIL, CARBONIL POLIAROMATICO, POLIAROMATICO, AROMATICO HETEROCICLICO DE 5- O 6- ELEMENTOS, CARBONIL POLIHETEROAROMATICO O POLIHETEROAROMATICO; R{SUB,2} ES ALQUIL REBAJADO, HIDROCARBIL REBAJADO, ALQUIL REBAJADO CON ARIL, ALQUIL REBAJADO CON HETEROARIL, HIDROCARBOIL REBAJADO, AROMATICO HETEROCICLICO DE 5- 0 6 ELEMENTOS, HIDROCARBOIL REBAJADO, CARBONIL AROMATICO HETEROCICLICO DE 5- O 6- ELEMENTOS, POLIAROMATICO O POLIHETEROAROMATICO; R{SUB,3} ES H O ALQUIL REBAJADO; R{SUB,5}ES H, ALQUIL REBAJADO, HIDROCARBIL REBAJADO, ALQUIL REBAJADO CON ARIL, ALQUIL REBAJADO CON HETEROARIL, UN AROMATICO HETEROCICLIOCO DE 5- O 6- ELEMENTOS, HALOGENO, O CIANO; Y R{SUB,6} ES H O HIDROCARBOIL REBAJADO.

Description

Utilización de compuestos de pirazola para el tratamiento de la glomerulonefritis, cáncer, ateroesclerosis o restenosis.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a pirazoles y a usos recientemente descubiertos de pirazoles como inhibidores de proteína quinasas, especialmente tirosina quinasas, como reactivos en el análisis de quinasas y sus substratos, y como composiciones farmacéuticas útiles en la inhibición de procesos dependientes de quinasas, tales como el crecimiento celular.

Antecedentes de la invención

Las proteína quinasas específicas de tirosina (tirosina quinasas) representan una familia de enzimas que catalizan las transferencia del fosfato terminal del trifosfato de adenosina a residuos de tirosina en sustratos de proteína. Los primeros miembros de esta clase en ser identificados fueron tirosina quinasas asociadas con genes víricos (denominados oncogenes), que eran capaces de transformación celular (por ejemplo, pp60v-src y pp98v-fps). Después, se demostró que habían contrapartes celulares normales (es decir, pp60c-src y pp98c-fps) a estos productos genéticos víricos. Una tercera categoría de tirosina quinasas en ser identificados son aquellos denominados receptores del factor de crecimiento, los cuales incluyen insulina, factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF), factor de crecimiento de fibroblasto (FGF) y receptores p185HER-2. Se piensa que todas estas tirosina quinasas, mediante fosforilación del sustrato, juegan un papel crítico en la transducción de señal para varias funciones celulares.

Aunque aún no se han elucidado los mecanismos exactos de la transducción de señal, se ha demostrado que las tirosina quinasas son factores importantes que participan en la proliferación celular, la carcinogénesis y la diferenciación celular.

La replicación celular puede desencadenarse mediante la exposición de las células a uno o más factores de crecimiento, ejemplos de los cuales son FGF, EGF y PDGF. Dichos factores de crecimiento interaccionan específicamente con sus correspondientes receptores, cuyos receptores comprenden un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico que posee la actividad enzimática de la tirosina quinasa. Se piensa que el inicio de la proliferación celular tiene lugar cuando un factor de crecimiento se une al dominio extracelular de su receptor en la superficie celular. Esta unión del receptor con el factor de crecimiento induce la dimerización del receptor que resulta en la autofosforilación del receptor, un aumento en la actividad enzimática del receptor y la fosforilación del sustrato. Recientemente se ha identificado una vía común para la señalización de la superficie celular al núcleo, y se ha demostrado que es utilizada por los receptores del factor de crecimiento de la tirosina quinasa. Esta vía implica la activación mediada por el factor de crecimiento de la proteína ras que inicia una cascada de proteína quinasa que lleva a la fosforilación de los factores de transcripción que regulan la expresión de genes que participan en la división celular.

La autofosforilación del receptor y la fosforilación de sustratos intracelulares son eventos bioquímicos que se requieren para la señalización del factor de crecimiento y la proliferación celular. Esto se ha demostrado mediante la eliminación de la actividad de la proteína tirosina quinasa de varios receptores, incluyendo el receptor EGF (EGFR), el receptor FGF (FGFR) y el receptor PDGF (PDGFR) mediante mutagénesis dirigida al sitio que resulta en la pérdida completa de la actividad biológica de los receptores. Asimismo, inhibidores de proteína quinasa como la staurosporina, K252a y las tirfostina, que bloquean la actividad enzimática de la tirosina quinasa del receptor, previenen la señalización intracelular y la proliferación celular. Estos estudios confirman la función esencial de la fosforilación de la tirosina en la señalización mediante receptores del factor de crecimiento, y demuestran que se pueden utilizar compuestos que inhiban la actividad de la tirosina quinasa para regular la proliferación celular.

Muchos estados de enfermedad se caracterizan por proliferación celular no controlada. Estas enfermedades abarcan varios tipos de células e incluyen trastornos como cáncer, psoriasis, fibrosis pulmonar, glomerulonefritis, aterosclerosis y restenosis después de angioplastia. La utilidad de los inhibidores de tirosina quinasa para el tratamiento de dichos trastornos se ha demostrado en varios estudios in vivo. Se ha demostrado que inhibidores de la tirosina quinasa con selectividad para la familia EGFR bloquean la formación de tumores en animales, demostrando así su utilidad potencial para suprimir directamente el crecimiento de células tumorales en el tratamiento del cáncer humano, especialmente el carcinoma de mama. Se ha demostrado también que la metástasis tumorosa y su antiogénesis asociada son inhibidas al prevenir la activación de la tirosina quinasa del receptor del factor de crecimiento endotelial vascular, lo cual indica una utilidad de los inhibidores de la tirosina quinasa en el bloqueo de eventos separados que ocurren durante la carcinogénesis.

En modelos experimentales de glomerulonefritis se asocia un aumento de 20 veces la expresión del receptor PDGF con la proliferación de células mesangiales. La neutralización de PDGF que previene la activación de su receptor de tirosina quinasa, limita al grado de degeneración renal que sucede normalmente. Estos estudios demuestran que un inhibidor de tirosina quinasa que bloqueara al receptor PDGF podría tener potencial para el tratamiento de la glomerulonefritis humana.

Un problema importante aún no resuelto de la cardiología de intervención es la restenosis seguida de una angioplastia coronaria. De las casi 400.000 angioplástias que se realizan comúnmente en los Estados Unidos cada año, del 30 al 40% de ellas fracasan dentro del primer año debido a la restenosis. El proceso de restenosis implica la reoclusión de una arteria aterosclerótica que en muchos casos se debe a la proliferación de células de músculo liso, que es mediada por factores de crecimiento como PDGF y FGF. En modelos de restenosis en animales, anticuerpos que bloquean la activación de la actividad de tirosina quinasa del receptor PDGF o FGF, previenen la proliferación de células de músculo liso y la formación de la neoíntima. Estos estudios indican que los inhibidores de tirosina quinasa que bloquean el funcionamiento del receptor PDGF o FGF podrían tener utilidad en el tratamiento de la restenosis humana.

Actualmente, la quimioterapia del cáncer hace uso de inhibidores de la síntesis del ADN (por ejemplo, adriamicina, fluorouracilo) y compuestos que rompen el citoesqueleto (vinblastina). Estos compuestos son altamente tóxicos, ya que su actividad inhibidora no se limita a células cancerosas, con la distinción, sin embargo, de que las células tumorales son atacadas más fácilmente por los inhibidores antedichos, debido a que estas células se dividen más rápidamente y el metabolismo de su ADN es, en consecuencia, más activo. Unos pocos tipos de cáncer son tratados con derivados de hormonas específicas. Estos casos, sin embargo, son la excepción y el tratamiento quimioterapéutico para la mayoría de los diferentes tipos de cáncer es inespecífico.

A principios de la década de 1980, fue evidente que del 20 al 30% de los cánceres expresan productos oncogénicos característicos que son receptores del factor de crecimiento o sus homólogos mutados, y que exhiben actividad proteica de tirosina quinasa (PTK). La actividad de PTK es intrínseca al receptor o su oncogeno homólogo e influye en la proliferación celular mediante su dominio PTK. Además, cada uno de estos receptores (normales o mutados) exhibe una actividad de PTK característica con una especificidad distinta por el sustrato. Uno de estos receptores es EGFR y su homólogo oncogénico V-ERB-B.

Como resultado de los desarrollos anteriormente descritos respecto a la actividad PTK de los receptores del factor de crecimiento, que ha propuesto tratar el cáncer por medio de varias sustancias químicas capaces de inhibir la actividad PTK de EGF. Véase, por ejemplo, las patentes Japonesas Nos. 62-39523, 62-39558, 62-42923 y 62-42925. Por ejemplo, la patente japonesa referida y expuesta No. SHO 62-39558 describe a la alfa-ciano-2,5-dihidroxicinamamida como el compuesto activo en composiciones eficaces como inhibidores de PTK.

La utilización de cinamamil malononitrilo y varios compuestos de malononitrilo de bencilideno como inhibidores del crecimiento tumoral, se describe en Gal y otros, Studies on the Biological Actino of Malononitriles. I. The Effect of Substituted Malononitriles on the Growth of Transplanted Tumors in Mice, Cancer Research, 12:565-72, 1952.

Yoshida y otros, Solicitud de patente japonesa No. 49100080 describen derivados de 3-aminopirazol que se dice tienen efectos antiinflamatorios y analgésicos.

