HUP0300548A2 - Poliol-ifn-béta konjugátumok - Google Patents

Poliol-ifn-béta konjugátumok Download PDF

Info

Publication number
HUP0300548A2
HUP0300548A2 HU0300548A HUP0300548A HUP0300548A2 HU P0300548 A2 HUP0300548 A2 HU P0300548A2 HU 0300548 A HU0300548 A HU 0300548A HU P0300548 A HUP0300548 A HU P0300548A HU P0300548 A2 HUP0300548 A2 HU P0300548A2
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
peg
residue
polyol
ifn
interferon
Prior art date
Application number
HU0300548A
Other languages
English (en)
Inventor
Nabil El Tayar
Milton Harris
Michael J. Roberts
Wayne Sawlivich
Original Assignee
Applied Research Systems Ars Holding N.V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Applied Research Systems Ars Holding N.V. filed Critical Applied Research Systems Ars Holding N.V.
Publication of HUP0300548A2 publication Critical patent/HUP0300548A2/hu
Publication of HUP0300548A3 publication Critical patent/HUP0300548A3/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

A találmány poliol-interferon-b konjugátumokra vonatkozik, amelyekbenegy poliolmaradék kovalensen kapcsolódik a humán interferon-b Cys17-hez. A fenti poliol-interferon-b konjugátumot úgy állítják elő, hogyaz interferon-b-tiol-reaktív poliollal reagáltatva egy poliol-maradékot kötnek helyspecifikusan és kovalensen a humán interferon-bCys17-hez, majd a kapott konjugátumot kinyerik. A fenti eljárástpolietilénglikol (PEG) maradékok kapcsolása esetén úgy végzik, hogy apolipeptidet először egy kis móltömegű heterobifunkciós vagyhomobifunkciós PEG-maradékkal reagáltatják, majd a polipeptidhezkötött kis móltömegű PEG-maradékot egy monofunkciós vagy bifunkciósPEG-maradékkal reagáltatva ez utóbbi monofunkciós vagy bifunkciós PEG-maradékot a kis móltömegű PEG-maradék szabad végéhez kötve alakítjákki a PEG-polipeptid konjugátumot. A PEG-polipeptid konjugátumokgyógyszerként alkalmazhatók. Ó

