ES2220721T3 - Proceso para la preparacion de fosforoticato-triesteres. - Google Patents
Proceso para la preparacion de fosforoticato-triesteres.Info
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Abstract
Un proceso para la preparación de un fosforotioato¿triéster que comprende acoplar un H¿fosfonato con un alcohol en presencia de un agente de acoplamiento para formar de este modo un H¿fosfonato¿diéster, y subsiguientemente, el H¿fosfonato¿diéster se hace reaccionar con un agente de transferencia de azufre para formar con ello un fosforotioato¿triéster caracterizado porque la reacción de acoplamiento entre el H¿fosfonato y el alcohol tiene lugar en presencia del agente de transferencia de azufre.
Description
Proceso para la preparación de
fosforotioato-triésteres.
La presente invención proporciona un método de
síntesis de fosforotioato-triésteres,
particularmente oligonucleótidos y con inclusión de
oligonucleótido-fosforotioatos.
En los últimos quince años aproximadamente, se ha
hecho un progreso enorme en el desarrollo de la síntesis de
oligodesoxirribonucleótidos (secuencias de DNA),
oligorribonucleótidos (secuencias de RNA) y sus análogos. El interés
incrementado en las aplicaciones terapéuticas de secuencias de DNA y
RNA ha conducido a una demanda creciente de cantidades mayores de
material, y se ha realizado una gran cantidad de trabajo en el
aumento a escala de la síntesis de oligonucleótidos. Virtualmente,
la totalidad de este trabajo ha implicado la construcción de
sintetizadores cada vez mayores y la utilización de la misma química
de fosforamiditos sobre un soporte sólido. Un procedimiento
alternativo para la síntesis de oligonucleótidos se describe en la
Solicitud de Patente Internacional WO99/09041. El procedimiento
descrito emplea acoplamiento secuencial y pasos de transferencia de
azufre en solución. Los documentos
EP-A-0723973 y Nucleosides &
Nucleotides, Vol 17 (1-3) 1998, pp
451-470 describen el uso de reactivos de
transferencia de azufre en la síntesis de oligonucleótidos mediante
fosfo-triésteres.
De acuerdo con un primer aspecto de la presente
invención, se proporciona un proceso para la preparación de un
fosforotioato-triéster que comprende acoplar un
H-fosfonato con un alcohol en presencia de un agente
de acoplamiento para formar con ello un
H-fosfonato-diéster, y
subsiguientemente, el
H-fosfonato-diéster se hace
reaccionar con un agente de transferencia de azufre para formar con
ello un -triéster fosforotioato, caracterizado porque la reacción de
acoplamiento entre el H-fosfonato y el alcohol tiene
lugar en presencia del agente de transferencia de azufre.
En muchas realizaciones preferidas, se considera
que la reacción transcurre por una secuencia por la cual el
H-fosfonato reacciona con el alcohol en presencia
del agente de acoplamiento y el
H-fosfonato-diéster formado in
situ reacciona rápidamente con el agente de transferencia de
azufre que está presente también, como se muestra a modo de ejemplo
en el esquema de reacción:
en el cual Z, Z' y Z'' representan
independientemente grupos protectores, B y B' son independientemente
nucleobases, y cada Y representa independientemente H,
O-alquilo, O-alquenilo, grupo
protector de O, C-alquilo o
C-alquenilo.
El H-fosfonato empleado en el
proceso de la presente invención es ventajosamente un nucleósido u
oligonucleótido H-fosfonato protegido, o un análogo
del mismo, que comprende preferiblemente una función 5' ó 3'
H-fosfonato, de modo particularmente favorable una
función 3' H-fosfonato. Nucleósidos preferidos son
2'-desoxirribonucleósidos y ribonucleósidos;
oligonucleótidos preferidos son oligodesoxirribonucleótidos y
oligorribonucleótidos.
Cuando el H-fosfonato es un
derivado de desoxirribonucleósido, ribonucleósido,
oligodesoxirribonucleótido u oligorribonucleótido protegido que
comprende una función 3' H-fosfonato, la función 5'
hidroxi está protegida ventajosamente por un grupo protector
adecuado. Ejemplos de tales grupos protectores adecuados incluyen
grupos protectores lábiles en medio ácido, particularmente grupos
tritilo y tritilo sustituido tales como grupos dimetoxitritilo y
9-fenilxanten-9-ilo;
y grupos protectores lábiles en medio básico tales como FMOC.
Cuando el bloque de construcción del
H-fosfonato es un derivado de desoxirribonucleósido,
ribonucleósido, oligodesoxirribonucleótido u oligorribonucleótido
protegido que comprende una función 5' H-fosfonato,
la función 3' hidroxi está protegida ventajosamente por un grupo
protector adecuado. Grupos protectores adecuados incluyen los
descritos anteriormente para la protección de las funciones 5'
hidroxi de los bloques de construcción 3'
H-fosfonato y grupos acilo, tales como levulinoílo y
levulinoílo sustituidos.
Cuando el H-fosfonato es un
ribonucleósido protegido o un oligorribonucleótido protegido, la
función 2'-hidroxi está protegida ventajosamente por
un grupo protector adecuado, por ejemplo un grupo protector acetal
lábil en medio ácido, particularmente un grupo
1-(aril)-4-alcoxipiperidin-4-ilo
tal como
1-(2-fluorofenil)-4-metoxipiperidin-4-ilo
(Fpmp) o
1-(2-clorofenil)-4-etoxi-piperidin-4-ilo
(Cpep); y grupos trialquilsililo, en muchos casos grupos
tri(C_{1}-C_{4}-alquil)sililo
tales como un grupo
terc-butil-dimetilsililo.
Alternativamente, el ribonucleósido u oligorribonucleótido puede ser
un derivado 2'-O-alquilo,
2'-O-alcoxialquilo o
2'-O-alquenilo, comúnmente un
derivado alquilo C_{1-4}, alcoxi
C_{1-4}-alquilo
C_{1-4} o alquenilo, en cuyo caso, la posición 2'
no precisa protección adicional. H-fosfonatos de
nucleósidos y oligonucleótidos análogos que se pueden emplear en el
proceso de la presente invención incluyen derivados de nucleósidos y
oligonucleótidos sustituidos con 2'-fluoro,
2'-amino,
2'-C-alquilo y
2'-C-alquenilo.
Otros H-fosfonatos que se pueden
emplear en el proceso de acuerdo con la presente invención se
derivan de otros alcoholes polifuncionales, especialmente alcoholes
alquílicos, y preferiblemente dioles o trioles. Ejemplos de
alquil-dioles incluyen
etano-1,2-diol, y
poli(etilen-glicoles) de peso molecular bajo,
tales como aquéllos que tienen un peso molecular de hasta 400.
Ejemplos de alquil-trioles incluyen glicerol y
butano-trioles. Comúnmente, estará presente sólo una
única función H-fosfonato, estando los restos
hidroxi restantes protegidos por grupos protectores adecuados, tales
como los descritos anteriormente en esta memoria para la protección
en las posiciones 5' ó 2' de los ribonucleósidos.
