ES2219697T3

ES2219697T3 - Proceso para la obtencion de estrogenos a partir de la orina de yeguas.

Info

Publication number: ES2219697T3
Application number: ES96930986T
Authority: ES
Inventors: Ivan Ban; Friedrich Borchers; Henning Heinemann; Heinz-Helmer Rasche
Original assignee: Solvay Pharmaceuticals GmbH
Current assignee: Abbott Products GmbH
Priority date: 1996-08-30
Filing date: 1996-08-30
Publication date: 2004-12-01
Anticipated expiration: 2016-08-30
Also published as: DE59610986D1; IL128671A0; PL331885A1; HK1023063A1; DE19681616D2; HUP9903670A3; DK0927040T3; DE19681616B4; NO318378B1; NO990953D0; WO1998008525A1; JP2000517309A; PT927040E; CA2263904A1; AU6985696A; HUP9903670A2; EP0927040B1; HU228765B1; PL185920B1; CZ298762B6

Abstract

SE DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA OBTENER UN EXTRACTO QUE CONTIENE UNA MEZCLA NATURAL DE ESTROGENOS CONJUGADOS PROCEDENTE DE ORINA DE YEGUA MEDIANTE UNA EXTRACCION EN FASE SOLIDA DE LA MEZCLA DE ESTROGENOS CONJUGADOS DE ORINA DE YEGUA QUE ESTA EMBARAZADA SOBRE UN GEL DE SILICE RP.

Description

Proceso para la obtención de estrógenos a partir de la orina de yeguas.

La presente invención concierne a la obtención de una mezcla natural de estrógenos conjugados a partir de la orina de yeguas preñadas.

Los estrógenos se emplean en medicina para la terapia de sustitución de hormonas. En particular, mezclas de estrógenos se emplean para el tratamiento y la profilaxis de los trastornos de la edad climatérica que se manifiestan en las mujeres después de la menopausia natural o artificial. En este caso, se han manifestado como particularmente eficaces y bien compatibles mezclas naturales de estrógenos conjugados, tal y como se presentan en la orina de yeguas preñadas.

El contenido de material sólido disuelto en la orina de yeguas preñadas (abreviado en lo que sigue como "OYP") puede oscilar por naturaleza en amplios intervalos y puede estar, por lo general, en un intervalo de 40 - 90 g de sustancia seca por litro. Junto a la urea y demás sustancias constituyentes de la orina usuales, en el contenido de material sólido de la OYP están contenidos componentes fenólicos en cantidades de aproximadamente 2 - 5% en peso, referidas a la sustancia seca. Entre estos componentes fenólicos se encuentran cresoles y la dihidro-3,4-bis[(3-hidroxifenil)metil]-2(3H)-furanona, conocida como HPMF. Estos componentes pueden estar presentes en forma libre o conjugada. En la OYP está contenida una mezcla natural de estrógenos que se presenta ampliamente en forma conjugada, por ejemplo como sal sódica de semiéster de ácido sulfúrico (abreviada en lo que sigue como "sal sulfato"). El contenido en estrógenos conjugados (calculado como sal sulfato de estrógeno) puede oscila entre 0,3 y 1% en peso, referido a la sustancia seca.

Habitualmente, extractos con contenido en estrógenos conjugados se obtienen a partir de la OYP por extracción con un disolvente orgánico polar, no miscible o sólo poco miscible con agua, tal como por ejemplo acetato de etilo, n-butanol o ciclohexanol. En el caso de extracciones líquido-líquido de este tipo se manifiesta, sin embargo, una pluralidad de problemas, tales como una fuerte formación de espuma, una formación de sedimentos, una formación de emulsiones y una mala separación de fases. Por lo general, se requieren varias etapas de extracción, lo que conduce a pérdidas y a una obtención, sólo parcial, del contenido en estrógeno.

Para el tratamiento de pequeñas cantidades de líquidos de orina y de plasma para una determinación analítica de estrógenos mediante cromatografía de gases se propone, por Heikkinnen et al. (Clin. Chem. 27/7, (1981), 1186 - 1189) y por Shackleton et al. (Clinica Chimica Acta 107 (1980) 231 - 243) una extracción en fase sólida de estrógenos mediante un cartucho con gel de sílice silanizado con contenido de radicales octadecilsilano (cartucho C_{18} Sep-Pak®, fabricante Waters Ass. Inc. Milford, MA, EE.UU.). En este caso, los estrógenos se eluyen con metanol del cartucho. Sin embargo, no se proporcionan datos sobre las restantes sustancias contenidas en el material eluido con contenido en estrógenos.