Description

KÖZZÉTÉTELI
PÉLDÁNY yrUZ
POLIOL-IFN-BÉTA KONJUGÁTUMOK
A találmány poliol-IFN-béta konjugátumokra vonatkozik, ahol a poliol egység kovalensen kötődik a Cys17-hez. A találmány tárgya továbbá eljárás ezek hely-specifikus előállítására, valamint ezek alkalmazására bakteriális fertőzések, virális fertőzések, autoimmun betegségek és gyulladásos betegségek terápiájában, prognózisában vagy diagnózisában. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás két vagy több PEG-maradék polipeptidhez történő lépésenként! kapcsolására.
A humán fibroblaszt interferon (IFN-β) antivirális aktivitással rendelkezik, és képes a daganatos sejtek elleni természetes gyilkos sejteket is stimulálni. Ez egy körülbelül 20000 Da méretű polipeptid, amelyet vírusok és kettős-szálú RNS-ek indukálnak. A fibroblaszt interferont kódoló gén nukleotidszekvenciájából - amelyet rekombináns DNS módszerrel klónoztak Derynk és munkatársai [Nature 285, 542-547 (1980)] - következtettek a protein teljes aminosavszekvenciájára. A protein 166 aminosav hosszúságú.
Shepard és munkatársai [Nature 294, 563-565 (1981)] ismertettek egy mutációt a 842. bázisnál (Cys -> Tyr a 141-es helyzetben), amely az antivirális aktivitás megszüntetéséhez vezetett, és leírtak egy, a 1119-1121. nukleotidok delécióját tartalmazó variáns kiónt.
93177-12247A Sí
- 2 Mark és munkatársai [Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 81(18). 5662-5666 (1984)] egy mesterséges mutációt inszertáltak a 469. bázis (T) adeninnal (A) történő helyettesítésével, amely 17-es helyzetben egy Cys -> Ser aminosavcserét okozott. Az így kapott IFN-β a leírás szerint ugyanolyan aktív, mint az „natív” IFN-β, és stabil hosszútávú tárolás során (-70 °C-on).
A hidrofil polimer polietilénglikol (PEG), más néven poli(etilén-oxid) (PEO) kovalens kapcsolása különféle molekulákhoz fontos alkalmazásokkal bír a biotechnológiában és gyógyászatban. Leggyakoribb formájában a PEG egy lineáris polimer, amely mindkét terminálisán hidroxilcsoportokat tartalmaz:
HO-CH2-CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-OH.
Ez a képlet rövidebben mint HO-PEG-OH jelölhető, ahol -PEG- jelenti a polimer vázat a terminális csoportok nélkül, azaz
-PEG- jelentése -CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-.
A PEG-et gyakran metoxi-PEG-OH-ként (m-PEG) alkalmazzák, amelyben az egyik terminusz egy viszonylag inert metoxicsoport, míg a másik terminusz egy hidroxilcsoport, amely kémiai módosításoknak vethető alá:
CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH.
Gyakran használják az elágazó PEG-eket is. Az elágazó PEG-eket az R(-PEG-OH)m képlettel ábrázolhatjuk, amelyben R
- 3 egy centrális mag maradékot, például pentaeritritet vagy glicerint jelent, és m jelenti az elágazó „karok” számát. Az elágazó karok száma (m) háromtól százig, vagy még nagyobb értékig változhat. A hidroxilcsoportokat kémiai módosításnak lehet alávetni.
Egy másik elágazó forma, például a WO 96/21469 számon publikált szabadalmi leírásban ismertetett, egyetlen terminuszt tartalmaz, amely a kémiai módosítás helye. Az ilyen típusú PEG a (CH3O-PEG-)pR-X képlettel ábrázolható, ahol p = 2 vagy 3, és R jelentése központi mag, például lizin vagy glicerin, és X jelentése funkciós csoport, például karboxilcsoport, amelyet kémiailag aktiválni lehet. Egy másik elágazó forma, a „függő PEG” a reakcióképes csoportokat, például karboxilcsoportot a PEG váza mentén tartalmazza a PEG-láncok vége helyett.
A PEG fenti formáin kívül olyan polimer is előállítható, amely a vázban gyenge vagy lebontható kötéseket tartalmaz. Például Harris az US 06/026716 számú szabadalmi bejelentésben bemutatta, hogy a polimer váz észterkötéseket tartalmazó PEG is előállítható, amelyek hidrolizálhatók. A hidrolízis a polimer alacsonyabb móltömegű fragmensekre történő hasadását eredményezi, az alábbi reakcióvázlat szerint:
-PEG-CO2-PEG- + H2O -> -PEG-CO2H + HO-PEG-.
A találmány értelmében a polietilénglikol vagy PEG kifejezés magában foglalja az összes fent említett származékokat is.
Az etilén-oxid és propilén-oxid polimerjei kémiailag nagyon hasonlítanak a PEG-hez, és ezeket PEG helyett számos al- 4 kalmazásban lehet használni. Ezek a
HO-CH2CHRO(CH2CHRO)nCH2CHR-OH általános képlettel ábrázolhatok, ahol R jelentése H vagy CH3.
A PEG egy nagyon hasznos polimer, amely nagy vízoldhatósággal, valamint számos szerves oldószerben is nagy oldhatósággal rendelkezik. A PEG ezenkívül nem toxikus és nem immunogén. Amikor a PEG-et kémiailag kapcsolják egy vízoldhatatlan vegyülethez (PEG-ilezés), a kapott konjugátum általában vízoldható, valamint számos szerves oldószerben is oldódik.
A PEG-protein konjugátumokat jelenleg protein-helyettesítéses terápiában alkalmazzák, valamint egyéb gyógyászati alkalmazásai is vannak. Például a PEG-ilezett adenozin-dezaminázt (ADAGÉN®) súlyos, kombinált immunhiány betegség (SCIDS) kezelésére alkalmazzák, a PEG-ilezett L-aszparaginázt (ONCAPSPAR®) akut limfoblasztos leukémia (ALL) kezelésére alkalmazzák, és a PEG-ilezett interferon-α, amely a vizsgálatok harmadik fázisában van, hepatitis C kezelésére alkalmazható.
A klinikai hatékonysággal rendelkező PEG-protein konjugátumok általános áttekintését lásd N. L. Burnham munkájában [Am. J. Hosp. Pharm. 15, 210-218 (1994)].
Számos eljárást kifejlesztettek a proteinek PEG-ilezésére. A PEG kapcsolását a proteinen levő reakcióképes csoportokhoz rendszerint elektrofil módon aktivált PEG-származékok alkalmazásával végzik. A PEG kapcsolása a lizin-maradékok a- és ε-amino-csoportjaihoz és az N-terminálishoz termékek elegyéből álló konjugátumot eredményez.
- 5 Általában az ilyen konjugátumok egy proteinmolekulához kapcsolt több PEG molekula populációjából állnak (PEGmerek), a PEG molekulák száma O-tól a proteinben lévő aminocsoportok számáig változik. Az egyszeresen módosítottprotein molekulában a PEG egység számos különböző amino-helyhez kapcsolódhat.
A nem-specifikus PEG-ilezés fenti típusa több konjugátumot eredményezett, amelyek szinte inaktívak voltak. Az aktivitás csökkenése rendszerint a protein aktív kötő doménjének leárnyékolásából eredt, ez a helyzet sok citokin és antitest esetén. Például Katre és munkatársai (US 4766106 és US 4917888 számú szabadalmi leírások) ismertetik az IFN-B és IL-2 PEG-ilezését metoxi-polietilénglikolil-N-szukcinimidil-glutarát és metoxi-polietilénglikolil-N-szukcinimidil-szukcinát nagy feleslegével. Mindkét proteint mikroba gazdasejtekben állították elő, amelyek lehetővé tették a szabad cisztein szerinné történő helyspecifikus mutációját. A mutáció az IFN-B mikrobás expressziójában szükséges volt a protein hajtogatott szerkezetének kialakulásához. Közelebbről, a fenti kísérletekben alkalmazott IFN-B a Betaseron® néven forgalmazott termék, amelyben a Cys17 maradék szerinnel van helyettesítve. Ezenkívül a glikozilezés hiánya csökkentette az oldhatóságot vizes oldatban. A nem—specifikus PEG-ilezés fokozott oldhatóságot eredményezett, de fő problémaként megmaradt az aktivitás és hozam csökkent szintje.
Az EP 593868 számú szabadalmi leírásban (amelynek címe PEG-interferon konjugátumok) PEG-IFN-oc konjugátumok előállítását ismertetik. Azonban a PEG-ilezési reakció nem hely-specifikus, ezért a PEG-IFN-α konjugátumok helyzeti izomer
- 6 jeinek elegyét kapták [lásd még Monkarsh és munkatársai, ACS Symp. Ser. 680, 207-216 (1997)].
Kinstler és munkatársai (EP-A 675201) bemutatták a megakariocita növekedési és fejlődés faktor (MGDF) N-terminális maradékának szelektív módosítását mPEG-propionaldehiddel. Ezáltal reprodukálható PEG-ilezést és farmakokinetikai tulajdonságokat kaptak sarzsról-sarzsra. Gilbert és munkatársai (US 5711944) bizonyították, hogy a PEG-ilezett IFN-α optimális aktivitással állítható elő. Ebben az esetben fáradságos tisztítási lépés kellett az optimális konjugátum előállításához.
A citokinek többsége, és egyéb proteinek sem rendelkeznek specifikus PEG-kapcsolódási hellyel, és a fenti példáktól eltekintve nagyon valószínű, hogy a PEG-ilezési reakcióban képződött izomerek némelyike teljesen vagy részlegesen inaktív lesz, ezáltal a végtermék elegy aktivitása csökken.
Tehát a hely-specifikus monoPEG-ilezés nagyon kívánatos lenne az ilyen protein konjugátumok előállításában.
Woghiren és munkatársai [Bioconjugate Chem. 4(5), 314-318 (1993)] előállítottak egy tiol-szelektív PEG-származékot egy ilyen hely-specifikus PEG-ilezéshez. Egy ortopiridil-diszulfid reakcióképes csoport formájában lévő stabil, tiol-védett PEG-származékról kimutatták, hogy specifikusan kötődik a papain proteinben lévő szabad ciszteinhez. A papain és PEG a között így kialakult diszulfid kötés enyhe redukciós körülmények között hasítható volt, ezáltal natív protein keletkezett.
A leírásban említett dokumentumokról nem állítjuk, hogy a technika állásának ideillő részét képezik, vagy az igénypontok szabadalmazhatóságát tekintve figyelembe veendő anyag. Az
- 7 idézett dokumentumok tartalmára vagy adataira való hivatkozás pusztán információs jellegű, amely a bejelentés benyújtásának időpontjában rendelkezésünkre állt, és ezek helyességéért nem szavatolunk.
A találmány poliol-IFN-B konjugátumokra, és főleg PEG-IFN-B konjugátumokra vonatkozik, amelyekben a poliol egység kovalensen kötődik a Cys17-hez. A specifikus konjugációt azáltal érjük el, hogy egy tiol-reaktív poliol reagenst reagáltatunk az IFN-B Cys17 maradékával. Az ilyen konjugátumok várhatólag fokozott hatékonyságot mutatnak in vivo. Célunk semleges pH-η fokozott oldhatóság, fokozott stabilitás (csökkent aggregáció), csökkent immunogén jelleg és a natív IFN-B aktivitásának megőrzése volt. Az ilyen konjugáció eredménye a kívánt hatás eléréséhez szükséges dózis nagyságának csökkenése a gyógyászati készítmény forma egyszerűsödése és stabilizálása, és a hosszútávú hatékonyság valószínű növekedése lehet.
A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás PEG-maradékok lépésenként! sorozatos kapcsolása egy polipeptidhez.
A leírás ábráit röviden az alábbiakban ismertetjük.
Az 1. ábrán látható a PEG-IFN-B konjugátum kapilláris elektroforézis (CE) görbéje tisztítás előtt.
