ES2285286T3 - Procedimiento para la union por etapas de polietilenglicol (peg) a un polipeptido. - Google Patents
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Abstract
Un método para la unión por etapas de restos de polietilénglicol (PEG) en serie a un polipéptido, que comprende las etapas de: hacer reaccionar un polipéptido con un resto de PEG heterobifuncional u homobifuncional que tiene un peso molecular en el intervalo de 100 a 5.000 daltons y que tiene la siguiente fórmula: W - CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2 - X, en la que ¿W¿ y ¿X¿ son grupos que reaccionan independientemente con un grupo funcional amino, sulfhidrilo, carboxilo o hidroxilo para unir el resto de PEG de bajo peso molecular al polipéptido; y hacer reaccionar el resto de PEG de bajo peso molecular unido al polipéptido con un resto de PEG monofuncional o bifuncional que tiene un peso molecular en el intervalo de 100 daltons a 200 kilodaltons para unir el resto de PEG monofuncional o bifuncional a un extremo libre del resto de PEG de bajo peso molecular y formar un conjugado de PEG-polipéptido.
Description
Procedimiento para la unión por etapas de
polietilenglicol (PEG) a un polipéptido.
La presente invención se refiere a un método
para la unión por etapas de dos o más restos de PEG a un
polipéptido.
También se describen conjugados de
poliol-INF-\beta en los que una
unidad de poliol se une de forma covalente a Cys^{17} y el
proceso para su producción específica de sitio así como su uso en la
terapia, pronóstico o diagnóstico de infecciones bacterianas,
infecciones víricas, enfermedades autoinmunes y enfermedades
inflamatorias.
El interferón de fibroblasto humano
(IFN-\beta) tiene actividad antivírica y puede
estimular también las células asesinas naturales contra las células
neoplásicas. Es un polipéptido de aproximadamente 20.000 Da
inducido por virus y ARN bicatenario. A partir de la secuencia de
nucleótidos del gen del interferón de fibroblasto, clonado mediante
la tecnología del ADN recombinante, Derynk et al.
(Nature, 285:542-547, 1980) dedujeron la
secuencia completa de aminoácidos de la proteína. Tiene una longitud
de 166 aminoácidos.
Shepard et al. (Nature, 294
:563-565, 1981) describieron una mutación en la base
842 (Cys - Tyr en la posición 141) que suprimía su actividad
antivírica, y un clon variante con una deleción de los nucleótidos
1119-1121.
Mark et al. (Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A., 81(18):5662-5666, 1984)
insertaron una mutación artificial reemplazando la base 469 (T) por
(A) causando un cambio de aminoácidos de Cys - Ser en la posición
17. Se informó que el IFN-\beta resultante era
tan activo como el IFN-\beta "nativo" y
estable durante un almacenamiento prolongado (-70ºC).
La unión covalente del polímero hidrófilo
polietilénglicol, (PEG), también conocido como óxido de polietileno
(PEO, del Inglés "Polyethylene Oxide"), a moléculas tiene
aplicaciones importantes en biotecnología y medicina. En su forma
más común, el PEG es un polímero lineal que tiene grupos hidroxilo
en cada extremo:
HO-CH_{2}-CH_{2}O(CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}CH_{2}-OH
Esta fórmula se puede representar abreviadamente
como HO-PEG-OH, donde se supone que
-PEG- representa la cadena principal del polímero sin los grupos
terminales:
"-PEG-" quiere decir
``-CH_{2}-CH_{2}O(CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}CH_{2}-
El PEG se utiliza habitualmente como
metoxi-PEG-OH,
(m-PEG), en el cual un extremo es el grupo
relativamente inerte metoxi, mientras que el otro extremo es un
grupo hidroxilo que está sujeto a modificación química.
CH_{3}O-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-OH
Los PEGs ramificados son también de uso común.
Los PEGs ramificados se pueden representar como
R(-PEG-OH)_{m} en donde "R"
representa un resto central a modo de núcleo tal como pentaeritritol
o glicerol, y "m" representa el número de ramificaciones. El
número de ramificaciones (m) puede variar de tres a cien o más. Los
grupos hidroxilo están sujetos a modificación química.
Otra forma ramificada, tal como la descrita en
la Solicitud de Patente PCT WO 96/21469, tiene un único extremo que
está sujeto a modificación química. Este tipo de PEG se puede
representar como
(CH_{3}O-PEG-)_{p}R-X, en donde
"p" es igual a 2 ó 3, "R" representa un núcleo central tal
como lisina o glicerol, y "X" representa un grupo funcional
tal como carboxilo que está sujeto a activación química. Otra forma
ramificada más, el "PEG con colgaduras", tiene grupos
reactivos, tales como el carboxilo, a lo largo de la cadena
principal de PEG en lugar de en el extremo de las cadenas de
PEG.
Además de estas formas de PEG, el polímero se
puede preparar también con uniones débiles o degradables en la
cadena principal. Por ejemplo, Harris ha mostrado en la Solicitud de
Patente de EE.UU. 06/026.716 que se puede preparar PEG con uniones
éster en la cadena principal del polímero que están sujetas a
hidrólisis. Esta hidrólisis da como resultado la escisión del
polímero en fragmentos de peso molecular menor, de acuerdo con el
esquema de reacción:
-PEG-CO_{2}-PEG-
\ + \ H_{2}O \rightarrow -PEG-CO_{2}H +
HO-PEG-
\newpage
De acuerdo con la presente invención, el término
polietilénglicol o PEG se supone que comprende todos los derivados
anteriormente descritos.
Los copolímeros de óxido de etileno y óxido de
propileno están estrechamente relacionados con el PEG en su
química, y pueden utilizarse en lugar del PEG en muchas de sus
aplicaciones. Tienen la siguiente fórmula general:
HO-CH_{2}CHRO(CH_{2}CHRO)_{n}CH_{2}CHR-OH
en la que "R" es H o
CH_{3}.
