ES2315691T3

ES2315691T3 - Procedimiento de obtencion de una mezcla natural de estrogenos equinos conjugados.

Info

Publication number: ES2315691T3
Application number: ES04766209T
Authority: ES
Inventors: Heinz-Helmer Rasche; Kirsten Wilbrand; Sabine Banschbach
Original assignee: Solvay Pharmaceuticals GmbH
Current assignee: Abbott Products GmbH
Priority date: 2003-07-17
Filing date: 2004-07-13
Publication date: 2009-04-01
Anticipated expiration: 2024-07-13
Also published as: JP4691028B2; HK1091841A1; EP1648916B1; WO2005010021A1; AR045908A1; AU2004259093A1; DE502004008218D1; MXPA06000645A; TWI355388B; EP1648916A1; RU2351607C2; BRPI0412877A; JP2009513561A; TW200505940A; RU2006104674A; AU2004259093B2; ATE410435T1; US20050032767A1; CA2529009A1; CN1805971A

Abstract

Procedimiento para la obtención de una mezcla natural de estrógenos conjugados a partir de la orina de yeguas preñadas, en el que a) un líquido de orina, que eventualmente constituye un líquido de orina liberado de sustancias mucosas y sólidas, un concentrado obtenido por evaporación de este líquido de orina o un material retenido de orina concentrado por evaporación, que se ha obtenido mediante filtración de este líquido de orina a través de una membrana, se pone en contacto con una cantidad de una resina adsorbente polimérica que es suficiente para la adsorción de la mezcla de estrógenos conjugados, que está contenida en el líquido de orina, y se separa con respecto del restante líquido de orina una resina adsorbente polimérica cargada con la mezcla de estrógenos conjugados, y b) la resina adsorbente polimérica, cargada con la mezcla de estrógenos conjugados, se lava con un agua de lavado ajustada a un valor del pH de por lo menos 12,0, y c) eventualmente se realiza un lavado intermedio, en el que la resina adsorbente polimérica, cargada con la mezcla de estrógenos conjugados, se lava con agua, y d) la resina adsorbente lavada se pone en contacto con una cantidad de un líquido para elución que es suficiente para la desorción de la mezcla de estrógenos conjugados, que está adsorbida a ella, y e) un material eluido, que contiene la mezcla natural de estrógenos conjugados, se separa con respecto de la resina adsorbente y eventualmente se concentra por evaporación, caracterizado porque la mezcla natural de estrógenos equinos conjugados, que se ha obtenido, está empobrecida en cuanto a sustancias fenólicas constitutivas de la orina y en cuanto a compuestos lipófilos no conjugados, tomados entre el conjunto que comprende flavonoides no conjugados, isoflavonoides no conjugados, nor-isoprenoides no conjugados, esteroides no conjugados, en particular esteroides de androstanos y pregnanos, y compuestos no conjugados comparables, y porque como líquido para elución en la etapa (d) de procedimiento se utiliza una mezcla monofásica o bifásica, que contiene y (i) agua, que se ha ajustado eventualmente a un valor del pH situado en el intervalo alcalino, (ii) por lo menos un disolvente orgánico no miscible o apenas miscible con agua, que es apropiado para la elución de compuestos lipófilos no conjugados tomados entre el conjunto antes indicado, y eventualmente y (iii) por lo menos un disolvente orgánico miscible con agua, seleccionado entre el conjunto que consta de éteres, alcanoles inferiores y cetonas alifáticas inferiores, miscibles con agua, así como mezclas de los disolventes antes mencionados, porque, en el caso de que el material eluido, eventualmente concentrado por evaporación, obtenido en la etapa e) de procedimiento, constituya una mezcla bifásica, en una etapa f) de procedimiento se separa la fase acuosa del material eluido obtenido, que consta de dos fases, y se obtiene una fase acuosa, que contiene la mezcla natural de estrógenos conjugados, y esta última, eventualmente, se concentra por evaporación.

Description

Procedimiento de obtención de una mezcla natural de estrógenos equinos conjugados.

El presente invento se refiere a la obtención de una mezcla natural de estrógenos equinos conjugados, que se ha empobrecido en cuanto a sustancias fenólicas constitutivas de la orina y en cuanto a compuestos lipófilos no conjugados tomados entre el conjunto que comprende flavonoides no conjugados, isoflavonoides no conjugados, nor-isoprenoides no conjugados, esteroides no conjugados, en particular esteroides de androstanos y pregnanos, y compuestos no conjugados comparables.

Los estrógenos se emplean en la medicina para la terapia por sustitución de hormonas. En particular, se emplean mezclas de estrógenos para el tratamiento y la profilaxis de los trastornos de la edad climatérica, que aparecen en las mujeres, después de una menopausia natural o artificial. En este caso, se han manifestado como especialmente eficaces y bien tolerables ciertas mezclas naturales de estrógenos conjugados, como las que se presentan en la orina de yeguas preñadas, designadas en lo sucesivo como mezclas naturales de estrógenos equinos conjugados.

El contenido de materiales sólidos disueltos en la orina de yeguas preñadas (del inglés Pregnant Mares Urine, en lo sucesivo designada abreviadamente como "PMU") puede fluctuar, de un modo natural, dentro de amplios intervalos y estar situado por lo general en un intervalo de 40 a 90 g de sustancia seca por litro. Junto a urea y otros usuales constituyentes de la orina, en el contenido de materiales sólidos de la PMU están incluidos constituyentes fenólicos en unas proporciones de aproximadamente 2 a 5% en peso, referidas a la sustancia seca. Dentro de estos constituyentes fenólicos se encuentran cresoles y la dihidro-3.4-bis[(3-hidroxi-fenil)metil]-2(3H)-furanona, que es conocida como HPMF. Estos compuestos pueden presentarse en forma libre o conjugada. En la PMU está contenida una mezcla natural de estrógenos, que se presenta ampliamente en una forma conjugada, p.ej. como sal de sodio de semiésteres de ácido sulfúrico (en lo sucesivo designada abreviadamente como "sal sulfato"). El contenido de estrógenos conjugados (calculado como la sal sulfato de estrógenos) puede encontrarse entre 0,1 y 0,5% en peso referido a la sustancia seca. Adicionalmente, en el contenido de materiales sólidos de la PMU pueden presentarse otros compuestos lipófilos, cuyas proporciones pueden variar dentro de amplios intervalos y no son previsibles. Estos compuestos lipófilos proceden predominantemente de las plantas ingeridas como nutrición por las yeguas preñadas, y abarcan sobre todo diferentes derivados de flavonoides, isoflavonoides, nor-isoprenoides y compuestos comparables, tales como por ejemplo formononetina, genisteína, daidzeína, biochanina A, equol y coumestrol. Estos compuestos lipófilos, que originalmente son de procedencia vegetal, se pueden presentar en la orina en una forma conjugada o en una forma libre (no conjugada). Entre los constituyentes lipófilos, presentes además en el contenido de materiales sólidos de la PMU, se cuentan también derivados de esteroides no conjugados; aquí se han de mencionar en particular los esteroides de androstanos y pregnanos, pero también los derivados de estrógenos no conjugados.

Las mezclas naturales de extractos, que contienen estrógenos conjugados, se obtienen usualmente, ya sea mediante un procedimiento de extracción en fase sólida o bien mediante un procedimiento, que se basa en diferentes etapas de extracción líquido - líquido con disolventes orgánicos no miscibles con agua o solamente poco miscibles con agua. Por lo general, se realiza que la mezcla natural obtenida de estrógenos conjugados, con el fin de poderse utilizar como componente de principio activo para productos farmacéuticos, debe cumplir determinadas especificaciones farmacéuticas, por ejemplo debe corresponder a la especificación establecida en la USP (de United States Pharmacopeia = Farmacopea de los Estados Unidos) o en la Farmacopea Europea. Así, en lo que se refiere al contenido de estrógenos conjugados, se deben respetar determinados valores límites, referidos a la sustancia seca.

Las patentes de los EE.UU. Nº 2.551.205 y Nº 2.429.398 describen un procedimiento para la preparación de una formulación soluble en agua de estrógenos, procedente de una PMU, en el que, en primer lugar, por adsorción a carbón activo u otros materiales adsorbentes apropiados, elución con un disolvente orgánico miscible con agua, tal como p.ej. piridina, y por subsiguiente eliminación del disolvente, se obtiene un concentrado acuoso, que contiene la mayor parte de los constituyentes estrógenos, solubles en agua, de la PMU empleada originalmente. Mientras que en la patente de los EE.UU. Nº 2.429.398 el concentrado es purificado adicionalmente por extracción con benceno y/o con un éter, en la patente de los EE.UU. Nº 2.551.205 se describe que el concentrado es acidificado a un valor del pH comprendido entre 2 y 6, de modo preferido entre 4 y 5, y luego es extraído rápidamente con un disolvente orgánico apenas miscible con agua, tomado entre el conjunto de los hidrocarburos alifáticos, aromáticos o alicíclicos (p.ej. hexano, benceno, tolueno, ciclohexano) o de los hidrocarburos clorados (p.ej. cloroformo, dicloruro de etileno, tricloroetileno, tetracloruro de carbono, clorobenceno), con el fin de separar sustancias indeseadas, tales como grasas, aceites, constituyentes fenólicos libres, y los esteroides no conjugados, por transferencia a la fase orgánica. Finalmente, la fase acuosa es estabilizada por neutralización. La patente de los EE.UU. Nº 2.551.205 recomienda purificar adicionalmente el extracto obtenido mediante subsiguientes etapas de extracción y precipitaciones. En conjunto, después de la realización del procedimiento descrito en la patente de los EE.UU. Nº 2.551.205, se obtiene sólo un rendimiento de aproximadamente 80% de los constituyentes estrógenos del concentrado empleado.

En la patente de los EE.UU. Nº 2.565.115 se describe la extracción con acetona de los estrógenos conjugados a partir de una PMU. No se da ninguna información ni ninguna predicción acerca de la pureza de la fracción obtenida de estrógenos.

La patente de los EE.UU. Nº 2.696.265 describe un procedimiento, en el que en primer lugar los estrógenos se extraen con un alcohol o una cetona de carácter alifático, tal como hexanol, ciclohexanol o ciclohexanona. Los estrógenos pasan a la fase orgánica, y a continuación se purifican adicionalmente, entre otros métodos una fase acuosa que contiene los estrógenos se ajusta con ácido clorhídrico a un valor del pH de 4, y se extrae con dicloruro de etileno.

En la patente de los EE.UU. Nº 2.834.712 se divulga un procedimiento para la preparación de mezclas de estrógenos con una pureza significativa y una toxicidad pequeña, que se basa en un gran número de etapas individuales de extracción con diferentes disolventes y en el ajuste de diferentes valores del pH. En tal caso, encuentran utilización grandes volúmenes de disolventes tales como hexano y benceno. Así, p.ej., en una etapa, un concentrado ya purificado se disuelve en agua, se ajusta con ácido clorhídrico a un valor del pH de aproximadamente 5,0, y se extrae con benceno y a continuación con un éter, con el fin de separar los constituyentes fenólicos.