A 2A-2C ábrán látható a PEG-IFN-B konjugátum tisztítása méret szerinti kizárásos kromatográfiával (Superose 12): 2A ábra - első átvezetés; 2B ábra - második átvezetés; 2C ábra - harmadik átvezetés.
A 3. ábrán látható a harmadik kromatográfiás tisztítással kapott tisztított PEG-IFN-B konjugátum SDS-PAGE kromatogramja. 1. és 4. sáv: protein móltömeg standardek, 2. sáv: „na- 8 tív” IFN-β, 3. sáv: PEG-IFN-β konjugátum.
A 4. ábrán látható a tisztított PEG-IFN-β konjugátum kapilláris elektroforézis (CE) görbéje, ahol az IFN-β mPEG-OPSS5kval van PEG-ilezve.
Az 5. ábrán látható a tisztított PEG-INF-β konjugátum MALDI MS spektruma.
A 6. ábrán látható egy összehasonlítás a natív IFN-β és a PEG-IFN-β konjugátum antivirális aktivitása között. A WISH sejteket az IFN-β minták megadott koncentrációinak jelenlétében inkubáltuk 24 órán keresztül a vezikuláris stomatitis vírus citopatikus dózisával történő provokálás előtt. A citopatikus hatást további 48 óra elteltével határoztuk meg MTT konverzióval.
A 7. ábrán látható az IFN-β és a PEG-IFN kötődési profilja Daudi sejtekben.
A 8. ábrán látható az IFN-β és PEG-IFN farmakokinetikai profilja, egérnek történő intravénás adagolás után. A pontozott vonalak jelzik az LOQ vizsgálatot az egyes standard görbékhez.
A 9. ábrán látható az IFN-β és PEG-IFN farmakokinetikai profilja, egérnek történő szubkután adagolást követően. A pontozott vonalak jelzik az LOQ vizsgálatot az egyes standard görbékhez.
A találmányt részletesen az alábbiakban ismertetjük.
A találmány azon a felismerésen alapul, hogy egy poliolmaradék, közelebbről egy PEG-maradék kapcsolása a humán IFN-β Cys17 maradékához előre nem várt módon fokozta (vagy legalábbis nem változtatta meg, vagy nem csökkentette) az IFN-β biológiai aktivitását a natív humán interferon-B-hoz viszonyítva. Tehát az IFN-β a Cys17 maradékhoz kapcsolt políol-ma- 9 radékkal nemcsak azonos vagy fokozott IFN-β biológiai aktivitást mutat, hanem ez a poliol-IFN-β konjugátum a polil-maradék által biztosított kívánatos tulajdonságokkal, például fokozott oldhatósággal rendelkezik.
IFN-β alatt a leírásban humán fibroblaszt interferont értünk, amely biológiai folyadékokból történő izolálással vagy prokariota vagy eukarióta gazdasejtekből DNS rekombináns módszerekkel állítható elő, valamint ennek sóit, funkcionális származékait, prekurzorait és aktív frakcióit, feltéve, hogy ezek tartalmazzák a természetben előforduló forma 17-es helyzetében lévő cisztein-maradékot.
A találmány szerinti poliol-IFN-β konjugátum poliol-maradéka bármely vízoldható, egyenes vagy elágazó szénláncú mono- vagy bifunkciós poli(alkilén-oxid) lehet. Rendszerint a poliol egy polialkilénglikol, például polietilénglikol (PEG). Azonban szakember számára nyilvánvaló, hogy egyéb poliolok, például polipropilénglikol és polietilénglikol és polipropilénglikol kopolimerjei is alkalmazhatók a találmány értelmében.
A leírás PEG-maradék alatt például - a korlátozás szándéka nélkül - egyenes vagy elágazó szénláncú PEG, metoxi-PEG, hidrolitikusan vagy enzimatikusan hasítható PEG, függő PEG, dendrimer PEG, PEG és egy vagy több poliol kopolimerjei, és PEG és PLGA [poli(tejsav)/glikolsav] kopolimerjei értendők.
Só alatt a leírásban a vegyületnek mind a karboxilcsoportokkal előállítható sóit, mind az aminocsoportokkal előállítható sóit értjük, amelyek ismert módon állíthatók elő. A karboxilcsoportok sói közé tartoznak a szervetlen sók, például nátrium-, kálium-, kalciumsók, és a szerves bázisokkal képzett sók, pél- 10 dául egy aminnal, így például trietanol-aminnal, argininnel vagy lizinnel alkotott sók. Az aminocsoportok sói közé tartoznak például a szervetlen savakkal, így például sósavval, és a szerves savakkal, például ecetsavval képzett sók.
Funkcionális származékok alatt a leírásban az aminosavak oldalláncában lévő funkciós csoportokból, vagy a terminális Nvagy C-csoportokból ismert módon előállított származékokat értjük, ha azok gyógyászatilag elfogadhatók, azaz nem rontják le a protein aktivitását, vagy ezektől nem lesz toxikus az ezeket tartalmazó gyógyászati készítmény. Ilyen származékok közé tartoznak például a karboxilcsoportok észterei vagy alifás amidjai, és a szabad aminocsoportok N-acil-származékai, vagy a szabad hidroxilcsoportok O-acil-származékai, amelyek acilcsoportokkal, például alkanoil- vagy aroilcsoportokkal állíthatók elő.
Prekurzor alatt olyan vegyületeket értünk, amelyek az emberi vagy állati testben IFN-B-vá alakulnak át.
A protein aktív frakciói alatt a találmány értelmében a vegyület polipeptid láncának bármely fragmentumát vagy prekurzorát értjük, önmagukban, vagy a kapcsolódó hozzájuk kötött molekulákkal vagy maradékokkal, például cukrok vagy foszfátok maradékaival kombinációban, vagy a peptidmolekula aggregátumait, ha ezek a fragmentumok vagy prekurzorok gyógyszerként az IFN-β aktivitásával rendelkeznek.
A találmány szerinti konjugátumokat bármely ismert eljárással előállíthatjuk. A találmány egyik kiviteli módja szerint az IFN-B-t PEG-ilező szerrel reagáltatjuk megfelelő oldószerben, és a kívánt konjugátumot izoláljuk és tisztítjuk, például egy vagy több kromatográfiás módszer alkalmazásával.
11 - <·: Ί 7:<::
«· · ·» · β·
Kromatográfiás módszer alatt a leírásban bármely olyan technikát értünk, amelyet egy elegy komponenseinek szétválasztására lehet alkalmazni azáltal, hogy az elegyet egy hordozóra (stacioner fázis) visszük fel, amelyen egy oldószer (mobil fázis) folyik keresztül. A kromatográfiás módszerek elválasztási elvei a mobil bázis és a stacioner fázis eltérő fizikai tulajdonságain alapulnak.
A kromatográfiás eljárások típusai közelebbről szakirodalomból jól ismertek, ilyenek például a folyadék-, nagynyomású folyadék-, ioncserés, adszorpciós, affinitás!, megoszlásos, hidrofób, fordított fázisú, gélszűréses, ultraszűréses vagy vékonyréteg-kromatográfiás eljárások.
Tiol-reaktív PEG-ilező szer alatt a leírásban bármely olyan PEG-származékot értünk, amely a cisztein-maradék tiolcsoportjával képes reagálni. Ez lehet például egy funkciós csoportot, például ortopiridil-diszulfidot, vinilszulfont, maleimidet, jódacetimidet vagy egyebet tartalmazó PEG. A találmány egyik előnyös kiviteli módja szerint a tiol-reaktív PEG-ilező szer a PEG ortopiridil-diszulfid (OPSS) származéka.
A PEG-ilező szert vagy mono-metoxilezett formájában alkalmazzuk, amikor csak az egyik vég használható fel a konjugáláshoz, vagy bifunkciós formában, amikor mindkét vég felhasználható a konjugáláshoz, például olyan konjugátum előállítására, amelyben két IFN-B kapcsolódik kovalensen ugyanazon PEG-maradékhoz. A PEG-ilező szer móltömege előnyösen 500 és 100000 közötti.
A találmány szerinti konjugátumok előállítását tipikusan az alábbi eljárással végezzük.
- 12 Ν-κ ρΗ<7 Protein-SH + m PEG-S~S\/------*- mPEG-S-S-Protein ^^^^^B-mericaptoetanol
Protein-S-H + mPEG-S-H + HOCH2CH2-S-S-CH2CH2OH
A fenti reakcióvázlat második sora a PEG-protein kötés hasítását mutatja be. Az mPEG-OPSS-származékok erősen szelektívek szabad szulfidrilcsoportokra, és gyorsan reagálnak savas pH körülmények között, ahol az IFN-Β stabil. A nagy szelektivitást a konjugátum natív IFN-Β formává és PEG-gé történő redukciójával bizonyíthatjuk.
A protein és a PEG-maradékok között képződött diszulfid-kötésről kimutattuk, hogy a keringésben stabilak, azonban a sejtkörnyezetbe történő bejutás után redukálhatok. Ezért várható, hogy az a konjugátum, amely nem jut be a sejtbe, stabil marad a keringésben, amíg onnan ki nem tisztul. Megjegyezzük, hogy a fenti reakció hely-specifikus, mivel a humán IFN-Β természetes formájában a 31-es és 141-es helyzetben jelenlévő másik két cisztein-maradék nem reagál a tiol-reaktív PEG-ilező szerrrel, ugyanis ezek diszulfid-hidat alkotnak.
A találmány tárgya továbbá eljárás két vagy több PEG-maradék polipeptidhez történő lépésenként! kapcsolására. Az eljárás azon a felismerésen alapul, hogy egy kis móltömegű aktivált PEG tökéletesebben reagál a proteinen lévő sztérikusan gátolt reakcióhellyel, mint egy nagy móltömegű aktivált PEG. A terápiás hatású drága proteinek PEG-módosításának költségkímélő
- 13 nek kell lennie annak érdekében, hogy a PEG konjugátum előállítása gyakorlatban megvalósítható legyen. Ezenkívül a PEG-protein konjugátum glomeruláris kiszűrődésének csökkentése és farmakológiai tulajdonságainak optimalizálása érdekében a konjugátumnak a 70 kDa móltömegű proteinnel ekvivalens effektív mérettel kell rendelkeznie. Ez azt jelenti, hogy egy olyan hely-specifikus módosításhoz, ahol egyetlen PEG-et kapcsolunk, a PEG-származéknak előnyösen 20 kDa-nál nagyobb móltömeggel kell rendelkeznie. Ha a módosítás helye szférikusán zsúfolt, a nagyméretű PEG-maradékon lévő reakcióképes csoport nehezen fér hozzá a módosítás helyéhez, ezáltal kis hozamokat kapunk. A polipeptid PEG-ilezésére szolgáló találmány szerinti előnyös eljárással úgy növeljük a hely-specifikus PEG-ilezés hozamát, hogy először egy kisméretű hetero- vagy homobifunkciós PEG-maradékot kapcsolunk, amely - viszonylag kisebb mérete következtében - képes reagálni a szférikusán zsúfolt helyekkel. Ezután a kisméretű PEG-hez egy nagy móltömegű PEG-származékot kapcsolva nagy hozammal kapjuk a kívánt PEG-ilezett proteint.
A találmány szerinti eljárás tehát egy vagy több maradék polipeptidhez történő sorozatos, lépésenként! kapcsolására alkalmas oly módon, hogy először egy kis móltömegű heterobifunkciós vagy homobifunkciós PEG-maradékot kapcsolunk a polipeptidhez, majd a polipeptidhez kapcsolt kis móltömegű PEG-maradék szabad végéhez ezután monofunkciós vagy bifunkciós PEG-maradékot kapcsolunk. Két vagy több PEG-maradék polipeptidhez - amely előnyösen az IFN-β, ahol a PEG kapcsolódásának előnyös helye egy szférikusán zsúfolt helyen loka
- 14 lizálódó Cys17 - történő sorozatos lépésenként! kapcsolása után a PEG-polipeptid konjugátumot egy vagy több tisztítási módszerrel, például ioncserés kromatográfiával, méret szerinti kizárásos kromatográfiával, hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfiával, affinitás! kromatográfiával és fordított fázisú kromatográfiával tisztíthatjuk.
A kis móltömegű PEG-maradék képlete