El PEG es un polímero útil que tiene la
propiedad de alta solubilidad en agua así como alta solubilidad en
muchos disolventes orgánicos. El PEG es también no tóxico y no
inmunógeno. Cuando el PEG está unido químicamente (PEGilación) a un
compuesto insoluble en agua, el conjugado resultante generalmente es
soluble en agua, así como soluble en muchos disolventes
orgánicos.
Los conjugados de PEG-proteína
se están usando en la actualidad en las terapias de reemplazo de
proteína y para otros usos terapéuticos. Por ejemplo, la adenosina
desaminasa PEGilada (ADAGEN®) se está utilizando para tratar la
enfermedad de la inmunodeficiencia severa combinada (SCIDS, del
Inglés "Severe Combined Immunodeficiency Disease"), la
L-asparaginasa PEGilada (ONCAPSPAR®) se está
utilizando para tratar la leucemia linfoblástica aguda (ALL, del
Inglés "Acute Lymphoblastic Leukemia"), y el interferón
\alpha PEGilado (INTRON® A) está en ensayos clínicos de la Fase
III para tratar la hepatitis C.
Para una revisión general de los conjugados de
PEG-proteína con eficacia clínica véase N.L.
Burnham, Am. J. Hosp. Pharm., 15:210-218,
1994.
Se han desarrollado diversidad de métodos para
PEGilar proteínas.
Por ejemplo, Goodson R. J. et al.,
Bio/Technology, Vol. 8, Nº 4, 1 de Abril de 1990, páginas
343-346, describen la PEGilación dirigida a sitio
de interleuquina-2 recombinante en su sitio de
glicosilación.
Además, el documento WO 98/32466 A se refiere a
un proceso para la PEGilación covalente directa de un substrato,
que comprende la reacción de un PEG halogenado con el substrato en
el que el halógeno del PEG halogenado actúa como un grupo saliente
en la reacción de PEGilación.
Además, el documento WO 97/11957 A describe
conjugados de un polipéptido y un polímero biocompatible,
particularmente el factor VIII con una alta actividad específica
usando óxido de monometoxi polialquileno (mPEG) como polímero
biocompatible; y el documento EP 0 690 127 A se refiere a un
polipéptido de MGDF monopegilado.
La unión de PEG a grupos reactivos que se hallan
en la proteína se realiza generalmente utilizando derivados de PEG
activados electrofílicamente. La unión del PEG a los grupos \alpha
y \varepsilon-amino que se hallan en los residuos
de lisina y al extremo N da como resultado un conjugado que consiste
en una mezcla de productos.
Generalmente, tales conjugados consisten en una
población de las varias moléculas de PEG unidas por molécula de
proteína ("PEGmeros") que varían de cero al número de grupos
amino de la proteína. En el caso de una molécula proteica que se ha
modificado en un único punto, la unidad de PEG se puede unir a
numerosos sitios amino diferentes.
Este tipo de PEGilación inespecífica ha dado
como resultado numerosos conjugados que se vuelven casi inactivos.
La reducción de la actividad está causada generalmente por el
apantallamiento del dominio de unión activo de la proteína, como es
el caso con muchas citoquinas y anticuerpos. Por ejemplo, Katre
et al. en la Patente de EE.UU. 4.766.106 y la Patente de
EE.UU. 4.917.888 describen la PEGilación de
IFN-\beta e IL-2 con un gran
exceso de glutarato de metoxi-polietilenglicolilo
N-succinimidilo y succinato de
metoxi-polietilenglicolilo
N-succinimidilo. Ambas proteínas se produjeron en
células microbianas hospedadoras, lo que permitió la mutación
específica de sitio de la cisteína libre a una serina. La mutación
era necesaria en la expresión microbiana del
IFN-\beta para facilitar el plegamiento de la
proteína. En particular, el IFN-\beta utilizado en
estos experimentos es el producto comercial Betaseron®, en el que
el residuo Cys^{17} se reemplaza por una serina. Además, la
ausencia de glicosilación redujo su solubilidad en disolución
acuosa. La PEGilación inespecífica dio como resultado un incremento
en la solubilidad, pero un problema principal era el reducido nivel
de actividad y rendimiento.
La Solicitud de Patente Europea
EP-593.868, titulada
"PEG-Interferon Conjugates", describe la
preparación de conjugados de
PEG-IFN-\alpha. Sin embargo, la
reacción de PEGilación no es específica de sitio y, por lo tanto,
se obtiene una mezcla de isómeros posicionales de conjugados de
PEG-IFN-\alpha (véase también
Monkarsh et al., ACS Symp. Ser.,
680:207-216, 1997).
Kinstler et al. en la Solicitud de
Patente Europea EP-675.201 demostraron la
modificación selectiva del residuo N-terminal del
factor de crecimiento y desarrollo de megacariocitos (MGDF, del
Inglés "Megakaryocyte Growth and Development Factor") con
mPEG-propionaldehído. Esto permitió una PEGilación y
farmacocinética reproducibles entre lote y lote. Gilbert et
al. en la Patente de EE.UU. 5.711.944 demostraron que se podía
producir la PEGilación de IFN-\alpha con un nivel
óptimo de actividad. En este caso se necesitó una etapa laboriosa
de purificación para obtener el conjugado óptimo.
La mayoría de las citoquinas, así como otras
proteínas, no poseen un sitio de unión específico para PEG y, a
parte de los ejemplos anteriormente mencionados, es muy probable que
algunos de los isómeros producidos a través de la reacción de
PEGilación sean parcial o totalmente inactivos, causando así una
pérdida de actividad de la mezcla final.