El alcohol empleado en el proceso de la presente
invención es comúnmente un nucleósido u oligonucleótido protegido
que comprende un grupo hidroxi libre, preferiblemente un grupo 3' ó
5' hidroxi libre, y de modo particularmente preferible un grupo 5'
hidroxi.
Cuando el alcohol es un nucleósido protegido o un
oligonucleótido protegido, nucleósidos preferidos son
desoxirribonucleósidos y ribonucleósidos, y oligonucleótidos
preferidos son oligodesoxirribonucleótidos y
oligorribonucleótidos.
Cuando el alcohol es un derivado de
desoxirribonucleósido, ribonucleósido, oligodesoxirribonucleótido u
oligorribonucleótido que comprende un grupo
5'-hidroxi libre, la función
3'-hidroxi está protegida ventajosamente por un
grupo protector adecuado. Ejemplos de tales grupos protectores
incluyen grupos acilo, que contienen comúnmente hasta 16 átomos de
carbono, tales como los derivados de
gamma-cetoácidos, tales como grupos levulinoílo y
levulinoílo sustituido, y grupos análogos. Grupos levulinoílo
sustituidos incluyen particularmente
5-halo-levulinoílo, tal como
5,5,5-trifluorolevulinoílo; grupos análogos incluyen
por ejemplo grupos benzoilpropionilo. Otros grupos protectores de
este tipo incluyen grupos alcanoílo grasos, con inclusión
particularmente de grupos alcanoílo C_{6-16}
lineales o ramificados, tales como grupos lauroílo; grupos benzoílo
y benzoílo sustituido, tales como grupos benzoílo sustituidos con
alquilo, comúnmente alquilo C_{1-4}, y halo,
comúnmente cloro o fluoro; y silil-éteres, tales como alquil-,
comúnmente alquil C_{1-4}-, y aril-, comúnmente
fenil-silil-éteres, en particular grupos
terc-butil-dimetil-sililo
y
terc-butil-difenil-sililo.
Cuando el alcohol es un desoxirribonucleósido,
ribonucleósido, oligodesoxirribonucleótido u oligorribonucleótido
protegido que comprende un grupo 3'-hidroxi libre,
la función 5' hidroxi está protegida ventajosamente por un grupo
protector adecuado. Grupos protectores adecuados son los descritos
anteriormente para la protección del grupo
5'-hidroxi de desoxirribonucleótidos,
ribonucleósidos, oligodesoxirribonucleótidos y
oligo-rribonucleótido
3'-H-fosfonatos.
Cuando el alcohol es un ribonucleósido o un
oligorribonucleótido, la función 2'-hidroxi está
protegida ventajosamente por un grupo protector adecuado, tal como
un grupo protector acetal, particularmente un grupo
1-(aril)-4-alcoxipiperidin-4-ilo
tal como
1-(2-fluoro-fenil)-4-metoxipiperidin-4-ilo
(Fpmp) o
1-(2-clorofenil)-4-etoxipiperidin-4-ilo
(Cpep); y grupos trialquilsililo, en muchos casos grupos
tri(alquil C_{1-4})sililo tales como
un grupo
terc-butil-dimetil-sililo.
Alternativamente, el ribonucleósido u oligorribonucleótido puede ser
un derivado 2'-O-alquilo,
2'-O-alcoxialquilo o
2'-O-alquenilo, comúnmente un
derivado alquilo C_{1-4}, alcoxi
C_{1-4}-alquilo
C_{1-4} o alquenilo, en cuyo caso, la posición 2'
no precisa protección ulterior. Análogos de nucleósidos y
oligonucleótidos que pueden emplearse como alcoholes en el proceso
de la presente invención incluyen derivados de nucleósidos y
oligonucleótidos sustituidos con 2'-fluoro,
2'-amino,
2'-C-alquilo y
2'-C-alquenilo
Otros alcoholes que se pueden emplear en el
proceso de acuerdo con la presente invención son polioles de tipo no
sacárido, especialmente alquil-polioles, y
preferiblemente dioles o trioles. Ejemplos de
alquil-dioles incluyen
etano-1,2-diol, y
poli(etilen-glicoles) de peso molecular bajo,
tales como aquéllos que tienen un peso molecular de hasta 400.
Ejemplos de alquil-trioles incluyen glicerol y
butano-trioles. Comúnmente, estará presente sólo un
único grupo hidroxi libre, estando los grupos hidroxi restantes
protegidos por grupos protectores adecuados, tales como los
descritos anteriormente en esta memoria para la protección de las
posiciones 5' ó 2' de ribonucleósidos. Sin embargo, puede estar
presente más de un grupo hidroxi libre si se desea realizar
acoplamientos idénticos en más de un grupo hidroxi.
Cuando se emplea uno cualquiera o ambos de un
oligonucleótido H-fosfonato u oligonucleótido que
contiene un grupo hidroxi libre, los enlaces internucleotídicos, que
pueden comprender enlaces fosfato, fosforotioato o a la vez fosfato
y fosforotioato, se protegen preferiblemente. Ejemplos de tales
grupos protectores son bien conocidos en la técnica e incluyen
grupos arilo, grupos metilo o grupos alquilo sustituidos,
preferiblemente grupos 2-cianoetilo, y grupos
alquenilo.
El proceso de acuerdo con la presente invención
puede llevarse a cabo en solución. Cuando se emplea dicha síntesis
en fase de solución, disolventes orgánicos que pueden emplearse en
el proceso de la presente invención incluyen haloalcanos,
particularmente diclorometano, ésteres, particularmente
alquil-ésteres tales como acetato de etilo, y propionato de metilo o
etilo, amidas tales como dimetilformamida,
N-metilpirrolidinona y
N,N'-dimetilimidazolidinona, y disolventes
nucleófilos básicos tales como piridina. Disolventes preferidos para
los pasos de acoplamiento y transferencia de azufre son piridina,
diclorometano y mezclas de los mismos, y de modo particularmente
preferible piridina. Los disolventes orgánicos empleados son con
preferencia sustancialmente anhidros.
En ciertas realizaciones de la presente
invención, el H-fosfonato o el alcohol,
preferiblemente el alcohol, está unido a un soporte sólido. Muy
preferiblemente, el alcohol unido a un soporte sólido es un
nucleósido o nucleótido que tiene un grupo 5' hidroxi libre, y está
unido al soporte sólido por la vía de la posición 3'. Soportes
sólidos que se pueden emplear son sustancialmente insolubles en el
disolvente empleado, e incluyen aquellos soportes bien conocidos en
la técnica para la síntesis en fase sólida de oligonucleótidos.
Ejemplos incluyen sílice, vidrio de poros controlados, poliestireno,
copolímeros que comprenden poliestireno tales como copolímeros
poliestireno-poli(etilen-glicol)
y polímeros tales como poli(acetato de vinilo).
Adicionalmente, pueden emplearse en caso deseado soportes de
poli(acrilamidas), tales como los empleados más comúnmente
para la síntesis de péptidos en fase sólida.