W-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-X, ahol W és X jelentése olyan csoport, amelyek egymástól függetlenül amin, szulfidril, karboxil vagy hidroxil funkciós csoportokkal reagálva a kis móltömegű PEG-maradékot a polipeptidhez kapcsolják. W és X jelentését előnyösen egymástól függetlenül ortopiridil-diszulfid, maleimidek, vinil-szulfonok, jódacetamidok, aminok, tiolok, karbonsavak, aktív észterek, benzotriazol-karbonátok, p-nitrofenol-karbonátok, izocianátok és biotin közül választjuk. A kis móltömegű PEG-maradék móltömege előnyösen körülbelül 100 és 5000 Da között lehet.
A polipeptidhez kapcsolt, kis móltömegű PEG szabad végéhez kapcsolandó monofunkciós vagy bifunkciós PEG-maradék móltömege előnyösen körülbelül 100 Da és 200 kDa között van, és ez előnyösen egy metoxi-PEG, elágazó láncú PEG, hidrolitikusan vagy enzimatikusan hasítható PEG, függő PEG vagy dendrimer PEG. A monofunkciós vagy bifunkciós PEG általános képlete
Y-CH2CH2O(CH2CH2O)mCH2CH2-Z,
- 15 - ·::.· ·· • · · » • · · · · « w ahol Y a polipeptidhez kapcsolódott kis móltömegü PEG-maradék szabad végén lévő terminális csoporttal reagálni képes csoportot jelent, és Z jelentése -OCH3, vagy egy olyan csoport, amely X-szel reagálni képes, ezáltal bifunkciós konjugátumot képez.
Az egy vagy több PEG-maradék lépésenként! kapcsolására szolgáló fenti eljárással előállított PEG-polipeptid konjugátum hatóanyagként olyan gyógyszerek vagy gyógyászati készítmények előállítására alkalmazható, amelyek a fenti polipeptiddel hatékonyan kezelhető betegségek vagy rendellenességek kezelésére alkalmazhatók.
A találmány további tárgyát alapvetően tiszta formában lévő konjugátumok képezik, amelyek hatóanyagként alkalmazhatók gyógyászati készítményekben bakteriális és virális fertőzések, valamint autoimmun, gyulladásos betegségek és tumorok kezelésére, diagnózisára és prgnózisára. Az ilyen gyógyászati készítmények a találmány további tárgyát jelentik.
A fenti betegségekre a korlátozás szándéka nélkül említjük az alábbiakat: szeptikus sokk, AIDS, reumás arthritis, lupus erythematosus és szklerózis multiplex.
A találmány további előnyei és kiviteli alakjai az alábbi leírásból nyilvánvalóak.
A találmány értelmében a találmány szerinti konjugátumok farmakológiailag hatékony mennyiségei olyan egyedeknek adagolhatok, amelyekben fennáll a veszélye a fent említett betegségek kifejlődésének, vagy olyan egyedeknek, amelyekben a fenti betegségek már megmutatkoztak.
Az adagolást a hatóanyaggal összeférhető bármely adago- 16 lási módszerrel elvégezhetjük. Előnyös a parenterális adagolás, például a szubkután, intramuszkuláris vagy intravénás injekció. A beadandó hatóanyag dózisa a gyógyászati előírásoktól függően változik, a beteg életkora, testtömege és egyedi válasza alapján.
A dózis 10 pg és 1 mg között változhat naponta egy átlagos, 75 kg testtömegű beteg esetén, az előnyös napi dózis 20 pg és 200 pg között lehet.
A parenterális adagolásra alkalmas gyógyászati készítményt hatóanyagot és megfelelő vivőanyagot tartalmazó injektálható formában állíthatjuk elő. Vivőanyagként parenterális adagolásra jól ismert anyagok alkalmazhatók, például víz, sóoldat, Ringer-oldat és/vagy dextróz. A vivőanyag tartalmazhat kis mennyiségben segédanyagokat is, a gyógyászati készítmény stabilitásának és izotonicitásának biztosításához. Az oldatok előállítását gyógyszerkészítésben szokásosan alkalmazott módszerek szerint végezhetjük.
A találmányt közelebbről specifikus kiviteli alakokkal ismertetjük, azonban magától értetődően a szakember számára nyilvánvaló módosítások és helyettesítések szintén a találmány tárgykörébe tartoznak.
A találmányt közelebbről - a korlátozás szándéka nélkül az alábbi példákkal ismertetjük.
1. példa
PEG-IFN-B konjugátum előállítása
IFN-B módosítása mPEGsK-OPSS-sel
A PEG-IFN-B konjugátum előállítására rekombináns humán IFN-B-t alkalmaztunk, amely 50 mmol/1 nátrium-acetát puffer
- 17 ben (pH 3,6) 0,37 mg/ml koncentrációban stabil. Körülbelül 1,0 ml 6 mol/1 koncentrációjú karbamidot adtunk 2 ml 0,37 mg/ml koncentrációjú IFN-B-oldathoz (0,74 mg, 3,7 x IO’8 mol). 1 mól IFN-B-hoz 50 mól moláris feleslegben adtunk mPEG5K-OPSS-t, és a két anyagot polipropilén csőben reagáltattuk 37 °C-on 2 órán keresztül, vagy 50 °C-on 1 órán keresztül. A reakcióelegyet kapilláris elektroforézissel (CE) analizáltuk, hogy meghatározzuk a tisztítás előtt a PEG-ilezési reakcióval keletkezett PEG-IFN-B konjugátum mennyiségét (1. ábra). A fenti reakció tipikus hozama 50% PEG-IFN-B. A reakcióelegyből a reakciótermékeket 0,22 mm-es fecskendős szűrővel elválasztottuk, és a szűrt oldatot ezután méret szerinti kizárásos oszlopra (Superose 12 vagy Superdex 75, Pharmacia) vittük fel, és 50 mmol/1 nátrium-foszfát, 150 mmol/1 NaCl (pH 7,0) pufferrel eluáltuk. A 2A ábrán látható a PEG-IFN-B konjugátum Superose 12 méret szerinti kizárásos kromatográfiás oszlopon történő tisztításával kapott elúciós profil. A csúcsokat összegyűjtöttük, és SDS-PAGE eljárással analizáltuk (3. ábra). A PEG-IFN-B konjugátumot tartalmazó frakciókat egyesítettük, és a koncentrátumot ugyanazon méret szerinti kizárásos oszlopra vittük fel a PEG-IFN-B konjugátum további tisztítása céljából, a „natív” IFN-Β csúcs közelsége miatt (2B ábra). Ezt az eljárást megismételtük (harmadik felvitel), hogy a terméket tiszta formában nyerjük (2C ábra). A 4. és 5. ábrán látható a tisztított PEG-IFN-B konjugátum kapilláris elektroforézis görbéje, és MALDI MS spektruma.
IFN-Β módosítása mPEG^oK-OPSS-sel
Rekombináns humán IFN-B-ból stabil, 0,36 mg/ml oldatot állítottuk elő 50 mmol/1 nátrium-acetát pufferben (pH 3,6).
- 18 3 ml 0,36 mg/ml koncentrációjú IFN-β oldathoz (1,08 mg, 4,9 x 10'8 mól) körülbelül 36 mg mPEG3oK-OPSS-t adtunk 3 ml ionmentes vízben, és a két reaktánst polipropilén csőben 50 °C-on 2 órán keresztül reagáltattuk. A reakcióelegyet kapilláris elektroforézissel analizáltuk a módosítás mértékének meghatározására. A tipikus hozam ebben a reakcióban <30%. Az oldatot ezután méret szerinti kizárásos oszlopra (Superose 12, Pharmacia) vittük fel, és 50 mmol/1 nátrium-foszfát, 150 mmol/1 NaCl (pH 7,0) pufferrel eluáltuk. A csúcsokat összegyűjtöttük, és SDS-PAGE módszerrel analizáltuk azok tartalmát.
2. példa
PEG-IFN-β konjugátum biológiai aktivitása
A PEG-ilezés hatását a humán rekombináns IFN-β antivirális aktivitására úgy határoztuk meg, hogy humán WISH amnionsejteket vagy frissen előállított IFN-B-val (ugyanaz a sarzs, mint amelyet a PEG-ilezésre alkalmaztunk), vagy PEG-IFN-β konjugátummal előinkubáltunk. Az IFN-B-mediálta antivirális aktivitást - amelyet WISH-VSV citopátiás vizsgálattal mértünk - a Novick és munkatársai [J. Immunoi. 129, 2244-2247 (1982)] eljárása alapján kifejlesztett antivirális WISH biovizsgálattal határoztuk meg. A WISH vizsgálatban az alábbi anyagokat alkalmaztuk:
WISH sejtek (ATCC CCL 25), hólyagos szájgyulladás vírus törzstenyészetek (ATCC V-520-001-522), amelyeket -70 °C-on tároltunk, humán rekombináns IFN-β (InterPharm Laboratories LTD, 32075 típus, 205035 számú sarzs), 82 x 106 NE (nemzetközi egység)/ml, specifikus aktivitás: 222 x 106 NE/mg,
- 19 PEG-IFN-β konjugátum, amelyet az 1. példában leírtak szerint állítottunk elő, és PBS-ben (pH 7,4) tartottunk,
WISH tenyésztő közeg (nagy glükóztartalmú MÉM, Earl-féle sókkal + 10% FBS + 0,1% L-glutamin + 100 egység/ml penicillin vagy 100 pg/ml streptomicin),
WISH vizsgálati közeg (nagy glükóztartalmú MÉM, Earl-féle sókkal + 5% FBS + 1,0% L-glutamin + 100 egység/ml penicillin vagy 100 pg/ml streptomicin),
MTT 5 mg/ml PBS-ben, -70 °C-on tárolt.
A WISH vizsgálatot az alábbiak szerint végezzük:
Az IFN-β mintát a kiindulási koncentráció kétszeresére hígítjuk WISH vizsgálati közeggel.
Az IFN-β mintából WISH vizsgálati közeggel háromszoros hígítási sort készítünk laposaljú 96-rezervoáros lemezen, oly módon, hogy minden egyes rezervoár 50 μΐ hígított IFN-β mintát tartalmaz (néhány kontroll rezervoárba 50 μΐ WISH vizsgálati közeget mérünk csak).
A log szaporodási fázisban lévő WISH sejteket tripszin/EDTA oldattal összegyűjtjük, WISH vizsgálati közeggel mossuk, és 0,8 x 106 sejt/ml végkoncentrációra állítjuk be.
Az egyes rezervoárokba 50 μΐ WISH sejtszuszpenziót (4 x 104 sejt/rezervoár) adunk. A sejtekkel érintkeztetett IFN-β végkoncentrációja így egyszeres lesz.
5% szén-dioxidot tartalmazó, párásított inkubátorban 24 órán keresztül történő inkubálás után 50 μΐ 1:10 hígítású (WISH vizsgálati közeggel) VSV törzstenyészetet (ezt a dózist úgy határoztuk meg előzetesen, hogy a WISH sejtek 100%-át lizálja 48 órán belül) adunk az összes rezervoárba, a vírust nem tártál- 20 mazó kontroll rezervoárok kivételével (ezekbe csak azonos térfogatú vizsgálati közeget mérünk).
További 48 óra elteltével 25 μΐ MTT oldatot mérünk az összes rezervoárba, ezután a lemezeket inkubátorban 2 órán keresztül tovább inkubáljuk.
A rezervoárok tartalmát a lemez megfordításával eltávolítjuk, és 200 μΐ 100%-os etanolt mérünk a rezervoárokba. 1 óra elteltével a lemezeket 595 nm-en leolvassuk Soft max Pro software programcsomag és Spectramax spektrofotométer rendszer (Molecular Devices) alkalmazásával.
1. táblázat
PEG-ilezett és ál-PEG-ilezett IFN-béta minták antivirális aktivitása
IFN-β minta* EC50**
PEG-IFN-β konjugátum 3,9 +/- 0,7 pg/ml
IFN-β 16,4 +/- 1,0 pg/ml
IFN-β törzskoncentrációit a mintákban aminosav-analízissel határoztuk meg ** EC50 (+/- S.D.) meghatározása Microcal Origin 4.1 software csomaggal
A 6. ábrából és az 1. táblázat adataiból látható, hogy a PEG-IFN-β konjugátumban az antivirális aktivitás szintje magasabb volt, mint az IFN-B-é a frissen előállított kiindulási sarzsban. Az a megfigyelés, hogy a PEG-IFN-β konjugátum körülbelül négyszer nagyobb bioaktivitással rendelkezik, mint a
- 21 - ·; y γ:
frissen előállított IFN-B, a PEG-IFN-B konjugátum natív IFN-B-hoz viszonyított fokozott stabilitásának következménye is lehet a WISH vizsgálati közeg hozzáadása után.
3, példa
PEG-IFN minták relatív aktivitásának vizsgálata in vitro