Breve descripción de la invención

Por lo tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar utilizaciones adicionales para viejas composiciones y proporcionar nuevas pirazolas útiles como inhibidores de proteína quinasas.

Estos y otros objetos de la invención se han cumplido mediante la proporción de procedimientos y utilizaciones según se definen en las reivindicaciones.

Los grupos alquilo, hidrocarbilo, arilalquilo, heteroarilalquilo, hidrocarboilo, heterocíclico aromático, poliaromático y poliheteraromático de los compuestos de fórmula (I) se pueden sustituir con diferentes sustituyentes, según se discute en detalle más abajo.

En la presente invención, "mamífero" tiene el significado habitual e incluye humanos junto con otros mamíferos. Utilizaciones farmacéuticas tienen la intención de incluir utilizaciones veterinarias, especialmente utilización en animales domésticos como ganado, ovejas, cerdos, cabras, perros, gatos, conejos, hámsters, jerbos, ratas y ratones.

Otras características y ventajas serán evidentes a partir de la descripción y las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La invención se entenderá mejor con referencia a la siguiente descripción detallada, en combinación con las figuras que forman parte de esta descripción, en donde:

La Figura 1 muestra el efecto del compuesto 1 sobre la inhibición de fosforilación en células HR5-\betaR.

La Figura 2 muestra el efecto del compuesto 1 sobre la actividad mitogénica en células 32D-\alphaR.

Descripción de modalidades especificas

La presente invención está dirigida a un nuevo uso de pirazoles sustituidos, algunos de los cuales son compuestos conocidos anteriormente, y algunos de los cuales son compuestos nuevos. Estos pirazoles son preferiblemente pirazoles 3,5-disustituidos o pirazoles 3,4,5-trisustituidos. Un compuesto preferido útil en los procedimientos de la invención tiene un substituyente de fenilcarboxamida en la posición 3 del anillo de pirazol y un substituyente fenilo en la posición 5. Muchos compuestos de esta clase son conocidos, pero no se ha sabido anteriormente que tengan actividad como inhibidores de quinasa.

En general, los compuestos útiles en las utilizaciones de esta invención tienen la fórmula I:

1

en donde:

R_{1} es alquilo inferior, hidrocarbilo inferior, arilalquilo inferior, heteroarilalquilo inferior, aromático heterocíclico de 5 ó 6 miembros, poliaromático o poliheteroaromático;

R_{2} es alquilo inferior, hidrocarbilo inferior, arilalquilo inferior, heteroarilalquili inferior, aromático heterocíclico de 5 ó 6 miembros, hidrocarboilo inferior, carbonilo aromático heterocílico de 5 ó 6 miembros, poliaromático, carbonilo poliaromático, poliheteroaromático o carbonilo poliheteroaromático;

R_{3} es H o alquilo inferior;

R_{5} es H, alquilo inferior, hidrocarbilo inferior, arilalquilo inferior, heteroarilalquilo inferior, aromático heterocíclico de 5 ó 6 miembros, halógeno o ciano; y

R_{6} es H o hidrocarboilo inferior.

Incluidos dentro de estas definiciones están los grupos alguilo, hidrocarbilo, arilalquilo, heteroarilalquilo, hidrocarboilo, aromático heterocíclico, poliaromático y poliheteroaromático que están sustituidos independientemente con (es decir, un hidrógeno o hidrógenos son reemplazados con) hasta 4 grupos R_{4} (preferiblemente no más de 3, preferiblemente no más de 2, sobre cualquiera de uno de los tres grupos R en la fórmula), en donde cada R_{4} representa independientemente halógeno, ciano, nitro, alquilo inferior (el cual da simplemente otro grupo hidrocarbilo), hidroxilo, alcoxilo, carbonilo, carboxilo, amino, alquilamino, dialquilamino, o hidrocarboilamido.

Se ha descubierto ahora que estos compuestos y composiciones farmacéuticas que los contienen pueden utilizarse para unirse con dominios de quinasa e inhibir la actividad de la quinasa. Dichas utilizaciones se describen, a continuación, con más detalle.

Descripción de términos

Como se utilizaron anteriormente y se utilizan a lo largo de la descripción, debe entenderse que los siguientes términos, a menos que se indique otra cosa, tienen los siguientes significados:

"Alquilo" significa un hidrocarburo alifático saturado que puede ser de cadena lineal o ramificada, conteniendo aproximadamente 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono.

"Alquilo inferior" significa un grupo alquilo como anteriormente, que tiene de 1 lineal a 4 átomos de carbono, que puede ser de cadena lineal o ramificada, tal como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo o terc-butilo. Grupos alquilo halogenados, particularmente grupos alguilo fluorados, tales como CF_{3}. CH_{2}CF_{3}. y CF_{2}CF_{3}. se incluyen dentro de la definición de grupos alquilo.

"Arilalquilo inferior" y "heteroarilalquilo inferior" significan un "alquilo inferior" como se describió previamente, unido a un grupo arilo o heteroarilo, respectivamente. El término "arilo" se refiere a un anillo aromático no sustituido o sustituido, sustituido con uno, dos, tres o cuatro substituyentes R_{4}. Los grupos arilo preferidos incluyen fenilo, fenantrenilo, naftacenilo, y heterocíclicos aromáticos. El término "heteroarilo" utilizado en la presente se refiere a cualquier grupo arilo, que contiene de uno a cuatro heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre.

"Alcoxi" significa un grupo alguil-oxi, en el cual "alquilo" es como se describió anteriormente. Se prefieren grupos alcoxi inferiores. Ejemplos de estos grupos incluyen metoxi, etoxi, n-propoxi, i-propoxi y n-butoxi.

"Hidrocarbilo" significa un radical orgánico derivado de una molécula de hidrocarburo por eliminación de uno de sus átomos de hidrógeno. Grupos hidrocarbilo incluyen tanto hidrocarburos alifáticos como aromáticos. Los hidrocarburos alifáticos pueden ser saturados o insaturados, de cadena lineal o ramificada. El grupo hidrocarbilo aromátido preferido es el fenilo, un aromático carbocíclico. "Hidrocarbilo inferior" se refiere a 6 o menos átomos de carbono alifáticos o un anillo fenilo.

"Hidrocarboilo" significa un radical orgánico derivado de un ácido orgánico, es decir, un ácido carboxílico, o ácido sufónico, mediante la eliminación de su grupo hidroxilo ácido. Grupos hidrocarboilo preferidos son grupos alquilo inferiores de ácido carboxílico, tales como acetilo y propionilo. Se prefiere también benzoilo. "Hidrocarboilo inferior" se refiere a 6 o menos átomos de carbono alifáticos o un anillo de fenilo, no contando el carbono de carbonilo mediante el cual ocurre el enlace del radical al resto de la molécula. Un símbolo "\varnothing" se usa para representar un anillo de fenilo en algunas formulaciones en esta descripción. Son menos preferidos los compuestos formados a partir de ácidos sulfónicos, pero están incluidos dentro del significado de hidrocarboilo, en cuyo caso todas las partes del radical son carbono o hidrógeno diferentes del grupo sulfonilo, a menos que el compuesto sea un hidrocarboilo sustituido, como se definió en otra parte. Entre los ejemplos se encuentra un grupo bencensulfonilo.

Hidrocarbilo o hidrocarboilo "sustituido" significa un hidrocarbilo o hidrocarboilo en el cual se ha reemplazado un átomo de hidrógeno o un grupo de átomos de hidrógeno por un substituyente de manera que el compuesto resultante sea estable a una concentración de 0,01 M en agua (conteniendo hasta un 10% de etanol para aumentar la solubilidad, si fuera necesario) durante 1 hora (medida típicamente a 37ºC, pH 7,4). Los substituyentes preferidos son halógeno, alquilo inferior (que da simplemente otro grupo hidrocarbilo), hidroxilo, alcoxilo, carbonilo, amino, alquilamino, dialquilamino, o hidrocarboilamido. Los substituyentes adicionales más preferibles en grupos hidrocarbilo e hidrocarboilo aromáticos que en los grupos alifáticos incluyen el nitro.

"Halo" significa un átomo de halógeno. Halógenos preferidos incluyen cloruro, bromo y flúor.

"Anillo aromático heterocíclico" se refiere a un anillo de 5 ó 6 miembros que contiene átomos de carbono y uno o más átomos de N, O, o S y un sistema de enlace pi conjugado deslocalizado de 6 electrones. Dicho anillo aromático heterocíclido puede reemplazar un anillo de fenilo en cualquiera de las estructuras descritas en la presente. Anillos aromáticos heterocíclicos preferidos son furano, tiofeno, pirrol, pirazol, triazol, imidazol, oxazol, isoxazol, tiazol, isotiazol, piridina, pirimidina, piridazina, pirazina, y triazina; son grupos especialmente preferidos el furano, tiofeno, pirrol, tiazol y piridina. "Carbonilo aromático heterocíclico" se refiere a un anillo aromático heterocíclico unido a un carbonilo. La unión ocurre preferiblemente mediante un carbono del anillo aromático tal como son 2-furilcarbonilo y 2-tiofenilcarbonilo.

"Poliaromático" y "poliheteroaromático" se refiere a sistemas de anillo múltiple, preferiblemente los sistemas que contienen dos anillos. Los términos están destinados a cubrir tanto radicales de anillo como naftilo y quinolino, como radicales de anillo no fusionados tales como bifenilo. "Carbonilo poliaromático" y "carbonilo poliheteroaromático" se refieren a un grupo "pliaromático" y "poliheteroaromático" unido a un carbonilo.

