ES2277592T3 - Metodo para estimular la eficacia de introduccion de genes en celulas vegetales. - Google Patents
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Abstract
Método para estimular la eficacia de introducción de genes dentro de tejido vegetal o células vegetales de angiospermas monocotiledóneas mediante una bacteria que pertenece al género Agrobacterium, comprendiendo el método centrifugar el tejido vegetal o células vegetales monocotiledóneas con una aceleración centrífuga de 1000 G a 150.000 G durante de 1 segundo a 4 horas, en el que: dicha introducción de genes se lleva a cabo tras centrifugar dichas células vegetales o tejido vegetal; o las células vegetales o tejido vegetal se ponen en contacto con las bacterias mientras se realiza la centrifugación
Description
Método para estimular la eficacia de
transferencia de genes en células vegetales.
La presente invención se refiere a un método
para estimular la eficacia de introducción de genes en células
vegetales.
El método de transformación usando
Agrobacterium tiene varias características excelentes,
incluyendo, en general, una alta eficacia, pequeño número de copias
del gen introducido, la característica de que el gen puede
introducirse sin fragmentar una región específica denominada
ADN-T, y la característica de que la frecuencia de
mutación producida durante el cultivo es baja debido a que los
transformantes pueden obtenerse mediante cultivo durante un corto
periodo de tiempo. Por tanto, el método se usa ampliamente como el
método más útil para transformar diversas
plantas.
plantas.
Aunque el método de Agrobacterium es un
método extremadamente excelente para transformar plantas, el que la
transformación sea satisfactoria o no y la eficacia de la
transformación varían en gran medida dependiendo de la especie
vegetal, genotipo y del tejido vegetal usado (Potrykus et al.
1998 (Referencia (33))). Es decir, hay especies con las que la
transformación no ha sido satisfactoria, y especies con las que la
transformación sólo puede alcanzarse con variedades limitadas.
Además, hay especies con las que el tejido usado está limitado de
modo que no pueden crearse una gran cantidad de materiales. Para
preparar una variedad práctica mediante recombinación genética, es
necesario preparar un gran número de plantas transformadas y
seleccionar la línea que tiene el carácter deseado de las mismas.
Sin embargo, en la actualidad, el tipo de plantas con las que puede
prepararse un gran número de plantas transformadas para este fin
está limitado. Por tanto, se solicita fuertemente desarrollar un
método mejorado mediante el que pueda superarse este problema.
Aunque el método para la transformación mediante
Agrobacterium difiere en el material de partida, composición
del medio de cultivo y similares, casi es común para el método de
Agrobacterium que el método comprenda poner en contacto un
tejido, que es un material de partida, con una suspensión de
Agrobacterium, seleccionar células transformadas tras un
cultivo conjunto, y hacer crecer las plantas transformadas. El
Agrobacterium se infecta sin realizar ningún tratamiento
especial excepto por un tratamiento de esterilización que se lleva a
cabo tal como se requiere (Rogers et al. 1988 (Referencia
(34)), Visser 1991 (Referencia (38)), McCormick 1991 (Referencia
(29)), Lindsey et al. 1991 (Referencia (28))).
El documento
EP-A-0 116 718 (Max Planck
Gesellschaft) describe la centrifugación de material de protoplasto
antes de la infección por la agrobacteria. El documento WO 96/29419
A describe la centrifugación de microesferas tras el cultivo
conjunto con agrobacteria.
Por tanto, se han llevado a cabo estudios para
mejorar el sistema de transformación principalmente en la cepa
Agrobacterium, constitución del vector, composición del
medio, tipos de promotor y gen marcador de selección, el tipo de
tejido usado como material, y similares.
Por otra parte, apenas se han realizado estudios
para cambiar el tejido vegetal antes de la infección de
Agrobacterium para dar un estado fisiológico en el que es
posible que se introduzcan los genes. Si puede cambiarse el estado
fisiológico del tejido para dar un estado fisiológico de ese tipo
mediante un tratamiento sencillo, el método es muy útil, y se espera
que, además de la estimulación de la eficacia de transformación,
puede alcanzarse la transformación para especies o genotipos con los
que la transformación ha sido difícil hasta ahora, lo que es un
efecto prominente. Estudios conocidos sobre el tratamiento previo de
tejido vegetal incluyen tratamiento con pistola de partículas
(Bidney et al., 1992 (Referencia (5))) y tratamiento por
ultrasonidos (Trick et al., 1997 (Referencia (37))). Ambos
métodos pretenden estimular la invasión de las bacterias dentro del
tejido vegetal dañando físicamente el tejido, de modo que aumente el
número de células vegetales infectadas. Sin embargo, estos métodos
no son más que desarrollos del método de disco de hoja (Horsch et
al., 1985 (Referencia (17))) y no tratamientos basados en
conceptos novedosos. El grado de eficacia y universalidad de los
métodos no se ha clarificado, y no se usan como métodos
generales.
En consecuencia, un objeto de la presente
invención es proporcionar un método para estimular la eficacia de la
introducción de genes en células vegetales, mediante el cual puede
lograrse sencillamente la introducción de genes con una eficacia
superior a la introducción de genes convencional mediante el método
de Agrobacterium, sin dañar el tejido.
Los presentes inventores estudiaron intensamente
para descubrir que en el método de introducción de genes que usa
Agrobacterium, la eficacia de la introducción de genes puede
estimularse significativamente centrifugando las células vegetales o
tejido vegetal sometido a la introducción de genes, completando así
la presente invención.