A PEG[30 kD]-IFN-B és PEG[2 x 20 kD]-IFN-B relatív bioaktivitását WISH módszerrel határoztuk meg a 2. példa szerinti standard protokoll alkalmazásával (2. táblázat). A három, egymástól független vizsgálatot három különböző egyén végezte különböző időkben.
2, táblázat
PEG-IFN-B relatív antivirális aktivitása
Relatív interferon aktivitás* (három vizsgálatból)
Minta 1. vizsgálat 2. vizsgálat 3. vizsgálat Átlag (S.D.)
PEG[30kD]-IFN-B 3,2 x nagyobb 3,1x nagyobb 1,8 x nagyobb 3,0 x (0,78) nagyobb
PEQ2x20kD}-IFN-B 4,2 x nagyobb 1,3 x nagyobb 0,85 x nagyobb 2,1 x (1,8) nagyobb
* EC50 dózisok a standard IFN-B-val történő összehasonlítás minden egyes vizsgálatban szerepelt ** Az összehasonlítást 330 pg/ml IFN-B koncentráció alapján végeztük. A PEG[30 kD]-IFN-B (5,41 pg/ml) és a PEG[2 x 20 kD]-IFN-B (6,86 pg/ml) alapkoncentrációit aminosav-analízissel határoztuk meg.
A PEG-IFN-B kötődését a sejteken lévő receptorához rögzített mennyiségű 125I-IFN-a2a jelenlétében értékeltük ki. Az
I C
IFN-a2a-t I-vel jeleztük radioaktívan, kloramin T módszerrel. Az IFN-a2a-hoz kötődött 125I-t a szabad jódtól úgy választottuk el, hogy a reaktánsokat Sephadex G25 oszlopon vezettük át, és összegyűjtöttük a proteintartalmú frakciókat (Pharmacia). A 125I-IFN-oc2a mennyiségét IFN-a2a ELISA módszerrel (Biosource, USA) határoztuk meg, és meghatároztuk a specifikus aktivitást. Az exponenciális szaporodási fázisban lévő Daudi sejteket összegyűjtöttük, és 2 x 106 sejtet 0,5 nmol/1 125I-IFN-a2a-val szobahőmérsékleten 3 órán keresztül inkubáltunk PEG-IFN-β vagy IFN-a2a különböző koncentrációinak jelenlétében, amelyek hígítását 2% magzati borjúszérumot és 0,1% nátriumazidot tartalmazó RPMI 1640 vizsgálati pufferrel végeztük. Az inkubációs periódus végén a sejteket ftalát.olaj rétegen keresztül centrifugáltuk, és a sejthez kötött radioaktivitást gamma számlálóval mértük. A PEG[30kD]-IFN-B és PEG[2x20kD]-IFN-β kötődése a receptorhoz nagyon hasonló vagy közeli volt az IFN-β kötődési aktivitásához, amint az a 7. ábrából látható.
Ezenkívül, meghatároztuk a relatív aktivitást Daudi sejten (humán B-sejtes limfóma) végzett antiproliferációs vizsgálattal (3. táblázat). Az összes IFN minta koncentrációja 200 ng/ml kétszerese volt. A mintákból háromszoros hígítási sort készítettünk a lemezen, 100 pl végtérfogatban. Az egyes rezervoárokba 1 x 105 sejt/rezervoár (100 μΐ) mennyiségben adtuk a sejteket, és összesen 72 órán keresztül inkubáltuk 37 °C-on szén-dioxidot tartalmazó párásított inkubátorban. 48 óra elteltével triciált (3H) timidint adtunk hozzá 1 pCi/rezervoár mennyiségben, 20 μΐ térfogatban. 72 órás inkubációs periódus végén a lemezről Tömtek Plate Harvester segítségével össze
- 23 - ·; yv:
gyűjtöttük a sejteket. Az eredményeket a 3. táblázatban közöljük, amelyek jelzik, hogy a PEG-ilezés nem eredményezett detektálható IFN-aktivitás veszteséget. Valójában az aktivitás valamivel nagyobb volt, mint a szabad IFN-β aktivitása. Ennek oka az lehet, hogy a szabad IFN-ben inaktív aggregátumok képződnek, vagy a kvantitatív módszerek különbségeiből adódhat az eltérés (aminosav-analízis a PEG-IFN minták, és RP-HPLC IFN-β esetén).
3, táblázat
Daudi antiproliferációs vizsgálat
IC50 dózis (pg/ml) Aktivitásnövekedés IFN-hez viszonyítva
IFN-β (1. lemez) 1153,1 -
PEG[30kD]-IFN (71 A) 696,6 1,6-szoros
IFN-β (2. lemez) 1005,8 -
PEG[40kD]-IFN (71B)________ 629,4 1,7-szeres
4. példa
Farmakokinetikai vizsgálatok egérben
Intravénás adagolás
Az egereknek 100 ng IFN-β-ί, PEG[30kD]-IFN-B-t vagy PEG[2x20kD]-IFN-B-t injektáltunk, és a megadott időpontokban vérmintát vettünk. Az IFN-β szérumkoncentrációit IFN-B-specifikus ELIAS módszerrel (Toray Industries) határoztuk meg, és az eredményeket a 8. ábrán ismertetjük. 28 db nőstény B6D2F1 egeret (6-8 hetesek, körülbelül 20 g-osak) négy csoportra ősz
- 24 tottunk, az alábbiak szerint: az 1. csoportnak (amely 9 egérből állt) 200 μΐ 500 ng/ml humán IFN-B-t injektáltunk egyetlen bóluszban (végső dózis 100 ng/egér); a 2. csoportnak (9 egér) 200 μΐ ekvivalens mennyiségű PEG[30kD]-IFN-B-t injektáltunk; a 3. csoportnak 200 μΐ ekvivalens mennyiségű PEG[2x20kD]-IFN-Bt injektáltunk, és a 4. csoportnak (3 egér) nem adtunk injekciót, ezek negatív kontrollként szolgáltak. A vérmintákat (körülbelül 200 μΐ/minta) kilenc megadott időpontban vettük, a retro-orbitális vénás plexus roncsolásával, kapilláris cső segítségével. A vérmintákat 1 órán keresztül szobahőmérsékleten alvadni hagytuk, a karimát összegyűjtöttük és mikrocentrifugáltuk. Az elválasztott szérumot -70 °C-on tároltuk addig, amíg az összes mintát levettük. A szérumokat bioaktív humán IFN-B jelenlétére vizsgáltuk Toray vizsgálattal. Az eredmények azt jelzik, hogy a görbe alatti terület (AUC) jelentősen megnőtt a PEG-IFN mintákban a szabad IFN-B-hoz képest és a PEG[2x20kD]-IFN-B minta előnyösebb, mint a PEG[30 kD]—IFN-B.
Szubkután adagolás
Az egereknek szubkután módon IFN-B-t és PEG-IFN-t (100 ng/egér) injektáltunk. A 9. ábrán látható, hogy a görbe alatti összes terület (AUC) drámaian megnőtt a PEG-IFN minták esetén a szabad IFN-B-hoz viszonyítva. A farmakokinetikai vizsgálatok összhangban vannak azzal, hogy a PEG-IFN minták hosszabb felezési idővel és megnövekedett AUC-val rendelkeznek.
5, példa
Kis móltömegű PEG-maradék kapcsolása polipeptidhez
Interferon-béta „címkézése” OPSS-PEG^-hidraziddal
Protein-SH
O
Protein-S-S-PEG2K-C-NH-NH2 zrS-S-pEG2K-C-NH-NH2 N
A rekombináns humán interferon-B-ból 0,33 mg/ml oldatot készítettünk 50 mmol/l nátrium-acetát pufferrel (pH 3,8). Körülbelül 3,6 mg (40 mol% felesleg a protein móljára vonatkoztatva) heterobifunkcionális PEG reagenst, azaz OPSS-PEG2k-hidrazidot adtunk 2 ml ionmentes vízben 3 ml 0,33 mg/ml koncentrációjú IFN-β oldathoz (0,99 mg), és a reaktánsokat polipropilén csőben, 45 °C-on 1 órán keresztül hagytuk reagálni. A reakcióelegyet ezután kapilláris elektroforézissel analizálva meghatároztuk a módosítás mértékét. A tipikus hozam 90-97% volt, az alkalmazott interferon-β és PEG reagens tisztaságától függően. Az oldatot ezután méret szerinti kizárásos oszlopra (Superdex 75, Pharmacia) vittük fel, és 5 mmol/l nátrium-foszfát, 150 mmol/l NaCl (pH 7,0) pufferrel eluáltuk. A csúcsokat összegyűjtöttük, és SDS-PAGE módszerrel analizáltuk. A monoPEG-ilezett interferon-β frakciókat összegyűjtöttük, majd ezt alkalmaztuk a nagy móltömegű PEG-gel végzett további módosítás lépésében.
- 26 Interferon-B „címkézése (OPSS)7-PEGidnn-zal
ProteiirS-S-PEGjjoo-S-S
A rekombináns humán interferon-B-ból 0,33 mg/ml koncentrációjú oldatot készítettünk 50 mmol/1 nátrium-acetát pufferrel (pH 3,8). Körülbelül 6,1 mg (40 mól felesleg a protein móljára vonatkoztatva) homobifunkcionális PEG reagenst, azaz (OPSS)2-PEG34oo-at adtunk 2 ml ionmentes vízben 3 ml 0,33 mg/ml koncentrációjú interferon-B-hoz (0,99 mg), és a két reaktánst polipropilén csőben 2 órán keresztül hagytuk reagálni 50 °C-on. A reakciót nem-redukáló SDS-PAGE módszerrel ellenőriztük, és a végső reakcióelegyet kapilláris elektroforézissel analizáltuk a módosítás mértékének meghatározására. A fenti reakcióban az interferon-B módosítása jellemzően >95%. Az oldatot ezután méret szerinti kizárásos oszlopra (Superdex 75, Pharmacia) vittük fel, és 50 mmol/1 nátrium-foszfát, 150 mmol/1 NaCl (pH 7,0) pufferrel eluáltuk. A csúcsokat összegyűjtöttük, és tartalmukat SDS-PAGE módszerrel analizáltuk. A monoPEGilezett interferon-B frakciókat egyesítettük.
6. példa
Második PEG-maradék kapcsolása kis móltömegű PEG-gel PEG-ilezett polipeptidhez
IFN-S-S-PEG?k-hidrazid módosítása rnPEGmk-aldehiddel (ÁLD)
PrrtenrS^-PEOjK-C-NlhNHi
Protein- S-S-PEG^-C-NH-N^ILmPEGjcK mPEGjQK-CHjCHzCH
Az 5. példa szerint előállított IFN-S-S-PEG2k-hidrazid egyesített frakcióit a proteinhez képest 20 mól feleslegben adtuk az mPEG3ok-ALD-hoz. A reakciót szobahőmérsékleten (25 C) 4 órán keresztül játszattuk le, és a mintát méret szerinti kizárásos oszlopra (Superose 6, Pharmacia) vittük fel, hogy meghatározzuk a módosítás hozamát. A módosítás hozama ebben a reakcióban rendszerint >80% a PEG reagens tisztaságától és a reakciókörülményektől függően.
Miután a találmányt részletesen ismertettük, szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány ekvivalens paraméterek, koncentrációk és körülmények tág körében megvalósítható anélkül, hogy a találmány szellemétől eltérnénk, és ez indokolatlanul sok kísérleti munkát követelne.
Noha a találmányt a fentiekben egy specifikus kiviteli alakokkal ismertettük, nyilvánvaló, hogy azon különféle módosítások hajthatók végre. A találmány oltalmi körébe tartoznak a találmány szellemében általában végzett változtatások, alkalma
- 28 zások vagy adaptációk, amelyek szakember számára kézenfekvőek.
A leírásban idézett irodalmak, így a szakcikkek vagy kivonatok, publikált vagy publikálatlan US vagy egyéb szabadalmi bejelentések, megadott US és egyéb szabadalmak, vagy bármely egyéb dokumentum tartalmát leírásunkba referenciaként beépítettük, beleértve az összes adatot, táblázatot, ábrát és szöveget. Ezenkívül leírásunkba referenciaként beépítettük az irodalmi hivatkozásokban hivatkozott összes szakirodalom teljes tartalmát is.
Az ismert eljárási lépésekre, szokásos eljárási lépésekre, ismert eljárásokra vagy szokásos eljárásokra való hivatkozást semmiképpen nem úgy értjük, hogy a találmány szerinti leírás vagy kiviteli mód a hivatkozott szakirodalomban le lett volna írva, vagy arra kitanítás vagy javaslat található lett volna.
A specifikus kiviteli módok fenti ismertetéséből a találmány általános jellege nyilvánvaló, és egy szakember köteles tudásának alkalmazásával (amelybe beletartozik a fent idézett irodalmak tartalma is) módosítani és/vagy adaptálni képes különféle alkalmazásokra a fenti specifikus kiviteli alakokat túlzott mértékű kísérleti munka végzése és a találmány elvétől való eltérés nélkül. Ezért az ilyen módosítások és adaptációk az ismertetett kiviteli alakok ekvivalenseinek körébe tartoznak, amelynek alapját a leírásban található kitanítás képezi. Magától értetődik, hogy a leírás céljára használt terminológia nem a korlátozást szolgálja, és hogy a leírásban alkalmazott kifejezéseket szakembernek saját tudásával kombinációban a leírásban adott kitanítás tükrében kell értelmeznie.