La mono-PEGilación específica de
sitio es así un objetivo deseable en la preparación de tales
conjugados proteicos.
Woghiren et al. en Bioconjugate
Chem., 4(5):314-318, 1993, sintetizaron
un derivado de PEG selectivo a tiol para tal PEGilación específica
de sitio. Se demostró que un derivado estable de PEG protegido con
tiol en forma de un grupo reactivo de disulfuro de parapiridilo se
conjugaba específicamente con la cisteína libre de la proteína, la
papaína. El enlace disulfuro recién formado entre la papaína y el
PEG se podría escindir bajo condiciones reductoras moderadas para
regenerar la proteína nativa.
La presente invención proporciona un método para
la unión por etapas de restos de PEG en serie a un polipéptido, que
comprende las etapas de:
hacer reaccionar un polipéptido con un resto de
PEG heterobifuncional u homobifuncional que tiene un peso molecular
en el intervalo de 100 a 5.000 daltons y que tiene la siguiente
fórmula:
W-CH_{2}CH_{2}O(CH_{2}CH_{2}O)nCH_{2}CH_{2}-X,
en la que "W" y "X" son
grupos que reaccionan independientemente con un grupo funcional
amino, sulfhidrilo, carboxilo o hidroxilo para unir el resto de PEG
de bajo peso molecular al polipéptido;
y
hacer reaccionar el resto de PEG de bajo peso
molecular unido al polipéptido con un resto de PEG monofuncional o
bifuncional que tiene un peso molecular en el intervalo de 100
daltons a 200 kilodaltons para unir el resto de PEG monofuncional o
bifuncional a un extremo libre del resto de PEG de bajo peso
molecular y formar un conjugado de
PEG-polipéptido.
También se describen conjugados de
poliol-IFN-\beta, y
particularmente conjugados de
PEG-IFN-\beta, en los que una
unidad de poliol está unida de forma covalente a Cys^{17}. La
conjugación específica se obtiene dejando que un agente de poliol
reactivo con tiol reaccione con el residuo Cys^{17} del
IFN-\beta. Es de esperar que tales conjugados
muestren una eficacia incrementada in vivo. El objetivo es
obtener un incremento en la solubilidad a pH neutro, un incremento
en la estabilidad (disminución de la agregación), disminución de la
inmunogenicidad y ninguna pérdida de actividad con respecto al
IFN-\beta "nativo". Los resultados de tal
conjugación disminuirían el número de dosis para un efecto previsto,
simplificarían y estabilizarían la formulación de una composición
farmacéutica y posiblemente incrementarían la eficacia
prolongada.
La Figura 1 muestra el gráfico de Electroforesis
Capilar (EC) del conjugado de
PEG-IFN-\beta antes de la
purificación.
Las Figuras 2A-2C muestran la
purificación del conjugado de
PEG-IFN-\beta llevada a cabo
mediante cromatografía de exclusión por tamaño (Superosa 12): Fig.
2A - primer pase; Fig. 2B - segundo pase; Fig. 2C - tercer
pase.
La Figura 3 muestra la cromatografía
SDS-PAGE del conjugado purificado de
PEG-IFN-\beta del tercer pase de
la cromatografía. Los carriles 1 y 4 son patrones proteicos de peso
molecular, el carril 2 es IFN-\beta
"nativo", y el carril 3 es conjugado de
PEG-IFN-\beta.
La Figura 4 representa el gráfico de
Electroforesis Capilar (EC) del conjugado purificado de
PEG-IFN-\beta en el que el
IFN-\beta está PEGilado con
mPEG-OPSS_{5k}.
La Figura 5 representa el espectro de
MALDI-MS del conjugado purificado de
PEG-IFN-\beta.
La Figura 6 muestra una comparación entre la
actividad antivírica del IFN-\beta "nativo" y
el conjugado de PEG-IFN-\beta. Se
incubaron células WISH con las concentraciones indicadas de muestras
de IFN-\beta durante 24 horas antes de someterlas
a dosis citopáticas de virus de la estomatitis vesicular. El efecto
citopático se determinó después de 48 horas adicionales mediante
conversión de MTT.
La Figura 7 muestra el perfil de unión de
IFN-\beta y PEG-IFN en células
Daudi.
La Figura 8 muestra el perfil farmocinético del
IFN-\beta y el PEG-IFN en ratones
tras la administración intravenosa. Las líneas discontinuas indican
el LOQ (límite de cuantificación) del ensayo para cada curva
patrón.
La Figura 9 muestra el perfil farmocinético del
IFN-\beta y el PEG-IFN en ratones
tras la administración subcutánea. Las líneas discontinuas indican
el LOQ (límite de cuantificación) del ensayo para cada curva
patrón.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que la unión de un resto poliol, más
específicamente un resto de PEG, al residuo Cys^{17} del
IFN-\beta humano incrementaba de forma inesperada
(o al menos retenía y no daba como resultado una disminución de) la
actividad biológica del IFN-\beta respecto a la
del interferón-\beta humano nativo. Así, no sólo
el IFN-\beta con un resto poliol unido al residuo
Cys^{17} presenta la misma actividad biológica del
IFN-\beta o incrementada sino que este conjugado
de poliol-IFN-\beta proporciona
también las propiedades deseables conferidas por el resto poliol,
tales como un incremento en la solubilidad.
"IFN-\beta", tal como se
utiliza en la presente memoria, quiere decir interferón de
fibroblasto humano, obtenido por aislamiento a partir de fluidos
biológicos u obtenido por técnicas de ADN recombinante de células
hospedadoras procariotas o eucariotas así como sus sales, derivados
funcionales, precursores y fracciones activas, siempre y cuando
contengan el residuo de cisteína que aparece en la posición 17 en la
forma presente en la naturaleza.