Es misión de la presente invención desarrollar un procedimiento técnico para la obtención de la mezcla natural de estrógenos conjugados a partir de la OYP evitando los inconvenientes conocidos de las extracciones líquido-líquido hasta ahora usuales, que proporcione un producto empobrecido en sustancias constituyentes de orina fenólicas y ampliamente exento de HPMF.

Se ha encontrado ahora un procedimiento con el que, en una extracción en fase sólida en gel de sílice hidrofobizado se puede obtener una mezcla empobrecida en sustancias constituyentes de la orina fenólicas, ampliamente exenta de HPMF, pero que contiene prácticamente por completo el contenido natural en estrógenos de la OYP, que puede servir como material de partida para la preparación de los productos farmacéuticos con contenido de la mezcla natural de estrógenos conjugados a partir de la OYP como componente activo.

El procedimiento conforme a la invención para la obtención de una mezcla natural de estrógenos conjugados, empobrecida en sustancias constituyentes de la orina fenólicas a partir de la OYP se caracteriza porque

a): un líquido de orina, que representa la orina liberada de sustancias mucilaginosas y sólidas, un concentrado de esta orina o un retenido de orina concentrado, obtenido por ultrafiltración de esta orina, se trata con una cantidad de una base soluble en agua, suficiente para el ajuste de un valor del pH de al menos 12 y, a continuación, el valor del pH del líquido de orina tratado con la base se ajusta, mediante la adición de una cantidad suficiente de una solución acuosa de ácidos, a un valor del pH en el intervalo de 5 a 8,5,

b): el líquido de orina, previamente tratado con la base y ajustado a pH 5 hasta 8,5, se pone en contacto con una cantidad de un gel de sílice hidrofobizado, suficiente para la adsorción de la mezcla de estrógenos conjugados contenida en el líquido de orina, y un gel de sílice hidrofobizado, cargado con la mezcla de estrógenos conjugados, se separa del líquido de orina restante,

c): el gel de sílice hidrofobizado, cargado con la mezcla de estrógenos conjugados, se lava con una solución tampón acuosa, ajustada a un intervalo de pH de 5 a 7, en particular 5,

d): el gel de sílice hidrofobizado y lavado se pone en contacto con una cantidad de un líquido de elución, suficiente para la desorción de la mezcla de estrógenos conjugados adsorbida al gel de sílice, que representa una mezcla a base de agua y un disolvente orgánico miscible con agua del grupo de los éteres, alcanoles inferiores y cetonas alifáticas inferiores miscibles con agua, y un material eluido que contiene la mezcla natural de estrógenos conjugados se separa del gel de sílice hidrofobizado y eventualmente se concentra.

Para el procedimiento conforme a la invención, a la OYP como tal se pueden añadir un concentrado obtenido por concentración o un retenido obtenido por filtración a través de membrana. La orina recogida se libera primeramente de manera en sí conocida de sustancias mucilaginosas y sólidas. Convenientemente, se deja que las sustancias sólidas y mucilaginosas se depositen y después se las separa según métodos de separación en sí conocidos, por ejemplo decantación, separación y/o filtración. Así, la OYP puede hacerse pasar por ejemplo a través de un dispositivo de separación en sí conocido, por ejemplo un separador, una instalación de filtración o un sedimentador. Como dispositivo de separación puede servir, por ejemplo, un lecho de arena, o se pueden emplear separadores usuales en el comercio, por ejemplo separadores de boquillas o de cámaras. En caso deseado, también puede emplearse una instalación de microfiltración o una instalación de ultrafiltración, con cuyo empleo se puede conseguir al mismo tiempo una amplia carencia de gérmenes y virus de la OYP filtrada.

En caso deseado, a la orina pueden agregarse agentes conservantes, germicidas, bactericidas y/o antihelmínticos.