Claims (25)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. Poliol-interferon-β konjugátum, amely humán interferon-β Cys17-jéhez kovalensen kötött poliol-maradékot tartalmaz.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti poliol-interferon-B konjugátum, amelyben a poliol-maradék egy polialkilénglikol-maradék.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti poliol-interferon-B konjugátum, amelyben a polialkilénglikol-maradék egy polietilénglikol (PEG) maradék.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti poliol-interferon-B konjugátum, ahol a poliol-interferon-B konjugátum azonos vagy nagyobb interferon-B aktivitással rendelkezik, mint a natív humán interferon-B.
  5. 5. Eljárás az 1. igénypont szerinti poliol-interferon-B konjugátum előállítására, azzal jellemezve, hogy interferon-B-t tiol-reaktív poliol reaktánssal reagáltatva hely-specifikusan és kovalensen kapcsolunk egy poliol-maradékot a humán interfelon-B Cys -hez; és az így kapott poliol-interferon-B konjugátumot kinyerjük.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tiol-reaktív poliolreaktánsként tiol-reaktív PEG-ilező szert alkalmazunk.
  7. 7. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tiol-reaktív poliol reaktáns mono-metoxilezett.
  8. 8. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tiol-reaktív poliol reaktáns bifunkciós.
  9. 9. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tiol-reaktív poliol reaktáns egy poliolszármazék,
    - 30 amely ortopiridil-diszulfid, vinil-szulfon, maleimid és jódacetimid közül választott funkciós csoportot tartalmaz.
  10. 10. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti eljárás, ahol a tiolreaktív poliol reaktáns egy mono-metoxilezett poliol ortopiridil-diszulfid származéka.
  11. 11. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reagáltatást savas pH-η hajtjuk végre, ahol az interfon-B stabil.
  12. 12. Gyógyászati készítmény, amely hatóanyagként az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti poliol-interferon-B konjugátumot, és gyógyászatilag elfogadható hordozót, kötőanyagot vagy segédanyagot tartalmaz.
  13. 13. A 12. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amelynek hatékony mennyisége fertőzések, tumorok és autoimmun és gyulladásos betegségek kezelésére alkalmazható.
  14. 14. Eljárás polietilénglikol (PEG) maradékok sorozatos, lépésenként! kapcsolására egy polipeptidhez, azzal jellemezve, hogy egy polipeptidet egy
    W-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-X, általános képletű kis móltömegű heterobifunkciós vagy homobifunkciós PEG-maradékkal - ahol W és X jelentése egymástól függetlenül amin, szulfidril, karboxil vagy hidroxil funkciós csoportokkal reagáló csoport - reagáltatva a kis móltömegű PEG-maradékot a polipeptidhez kapcsoljuk; és a polipeptidhez kapcsolt kis móltömegű PEG-maradékot egy monofunkciós vagy bifunkciós PEG-maradékkal reagáltatva a monofunkciós vagy
    - 31 - C: ·· · ? ·::;
    «· · · · * ·* bifunkciós PEG-maradékot a kis móltömegű PEG-maradék szabad végéhez kapcsoljuk, és így PEG-polipeptid konjugátumot kapunk.
  15. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy
    Y-CH2CH2O(CH2CH2O)MCH2CH2-Z általános képletű monofunkciós vagy bifunkciós PEG-maradékot - ahol Y a polipeptidhez kapcsolt kis móltömegű PEG-maradék szabad végén lévén terminális csoporttal reagálni képes csoportot jelent, és Z jelentése -OCH3 vagy az X-szel reagálni képes csoport - alkalmazunk a bifunkciós konjugátum kialakítására.
  16. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy monofunkciós vagy bifunkciós PEG-maradékként metoxi-PEG-et, elágazó láncú PEG-et, hidrolítikusan vagy enzimatikusan lebontható PEG-et, függő PEG-et vagy dendrimer PEG-et alkalmazunk.
  17. 17. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy W és X jelentését egymástól függetlenül ortopiridil-diszulfid, maleimidek, vinilszulfonok, jódacetamidok, hidrazidok, aldehidek, szukcinimidil-észterek, epoxidok, aminok, tiolok, karbonsavak, aktív észterek, benzotriazol-karbonátok, p-nitrofenolkarbonátok, izocianátok és biotin közül választjuk.
  18. 18. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kis móltömegű PEG-maradék móltömege körülbelül 100-5000 Da.
  19. 19. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a monofunkciós vagy bifunkciós PEG-maradék móltömege körülbelül 100 Da - 200 kDa.
  20. 20. A 14. igénypont szerinti eljárás, ahol a kis móltömegű PEG-maradék és/vagy monofunkciós vagy bifunkciós PEG-maradék egy polietilénglikol kopolimer.
  21. 21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polietilénglikol kopolimert polietilénglikol/polipropilénglikol kopolimerek és polietilénglikol/poli(tejsav/glikolsav) kopolimerek közül választjuk.
  22. 22. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további lépésként tartalmazza a PEG-polipeptid konjugátum tisztítását a két PEG-maradék polipeptidhez sorozatos, lépésenként történő kapcsolása után.
  23. 23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tisztítást ioncserés kromatográfia, méret szerinti kizárásos kromatográfia, hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia, affinitási kromatográfia és fordított fázisú kromatográfia közül választott egy vagy több tisztítási módszerrel végezzük.
  24. 24. A 14-23. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptid az interferon-β.
  25. 25. A 14-23. igénypontok bármelyike szerint előállított PEG-polipeptid konjugátumok alkalmazása gyógyszerként.
    A meghatalmazott:
    danubia
    Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.
    dr. Kiss Ildikó szabadalmi ügyvivő
    Aktaszámunk: 93177-12247A Sí
HU0300548A 1998-04-28 1999-04-28 Polyol-ifn-betha conjugates HUP0300548A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8333998P 1998-04-28 1998-04-28
PCT/US1999/009161 WO1999055377A2 (en) 1998-04-28 1999-04-28 Polyol-ifn-beta conjugates