La solicitud de patente internacional WO 01/27134 describe un procedimiento comparativamente sencillo, para extraer estrógenos conjugados a partir de una PMU. Después de haber añadido una sal, tal como p.ej. cloruro de sodio, la PMU se extrae con por lo menos la misma proporción en volumen de un disolvente orgánico, tal como p.ej. acetato de etilo, en este caso los estrógenos conjugados pasan a la fase orgánica. La fase orgánica se separa y se seca, para obtener el extracto. En el documento WO 01/27134 no se da ninguna información ni ninguna predicción acerca de la pureza del extracto obtenido de estrógenos conjugados.

En el caso del procedimiento de extracción líquido - líquido, descrito precedentemente y conocido a partir del estado de la técnica, aparecen sin embargo un gran número de problemas, tales como una fuerte formación de espuma, una formación de sedimentos, una formación de emulsiones y una mala separación entre fases. Por lo general, se necesitan varias etapas de extracción, lo cual conduce a pérdidas y a una obtención solamente parcial del contenido de estrógenos. Además, estos procedimientos de extracción necesitan grandes volúmenes de disolventes, que en parte son perjudiciales para la salud. Además, en los documentos de patente antes señalados no se da ninguna información ni acerca del contenido de constituyentes lipófilos no conjugados, tales como por ejemplo derivados no conjugados de flavonoides, isoflavonoides, nor-isoprenoides y compuestos no conjugados comparables, ni tampoco de esteroides no conjugados, en particular esteroides de androstanos y pregnanos, en los productos obtenidos, ni acerca de una separación de estos constituyentes. Estos procedimientos conocidos a partir del estado de la técnica, o bien no proporcionan resultados satisfactorios algunos en lo que se refiere al rendimiento ni en lo que se refiere a la pureza del extracto obtenido, medida por medio del contenido obtenido de hormonas totales, referido a la sustancia seca, o se basan en un gran número de diferentes etapas de procedimiento y en la utilización de grandes volúmenes de disolventes orgánicos, y en parte incluso de disolventes indeseados desde un punto de vista toxicológico.

Además, a partir del estado de la técnica se conocen diferentes procedimientos de extracción en fase sólida, para obtener una mezcla natural de estrógenos equinos conjugados, ampliamente empobrecida en cuanto a sustancias fenólicas constitutivas de la orina.

Así, la solicitud de patente internacional WO 98/08526 describe un procedimiento, con el que en una extracción en fase sólida en presencia de una resina adsorbente polimérica semipolar, en particular una resina semipolar no iónica, empobrecida en cuanto a sustancias fenólicas constitutivas de la orina, ampliamente exenta de cresoles y HPMF, se puede obtener la mezcla natural que contiene prácticamente de modo total el contenido de estrógenos de la PMU. En la solicitud de patente internacional WO 98/08526 se describe un procedimiento similar, en el que pasa a emplearse gel de sílice como material adsorbente para la extracción en fase sólida. También la solicitud de patente china CN 1308083 describe un procedimiento comparable, en el que se utilizan resinas adsorbentes polares que contienen grupos ciano. Además, en la solicitud de patente de los EE.UU. US 2002/0156303 se describe un procedimiento, en el que la PMU, antes de la purificación a través de una resina adsorbente de poliestireno, se trata en primer lugar con un disolvente alcalino y se purifica previamente por filtración. Los extractos obtenidos son adecuados como material de partida para la preparación de productos farmacéuticos, que como componente de principio activo contiene la mezcla natural de estrógenos conjugados, procedente de una PMU.

Los requisitos establecidos por las especificaciones farmacéuticas, por ejemplo los valores límites que se han de respetar en lo que se refiere al contenido de estrógenos conjugados, referido a la sustancia seca, son cumplidos normalmente por las mezclas de estrógenos conjugados que se han obtenido a partir de una PMU de acuerdo con el procedimiento del documento WO 98/08526 o con el procedimiento del documento WO 98/08525. En particular, con ayuda de los procedimientos allí divulgados se puede obtener un producto ampliamente exento de cresol y HPMF, empobrecido en cuanto a sustancias fenólicas constitutivas de la orina. Sin embargo, se ha puesto de manifiesto que, junto al contenido deseado de estrógenos conjugados, en la sustancia seca obtenida pueden estar contenidos también compuestos lipófilos no conjugados. Entre los compuestos lipófilos no conjugados se cuentan, por ejemplo, diferentes derivados de flavonoides, isoflavonoides, nor-isoprenoides y compuestos no conjugados comparables, tales como por ejemplo formononetina, genisteína, daidzeína, biochanina A, equol y coumestrol, pero también esteroides no conjugados, en particular esteroides de androstanos y pregnanos, y esteroides no conjugados, en particular esteroides de androstanos y pregnanos, y estrógenos no conjugados, no teniendo que considerarse como concluyente esta enumeración. La presencia de estos compuestos lipófilos no conjugados en la mezcla de estrógenos conjugados, que se ha obtenido a partir de una PMU, no se puede normalizar, sino que tanto el contenido como también la composición de los compuestos lipófilos libres y de los conjugados varían por ejemplo en dependencia de la nutrición ingerida por las yeguas preñadas.

Ciertamente, la composición de la mezcla natural de estrógenos equinos conjugados no se modifica por la presencia adicional de los compuestos lipófilos no conjugados, pero puede haberse disminuido el contenido de los estrógenos equinos conjugados, referido a la sustancia seca. Mediante una separación planificada de los constituyentes lipófilos no conjugados, se podría conseguir una concentración más alta de las sustancias activas, es decir de los estrógenos equinos conjugados, en el extracto obtenido. Además, una separación de los compuestos lipófilos no conjugados garantiza una composición más uniforme de las cargas de extractos individuales, puesto que de esta manera se eliminan los constituyentes lipófilos no conjugados, cuyo contenido y cuya composición en una PMU pueden variar en dependencia del tipo de la nutrición ingerida por las yeguas preñadas, que es variable dependiendo de la estación anual, y por consiguiente los extractos obtenidos tienen todos ellos un contenido comparable de estrógenos equinos conjugados, referido a la sustancia seca. Además, puede ser ventajosa una separación de los compuestos lipófilos no conjugados, a fin de conseguir un espectro fisiológico uniforme de efectos. Por ejemplo, puede ser oportuno separar compuestos lipófilos no conjugados eventualmente presentes, que posiblemente pueden poseer por sí mismos un efecto fisiológico propio, a partir de la mezcla natural de estrógenos equinos conjugados.

Una posibilidad, de separar los indeseados compuestos lipófilos no conjugados, sería por ejemplo someter las mezclas naturales de estrógenos equinos conjugados, obtenidas con ayuda de los conocidos procedimientos de extracción en fase sólida, que antes se han expuesto, a una extracción líquido - líquido realizada por separado con un disolvente orgánico apropiado, que extraiga planificadamente los indeseados compuestos lipófilos no conjugados, sin conducir a una pérdida de estrógenos equinos conjugados. Un procedimiento de este tipo se describe, de forma general, en la solicitud de patente internacional PCT/EP 03/50703 dependiente.

El presente invento se ha establecido como misión desarrollar un procedimiento, que sea óptimo desde puntos de vista técnicos y económicos, para la obtención de una mezcla natural de estrógenos equinos conjugados, realizándose que la mezcla ha de estar ampliamente empobrecida tanto en cuanto a sustancias fenólicas constitutivas de la orina como también en cuanto a compuestos lipófilos no conjugados, en particular en cuanto a derivados no conjugados de flavonoides, isoflavonoides y nor-isoprenoides. En particular, la misión del presente invento es desarrollar un procedimiento que no exija ninguna etapa de trabajo adicional, en comparación con los procedimientos ya conocidos para la obtención de mezclas naturales de estrógenos equinos conjugados. Es misión del presente invento realizar el desarrollo de un procedimiento en el que el empobrecimiento, tanto en cuanto a sustancias fenólicas constitutivas de la orina como también en cuanto a compuestos lipófilos no conjugados, se efectúe durante una extracción en fase sólida. Además, se debe desarrollar un procedimiento, que se base solamente en pocas etapas de procedimiento, y en tal contexto suministre un extracto de estrógenos equinos conjugados, que tenga un contenido comparablemente alto de estrógenos conjugados, referido a la sustancia seca. Además, con el procedimiento del presente invento debe ser posible, de una manera sencilla, obtener una mezcla natural de estrógenos conjugados a partir de una orina de yeguas preñadas también en el caso de que la orina contenga cantidades variables y eventualmente elevadas de compuestos lipófilos no conjugados. Es misión del presente invento desarrollar un procedimiento optimizado para la extracción en fase sólida, de manera tal que la mezcla natural obtenida de estrógenos equinos conjugados presente unos buenos contenidos de principio activo, y cumpla las especificaciones farmacéuticas exigidas, en particular éste debe respetar los necesarios valores límites cin respecto al contenido de estrógenos conjugados, referido a la sustancia seca.

Se encontró, por fin, un procedimiento con el cual se puede obtener a partir de una PMU, de una manera sorprendentemente sencilla, una mezcla de estrógenos equinos conjugados, ampliamente exenta de cresoles y HPMF, empobrecida en cuanto a sustancias constitutivas fenólicas, que al mismo tiempo también esté ampliamente empobrecida en cuanto a compuestos lipófilos no conjugados, en particular derivados no conjugados de flavonoides, isoflavonoides y nor-isoprenoides, incluso en el caso de que la PMU tenga cantidades variables y eventualmente elevadas de compuestos lipófilos no conjugados.

El procedimiento conforme al invento se basa en etapas esenciales en el procedimiento descrito en el documento WO 98/08526, que sirve para la obtención, a partir de una PMU, de una mezcla natural de estrógenos conjugados, empobrecida en cuanto a sustancias fenólicas constitutivas de la orina. Además, el procedimiento conforme al invento se basa en el procedimiento descrito en la solicitud de patente internacional WO 03/048183, con el que, incluso en el caso de la utilización de una PMU envejecida, que eventualmente contenga proporciones aumentadas de estrógenos libres, se pueda obtener una mezcla natural de estrógenos conjugados, que cumpla las especificaciones farmacéuticas exigidas.