Si en lugar de la OYP se ha de emplear un retenido de OYP concentrado, éste se puede obtener a partir de la OYP mediante filtración a través de membrana en sí conocida. El contenido en materiales sólidos del retenido y su composición pueden variar, en función de la OYP empleada y de la membrana utilizada para la filtración a través de membrana, por ejemplo en su anchura de poros, así como en las condiciones de la filtración. Por ejemplo, en el caso de emplear una membrana de nanofiltración, se puede conseguir una concentración del contenido en estrógenos exenta de pérdidas en el retenido de OYP con eliminación simultánea de hasta 50% en peso de las sustancias constituyentes de la OYP de bajo peso molecular. Para el procedimiento conforme a la invención pueden emplearse retenidos de OYP que se concentraron hasta una relación de aproximadamente 1:10, por ejemplo una relación de aproximadamente 1:7, y cuyo volumen puede estar reducido, por consiguiente, hasta aproximadamente 1/10, por ejemplo aproximadamente 1/7 del volumen original de la OYP.

En la etapa a) del procedimiento, al líquido de orina se añade una cantidad de una base soluble en agua, suficiente para el ajuste de un valor del pH de al menos 12, en particular 13 a 14. Como bases solubles en agua son adecuadas bases inorgánicas u orgánicas, inertes y solubles en el líquido de orina, que son suficientemente fuertes como para alcanzar un valor del pH de al menos 12. Así, son adecuados hidróxidos de metales alcalinos o de metales alcalinotérreos, en particular hidróxido de sodio, o también bases orgánicas, tales como hidróxidos de alquilo inferior-amonio cuaternario. Preferentemente, la base se añade en forma de una solución acuosa con un contenido en base de al menos 20% en peso, de preferencia 40 a 60% en peso. Se manifiesta como conveniente en particular una lejía de sosa acuosa al 45 a 55%. En este tratamiento previo alcalino el valor del pH del líquido de orina se ajusta a al menos 12, por ejemplo en un intervalo de 12 a 14, de preferencia aproximadamente 13, y este valor del pH alcalino se mantiene durante un espacio de tiempo suficiente para la separación de agrupaciones de lactona contenidas en sustancias constituyentes de la orina que, en general, puede ser de 1/2 a 2 horas. Las condiciones de tratamiento han de elegirse de manera que en este caso no sean atacados los estrógenos conjugados. Así, el tratamiento tiene lugar preferentemente a temperatura ambiente con limitación de la adición de bases a la cantidad requerida para alcanzar el valor del pH deseado en el intervalo de 12 a 14. La cantidad de base requerida para alcanzar un valor del pH en el intervalo de 12 a 14 puede variar en función de la composición de la OYP empleada. En el caso de emplear lejía de sosa al 50%, se manifiestan suficientes, por lo general, cantidades de aproximadamente 100 a 700 ml de lejía de sosa al 50%, referidas a 10 l de OYP. A continuación, el líquido de orina se ajusta, mediante la adición de una solución acuosa de ácidos, a un valor del pH en el intervalo de 5 a 8,5, de preferencia 7 a 8,5, en particular 8 a 8,5. Como ácidos son adecuados ácidos inorgánicos u orgánicos inertes, solubles en el líquido de orina, tales como por ejemplo ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico o ácidos carboxílicos inferiores, tales como ácido acético. Se manifiesta como conveniente por ejemplo una solución acuosa concentrada de ácido clorhídrico. La cantidad de ácido necesaria para alcanzar el intervalo de pH antes mencionado puede variar en función de la composición de la OYP empleada y de la cantidad de base utilizada para el ajuste alcalino. En el caso de emplear una solución de ácido clorhídrico concentrada, el valor del pH deseado puede conseguirse, por lo general, por adición de aproximadamente 25 a 100 g de solución de ácido clorhídrico concentrada, referido a 1 l de OYP.