Cuando se emplea un soporte sólido, el alcohol o
H-fosfonato, muy comúnmente el alcohol, se une
comúnmente al soporte sólido por la vía de un enlazador escindible,
preferiblemente por la vía de la posición 3'. Ejemplos de
enlazadores que se pueden emplear incluyen aquéllos que son bien
conocidos en la técnica para la síntesis en fase sólida de
oligonucleótidos, tales como enlazadores derivados de uretano,
oxalilo, succinilo y amino.
El proceso de acuerdo con la presente invención
puede llevarse a cabo por agitación de una suspensión del alcohol o
H-fosfonato unido al sólido en una solución del
H-fosfonato o alcohol, respectivamente, agente de
acoplamiento y agente de transferencia de azufre. Alternativamente,
el soporte sólido puede estar compactado en una columna, y puede
hacerse pasar a través de la columna una solución de
H-fosfonato, agente de acoplamiento y agente de
transferencia de azufre.
Cuando el H-fosfonato y el
alcohol son ambos nucleósidos u oligonucleótidos protegidos, la
invención proporciona un método mejorado para la síntesis gradual y
por bloques de olidesoxirribonucleótidos, oligorribonucleótidos y
análogos de los mismos, basada en reacciones de acoplamiento de
H-fosfonatos. De acuerdo con un aspecto preferido de
la presente invención, nucleósidos u oligonucleótidos protegidos con
una función H-fosfonato 3'-terminal
y nucleósidos u oligonucleótidos protegidos con una función hidroxi
5'-terminal se hacen reaccionar en presencia a la
vez de un agente de acoplamiento adecuado y un agente de
transferencia de azufre adecuado, con formación de un compuesto
intermedio de dinucleósido u oligonucleótido
H-fosfonato protegido y dichos compuestos
intermedios se someten a transferencia de azufre por una reacción
in situ con el agente de transferencia de azufre
adecuado.
Además de la presencia de grupos protectores de
hidroxi, las bases presentes en los nucleósidos/nucleótidos
empleados en la presente invención se protegen también
preferiblemente en caso necesario por grupos protectores adecuados.
Bases orgánicas que pueden estar presentes incluyen nucleobases,
tales como nucleobases naturales y no naturales, y especialmente
purinas, tales como hipoxantina, y particularmente A y G, y
pirimidinas, particularmente T, C y U. Los grupos protectores
empleados son los conocidos en la técnica para la protección de
dichas bases. Por ejemplo, A y/o C pueden protegerse por benzoílo,
con inclusión de benzoílo sustituido, por ejemplo alquil- o alcoxi-,
en muchos casos alquil C_{1-4}- o alcoxi
C_{1-4}-, benzoílo; pivaloílo; y amidina,
particularmente dialquilaminometileno, preferiblemente
di(alquil
C_{1-4})-aminometileno tal como
dimetil- o dibutil-aminometileno. G puede protegerse
en O6 por ejemplo por un grupo fenilo, con inclusión de fenilo
sustituido, por ejemplo 2,5-diclorofenilo y también
en N2, por ejemplo por un grupo acilo tal como un grupo isobutirilo.
T y U no requieren generalmente protección, pero en ciertas
realizaciones pueden protegerse ventajosamente, por ejemplo en O4
con un grupo fenilo, con inclusión de fenilo sustituido, por ejemplo
2,4-dimetilfenilo o en N3 por pivaloiloximetilo,
benzoílo, benzoílo sustituido con alquilo o alcoxi, tal como un
alquil C_{1-4}- o alcoxi
C_{1-4}-benzoílo.
Cuando el alcohol y/o el
H-fosfonato es un nucleósido u oligonucleótido
protegido que tiene grupos hidroxi protegidos, uno de los grupos
protectores de hidroxi puede eliminarse después de la realización
del proceso de la invención con objeto de permitir un acoplamiento
ulterior en dicho punto. El grupo protector eliminado y las
reacciones subsiguientes que tengan lugar en dicho punto dependerán
del tipo de molécula que se prepare. Cuando el acoplamiento está
teniendo lugar en solución, el grupo protector eliminado puede ser
el que se encuentra en la posición 3'-hidroxi. El
oligonucleótido así formado puede convertirse en un
H-fosfonato y puede proseguirse luego a través de
acoplamientos ulteriores de acuerdo con el proceso de la presente
invención, por ejemplo con un nucleósido u oligonucleótido que
comprenda un grupo 5'-hidroxi, en la síntesis de una
secuencia oligonucleotídica deseada. Preferiblemente, cuando el
acoplamiento está realizándose en solución, se elimina el grupo
protector 5'. Éste puede convertirse en un resto
H-fosfonato y acoplarse ulteriormente con un grupo
hidroxi libre, tal como un grupo 3'-hidroxi. No
obstante, se prefiere que el grupo 5'-hidroxi
desprotegido se haga reaccionar con un nucleósido u oligonucleótido
que comprenda un resto 3' H-fosfonato. Cuando el
acoplamiento está teniendo lugar utilizando síntesis en fase sólida,
preferiblemente con un oligonucleótido unido al soporte sólido por
la vía de la posición 3', el grupo protector eliminado se encuentra
preferiblemente en la posición 5'. El grupo
5'-hidroxi libre puede convertirse en un resto
H-fosfonato y emplearse en acoplamientos ulteriores.
No obstante, es muy preferido que el 5'-hidroxi
libre se acople con un nucleósido u oligonucleótido
H-fosfonato, muy preferiblemente un 3'
H-fosfonato. Se reconocerá que pueden emplearse
reacciones correspondientes en los casos en que un oligonucleótido
está unido a un soporte sólido por la vía de la posición 5'. En caso
requerido, los grupos hidroxi libres pueden convertirse en restos
H-fosfonato utilizando métodos conocidos en la
técnica para este propósito. Cuando se han completado los
acoplamientos deseados, el método puede proseguir luego con pasos
para eliminar los grupos protectores de los enlaces
internucleotídicos, los grupos 3' y 5'-hidroxi y de
las bases y, en caso apropiado, para separar el producto del soporte
sólido.
En una realización particularmente preferida, la
invención proporciona un método que comprende el acoplamiento de un
5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-desoxirribo-nucleósido
o ribonucleósido 3'-H-fosfonato o un
oligodes-oxirribonucleótido u oligorribonucleótido
3'-H-fosfonato protegido y un
componente con una función 5'-hidroxi libre en
presencia a la vez de un agente de acoplamiento adecuado y de un
agente de transferencia de azufre adecuado.
En el proceso de la presente invención, pueden
utilizarse cualesquiera agentes de acoplamiento adecuados y agentes
de transferencia de azufre disponibles en la técnica anterior.
Ejemplos de agentes de acoplamiento adecuados
incluyen alquil- y aril-cloruros de ácido, cloruros
de alcano-y areno-sulfonilo, alquil-
y aril-cloroformiatos, alquil- y
aril-clorosulfitos y alquil- y
aril-fosforocloruratos.