Estructura de los compuestos preferidos de fórmula I

Un grupo preferido de compuestos de fórmula (I) tiene los siguientes substituyentes: R_{1} es alquilo inferior, hidrocarbilo inferior, o aromático heterocíclico de 5 ó 6 miembros; R_{2} es alquilo inferior, hidrocarbilo inferior, aromático heterocíclico de 5 ó 6 miembros, hidrocarboilo inferior, o carbonilo aromático heterocíclico de 5 ó 6 miembros; R_{3} es H o alquilo inferior; R_{5} es H, alquilo inferior, halógeno, o ciano; y R_{6} es H o hidrocarboilo inferior.

Otro grupo preferido de compuestos de fórmula (I) tiene los siguientes substituyentes: R_{1} es hidrocarbilo inferior o aromático heterocíclico de 5 ó 6 miembros; R_{2} es hidrocarboilo inferior o carbonilo aromático heterocíclido de 5 ó 6 miembros; R_{3} es H o alquilo inferior; R_{5} es H; y R_{6} es H o alguilocarbonilo inferior.

Los compuestos preferidos incluyen aquellos en donde R_{1} es un hidrocarbilo inferior o un aromático heterocíclico de 5 ó 6 miembros, y está sustituido opcionalmente con hasta 4 grupos R_{4}. Compuestos incluso más preferidos incluyen aquellos en los cuales R_{1} es un aromático carbocíclico, tal como fenilo o fenilo subsituido o un aromático heterocíclico de 5 miembros tal como tienilo. El grupo R_{1} más preferido es fenilo o fenilo sustituido.

Los compuestos preferidos incluyen aquellos en donde R_{2} es un hidrocarboilo inferior, o un carbonilo aromático heterocíclico de 5 ó 6 miembros, y está sustituido opcionalmente con hasta 4 grupos R_{4}. Compuestos incluso más preferidos incluyen aquellos en los cuales R_{2} es un hidrocarboilo inferior tal como un carbonilo aromático carbocíclico, preferiblemente un fenilcarbonilo o un fenilcarbonilo sustituido. Los substituyentes preferidos incluyen grupos nitro y amino. También se prefieren los compuestos en donde R_{2} es un carbonilo aromático heterocíclico de 6 miembros tal como nicotinoilo o isonicotinoilo. Compuestos más preferidos son aquellos en donde R_{2} es fenilcarbonilo (es decir benzoílo) o fenilcarbonilo sustituido. Los substituyentes R_{2} particularmente preferidos son aquellos que contienen un fenilcarbonilo o un fenilcarbonilo sustituido con un substituyente donador de electrones o neutro electrónicamente (en relación al H del grupo fenilo), especialmente substituyentes alquilo o alcoxilo.

Los compuestos preferidos incluyen aquellos en donde R_{3} es H.

Los compuestos preferidos incluyen aquellos en los que R_{5} es H, alquilo inferior, halógeno o ciano, sujeto a las limitaciones de substitución explicadas anteriormente. Compuestos incluso más preferidos incluyen aquellos en donde R_{5} es H.

Compuestos preferidos incluyen aquellos en donde R_{6} es H.

Las estructuras identificadas de los compuestos de fórmula (I) se indican en la tabla de más abajo. El compuesto 1, un compuesto preferido en donde R_{1} es fenilo, R_{2} es benzoilo, y R_{3}, R_{5} y R_{6} son H, se utilizó en el trabajo experimental descrito con detalle en la sección de ejemplos de esta descripción.

TABLA 1A

2

En la tabla 1A se usan las siguientes abreviaturas: Me-metilo; Et-etilo; nPr-n-propilo; iPr-isopropilo; nBu-n-butilo; tBu-tercbutilo; nPn-neo-pentilo (2,2-dimetilpropilo); iBu-isobutilo; MeCO-acetilo; (los demás derivados de acilo nombrados de la misma manera); \varnothing-fenilo.

La siguiente tabla indica los compuestos fórmula (I) que fueron sintetizados de manera similar a la descrita en el ejemplo 3. Los substituyentes R_{1}-R_{6} en estos compuestos son ilustrativos de los substituyentes que son adecuados para utilizarse en la presente invención y no están diseñados para ser limitantes.

Se evaluaron sus actividades de manera similar a la descrita en el Ejemplo 1. Todos estos compuestos inhibieron la actividad de proteína quinasa de los \alphaPDGFR y \betaPDGFR. Los acilamino-pirazoles aromáticos y heteroaromáticos, ambos, tanto sustituidos como no sustituidos, en donde R_{3}, R_{5} y R_{6} son H, exhibieron las mejores actividades: compuestos 37-42, 45 y 46.

TABLA 1B

3

En la tabla 1B se utilizaron las siguientes abreviaturas: Me-metilo; iPr-isopropilo; MeCO-acelito (los demás derivados de acilo nombrados de la misma manera), \varnothingtBu-\varnothing-terc-butilo y \varnothing-fenilo.

Preparación y producción de los compuestos

Muchos compuestos de la clase de aminopirazol útiles en la presente invención son bien conocidos, estando descrita la síntesis de varios compuestos en la literatura científica durante 30 años. Existe algo de confusión potencial sobre la nomenclatura en la literatura, lo cual no debería ocasionar problemas a ningún experto en la materia. Esto se presenta debido a la naturaleza simétrica del anillo de pirazol, puesto que cualquiera de los dos nitrógenos se puede considerar como el punto de partida para la enumeración de los átomos del anillo. En las fórmulas anteriores y a lo largo de esta solicitud, los compuestos son nombrados de manera coherente para que el substituyente amino aparezca sobre el carbono designado "3" en la numeración del anillo de pirazol. Sin embargo, sería igualmente satisfactorio numerar el anillo en la dirección contraria de manera que el substituyente amino aparezca en el carbono 5 y el otro substituyente aparezca en el carbono 3. De esta manera, parte de la literatura científica se refiere a 3-aminopirazoles y parte a 5-aminopirazoles, significando al mismo tiempo el mismo compuesto o compuestos. Sin embargo, la utilización de la nomenclatura en una sola publicación es coherente, y no hay una confusión total en la literatura una vez que este rasgo de nomenclatura se entienda.

Los 3-aminopirazoles utilizados en los procedimientos de la invención pueden prepararse y modificarse mediante técnicas conocidas, ya que muchos de estos compuestos ya son conocidos para otros usos. El mismo 3-aminopirazol se encuentra disponible comercialmente, por ejemplo de Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, Wisconsin, Missouri, USA (catálogo No. 16,064-4). Los pirazoles pueden ser sintetizados fácilmente mediante la reacción de diazometano con acetileno. Esta ruta sintética para pirazoles tiene casi 100 años de antigüedad y se encuentra bien establecida. Véase, por ejemplo, von Pechmann, Ver. Deut. Chem. Ges., 31:2950 (1898) y Hueckel et y otros., Z. Phys. Chem., A, 186:159 (1940). Pueden prepararse fácilmente varios patrones de substitución en el pirazol resultante, seleccionando alquinos y compuestos diazo de partida con el patrón de substitución deseado.

Existen otras rutas sintéticas para producir 3-aminopirazoles. Por ejemplo, una síntesis general de 3-aminopirazoles sustituidos se da en la Patente US no. 4,622,330, en la cual una alquilhidrazina de fórmula R_{1}-NHNH_{2} sufre una reacción de condensación con un compuesto de fórmula AlqOCR_{4}=C(CN)_{2}, para dar un producto l-R_{1}-3-R_{4}-4-CN-5-aminopirazol. Esta reacción puede adaptarse con facilidad para producir compuestos de fórmula (I) substituyendo hidracina por la alquilhidrazina y (si es necesario) extraer el grupo ciano del producto de pirazol, conversirlo en un grupo alquilo, o seleccionar un material de partida con solo un grupo ciano. Para ejemplos de la síntesis del compuesto 3-benzoilamida-5-fenilpirazol, que es el compuesto 1 en la Tabla 1A, véase Huening, Chem. Ber., 95:937-943 (1962) y Checchi y otros., Gazz. Chim. Ital., 85:1558-1568 (1955).

Varios compuestos de particular interés se encuentran disponibles comercialmente de Maybridge Chemical Co., Ltd., Travillett, Tintagel, Cornwall PL340HW, Reino Unido, especialmente 3-[2'-fluorobenzoilamino]-5-pentilpirazol, 3-[2'-clorobenzoilamino]-5-fenilpirazol, 3-benzoilamino-5-fenilpirazol y 3-[4'-clorobenzoilamino]-5-fenilpirazol. Debe observarse aquí que los nombres dados en la oración anterior no están estrictamente de acuerdo a las reglas de nomenclatura de la IUPAC, sino que están nombradas para retener la nomenclatura de los compuestos como pirazoles para consistencia en esta descripción. Un nombre alternativo para el 3-benzoilamino-5-fenilpirazol (compuesto 1) es el N-5(fenil-1(2)H-pirazol-3-il)-benzamida. Este es el nombre usado en Beilstein (Beilstein Reg. No. 22573; CAS Reg. No. 97620-2).

Pueden estar presentes varios substituyentes en el grupo 3-amino o en el anillo de pirazol en el compuesto de partida o agregarse después de la formación del producto de condensación por métodos conocidos en la materia por sustitución o conversión de un grupo a otro. Si los mismos sustituyentes son reactivos, entonces los mismos sustituyentes pueden ser protegidos de acuerdo a las técnicas conocidas en la materia. Puede emplearse una variedad de grupos protectores conocidos en la materia. Ejemplos de muchos de estos posibles grupos pueden encontrarse en "Protective Groups in Organic Síntesis" de T.W. Green, John Wiley and Sons, 1981. Los alcoholes primarios pueden oxidarse mediante agentes oxidantes conocidos en la materia para formar ácidos carboxílicos o aldehídos y los alcoholes secundarios pueden oxidarse para formar cetonas. De esta manera, las reacciones de substitución o alteración se pueden utilizar para proporcionar una variedad de substituyentes en toda la molécula del material de partida, intermediarios o el producto final. Es de particular importancia la ruta sintética disponible por hidrólisis de grupos existentes de carboxamida y la sustitución por otro mediante una simple reacción de amidación.