Es decir, la presente invención proporciona un
método para estimular la eficacia de la introducción de genes en
tejido vegetal o células vegetales de angiospermas monocotiledóneas
mediante una bacteria que pertenece al género Agrobacterium,
comprendiendo el método centrifugar el tejido vegetal o células
vegetales monocotiledóneas con una aceleración centrífuga de 1000 G
a 150.000 G durante de 1 segundo a 4 horas, en el que dicha
introducción de genes se lleva a cabo tras centrifugar dichas
células vegetales o tejido vegetal; o se ponen en contacto las
células vegetales o tejido vegetal con la bacteria mientras se lleva
a cabo la centrifugación.
Mediante la presente invención, se ha
proporcionado un método para estimular la eficacia de introducción
de genes en células vegetales, mediante el cual puede lograrse
sencillamente la introducción de genes con una eficacia superior que
la introducción de genes convencional por el método de
Agrobacterium, sin dañar el tejido.
La figura 1 es una figura para mostrar un método
para construir pTOK233, que es un ejemplo de vectores superbinarios,
que puede emplearse preferiblemente en la presente invención.
La figura 2 es un mapa génico de pSB133 que es
un ejemplo de vectores superbinarios, que puede emplearse
preferiblemente en la presente invención.
La figura 3 es una vista esquemática para
mostrar el sistema de vector intermedio y sistema de vector binario
que son los dos sistemas de vectores principales de bacterias que
pertenecen al género Agrobacterium.
La figura 4 es una vista esquemática que muestra
dos sistemas de vectores binarios derivados de la cepa
supervirulenta A281 de Agrobacterium tumefaciens.
En las figuras anteriores, los siguientes
símbolos de referencia representan los siguientes significados:
virB: el gen virB en la región de
virulencia del plásmido Ti pTiBo542 contenido en Agrobacterium
tumefaciens A281
virC: el gen virC en la región de
virulencia del plásmido Ti pTiBo542 contenido en Agrobacterium
tumefaciens A281
virG: el gen virG en la región de
virulencia del plásmido Ti pTiBo542 contenido en Agrobacterium
tumefaciens A281
BL: secuencia de borde izquierdo de
ADN-T de bacterias que pertenecen al género
Agrobacterium.
BR: secuencia de borde derecho de
ADN-T de bacterias que pertenecen al género
Agrobacterium.
TC: gen resistente a la tetraciclina.
SP: gen resistente a espectinomicina.
IG: gen intrón-GUS.
HPT: gen resistente a la higromicina.
K: sitio KpnI de enzima de
restricción.
H: sitio HindIII de enzima de
restricción.
Ampr: gen resistente a la ampicilina.
BAR: gen bar.
Pnos: promotor del gen de la nopalina
sintetasa.
Tnos: terminador del gen de la nopalina
sintetasa.
P35S: promotor de CaMV 35S.
COS, cos: sitio COS del fago \lambda.
ORI, ori: origen de replicación de ColE1.
NPT, NPTII: gen resistente a kanamicina.
Vir: región vir entera del plásmido Ti de
bacterias que pertenecen al género Agrobacterium.
S Vir: región vir entera del plásmido Ti
pTiBo542 de bacterias supervirulentas que pertenecen al género
Agrobacterium.
s vir*: fragmento que contiene una parte de la
región vir del plásmido Ti pTiBo542.
El método de la presente invención para
estimular la eficacia de la introducción de genes en células
vegetales mediante una bacteria que pertenece al género
Agrobacterium, comprende centrifugar las células vegetales o
tejido vegetal. Las células vegetales o tejido vegetal pueden
ponerse en contacto con bacterias que pertenecen al género
Agrobacterium con gravedad normal tras centrifugar el tejido
o células vegetales, o el tejido o células vegetales pueden ponerse
en contacto con bacterias que pertenecen al género
Agrobacterium mientras se centrifuga el tejido o células
vegetales.
Las condiciones para la centrifugación son de
1000 G a 150.000 G. El tiempo para la centrifugación puede
seleccionarse apropiadamente dependiendo de la aceleración
centrífuga, tipo de planta usado, etc., y no es inferior a un
segundo. Cuando la aceleración centrífuga es grande, la eficacia de
introducir genes puede estimularse significativamente incluso si el
tiempo de centrifugación es muy corto, por ejemplo, de 1 segundo.
Por otra parte cuando la aceleración centrífuga es pequeña, la
eficacia de introducir genes puede estimularse significativamente
realizando la centrifugación durante mucho tiempo. Las condiciones
de centrifugación apropiadas para el tejido o células vegetales
particulares pueden seleccionarse fácilmente mediante un experimento
rutinario.
El método de la presente invención se
caracteriza por usar tejido vegetal o células vegetales que se
centrifugó (centrifugaron), o por poner en contacto las células
vegetales o tejido vegetal con bacterias que pertenecen al género
Agrobacterium mientras se realiza la centrifugación, y como
método para la introducción de genes o transformación en sí usando
las bacterias que pertenecen al género Agrobacterium, puede
aplicarse un método bien conocido en sí mismo.
El método para la introducción de genes o
transformación en sí en plantas usando bacterias que pertenecen al
género Agrobacterium se conoce bien en la técnica y se usa
ampliamente.
Desde hace mucho tiempo se sabe que una bacteria
Agrobacterium del suelo (Agrobacterium tumefaciens)
provoca la enfermedad del tumor de cuello en varias dicotiledóneas.
En los años 1970, se descubrió que el plásmido Ti concierne a la
virulencia, y que el ADN-T que es una parte del
plásmido Ti, se incorpora dentro del genoma de la planta. Después de
eso, se probó que el ADN-T contiene genes que
participan en la síntesis de hormonas (citocininas y auxinas)
requeridas para la inducción del tumor, y que los genes se expresan
en plantas a pesar del hecho de que los genes son genes bacterianos.