Ejemplos de alquil-cloruros de
ácido adecuados que pueden emplearse incluyen cloruros de alcanoílo
C_{2} a C_{16}, con inclusión de cloruros de alcanoílo lineales
y cíclicos, y particularmente cloruro de pivaloílo y cloruro de
adamantano-carbonilo. Ejemplos de
aril-cloruros de ácido que se pueden emplear
incluyen cloruros de benzoílo sustituidos e insustituidos, tales
como cloruros de benzoílo sustituidos con alcoxi
C_{1-4}, halo, particularmente fluoro, cloro y
bromo, y alquilo C_{1-4}. En caso de estar
sustituidos, en muchos casos están presentes 1 a 3 sustituyentes,
particularmente en el caso de los sustituyentes alquilo y halo.
Ejemplos de cloruros de alcanosulfonilo adecuados
que se pueden emplear incluyen cloruros de alcanosulfonilo C_{1} a
C_{16}. Ejemplos de cloruros de arenosulfonilo que se pueden
emplear incluyen cloruros de bencenosulfonilo sustituidos e
insustituidos, tales como cloruros de
benceno-sulfonilo sustituidos con alcoxi
C_{1-4}, halo, particularmente fluoro, cloro y
bromo, y alquilo C_{1-4}. En caso de estar
sustituidos, a menudo están presentes de 1 a 3 sustituyentes,
particularmente en el caso de los sustituyentes alquilo y halo.
Ejemplos de cloroformiatos de alquilo adecuados
que se pueden emplear incluyen cloroformiatos de alquilo C_{2} a
C_{16}. Ejemplos de cloroformiatos de arilo que se pueden emplear
incluyen cloroformiatos de fenilo sustituidos e insustituidos, tales
como cloroformiatos de fenilo sustituidos con alcoxi
C_{1-4}, halo, particularmente fluoro, cloro y
bromo, y alquilo C_{1-4}. En caso de estar
sustituidos, a menudo están presentes de 1 a 3 sustituyentes,
particularmente en el caso de los sustituyentes alquilo y halo.
Ejemplos de clorosulfitos de alquilo adecuados
que se pueden emplear incluyen clorosulfitos de alquilo C_{1} a
C_{16}. Ejemplos de clorosulfitos de arilo que se pueden emplear
incluyen clorosulfitos de fenilo sustituidos e insustituidos, tales
como clorosulfitos de fenilo sustituidos con alcoxi
C_{1-4}, halo, particularmente fluoro, cloro y
bromo, y alquilo C_{1-4}. En caso de estar
sustituidos, a menudo están presentes de 1 a 3 sustituyentes,
particularmente en el caso de los sustituyentes alquilo y halo.
Ejemplos de fosforocloruratos de alquilo
adecuados que se pueden emplear incluyen fosforocloruratos de
di(alquilo C_{1} a C_{6}). Ejemplos de fosforocloruratos
de arilo que se pueden emplear incluyen fosforocloruratos de
difenilo sustituidos e insustituidos, tales como fosforocloruratos
de difenilo sustituidos con alcoxi C_{1-4}, halo,
particularmente fluoro, cloro y bromo, y alquilo
C_{1-4}. En caso de estar sustituidos, a menudo
están presentes de 1 a 3 sustituyentes, particularmente en el caso
de los sustituyentes alquilo y halo.
Agentes de acoplamiento adicionales que se pueden
emplear son los compuestos de cloro-, bromo- y
(benzotriazo-1-iloxi)-fosfonio
y carbonio, descritos por Wada et al., en J. A. C. S. 1997,
119, pp 12710-12721.
Agentes de acoplamiento preferidos son
fosforocloruratos de diarilo, particularmente aquéllos que tienen la
fórmula (ArO)_{2}POCl, en donde Ar es preferiblemente
fenilo, 2-clorofenilo,
2,4,6-triclorofenilo o
2,4,6-tribromo-fenilo.
La naturaleza del agente de transferencia de
azufre dependerá de si se requiere un oligonucleótido, un análogo de
fosforotioato o un
oligonucleótido/oligonucleótido-fosforotioato mixto.
Agentes de transferencia de azufre empleados en el proceso de la
presente invención tienen a menudo la fórmula química general:
L ------ S
------
D
en donde L representa un grupo
lábil, y D representa un grupo arilo, un grupo metilo o alquilo
sustituido, preferiblemente un grupo 2-cianoetilo, o
un grupo alquenilo. Comúnmente, el grupo lábil se selecciona de tal
manera que comprenda un enlace nitrógeno-azufre.
Ejemplos de grupos lábiles adecuados incluyen imidas tales como
morfolinas, por ejemplo
morfolina-3,5-diona; ftalimidas,
succinimidas y maleimidas; indazoles, particularmente indazoles con
sustituyentes que sustraen electrones tales como
4-nitroindazoles; y
triazoles.
Cuando se requiere un enlace fosfodiéster
estándar en el producto final, el resto D representa un grupo arilo,
tal como un grupo fenilo o naftilo. Ejemplos de grupos arilo
adecuados incluyen grupos fenilo sustituidos e insustituidos,
particularmente grupos halofenilo y alquilfenilo, especialmente
4-halofenilo y 4-alquilfenilo,
comúnmente grupos 4-(alquil C_{1-4})fenilo,
muy preferiblemente grupos 4-clorofenilo y
p-tolilo. Un ejemplo de una clase adecuada de agente
de transferencia de azufre estándar dirigido a fosfodiésteres es una
N-(arilsulfanil)ftalimida, o una
N-(arilsulfanil)succin-imida, por
ejemplo N-(fenilsulfanil)succinimida (pueden utilizarse
también otras imidas, tales como maleimidas).
Cuando se requiere un enlace -diéster
fosforotioato en el producto final, el resto D representa un grupo
metilo, alquilo sustituido o alquenilo. Ejemplos de grupos alquilo
sustituidos adecuados incluyen grupos metilo sustituidos,
particularmente bencilo y grupos bencilo sustituidos, tales como
grupos bencilo sustituidos con alquilo, comúnmente alquilo
C_{1-4}, alcoxi, comúnmente alcoxi
C_{1-4}, nitro, y halo, comúnmente cloro, y grupos
etilo sustituidos, especialmente grupos etilo sustituidos en la
posición 2 con un sustituyente que sustrae electrones tal como los
grupos 2-(4-nitrofenil)etilo y
2-cianoetilo. Ejemplos de grupos alquenilo adecuados
son grupos alilo, crotilo y
4-cianobut-2-enilo.
Ejemplos de una clase adecuada de agentes de transferencia de azufre
dirigidos a fosforotioatos son, por ejemplo, derivados de
(2-cianoetil)sulfanilo tales como
4-[(2-cianoetil)sulfanil]-morfolina-3,5-diona
o un reactivo correspondiente tal como
3-(ftalimidosulfanil)propanonitrilo o más preferiblemente
3-(succinimidosulfanil)propanonitrilo.
En muchas realizaciones, el agente de
transferencia de azufre se selecciona de modo que reaccione más
rápidamente con un
H-fosfonato-diéster, particularmente
el H-fosfonato-diéster formado por
el acoplamiento del H-fosfonato y el alcohol, que
con un H-fosfonato-monoéster y/o la
especie activada formada por reacción del
H-fosfonato-monoéster con el agente
de acoplamiento.