Los geles de sílice hidrofobizados, empleables en la etapa b) del procedimiento, son geles de sílice de fase inversa (abreviados, "geles de sílice RP") en sí conocidos, que son geles de sílice químicamente modificados que llevan grupos o ligandos hidrófobos funcionales. Así, por ejemplo, son adecuados geles de sílice RP silanizados que, como grupos hidrófobos funcionales, contienen radicales n-octadecildimetilsililoxi, n-octildimetilsililoxi o dimetilhidroxisililoxi. Son adecuados por ejemplo geles de sílice silanizados con tamaños medios de granos de 15 a 500 \mum. Se ha manifestado como particularmente conveniente un gel de sílice con contenido de radicales dimetilhidroxisililoxi con un tamaño medio de granos en el intervalo de 0,05 - 0,3 mm, por ejemplo el "gel de sílice 60/derivado de dimetilsilano" de la razón social Merck.

Conforme a la invención, la adsorción de los estrógenos conjugados al gel de sílice hidrofobizado puede efectuarse por contacto de la OYP eventualmente concentrada o de su retenido con el gel de sílice hidrofobizado, introduciendo el líquido de orina, previamente tratado en la etapa a) del procedimiento, en un reactor que contiene el gel de sílice y manteniéndole allí en contacto con el gel de sílice durante un tiempo suficiente para la adsorción del contenido en estrógenos. Después de realizada la adsorción de los estrógenos conjugados al gel de sílice hidrofobizado, el gel de sílice cargado con la mezcla de estrógenos conjugados se puede separar, de manera en sí conocida, del líquido de orina restante. Convenientemente, el líquido de orina puede hacerse pasar a través de una columna que contiene el gel de sílice con un caudal de paso tal que sea suficiente el tiempo de contacto para la adsorción del contenido en estrógenos. Son adecuados por ejemplo caudales de paso que correspondan a un caudal de 5 a 20 partes en volumen de OYP/1 parte en volumen de gel de sílice/hora. La adsorción se lleva a cabo preferiblemente a temperatura ambiente. Convenientemente, el caudal de paso del líquido de orina a través del reactor puede controlarse trabajando a una ligera sobrepresión o a depresión. La cantidad de gel de sílice hidrofobizado a emplear puede variar en función del tipo de gel de sílice utilizado y de la cantidad del contenido en materiales sólidos del líquido de orina previamente tratado en la etapa a) del procedimiento. En el caso de emplear OYP previamente tratada, puede cargarse por ejemplo una parte en volumen de gel de sílice hidrofobizado con hasta 80 partes en volumen de OYP previamente tratada, sin que en el líquido de orina efluyente puedan detectarse cantidades notorias de estrógeno. En el caso de utilizar un concentrado de OYP o un retenido de OYP previamente tratado, se reduce naturalmente la capacidad de carga del gel de sílice hidrofobizado en la medida en que estos estén concentrados. Así, por ejemplo, se puede cargar 1 parte en volumen de gel de sílice hidrofobizado con una cantidad de líquido de orina correspondiente a 30 hasta 80, de preferencia 40 a 50 partes en volumen de OYP.

El gel de sílice hidrofobizado cargado con la mezcla de estrógenos conjugados se lava en la etapa c) del procedimiento con una solución tampón ajustada a un intervalo de pH de 5 a 7, de preferencia aproximadamente 5. Como líquido de lavado se emplea preferiblemente una solución acuosa de ácido acético/tampón acetato ajustada a aproximadamente pH 5. Son particularmente adecuadas soluciones de ácido acético/tampón acetato 0,1 a 1 molares, de preferencia 0,1 a 0,2 molares. La cantidad de líquido de lavado se elige de manera que sea suficiente para separar ampliamente por lavado sustancias constituyentes de la orina fenólicas, sin que por ello se separen conjuntamente por lavado cantidades de estrógenos conjugados dignas de mención. Se manifiesta conveniente por ejemplo el empleo de 8 a 15, en particular 9 a 10 volúmenes de lecho de líquido de lavado por volumen de lecho de gel de sílice hidrofobizado. En este caso, el líquido de lavado se hace pasar convenientemente a través de un reactor que contiene gel de sílice hidrofobizado con un caudal de paso de 5 a 20 partes en volumen de líquido de lavado/1 parte en volumen de gel de sílice/hora.