Se requiere un grupo de genes que existen en la región de
virulencia (región vir) en el plásmido Ti para la escisión de
ADN-T y su transferencia en plantas, y las
secuencias de borde existentes en ambos extremos del
ADN-T son necesarias para escindir el
ADN-T. Agrobacterium rhizogenes, que es otra
bacteria que pertenece al género Agrobacterium tiene un
sistema similar en el plásmido Ri (figuras 3 y 4).
Dado que se incorpora ADN-T
dentro del genoma de la planta mediante infección de
Agrobacterium, se esperó que pudiera incorporarse un gen
deseado dentro del genoma de la planta insertando el gen deseado en
el ADN-T. Sin embargo, dado que el plásmido Ti es de
no menos de 190 kb, fue difícil insertar un gen dentro del
ADN-T mediante una técnica habitual de ingeniería
genética. Por tanto, se desarrolló un método para introducir un gen
extraño dentro del ADN-T.
En primer lugar, se prepararon cepas desarmadas
tales como LBA4404 (Hoekema et al., 1983 (Referencia (12))),
C58C1(pGV3850) (Zambryski et al., 1983 (Referencia
(40))), y GV3Ti11SE (Fraley et al., 1985 (Referencia (9))),
que tienen plásmidos Ti tumorigénicos de los que se eliminaron los
genes de la hormona sintetasa (figura 3). Se desarrollaron dos
métodos empleando una cepa de ese tipo, es decir, un método mediante
el cual se introduce un gen deseado dentro del plásmido Ti de
Agrobacterium, y un método mediante el cual se introduce un
ADN-T que tiene un gen deseado dentro de
Agrobacterium. Uno de esos métodos es el denominado método
del vector intermedio (Fraley et al., 1985 (Referencia (9));
Fraley et al., 1983 (Referencia (10)); Zambryski et
al., 1983 (Referencia (40)), solicitud de patente japonesa
abierta a consulta por el público (Kokai) número
59-140885 (documento EP116718)). En este método, se
introduce un vector intermedio, que es fácil de manejar mediante
técnicas de manipulación genética, en el que puede insertarse un gen
deseado, y que puede duplicarse en E. coli, dentro del
ADN-T en el plásmido Ti de tipo desarmado de
Agrobacterium mediante conjugación triparental (Ditta et
al., 1980 (Referencia (8))). Otro método es el denominado método
del vector binario (figura 3), que se basa en el hecho de que aunque
la región vir es necesaria para incorporar el
ADN-T dentro de las plantas, no es necesario que el
ADN-T y la región vir existan en el mismo
plásmido ((Hoekema et al., 1983). La región vir
contiene virA, virB, virC, virD,
virE y virG (Plant Biotechnology Encyclopedia
(Enterprise Co., Ltd. (1989)), y la región vir se define
como aquélla que contiene todas las virA, virB,
virC, virD, virE y virG. Por tanto, el
vector binario es un plásmido pequeño que puede duplicarse tanto en
Agrobacterium como en E. coli, y este plásmido se
introduce en Agrobacterium teniendo un plásmido Ti de tipo
desarmado. La introducción del vector binario dentro de
Agrobacterium puede llevarse a cabo mediante un método de
electroporación, conjugación triparental o similar). El vector
binario incluye pBIN19 (Bevan, 1984 (Referencia (4))), pBI121
(Jefferson, 1987 (Referencia (19))), pGA482 (An et al., 1988
(Referencia (2)), solicitud de patente japonesa abierta a consulta
por el público (Kokai) número 60-70080 (documento EP
120516)), y se han construido varios vectores binarios nuevos
basándose en esos vectores. En el sistema de plásmido Ri, se han
construido vectores similares y se usan para la transformación.
Agrobacterium A281 (Watson et al.,
1975 (Referencia (39))) es una cepa supervirulenta, cuyo espectro de
huéspedes es amplio y cuya eficacia de transformación es superior a
la de otras cepas (Hood et al., 1987 (Referencia (13));
Komari, 1989 (Referencia (21))). Esta característica la provoca un
plásmido Ti pTiBo542 contenido en A281 (Hood et al., 1984
(Referencia (16)); Jin et al., 1987 (Referencia (20)); Komari
et al., 1986 (Referencia (24))).
Se han desarrollado dos sistemas nuevos usando
pTiBo542. Un sistema utiliza cepas EHA101 (Hood et al., 1986)
y EHA105 (Hood et al., 1993) que contienen un plásmido Ti que
es un tipo desarmado de pTiBo542. Aplicando estas cepas al sistema
de vectores binarios anteriormente mencionado, se logró un sistema
que tiene una alta eficacia de transformación, que se usa
ampliamente para la transformación de diversas plantas. Otro sistema
es el sistema de vector "superbinario" (Hiei et al.,
1994 (Referencia (11)); Ishida et al., 1996 (Referencia
(18)); Komari et al., 1999 (Referencia (26)), documento
WO94/00977, documento WO95/06722) (figura 4). Dado que este sistema
comprende un plásmido Ti de tipo desarmado que tiene la región
vir (virA, virB, virC, virD,
virE y virG) (cada una de ellas también puede
denominarse a continuación en el presente documento como "región
de fragmento vir") y un plásmido que tiene
ADN-T, esta es una clase de sistema de vector
binario. Sin embargo, es diferente del vector binario porque el
vector superbinario (Komari, 1990a (Referencia (22))) en el que un
fragmento de región vir (preferiblemente un fragmento que
contiene al menos virB o virG, más preferiblemente un
fragmento que contiene al menos virB y virG) que
carece sustancialmente de al menos uno de los fragmentos de región
vir se incorpora dentro del plásmido que tiene el
ADN-T, es decir, el vector binario. Para introducir
una región de ADN-T dentro de la que se ha insertado
un gen deseado dentro de una Agrobacterium que tiene un
vector superbinario, puede emplearse la recombinación homóloga
mediante el método de conjugación triparental como un método fácil
(Komari et al., 1996 (Referencia (25))). Se ha probado que el
vector superbinario proporciona una eficacia de transformación muy
superior a los diversos sistemas de vectores anteriormente descritos
para varias especies vegetales (Hiei et al., 1994 (Referencia
(11)); Ishida et al., 1996 (Referencia (18)); Komari, 1990b
(Referencia (23)); Li et al., 1996 (Referencia (27)); Saito
et al., 1992 (Referencia (35))).