Por consiguiente, el invento se refiere a un procedimiento para la obtención de una mezcla natural de estrógenos conjugados a partir de la orina de yeguas preñadas, en el que

a) un líquido de orina, que eventualmente constituye un líquido de orina liberado de sustancias mucosas y sólidas, un concentrado obtenido por evaporación de este líquido de orina o un material retenido de orina concentrado por evaporación, que se ha obtenido mediante filtración de este líquido de orina a través de una membrana, se pone en contacto con una cantidad de una resina adsorbente polimérica que es suficiente para la adsorción de la mezcla de estrógenos conjugados que está contenida en el líquido de orina, y se separa con respecto del restante líquido de orina una resina adsorbente polimérica cargada con la mezcla de estrógenos conjugados, y

b) la resina adsorbente polimérica, cargada con la mezcla de estrógenos conjugados, se lava con un agua de lavado ajustada a un valor del pH de por lo menos 12,0, en particular de 12,5 a 14,0, y

c) eventualmente se realiza un lavado intermedio, en el que la resina adsorbente polimérica, cargada con la mezcla de estrógenos conjugados, se lava con agua, y

d) la resina adsorbente lavada se pone en contacto con una cantidad de un líquido para elución, que es suficiente para la desorción de la mezcla de estrógenos conjugados, que está adsorbida a ella, y

e) un material eluido, que contiene la mezcla natural de estrógenos conjugados, se separa con respecto de la resina adsorbente y eventualmente se concentra por evaporación,

distinguiéndose el procedimiento conforme al invento, con respecto a los procedimientos del estado de la técnica, por los hechos

de que la mezcla natural de estrógenos equinos conjugados, que se ha obtenido, está empobrecida en cuanto a sustancias fenólicas constitutivas de la orina y en cuanto a compuestos lipófilos no conjugados, tomados entre el conjunto que comprende flavonoides no conjugados, isoflavonoides no conjugados, nor-isoprenoides no conjugados, esteroides no conjugados, en particular esteroides de androstanos y pregnanos, y a compuestos no conjugados comparables, y

de que como líquido para elución en la etapa (d) de procedimiento se utiliza una mezcla monofásica o bifásica, que contiene

(i) agua, que se ha ajustado eventualmente a un valor del pH situado en el intervalo alcalino,

y

(ii) por lo menos un disolvente orgánico no miscible o apenas miscible con agua, que es apropiado para la elución de compuestos lipófilos no conjugados tomados entre el conjunto antes indicado,

y eventualmente

(iii) por lo menos un disolvente orgánico miscible con agua, seleccionado entre el conjunto que consta de éteres, alcanoles inferiores y cetonas alifáticas inferiores, miscibles con agua, así como mezclas de los disolventes antes mencionados,

y

de que, en el caso de que el material eluido, eventualmente concentrado por evaporación, obtenido en la etapa e) de procedimiento, constituya una mezcla bifásica, se separa la fase acuosa del material eluido obtenido, que consta de dos fases, y se obtiene una fase acuosa, que contiene la mezcla natural de estrógenos conjugados, y esta última, eventualmente, se concentra por evaporación.

La preparación preliminar de las cargas, es decir las etapas a), b), d) y e) de procedimiento, en sí conocidas, así como la utilización del material eluido obtenido en la etapa e) de procedimiento, que contiene una mezcla de estrógenos conjugados naturales, ya se han descrito en términos generales en la solicitud de patente internacional WO 98/08526 como etapas a), b) y c) de procedimiento, y por consiguiente resultan familiares y habituales para un experto en la especialidad a partir de esta solicitud de patente publicada. La etapa c) de procedimiento, en sí conocida, del presente invento está descrita en términos generales como "lavado intermedio" en la solicitud de patente internacional PCT/EP02/13343 y, por consiguiente, es habitual para el experto en la materia a partir de esta solicitud de patente publicada. El contenido de este documento WO 98/08526, así como del documento WO 03/048183 para la finalidad de la divulgación, se hace también objeto de la presente solicitud. Otros detalles acerca del modo de proceder general y de los materiales que se pueden emplear, se recopilan en la parte de Ejemplos de la presente solicitud.

Por ejemplo, de acuerdo con el documento WO 98/08526 se pueden emplear resinas adsorbentes semipolares, en particular las semipolares no iónicas. Además de esto, de acuerdo con el procedimiento de la presente solicitud es posible sorprendentemente también emplear otras resinas adsorbentes juntamente con la del procedimiento conforme al invento, sin que se perjudique la calidad de los productos ni la especificación farmacéutica que se ha de respetar. Así, dentro del marco del presente invento, las resinas adsorbentes poliméricas son apropiadas para su empleo como adsorbente para el procedimiento conforme al invento. Las resinas adsorbentes poliméricas, utilizables dentro del marco del presente invento, se explican todavía con mayor detalle en la parte de Ejemplos de la memoria descriptiva.

Conforme al invento, con el presente procedimiento se obtiene una mezcla natural de estrógenos equinos conjugados, que está empobrecida tanto en cuanto a sustancias fenólicas constitutivas de la orina, tales como cresoles y HPMF, como también en cuanto a compuestos lipófilos no conjugados, tomados entre el conjunto que comprende flavonoides no conjugados, isoflavonoides no conjugados, nor-isoprenoides no conjugados, esteroides no conjugados, en particular esteroides de androstanos y pregnanos, y en cuanto a compuestos no conjugados comparables.

Después de la realización de las etapas (a) hasta (c) de procedimiento, de por sí conocidas, para tal fin en la etapa (d) de procedimiento la resina adsorbente lavada, cargada con la mezcla de estrógenos conjugados, se trata con una cantidad de un líquido para elución, que es suficiente para la elución de la mezcla de los estrógenos conjugados. Conforme al invento, se utiliza para esto, como líquido de elución en la etapa (d) de procedimiento, una mezcla monofásica o bifásica, que contiene

(i) agua, que eventualmente se ha ajustado a un valor del pH situado en el intervalo alcalino,

y

(ii) por lo menos un disolvente orgánico no miscible o apenas miscible con agua, que es apropiado para la elución de compuestos lipófilos no conjugados, tomados entre el conjunto que comprende flavonoides no conjugados, isoflavonoides no conjugados, nor-isoprenoides no conjugados, esteroides no conjugados, en particular esteroides de androstanos y pregnanos, y compuestos no conjugados comparables,

y eventualmente

(iii) por lo menos un disolvente orgánico miscible con agua, seleccionado entre el conjunto que consta de éteres, alcanoles inferiores y cetonas alifáticas inferiores, miscibles con agua, así como mezclas de los disolventes antes mencionados.

En una forma preferida de realización del presente invento, se utiliza como líquido para elución en la etapa (d) de procedimiento una mezcla monofásica o bifásica, que contiene

y

(ii) por lo menos un disolvente orgánico no miscible o apenas miscible con agua, apropiado para la elución de compuestos lipófilos no conjugados, tomados entre el conjunto que comprende flavonoides no conjugados, isoflavonoides no conjugados, nor-isoprenoides no conjugados, esteroides no conjugados, en particular esteroides de androstanos y pregnanos, y compuestos no conjugados comparables,

y

La mezcla monofásica o bifásica, que encuentra utilización como líquido para elución en la etapa (d) de procedimiento, contiene un agua (i), que eventualmente se ha ajustado a un valor del pH situado en el intervalo alcalino.

Si en el caso del líquido para elución, que encuentra utilización en la etapa (d) de procedimiento, se trata de una mezcla monofásica, entonces el valor del pH de tales líquidos para elución, que contienen agua, está situado en el intervalo desde neutro hasta alcalino hasta llegar a un pH de 13, y puede estar situado ventajosamente en el intervalo comprendido entre los pH de 7 y 10. Como componentes disolventes en el líquido para elución que contiene agua, se escogen disolventes orgánicos que son estables en el intervalo empleado de pH. El deseado valor del pH del líquido para elución monofásico, que contiene agua, se ajusta por adición de una cantidad correspondiente de una sustancia de carácter básico, inerte y soluble en agua, preferiblemente de una base inorgánica, por ejemplo de un hidróxido de un metal alcalino o de un metal alcalino-térreo, en particular hidróxido de sodio.

Si en el caso del líquido para elución, que encuentra utilización en la etapa (d) de procedimiento, se trata de una mezcla bifásica, entonces el valor del pH de la fase acuosa de tales líquidos para elución, después de un mezclamiento a fondo de ambas fases, se encuentra en el intervalo desde neutro hasta alcalino hasta llegar a un pH de 13, y puede estar situado ventajosamente en el intervalo comprendido entre los pH de 7 y 10. Si es que la fase acuosa de tales líquidos bifásicos para elución contiene un componente disolvente orgánico, como tal componente disolvente se seleccionan disolventes orgánicos que son estables en el intervalo empleado de valores del pH. El deseado valor del pH de la fase acuosa de líquidos para elución bifásicos se ajusta por adición de una cantidad correspondiente de una sustancia de carácter básico, inerte y soluble en agua, de modo preferido de una base inorgánica, por ejemplo de un hidróxido de un metal alcalino o de un metal alcalino-térreo, en particular hidróxido de sodio.

Junto a un agua (i) eventualmente ajustada a carácter alcalino, la mezcla monofásica o bifásica, que encuentra utilización como líquido para elución en la etapa (d) de procedimiento, contiene por lo menos un disolvente orgánico (ii), que es apropiado para la elución de compuestos lipófilos no conjugados tomados entre el conjunto que comprende flavonoides no conjugados, isoflavonoides no conjugados, nor-isoprenoides no conjugados, esteroides no conjugados, en particular esteroides de androstanos y pregnanos, y compuestos no conjugados comparables. Además, el disolvente orgánico (ii) apropiado por esta razón no debe ser miscible con agua o solamente debe ser apenas miscible con agua, significando la expresión "apenas miscible" que en la fase acuosa debe presentarse como máximo un 6% en volumen de un disolvente orgánico disuelto. Dentro del marco del presente invento, disolventes orgánicos (ii), que son apropiados para la elución de compuestos lipófilos no conjugados, constituyen por ejemplo los siguientes disolventes orgánicos con 1 hasta 10 átomos de C, que pueden estar presentes con carácter lineal, ramificado o cíclico: alcoholes C_{4}-C_{10} (tales como por ejemplo butanol, hexanol, ciclohexanol y pentanol), ácidos C_{1}-C_{10} esterificados (tales como por ejemplo acetato de etilo (= éster etílico de ácido acético), acetato de metilo, acetato de propilo, acetato de isopropilo (= éster isopropílico de ácido acético), acetato de butilo, acetato de amilo, malonato de etilo y metilo, fosfonato de dimetilo), aldehídos C_{3}-C_{10} y cetonas C_{4}-C_{10} (tales como, por ejemplo, butanona, pentanona, hexano-2,4-diona, hexanodial, ciclohexano-carbaldehído, butano-1,2,4-tricarbaldehído, metil-fenil-cetona y similares) o, en términos generales, compuestos de alcoxi C_{3}-C_{10}, éteres C_{3}-C_{10} (dietil-éter, metil-terc.-butil-éter), nitrilos C_{3}-C_{6} y halógeno-alcanos C_{1}-C_{3} (cloruro de metileno), así como mezclas de los disolventes antes mencionados. En particular, se pueden usar dentro del marco del presente invento ésteres alquílicos C_{1}-C_{4} de ácido acético, butanol, ciclohexanol, hexanol, dietil-éter, cloruro de metileno, metil-terc.-butil-éter, y mezclas de los disolventes antes mencionados, como disolventes orgánicos (ii), no miscibles con agua o solamente poco miscibles con agua, apropiados para la elución de compuestos lipófilos no conjugados. De esta paleta para elección, los ésteres alquílicos C_{1}-C_{4} de ácido acético, y en particular el éster etílico de ácido acético (= acetato de etilo) y/o el éster isopropílico de ácido acético (= acetato de isopropilo) constituyen los disolventes orgánicos (ii) del presente invento, no miscibles con agua o solamente apenas miscibles con agua, que se han de utilizar de modo preferente, que son apropiados para la elución de compuestos lipófilos no conjugados.