El resto poliol del conjugado de
poliol-IFN-\beta puede ser
cualquier poli(óxido de alquileno) mono o bifuncional, soluble en
agua, que tenga una cadena lineal o ramificada. Generalmente, el
poliol es un poli(alquilénglicol) tal como
poli(etilénglicol) (PEG). Sin embargo, los expertos en la
técnica reconocerán que se pueden utilizar de forma adecuada otros
polioles, tales como, por ejemplo, poli(propilénglicol) y
copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "resto de PEG" se pretende que incluya, pero no se
limita a, PEG lineal y ramificado, metoxi-PEG, PEG
degradable hidrolítica o enzimáticamente, PEG con colgaduras, PEG
dendrimérico, copolímeros de PEG y uno o más polioles y copolímeros
de PEG y PLGA (poli(ácido láctico/glicólico)).
La definición de "sales" tal como se
utiliza en la presente memoria se refiere tanto a sales de los
grupos carboxilo como a las sales de las funciones amino de los
compuestos obtenibles mediante métodos conocidos. Las sales de los
grupos carboxilo incluyen sales inorgánicas como, por ejemplo, sales
de sodio, potasio, calcio y sales con bases orgánicas como las
formadas con una amino como trietanolamina, arginina o lisina. Las
sales de los grupos amino incluyen, por ejemplo, sales con ácidos
inorgánicos como el ácido clorhídrico y con ácidos orgánicos como
el ácido acético.
La definición de "derivados funcionales"
tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a derivados
que se pueden preparar a partir de grupos funcionales presentes en
las cadenas laterales de los restos de aminoácidos o en los grupos
N- o C-terminales de acuerdo con métodos conocidos y
están incluidos en la presente invención cuando son
farmacéuticamente aceptables, es decir, cuando no destruyen la
actividad de la proteína o no transmiten toxicidad a las
composiciones farmacéuticas que los contienen. Tales derivados
incluyen, por ejemplo, ésteres o amidas alifáticas de los grupos
carboxilo y derivados N-acilo de grupos amino libres
o derivados O-acilo de grupos hidroxilo libres y se
forman con grupos acilo como, por ejemplo, grupos alcanoílo o
aroílo.
Los "precursores" son compuestos que se
convierten en IFN-\beta en el cuerpo humano o de
animales.
Como "fracciones activas" de la proteína,
la presente invención se refiere a cualquier fragmento o precursor
de la cadena polipeptídica del mismo compuesto, solo o en
combinación con moléculas relacionadas o residuos unidos a él, por
ejemplo, residuos de azúcares o fosfatos, o agregados de la molécula
polipeptídica cuando tales fragmentos o precursores muestran la
misma actividad del IFN-\beta como
medicamento.
Un conjugado de PEG-polipéptido
se puede preparar mediante cualquiera de los métodos conocidos en la
técnica. De acuerdo con una realización de la invención, se hace
reaccionar IFN-\beta con el agente PEGilante en
un disolvente adecuado y el conjugado deseado se aísla y purifica,
por ejemplo, aplicando uno o más métodos cromatográficos.
"Método cromatográfico" quiere decir
cualquier técnica que se utilice para separar los componentes de una
mezcla mediante su aplicación sobre un soporte (fase estacionaria)
a través del cual fluye un disolvente (fase móvil). Los principios
de separación de la cromatografía se basan en la diferente
naturaleza física de la fase estacionaria y móvil.
Algunos tipos concretos de métodos
cromatográficos, que son bien conocidos en la bibliografía,
incluyen: cromatografía líquida, líquida de alta presión, de
intercambio iónico, de absorción, de afinidad, de reparto,
hidrófoba, en fase inversa, de filtración en gel, de
ultrafiltración o de capa fina.
El "agente PEGilante reactivo con tiol",
tal como se utiliza en la presente solicitud, quiere decir cualquier
derivado de PEG que es capaz de reaccionar con el grupo tiol del
residuo de cisteína. Puede ser, por ejemplo, PEG que contenga un
grupo funcional tal como disulfuro de ortopiridilo, vinilsulfona,
maleimida, yodoacetimida y otros. De acuerdo con una realización
preferida de la presente invención, el agente PEGilante reactivo con
tiol es el derivado disulfuro de ortopiridilo (OPSS) del PEG.
El agente PEGilante se utiliza en su forma
monometoxilada en la que sólo un extremo está disponible para la
conjugación, o en una forma bifuncional en la que ambos extremos
están disponibles para la conjugación, tal como, por ejemplo, para
formar un conjugado con dos IFN-\beta unidos de
forma covalente a un único resto de PEG. Preferiblemente tiene un
peso molecular entre 500 y 100.000.
A continuación, se presenta un esquema típico de
reacción para la preparación de un conjugado de
PEG-polipéptido:
La segunda línea del esquema anterior representa
un método para escindir la unión PEG-proteína. El
derivado de mPEG-OPSS es altamente selectivo para
los grupos sulfhidrilo libres y reacciona rápidamente bajo
condiciones de pH ácido en las que el IFN-\beta
es estable. La alta selectividad se puede demostrar a partir de la
reducción del conjugado hasta la forma nativa del
IFN-\beta y PEG.
Se ha demostrado que el enlace disulfuro que se
produce entre la proteína y los restos de PEG es estable en la
circulación, pero se puede reducir al penetrar en el ambiente de la
célula. Por lo tanto, se espera que este conjugado, el cual no
penetra en la célula, será estable en la circulación hasta que se
purifique.
Se debería notar que la reacción anterior es
específica de sitio porque los otros dos residuos de Cys que
aparecen en las posiciones 31 y 141 de la forma presente en la
naturaleza de IFN-\beta humano no reaccionan con
el agente PEGilante reactivo con tiol puesto que forman un puente
disulfuro.