En el método de la presente invención, no se
restringe la bacteria huésped que pertenece al género
Agrobacterium, y puede emplearse preferiblemente
Agrobacterium tumefaciens (por ejemplo, las Agrobacterium
tumefaciens anteriormente descritas LBA4404 (Hoekema et
al., 1983 (Referencia (12))) y EHA101 (Hood et al., 1986
(Referencia (15))).
El método de la presente invención puede
aplicarse a cualquiera de los sistemas de introducción de genes
siempre que se base en la expresión del grupo de genes en la región
vir en las bacterias que pertenecen al género
Agrobacterium de modo que se obtenga un efecto significativo.
Por tanto, el método de la presente invención puede aplicarse a
cualquiera de los sistemas de vectores tales como los vectores
intermedios, vectores binarios, vectores binarios supervirulentos y
vectores superbinarios anteriormente descritos de modo que se
obtiene el efecto ventajoso de la presente invención. El método de
la presente invención también puede aplicarse a los sistemas de
vectores obtenidos mediante modificación de estos vectores (por
ejemplo, aquéllos en los que toda o una parte de la región
vir de una bacteria que pertenece al género
Agrobacterium se escinde y adicionalmente se incorpora dentro
del plásmido, o toda o una parte de la región vir de una
bacteria que pertenece al género Agrobacterium se escinde y
se introduce a la Agrobacterium como parte de un nuevo
plásmido). Además, no es necesario decir que mediante el método de
la presente invención, se estimula la eficacia de la introducción de
la región de ADN-T de Agrobacterium de tipo
natural de manera que se estimula la eficacia de la infección.
El gen deseado que va a introducirse dentro de
la planta puede insertarse dentro de un sitio de restricción en la
región de ADN-T del plásmido anteriormente descrito
mediante un método convencional, y el Agrobacterium dentro
del que se incorporó el gen deseado puede seleccionarse basándose en
un marcador de selección apropiado tal como un gen resistente al
fármaco frente a un fármaco tal como kanamicina o paromomicina. En
casos en los que el plásmido es grande y tiene varios sitios de
restricción, no siempre es fácil insertar el ADN deseado dentro de
la región de ADN-T mediante un método de
subclonación ordinario. En un caso de este tipo, puede insertarse el
ADN deseado mediante el método de conjugación triparental utilizando
la recombinación homóloga en la célula de la bacteria que pertenece
al género Agrobacterium.
La Introducción del plásmido dentro de una
bacteria que pertenece al género Agrobacterium tal como
Agrobacterium tumefaciens puede llevarse a cabo mediante un
método conocido, incluyendo el método de conjugación triparental
anteriormente mencionado, método de electroporación, método de
electroinyección y tratamientos químicos con PEG o similares.
El gen que debe introducirse dentro de la
planta, en principio, está dispuesto entre las secuencias de borde
izquierda y derecha del ADN-T tal como en el método
convencional. Sin embargo, dado que el plásmido es anular, el
plásmido sólo puede contener una secuencia de borde.
Alternativamente, en casos en los que deben disponerse una
pluralidad de genes en diferentes sitios, el plásmido puede contener
tres o más secuencias de borde. Alternativamente, la disposición del
plásmido deseado en el plásmido Ti o Ri puede realizarse en la
célula de la bacteria que pertenece al género Agrobacterium,
o el gen deseado puede disponerse en otro plásmido. Además, el gen
deseado puede disponerse en una pluralidad de tipos de
plásmidos.
La introducción de un gene dentro de células
vegetales mediante una bacteria que pertenece al género
Agrobacterium puede lograrse poniendo sencillamente en
contacto las células vegetales o tejido vegetal con las bacterias
que pertenecen al género Agrobacterium. Por ejemplo, se
prepara una suspensión celular de las bacterias que pertenecen al
género Agrobacterium que tiene una densidad de población de
aproximadamente 10^{6} a 10^{11} células/ml, y se
sumerge(n)
las células vegetales o el tejido vegetal en la suspensión durante aproximadamente de 3 a 10 minutos, seguido de un cultivo conjunto de lo resultante sobre un medio sólido durante varios días, logrando así la introducción del gen.
las células vegetales o el tejido vegetal en la suspensión durante aproximadamente de 3 a 10 minutos, seguido de un cultivo conjunto de lo resultante sobre un medio sólido durante varios días, logrando así la introducción del gen.
El tejido o las células que va(n) a
someterse a la introducción de genes no está(n)
restringido(as) de ninguna manera y puede ser una hoja, raíz,
tallo, fruto o cualquier otra parte de la planta. Además, puede
emplearse tejido desdiferenciado tal como callo o un tejido no
desdiferenciado tal como un embrión.
Tal como se mostrará concretamente en los
siguientes ejemplos, mediante el método de la presente invención, se
estimula significativamente la eficacia de introducción de genes
cuando se compara con el método de Agrobacterium
convencional.
La presente invención se describirá ahora a modo
de ejemplos de la misma. Debe observarse que la presente invención
no se restringe a los siguientes ejemplos.
Como Agrobacterium y sus vectores, se
usaron LBA4404(pBI121) (pBI121 está comercialmente disponible
de CLONETECH, EE.UU. (Jefferson RA 1987 (Referencia (19))),
LBA4404(pIG121Hm) (Hiei, Y. et al., 1994 (Referencia
(11)), LBA4404(pTOK233) (Hiei et al., 1994 (Referencia
(11))) y LBA4404(pSB133) (figura 2).