Además, la mezcla monofásica o bifásica, que encuentra utilización conforme al invento como líquido para elución en la etapa (d) de procedimiento, contiene eventualmente por lo menos un disolvente orgánico (iii) miscible con agua, seleccionado entre el conjunto que consta de éteres, alcanoles inferiores y cetonas alifáticas inferiores, miscibles con agua, así como mezclas de los disolventes antes mencionados. Como éteres constituyentes del líquido para elución son apropiados éteres cíclicos, miscibles con agua, tales como tetrahidrofurano o dioxano, pero también éteres de cadena abierta, miscibles con agua, tales como por ejemplo etilenglicol-dimetil-éter (= monoglima), dietilenglicol-dimetil-éter (= diglima), o etiloxi-etiloxi-etanol (= carbitol). Como alcanoles inferiores son apropiados los alcoholes alquílicos miscibles con agua, que tienen 1-4, de modo preferido 1-3, átomos de carbono, en particular etanol o isopropanol. Como cetonas alifáticas inferiores son apropiadas las cetonas miscibles con agua, que tienen 3-5 átomos de carbono, en particular acetona. Como especialmente favorables se manifiestan además los líquidos para elución, en los que el disolvente orgánico (iii), miscible con agua, es acetona, etanol o una mezcla de acetona y etanol.

En una forma de realización preferida del invento, la mezcla monofásica o bifásica, que encuentra utilización como líquido para elución en la etapa (d) de procedimiento, junto a un agua (i) ajustada eventualmente a carácter alcalino, como disolvente orgánico (ii), no miscible o apenas miscible con agua, que es apropiado para la elución de compuestos lipófilos no conjugados, contiene ésteres alquílicos C_{1}-C_{4} de ácido acético, de modo preferido éster etílico de ácido acético y/o éster isopropílico de ácido acético, y como disolvente orgánico (iii) miscible con agua contiene acetona y/o etanol.

En una forma de realización preferida adicional del invento, la mezcla monofásica o bifásica, que encuentra utilización como líquido para elución en la etapa (d) de procedimiento, junto a un agua (i) ajustada eventualmente a carácter alcalino, como disolvente orgánico (ii), no miscible o apenas miscible con agua, que es apropiado para la elución de compuestos lipófilos no conjugados, contiene éster etílico de ácido acético, y como disolvente orgánico (iii) miscible con agua contiene acetona.

La mezcla monofásica o bifásica, que encuentra utilización conforme al invento como líquido para elución en la etapa (d) de procedimiento, puede tener una relación en volumen de agua (i) al disolvente orgánico (ii), no miscible o apenas miscible con agua, que está situada en el intervalo de 5:1 a 1:5, en particular se considera como conveniente una relación en volumen situada en el intervalo de 2:1 a 1:2.

Además, la mezcla monofásica o bifásica, que encuentra utilización como líquido para elución en la etapa de procedimiento (d), puede tener una relación en volumen de agua (i) al disolvente orgánico (ii), miscible con agua, que está situada en el intervalo de 4:1 a 1:5; preferiblemente se considera como conveniente una relación en volumen situada en el intervalo de 2:1 a 1:3.

En particular, la mezcla monofásica o bifásica, que encuentra utilización como líquido para elución en la etapa (d) de procedimiento, puede tener una relación en volumen del volumen total de agua (i) junto con el disolvente orgánico (ii), no miscible o apenas miscible con agua, en relación con el disolvente orgánico (ii) miscible con agua, situada en el intervalo de 5:1 a 1:5, de modo preferido en el intervalo de 2:1 a 1:2.

En una forma de realización especialmente preferida del invento, la mezcla monofásica o bifásica, que encuentra utilización como líquido para elución en la etapa (d) de procedimiento, se compone de (i) agua, de (ii) un éster alquílico C_{1}-C_{4} de ácido acético, de modo preferido éster etílico de ácido acético y/o éster isopropílico de ácido acético como disolvente orgánico no miscible o apenas miscible con agua, y de (iii) acetona y/o etanol como disolvente orgánico miscible con agua, en una relación en volumen situada en el intervalo de 1:1:1 a 1:1:2. En particular, en la etapa (d) de procedimiento encuentra utilización como líquido para elución una mezcla monofásica que se compone de (i) agua, de (ii) éster etílico de ácido acético como disolvente orgánico, no miscible o apenas miscible con agua, y de (iii) acetona como disolvente orgánico miscible con agua, en una relación en volumen de 1:1:1,4.

Sí en la etapa (d) de procedimiento encuentra utilización como líquido para elución una mezcla bifásica, se recomienda mezclar bien a fondo las dos fases inmediatamente antes de su alimentación en la columna.

El volumen empleado de líquido para elución puede ser de aproximadamente 3 a 10, en particular de aproximadamente 4 a 6, volúmenes de lecho por cada volumen de lecho de resina adsorbente polimérica. Convenientemente, el líquido para elución se conduce a través de un reactor, que contiene la resina adsorbente que está cargada con la mezcla de estrógenos, con una velocidad de circulación a su través tal que el período de tiempo de contacto sea suficiente para la elución completa de la mezcla de estrógenos conjugados. En el caso de la utilización de una mezcla monofásica de agua, éster etílico de ácido acético y acetona en la relación en volumen 10:10:14, son apropiadas por ejemplo unas velocidades de circulación de 3 a 10, de modo preferido de 5 a 7, partes en volumen de líquido para elución por 1 parte en volumen de resina adsorbente por hora. Convenientemente, la elución se lleva a cabo en un intervalo de temperaturas de aproximadamente 20ºC a aproximadamente 80ºC, de modo preferido a unas temperaturas comprendidas entre aproximadamente 30ºC y 50ºC. En caso deseado, la velocidad de circulación se regula trabajando a una presión ligeramente aumentada, p.ej. a una sobrepresión de hasta 0,2 bares, y el material eluido se recoge en varias fracciones.

Los contenidos de las fracciones individuales de material eluido, en cuanto a estrógenos conjugados, en cuanto a sustancias fenólicas constitutivas de la orina, tales como cresoles y HPMF, y en cuanto a compuestos lipófilos no conjugados, se pueden determinar de una manera de por sí conocida por cromatografía de líquido de alto rendimiento (= del inglés high performance liquid chromatography, designada abreviadamente como "HPLC") o también por cromatografía de gases (designada abreviadamente como "GC", del inglés gas chromatography).

Al realizar la elución, en la etapa e) de procedimiento se obtiene primeramente una fracción preliminar prácticamente exenta de estrógenos, desde débilmente coloreada hasta incolora, cuya cantidad corresponde por lo general aproximadamente a un volumen de lecho. La cantidad principal de los estrógenos conjugados, situada por ejemplo entre 80 y 99% de los estrógenos conjugados, presentes en la PMU de partida, se encuentra en las subsiguientes fracciones del material eluido principal coloreado de amarillo oscuro - pardo, cuya cantidad abarca por lo general de 2 a 4 volúmenes de lecho. En las fracciones pasadas subsiguientes están contenidos por lo general solamente vestigios de estrógenos conjugados. Si es que se obtienen fracciones subsiguientes, que todavía contienen un cierto contenido de estrógenos conjugados de por encima de 10% en peso, referido a la sustancia seca, y menos de 0,6% en peso de cresoles y HPMF, referido a la sustancia seca, éstas se pueden reunir con el material eluido principal, rico en estrógenos, para su tratamiento ulterior.

En el caso del material eluido, obtenido en la etapa (e) de procedimiento, puede tratarse de una mezcla monofásica o bifásica. También en el caso de la utilización de una mezcla monofásica como líquido para elución, mediante la expulsión del agua, presente antes de la elución en la columna de resina adsorbente, desde esta columna, y mediante el desplazamiento, obtenido con ello, de las relaciones en volumen de fase acuosa y de fase orgánica, el material eluido puede constar de dos fases. En caso deseado, el material eluido monofásico o bifásico, obtenido en la etapa (e) de procedimiento, se puede concentrar adicionalmente por evaporación de una manera de por sí conocida. En particular, en el caso de que el material eluido, obtenido en la etapa (e) de procedimiento, sea monofásico, este material eluido se concentra por evaporación, de manera tal que sea separado preferiblemente el disolvente orgánico (iii), miscible con agua, hasta que el material eluido concentrado por evaporación constituya una mezcla bifásica.

De acuerdo con el invento, en el caso de que el material eluido eventualmente concentrado por evaporación, obtenido en la etapa (e) de procedimiento, constituya una mezcla bifásica, en una etapa (f) de procedimiento, se separa la fase acuosa del material eluido obtenido, que consta de dos fases, y se obtiene una fase acuosa, que contiene la mezcla natural de estrógenos conjugados. Para esto, el material eluido bifásico, que se ha obtenido, se deja reposar con el fin de conseguir una separación de las fases. La separación de las fases, dependiendo de los volúmenes obtenidos, puede ocupar un período de tiempo de 10 minutos hasta 24 horas, preferiblemente las fases se dejan reposar durante 5 a 10 h. Cuando la fase acuosa y la fase orgánica se han separado una de otra, la fase acuosa se separa y se reserva para la utilización ulterior, mientras que la fase orgánica se desecha.

Después de la separación de la fase orgánica con respecto de la fase acuosa, en la etapa (f) de procedimiento se obtiene una fase acuosa, que contiene la mezcla natural de estrógenos conjugados. Esta fase acuosa contiene la mezcla de estrógenos conjugados, que aparece de modo natural en la PMU, junto con solamente una pequeña proporción del contenido de sustancias fenólicas constitutivas de la orina, tales como cresoles y HPMF, que originalmente estaban presentes en la PMU, así como junto con solamente una proporción extremadamente pequeña del contenido de constituyentes lipófilos no conjugados, que estaban presentes originalmente en la PMU. En caso deseado, esta fase acuosa se puede concentrar por evaporación ulteriormente de una manera en sí conocida, a fin de obtener un concentrado apropiado para el tratamiento ulterior, que ha sido liberado ampliamente del disolvente orgánico. Así, por ejemplo, a partir de la fase acuosa obtenida se pueden separar por destilación los restos todavía presentes de disolvente orgánico. Mediante la destilación, también el contenido de sustancia seca de la fase de extracto acuoso se puede ajustar a un valor concreto, de modo preferido a un contenido de sustancia seca situado en el intervalo comprendido entre 5 y 15%, en particular a un contenido de sustancia seca de 9%. A continuación, con el fin de estabilizar la mezcla natural obtenida de estrógenos equinos conjugados, el valor del pH de la solución acuosa de extracto se puede ajustar todavía a un valor situado en el intervalo alcalino, preferiblemente en el intervalo comprendido entre 8 y 13, preferiblemente a un valor comprendido entre 9 y 12. Con el fin de ajustar el valor del pH, son apropiadas las fases que encuentran utilización usualmente para el ajuste del valor del pH, por ejemplo NaOH 1 N o Na_{2}CO_{3}.

La fase acuosa obtenida, y eventualmente tratada ulteriormente o concentrada de manera adicional, puede servir como material de partida para la preparación de medicamentos que contienen la mezcla natural de estrógenos equinos conjugados. En caso deseado, mediante un proceso apropiado de desecación, tal como por ejemplo de desecación por atomización o de desecación en capa fluidizada, se puede preparar una mezcla de materiales sólidos que está exenta de agentes de elución. Si la mezcla natural de estrógenos conjugados se debe utilizar para la preparación de medicamentos sólidos, puede ser conveniente añadir a la fase acuosa, que contiene los estrógenos conjugados, una sustancia de vehículo sólida, ya antes de una operación de concentración o desecación, para obtener de esta manera una mezcla de materiales sólidos, que contiene los estrógenos conjugados y los materiales de vehículo. Por ejemplo, la fase acuosa, que contiene los estrógenos conjugados, se puede aplicar por proyección en la capa fluidizada sobre un material de vehículo sólido, tal como p.ej. celulosa. Tanto la fase acuosa, que contiene la mezcla de estrógenos, como también un concentrado preparado a partir de ésta o un producto sólido secado, se pueden incorporar de una manera de por sí conocida en formulaciones galénicas sólidas o líquidas, tales como por ejemplo tabletas, grageas, cápsulas o emulsiones. Estas formulaciones galénicas se pueden preparar de acuerdo con métodos de por sí conocidos mediando utilización de usuales materiales de vehículo sólidos o líquidos, tales como p.ej. un almidón, una celulosa, lactosa o talco, o bien parafinas líquidas, y/o mediando utilización de sustancias coadyuvantes farmacéuticas usuales, por ejemplo agentes disgregantes de tabletas, agentes solubilizantes o agentes conservantes. De esta manera, el producto que contiene los estrógenos conjugados se puede mezclar de una manera de por sí conocida con las sustancias de vehículo y coadyuvantes farmacéuticas, y la mezcla se puede transformar en una apropiada forma de dosificación.