La presente invención está dirigida a un método
para la unión por etapas de dos o más restos de PEG a un
polipéptido. Este método se basa en el reconocimiento de que un PEG
activado de bajo peso molecular reacciona más completamente con un
sitio de reacción impedido estéricamente de una proteína que como lo
hace un PEG activado de alto peso molecular. La modificación con
PEG de proteínas terapéuticas caras debe ser eficaz desde el punto
de vista de los costes con el fin de que la producción del
conjugado de PEG sea práctica. Además, con el fin de reducir la
filtración glomerular y optimizar las propiedades farmacológicas del
conjugado de PEG-proteína, el conjugado debería
tener un tamaño eficaz equivalente al de una proteína con un peso
molecular de 70 kDa. Esto quiere decir que en el caso de una
modificación específica de sitio donde se unirá un PEG, se une
preferiblemente un derivado de PEG que tiene un peso molecular
mayor que 20 kDa. Si el sitio de modificación está estéricamente
muy ocupado, el grupo reactivo del gran resto de PEG puede tener
dificultades para alcanzar el sitio de modificación y así dará
lugar a rendimientos bajos. Un método preferido de PEGilación de un
polipéptido de acuerdo con la presente invención incrementa el
rendimiento de la PEGilación específica de sitio uniendo primero un
resto de PEG pequeño hetero u homobifuncional que, debido a su
tamaño relativamente más pequeño, puede reaccionar con sitios
estéricamente muy ocupados. La posterior unión de un derivado de PEG
de peso molecular grande al PEG pequeño da como resultado un alto
rendimiento de la proteína PEGilada deseada.
El método para la unión por etapas de dos o más
restos de PEG en serie a un polipéptido de acuerdo con la presente
invención incluye unir primero un resto de PEG heterobifuncional u
homobifuncional de bajo peso molecular al polipéptido y, a
continuación, unir un resto de PEG monofuncional o bifuncional al
extremo libre del resto de PEG de bajo peso molecular que está
unido al polipéptido. Tras la unión por etapas de dos o más restos
de PEG en serie a un polipéptido, siendo preferiblemente dicho
polipéptido IFN-\beta y donde Cys^{17},
localizada en un sitio estéricamente muy ocupado, es el sitio
preferido de unión del PEG, el conjugado de
PEG-polipéptido se puede purificar utilizando una o
más de las técnicas de purificación tales como cromatografía de
intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño,
cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad y
cromatografía en fase inversa.
El resto de PEG de bajo peso molecular tiene la
fórmula:
W-CH_{2}CH_{2}O(CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}CH_{2}-X,
en la que "W" y "X" son
grupos que reaccionan independientemente con un grupo funcional
amino, sulfhidrilo, carboxilo o hidroxilo para unir el resto de PEG
de bajo peso molecular al polipéptido. Preferiblemente "W" y
"X" se seleccionan independientemente entre disulfuro de
ortopiridilo, maleimidas, vinilsulfonas, yodoacetamidas, aminas,
tioles, carboxilos, ésteres activos, carbonatos de benzotriazol,
carbonatos de p-nitrofenol, isocianatos y biotina.
El resto de PEG de bajo peso molecular tiene un peso molecular en el
intervalo de aproximadamente 100 a 5.000
daltons.
El resto de PEG monofuncional o bifuncional para
la unión al extremo libre de un PEG de bajo peso molecular que está
unido al polipéptido tiene un peso molecular en el intervalo de
aproximadamente 100 daltons a 200 kDa y es preferiblemente un
metoxi-PEG, PEG ramificado, PEG degradable
hidrolítica o enzimáticamente, PEG con colgaduras o PEG
dendrimérico. El PEG monofuncional o bifuncional tiene además la
fórmula:
Y-CH_{2}CH_{2}O(CH_{2}CH_{2}O)_{M}CH_{2}CH_{2}-Z,
en la que "Y" es reactivo con
un grupo terminal del extremo libre del resto de PEG de bajo peso
molecular que está unido al polipéptido y "Z" es -OCH_{3} o
un grupo reactivo con él para formar un conjugado
bifuncional.
El conjugado de PEG-polipéptido
producido por el método anterior para la unión por etapas de dos o
más restos de PEG se puede utilizar para producir una composición
farmacéutica o medicamento para tratar enfermedades o trastornos
para los que el polipéptido es eficaz como ingrediente activo. Este
uso no es parte de la invención.
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar los conjugados en una forma sustancialmente purificada
con el fin de que sean adecuados para su uso en composiciones
farmacéuticas, como ingrediente activo para el tratamiento,
diagnóstico o pronóstico de infecciones bacterianas y víricas así
como de enfermedades autoinmunes, inflamatorias y tumores.
Los ejemplos de las enfermedades anteriormente
mencionadas incluyen: choque séptico, SIDA, artritis reumatoide,
lupus eritematoso y esclerosis múltiple.
Las realizaciones y ventajas adicionales de la
invención serán evidentes en la siguiente descripción.
Aunque no sea parte de la invención, además se
describe la administración de una cantidad farmacológicamente
activa de los conjugados obtenidos de acuerdo con la invención a
sujetos en riesgo de desarrollar una de las enfermedades
anteriormente citadas o a sujetos que muestren ya tales
patologías.
Se puede utilizar cualquier ruta de
administración compatible con el principio activo. Se prefiere la
administración parenteral, tal como la inyección subcutánea,
intramuscular o intravenosa. La dosis del ingrediente activo a
administrar depende en base de las prescripciones médicas de acuerdo
con la edad, el peso y la respuesta individual del paciente.