Se llevó a cabo la construcción de pSB 133 tal
como sigue: se ligó un fragmento de ADN que tenía un tamaño de 6,2
kb obtenido mediante digestión de pGA482 (An G et al., 1985
(Referencia (3))) con una enzima de restricción Sal I a un
fragmento de ADN con un tamaño de 5,1 kpb obtenido mediante
digestión de pSB11 (Komari et al., 1996 (Referencia (25)) con
Sal I para preparar un plásmido. Entonces se digirió este
plásmido con enzimas de restricción Eco RI y Bgl II
para obtener un fragmento de ADN con un tamaño de 8,6 kb. Se hizo
romo este fragmento de ADN y se insertó un ligador Bgl II
(comercialmente disponible de TaKaRa) en el mismo para obtener un
plásmido pSB27. Se digirió el pSB27 con una enzima de restricción
Hind III, y se insertó un fragmento de ADN con un tamaño de
3,1 kb que contenía el promotor 35S y un gen intrón GUS, fragmento
que se obtuvo digiriendo pIG221 (Ohta S et al., 1990
(Referencia (32)), en el mismo para obtener pSB33. Se introdujo el
pSB33 dentro de E. coli LE392, y luego se introdujo en
Agrobacterium LBA4404 que contenía pSB1 (Komari et
al., 1996 (Referencia (25))) mediante el método de conjugación
triparental (Ditta G et al., 1980 (Referencia (8)). Se obtuvo
el pSB133 mediante recombinación homóloga entre pSB1 y pSB33 en la
célula de Agrobacterium. La región de ADN-T
del pBI121 contiene un gen resistente a la kanamicina (nptII)
controlado por el promotor del gen de nopalina sintetasa (nos) y un
gen GUS controlado por el promotor 35S del virus del mosaico de la
coliflor (CaMV). Cada una de las regiones de ADN-T
de pIG121Hm y pTOK233 contiene un gen nptII controlado por un
promotor nos, un gen hpt controlado por un promotor 35S, y un gen
GUS controlado por el promotor 35S, gen GUS que contiene intrones
del gen de la catalasa de la semilla de ricino. La región de
ADN-T de pSB133 contiene un gen nptII controlado por
un promotor nos y un gen GUS controlado por un promotor 35S de CaMV,
gen GUS que contiene intrones del gen de la catalasa de la semilla
de ricino (figura 2). Los plásmidos pSB133 y pTOK233 son vectores
superbinarios que tienen altas capacidades de transformación
(Komari, T. et al., 1999 (Referencia (26))).
Como las variedades de muestras, se usaron
Koshihikari y Tsukinohikari, que son variedades de arroz Japonica.
Se retiraron las glumas de semillas inmaduras a de 8 a 14 días tras
la floración y se esterilizaron las semillas con etanol al 70%
durante varios segundos y con disolución acuosa de hipoclorito de
sodio al 1% que contenía Tween 20 durante 15 minutos. Tras lavar las
semillas varias veces con agua esterilizada, se escindieron los
embriones inmaduros con longitudes de 1,5 a 2 mm y se usaron como
tejido de muestra.
Se colocaron los embriones inmaduros de arroz en
tubos que contenían agua esterilizada y con una aceleración de 760 G
a 150.000 G usando una microcentrífuga de alta velocidad, una
centrífuga de alta velocidad grande o ultracentrífuga de alta
velocidad. Tras la centrifugación, se infectaron los embriones
inmaduros con Agrobacterium.
El método para infección de los embriones
inmaduros y el método para cultivar conjuntamente fueron de acuerdo
con los métodos de Hiei et al. (1994) (Referencia (11)). Es
decir, tras la centrifugación, se eliminó el agua esterilizada en
cada tubo y se añadió la suspensión de Agrobacterium, seguido
de agitar la mezcla con una mezcladora de torbellino durante de 5 a
30 segundos.
Las suspensiones de bacterias se prepararon
recogiendo colonias de Agrobacterium cultivadas sobre medio
AB (Chilton, M-D et al., 1974 (Referencia
(6))) con un bucle de platino y suspendiendo las bacterias recogidas
en medio AA modificado (sales inorgánicas principales AA,
aminoácidos AA y vitaminas AA (Toriyama K. et al., 1985
(Referencia (36)), sales secundarias MS (Murashige, T et al.,
1962 (Referencia (30)), casaminoácido 1,0 g/l, acetosiringona 100
\muM, sacarosa 0,2 M, glucosa 0,2 M). Tras dejar reposar la mezcla
de embriones inmaduros y la suspensión de Agrobacterium a
temperatura ambiente durante aproximadamente 5 minutos, se sembraron
en placas los embriones inmaduros sobre un medio para cultivar
conjuntamente. Tal como el medio para cultivar conjuntamente, se usó
medio 2N6-AS (Hiei et al. 1994 (Referencia
(11))) excepto porque se cambiaron las sales inorgánicas del mismo a
la composición de medio R2 (Ohira et al. 1973 (Referencia
(31)). Sin embargo, debe observarse que las sales inorgánicas
principales (KNO_{3}, KH_{2}PO_{4}, CaCl_{2}2H_{2}O,
MgSO_{4}7H_{2}O) se añadieron al medio a la mitad de las
concentraciones. Se ajustó la densidad de las células bacterianas
que van a infectarse hasta de 1 x 10^{8} a 1 x 10^{9} ufc/ml. Se
llevó a cabo el cultivo conjunto durante de 3 a 13 días, y se trató
una parte del embrión inmaduro con X-Gluc para
comprobar la expresión del gen GUS (Hiei et al. 1994)
(Referencia (11)). Es decir, inmediatamente tras el cultivo
conjunto, se sumergió el tejido en tampón fosfato 0,1 M (pH 6,8)
que contenía Triton X-100 al 0,1%, y se dejó
reposar a 37ºC durante 1 hora. Tras eliminar el Agrobacterium
con tampón fosfato, se añadió tampón fosfato que contenía ácido
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-glucurónico
(X-gluc) 1,0 mM y metanol al 20%. Tras incubar el
resultante a 37ºC durante 24 horas, se observaron tejidos teñidos
de azul bajo el microscopio.