Otros ejemplos de publicaciones científicas que dan detalles de las técnicas sintéticas para preparar los compuestos de la invención, así como discusiones sobre sus utilidades conocidas anteriormente, incluyen los siguientes: Sanz et al., J. Chem., Soc. Perkin Trans. I, 1990, pp.809-810; Hammouda. et al., J. Heterocycl. Chem., 21:945-947 (1984) y Sawali. et al; J. Heterocycl. Chem., 17:877-880(1980).

Utilización como inhibidores de cinasas

Todos los compuestos de fórmula (I) se adaptan fácilmente para uso terapéutico como inhibidores de quinasa para el control de enfermedades dependientes de quinasa en mamíferos, especialmente las relacionadas con tirosina quinasa. Los compuestos particularmente adecuados son aquellos con un valor de IC_{50} dentro de la escala 10 nM - 1 \muM. La capacidad de un dericado del ácido de pirazol para inhibir específicamente uno de los tres tipos de proteína quinasas con preferencia sobre otras clases (las tres clases conocidas se discuten más abajo) es uno de los factores que determinan la manera en la cual será utilizado un compuesto específico. Las enfermedades dependientes de tirosina quinasa incluyen trastornos hiperproliferativos que se inician o mantienen por la actividad enzimática aberrante de tirosina quinasa. Los ejemplos incluyen cáncer, aterosclerosis, y antiangiogénesis (p.e., crecimiento tumoral, retinopatía diabética). Aunque existe menos información disponible sobre la relación de otras clases de quinasas con enfermedades específicas, se entiende en la técnica que los compuestos inhibidores de la PTK terapéuticamente útiles deberían ser preferiblemente selectivos, y los mismo es válido para las otras clases de quinasas. Los inhibidores de PTK quercetina, genisteína y estaurosporina inhiben muchas otras proteína quinasas, además de tirosina quinasas, y son altamente citotóxicas como resultado de su falta de especifidad. Por lo tanto, se pueden utilizar ensayos de rutina que midan la citotoxicidad para identificar inhibidores de la PTK (o inhibidores de otras clases de quinasas) que probablemente produzcan efectos laterales indeseables debido a una falta de selectividad.

Se han identificado tres clases generales de proteína quinasas en base al aminoácido o aminoácidos que sirven como su substrato: quinasas que fosforilan tirosina, quinasas que fosforilan tirosina y treonina y quinasas que fosforilan serina y treonina. Como una prueba más detallada de selectividad, se debería de probar la capacidad de los compuestos para inhibir la actividad enzimática de una gama de estas proteína quinasas. En la sección de "Antecedentes" se describen proteína quinasas específicas de tirosina. Ejemplos de quinasas que fosforilan serina y treonina (la clase más común) inluyen RAF, proteína quinasa A, proteína quinasa C y el receptor del factor de crecimiento transformante beta. La quinasa MEK es un ejemplo de quinasas que fosforilan tirosina y treonina.

En la siguiente discusión de las utilizaciones de inhibidores de quinasa, la discusión se enfoca en las tirosina quinasas, puesto que éstas son las quinasas que han estado más fácilmente accesibles a control farmacéutico. Sin embargo, debe entenderse que cualquier discusión en la presente sobre la utilización de un compuesto como un inhibidor de tirosina quinasa es aplicable igualmente al uso de un compuesto que es específico para alguna de las otras clases de quinasa, una vez que se conozca la especifidad de acción. Se determina fácilmente si un compuesto de pirazol es específico para una clase particular de quinasa mediante la utilización de los ensayos de actividad de quinasa expuestos en los ejemplos (o un ensayo idéntico de otra manera que sustituya una quinasa diferente por la quinasa discutida en el ejemplo). Con el fin de evitar una repetición indebida, la siguiente discusión describe tirosina quinasas como ejemplos de lo que puede hacerse con otras clases de quinasas. De esta manera, una referencia a "tirosina quinasa" o "PTK" para una utilización determinada en una situación concreta, debe tomarse como ejemplo de una utilización de un compuesto específico para cualquiera de las clases de quinasa, a menos que se especifique o aclare de otra manera en el contexto.

Con el fin de que los compuestos que inhiben la PTK o alguna de las otras clases de quinasa sean terapéuticamente útiles, ser activos en células intactas. Se sabe que los inhibidores de PTK, que son identificados en base a su capacidad para inhibir preparaciones de enzima aislada, son frecuentemente débiles o inefectivos al inhibir PTKs nativos. Esta falta de actividad se debe a la incapacidad de los inhibidores de la PTK a atravesar la membrana celular para alcanzar su sitio de acción, o son incapaces de inhibir las PTKs en células en donde las concentraciones de trifosfato de adenosina (ATP) son altas y se pueden incluir otros factores. Se tienen fácilmente disponibles varios procedimientos para determinar la actividad de inhibidores de PTK contra tirosina quinasas del receptor del factor de crecimiento. El tratamiento de células con factor de crecimiento da como resultado la rápida autofosforilación del receptor correspondiente así como la fosforilación de los substratos receptores y estos hechos pueden medirse utilizando anticuerpos de antifosfotirosina. También pueden medirse acontecimientos de señales intracelulares adicionales incluyendo el flujo de calcio, metabolismo del fosfato de inositol y síntesis celular de ADN. Finalmente, un inhibidor de PTK terapéuticamente útil debe ser capaz de bloquear la proliferación celular que es el resultado indeseado de la acción del factor de crecimiento y es fácil de darle seguimiento.

Se supone que la solubilidad de los compuestos de fórmula (I) tanto en agua como en disolventes ligeramente hidrofóbicos aumenta la probabilidad de que atraviesen la membrana celular. Sin embargo, varios compuestos insolubles han exhibido una inhibición significativa de quinasas en ensayos in vitro.

Los compuestos de fórmula (I) pueden ser útiles en forma de ácido o base libres (si está presente un grupo carboxilo, hidroxilo fenólico o amino), en forma de una sal o como un hidrato. Todas las formas están dentro del alcance de la invención. Pueden formarse sales básicas y son simplemente una forma más conveniente para utilizar; en la práctica, el uso de la forma de sal iguala inherentemente el uso de la forma de ácido. Los ácidos o las bases que pueden usarse para preparar las sales incluyen preferiblemente aquellas que producen cuando se combinan con el ácido o la base libres, sales farmacéuticamente aceptables, esto es, sales cuyos cationes o aniones no son tóxicos para el organismo animal en dosis farmacéuticas de las sales, de manera que las propiedades benéficas inherentes en el ácido o la base libres no sean anuladas por los efectos laterales atribuibles a los cationes. Aunque se prefieren las sales farmacéuticamente aceptables de un compuesto ácido o básico, todas las sales son útiles como fuentes de la forma de ácido libre, aún si la sal particular per se se desea solamente como un producto intermedio, como por ejemplo cuando la sal se forma solamente con la finalidad de purificación o identificación, o cuando se usa como un intermedio en la preparación de una sal farmacéuticamente aceptable mediante procedimientos de intercambio de iones.

Los compuesto de fórmula (I) que tienen actividad como inhibidores específicos de proteínas tirosina quinasa poseen valor terapéutico como agentes antiproliferativos celulares para el tratamiento de ciertos estados que incluyen por ejemplo, psoriasis y restenosis. Se espera que las utilizaciones de la invención se pueden aplicar, en particular, en el tratamiento de la ateroesclerosis. Con respecto al tratamiento de algunos estados, por ejemplo, aterosclerosis, se pueden identificar ciertas personas como de alto riesgo, debido, por ejemplo, a factores genéticos, al medio ambiente o históricos. Los compuestos de fórmula (I) se pueden utilizar en la prevención o retraso de la ocurrencia o recurrencia de dichos estados o para tratar de otra forma.

Los compuestos de fórmula (I) se pueden administrar a un hospedador mamífero de diversas maneras, es decir, pueden combinarse con diferentes vehículos inertes farmacéuticamente aceptables en la forma de tabletas, cápsulas, pastillas, troches, caramelos duros, polvos, aerosoles, elixires, jarabes, soluciones inyectables o para gotas oftálmicas y similares, dependiendo de la ruta de administración elegida, por ejemplo oralmente o parentenalmente. En este sentido, la administración parenteral incluye la administración mediante las siguientes rutas: intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraocular, instrasinovial, transepitelial (incluyendo transdérmica, oftálmica, sublingual y bucal), tópica (incluyendo oftálmica, dérmica, ocular, rectal, inhalación nasal mediante insuflación y aerosol), y rectal sistémica.

Como se ha indicado más arriba, las enfermedades dependientes de quinasa se pueden controlar inhibiendo la actividad quinasa. Aunque son bien conocidos muchos compuestos de la clase de aminopirazol útiles en la presente invención, no se conoce ninguno que inhiba la actividad quinasa y muy pocos tienen utilidad terapéutica conocida. Una composición farmacéutica preferida contiene un compuesto de fórmula (I) con la condición de que cuando R_{1} sea fenilo o fenilo sustituido con un alquilo inferior, alcoxilo inferior o halógeno; R_{3} y R_{6} sea H; y R_{5} sea alquilo inferior, arilo o arilo sustituido con alquilo inferior, alcoxilo inferior o halógeno, entonces R_{2} no puede ser alquilo inferior.