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUP0300548A2 true HUP0300548A2 (hu) 2003-06-28
HUP0300548A3 HUP0300548A3 (en) 2005-07-28

Family

ID=22177687

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0300548A HUP0300548A3 (en) 1998-04-28 1999-04-28 Polyol-ifn-betha conjugates

Country Status (30)

Country Link
US (3) US6638500B1 (hu)
EP (2) EP1075281B1 (hu)
JP (2) JP4574007B2 (hu)
KR (1) KR100622796B1 (hu)
CN (2) CN100335503C (hu)
AR (1) AR020070A1 (hu)
AT (2) ATE275422T1 (hu)
AU (1) AU762621B2 (hu)
BG (2) BG65046B1 (hu)
BR (1) BR9910023A (hu)
CA (2) CA2565375A1 (hu)
CY (1) CY1108022T1 (hu)
CZ (2) CZ298579B6 (hu)
DE (2) DE69920002T2 (hu)
DK (2) DK1075281T3 (hu)
EA (2) EA005495B1 (hu)
EE (1) EE05214B1 (hu)
ES (2) ES2224649T3 (hu)
HU (1) HUP0300548A3 (hu)
IL (1) IL139286A (hu)
NO (2) NO329749B1 (hu)
NZ (1) NZ507456A (hu)
PL (2) PL196533B1 (hu)
PT (2) PT1421956E (hu)
SI (2) SI1075281T1 (hu)
SK (2) SK286217B6 (hu)
TR (2) TR200101751T2 (hu)
TW (2) TWI266800B (hu)
UA (2) UA66857C2 (hu)
WO (1) WO1999055377A2 (hu)

Families Citing this family (82)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US7220717B2 (en) 1997-08-14 2007-05-22 Yeda Research And Development Company Ltd. Interleukin-18 binding proteins, their preparation and use
US7704944B2 (en) 1997-08-14 2010-04-27 Yeda Research And Development Company Ltd. Interleukin-18 binding proteins, their preparation and use for the treatment of sepsis
IL121860A0 (en) 1997-08-14 1998-02-22 Yeda Res & Dev Interleukin-18 binding proteins their preparation and use
BR9915548A (pt) 1998-10-16 2001-08-14 Biogen Inc Proteìnas de fusão de interferon-beta e usos
HU229888B1 (en) 1998-10-16 2014-11-28 Biogen Idec Ma Inc Cambridge Polymer conjugates of interferon betha-1a and uses
ATE340592T1 (de) * 1999-04-23 2006-10-15 Alza Corp Konjugate enthaltend eine spaltbare bindung zur anwendung in einem liposom
US7238368B2 (en) * 1999-04-23 2007-07-03 Alza Corporation Releasable linkage and compositions containing same
US7303760B2 (en) * 1999-04-23 2007-12-04 Alza Corporation Method for treating multi-drug resistant tumors
US7431921B2 (en) 1999-08-27 2008-10-07 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules
US6531122B1 (en) 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
US7144574B2 (en) 1999-08-27 2006-12-05 Maxygen Aps Interferon β variants and conjugates
TR200101086A3 (hu) * 1999-10-15 2001-08-21
AU2223401A (en) 1999-12-24 2001-07-09 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Branched polyalkylene glycols
KR100773323B1 (ko) 2000-01-10 2007-11-05 맥시겐 홀딩스 리미티드 지-씨에스에프 접합체
CA2739933A1 (en) 2000-02-11 2001-08-16 Bayer Healthcare Llc Factor vii or viia-like molecules
ATE471956T1 (de) * 2001-01-30 2010-07-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Verzweigte polyalkylenglykole
EP1234583A1 (en) * 2001-02-23 2002-08-28 F. Hoffmann-La Roche Ag PEG-conjugates of HGF-NK4
WO2002074806A2 (en) 2001-02-27 2002-09-26 Maxygen Aps New interferon beta-like molecules
EP1425304B9 (en) 2001-07-11 2010-09-08 Maxygen, Inc. G-csf conjugates
PT3025726T (pt) 2002-01-18 2020-01-09 Biogen Ma Inc Compostos do polímero polialquileno e utilizações dos mesmos
TWI334785B (en) 2002-06-03 2010-12-21 Serono Lab Use of recombinant ifn-β1a and pharmaceutical composition comprising recombinant ifn-β1a for the treatment of hcv infection in patients of asian race
AU2003254641A1 (en) * 2002-08-28 2004-03-19 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules for treatment of cancer
US8129330B2 (en) * 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
JP5207590B2 (ja) 2002-12-26 2013-06-12 マウンテン ビュー ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド 増強された生物学的能力を有するインターフェロン−βのポリマー結合体
GEP20084487B (en) * 2002-12-26 2008-09-25 Mountain View Pharmaceuticals Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof
CA2519873C (en) 2003-03-20 2012-12-18 Maxygen Holdings Ltd. Fvii or fviia variants
TWI272948B (en) 2003-05-01 2007-02-11 Ares Trading Sa HSA-free stabilized interferon liquid formulations
GB0316294D0 (en) * 2003-07-11 2003-08-13 Polytherics Ltd Conjugated biological molecules and their preparation
EP2641611A3 (en) 2003-10-17 2013-12-18 Novo Nordisk A/S Combination therapy
BRPI0507169A (pt) 2004-02-02 2007-06-26 Ambrx Inc polipeptìdeos do hormÈnio de crescimento humano modificados e seu usos
AU2008201682B2 (en) * 2004-02-02 2011-02-24 Ambrx, Inc. Modified human interferon polypeptides and their uses
EP1586334A1 (en) * 2004-04-15 2005-10-19 TRASTEC scpa G-CSF conjugates with peg
ZA200609412B (en) 2004-05-17 2008-07-30 Ares Trading Sa Hydrogel interferon formulations
JP4988562B2 (ja) 2004-06-01 2012-08-01 アレス トレーディング ソシエテ アノニム 安定化したインターフェロン液体製剤
CA2567309A1 (en) 2004-06-01 2005-12-15 Ares Trading S.A. Method of stabilizing proteins
TW200633718A (en) * 2004-12-16 2006-10-01 Applied Research Systems Treatment of hepatitis c in the asian population
US7851565B2 (en) † 2004-12-21 2010-12-14 Nektar Therapeutics Stabilized polymeric thiol reagents
BRPI0519430A2 (pt) 2004-12-22 2009-02-10 Ambrx Inc hormânio do crescimento humano modificado
EP1836316A4 (en) 2004-12-22 2009-07-22 Ambrx Inc PROCESS FOR EXPRESSION AND CLEANING OF RECOMBINANT HUMAN GROWTH HORMONE
CN103520735B (zh) * 2004-12-22 2015-11-25 Ambrx公司 包含非天然编码的氨基酸的人生长激素配方
ES2553160T3 (es) 2005-06-17 2015-12-04 Novo Nordisk Health Care Ag Reducción y derivatización selectivas de proteínas Factor VII transformadas por ingeniería que comprenden al menos una cisteína no nativa
US20070092482A1 (en) * 2005-08-04 2007-04-26 Bossard Mary J Conjugates of a G-CSF moiety and a polymer
WO2007022799A1 (en) 2005-08-26 2007-03-01 Ares Trading S.A. Process for the preparation of glycosylated interferon beta
EA013816B1 (ru) 2005-09-01 2010-08-30 Арес Трейдинг С.А. Лечение неврита зрительного нерва
US20070238656A1 (en) * 2006-04-10 2007-10-11 Eastman Kodak Company Functionalized poly(ethylene glycol)
JP5313129B2 (ja) * 2006-05-02 2013-10-09 アロザイン， インコーポレイテッド 非天然アミノ酸置換ポリペプチド
US20080096819A1 (en) * 2006-05-02 2008-04-24 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
KR20090013816A (ko) 2006-05-24 2009-02-05 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 연장된 생체내 반감기를 갖는 인자 ⅸ 유사체
WO2007135172A2 (en) 2006-05-24 2007-11-29 Laboratoires Serono S.A. Cladribine regimen for treating multiple sclerosis
US8114630B2 (en) 2007-05-02 2012-02-14 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
CA2707840A1 (en) 2007-08-20 2009-02-26 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
JP5563475B2 (ja) 2007-12-20 2014-07-30 メルク セローノ ソシエテ アノニム Ｐｅｇインターフェロン−ベータ製剤
MX344166B (es) 2008-02-08 2016-12-07 Ambrx Inc Leptina-polipeptidos modificados y sus usos.
CN101525381B (zh) * 2008-03-04 2012-04-18 北京百川飞虹生物科技有限公司 一种重组复合干扰素及其表达载体的构建和表达
WO2009155102A2 (en) * 2008-05-30 2009-12-23 Barofold, Inc. Method for derivatization of proteins using hydrostatic pressure
US20110124614A1 (en) * 2008-10-25 2011-05-26 Halina Offner Methods And Compositions For The Treatment of Autoimmune Disorders
DE102009032179A1 (de) * 2009-07-07 2011-01-13 Biogenerix Ag Verfahren zur Reinigung von Interferon beta
ES2365343B1 (es) 2009-11-19 2012-07-10 Fundación Centro Nacional De Investigaciones Cardiovasculares Carlos Iii Uso de cd98 como marcador de receptividad endometrial.
EP2536753B1 (en) 2010-02-16 2017-12-20 Novo Nordisk A/S Factor viii molecules with reduced vwf binding
ES2993140T3 (en) 2010-04-02 2024-12-23 Amunix Pharmaceuticals Inc Binding fusion proteins, binding fusion protein-drug conjugates, xten-drug conjugates and methods of making and using same
AR080993A1 (es) 2010-04-02 2012-05-30 Hanmi Holdings Co Ltd Formulacion de accion prolongada de interferon beta donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
WO2011143274A1 (en) 2010-05-10 2011-11-17 Perseid Therapeutics Polypeptide inhibitors of vla4
JP2013532176A (ja) 2010-07-15 2013-08-15 ノヴォ ノルディスク アー／エス 安定化させた第ｖｉｉｉ因子バリアント
JP6042335B2 (ja) 2010-09-15 2016-12-14 ノヴォ ノルディスク アー／エス 細胞取込みが低下した第ｖｉｉｉ因子変異体
KR101451357B1 (ko) * 2011-02-18 2014-10-15 주식회사 스템디알 Ｓｉｒｔ１ 발현 유도 물질을 포함하는 패혈증 또는 패혈증 쇼크의 예방 또는 치료용 조성물
RU2014103288A (ru) 2011-07-01 2015-08-10 Байер Интеллектчуал Проперти Гмбх Слитые полипептиды релаксина и их применение
DK2762489T3 (en) * 2011-10-01 2018-07-02 Glytech Inc GLYCOSYLED POLYPEPTIDE AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING SAME
JP6355563B2 (ja) 2012-02-27 2018-07-11 アムニクス オペレーティング インコーポレイテッド Ｘｔｅｎ共役組成物およびそれを製造する方法
MX2014010209A (es) 2012-02-29 2014-11-21 Toray Industries Agente inhibidor para acumulacion de fluido de la cavidad corporal.
SG11201507769SA (en) 2013-03-29 2015-10-29 Glytech Inc Polypeptide having sialylated sugar chains attached thereto
WO2016013697A1 (ko) * 2014-07-24 2016-01-28 에이비온 주식회사 인터페론-베타 변이체의 폴리에틸렌글리콜 배합체
KR101671501B1 (ko) * 2014-07-24 2016-11-03 에이비온 주식회사 페길화된 인터페론-베타 변이체
MX387205B (es) 2014-08-19 2025-03-18 Biogen Ma Inc Método de pegilación.
CN115919996A (zh) 2015-05-01 2023-04-07 雅利斯塔制药公司 用于治疗眼科疾病的脂联素拟肽
SMT202000633T1 (it) * 2015-06-19 2021-01-05 Eisai R&D Man Co Ltd Immunoglobuline coniugate a cys80
FI3998067T3 (fi) 2015-11-09 2024-10-31 Univ Colorado Regents Koostumukset ja menetelmät homokystinurian hoitoon
IL269544B2 (en) * 2017-04-17 2025-01-01 Univ Colorado Regents Streamlining enzyme replacement therapy for the treatment of high homocysteine
AR113906A1 (es) 2017-11-24 2020-06-24 Merck Patent Ges Mit Beschraenkter Haftung Régimen con cladribina para tratar formas progresivas de la esclerosis múltiple
BR112021012472A2 (pt) 2019-01-28 2021-11-30 Toray Industries Forma modificada por polietileno glicol de um fator de crescimento de hepatócito ou um fragmento ativo do mesmo, e, medicamento
JPWO2020158690A1 (ja) 2019-01-28 2021-12-16 東レ株式会社 肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体
BR112023003432A2 (pt) 2020-09-10 2023-03-21 Merck Patent Gmbh Regime de tratamento para o tratamento de doenças autoimunes