La dosificación puede estar entre 10 \mug y 1
mg diario para un peso corporal medio de 75 kg, y la dosis diaria
preferible está entre 20 \mug y 200 \mug.
La composición farmacéutica para la
administración parenteral se puede preparar en una forma inyectable
que comprende el principio activo y un vehículo adecuado. Los
vehículos para la administración parenteral son bien conocidos en
la técnica e incluyen, por ejemplo, agua, disolución salina,
solución de Ringer y/o dextrosa. El vehículo puede contener
pequeñas cantidades de excipientes para mantener la estabilidad y la
isotonicidad de la preparación farmacéutica. La preparación de las
disoluciones se puede llevar a cabo de acuerdo con las modalidades
ordinarias.
Se ha descrito la presente invención en
referencia a las realizaciones específicas, pero el contenido de la
descripción comprende todas las modificaciones y sustituciones que
se puedan hacer por un experto en la técnica sin extenderse más
allá del significado y el propósito de las reivindicaciones.
A continuación, se describirá la invención por
medio de los siguientes Ejemplos.
Ejemplo
1
Se utilizó IFN-\beta
recombinante humano, estable a una concentración de 0,37 mg/ml en
tampón de acetato sódico 50 mM, pH 3,6, para la preparación de un
conjugado de PEG-IFN-\beta. Se
añadió aproximadamente 1,0 ml de urea 6 M a 2 ml de
IFN-\beta a una concentración de 0,37 mg/ml (0,74
mg, 3,7 x 10^{-8} moles). Se añadió
mPEG_{5K}-OPSS en un exceso molar de 50 moles por
mol de IFN-\beta y se dejó que los dos
reaccionaran en un vial de polipropileno durante o bien 2 horas a
37ºC o 1 hora a 50ºC. La mezcla de reacción se analizó con un
gráfico de Electroforesis Capilar (EC) para determinar el grado de
formación de conjugado de
PEG-IFN-\beta mediante la
reacción de PEGilación antes de cualquier purificación (Fig. 1). Un
rendimiento típico de esta reacción es del 50% de
PEG-IFN-\beta. Los productos de la
reacción se filtraron a partir de la mezcla de reacción con un
filtro de jeringa de 0,22 mm y, a continuación, se cargó la
disolución filtrada en una columna de exclusión por tamaño (o bien
de Superosa 12 o de Superdex 75, Pharmacia) y se eluyeron con un
tampón de fosfato sódico 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0. La Fig. 2A
muestra el perfil de elución de la purificación del conjugado de
PEG-IFN-\beta en una columna de
cromatografía de exclusión por tamaño de Superosa 12. Se recogieron
los picos y se analizaron con SDS-PAGE (Fig. 3). Se
juntaron las fracciones que contenían el conjugado de
PEG-IFN-\beta y, a continuación,
se cargó de nuevo el concentrado en la misma columna de exclusión
por tamaño para purificar más el conjugado de
PEG-IFN-\beta debido a la estrecha
proximidad del pico del IFN-\beta "nativo"
(Fig. 2B). Este procedimiento se repitió (tercer pase) para asegurar
la pureza (Fig. 2C). La Fig. 4 y la Fig. 5 muestran el gráfico de
la Electroforesis Capilar y el espectro de MALDI-MS,
respectivamente, del conjugado purificado de
PEG-IFN-\beta.
Se proporcionó IFN-\beta
humano recombinante estable en disolución a 0,36 mg/ml en tampón de
acetato sódico 50 mM, pH 3,6. Se añadieron aproximadamente 36 mg de
mPEG_{30K}-OPSS en 3 ml de H_{2}O desionizada a
3 ml de IFN-\beta a 0,36 mg/ml (1,08 mg, 4,9 x
10^{-8} moles) y se dejó que los dos reaccionaran en un vial de
polipropileno durante 2 horas a 50ºC. Se analizó el grado de
modificación en la mezcla de reacción con electroforesis capilar.
Los rendimientos típicos de esta reacción son <30%. A
continuación, se cargó, la disolución en una columna de exclusión
por tamaño (Superosa 12, Pharmacia) y se eluyó con un tampón de
fosfato sódico 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0. Se recogieron los picos
y se analizaron sus contenidos con SDS-PAGE.
Ejemplo
2
Para evaluar los efectos de la PEGilación sobre
la actividad antivírica del IFN-\beta humano
recombinante, se preincubaron células amnióticas humanas WISH o
bien con IFN-\beta de reciente preparación (mismo
lote que el utilizado para la PEGilación) o con el conjugado de
PEG-IFN-\beta. La actividad
antivírica mediada por el IFN-\beta, tal como la
medida mediante el ensayo de citopaticidad WISH-VSV,
se determinó de acuerdo con un bioensayo antivírico de WISH
desarrollado basándose en el protocolo de Novick et al.,
J. Immunol., 129:2244-2247 (1982). Los
materiales utilizados en este ensayo WISH son los siguientes:
Células WISH (ATCC CCL 25)
Reservas de Virus de Estomatitis Vesicular (ATCC
V-520-001-522),
almacenadas a -70ºC.
IFN-\beta, recombinante
humano, InterPharm Laboratories LTD (tipo 32.075, lote nº 205035),
82 x 10^{6} UI/ml, actividad específica: 222 x 10^{6} UI/mg
Conjugado de
PEG-IFN-\beta tal como el
preparado en el Ejemplo 1 y mantenido en PBS, pH 7,4
Medio de crecimiento de WISH (MEM con alta
glucosa con sales de Earls + 10% FBS + 1,0%
L-glutamina + Penicilina/Estreptomicina (100 U/ml,
100 \mug/ml)
Medio del ensayo WISH (MEM con alta glucosa con
sales de Earls + 5% FBS + 1,0% L-glutamina +
Penicilina/Estreptomicina (100 U/ml, 100 \mug/ml)
MTT a 5 mg/ml en PBS, almacenado a menos
70ºC.