En el caso del procedimiento de extracción en fase sólida, que se ha descrito conforme al invento, a partir de un líquido de orina, que constituye eventualmente un líquido de orina liberado de sustancias mucosas y sólidas, un material concentrado por evaporación de este líquido de orina, o un material retenido de orina, concentrado por evaporación, que se ha obtenido mediante filtración de este líquido de orina a través de una membrana, se obtiene una mezcla natural de estrógenos equinos conjugados, habiendo sido empobrecida ampliamente la mezcla, en un procedimiento sencillo, tanto en cuanto a sustancias fenólicas constitutivas de la orina, tales como en particular cresoles y HPMF, como también en cuanto a un gran número de compuestos lipófilos no conjugados. En los casos de los compuestos lipófilos no conjugados, que se han separado, se trata en particular de flavonoides no conjugados, isoflavonoides no conjugados, nor-isoprenoides no conjugados y esteroides no conjugados, y dentro de éstos, en particular, de derivados de androstanos no conjugados y de pregnanos no conjugados.

En comparación con los conocidos procedimientos de extracción en fase sólida, el procedimiento de extracción en fase sólida conforme al invento suministra una mezcla natural de estrógenos equinos conjugados, que está amplísimamente empobrecida tanto en cuanto a sustancias fenólicas constitutivas de la orina como también en cuanto a compuestos lipófilos no conjugados, realizándose que el procedimiento conforme al invento se contenta sin adicionales etapas de trabajo, puesto que también el empobrecimiento en cuanto a compuestos lipófilos no conjugados se efectúa ya al realizar la extracción en fase sólida.

En el caso del procedimiento conocido por el documento WO 98/08526, una parte de los compuestos lipófilos no conjugados, por ejemplo la isoflavona equol, se separa por lavado en la etapa b) de procedimiento, mientras que otros compuestos lipófilos no conjugados, por ejemplo la formononetina, pasan conjuntamente al material eluido y eventualmente se deben separar mediante una subsiguiente extracción líquido - líquido. Algo similar resulta válido también para las hormonas esteroides no conjugadas, es decir libres, que asimismo se pueden detectar en el material eluido en unas ciertas proporciones. Por lo tanto, se ha de considerar como manifiéstamente sorprendente el hecho de que para la elución cuantitativa de los estrógenos conjugados adsorbidos a una resina adsorbente polimérica se pueda utilizar una mezcla monofásica o incluso bifásica a base de agua, de un disolvente orgánico no miscible o apenas miscible con agua, así como eventualmente de un disolvente orgánico miscible con agua, tal como éteres, alcanoles o cetonas inferiores; y que el material eluido obtenido, eventualmente concentrado por evaporación, se pueda separar en dos fases, encontrándose los estrógenos conjugados -eluidos cuantitativamente- casi de manera exclusiva en la fase acuosa, mientras que los indeseados compuestos lipófilos no conjugados se hallan en la fase orgánica, y por consiguiente se pueden separar con facilidad.

Además, el procedimiento conforme al invento suministra un extracto de estrógenos equinos conjugados, que presenta un contenido comparablemente alto de estrógenos conjugados, referido a la sustancia seca. Así, con el procedimiento del presente invento es posible, de una manera sencilla, obtener una mezcla natural de estrógenos conjugados a partir de la orina de yeguas preñadas, también en el caso de que la orina contenga cantidades variables y eventualmente elevadas de compuestos lipófilos no conjugados, sin que a la extracción en fase sólida se le hagan seguir etapas de purificación más amplia.

La mezcla natural de estrógenos equinos conjugados, obtenida mediante el procedimiento conforme al invento como extracto de principio activo, empobrecida en cuanto a constituyentes lipófilos no conjugados y en cuanto a sustancias fenólicas constituyentes de la orina, se distingue, con respecto a los extractos de principios activos que se han obtenido mediante los conocidos procedimientos de extracción en fase sólida, por una manifiesta optimización de la especificación farmacéutica, tal como se comprobó de acuerdo con el invento.

Se debe designar como manifiestamente sorprendente el hecho de que, mediante la modificación conforme al invento de los procedimientos de extracción en fase sólida ya conocidos, se pueda originar una mejoría de tal índole de la calidad del extracto de principio activo, que se ha obtenido, incluso cuando la orina de yeguas preñadas que suministra la mezcla natural de estrógenos conjugados, contenga cantidades diferentes y variables de constituyentes lipófilos no conjugados. En particular, es muy sorprendente el hecho de que la proporción de compuestos lipófilos no conjugados, que en dependencia de la PMU utilizada, puede fluctuar grandemente tanto en cuanto a la cantidad como también en cuanto a la composición, se pueda disminuir con seguridad mediante el procedimiento conforme al invento de tal manera que en la etapa f) de procedimiento se pueda obtener como fase acuosa una mezcla natural de estrógenos equinos conjugados, que cumpla los elevados requisitos establecidos en cuanto a la especificación farmacéutica, por ejemplo los requisitos establecidos de acuerdo con la USP o la Farmacopea Europea.

El procedimiento conforme al invento ofrece, tal como con anterioridad ya se ha descrito de manera detallada, una serie de ventajas y mejorías en comparación con el estado de la técnica. Así, el invento hace posible la utilización también de una PMU que contenga cantidades variables de constituyentes lipófilos no conjugados, que por ejemplo puede presentar una proporción aumentada de flavonoides libres, isoflavonoides libres, nor-isoprenoides libres o derivados esteroides libres, aquí en particular de esteroides de androstanos o pregnanos libres, sin que se pongan en peligro las especificaciones farmacéuticas que se han de respetar. En este caso, el procedimiento conforme al invento se basa en los conocidos procedimientos de extracción en fase sólida, pero de una manera sorprendente se contenta sin etapas de extracción adicionales. Así, con el procedimiento conforme al invento se puede garantizar una composición uniforme de cargas individuales de extractos, puesto que siempre se eliminan los constituyentes lipófilos no conjugados, cuyo contenido y cuya composición en la PMU pueden variar en dependencia del tipo de la nutrición ingerida por las yeguas preñadas, y por consiguiente los extractos obtenidos tienen todos ellos un contenido comparable de estrógenos equinos conjugados, referido a la sustancia seca. Además, mediante la separación conseguida con el procedimiento conforme al invento, no solamente de las sustancias fenólicas constitutivas de la orina, sino en particular también de los constituyentes lipófilos no conjugados, se puede conseguir en el extracto obtenido, en solamente un proceso de trabajo, una más alta concentración de las sustancias activas, es decir de los estrógenos equinos conjugados. El procedimiento conforme al invento presenta adicionalmente también ventajas económicas, puesto que se disminuye manifiestamente el peligro de perder valiosos principios activos en el caso de no respetarse la especificación farmacéutica, por ejemplo en el caso de contenidos insuficientes de estrógenos conjugados, referidos a la sustancia seca. Además, mediante la aplicación del procedimiento descrito conforme al invento, se hace posible un ajuste esencialmente más exacto y más reproducible del contenido de principio activo del extracto obtenido. Este componente de principio activo es apropiado sobresalientemente para la preparación de productos farmacéuticos, que como principio activo contienen una mezcla de estrógenos equinos conjugados naturales.

Los siguientes Ejemplos deben explicar el invento con mayor detalle, pero sin limitar su extensión.

Ejemplos

En los siguientes Ejemplos se presenta una prescripción general de trabajo para la obtención, a partir de una PMU, de extractos de principios activos que contienen la mezcla natural de los estrógenos conjugados contenidos en la PMU, y que están ampliamente empobrecidos tanto en cuanto a sustancias fenólicas constitutivas de la orina, tales como por ejemplo cresoles o HPMF, como también de compuestos lipófilos no conjugados, tales como por ejemplo flavonoides no conjugados, isoflavonoides no conjugados, nor-isoprenoides no conjugados, esteroides no conjugados, en particular esteroides de androstanos y pregnanos, y compuestos no conjugados comparables. Se muestra cómo, de acuerdo con el invento, se puede obtener un extracto de alta calidad con elevados contenidos de principio activo a partir de una PMU que puede presentar unas proporciones variables o respectivamente aumentadas de compuestos lipófilos no conjugados.

Líquido de orina

Para el procedimiento conforme al invento se puede emplear, como líquido de orina, al igual que de acuerdo con el documento WO 98/08526 la PMU como tal, un material concentrado obtenido a partir de la PMU mediante concentración por evaporación, o un concentrado obtenido a partir de la PMU, que ya se había purificado previamente mediante filtración o procedimientos comparables. La orina (PMU) recogida se libera en primer término de una manera de por sí conocida de sustancias mucosas y sólidas. De manera conveniente, se dejan sedimentar las sustancias sólidas y mucosas, y éstas se separan luego de acuerdo con métodos de separación de por sí conocidos, por ejemplo por decantación, segregación y/o filtración. De esta manera, la PMU se puede conducir por ejemplo a través de una disposición de separación de por sí conocida, p.ej. un aparato separador, una instalación de filtración o un sedimentador. Como disposición de separación puede servir p.ej. un lecho de arena, o se pueden emplear aparatos separadores usuales en el comercio, tales como separadores de toberas o de cámaras. En caso deseado, se puede emplear también una instalación de microfiltración o una instalación de ultrafiltración, con cuya utilización se puede conseguir al mismo tiempo una amplia ausencia de gérmenes y virus en la PMU filtrada.

Eventualmente, a la orina o al material concentrado de orina se le pueden añadir agentes de conservación, germicidas, bactericidas y/o antihelmínticos.

Como concentrado de orina previamente purificado se puede emplear también un material retenido de PMU aumentado de concentración, que se puede obtener a partir de la PMU mediante una filtración a través de una membrana, de por sí conocida. El contenido de materiales sólidos del material retenido y su composición se pueden hacer variar según sea la PMU empleada y la membrana utilizada para la filtración a través de una membrana, por ejemplo la anchura de poros de ésta, así como según sean las condiciones de la filtración. Por ejemplo, en el caso de la utilización de una membrana de nanofiltración, se puede conseguir una concentración casi exenta de pérdidas del contenido de estrógenos en el material retenido de la PMU, con simultánea eliminación de hasta 50% en peso de las sustancias constitutivas de bajo peso molecular de la PMU. Para el procedimiento conforme al invento se pueden emplear materiales retenidos de PMU, que se habían aumentado de concentración hasta en una relación de aproximadamente 1:10, por ejemplo en una relación de aproximadamente 1:7, y cuyo volumen, por consiguiente, se puede haber concentrado hasta aproximadamente 1/10, por ejemplo hasta aproximadamente 1/7 del volumen original de la PMU.