En la etapa d) del procedimiento, el gel de sílice hidrofobizado lavado, cargado con la mezcla de estrógenos conjugados, se trata a continuación con una cantidad de un líquido de elución suficiente para la elución de la mezcla de los estrógenos conjugados, y se obtiene un material eluido que contiene la mezcla natural de los estrógenos conjugados de la OYP. El líquido de elución utilizado conforme a la invención representa una mezcla a base de agua y un éter, alcanol inferior y/o cetona alifática inferior miscible con agua. Como componentes éter del líquido de elución son adecuados éteres cíclicos miscibles con agua, tales como tetrahidrofurano o dioxano, pero también éteres de cadena abierta miscibles con agua, tales como por ejemplo etilenglicoldimetiléter (= monoglima), dietilenglicoldietiléter (= diglima) o etiloxietiloxietanol (= carbitol). Como alcanoles inferiores son adecuados alcoholes alquílicos miscibles con agua con 1 - 4, de preferencia 1 - 3 átomos de carbono, en particular etanol o isopropanol. Como cetonas alifáticas inferiores son adecuadas cetonas miscibles con agua con 3 - 5 átomos de carbono, en particular acetona. Como particularmente favorables se manifiestan líquidos de elución en los que el disolvente orgánico es etanol. En el líquido de elución puede estar presente una relación en volumen de disolvente orgánico miscible con agua a agua en el intervalo de 40:60 a 20:80, de preferencia aproximadamente 30:70. La cantidad empleada de agente eluyente puede ascender a aproximadamente 3 a 5 volúmenes de lecho por volumen de lecho de gel de sílice hidrofobizado. Convenientemente, el líquido de elución se hace pasar a través de un reactor que contiene el gel de sílice hidrofobizado cargado con la mezcla de estrógenos con un caudal de paso tal que el tiempo de contacto sea suficiente para la elución completa de la mezcla de estrógenos conjugados. En el caso de emplear una mezcla de tetrahidrofurano y/o etanol con agua en la relación en volumen 30:70 son adecuados, por ejemplo, caudales de paso de 5 a 20 partes en volumen de líquido de elución por 1 parte en volumen de gel de sílice por hora. Convenientemente, el caudal de paso se regula trabajando a presión ligeramente elevada, por ejemplo a una sobrepresión de hasta 0,2 bares, y el material eluido se recoge en varias fracciones. Los contenidos de las distintas fracciones de material eluido en estrógenos conjugados y sustancias constituyentes de la orina fenólicas, tales como cresoles y HPMF, se pueden determinar de manera en sí conocida por cromatografía líquida de alta resolución (abreviada como "HPLC").

Durante la elución, se obtiene primeramente una fracción de cabeza desde débilmente coloreada a incolora, prácticamente exenta de estrógenos, cuya cantidad corresponde en general aproximadamente a un volumen de lecho. La cantidad principal de los estrógenos conjugados, por ejemplo entre 80 y 99% de los estrógenos conjugados presentes en la OYP de partida, se encuentra en las siguientes fracciones de material eluido principales de color amarillo oscuro-pardo, cuya cantidad abarca en general 1 a 2 volúmenes de lecho. En las siguientes fracciones de cola, por lo general, ya sólo están contenidas trazas de estrógenos conjugados. Si se obtienen fracciones de cola que todavía contienen un contenido en estrógenos conjugados superior a 10% en peso, referido a la sustancia seca, y menos de 0,6% en peso, referido a la sustancia seca, en cresoles de HPMF, estas fracciones pueden reunirse para el tratamiento ulterior con el material eluido principal rico en estrógenos.