Tras el cultivo conjunto, se transfirieron los
callos y embriones inmaduros a un medio de selección primaria que
contenía carbenicilina 250 mg/l y cefotaxima 250 mg/l, y que
contenía además paromomicina 200 mg/l o higromicina de 10 a 30 mg/l,
y se cultivaron a 30ºC en condiciones luminosas durante de 1 a 2
semanas. Como medio de selección primaria, se usó medio 2N6K
descrito en Hiei et al. (1994) (Referencia (11)) completado
con D-sorbitol hasta 30 g/l (medio K). Además,
también se usó en la prueba un medio (medio N) que era el mismo que
el medio 2N6 (sales inorgánicas y vitaminas de N6 (Chu C. C. 1978
(Referencia (7))), casaminoácido 1 g/l, 2,4-D 2
mg/l) excepto porque la concentración de
(NH_{4})_{2}SO_{4} se cambió a 232 mg/l y porque se
complementaron los aminoácidos del medio AA (Toriyama et al.,
1985 (Referencia (36)).
Se transfirieron los callos formados en el medio
de selección primaria a un medio de selección secundaria que
contenía cefotaxima 250 mg/l y carbenicilina 250 mg/l, y que
contenía además paromomicina 200 mg/l o higromicina 80 mg/l, y se
cultivaron a 30ºC en condiciones luminosas durante de 1 a 2 semanas.
Como medio de selección secundaria, se usó un medio que era el mismo
que el medio N6-7 descrito en Hiei et al.
(1994) (Referencia (11)) excepto porque la concentración de
(NH_{4})_{2}SO_{4} se cambió a 232 mg/l y que se
complementaron los aminoácidos del medio AA (Toriyama et
al., 1985 (Referencia (36)). A los medios de selección primaria
y secundaria que contenían paromomicina, se les añadió agarosa hasta
8 g/l como solidificante. Se investigó la tasa de callos resistentes
emergentes tras la selección secundaria.
Los callos resistentes a los fármacos de
selección, obtenidos de los escutelos de embriones inmaduros, se
sembraron en placas en medio N6S3 (Hiei et al. 1994
(Referencia (11)) para la regeneración que contenía carbenicilina
250 mg/l y cefotaxima 250 mg/l, y que contenía además paromomicina
100 mg/l o higromicina 50 mg/l.
Las hojas de las plantas regeneradas resistentes
a los fármacos, obtenidas mediante cultivo par regeneración a 25ºC
en condiciones luminosas durante de 4 a 5 semanas, se comprobaron
para determinar la expresión del gen GUS tratándolas con
X-Gluc de la misma manera tal como se mencionó
anteriormente (Hiei et al. 1994 (Referencia (11)). Se
transplantaron las plantas regeneradas a una disolución de Hyponex
acuosa diluida 500 veces y se cultivaron a 25ºC en condiciones
luminosas durante aproximadamente 2 semanas, seguido de transplante
a macetas en un
invernadero.
invernadero.
Usando una microcentrífuga de alta velocidad,
una centrífuga de alta velocidad grande y una ultracentrífuga de
alta velocidad, se sometió a prueba el efecto del tratamiento por
centrifugación de embriones inmaduros de arroz. Como resultado, se
estimuló la eficacia de la introducción de genes cuando la
aceleración estaba dentro del intervalo de 10 KG a 100 KG (tablas 1,
2, 3 y 6). En cuanto al tiempo de tratamiento, se observó claramente
un efecto ventajoso con el tratamiento durante 10 minutos (tablas 4
y 5). La frecuencia de la expresión transitoria de GUS no fue
diferente entre las variedades, es decir, entre Koshihikari y
Tsukinohikari. Ya que no sólo se observó el efecto de estimular la
eficacia de la introducción de genes, sino también el efecto de
inducir la formación de callos, se sugirió que el tratamiento por
centrifugación es eficaz para la inducción y crecimiento de callos y
en el cultivo de plantas que incluyen otras
especies.
especies.
Tal como se muestra en la tabla 6, no se observó
para nada la inducción de callos desde los embriones inmaduros de
Tsukinohikari cuando se llevó a cabo la centrifugación a 250 KG
durante 60 minutos usando la ultracentrífuga de alta velocidad. Sin
embargo, se observó la inducción de callos cuando se llevó a cabo la
centrifugación a 110 KG durante 60 minutos, y también se observó la
expresión de GUS con una tasa alta. De manera similar, tal como para
Koshihikari, no se observó para nada la inducción de callos desde
los embriones inmaduros de Tsukinohikari cuando se llevó a cabo la
centrifugación a 250 KG durante 60 minutos usando la ultracentrífuga
de alta velocidad. A partir de estos resultados, se cree que se
obtiene el efecto ventajoso mediante centrifugación para embriones
inmaduros de arroz con una aceleración de entre 5 KG y 200 KG. Por
tanto, en vista de la simplicidad del tratamiento, cuando se usa una
microcentrífuga de alta velocidad o una centrífuga de alta velocidad
grande, se cree que el tratamiento a 20 KG o 40 KG es apropiado.
Además, tal como se muestra en las tablas 9, 10 y 11, se probó que
mediante el tratamiento por centrifugación a 20 KG durante 60
minutos, puede lograrse la transformación usando embriones inmaduros
no sólo para LBA4404(pSB 133) que tiene un vector
superbinario que se sabe que tiene una alta capacidad de
transformación, sino también para LBA4404 (pIG121Hm) que contiene un
vector binario
ordinario.
ordinario.