Resinas adsorbentes

Las resinas adsorbentes poliméricas, que se pueden emplear en la etapa a) del procedimiento, son, de acuerdo con el documento WO 98/08526, resinas adsorbentes poliméricas semipolares, en particular semipolares no iónicas. Las resinas adsorbentes poliméricas, que se pueden emplear en el procedimiento conforme al invento como adsorbentes, son de modo preferido polímeros orgánicos no iónicos porosos, que, al contrario que las resinas adsorbentes poliméricas hidrófobas no polares, poseen una polaridad intermedia (= p.ej. con un momento dipolar de la superficie activa de la resina, situado en el intervalo de 1,0 a 3,0, en particular de 1,5 a 2,0, Debye) y poseen una estructura algo más hidrófila, por ejemplo resinas de poli(ésteres de ácidos carboxílicos). Convenientemente, se emplean resinas semipolares macroporosas con una estructura preferentemente macrorreticular y con unos diámetros medios de poros situados en el intervalo de 50 a 150, preferiblemente de 70 a 100, Angström, y con una superficie específica situada en el intervalo de 300 a 900, de modo preferido de 400 a 500, m^{2}/g. Se manifiestan como especialmente apropiadas las resinas de poli(ésteres de ácidos carboxílicos alifáticos) reticuladas y macroporosas, en particular resinas de poli(ésteres acrílicos) reticuladas, tales como p.ej. Amberlite XAD-7 (Tipo HP) de la entidad Rohm und Haas, que constituyen resinas adsorbentes semipolares no iónicas.

Junto con los adsorbentes mencionados de modo preferente se pueden emplear también otras resinas adsorbentes distintas. Como resinas adsorbentes son apropiadas en este caso resinas adsorbentes tanto no polares, como semipolares y también polares. La cantidad de la orina, que se puede bombear a través del adsorbente, ha de determinarse en este caso previamente con ayuda de la correspondiente capacidad adsorbedora. Ejemplos de resinas adsorbentes utilizables son tipos usuales en el comercio, tales como adsorbentes poliméricos del tipo Amberlite con entramados fundamentales de estireno y divinilbenceno (p.ej. de los tipos XAD-1180, XAD-2, XAD-16), con entramados fundamentales de ésteres acrílicos (p.ej. XAD-7) o las que poseen entramados fundamentales muy polares que contienen nitrógeno y oxígeno (p.ej. XAD-12). Otras resinas adsorbentes son las resinas del tipo Dowex (copolímeros de estireno y divinilbenceno) tales como p.ej. Dowex 112, Dowex Optipore y Dowex Optipore V 493; las Lewatitas (poliestirenos reticulados), p.ej. Lewatit OC 1064, Lewatit OC 1066 o Lewatit OC 1163; resinas intercambiadoras de aniones del tipo de poliaminas, p.ej. resinas Dowex. Resinas adsorbentes ventajosas son, en particular, XAD-7 (tipo HP), XAD-16 (tipo HP), XAD-118 y Dowex Optipore, preferiblemente en forma de Dowex Optipore V 493, así como las Lewatitas OC 1064, OC 1066 y OC 1163.

Etapa a) de procedimiento

La adsorción de los estrógenos conjugados a la resina adsorbente polimérica puede efectuarse, de acuerdo con el documento WO 98/08526 así como también en el presente procedimiento conforme al invento, mediante puesta en contacto de la PMU eventualmente tratada o de su material retenido, con la resina adsorbente, siendo introducido el líquido de orina en un reactor que contiene la resina adsorbente y siendo mantenido allí en contacto con la resina adsorbente durante un período de tiempo suficiente para la adsorción del contenido de estrógenos. Después de haberse efectuado la adsorción de los estrógenos conjugados a la resina adsorbente polimérica, la resina adsorbente cargada con la mezcla de estrógenos conjugados puede ser separada con respecto del restante líquido de orina de una manera de por sí conocida. Convenientemente, el líquido de orina se puede conducir a través de una columna que contiene la resina adsorbente con una velocidad de circulación a través de ésta, tal que el tiempo de contacto sea suficiente para la adsorción del contenido de estrógenos. Son apropiadas, por ejemplo, unas velocidades de circulación que corresponden a un paso a través de la columna de 3 a 10, preferiblemente de 5 a 7, partes en volumen de una PMU/1 parte en columna de una resina adsorbente/hora. Convenientemente, la velocidad de circulación del líquido de orina a través del reactor se puede controlar mediante trabajo con una pequeña sobrepresión o depresión. La cantidad de resina adsorbente polimérica, que se ha de utilizar, puede variar dependiendo del tipo de la resina adsorbente utilizada y de la cantidad del contenido de material sólido en el líquido de orina. En el caso de la utilización de una PMU, por ejemplo una parte en volumen de una resina adsorbente, p.ej. una resina adsorbente de poli(éster de ácido carboxílico alifático) reticulada puede cargarse con hasta 80, preferiblemente de 30 a 50, partes en volumen de una PMU previamente tratada, sin que se puedan detectar cantidades apreciables de estrógenos en el líquido de orina que sale fluyendo. En el caso de la utilización de un material concentrado de PMU o de un material retenido de PMU, la capacidad de la resina adsorbente para cargarse se reduce naturalmente en la medida en la que estos han aumentado de concentración. Así, por ejemplo, una parte en volumen de una resina adsorbente de poli(éster de ácido carboxílico alifático) reticulada se puede cargar con una cantidad de líquido de orina que corresponde a 20 hasta 80, de modo preferido a 30 hasta 50, partes en volumen de PMU.

Etapa b) de procedimiento

La resina adsorbente polimérica, cargada con la mezcla de estrógenos conjugados, se lava en la etapa b) de procedimiento con un agua de lavado que se ha ajustado a un intervalo de pH de por lo menos 12,0, en particular de 12,5 a 14, de modo preferido de aproximadamente 12,5 a 13,5. Como aguas de lavado se pueden emplear soluciones acuosas de las sustancias básicas inertes, solubles en el líquido de orina, que estén lo suficientemente concentradas como para alcanzar un valor de pH de por lo menos 12,5. Como sustancias básicas solubles en agua, que son inertes frente a la resina adsorbente polimérica, son apropiadas de modo preferido bases inorgánicas solubles en agua, tales como hidróxidos de metales alcalinos o de metales alcalino-térreos, en particular hidróxido de sodio. Convenientemente, el agua de lavado contiene solamente la cantidad de sustancias de carácter básico, que se necesita para conseguir el deseado valor del pH, de modo preferido un pH de aproximadamente 13. La cantidad del agua de lavado se escoge de tal manera que ella sea suficiente para eliminar ampliamente las sustancias fenólicas constitutivas de la orina, sin que en tal caso se separen por lavado conjuntamente cantidades dignas de mención de estrógenos conjugados. Se manifiesta como conveniente, por ejemplo, la utilización de 2 a 10, en particular de 4 a 6, volúmenes de lecho de líquido de lavado por cada volumen de lecho de resina adsorbente. En este caso, el agua de lavado se conduce convenientemente a través de un reactor que contiene la resina adsorbente con una velocidad de circulación de 3 a 10, de modo preferido de 5 a 7, partes en volumen de agua de lavado/1 parte en volumen de resina adsorbente/hora.

Etapa c) de procedimiento

Lavado intermedio

La resina adsorbente polimérica, cargada en la etapa a) de procedimiento con la mezcla de estrógenos conjugados, se lava con agua en una operación de lavado intermedio que sigue a la etapa b) de procedimiento. La cantidad del agua de lavado se escoge de tal manera que el material eluido, obtenido en la etapa e) de procedimiento final, tenga una mezcla de estrógenos conjugados, que cumpla los requisitos en cuanto a un contenido máximo de estrógenos libres, y que por consiguiente se pueda utilizar como componente de principio activo para productos farmacéuticos. Como conveniente se manifiesta por ejemplo la utilización de 1 a 8, de modo preferido 1 a 4, volúmenes de lecho de agua de lavado por cada volumen de lecho de resina adsorbente. En este caso, el agua de lavado se conduce convenientemente a través de un reactor que contiene la resina adsorbente con una velocidad de circulación de 3 a 10, de modo preferido de 5 a 7, partes en volumen de agua de lavado por 1 parte en volumen de resina adsorbente por hora.

En una forma ventajosa de realización del procedimiento conforme al invento, el lavado intermedio se lleva a cabo a unas temperaturas situadas por debajo de la temperatura ambiente, en particular a unas temperaturas comprendidas entre 0ºC y 10ºC, puesto que se ha manifestado que mediante el lavado intermedio adicional se pueden disminuir con claridad las pérdidas de hormonas o de principios activos, que eventualmente son debidas a ello. Como temperatura ambiente se considera usualmente la temperatura del entorno, se designa p.ej. una temperatura que está situada entre 20º y 30ºC. Es muy conveniente realizar el procedimiento a unas temperaturas realmente de 0ºC o de aproximadamente 0ºC. En la práctica se recomienda, por lo tanto, trabajar a unas temperaturas cercanamente por encima de 0ºC, y procurar mediante medidas adecuadas el respeto de los intervalos mencionados de temperaturas. Para esto, se pueden adoptar medidas de por sí usuales para la disminución de la temperatura, p.ej. el empleo de reactores refrigerados, de materiales refrigerados y/o de sustancias de partida, tales como las PMU, refrigeradas. Como temperaturas de 0ºC o de aproximadamente 0ºC se pueden considerar dentro de puntos de vista prácticos un intervalo de temperaturas de 0ºC hasta aproximadamente 5ºC, en particular de 0ºC hasta aproximadamente 3ºC.

Con el fin de mantener lo más pequeñas que sea posible las posibles pérdidas de hormonas durante el lavado intermedio, de acuerdo con esta variante el agua de lavado ajustada a carácter alcalino, utilizada en el lavado intermedio y/o también en la etapa b) de procedimiento, debe haber sido enfriada previamente a unas temperaturas situadas por debajo de la temperatura ambiente, en particular a unas temperaturas comprendidas entre 0ºC y 10ºC. Otros intervalos de temperaturas, convenientes o preferidos, son, como se ha señalado precedentemente, temperaturas de 0ºC hasta de aproximadamente 5ºC, en particular de 0ºC hasta aproximadamente 3ºC. De modo preferido, se trabaja a unas temperaturas de 0ºC o de aproximadamente 0ºC, es decir que, de modo preferido, el agua de lavado ajustada a carácter alcalino, utilizada en el lavado intermedio y/o en la etapa b) de procedimiento, ha sido enfriada previamente a unas temperaturas situadas cercanamente por encima de 0ºC. Mediante la utilización de un agua de lavado, ajustada a carácter alcalino y refrigerada, en la etapa b) de procedimiento, se consigue una especie de enfriamiento previo o de mantenimiento del enfriamiento ya efectuado de la resina adsorbente, p.ej. con el fin de evitar que, en el caso del empleo de un agua de lavado refrigerada para el lavado intermedio, tenga lugar un calentamiento renovado indeseado de la misma. De modo preferido, por lo tanto, el lavado intermedio y la etapa b) de procedimiento precedente se llevan a cabo en ambos casos en el mismo intervalo de temperaturas, p.ej. a unas temperaturas situadas por debajo de la temperatura ambiente, en particular a unas temperaturas comprendidas entre 0ºC y 10ºC, o de modo preferido en los intervalos de temperaturas como los que antes se han señalado.