El compuesto activo puede administrarse oralmente, por ejemplo, con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable, o puede ser encerrado en cápsulas de gelatina dura o de capa blanda, o puede ser comprimido en tabletas, o se pude incorporar directamente con el alimento de la dieta. Para administración terapéutica oral, el compuesto activo puede ser incorporado con un excipiente y usado en la forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, troches, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, wafers y similares. Dichas composiciones y preparaciones deberían contener por lo menos un 0,1% de compuesto activo. Por supuesto, puede variar el porcentaje de las composiciones y preparaciones, y puede estar convenientemente aproximadamente de un 2 a aproximadamente un 6% del peso de la unidad. La cantidad de compuesto activo en dichas composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtiene una dosificación adecuada. Las composiciones o preparaciones preferidas de acuerdo con la presente invención se preparan de manera que una forma de dosis oral unitaria contenga entre aproximadamente 1 y 1000 mg de compuesto activo.

Las tabletas, troches, píldoras, cápsulas y similares pueden contener también lo siguiente: un aglutinador tal como polivinilpirrolidona, goma tragacanto, acacia, sacarosa, almidón de maíz o gelatina; un excipiente tal como fosfato de calcio, citrato de sodio y carbonato de calcio; un agente desintegrante tal como almidón de maíz, almidón de patata, almidón de tapioca, ciertos silicatos complejos, ácido algínico y similares; un lubricante tal como laurilsulfato de sodio, talco y estearato de magnesio; un agente edulcorante tal como menta, aceite de pirola o sabor cereza. En cápsulas de gelatina blanda y dura también se emplean composiciones sólidas de un tipo similar como rellenos; a este respecto, los materiales preferidos incluyen también lactosa o azúcar de leche así como polietilenglicoles de alto peso molecular. Cuando la forma de dosis unitaria es una cápsula, esta puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un vehículo líquido. Pueden estar presentes otros materiales diferentes como recubrimientos o para modificar la forma física de la unidad dosificada. Por ejemplo, pueden recubrirse tabletas, píldoras o cápsulas con goma laca, azúcar o ambos. Un jarabe o elixir puede contener el compuesto activo, sacarosa como agente edulcorante, metil y propilparabenos como conservadores, un colorante, agente saborizante tal como sabor cereza o naranja, agentes emulsificantes y/o agentes de suspensión, así como diluyentes tales como agua, etanol, propilenglicol, glicerina y diversas combinaciones similares de los mismos. Por supuestos, cualquier material utilizado en la preparación de cualquier forma de dosis unitaria debería ser farmacéuticamente pura y substancialmente no tóxica en las cantidades empleadas. Además, el compuesto activo puede incorporarse en preparaciones y formulaciones de liberación sostenida.

El compuesto activo puede también administrarse parenteralmente o intraperitonealmente. Para propósitos de administración parenteral, pueden emplearse soluciones en aceite de sésamo o cacahuete, o en propilenglicol acuoso, así como soluciones acuosas estériles de las correspondientes sales de metal alcalino o alcalinotérreo solubles en agua, indicadas anteriormente. Dichas disoluciones acuosas deberían estar reguladas en su pH adecuadamente, si es necesario, y debería hacerse primero el diluyente líquido isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Las disoluciones del compuesto activo, como base libre o como sal farmacéuticamente aceptable, pueden prepararse en agua mezclado adecuadamente con un agente tensioactivo tal como hidroxipropilcelulosa. También puede prepararse una dispersión en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. Bajo condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos. Estas soluciones acuosas particulares son adecuadas especialmente para propósitos de inyección intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, el medio acuoso estéril empleado es obtenible fácilmente mediante técnicas estándar bien conocidas para los expertos en la materia.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida a una extensión tal que pueda ser extraída fácilmente de la jeringa. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe estar conservada contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. Puede mantenerse la fluidez apropiada, por ejemplo, con el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión, y con el uso de agentes tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse con diferentes agentes antibacterianos y fúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. Puede llevarse a cabo la absorción prolongada de composiciones inyectables con el uso de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en el solvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según sea requerido, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, se preparan dispersiones incorporando el ingrediente activo esterilizado en un vehículo estéril que contenga el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos preferidos de preparación son secado a vacío y la técnica de secado en congelación que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional, a partir de la solución anteriormente esterilizada por filtración.

Para propósitos de administración tópica, se preparan soluciones acuosas diluidas estériles habitualmente en aproximadamente 0,1% a 5% de concentración), similares, de otra manera, a las soluciones parenterales anteriores, en recipientes adecuados para administración en forma de gotas oftálmicas.

Los compuestos terapéuticos de fórmula (I) se puedenadministrar a un mamífero solos o en combinación con vehículos farmacéuticamente aceptables. Como se indicó antes, las proporciones relativas de ingrediente activo y vehículo se determinan por la solubilidad y naturaleza química del compuesto, ruta de administración elegida y práctica farmacéutica normal.

La dosificación de los agentes terapéuticos presentes que sea más adecuada para la profilaxis o el tratamiento varía con la forma de administración, el compuesto particular elegido y las características fisiológicas del paciente particular bajo tratamiento. Generalmente al principio se usan dosis pequeñas y, si es necesario, se aumentan mediante pequeños incrementos hasta que se alcance el efecto óptimo bajo esas circunstancias. La dosificación humana terapéutica, en base a estudios fisiológicos usando ratas, será generalmente de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por día o de aproximadamente 0,4 mg a aproximadamente 10 g y mayor, aunque se puede administrar en varias unidades de dosis diferentes de una sola vez a varias veces al día. La administración oral requiere dosificaciones más altas.

Los compuestos se administran oralmente o parenteralmente, o tópicamente como gotas oftálmicas, en dosificaciones que varían de aproximadamente 0,1 a 10 mg/kg de peso corporal por día en una sola dosis o dosis divididas. En situaciones concretas, por ejemplo, se usan dosis fuera de esta escala a discreción del médico tratante.

En una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, la proporción en peso de vehículo respecto a ingrediente activo está normalmente en la escala de 1:4 a 4:1 y preferiblemente de 1:2 a 2:1. Sin embargo, en cualquier caso dado, la proporción elegida depende de factores tales como la solubilidad del componente activo, la dosificación contemplada y la ruta precisa de administración.

Los compuestos de fórmula (I) son útiles también para detectar la presencia de tirosina quinasa o un substrato de tirosina quinasa en un fluido corporal tal como sangre o una fracción de sangre. Se mide la actividad de tirosina quinasa en una composición en ausencia de un compuesto de la invención y se compara con la actividad medida en presencia de dicho compuesto. La diferencia en estas actividades medidas de quinasa se relaciona, a continuación, con la concentración de tirosina quinasa o el substrato de tirosina quinasa en la composición.

La invención ahora descrita de manera general, se entenderá mejor con referencia a los siguientes ejemplos detallados, que se proporcionan con el fin de ilustrar solamente y no para considerarlos limitantes de la invención, a menos que se especifique de otra manera.

Ejemplo 1 Inhibición de actividad enzimatica de proteína quinasa por parte de compuestos de pirazol

Los compuestos de pirazol usados en éste y en los siguientes ejemplos se obtuvieron de Maybridge Chemical Co.Ltd., Trevillent, Tintagel, Cornwall PL340HW, Reino Unido.

La estimulación de la proliferación celular mediante factores de crecimiento tales como PDGF, FGF y EGF depende de su inducción de la autofosforilación de cada uno de sus respectivos receptores de tirosina quinasa. Por lo tanto, la capacidad de un inhibidor de PTK para inhibir la proliferación celular inducida por estos factores de crecimiento se correlaciona directamente con su capacidad para bloquear la autofosforilación del receptor. Para medir la autofosforilación de alfa-PDGFR, se utilizó la línea celular hematopoyética de ratón descrita anteriormente, 32D-\alphaR, la cual ha sido manipulada por ingeniería genética para sobreexpresar el alfa PDGFR humano. Estas células se desarrollaron en una suspensión de 10^{6} células/ml en medio RPMI (Gibco BRL) que contenía suero fetal bovino al 10% y medio acondicionado WEHI al 5% (medio de cultivo de tejido acondicionado con células WEHI disponibles de ATCC), como se describió anteriormente. Las células se hicieron pellets mediante centrifugación a baja velocidad y se resuspendieron en RPMI libre de suero antes de su distribución a 500,000 células/pocillo en placas de microtítulo de fondo cónico de 96 pocillos (Falcon). Se agregaron los compuestos (0,01-30 \muM) a los pocillos a temperatura ambiente, 15 minutos antes de la adición de PDGF AA (15 ng/ml) y la incubación se continuó sobre hielo durante 90 minutos en un volumen de incubación final de 100 \mul. Después, las células se hicieron pellets a 2000 rpm durante 10 minutos a 4ºC y se agregaron directamente a cada pocillo 50 \mul de un tampón de pH de lisis recién preparado (20 mM de Tris a pH 7,3, 150 mM de NaCl, 1% de Tritón X-100, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 1 mM de ortovanadato de sodio, 10 mg/ml de aprotinina y 10 mg/ml de leupeptina), se continuó la incubación durante 10 minutos sobre hielo y se facilitó la lisis celular mediante agitación vigorosa sobre un agitador de placas. Los lisados celulares se clarificaron mediante centrifugación a 2000 rpm durante 10 minutos, antes de su análisis.