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5206344A (en) * 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
JP2524586B2 (ja) * 1985-06-26 1996-08-14 シタス コーポレイション ポリマ−接合を利用する医薬組成物用蛋白質の可溶化
US4917888A (en) 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5208344A (en) * 1987-07-31 1993-05-04 American Home Products Corporation Naphthalenepropionic acid derivatives as anti-inflammatory/antiallergic agents
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US5595732A (en) * 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
ATE214940T1 (de) 1993-11-10 2002-04-15 Enzon Inc Verbesserte interferon-polymerkonjugate
GEP20002180B (en) * 1994-03-31 2000-07-25 Amgen Inc Composition and Methods for Stimulating Megakaryocyte Growth and Differentiation
MX9605717A (es) * 1994-05-18 1998-05-31 Inhale Therapeutic Syst Metodos y composiciones para la formulacion de polvo seco de interferones.
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
SE9503380D0 (sv) * 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
TW517067B (en) * 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
US5851984A (en) * 1996-08-16 1998-12-22 Genentech, Inc. Method of enhancing proliferation or differentiation of hematopoietic stem cells using Wnt polypeptides
KR0176625B1 (ko) 1996-11-05 1999-04-01 삼성전자주식회사 적외선 물체검출장치
WO1998032466A1 (en) * 1997-01-29 1998-07-30 Polymasc Pharmaceuticals Plc Pegylation process
ES2297889T3 (es) * 1997-07-14 2008-05-01 Bolder Biotechnology, Inc. Derivados de hormona de crecimiento y proteinas relacionadas.
US6307024B1 (en) * 1999-03-09 2001-10-23 Zymogenetics, Inc. Cytokine zalpha11 Ligand
US6531122B1 (en) * 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
AU3767499A (en) 1999-11-16
SI1421956T1 (sl) 2007-10-31
EP1421956B1 (en) 2007-06-27
IL139286A (en) 2005-12-18
CN100335503C (zh) 2007-09-05
US20040043002A1 (en) 2004-03-04
WO1999055377A2 (en) 1999-11-04
AU762621B2 (en) 2003-07-03
UA66857C2 (uk) 2004-06-15
KR100622796B1 (ko) 2006-09-13
JP4574007B2 (ja) 2010-11-04
CY1108022T1 (el) 2013-09-04
PL196533B1 (pl) 2008-01-31
TWI266800B (en) 2006-11-21
DE69920002T2 (de) 2005-09-22
PT1075281E (pt) 2004-11-30
BG104871A (bg) 2001-07-31
CA2565375A1 (en) 1999-11-04
CN1637020A (zh) 2005-07-13
PL193352B1 (pl) 2007-02-28
NO332224B1 (no) 2012-07-30
ATE275422T1 (de) 2004-09-15
BR9910023A (pt) 2000-12-26
CN1187094C (zh) 2005-02-02
SK16222000A3 (sk) 2001-04-09
WO1999055377A9 (en) 2000-03-02
DE69920002D1 (de) 2004-10-14
CN1302209A (zh) 2001-07-04
EE200000614A (et) 2002-04-15
BG109291A (en) 2006-04-28
EP1421956A1 (en) 2004-05-26
US6638500B1 (en) 2003-10-28
NO20100324L (no) 2000-12-28
ATE365563T1 (de) 2007-07-15
EA200001111A1 (ru) 2001-04-23
EE05214B1 (et) 2009-10-15
EP1075281B1 (en) 2004-09-08
BG65046B1 (bg) 2007-01-31
PL344490A1 (en) 2001-11-05
NO329749B1 (no) 2010-12-13
TWI232882B (en) 2005-05-21
IL139286A0 (en) 2001-11-25
US7700314B2 (en) 2010-04-20
DE69936409D1 (de) 2007-08-09
DE69936409T2 (de) 2008-04-17
KR20010071158A (ko) 2001-07-28
PT1421956E (pt) 2007-07-13
SI1075281T1 (en) 2005-02-28
JP2002512983A (ja) 2002-05-08
HK1076115A1 (zh) 2006-01-06
EA003789B1 (ru) 2003-10-30
HK1038194A1 (zh) 2002-03-08
DK1421956T3 (da) 2007-10-01
HUP0300548A3 (en) 2005-07-28
WO1999055377A3 (en) 1999-12-29
EP1075281A2 (en) 2001-02-14
JP2010184929A (ja) 2010-08-26
EA200300382A1 (ru) 2005-02-24
ES2224649T3 (es) 2005-03-01
UA79430C2 (en) 2007-06-25
TR200101751T2 (tr) 2002-05-21
NO20005337L (no) 2000-12-28
CZ298597B6 (cs) 2007-11-21
NO20005337D0 (no) 2000-10-23
CZ20003995A3 (en) 2001-06-13
TR200003161T2 (tr) 2001-01-22
NZ507456A (en) 2003-10-31
BG64694B1 (bg) 2005-12-30
US20070141620A1 (en) 2007-06-21
CA2330451A1 (en) 1999-11-04
SK286654B6 (sk) 2009-03-05
EA005495B1 (ru) 2005-02-24
DK1075281T3 (da) 2005-01-03
AR020070A1 (es) 2002-04-10
US7357925B2 (en) 2008-04-15
ES2285286T3 (es) 2007-11-16
CZ298579B6 (cs) 2007-11-14
SK286217B6 (sk) 2008-05-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUP0300548A2 (hu) Poliol-ifn-béta konjugátumok
MXPA00010223A (en) Polyol-ifn-beta conjugates
HK1076115B (en) Polyol-ifn-beta conjugates
HK1038194B (en) Polyol-ifn-beta conjugates

Legal Events

Date Code Title Description
FA9A Lapse of provisional patent protection due to relinquishment or protection considered relinquished