En la precedente variante del invento, en la que el procedimiento se lleva a cabo a unas temperaturas situadas por debajo de la temperatura ambiente, puede ser deseable que todos los dispositivos utilizados, tales como reactores para la recepción de la resina adsorbente polimérica o reactores, que ya contengan a ésta, y/o de la PMU empleada, se empleen de un modo enfriado previamente de manera correspondiente a unas temperaturas situadas por debajo de la temperatura ambiente, en particular a unas temperaturas comprendidas entre 0ºC y 10ºC, o a los intervalos temperaturas antes indicados, que se han de respetar de modo preferente.

Etapas d), e) y f) de procedimiento del presente invento

A continuación, de acuerdo con la descripción dada en la etapa d) de procedimiento del presente invento, la resina adsorbente lavada, que está cargada con la mezcla de estrógenos conjugados, se trata con una cantidad de un líquido para elución que es suficiente para la elución de la mezcla de los estrógenos conjugados, y en la etapa e) de procedimiento se obtiene, y eventualmente se concentra por evaporación, un material eluido que contiene la mezcla natural de los estrógenos conjugados de la PMU. Caso de que el material eluido obtenido, eventualmente concentrado por evaporación, constituya una mezcla bifásica, en una etapa f) de procedimiento se separa la fase acuosa del material eluido, de manera tal que se obtenga una fase acuosa que contenga la mezcla natural de los estrógenos conjugados de la PMU, que se puede concentrar eventualmente de modo adicional.

Regeneración de la columna de resina adsorbente

Para efectuar la regeneración, la columna se lava primeramente mediando utilización en cada caso de 1 a 4, en particular de 2 a 3, volúmenes de lecho de una mezcla de etanol y agua, ajustada a un pH de 13, que contiene 50% de etanol, por cada volumen de lecho de resina adsorbente, luego se lava con el correspondiente volumen de una solución acuosa al 10% de citrato de sodio y finalmente se lava con el correspondiente volumen de agua destilada. La regeneración total se efectúa a una temperatura de 40ºC a 45ºC. La columna se puede cargar múltiples veces, por ejemplo hasta 40 veces, y regenerar de nuevo.

Ejemplo 1

Ejemplo comparativo correspondiente a los procedimientos de los documentos WO 98/08526 y WO 03/048183

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Ejemplos 2a, 2b y 3

(Procedimiento conforme al invento)

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Ejemplo 2a

Elución con 50% en volumen de acetato de etilo a la temperatura ambiente

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Ejemplo 2b

Elución con 50% en volumen de acetato de etilo a 45ºC

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Ejemplo 3

Elución con una mezcla monofásica para elución, que contiene acetato de etilo, a 40ºC a) Adsorción del contenido de estrógenos de la PMU a una resina adsorbente de un poli(éster acrílico) semipolar (para todos los Ejemplos)

Una columna con una altura de 330 mm y un diámetro de 40 mm se alimenta con 200 ml de una resina adsorbente de poli(éster acrílico), semipolar, hinchada en agua (= Amberlite XAD-7 (tipo HP) de la entidad Rohm und Haas, con un tamaño de granos de 0,3 a 1,2 mm, un momento dipolar de 1,8 Debye, un diámetro medio de poros de 80 Angström, y una superficie específica de aproximadamente 450 m^{2}/g en estado seco). 7 l (= 35 volúmenes de lecho, en lo sucesivo designados abreviadamente como VL) de una PMU filtrada a través de una instalación de ultrafiltración, cuyo contenido de estrógenos conjugados, calculado como la suma de sulfato de estrona, sulfato de equilina y 17\alpha-DH-equilina, así como cuyo contenido de cresol se determinaron mediante HPLC (para los valores véase la Tabla I), se conducen a través de la columna a la temperatura ambiente con una velocidad de circulación, que en promedio es de 16,7 ml/min (= 5 VL/h) en el Ejemplo 1, de 40 ml/min (= 12 VL/h) en el Ejemplo 2a y de 24,4 ml/min (= 7,3 VL/h) en los Ejemplos 2b y 3. El contenido de estrógenos de la PMU está adsorbido totalmente en la columna de resina adsorbente semipolar, cargada de esta manera. El líquido de orina saliente se investiga mediante una HPLC en cuanto a su contenido de estrógenos conjugados y se manifiesta como prácticamente exento de estrógenos. La fracción de salida se desecha.

b) Lavado de la columna de resina adsorbente cargada (para todos los Ejemplos)

La columna de resina adsorbente cargada se lava con 1,0 l (= 5 VL) de una solución acuosa de hidróxido de sodio con un valor del pH de 13. Para esto, el agua de lavado de carácter alcalino se conduce a través de la columna con una velocidad de circulación que, en promedio, es de 16,7 ml/min (= 5 VL/h). El líquido de lavado saliente se investiga mediante una HPLC en cuanto a su contenido de estrógenos conjugados y de cresol. La investigación muestra que durante la fase de lavado se separa menos de 5% de los estrógenos totales que se alimentan en la columna.

c) Lavado intermedio (para todos los Ejemplos)

La columna de resina adsorbente cargada se lava con 600 ml de agua (= 3 VL). Para esto, el agua de lavado neutra se conduce a través de la columna con una velocidad de circulación que, en promedio, es de 16,7 ml/min (= 5 VL/h). El líquido de lavado saliente se investiga mediante una HPLC en cuanto a su contenido de estrógenos conjugados y de cresol. La investigación muestra que durante esta fase de lavado se separa por lavado solamente una pequeña parte (como máximo solo aproximadamente unos pocos tantos por ciento) de los estrógenos totales que se alimentan en la columna.

d) y e) Desorción de los estrógenos conjugados desde la columna de resina adsorbente lavada

Ejemplo 1

Ejemplo comparativo

1,1 l (= 5,5 VL) del líquido para elución (mezcla de etanol y agua 30:70) se conducen con una velocidad de circulaciónque, en promedio, es de 8,2 ml/min (= 2,4 VL/h) a través de la columna previamente calentada a una temperatura de 45ºC. El material eluido saliente se recoge en 6 fracciones E 1 hasta E 5. Las fracciones son en cada caso de 200 ml (= 1 VL) y respectivamente de 100 ml (= 0,5 VL para E 6) y se investigan mediante una HPLC en cuanto a su contenido de estrógenos conjugados y cresol (los valores véanse en la Tabla I).

Las primeras cuatro fracciones contienen aproximadamente de 80 a 98% de la cantidad total de estrógenos conjugados que se ha adsorbido en la columna. Las últimas fracciones contienen solamente pequeñas cantidades de estrógenos conjugados. Las fracciones que contienen la cantidad principal de los estrógenos conjugados constituyen extractos apropiados para un ulterior tratamiento galénico.

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Ejemplo 2

Ejemplo 2a

Elución con 50% en volumen de acetato de etilo a la temperatura ambiente

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Ejemplo 2b

Elución con 50% en volumen de acetato de etilo a 45ºC

900 ml (= 4,5 VL) del líquido para elución en dos fases (mezcla de acetato de etilo y agua en la relación 50:50) se conducen con una velocidad de circulación que, en promedio, es de 16,7 ml/min (= 5,0 VL/h) a través de la columna atemperada a la temperatura de elución indicada. El material eluido saliente se recoge en 9 fracciones E 1 hasta E 9. Las fracciones son en cada caso de 100 ml (= 0,5 VL); a partir de la cuarta fracción, se obtiene como material eluido una mezcla bifásica, que - con el fin de analizar individualmente para cada material eluido - se separa en las fases acuosa y orgánica (E 4 hasta E 9, en cada caso LM representa el disolvente y W representa la fase acuosa). Todas las fracciones se investigan mediante una HPLC en cuanto a su contenido de estrógenos conjugados y cresol (los valores véanse en la Tabla II). Para algunas fracciones se determina mediante una GC también el contenido de compuestos lipófilos no conjugados en el ejemplo de la formononetina (los valores véanse en la Tabla II).

Las primeras tres fracciones contienen solamente vestigios de estrógenos. En las siguientes fases acuosas de las fracciones 4 a 8 está contenido entonces aproximadamente de 80 a 98% de la cantidad total de estrógenos conjugados que se ha adsorbido en la columna. Las últimas fracciones contienen solamente pequeñas cantidades de estrógenos. Las fracciones, que contienen la cantidad principal de los estrógenos conjugados, constituyen extractos que son apropiados para un ulterior tratamiento galénico.

Para controlar la compleción de la elución conforme al invento con la mezcla de acetato de etilo y agua, a continuación de la extracción se hizo seguir la extracción ya conocida con la mezcla monofásica de etanol y agua (30:70).

Mediante la subsiguiente elución etanólica se eluyen en el Ejemplo 2a sin embargo todavía manifiestas cantidades apreciables de estrógenos conjugados, correspondientes a aproximadamente 6,8% de la cantidad alimentada. Mediante el aumento de la temperatura de elución a 45ºC se pudieron reducir a valores hasta por debajo de 1% las cantidades de los estrógenos conjugados que todavía quedaban en la columna, que se eluyen tan sólo mediante la elución etanólica.

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Ejemplo 3

Elución con una mezcla de elución monofásica que contiene acetato de etilo a 40ºC

1,0 l (= 5 VL) del líquido para elución de una sola fase (mezcla de acetato de etilo, agua y acetona en la relación en volumen de 1:1:1,4) se conducen con una velocidad de circulación que, en promedio, es de 16,7 ml/min (= 5,0 volúmenes de lecho por hora) a través de la columna atemperada a 40ºC. El material eluido saliente se recoge en 13 fracciones de diferente magnitud. La primera fracción fue de 100 ml (= 0,5 VL), las siguientes 10 fracciones fueron en cada caso de 50 ml (= 0,25 VL) mientras que las dos últimas fracciones se recogieron en una cantidad en cada caso de 200 ml. Después de la expulsión del agua de lavado fuera de la columna, aparecen sorprendentemente ya dos fases en el material eluido (a partir de la fracción 4). Todas las fracciones se investigan mediante una HPLC en cuanto a su contenido de estrógenos conjugados y cresol (los valores véanse en la Tabla I).

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La primera fracción contiene solamente vestigios de estrógenos. En las subsiguientes fracciones 2 a 7 está contenido entonces aproximadamente un 80 hasta 98% de la cantidad total, adsorbida en la columna, de estrógenos conjugados. Las últimas fracciones contienen solamente pequeñas cantidades de estrógenos. Las fracciones, que contienen la cantidad principal de los estrógenos conjugados, constituyen extractos apropiados para un ulterior tratamiento galénico.

Los materiales eluidos E7 hasta E13 se han separado en 2 fases tan sólo después de aproximadamente 24 h. Los materiales eluidos E1 hasta E7 se reúnen y se tratan de la siguiente manera: Los materiales eluidos E1 - E7 se reúnen en un embudo de goteo con una capacidad de 500 ml y proporcionan aproximadamente 350 ml de una solución. No se efectúa ninguna inmediata separación de fases, pero después de haber dejado reposar durante un final de semana se puede observar arriba en el embudo de goteo una pequeña fase orgánica de aproximadamente 10 ml. Las fases se investigan mediante una HPLC en cuanto a su contenido de estrógenos conjugados y cresol. Después de haber separado las fases, la fase acuosa se concentra por evaporación en un evaporador rotatorio a 70ºC hasta llegar a una SS (cantidad de sustancia seca) de 8-10% (aquí una SS de 8,16%, los valores véanse la Tabla I).