El material eluido principal separado de la manera precedentemente descrita del gel de sílice contiene la mezcla de estrógenos conjugados natural que se manifiesta en la OYP junto a sólo una pequeña proporción del contenido en sustancias constituyentes de la orina fenólicas, presente originalmente en la OYP. Este material eluido puede servir como material de partida para la preparación de medicamentos que contienen la mezcla natural de estrógenos conjugados. En caso deseado, el material eluido se puede concentrar ulteriormente, de manera en sí conocida, con el fin de obtener un concentrado ampliamente liberado de disolvente orgánico y adecuado para el tratamiento ulterior galénico. En caso deseado, también se puede preparar mediante secado por atomización una mezcla de materiales sólidos exenta de agentes eluyentes. Si la mezcla natural de estrógenos conjugados se ha de utilizar para la preparación de medicamentos sólidos, puede ser conveniente añadir por mezclado al material eluido que contiene los estrógenos conjugados un material de soporte sólido ya antes de una concentración o secado por atomización, con el fin de obtener de este modo una mezcla de materiales sólidos que contenga los estrógenos conjugados y los materiales de soporte. Tanto el material eluido que contiene la mezcla de estrógenos, como también un concentrado preparado a partir del anterior o un producto de material sólido secado por atomización, pueden incorporarse, de manera en sí conocida, en preparados galénicos sólidos o líquidos, tales como por ejemplo comprimidos, grageas, cápsulas o emulsiones. Estos preparados galénicos pueden producirse según métodos en sí conocidos empleando sustancias de soporte sólidas o líquidas usuales, tales como por ejemplo almidón, celulosa, lactosa o talco, o parafinas líquidas y/o con empleo de sustancias auxiliares farmacéuticas usuales, por ejemplo agentes disgregantes de tabletas, inductores de disolución o agentes conservantes. Así, el producto que contiene los estrógenos conjugados puede mezclarse de manera en sí conocida con las sustancias de soporte y auxiliares farmacéuticas y la mezcla se puede transformar en una forma de dosificación adecuada.

Los siguientes ejemplos han de explicar más detalladamente la invención, pero sin limitar su alcance.

Ejemplos 1 - 5

Prescripción de trabajo general para la obtención de un extracto a base de OYP ampliamente empobrecido en sustancias constituyentes de la orina fenólicas y que contiene la mezcla natural de los estrógenos conjugados contenidos en la OYP.

A) Tratamiento previo de la OYP

10 l de una OYP filtrada a través de un lecho de arena de 5 cm de altura o a través de una instalación de microfiltración (contenido en sustancia seca (= SS) y también contenidos en estrógenos conjugados (calculados como sal sulfato de estrona) determinados mediante HPLC, véase la siguiente tabla de ejemplos) se ajustan a pH 13 bajo intensa agitación mediante la adición de una solución acuosa de hidróxido de sodio al 50% (densidad a 20ºC = 1,52 g/ml) (cantidad añadida de NaOH, véase la Tabla de ejemplos) y se agita durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, el líquido de orina alcalino se ajusta a un valor del pH de 8 a 8,5 mediante la adición de una solución acuosa de ácido clorhídrico concentrada (aproximadamente al 35%).

B) Adsorción del contenido en estrógenos de la OYP a gel de sílice RP

Se llena una columna de 5 cm de altura con un diámetro de 5 cm con 100 g (\underline{\wedge} un volumen de aproximadamente 193 ml = 1 lecho en volumen) de gel de sílice RP (= "gel de sílice 60/derivado de dimetilsilano" de la razón social Merck, nº de pedido 7719, tamaño de granos 63 a 200 \mum). La columna se lava primeramente con 0,5 l de agua, después con 0,25 l de metanol y de nuevo con 0,5 l de agua.

El líquido de orina previamente tratado en el apartado A) se hace pasar a través de la columna con una sobrepresión de 0,2 bares y con un caudal de paso de 60 ml/minuto. El contenido en estrógenos de la OYP está adsorbido por completo a la columna de gel de sílice RP así cargada. El líquido de orina que se evacúa se exa-mina mediante HPLC en cuanto a su contenido en sal sulfato de estrógeno y se manifiesta como prácticamente exenta de estrógenos. El material evacuado se desecha.

C) Lavado de la columna de gel de sílice de RP cargada

La columna de gel de sílice RP cargada se lava con 2 l (\underline{\wedge} aproximadamente 10 lechos en volumen) de una solución de 0,15 molar de ácido acético/tampón acetato de sodio. La solución tampón se prepara añadiendo a una solución acuosa de ácido acético 0,15 molar acetato de sodio sólido (aproximadamente 107 g) hasta alcanzar un pH de 5. El líquido de lavado que se evacúa se examina mediante HPLC en cuanto a su contenido en sal sulfato de estrona, cresol y HPMF, y contiene menos de 5% del contenido en estrógenos de la OYP de partida.