El proceso de la presente invención puede
realizarse convenientemente a una temperatura en el intervalo de
aproximadamente -55ºC a aproximadamente 35ºC. Ventajosamente, la
temperatura se encuentra en el intervalo de aproximadamente 0ºC a
aproximadamente 30ºC. Muy preferiblemente, se emplea la temperatura
ambiente (comúnmente en el intervalo de 10 a 25ºC, por ejemplo
aproximadamente 20-25ºC).
La relación molar de H-fosfonato
a alcohol en el proceso de la presente invención se selecciona a
menudo de modo que esté comprendida en el intervalo que va desde
aproximadamente 0,9:1 a 3:1, por lo general desde aproximadamente
1:1 a aproximadamente 2:1, y de modo preferible desde
aproximadamente 1,1:1 a aproximadamente 1,5:1, tal como
aproximadamente 1,2:1 cuando se preparan dímeros o aproximadamente
1,4:1 cuando se preparan unidades mayores. Sin embargo, en los casos
en que están teniendo lugar al mismo tiempo acoplamientos en más de
un hidroxilo libre, las relaciones molares se aumentarán
proporcionalmente. La relación molar de agente de acoplamiento a
alcohol se selecciona a menudo de modo que esté comprendida en el
intervalo de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 10:1, por lo
general desde aproximadamente 1,5:1 a aproximadamente 6:1, y con
preferencia desde aproximadamente 2:1 a aproximadamente 4:1. La
relación molar de agente de transferencia de azufre a alcohol se
selecciona a menudo de modo que esté comprendida en el intervalo que
va desde aproximadamente 1:1 a aproximadamente 10:1, por lo general
desde aproximadamente 1,5:1 a aproximadamente 5:1, y con preferencia
desde aproximadamente 2:1 a aproximadamente 3:1.
En el proceso de la presente invención, el
H-fosfonato y el alcohol pueden
pre-mezclarse en solución, y puede añadirse a esta
mezcla una mezcla del agente de acoplamiento y el agente de
transferencia de azufre. Las adiciones de reactivos tienen lugar
comúnmente de modo continuo o por incrementos a lo largo de un
periodo de adición.
Las concentraciones de agente de acoplamiento y
agente de transferencia de azufre empleadas en solución dependerán a
menudo de la naturaleza del disolvente empleado. Se emplean
comúnmente concentraciones de hasta 0,5M, por ejemplo,
concentraciones comprendidas en el intervalo de 0,05M a 0,35M. En
muchas realizaciones, se pueden emplear concentraciones de agente de
transferencia de azufre de aproximadamente 0,2M, y concentraciones
de agente de acoplamiento de aproximadamente 0,3M.
Cuando uno cualquiera o ambos del
H-fosfonato y el alcohol se emplean como soluciones,
la concentración empleada dependerá de la naturaleza del disolvente,
y particularmente del peso molecular del H-fosfonato
o alcohol. Pueden emplearse concentraciones comprendidas en los
intervalos descritos para agentes de acoplamiento y agentes de
transferencia de azufre, aunque en muchas realizaciones se emplean
concentraciones de aproximadamente 0,1M.
En el proceso de la presente invención, es
posible preparar oligonucleótidos que contienen a la vez enlaces
internucleotídicos de fosfodiéster y
fosforotioato-diéster en la misma molécula, por
selección de agentes de transferencia de azufre apropiados,
particularmente cuando el proceso se realiza de una manera
gradual.
El proceso de acuerdo con la presente invención
se emplea preferiblemente para producir oligonucleótidos que
comprenden típicamente 2 o más residuos nucleotídicos. El límite
superior dependerá de la longitud del oligonucleótido que se desea
preparar. A menudo, los oligonucleótidos producidos por el proceso
de la presente invención comprenden hasta 40 residuos nucleotídicos,
comúnmente hasta 35 residuos nucleotídicos, y preferiblemente de 5 a
25, por ejemplo de 8 a 20, residuos nucleotídicos. Los pasos de
acoplamiento y transferencia de azufre en el proceso de la presente
invención se repiten un número suficiente de veces para producir la
longitud y secuencia deseadas. El proceso de la presente invención
es especialmente adecuado para la preparación de oligonucleótidos
que comprenden 2, 3, 4, 5 ó 6 residuos nucleotídicos, y
particularmente dímeros, trímeros y tetrámeros.
Como se ha expuesto previamente, el método de la
invención puede utilizarse en la síntesis de secuencias de RNA,
2'-O-alquil-RNA,
2'-O-alcoxialquil-RNA y
2'-O-alquenil-RNA. 2'-O-(grupo
protector, v.g.
fpmp)-5'-O-(4,4-dimetoxitritil)-ribonucleósido
3'-H-fosfonatos 9 y
2'-O-(alquil, alcoxialquil o
alquenil)-5'-O-(4,4-dimetoxitritil)-ribonucleósido
3'-H-fosfonatos
10a-c se pueden preparar, por ejemplo, a partir de
los bloques de construcción de nucleósidos protegidos
correspondientes, p-cresil H-fosfonato de
amonio y cloruro de pivaloílo.
Para secuencias de ribozimas
quimioterapéuticamente útiles, la síntesis de RNA en escala
relativamente grande es una cuestión de importancia práctica
considerable. La incorporación de 2'-O-alquil,
2'-O-alquil sustituido y 2'-O-alquenil [especialmente
2'-O-metil, 2'-O-alil y
2'-O-(2-metoxietil)]-ribonucleósidos
(Sproat, B.S. en "Methods in Molecular Biology, Vol. 20. Protocols
for Oligonucleotides and Analogs", Agrawal, S., compilador,
Humana Press, Totowa, 1993) en oligonucleótidos es actualmente una
cuestión de gran importancia, dado que estas modificaciones
confieren tanto resistencia a la digestión por las nucleasas como
propiedades de hibridación satisfactorias a los oligómeros
resultantes.
El paso de transferencia de azufre se lleva a
cabo sobre el producto del acoplamiento de
H-fosfonato in situ, es decir sin separación
y purificación del compuesto intermedio producido por la reacción de
acoplamiento. Preferiblemente, el agente de transferencia de azufre
se añade al mismo tiempo que el agente de acoplamiento. El reactivo
de transferencia de azufre empleado y el agente de acoplamiento se
seleccionan ambos para minimizar las reacciones secundarias, de tal
modo que se favorece la velocidad de acoplamiento sobre la velocidad
de la reacción secundaria del
H-fosfonato-monoéster con el agente
de transferencia de azufre. La elección de los reactivos está
influenciada por la naturaleza del H-fosfonato y el
alcohol que deben acoplarse.
El procedimiento de acoplamiento presente difiere
del seguido en el enfoque de H-fosfonato para
síntesis en fase sólida (Froehler et al., Methods in
Molecular Biology, 1993) en el sentido de que la transferencia de
azufre se realiza en cada paso de acoplamiento en lugar de sólo una
vez después del ensamblaje de la secuencia de oligómeros entera.