El protocolo del ensayo WISH es el
siguiente:
Diluir las muestras de
IFN-\beta hasta 2X la concentración de partida en
medio de ensayo de WISH.
Realizar tres veces diluciones de muestras de
IFN-\beta en medio de ensayo de WISH en placas de
96 pocillos de fondo plano de forma que cada pocillo contenga 50
\mul de muestra diluida de IFN-\beta (algunos
pocillos de control reciben sólo 50 \mul de medio de ensayo de
WISH).
Recolectar células WISH en fase logarítmica de
crecimiento con una disolución de tripsina/EDTA, lavar con medio de
ensayo de WISH y llevar a una concentración final de 0,8 x 10^{6}
células/ml.
Añadir 50 \mul de suspensión de células WISH
(4 x 10^{4} células por pocillo) a cada pocillo. La concentración
final de IFN-\beta expuesto a las células es ahora
1X.
Después de la incubación durante 24 horas en un
incubador humidificado con CO_{2} al 5%, se añade 50 \mul de
una dilución 1:10 (en medio de ensayo de WISH) de reservas de VSV
(una dosis predeterminada para producir la lisis del 100 por cien
de las células WISH en 48 horas) a todos los pocillos excepto a los
pocillos de control sin virus (estos reciben sólo un volumen igual
del medio de ensayo).
Después de 48 horas adicionales, se añade 25
\mul de disolución con MTT a todos los pocillos, después de lo
cual se incuban las placas durante 2 horas adicionales en un
incubador.
Se retiran los contenidos de los pocillos por
inversión de placa, y se añaden a los pocillos 200 \mul de etanol
al 100%.
Después de una hora, se leen las placas a 595 nm
utilizando el paquete de programa informático Soft max Pro y el
sistema de espectrofotómetro Spectramax (Molecular Devices).
Tal como se demuestra en la Fig. 6 y en la Tabla
1 anterior, el conjugado de
PEG-IFN-\beta mantuvo un nivel de
actividad antivírica superior a la del lote precursor de reciente
preparación de IFN-\beta. La observación de que
el conjugado de PEG-IFN-\beta
tiene una bioactividad aproximadamente 4 veces mayor que la del
IFN-\beta de reciente preparación puede ser
también una consecuencia del incremento en la estabilidad del
conjugado de PEG-IFN-\beta con
respecto al IFN-\beta "nativo" después de la
adición del medio de ensayo de las células WISH.
Ejemplo
3
Se determinó la bioactividad relativa del
PEG[30 kD]-IFN-\beta y
PEG[2 x 20 kD]-IFN-\beta
mediante un ensayo WISH utilizando el protocolo normalizado
descrito en el Ejemplo 2 (Tabla 2). Se realizaron tres ensayos
independientes por tres individuos diferentes en momentos
separados.
\vskip1.000000\baselineskip
La unión del
PEG-IFN-\beta a su receptor en las
células se evaluó en presencia de una cantidad fija de
^{125}I-IFN-\alpha2a. El
IFN-\alpha2a se marcó radiactivamente con
^{125}I utilizando el método de la cloramina T. El IFN\alpha2a
unido a ^{125}I se separó del yodo libre haciendo correr los
reactivos a través de una columna de Sephadex G25 y juntando las
fracciones que contenían proteína (Pharmacia). El
^{125}I-IFN-\alpha2a se
cuantificó mediante un ensayo ELISA del
IFN-\alpha2a (Biosource, EE.UU.) y se determinó la
actividad específica. Se recolectaron células Daudi crecidas en la
fase exponencial de crecimiento y se incubaron 2 x 10^{6} células
con ^{125}I-IFN-\alpha2a 0,5 nM
durante 3 horas a temperatura ambiente en presencia de diferentes
concentraciones de PEG-IFN-\beta
o IFN-\alpha2a diluidas en un tampón de ensayo el
cual era RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal al 2% y azida
sódica al 0,1%. Al final de la incubación, se centrifugaron las
células a través de una capa de aceite de ftalato y se contó la
radiactividad unida a célula en el contador gamma. Además, la unión
del PEG[30 kD]-IFN-\beta y
el PEG[2 x 20 kD]-IFN-\beta
al receptor fue muy similar o próxima a la actividad de unión del
IFN-\beta tal como se muestra en la Fig. 7.