D) Desorción de los estrógenos conjugados de la columna de gel de sílice RP lavada y separación de una fracción de material eluido rica en estrógenos

1 l del líquido de elución (mezcla de agua/disolvente, composición véase la siguiente Tabla de ejemplos) se hace pasar a través de la columna con una sobrepresión de 0,2 bares y un caudal de aproximadamente 60 ml/min. El material eluido que se evacúa se recoge en varias fracciones (volumen en cada caso aproximadamente 200 ml \underline{\wedge} aproximadamente 1 lecho en volumen). Las fracciones individuales se examinan mediante HPLC en cuanto a su contenido en sal sulfato de estrona, cresol y HPMF. La primera fracción se recoge hasta que el material eluido aparezca de incoloro a coloreado de amarillo pálido. El volumen de esta fracción es 150 a 200 ml. Esta fracción contiene sólo trazas de sal sulfato de estrona.

Tan pronto como se manifiesta un cambio de color del material eluido en un color amarillo oscuro intenso a pardo, se recoge la siguiente fracción de aproximadamente 200 ml. En esta fracción está contenido aproximadamente 80 a 98% de toda la cantidad de estrógenos conjugados cargada en la columna. Las restantes fracciones ya sólo contienen pequeñas cantidades de sal sulfato de estrona. En caso deseado, se pueden aportar de nuevo a la etapa B) del procedimiento después de la separación por destilación del contenido en disolvente.

Para la 2ª fracción que contiene la cantidad principal de los estrógenos conjugados se indican en la siguiente Tabla de ejemplos en cada caso el contenido en SS en % en peso y los contenidos en sal sulfato de estrona, cresol y HPMF determinados mediante HPLC. Esta fracción representa un extracto adecuado para un tratamiento ulterior galénico.

E) Regeneración de la columna de gel de sílice RP

Para la regeneración, la columna se lava primeramente con 2 l de agua, después con 0,5 l de metanol y de nuevo con 2 l de agua. Después, la columna se puede emplear de nuevo para el procedimiento. La columna se puede regenerar varias veces, por ejemplo hasta 10 veces, y utilizar de nuevo.

1

2

Claims

1. Procedimiento para la obtención de una mezcla natural de estrógenos conjugados, empobrecida en sustancias constituyentes de la orina fenólicas a partir de la urea de yeguas preñadas, caracterizado porque

a): un líquido de orina, que representa la orina liberada de sustancias mucilaginosas y sólidas, un concentrado de esta orina o un retenido de orina concentrado, obtenido por filtración a través de membrana de esta orina, se trata con una cantidad de una base soluble en agua, suficiente para el ajuste de un valor del pH de al menos 12 y, a continuación, el valor del pH del líquido de orina tratado con la base se ajusta, mediante la adición de una cantidad suficiente de una solución acuosa de ácidos, a un valor del pH en el intervalo de 5 a 8,5,

c): el gel de sílice hidrofobizado, cargado con la mezcla de estrógenos conjugados, se lava con una solución tampón acuosa, ajustada a un intervalo de pH de 5 a 7, y

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa a) del procedimiento del líquido de orina se mezcla con la base, preferiblemente con una solución acuosa de la base y se mantiene al valor del pH de al menos 12 durante un espacio de tiempo suficiente para la disociación de agrupaciones lactona contenidas en las sustancias constituyentes de la orina.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque como gel de sílice hidrofobizado se emplea un gel de sílice silanizado que porta radicales dimetilhidroxisililoxi.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque en la etapa b) del procedimiento se carga 1 parte en volumen de gel de sílice hidrofobizado con una cantidad de líquido de orina correspondiente a 30 a 80, de preferencia 40 a 50 partes en volumen de orina.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque en la etapa b) del procedimiento el líquido de orina se hace pasar a través de un reactor que contiene el gel de sílice hidrofobizado, con un caudal de paso que corresponde a un caudal de 5 a 20 partes en volumen de urea/1 parte en volumen de gel de sílice hidrofobizado/hora.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la solución tampón acuosa empleada como líquido de lavado en la etapa c) del procedimiento es una solución de ácido acético/tampón acetato acuosa ajustada a aproximadamente pH 5.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque en la etapa d) del procedimiento se emplea como líquido de elución una mezcla a base de agua y un disolvente orgánico miscible con agua con una relación en volumen de disolvente orgánico a agua en el intervalo de 20:80 a 40:60, en particular 30:70.