Para el análisis de autofosforilación de beta-PDGFR, se utilizó la línea celular de ovario de hámster chino (CHO), HR5-\betaR, la cual ha sido manipulada mediante ingeniería genética para sobreexpresar establemente el beta-PDGFR humano, como se describió antes. Estas células se sembraron a 10,000 células/pocillo en placas de microtítulo (placas de 96 pocillos Falcon) y se incubaron a 37ºC en RPMI con 10% de suero fetal bovino durante tres días, al cabo de los cuales se alcanzó confluencia. Se extrajo medio de los pocillos y se reemplazó con 100 \mul de RPMI libre de suero, y se continuó la incubación a 37ºC durante 18 horas. Se agregaron los compuestos (0,01-30 \muM) a los pocillos 15 minutos antes de la adición de PDGF BB (100 ng/ml) y la incubación se continuó a 37ºC durante 10 minutos. El medio se vacía y se agregaron 50 \mul de solución tamponadora de lisis recién preparada a cada pocillo y la placa se agitó vigorosamente para preparar el lisado celular. Los lisados se clarificaron, a continuación, mediante centrifugación a 2600 rpm durante 10 minutos antes de su análisis.

En un placa de microtítulo separada, se inmovilizaron anticuerpos monoclonales (preparados en COR Therapeutics, Inc.) dirigidos contra el dominio extracelular del alfa-PDGFR, (Mab \alphaR10) o del beta-PDGFR (Mab 1B5B11), incubando 0,5 \mug. de anticuerpo por pocillo a 4ºC durante 18 horas en Tris 23 mM a pH 8,0, 68 mM de NaCl, 14 mM de bicarbonato de amonio y 0,01% de azida de sodio. Se eliminó el anticuerpo no unido y los pocillos se bloquearon con 25 mM de N-(2-hidroxietil)-piperazina-N-(ácido 2-etanolsulfónico) (HEPES) pH 7,6, 100 mM de NaCl, y 0,2% de Tween 20 justo antes de la adición del lisado celular que había sido diluido 1:2 en tampón de unión (tampón de bloqueo con 0,3% de gelatina). El lisado celular 32D-\alphaR o HR5-\betaR se incubó con Mab \alphaR10 o Mab 1B5B11 inmovilizado, respectivamente, durante 2 horas a temperatura ambiente y los pocillos se lavaron 3 veces con 200 \mul de tampón de lavado (solución salina tamponada de fosfato, "PBS", 0,01% de Tween 20). Para detectar el nivel de fosforilación de PDGFR se añadió un anticuerpo de conejo antifosfotirosina (Upstate Biotechnology, Inc., "UBI"), a 1,25 \mug/ml y se incubó durante 1 hora a 37ºC. Después de la eliminación del anticuerpo antifosfotirosina no unido, las placas se incubaron con IgG anticonejo conjugada de cabra y rábano (Boehringer Mannheim) a una dilución 1:1000, antes de la adición de sustrato de peroxidasa (ABTS^{TM}). Se siguió la formación de producto a 650 nm utilizando un lector de placas de microtítulo (Molecular devices).

Se midió autofosforilación de EGFR en células MDA MB 468 (ATTC # HTB 132), una línea celular de tumor mamario humano que sobreexpresa el EGFR. Estas células se desarrollaron para confluencia en placas de 6 pocillos y se incubaron en medio de Eagle modificado de Dulbeco libre de suero (DMEM) durante 10 horas. Las células se expusieron a diferentes concentraciones de compuestos (0,01 a 30 \muM) durante 15 minutos y después a EGF (100 ng/ml) durante 10 minutos a 37ºC. Las células se rasparon y se prepararon lisados en el mismo tampón que el descrito para las células 32D-\alphaR antes del fraccionamiento mediante SDS PAGE convencional, seguido de análisis de transferencia Western. Para esto, se transfirieron proteínas sobre nitrocelulosa y la membrana se bloqueó en solución salina tamponadora Tris (TBS) pH 7,0, 0,1% de Tween 20,5% de leche en polvo. La membrana se manchó con anticuerpo antifosfotirosina (UBI, 1 \mug/ml) en un tampón de unión (TBS, 0,1% Tween 20; 1% de leche en polvo) durante 2 horas a temperatura ambiente. Se efectuó la detección utilizando una IgG conjugada a peroxidasa de rábano anticonejo (Boehringer Mannheim). La mancha se desarrolló usando un sistema quimoluminiscente (Amersham).

Con el fin de medir la autofosforilación de FGFR-1, el ADNc del FGFR-1 humano se sobreexpresó de manera estable en células CHO utilizando técnicas estándar. Estas células se desarrollaron a confluencia en RPMI con suero bovino fetal al 10%, el medio se reemplazó por RPMI libre de suero y se continuó la incubación durante 18 horas antes de la estimulación con \beta-FGF (75 ng/ml) durante 10 min a 37ºC en ausencia o presencia de inhibidores de PTK en un rango de concentración de 0,1-30 \muM. Los lisados celulares se prepararon bajo las mismas condiciones que se describieron anteriormente para la prueba del EGFR. Se incubaron los lisados con un anticuerpo monoclonal dirigido contra el dominio extracelular de FGFR-1 (Mab 1H9D3, que fue preparado en COR) y el receptor inmunoprecipitado se sometió a análisis de SDS-PAGE y transferencia con anticuerpos antifosfotirosina conjugados con peroxidasa de rábano, 4G10 (UBI) y se realizó la detección mediante quimoluminiscencia (Amersham).

Como se muestra en la figura 1, el compuesto 1 (véase Tabla 1A para la estructura) bloquea eficientemente la autofosforilación del beta-PDGFR en células HR5-\betaR con un valor IC_{50}=220 nM y inhibición fue máxima a 5 \muM. Cuando se comparó el compuesto 1 con otros inhibidores potentes de PTK bajo estas condiciones, se encontró que el compuesto 1 era igualmente potente a K252a y un poco menos potente (tres veces) que la Staurosporina (véase Tabla 2 de más abajo). También se encontró que el compuesto 1 inhibía la autofosforilación de PDGFR sobre el mismo rango de concentraciones que la observada para el beta-receptor. Estos resultados demuestran que el compuesto 1 es un inhibidor potente de la autofosforilación del PDGFR en células intactas, lo que indica que este compuesto será activo in vivo y que deberían de alcanzarse concentraciones terapéuticas.

Para determinar si el compuesto 1 inhibe selectivamente el PDGFR de tirosina quinasa, se evaluó su efecto sobre los EGFR y FGFR-1 de tirosina quinasas, estrechamente relacionados. Sorprendentemente, no se observó inhibición detectable de autofosforilación de estos receptores a concentraciones del compuesto 1 tan altas como 30 \muM. La autofosforilación de EGFR fue inhibida por K252a (IC_{50}=1 \muM), pero no por Staurosporina a concentraciones de hasta 30 \muM (Tabla 2).

La familia src PTK está relacionada estructuralmente con el receptor PTKs según se demuestra por la identidad de secuencia del 60 al 80% de aminoácidos en sus dominios enzimáticos de tirosina quinasa. También, estas quinasas son similares funcionalmente ya que intervienen en la señalización intracelular que conduce a proliferación celular. A diferencia de los receptores PTKs, las proteínas src no contienen dominios extracelulares o transmembrana y por lo tanto no funcionan directamente como receptores para estímulos extracelulares. Para probar adicionalmente la especifidad del compuesto 1, se evaluó su capacidad para inhibir la actividad del c-src recombinante (catálogo UBI # 14-117). Con el fin de adaptar este ensayo a un formato de placa de microtítulo de 96 pocillos, se añadieron 0,5 \mug del péptido 2 de substrato src (catálogo UBI # 12-140) a cada pocillo en 23 mM de Tris a pH 8,0, 68 mM de NaCl, 14 mM de bicarbonato de amonio y 0,01% de azida de sodio. Después de la inmovilización del péptido, se lavaron los pocillos y, a continuación, se bloquearon con 25 mM de HEPES pH 7,6, 100 mM de NaCl, 0,2% de Tween 20. La reacción de quinasa se inició añadiendo a cada pocillo 100 ml de una mezcla de reacción de compuestos de prueba contenidos a 0,03-30 \muM, 50 \muM de ATP y 10 unidades de c-src en 50 mM de Tris; pH 7, 25 mM de MnCl_{2}; 5 mM de MnCl_{2}; 0,05 mM de Na_{3}VO_{4}; 100 mM de HEPES pH 7; 5% de glicerol y 0,05% de nonifenoxipolietoxietanol (NP-40). Después de 20 minutos de incubación a 37ºC, se pararon las reacciones añadiendo 10 \mul de ácido acético al 50%, se lavaron los pocillos y se utilizó anticuerpo antifosfotirosina para detectar el sustrato fosforilado de tirosina en las mismas condiciones que las descritas anteriormente para la detección del PDGFR fosforilado. Como se muestra en la Tabla 2, el compuesto 1 inhibió src quinasa con un valor de IC_{50} = 8,0 \muM lo cual era una concentración 40 veces mayor que la requerida para inhibir la autofosforilación del PDGFR. Por otra parte, la Steauroporina y K252a bloquearon la actividad de la src quinasa con valores IC_{50} de 70 nM y 20 nM, respectivamente. Estos resultados demuestran que mientras el compuesto 1 es selectivo para inhibir la actividad del PDGFR de quinasa, la Stauroporina y K252a son igualmente o más potentes inhibiendo la actividad de la src quinasa ya que son PDGFR con actividad de quinasa.