Regeneración de la columna de resina adsorbente (para todos los Ejemplos)

Para realizar la regeneración, la columna se lava primeramente con 400 ml de una mezcla de etanol y agua que contiene 50% de etanol, ajustada a un pH de 13, luego se lava con una solución acuosa al 10% de citrato de sodio, y finalmente con 400 ml de agua destilada. La regeneración total se efectúa a una temperatura de 40ºC a 45ºC. La columna se puede cargar y regenerar de nuevo múltiples veces, por ejemplo hasta 40 veces.

Para las fracciones que contienen la cantidad principal de los estrógenos conjugados, obtenidas al realizar la elución, se indican en la siguiente Tabla respectivamente el contenido de SS en % en peso y los contenidos de estrógenos conjugados determinados por HPLC (EC, calculados como la suma de sulfato de estrona sódico, sulfato de equilina sódico y 17 \alpha-DH-equilina) así como de cresol. Además, el rendimiento de la extracción se indica como un valor.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA I Comparación de los procedimientos individuales con ayuda de la composición de las fracciones que contienen la cantidad principal de los estrógenos conjugados

1

En una realización de los ensayos como en el Ejemplo 1, es decir en el caso de una elución etanólica, una parte de las isoflavonas, por ejemplo el equol, se separa por lavado con la fracción de lavado de carácter básico, una parte de las isoflavonas, por ejemplo la formononetina, llega sin embargo al material eluido, y se puede separar tan sólo mediante una subsiguiente extracción. Lo similar es válido para otros compuestos lipófilos no conjugados, tales como por ejemplo hormonas esteroides libres. Al contrario que esto, en el procedimiento de elución conforme al invento las isoflavonas y los esteroides libres, que todavía se encuentran en la columna, llegan en su parte predominante a la fase de disolvente, no miscible con agua, del material eluido, eventualmente concentrado por evaporación, mientras que los estrógenos conjugados se encuentran en aproximadamente un 98% en la fase acuosa, que se ha de tratar ulteriormente, de este material eluido. Esta fase acuosa está libre de hormonas esteroides no conjugadas y ampliamente empobrecida en cuanto a isoflavonas y compuestos lipófilos no conjugados comparables. Esta distribución se explica con ayuda de un análisis por GC de la fase acuosa y de la fase orgánica del 4º material eluido del Ejemplo 2a, como se puede deducir de la siguiente Tabla.

TABLA II Distribución de los estrógenos conjugados, de las hormonas esteroides libres y de la formononetina (como ejemplo de isoflavonas) en la fase acuosa y en la fase de disolvente orgánico del 4º material eluido del Ejemplo 2a - evaluación del análisis por GC (la fase acuosa fue concentrada aproximadamente 1,8 veces antes de la determinación)

2

Claims

```
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```
1. Procedimiento para la obtención de una mezcla natural de estrógenos conjugados a partir de la orina de yeguas preñadas, en el que

a)

un líquido de orina, que eventualmente constituye un líquido de orina liberado de sustancias mucosas y sólidas, un concentrado obtenido por evaporación de este líquido de orina o un material retenido de orina concentrado por evaporación, que se ha obtenido mediante filtración de este líquido de orina a través de una membrana, se pone en contacto con una cantidad de una resina adsorbente polimérica que es suficiente para la adsorción de la mezcla de estrógenos conjugados, que está contenida en el líquido de orina, y se separa con respecto del restante líquido de orina una resina adsorbente polimérica cargada con la mezcla de estrógenos conjugados, y

b)

la resina adsorbente polimérica, cargada con la mezcla de estrógenos conjugados, se lava con un agua de lavado ajustada a un valor del pH de por lo menos 12,0, y

c)

eventualmente se realiza un lavado intermedio, en el que la resina adsorbente polimérica, cargada con la mezcla de estrógenos conjugados, se lava con agua, y

d)

la resina adsorbente lavada se pone en contacto con una cantidad de un líquido para elución que es suficiente para la desorción de la mezcla de estrógenos conjugados, que está adsorbida a ella, y

e)

un material eluido, que contiene la mezcla natural de estrógenos conjugados, se separa con respecto de la resina adsorbente y eventualmente se concentra por evaporación,

caracterizado porque

la mezcla natural de estrógenos equinos conjugados, que se ha obtenido, está empobrecida en cuanto a sustancias fenólicas constitutivas de la orina y en cuanto a compuestos lipófilos no conjugados, tomados entre el conjunto que comprende flavonoides no conjugados, isoflavonoides no conjugados, nor-isoprenoides no conjugados, esteroides no conjugados, en particular esteroides de androstanos y pregnanos, y compuestos no conjugados comparables, y

porque como líquido para elución en la etapa (d) de procedimiento se utiliza una mezcla monofásica o bifásica, que contiene

(i)

agua, que se ha ajustado eventualmente a un valor del pH situado en el intervalo alcalino,

y

(ii)

por lo menos un disolvente orgánico no miscible o apenas miscible con agua, que es apropiado para la elución de compuestos lipófilos no conjugados tomados entre el conjunto antes indicado,

y eventualmente

(iii)

por lo menos un disolvente orgánico miscible con agua, seleccionado entre el conjunto que consta de éteres, alcanoles inferiores y cetonas alifáticas inferiores, miscibles con agua, así como mezclas de los disolventes antes mencionados,

y

porque, en el caso de que el material eluido, eventualmente concentrado por evaporación, obtenido en la etapa e) de procedimiento, constituya una mezcla bifásica, en una etapa f) de procedimiento se separa la fase acuosa del material eluido obtenido, que consta de dos fases, y se obtiene una fase acuosa, que contiene la mezcla natural de estrógenos conjugados, y esta última, eventualmente, se concentra por evaporación.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que en la etapa (d) de procedimiento se utiliza como líquido para elución una mezcla monofásica o bifásica, que contiene

(i)

agua, que se ha ajustado eventualmente a un valor del pH situado en el intervalo alcalino, y

(ii)

por lo menos un disolvente orgánico no miscible o apenas miscible con agua, que es apropiado para la elución de compuestos lipófilos no conjugados tomados entre el conjunto que comprende flavonoides no conjugados, isoflavonoides no conjugados, nor-isoprenoides no conjugados, esteroides no conjugados, en particular esteroides de androstanos y pregnanos, y compuestos no conjugados comparables, y,

(iii)

por lo menos un disolvente orgánico miscible con agua, seleccionado entre el conjunto que consta de éteres, alcanoles inferiores y cetonas alifáticas inferiores, miscibles con agua, así como mezclas de los disolventes antes mencionados.
```
\global\parskip1.000000\baselineskip
```
3. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el que el disolvente orgánico (ii), no miscible o apenas miscible con agua, que es apropiado para la elución de compuestos lipófilos no conjugados, está seleccionado entre el conjunto que consta de alcoholes C_{4}-C_{10}, ácidos C_{1}-C_{10} esterificados, aldehídos C_{3}-C_{10}, cetonas C_{4}-C_{10}, éteres C_{3}-C_{10}, nitrilos C_{3}-C_{6} y halógeno-alcanos C_{1}-C_{3}, lineales, ramificados o cíclicos así como mezclas de los disolventes antes mencionados.
4. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el disolvente orgánico (ii), no miscible o apenas miscible con agua, que es apropiado para la elución de compuestos lipófilos no conjugados, está seleccionado entre el conjunto que consta de ésteres alquílicos C_{1}-C_{4} de ácido acético, butanol, ciclohexanol, hexanol, dietil-éter, cloruro de metileno, metil-terc.-butil-éter, y mezclas de los disolventes antes mencionados.
5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el disolvente orgánico (ii), no miscible o apenas miscible con agua, que es apropiado para la elución de compuestos lipófilos no conjugados, es un éster alquílico C_{1}-C_{4} de ácido acético, de modo preferido éster etílico de ácido acético y/o éster isopropílico de ácido acético.
6. Un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el que el disolvente orgánico (iii), miscible con agua, está seleccionado entre el conjunto que consta de acetona, etanol y tetrahidrofurano, así como de mezclas de los disolventes antes mencionados.
7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el disolvente orgánico (iii), miscible con agua, es acetona y/o etanol.
8. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el disolvente orgánico (iii), miscible con agua, es acetona.
9. Un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el disolvente orgánico (ii), no miscible o apenas miscible con agua, que es apropiado para la elución de compuestos lipófilos no conjugados, es un éster alquílico C_{1}-C_{4} de ácido acético, de modo preferido éster etílico de ácido acético y/o éster isopropílico de ácido acético, y en el que el disolvente orgánico (iii), miscible con agua, es acetona y/o etanol.
10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el disolvente orgánico (ii), no miscible o apenas miscible con agua, que es apropiado para la elución de compuestos lipófilos no conjugados, es el éster etílico de ácido acético, el disolvente orgánico (iii), miscible con agua, es acetona.
11. Un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el que la mezcla monofásica o bifásica, que encuentra utilización como líquido para elución en la etapa (d) de procedimiento, presenta una relación en volumen del agua (i) al disolvente orgánico (ii), no miscible o apenas miscible con agua, situada en el intervalo de 5:1 a 1:5, de modo preferido en el intervalo de 2:1 a 1:2.
12. Un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el que la mezcla monofásica o bifásica, que encuentra utilización como líquido para elución en la etapa (d) de procedimiento, presenta una relación en volumen del agua (i) al disolvente orgánico (iii), miscible con agua, situada en el intervalo de 4:1 a 1:5, de modo preferido en el intervalo de 2:1 a 1:3.
13. Un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el que la mezcla monofásica o bifásica, que encuentra utilización como líquido para elución en la etapa (d) de procedimiento, presenta una relación en volumen del agua (i) al disolvente orgánico (ii), no miscible o apenas miscible con agua, juntamente con el disolvente orgánico (iii), miscible con agua, situada en el intervalo de 5:1 a 1:5, de modo preferido en el intervalo de 2:1 a 1:2.
14. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que en el que la mezcla monofásica o bifásica, que encuentra utilización como líquido para elución en la etapa (d) de procedimiento, presenta una relación en volumen del agua (i) al éster alquílico C_{1}-C_{4} de ácido acético, de modo preferido al éster etílico de ácido acético y/o éster isopropílico de ácido acético, que encuentra utilización como disolvente orgánico (ii), no miscible o apenas miscible con agua, y a la acetona y/o etanol que encuentra utilización como disolvente orgánico (iii), miscible con agua, situada en el intervalo de 1:1:1 a 1:1:2, de modo preferido de aproximadamente 1:1:1,4.
15. Un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el que como resinas adsorbentes poliméricas se utilizan resinas adsorbentes semipolares, de modo preferido resinas adsorbentes semipolares no iónicas.
16. Un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el que la elución de la mezcla natural de estrógenos conjugados a partir de la resina adsorbente lavada en la etapa d) de procedimiento se lleva a cabo a unas temperaturas situadas en el intervalo comprendido entre 20ºC y 80ºC, de modo preferido a unas temperaturas comprendidas entre 30ºC y 50ºC.