Los grupos protectores pueden eliminarse
utilizando métodos conocidos en la técnica para el grupo y función
protector(a) particular. Por ejemplo, grupos protectores
transitorios, particularmente gamma-cetoácidos tales
como los grupos protectores de tipo levulinoílo, pueden eliminarse
por tratamiento con hidrazina, por ejemplo, hidrazina tamponada, tal
como el tratamiento con hidrazina en condiciones muy suaves descrito
por van Boom, J.H.; Burgers, P.M.J. Tetrahedron Lett., 1976,
4875-4878. Los oligonucleótidos parcialmente
protegidos resultantes con funciones 3'-hidroxi
libres pueden convertirse luego en los H-fosfonatos
correspondientes que son compuestos intermedios que se pueden
emplear para la síntesis de bloques de oligonucleótidos y sus
análogos fosforotioato.
Cuando se desprotege el producto deseado una vez
que se ha producido éste, los grupos protectores en los átomos de
fósforo que producen enlaces fosforotioato se eliminan comúnmente en
primer lugar. Por ejemplo, un grupo cianoetilo puede eliminarse por
tratamiento con una amina fuertemente básica tal como DABCO,
1,5-diazabiciclo-[4.3.0]non-5-eno
(DBN),
1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno
(DBU) o trietilamina.
Los grupos fenilo y fenilo sustituido en los
enlaces internucleotídicos de fosforotioato y en los residuos de
bases pueden eliminarse por tratamiento con oximatos, por ejemplo
con el conjugado base de una aldoxima, preferiblemente la de
E-2-nitrobenzaldoxima o
piridina-2-carboxaldoxima (Reese,
et al., Nucleic Acids Res. 1981). Kamimura, T. et al.,
en J. Am. Chem. Soc., 1984, 106 4552-4557 y
Sekine, M. et al., Tetrahedron, 1985, 41,
5279-5288 en un enfoque para la síntesis de
oligonucleótidos por el enfoque de fosfotriéster en solución, basado
en compuestos intermedios de
S-fenil-fosforotioato; y van Boom y
sus colaboradores en un enfoque para síntesis de oligonucleótidos,
basado en compuestos intermedios de
S-(4-metilfenil)fosforotioato
(Wreesman, C.T.J. et al., Tetrahedron Lett., 1985, 26,
933-936) han demostrado todos ellos que el
desbloqueo de S-fenil-fosforotioatos
con iones oximato (utilizando el método de Reese et al.,
1978; Reese, C.B.; Zard, L. Nucleic Acids Res., 1981, 9,
4611-4626) conducía a enlaces internucleotídicos
fosfodiéster naturales. En la presente invención, el desbloqueo de
los fosforotioatos protegidos en S-(fenilo) con la base
conjugada de E-2-nitrobenzaldoxima transcurre
suavemente y sin escisión internucleotídica detectable alguna.
\newpage
Otros grupos protectores básicos, por ejemplo
grupos benzoílo, pivaloílo y amidina pueden eliminarse por
tratamiento con amoniaco acuoso concentrado.
Los grupos tritilo (con inclusión de monometoxi-
y dimetoxi-tritilo) presentes pueden eliminarse por
tratamiento con ácido. Con relación a la estrategia de desbloqueo
global en la síntesis de
oligodesoxirribo-nucleótidos, otra consideración
importante de la presente invención es que la eliminación del grupo
protector tritilo, a menudo un grupo DMTr
5'-terminal ("destritilación") debería proceder
sin despurinación concomitante, especialmente de cualesquiera
residuos de
6-N-acil-2'-desoxiadenosina.
De acuerdo con una realización de la invención, los presentes
inventores han encontrado que dicha despurinación, que quizás es
difícil de evitar por completo en la síntesis en fase sólida, puede
suprimirse totalmente efectuando la "destritilación" con una
solución diluida de cloruro de hidrógeno a baja temperatura,
particularmente cloruro de hidrógeno aprox. 0,45M en solución en
dioxano-diclorometano (1:8 v/v) a -50ºC. En estas
condiciones de reacción, la "destritilación" puede completarse
rápidamente, y en ciertos casos después de 5 minutos o menos. Por
ejemplo, cuando se trató
6-N-benzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-desoxiadenosina
con cloruro de hidrógeno en dioxano-diclorometano en
tales condiciones, la "destritilación" era completa al cabo de
2 minutos, pero no se detectó despurinación alguna ni siquiera
después de 4 horas.
Los grupos protectores sililo pueden eliminarse
por tratamiento con fluoruro, por ejemplo con una solución de sal
fluoruro de tetraalquil-amonio tal como fluoruro de
tetrabutilamonio.
Los grupos protectores Fpmp pueden eliminarse por
hidrólisis ácida en condiciones suaves.
El proceso de la presente invención puede
emplearse para la preparación de secuencias oligonucleótidos con (a)
exclusivamente enlaces internucleotídicos fosfodiéster, (b)
exclusivamente enlaces internucleotídicos
fosforotioato-diéster y (c) una combinación de
enlaces internucleotídicos fosfodiéster y
fosforotioato-diéster a la vez.
Será evidente que cuando el proceso de la
presente invención se aplica a la síntesis por bloques, están
disponibles cierto número de estrategias alternativas en lo que
respecta a la ruta para dar el producto deseado. Éstas dependerán de
la naturaleza del producto deseado. Por ejemplo, puede prepararse un
octámero por la preparación de dímeros, acoplarse para producir
tetrámeros, los cuales se acoplan luego para producir el octámero
deseado. Alternativamente, un dímero y un trímero pueden acoplarse
para producir un pentámero, que puede acoplarse con un trímero
adicional para producir el octámero deseado. La elección de la
estrategia está a discreción del usuario. Sin embargo, la
característica común de tal acoplamiento por bloques es que un
H-fosfonato oligómero que comprende dos o más
unidades se acopla con un alcohol oligómero que comprende también
dos o más unidades. Muy frecuentemente, se acoplan 3'
H-fosfonatos oligonucleotídicos con oligonucleótidos
que tienen funciones 5'-hidroxi libres.
El proceso de la presente invención se puede
emplear también para preparar oligonucleótidos cíclicos,
especialmente oligodesoxirribonucleótidos cíclicos y ribonucleótidos
cíclicos. En la preparación de oligonucleótidos cíclicos, se prepara
un oligonucleótido que comprende una función
H-fosfonato, a menudo un 3' ó 5'
H-fosfonato, y se introduce una función hidroxi
libre por desprotección apropiada. La posición de la función hidroxi
libre se selecciona usualmente de modo que corresponda al
H-fosfonato, por ejemplo una función
5'-hidroxi se acoplaría con un 3'
H-fosfonato, y una función
3'-hidroxi se acoplaría con un 5'
H-fosfonato. Las funciones hidroxi y
H-fosfonato pueden acoplarse luego
intramolecularmente en solución en presencia de un agente de
acoplamiento, y esta reacción va seguida por una transferencia de
azufre in situ.
El producto deseado, particularmente un
oligonucleótido desprotegido, tal como un oligonucleótido
desprotegido que comprende exclusivamente fosfodiéster o
exclusivamente enlaces internucleotídicos fosforotioato, o una
mezcla de fosfodiéster y al menos un enlace internucleotídico
fosforotioato, se purifican ventajosamente por métodos conocidos en
la técnica, tales como uno o más de cromatografía de intercambio
iónico, cromatografía en fase inversa, y precipitación a partir de
un disolvente apropiado. Puede emplearse también el procesamiento
ulterior del producto mediante, por ejemplo, ultrafiltración.