Se sabe que la Staurosprina es un potente inhibidor de receptor de tirosina quinasa, la familia src de tirosina quinasas y las quinasas serina/treonina relacionadas más distantemente. Esta falta de especificidad asociada con la Stauroporina y otros inhibidores conocidos de PTK limitan, en gran medida, su potencial como agentes terapéuticos. Para investigar la posibilidad de que el compuesto 1 pueda inhibir proteína quinasas de serina/treonina, se efectuaron ensayos de proteína quinasa A (PKA) y proteína quinasa C (PKA) utilizando el ensayo de proteína quinasa no radioactiva de UBI en las condiciones descritas por el fabricante (catálogo UBI # 17-112). Se comparó el compuesto 1 con la Stauroporina y K25a probando cada uno de éstos compuestos sobre una escala de concentración de 0,025-40 \muM. Como se muestra en la Tabla 2, el compuesto 1 no alcanzó una reducción del 50% ni de actividad PKC ni PKA a una concentración de 40 \muM, la cual es aproximadamente 200 veces más grande que la concentración requerida para inhibir la actividad de la quinasa de PDGFR. Se encontró que K252a es un potente inhibidor de estas serina/treonina quinasas con un valor de IC_{50} de 70 nM para PKA y 100 nM para PKC, mientras que la Staurosporina inhibió ambas quinasas con un valor de IC_{50} = 70-80 nM. Estos resultados demuestran que aunque algunos inhibidores de quinasa tales como la Staurosporina y K252a carecen de selectividad, el compuesto 1 es de 40 a 200 veces más selectivo para el receptor PDGF que para otros receptores de tirosina quinasas, src quinasas y serina/treonina quinasas. Dicha selectividad aumenta en gran medida el potencial terapéutico del compuesto 1 para tratamiento de enfermedades en las que el PDGF juega una función, tales como la aterosclerosis, ciertos cánceres, glomerulonefritis y restenosis siguiente a angioplastia.

TABLA 2 Inhibición de actividad de proteína quinasa IC_{50} [\muM]

Compuesto	\alphaPDGFR	\betaPDGFR	EGFR	FGFR-1	src-quinasa	PKA	PKC
Comp.1	17	0,22	>30	>30	8,0	>40	>40
K252a	ND	0,27	1,0	ND	0,02	0,07	0,10
Staurosporina	ND	0,07	>30	ND	0,07	0,07	0,08
ND = No determinado

Ejemplo 2 Inhibición de proliferación celular mediante el compuesto 292

Para determinar la utilidad terapéutica potencial de un inhibidor de PTK es importante demostrar la capacidad inhibidora para bloquear la proliferación celular en respuesta a un factor de crecimiento que está implicado en la mediación de un trastorno proliferativo. Puesto que existen muchas publicaciones en la literatura que implican al PDGF en enfermedades tales como glomerulonefritis, cáncer, aterosclerosis, y restenosis, se probó el compuesto 1 para su capacidad de bloquear la proliferación celular inducida por PDGF. Con este propósito, se usaron células 32D-\alphaR y técnicas estándar que han sido desarrolladas previamente para medir la proliferación inducida por PDGF. Brevemente, se desarrollaron células 32D-\alphaR en medio RPMI acondicionado con interleucina 3 (IL-3) con suero bovino fetal al 10% y se lavaron 2 veces con RPMI con suero bobino fetal al 10%, se resuspendió a 5 X 10^{5} células/ml, en el mismo medio y, a continuación, se dispensaron a 250 \mul/pocillo en placas de 24 pocillos (Falcon). Se añadió PDGF AA a 30 ng/ml en ausencia o presencia del compuesto 1 (0,04-40 \muM) en un volumen de incubación final de 0,5 ml. Las células se incubaron durante 43 horas seguido de una incubación adicional de 3 horas con [^{3}H]timidina (10 \muCi/pocillo). Después, las células se recogieron con un colector de células automatizado; se colocaron filtros en mezcla de escintilación líquida y se contaron en un contador \beta. Como se muestra en la figura 2, el compuesto 1 bloqueaba la incorporación de timidina inducida por PDGF en un 50% a 700 nM e inhibía completamente la mitogenecidad a concentraciones >1 \muM.

Para determinar si el compuesto 1 ejerce un efecto no específico antiproliferativo o es citotóxico, se determinaron sus efectos sobre la proliferación de líneas celulares humanas (p.e., HS68, HS 27, CCD18, y WS1, obtenidas de ATCC) en condiciones estándar de cultivo de tejidos. Las células fueron sembradas no densamente en un medio de cultivo de tejido normal que contenía un 10% de suero bovino fetal a 3,5 x 10^{3} células/pocillo en una placa de microtítulo de 96 pocillos (Falcon) en ausencia o presencia del compuesto 1, la Staurosporina o K252a, en el rango de concentración de 0,01-30 \muM. A continuación, se dejaron desarrollar las células en condiciones estándar de cultivo de tejido durante 96 horas al cabo de las cuales fueron fijadas con glutaraldehído al 3,3%, se lavaron con H_{2}O y se tiñeron con azul de metileno al 0,05% (Sigma). Después de tinción, las células se lavaron, el colorante se eluyó con HC1 al 3% y se siguió la absorbancia a 665 nM utilizando un lector de placa (Molecular Decives). Se determinó el porcentaje de inhibición de proliferación celular mediante comparación de absorbancia observada en presencia del inhibidor con la absorbancia obtenida en ausencia del inhibidor. Como se muestra en la Tabla 3, no se observó un descenso en el crecimiento celular de cualquiera de las líneas celulares probadas después del tratamiento con el compuesto 1 a concentraciones de hasta 10 \muM, y ocurrió solamente un ligero descenso (10-20%) a 30 \muM. En contraste, la Staurosporina bloqueó completamente el crecimiento de todas las líneas celulares a 0,01 \muM, y K252a inhibió el crecimiento celular en un 50% en el rango de concentraciones de 1-12 \muM, siendo las células CCD 1B las más sensibles (IC_{50}=1 \muM). También se evaluó el efecto de estos compuestos sobre el crecimiento celular normal con células HR5-\betaR que se utilizaron previamente para medir la autofosforilación de beta-PDGFR. Se requirió de una concentración elevada (28 \muM) del compuesto 1 para inhibir en un 50% el crecimiento de células HR5-\betar. En contraste, la Staurosporina (IC_{50}<10 nM) y K252a (IC_{50}=130 nM) inhibieron potentemente el crecimiento celular de HR5- \betaR a concentraciones más bajas que las requeridas para inhibir la fosforilación de PDEGFR. Estos resultados demuestran que la Staurosporina, que es un inhibidor no específico de proteína quinasa, también ejerce un efecto no específico antiproliferativo o citotóxico a concentraciones más bajas que las requeridas para inhibir la actividad de quinasa. Por otra parte, las concentraciones del compuesto 1 requeridas para inhibir el crecimiento celular bajo condiciones estándar de cultivo de tejido fueron > 100 veces más altas que las requeridas para bloquear la autofosforilación de PDGFR. Estos resultados indican que el efecto terapéutico de la inhibición de actividad del PDGFR de quinasa debería ocurrir a concentraciones del compuesto 1 muy por debajo de las que ocasionan efectos citotóxicos.

TABLA 3 Inhibición de proliferación celular bajo condiciones normales de cultivo de tejido

IC_{50} [\muM]
Líneas celulares
Compuesto	CCD18	HS27	WS1	HS68	HR5-\betaR
Compuesto 1	>30	>30	>30	>30	28
Staurospina	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01
K252a	1,0	12	5,0	5,0	0,13

Ejemplo 3

General: Se registraron los espectros RMN es un instrumento Varian Unity Plus 400 MHz. Los espectros IR fueron registrados en un Perkin Elmer Modelo 1600 FT-IR. Se efectuó la HPLC de fase inversa sobre un controlador Waters Modelo 600 con un detector Modelo 965 Photo Dio de Array, utilizando un software Millenium 2020 para procesar los datos y una columna analítica Vydac 4,5 mm x 25 cm C18 o una columna preparativa Vydac 2,5 cm x 25 cm C18. Se efectuó la HPLC de fase normal sobre un controlador Waters DeltaPrep Modelo 4000 con un detector Modelo 965 PhotoDiodeArray utilizando un software Millenium 2020 para procesar los datos y una columna analítica de gel de sílice Alltech Econosil 4,5 mm x 25 cm o una columna semipreparativa de gel de sílice Alltech Econosil 22 mm x 25 cm. Se efectuó la cromatografía en columna instantánea utilizando gel de sílice GF E Merck. Se efectuaron espectros de masas utilizando técnicas de introducción de muestra de impacto de electrones o ionización química directa.

(A) Preparación de 2-Benzoilamino-5-fenil-2-benzoilpirazol (Compuesto 35)

A una solución de 0,31 g (2,0 mmoles) de 5-amino-3-fenilpirazol (suministrado por Maybridge o Aldrich) disuelto en 5,0 ml de piridina agitando en un baño de hielo-agua bajo atmósfera de argón, se introdujeron 1,4 ml (12,1 mmoles) de cloruro de benzoilo. La solución se agitó en el baño frío durante una hora, se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante tres horas y media más. Durante la reacción, se separó de la solución el clorhidrato de piridinio.

La reacción se extinguió mediante la introducción de 10 ml de ácido clorhídrico acuoso al 10% (v/v), se transfirió a un embudo de separación, y se extrajo dos veces con 25 ml de diclorometano. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con una porción de 10 ml de ácido clorhídrico al 10%, una vez con solución de cloruro de sodio saturada, se secó sobre sulfato de magnesio, y se concentró al vacío. Se obtuvo un sólido blanco.

El sólido fue sometido a cromatografía sobre una columna semipreparativa de gel de sílice utilizando el instrumento Waters DeltaPrep. Se desarrolló el gradiente de elusión de 9:l:hexano: diclorometano a 1:1:hexano:diclormetano durante 80 minutos a una velocidad de flujo de 10 ml por minuto. Se obtuvieron 0,37 g (1,0 mmoles, 50%) del compuesto del título como un sólido blanco.