Tal como se muestra en las tablas 7 y 8, la
eficacia de la expresión de GUS observada en el ensayo transitorio
fue superior cuando la duración del cultivo conjunto fue de 6 ó 13
días que cuando la duración del cultivo conjunto fue de 3 días. En
otro experimento, se observó una alta expresión de GUS cuando la
duración del cultivo conjunto fue de 9 días. Ahora se cultivan
diversos embriones inmaduros, que se sometieron a diferentes
duraciones de cultivo conjunto, en un medio de selección primaria
(higromicina 10 ppm, paromomicina 200 ppm), y hay una tendencia de
que la tasa de aparición de callos resistentes al fármaco sea menor
en el grupo cultivado conjuntamente durante 9 ó 13 días que en el
grupo cultivado conjuntamente durante 3 ó 6 días.
En la actualidad, se aclimatan los
transformantes positivos para GUS (tablas 4 y 5) preparados tal como
se describió anteriormente, y se continúa el cultivo. Para algunas
líneas, se recogieron semillas y se comprobó la fertilidad. Como
resultado, no se observaron diferencias entre la morfología y la
fertilidad entre los transformantes centrifugados y los
transformantes no tratados (Koshihikari y Tsukinohikari).
Hiei et al. (1994 (Referencia (11)))
notificó que puede lograrse la transformación con una eficacia
relativamente alta usando callos de arroz. Aldemita RR et al.
1996 (Referencia (1))) notificó un caso de transformación usando
embriones inmaduros de arroz. Para llevar a cabo estos métodos de
transformación de un modo más eficaz y estable, el método de
tratamiento por centrifugación descrito anteriormente es muy eficaz.
Especialmente, aunque es posible que la calidad del embrión inmaduro
varíe dependiendo del entorno de cultivo de modo que no es fácil
obtener siempre embriones inmaduros adecuados para la
transformación, puede ser posible mantener una alta eficacia de
transformación sometiendo a los embriones inmaduros al tratamiento
por centrifugación. Hiei et al. (1994)(Referencia (11))
mostró que un vector superbinario que tiene una alta capacidad de
transformación estimula la eficacia de transformación del arroz.
Según Aldemita RR et al. 1996 (Referencia (1))), se
obtuvieron transformantes sólo en la prueba que usaba
LBA4404(pTOK233) que contenía un vector superbinario.
Mediante el método de tratamiento por centrifugación según la
presente invención, incluso cuando se usa un vector binario
ordinario, se logra una alta eficacia de transformación, que es
comparable a, o incluso superior a, la obtenida en la transformación
usando un vector superbinario. Además, empleando el método tanto de
vector superbinario como de tratamiento por centrifugación, puede
estimularse aún más la eficacia. Además, se espera que puedan
obtenerse transformantes empleando el método de tratamiento por
centrifugación para las variedades con las que no se ha obtenido un
transformante hasta
ahora.
ahora.
Tiempo de tratamiento por centrifugación: 10
minutos; Duración del cultivo conjunto: de 3 a 5 días; Número de
embriones inmaduros positivos para GUS / Número de embriones
inmaduros de muestra.
Los símbolos entre paréntesis indican la zona de
la región en escutelos en la que se expresó GUS. -: ninguna;
+: pequeña; ++: media; +++: grande.
+: pequeña; ++: media; +++: grande.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Número de embriones inmaduros de los que se
derivaron callos resistentes / Número de embriones inmaduros de
muestra, comprobados tras la finalización de la selección
secundaria.
Tiempo de tratamiento por centrifugación: 10
minutos; Duración del cultivo conjunto: de 3 a 5 días.
Número de embriones inmaduros de los que se
derivan callos resistentes / Número de embriones inmaduros de
muestra, comprobados tras la finalización de la selección
secundaria.
Tiempo de tratamiento por centrifugación: 10
minutos; Duración del cultivo conjunto: de 3 a 5 días.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Aceleración centrífuga: 20.000 G; Variedad de
muestra: Koshihikari; Número de embriones inmaduros positivos para
GUS / Número de embriones inmaduros de muestra. Zona de la región en
escutelos en la que se expresó GUS.
+: pequeña; ++: media; +++: grande.
+: pequeña; ++: media; +++: grande.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Aceleración centrífuga: 20.000 G; Duración del
cultivo conjunto: de 3 a 5 días, comprobados tras la finalización de
la selección secundaria.
Número de embriones inmaduros de los que se
derivan callos resistentes / Número de embriones inmaduros de
muestra.
Cepa de muestra: LBA4404/pIG121Hm; Tiempo de
tratamiento por centrifugación: 60 minutos.
1) microcentrífuga de alta velocidad; 2)
centrífuga de alta velocidad grande; 3) ultracentrífuga de alta
velocidad.
Tasa de zona con GUS expresado en escutelo: -:
ninguna; \pm:<1/8; +: 1/8-1/4; ++: >1/4.
\vskip1.000000\baselineskip
Cepa de muestra: LBA4404/pIG121Hm; 1)
microcentrífuga de alta velocidad; 2) centrífuga de alta velocidad
grande; la centrifugación se llevó a cabo durante 60 minutos a las
revoluciones indicadas.
Tasa de zona con GUS expresado en escutelo: -:
ninguna; \pm:<1/8; +: 1/8-1/4; ++: >1/4.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Cepa de muestra: LBA4404/pIG121Hm; 1)
microcentrífuga de alta velocidad; 2) centrífuga de alta velocidad
grande; la centrifugación se llevó a cabo durante 60 minutos a las
revoluciones indicadas.