El método de acuerdo con la invención se
ilustrará ahora con referencia a los ejemplos siguientes, que no
pretenden ser limitantes:
En los ejemplos, debe indicarse que en los casos
en que los residuos de nucleósidos y los enlaces internucleotídicos
están escritos en cursiva, ello indica que los mismos están
protegidos de algún modo. En el presente contexto, A, C, G, T
y T (que no está escrito en cursiva) representan
2'-desoxiadenosina protegida en N-6
con un grupo benzoílo, 2'-desoxicitidina protegida
en N-4 con un grupo benzoílo,
2'-desoxiguanosina protegida en N-2
y en O-6 con grupos isobutirilo y
2,5-diclorofenilo, timina protegida en
O-4 con un grupo fenilo, y timina desprotegida. Por
ejemplo, como se indica en el esquema 3, p(s) y
p(s') representan S-(2-cianoetil)- y
S-(fenil)-fosforotioatos, respectivamente, y
p(H), que no está protegido y por consiguiente no está
escrito en cursiva, representa un
H-fosfonato-monoéster si está
situado al final de una secuencia o fijado a un monómero, pero en
caso contrario representa un
H-fosfonato-diéster.
Se calentaron N-bromosuccinimida (17,80 g,
0,10 mol) y disulfuro de di-(2-cianoetilo) (17,20 g,
0,10 mol), a reflujo, en 1,2-dicloroetano seco (30
ml) en una atmósfera de argón durante 2 h. Después que la mezcla de
reacción se hubo enfriado a la temperatura ambiente, se añadió
hexano (300 ml) y la mezcla se agitó durante 10 min. La capa
superior se decantó y el residuo aceitoso se trituró con acetato de
etilo (20 ml) durante 10 min. El sólido obtenido se recogió por
filtración y se lavó con éter (70 ml) para dar el compuesto del
título como un sólido blanquecino (12,4 g, 67,3%) (encontrado,
en material recristalizado en etanol absoluto: C, 45,8; H, 4,3; N,
15,2. C_{7}H_{8}N_{2}O_{2}S requiere: C, 45,64; H, 4,38; N,
15,21%), p.f. 110-112ºC; \delta_{H}
[(CD_{3})_{2}SO] 2,71 (4H, s), 2,75 (2H, t, J
6,9), 3,02 (2H, t, J 6,9); \delta_{C}
[(CD_{3})_{2}SO] 17,9, 32,8, 118,2, 177,9.
N-Bromosuccinimida (8,90 g, 50,0
mmol) y disulfuro de difenilo (10,9 g, 49,9 mmol) se calentaron, a
reflujo, en 1,2-dicloroetano seco (40 ml) durante 2
h. Después que la mezcla de reacción se hubo enfriado a la
temperatura ambiente, se añadió hexano (150 ml) y la mezcla se agitó
durante 30 min. El producto se recogió por filtración y se lavó con
hexano (50 ml). La recristalización en metanol absoluto dio el
compuesto del título como cristales incoloros (6,2 g, 59,8%),
p.f. 110-112ºC (lit.
^{7}115-116ºC; \delta_{H}
[(CD_{3})_{2}SO] 2,84 (4H, s), 7,32 (5H, m);
\delta_{C} [(CD_{3})_{2}SO] 28,8, 126,3, 127,6,
129,2, 135,3, 177,2.
DMTr-Tp(H) (B =
timin-1-ilo) (0,852 g, 1,2 mmol) y
HO-T-Lev (B' =
timin-1-ilo) (0,340 g, 1,0 mmol) se
evaporaron juntos con piridina seca (2 ml) y el residuo se
redisolvió luego en piridina seca (6 ml) a la temperatura ambiente.
A esta solución se añadió, gota a gota durante un periodo de 5 min,
una solución de
N-[(2-cianoetil)sulfanil]succinimida
(0,46 g, 2,5 mmol) y fosforoclorurato de difenilo (0,52 ml, 3,5
mmol) en piridina seca (6 ml). Después de 5 min, se añadió agua (1
ml). La mezcla de reacción se agitó luego durante 5 min adicionales
antes de distribuirla entre diclorometano (50 ml) y solución acuosa
saturada de hidrogenocarbonato de sodio (50 ml). La capa orgánica se
separó y se lavó luego adicionalmente con solución acuosa saturada
de hidrogenocarbonato de sodio (2 x 30 ml). Las capas orgánicas
reunidas se secaron (MgSO_{4}) y se concentraron a presión
reducida. El residuo se fraccionó por cromatografía en columna corta
sobre gel de sílice: la evaporación de las fracciones apropiadas,
que se eluyeron con CH_{2}Cl_{2}-MeOH (96:4 v/v)
dio DMTr-Tp(s)T-Lev (B
= B' = timin-1-ilo) como una espuma
incolora (1,009 g, 99,3%); \delta_{P}[(CD_{3}) _{2}SO] 27,9,
27,7, 27,0 (aprox. 0,7%).
Ejemplos adicionales del proceso de la presente
invención se llevaron a cabo por adición de una solución de
fosforoclorurato de difenilo 5b (2,5 mmol) y
N-[(2-cianoetil)sulfanil]- o
N-(fenilsulfanil)-succinimida (8a ó 8b, 2,5
mmol) en piridina anhidra (6 ml) gota a gota durante un periodo de 5
min a una solución agitada del H-fosfonato monómero
(1,2 ó 1,4 mmol) y el componente 5'-OH (1,0 mmol)
disuelto en piridina anhidra (6 ml) a la temperatura ambiente.
Después de un periodo adicional de 5-25 min (véase
tiempo total de reacción), los productos se sometieron al
tratamiento de acabado y se cromatografiaron. Los resultados
obtenidos se dan en la tabla 1.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Claims (28)
1. Un proceso para la preparación de un
fosforotioato-triéster que comprende acoplar un
H-fosfonato con un alcohol en presencia de un agente
de acoplamiento para formar de este modo un
H-fosfonato-diéster, y
subsiguientemente, el
H-fosfonato-diéster se hace
reaccionar con un agente de transferencia de azufre para formar con
ello un fosforotioato-triéster caracterizado
porque la reacción de acoplamiento entre el
H-fosfonato y el alcohol tiene lugar en presencia
del agente de transferencia de azufre.
2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
en el cual el H-fosfonato es un nucleósido u
oligonucleótido protegido que comprende una función 3'
H-fosfonato.
3. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 2, en el cual el alcohol es un nucleósido u
oligonucleótido protegido que comprende una función
5'-hidroxi libre.
4. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el cual el agente de acoplamiento es
un fosforoclorurato de diarilo de fórmula (ArO)_{2}POCl, en
la cual Ar representa fenilo, 2-clorofenilo,
2,4,6-triclorofenilo o
2,4,6-tribromofenilo.
5. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el cual el agente de transferencia
de azufre tiene la fórmula química general:
L ------ S
------
D
en la cual L representa un grupo
lábil, y D representa un grupo arilo, un grupo metilo, un grupo
alquilo sustituido o un grupo
alquenilo.
6. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 5,
en el cual el grupo lábil es una
morfolina-3,5-diona, ftalimida,
succinimida, maleimida o indazol, y D representa un grupo
4-halofenilo, grupo 4-alquilfenilo,
grupo metilo, grupo bencilo, grupo alquilbencilo, grupo halobencilo,
grupo alilo, grupo crotilo, grupo 2-cianoetilo o un
grupo 2-(4-nitrofenil)etilo.
7. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el cual el
H-fosfonato y el alcohol se seleccionan
independientemente del grupo constituido por desoxirribonucleósidos,
oligodesoxirribonucleósidos, ribonucleósidos,
2'-O-(alquil, alcoxialquil o
alquenil)-ribonucleósidos, oligorribonucleótidos y
2'-O-(alquil, alcoxialquil o
alquenil)-oligorribo-nucleótidos.
8. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el cual el
H-fosfonato o el alcohol, preferiblemente el
alcohol, está unido a un soporte sólido.
9. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 8,
en el cual un alcohol está unido a un soporte sólido, el alcohol es
un nucleósido o nucleótido que tiene un grupo hidroxi libre en la
posición 5', y está unido al soporte sólido por la posición 3'.
10. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 8
ó 9, en el cual un alcohol unido a un soporte sólido se pone en
contacto con una solución que comprende un
H-fosfonato, un agente de acoplamiento y un agente
de transferencia de azufre.
11. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, en el cual el proceso se lleva a cabo en
fase de solución.
12. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
11, en el cual una solución que comprende el agente de acoplamiento
y el agente de transferencia de azufre se añade a una solución que
comprende el H-fosfonato y el alcohol.
13. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el cual se emplea un oligonucleótido
H-fosfonato y/o un oligonucleótido que comprende una
función 3' ó 5'-hidroxi libre y uno cualquiera o
ambos del oligonucleótido H-fosfonato y el
oligonucleótido que comprende una función 3' ó
5'-hidroxi libre comprenden uno o más enlaces
internucleotídicos fosfotioato.
14. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el cual el
fosforotioato-triéster comprende de 2 a 8,
preferiblemente de 2 a 4 residuos nucleotídicos.
15. Un proceso para la preparación de un
oligonucleótido, oligonucleótido-fosforotioato u
oligonucleótido/oligo-nucleótido-fosforotioato
mixto desprotegido que comprende:
a) acoplar un nucleósido protegido u
oligonucleótido H-fosfonato que comprende una
función 3' ó 5' H-fosfonato con un nucleósido u
oligonucleótido protegido que comprende una función 3' ó
5'-hidroxi libre en presencia de un agente de
acoplamiento para formar de este modo un
H-fosfonato-diéster y, in
situ, hacer reaccionar el
H-fosfonato-diéster con un agente de
transferencia de azufre para producir un
fosforotioato-triéster, en el cual la reacción de
acoplamiento entre el H-fosfonato y el alcohol tiene
lugar en presencia del agente de transferencia de azufre; y
b) desproteger el
fosforotioato-triéster producido en a) para formar
de este modo un oligonucleótido,
oligonucleótido-fosforotioato u
oligonucleótido/oligonucleótido-fosforotioato mixto
desprotegido.
16. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
15, en el cual el oligonucleótido,
oligonucleótido-fosforotioato u
oligonucleótido/oligonucleótido-fosforotioato mixto
desprotegido se purifica posteriormente.
17. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
15 ó 16, en el cual el nucleósido u oligonucleótido
H-fosfonato protegido comprende una función 3'
H-fosfonato y el nucleósido u oligonucleótido
protegido que comprende una función hidroxi libre comprende una
función 5'-hidroxi libre.
18. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 15 a 17, en el cual el agente de acoplamiento
es un fosforoclorurato de diarilo de fórmula (ArO)_{2}POCl,
en la cual Ar representa fenilo, 2-clorofenilo,
2,4,6-triclorofenilo o
2,4,6-tribromofenilo.
19. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 15 a 8, en el cual el agente de transferencia
de azufre tiene la fórmula química general:
L ------ S
------
D
en la cual L representa un grupo
lábil, y D representa un grupo arilo, un grupo metilo, un grupo
alquilo sustituido o un grupo
alquenilo.
20. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
19, en el cual el grupo lábil es una
morfolina-3,5-diona, ftalimida,
succinimida, maleimida o indazol, y D representa un grupo
4-halofenilo, grupo 4-alquilfenilo,
grupo metilo, grupo bencilo, grupo alquilbencilo, grupo halobencilo,
grupo alilo, grupo crotilo, grupo 2-cianoetilo o un
grupo 2-(4-nitrofenil)etilo.
21. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 15 a 20, en el cual se emplea un
oligonucleótido H-fosfonato y/o un oligonucleótido
que comprende una función 3'- ó 5'-hidroxi libre y
uno cualquiera o ambos del oligonucleótido
H-fosfonato y el oligonucleótido que comprende una
función 3'- ó 5'-hidroxi libre comprenden uno o más
enlaces internucleotídicos fosforotioato.
22. Un proceso para la síntesis de un
oligonucleótido desprotegido, comprendiendo dicho proceso un proceso
de ensamblaje en el cual se ensambla un oligonucleótido protegido, y
un proceso de desprotección en el cual se produce el oligonucleótido
desprotegido, comprendiendo el proceso de ensamblaje el acoplamiento
de un nucleósido u oligonucleótido H-fosfonato
protegido con un nucleósido u oligonucleótido protegido que
comprende una función hidroxi libre en presencia de un agente de
acoplamiento para formar de este modo un H-fosfonato
-diéster, caracterizado porque el acoplamiento del nucleósido
u oligonucleótido H-fosfonato protegido con el
nucleósido u oligonucleótido protegido que comprende una función
hidroxi libre tiene lugar en presencia del agente de transferencia
de azufre.
23. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
22, en el cual el oligonucleótido desprotegido es un oligonucleótido
fosfodiéster, oligonucleótido fosforotioato o un oligonucleótido que
comprende a la vez enlaces inter-nucleotídicos
fosfodiéster y fosforotioato-diéster.
24. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
22 ó 23, en el cual el nucleósido u oligonucleótido
H-fosfonato protegido comprende un grupo 3'- ó 5'
H-fosfonato.
25. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 22 a 24, en el cual el nucleósido u
oligonucleótido protegido que comprende una función hidroxi libre
comprende una función 3'- ó 5'-hidroxi libre.
26. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 22 a 25, en el cual el oligonucleótido se
purifica posteriormente.
27. Un proceso para la preparación de un
H-fosfonato -diéster, que comprende acoplar un
H-fosfonato con un alcohol en presencia de un agente
de acoplamiento, caracterizado porque la reacción de
acoplamiento entre el H-fosfonato y el alcohol tiene
lugar en presencia del agente de transferencia de azufre.
28. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
27, en el cual el H-fosfonato es un nucleósido u
oligonucleótido protegido que comprende una función 3'
H-fosfonato y el alcohol es un nucleósido u
oligonucleótido protegido que comprende una función
5'-hidroxi libre.
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