CCD (diclorometano): R_{f}=0,86

IR (nujol): NH a 3317 cm^{-1}, CO a 1689 cm^{-1}

RMN (CDCI_{3}): 11,67 (s,NH);8,21/8,23 (dd,2 ArH); 8,00/8,02 (dd,2 ArH); 7,88/7,90 (dd,2 ArH); 7,58-7,66 (m,2 ArH); 7,51-7,56 (m,5 ArH); 7,38-7,48 (m,3 ArH)

ES (EI); M^{+} = 367

(B) Preparación de 3-Benzoilamino-5-fenilpirazol (Compuesto 1)

Se calentó una suspensión de 100 mg (0,27 mmoles) de 5-benzoilamino-3-fenil-1-benzoilpirazol en 4 ml de hidróxido de potasio acuoso al 10% (p/v) en un baño de agua mantenido a 100ºC durante 5 minutos. Durante este tiempo la mezcla de reacción permaneció como una suspensión. La suspensión fría se filtró y se lavó con agua y, a continuación, se secó con aire. Se obtuvieron 48 mg (0,18 mmoles, 67%) del compuesto de título como un sólido blanco.

CCD (diclorometano): R_{f} = 0,20

IR (nujol): NH a 3288 cm^{-1}, CO a 1656 cm^{-1}

RMN (DMSO-d_{6}): 10,80 (s,NH);7,97/7,99 (dd,2 ArH); 7,71/7,73 (d,2 ArH); 7,40/7,56 (m,5 ArH); 7,29-7,33 (t, ArH); 7,01 (bs, pirazol CH)

ES (EI); M^{+} = 263

C) Preparación de 3-Benzoilamino-5-fenilpirazol (Compuesto 53)

Se transfirieron 0,17 g (0,66 mmoles) de 5-benzoilamino-3-fenilpirazol a un matraz de fondo redondo de 3 cuellos seco, equipado con un tapón de hule, un tapón de vidrio y un condensador de reflujo con entrada de argón. Se añadió tetrahidrofurano anhidro (5 ml) mediante jeringa, y la agitación a temperatura ambiente produjo una solución clara incolora. Se introdujeron a esta solución 0,93 ml (1,86 mmoles) de una solución 2 Molar disponible comercialmente (Aldrich) de un complejo borano-sulfuro de dimetilo en tetrahidrofurano. La solución se sometió a reflujo en un baño de aceite durante 17 horas. La solución de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se extinguió con 2 ml de ácido clorhídrico acuoso al 10% (v/v).

La mezcla cruda se sometió a cromatografía sobre una columna de C_{18} utilizando el instrumento Waters Modelo 600. El gradiente de elusión fue de un 100% de agua (con ácido trifluoroacetico al 0,1% "TFA") hasta 1:1: agua: acetontrilo (con 0,1% TFA), durante 50 minutos, después un lavado isocrático de 10 minutos al 100% de agua (con 0,1% TFA) a una velocidad de flujo de 10 ml por minuto. Se analizaron las fracciones eluidas sobre una columna analítica de C_{18} utilizando un gradiente de 9 5:5 agua: acetonitrilo (con 0,1% TFA) hasta 20:80: agua: acetonitrilo (con 0,1% TFA) hasta 30 minutos a una velocidad de flujo de 1,5 ml por minuto. Se reunieron las fracciones apropiadas (es decir, aquellas que eluyeron entre 38%-44% de acetonitrilo) y se liofilizaron para producir 72,3 mg (0,29 mmoles, 44%) del compuesto del título como un polvo blanco.

HPLC (Columna C_{18}): R_{t} = 16.9 minutos

RMN (CD_{3}OD)): 7,65-7,68 (m, 2 ArH); 7,44-7,47 (m, 3 ArH); 7,31-7,38 (m, 4 ArH); 7,23-7,27 (m, ArH); 4,42 (s, NCH_{2})

EM (EI): M^{+} = 249

Debe entenderse que la invención no está limitada a las modalidades particulares mostradas y descritas en la presente, sino que pueden hacerse varios cambios y modificaciones sin apartarse del espíritu y alcance de este concepto novedoso como está definido por las siguientes reivindicaciones.

Claims (20)

1. Utilización de un compuesto de la fórmula (I):

4

en donde

R_{1} es un alquilo inferior, hidrocarbilo inferior, arilalquilo inferior, hteroarilalquilo inferior, aromático heterocíclico de 5 ó 6 miembros, pliaromático o poliheteroaromático;

R_{2} es un alquilo inferior, hidrocarbilo inferior, arilalquilo inferior, heteroarilalquilo inferior, aromático heterocíclico de 5 ó 6 miembros, hidrocarboilo inferior, carbonilo poliaromático, poliheteroaromático o carbonilo poliheteroaromático;

R_{3} es H o alquilo inferior;

R_{5} es H, alquilo inferior, hidrocarbilo inferior, arilalquilo inferior, heteroarilalquilo inferior, aromático heterocíclico de 5 ó 6 miembros, halógeno o ciano; y

R_{6} es H o hidrocarboilo inferior;

en donde cada uno de dichos grupos alquilo, hidrocarbilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, hidrocarboilo o aromático heterocíclico están sustituidos opcionalmente de manera independiente con hasta cuatro grupos R_{4}, en donde cada R_{4} representa independientemente halógeno, ciano, nitro, alquilo inferior, hidroxilo, alcoxilo, carbonilo, carboxilo, amino, alquilamino, dialquilamino o hidrocarboilamido en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de glomerulonefritis, cáncer, aterosclerosis o restenosis en mamíferos en donde "alquilo inferior" significa un grupo alquilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono, y "hidrocarbilo inferior" significa un grupo hidrocarbilo que tiene 6 o menos átomos de carbono o un anillo fenilo.

2. Utilización de la reivindicación 1, en donde R_{1} es un hidrocarbilo inferior o un aromático heterocíclico de 5 ó 6 miembros, y está sustituido opcionalmente con hasta cuatro grupos R_{4}.

3. Utilización de la reivindicación 2, en donde dicho hidrocarbilo inferior es un aromático carbocíclico y está sustituido opcionalmente con hasta cuatro grupos R_{4}.

4. Utilización de la reivindicación 3, en donde el aromático carbocíclico es fenilo o fenilo sustituido con hasta cuatro grupos R_{4}.

5. Utilización de la reivindicación 1, en donde R_{2} es un hidrocarboilo inferior o un carbonilo aromático heterocíclico de 5 ó 6 miembros, y está sustituido opcionalmente con hasta cuatro grupos R_{4}.

6. Utilización de la reivindicación 5, en donde dicho hidrocarboilo inferior es un carbonilo aromático carbocíclico y está sustituido opcionalmente con hasta cuatro grupos R_{4}.

7. Utilización de la reivindicación 6, en donde dicho carbonilo aromático carbocíclico es fenilcarbonilo o fenilcarbonilo sustituido con hasta cuatro grupos R_{4}.

8. Utilización de la reivindicación 1, en donde R_{3} es H.

9. Utilización de la reivindicación 1, en donde R_{5} es H, alquilo inferior, halógeno o ciano.

10. Utilización de la reivindicación 9, en donde R_{5} es H.

11. Utilización de la reivindicación 1, en donde R_{6} es H.

12. Utilización de la reivindicación 1, en donde R_{1} es alquilo inferior, hidrocarbilo inferior o aromático heterocíclico de 5 ó 6 miembros; R_{2} es alquilo inferior, hidrocarbilo inferior, aromático heterocíclico de 5 ó 6 miembros, hidrocarboilo inferior o carbonilo aromático heterocíclico de 5 ó 6 miembros; R_{3} es H o alquilo inferior; R_{5} es H, alquilo inferior, halógeno o ciano; y R_{6} es H o hidrocarboilo inferior.

13. Utilización de la reivindicación 12, en donde R_{1} es fenilo o un fenilo sustituido; R_{2} es fenilcarbonilo o fenilcarbonilo sustituido y R_{3}, R_{5} y R_{6} son H.

14. Utilización de la reivindicación 1, en donde R_{1} es fenilo, R_{2} es benzoilo y R_{3}, R_{5} y R_{6} son H.

15. Utilización de la reivindicación 1, en donde R_{2} es un fenilcarbonilo o un fenilcarbonilo sustituido con un sustituyente donador de electrones o neutro electrónicamente con respecto a H en el grupo fenilo.

16. Utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde el medicamento comprende una cantidad inhibidora del receptor de PDGF de un compuesto de fórmula (I) es un vehículo farmacéuticamente aceptable.

17. Utilización de la reivindicación 16 con la condición de que cuando R es fenilo o fenilo sustituido con un alquilo inferior, alcoxilo inferior o halógeno, R_{3} y R_{6} son H, y R_{5} es alquilo inferior, arilo o arilo sustituido con un alquilo inferior, alcoxilo inferior o halógeno, entonces R_{2} no puede ser alquilo inferior.

18. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde el medicamento es para el tratamiento de la glomerulonefritis, aterosclerosis o restenosis.

19. Procedimiento de inhibición de un receptor de PDGF, no siendo un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia o un procedimiento de diagnóstico aplicado en el cuerpo humano o animal que comprende:

poner en contacto una composición que contiene un receptor PDGF con un compuesto de fórmula (I) según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-15.

20. Procedimiento de la reivindicación 19 en donde dicha composición que contiene un receptor de ADGF comprende un fluido corporal de un mamífero, y dicho procedimiento comprende además medir la actividad tirosina quinasa en dicho fluido corporal en presencia o ausencia de dicho compuesto y relacionar dicha actividad quinasa con la concentración de tirosina quinasa o el sustrato para tirosina quinasa en dicha composición.