Tasa de zona con GUS expresado en escutelo: -:
ninguna; \pm:<1/8; +: 1/8-1/4; ++: >1/4.
Tratamiento por centrifugación: 20 KG – 60
minutos; Duración del cultivo conjunto: 5 días.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Tratamiento por centrifugación: 20 KG – 60
minutos; Duración del cultivo conjunto: 5 días.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Tratamiento por centrifugación: 20 KG – 60
minutos; Duración del cultivo conjunto: 5 días.
Tratamiento por centrifugación: 20 KG – 60
minutos; Duración del cultivo conjunto: 3 días.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recogieron asépticamente embriones inmaduros
de maíz con un tamaño de aproximadamente 1,2 mm (variedad: A 188,
obtenidos del National Institute of Agrobiological Resources, The
Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries ("Instituto
Nacional de Recursos Agrobiológicos, Ministerio de Agricultura,
Bosques y Pesca") y se lavaron una vez con medio líquido
LS-inf. A un tubo de centrifugación que contenía el
embrión inmaduro y 2,0 ml de medio LS-inf que
contenía acetosiringona 100 \muM, se añadió una suspensión de
Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pSB 131) (Ishida et
al. 1996 (Referencia (18))) hasta una densidad de población de
aproximadamente 1 x 10^{9} ufc/ml, y se centrifugó la mezcla
resultante a 40.000 G, a 4ºC durante 30 minutos. Se dejó reposar el
embrión de control en la misma suspensión celular a temperatura
ambiente durante 30 minutos. Tras el tratamiento, se agitó
suavemente la mezcla y se sembró en placas sobre medio
LS-AS de tal manera que la superficie de hipocótilo
está en contacto con el medio. Por otra parte, se llevó a cabo la
infección de embriones inmaduros tras el tratamiento por
centrifugación tal como sigue: Se lavaron los embriones
asépticamente recogidos una vez con medio líquido
LS-inf y se transfirieron a tubos de centrifugación
que contenían el mismo medio, seguido por un tratamiento por
centrifugación a 20 KG o 40 KG a 4ºC durante 1 hora. Se dejó reposar
la muestra de control en el medio líquido a temperatura ambiente
durante 1 hora. Tras el tratamiento, se eliminó el medio líquido, y
se añadió una suspensión de LBA4404 (pSB 131) con una densidad de
población de aproximadamente 1 x 10^{9} ufc/ml, seguido por una
agitación suave de la mezcla. Tras dejar reposar la mezcla a
temperatura ambiente durante 5 minutos, se sembraron en placas los
embriones sobre medio LS-AS que contenía AgNO_{3}
10 \muM de tal manera que la superficie de cada hipocótilo estaba
en contacto con el medio. Tras cultivar conjuntamente en la
oscuridad a 25ºC durante 3 días, se tomó una muestra de una alícuota
de los embriones inmaduros y se comprobó la expresión transitoria
del gen GUS mediante el tratamiento con X-gluc tal
como en el ejemplo 1. El método y medio anteriormente descrito para
cultivar fueron según Ishida, Y. et al. 1996 (Referencia
(18)).
La expresión transitoria del gen GUS en los
embriones inmaduros A188 infectados con LBA4404 (pSB 131) se muestra
en la tabla 13. Aunque todos los embriones mostraron expresión del
gen GUS, varios de los embriones inmaduros sometidos al tratamiento
por centrifugación mostraron expresión en una zona mayor que los
embriones inmaduros de control. Se observó el aumento en los sitios
de introducción de genes mediante tratamiento por centrifugación
tanto en los casos en los que se realizó el tratamiento por
centrifugación junto con Agrobacterium como en los que se
infectó Agrobacterium tras el tratamiento por centrifugación.
Además, se observó la expresión del gen GUS en una zona mayor que
en el control incluso si se cambiaban la intensidad de
centrifugación y el tiempo de
tratamiento.
tratamiento.
Mediante estos resultados, se sugirió la
posibilidad de que cultivando los embriones inmaduros tras el
tratamiento por centrifugación sobre un medio de selección, se
obtienen plantas transformadas con una eficacia superior que el
control. Además, se sugirió la posibilidad de que las variedades de
maíz (Ishida et al. 1996 (Referencia (18))) distintas de
A188, que hasta ahora no podían transformarse mediante el método de
Agrobacterium convencional, puedan transformarse mediante el
tratamiento por centrifugación.
El control se trató con 1 G.
En la prueba 1, se realizó el tratamiento por
centrifugación en presencia de Agrobacterium.
En la prueba 2, se infectó Agrobacterium
tras el tratamiento por centrifugación.
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (6)
1. Método para estimular la eficacia de
introducción de genes dentro de tejido vegetal o células vegetales
de angiospermas monocotiledóneas mediante una bacteria que pertenece
al género Agrobacterium, comprendiendo el método centrifugar
el tejido vegetal o células vegetales monocotiledóneas con una
aceleración centrífuga de 1000 G a 150.000 G durante de 1 segundo a
4 horas, en el que:
dicha introducción de genes se lleva a cabo tras
centrifugar dichas células vegetales o tejido vegetal; o
las células vegetales o tejido vegetal se ponen
en contacto con las bacterias mientras se realiza la
centrifugación.
2. Método para preparar una planta,
caracterizado porque usa el método según la reivindicación
1.
3. Método según la reivindicación 1, en el que
dichas células vegetales o tejido vegetal provienen de una planta
que pertenece a la familia Gramineae.
4. Método para preparar una planta que pertenece
a la familia Gramineae, caracterizado porque usa el
método según la reivindicación 1.
5. Método según la reivindicación 3, en el que
dichas células vegetales o tejido vegetal son de arroz o maíz.
6. Método para preparar arroz o maíz,
caracterizado porque usa el método según la reivindicación
5.
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