\newpage
Además, se determinó la actividad relativa en un
ensayo antiproliferación de células Daudi (linfoma de células B
humanas) (Tabla 3). Se prepararon todos los IFNs a una concentración
2x de 200 ng/ml. Las muestras se diluyeron tres veces bajo la
extensión de la placa a un volumen final de 100 \mul. Se añadieron
a cada pocillo 1 x 10^{5} células /pocillo (100 \mul) y se
incubaron durante un total de 72 horas a 37ºC en un incubador
humidificado con CO_{2}. Después de 48 horas, se añadió timidina
tritiada (^{3}H) a 1 \muCi/pocillo en 20 \mul. Al final de la
incubación de 72 horas, se procedió a la recolección en la placa con
el Recolector de Placas Tomtek. Los resultados mostrados en la
Tabla 3 indican que no se observó ninguna pérdida detectable de
actividad del IFN procedente a partir de la PEGilación. De hecho, se
encontró que la actividad era algo mayor que la del
IFN-\beta libre. Esto se puede deber a la
formación de agregados inactivos en el IFN libre o a las
diferencias en los métodos de cuantificación (análisis de
aminoácidos en el caso de las muestras de PEG-IFN y
RP-HPLC en el caso del
IFN-\beta).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se inyectaron a ratones 100 ng de
IFN-\beta, PEG[30
kD]-IFN-\beta o PEG[2 x 20
kD]-IFN-\beta y, a continuación,
se extrajo sangre en los tiempos indicados. Se determinaron las
concentraciones de IFN-\beta en suero mediante
ELIAS específico a IFN-\beta (Toray Industries) y
los resultados se muestran en la Fig. 8. Se separaron veintiocho
ratones hembra de la estirpe B6D2F1 (6-8 semanas)
(de aproximadamente 20 g cada uno) en cuatro grupos tal como sigue:
el Grupo 1 contenía nueve ratones a los que se había inyectado una
única inyección intravenosa rápida 200 \mul de
IFN-\beta humano a 500 ng/ml (dosis final de 100
ng/ratón); el Grupo 2 (nueve ratones) recibió 200 \mul de una
masa equivalente de
PEG30kD-IFN-\beta; el Grupo 3
recibió 200 \mul de una masa equivalente de PEG(2 x 20
kD)-IFN-\beta; y el Grupo 4 es un
grupo de tres ratones sin inyectar que sirvió como control
negativo. Se recogieron muestras de sangre (aproximadamente 200
\mul/muestra) en nueve tiempos indicados por rotura del plexo
venoso retroorbital con un tubo capilar. Se dejó que las muestras
de sangre coagularan durante 1 hora a temperatura ambiente, se
separaron de las paredes del tubo con ayuda de una varilla y se
sometieron a microcentrifugación. Los sueros retirados de allí se
almacenaron a -70ºC hasta que se recogieron todas las muestras. En
los sueros se ensayó la presencia de IFN-\beta
humano bioactivo utilizando el ensayo de Toray. Los resultados
indican que el área bajo la curva (ABC) se incrementa marcadamente
en las muestras de PEG-IFN respecto al
IFN-beta libre y que la del PEG[2 X 20
kD]-IFN-\beta es superior a la
del PEG[30 kD]-
IFN-\beta.
IFN-\beta.
Se inyectaron subcutáneamente a ratones
IFN-\beta y PEG-IFN (100
ng/ratón). La Figura 9 demuestra que el área total bajo la curva
(ABC) se incrementa dramáticamente en el caso de las muestras de
PEG-IFN comparadas con el
IFN-\beta libre. Los estudios farmacocinéticos son
consistentes con las muestras de PEG-IFN que tienen
una semivida mayor y un ABC incrementado.
\newpage
Ejemplo
5
Se proporcionó
interferón-\beta humano recombinante en disolución
a 0,33 mg/ml en un tampón de acetato sódico 50 mM, pH 3,8. Se
añadieron aproximadamente 3,6 mg (exceso de 40 moles por mol de
proteína) del reactivo de PEG heterobifuncional,
OPSS-PEG_{2k}-hidrazida, en 2ml de
agua desionizada a 3 ml de IFN-\beta a 0,33 mg/ml
(0,99 mg) y se dejó que los dos reaccionaran en un vial de
polipropileno durante 1 hora a 45ºC. A continuación, se analizó la
mezcla de reacción con electroforesis capilar para determinar el
grado de modificación. Los rendimientos típicos variaban entre
90-97% dependiendo de la pureza del interferón
\beta y del reactivo de PEG. A continuación, se cargó la
disolución en una columna de exclusión por tamaño (Superdex 75,
Pharmacia) y se eluyó con un tampón de fosfato sódico 5 mM, NaCl
150 mM, pH 7,0. Se recogieron los picos y se analizaron con
SDS-PAGE. Las fracciones de
interferón-\beta monoPEGilado se juntaron y se
utilizaron en una etapa adicional de modificación con PEG de alto
peso molecular.
Se proporcionó
interferón-\beta humano recombinante en disolución
a 0,33 mg/ml en un tampón de acetato sódico 50 mM, pH 3,8. Se
añadieron aproximadamente 6,1 mg (exceso de 40 moles por mol de
proteína) del reactivo de PEG homobifuncional,
(OPSS)_{2}-PEG_{3400}, en 2 ml de agua
desionizada a 3 ml de interferón-\beta a 0,33
mg/ml (0,99 mg) y se dejó que los dos reaccionaran en un vial de
polipropileno durante 2 horas a 50ºC. Se siguió el desarrollo de la
reacción con SDS-PAGE no reductora y se analizó la
mezcla final de reacción con electroforesis capilar para determinar
el grado de modificación. Las modificaciones típicas para esta
reacción con interferón-\beta eran >95%. A
continuación, se cargó la disolución en una columna de exclusión
por tamaño (Superdex 75, Pharmacia) y se eluyó con un tampón de
fosfato sódico 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0. Se recogieron los picos
y se analizaron sus contenidos con SDS-PAGE. Se
combinaron las fracciones de interferón-\beta
monoPEGilado.
Ejemplo
6
Se añadió mPEG_{30k}-ALD en un
exceso de 20 moles por proteína a las fracciones combinadas de
IFN-S-S-PEG_{2k}-hidrazida
del Ejemplo 5. La reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente
(25ºC) durante 4 horas y se añadió una muestra a una columna de
exclusión por tamaño (Superosa 6, Pharmacia) para determinar el
rendimiento de modificación. El rendimiento de modificación de esta
reacción fue generalmente >80% dependiendo de la pureza del
reactivo de PEG y las condiciones de reacción.
Habiendo descrito ahora por completo esta
invención, los expertos en la técnica apreciarán que la misma se
puede realizar dentro de un amplio margen de parámetros,
concentraciones y condiciones equivalentes sin apartarse del
espíritu y alcance de la invención y sin experimentación
innecesaria.
Aunque esta invención se ha descrito en conexión
con realizaciones específicas de la misma, se comprenderá que es
susceptible de modificaciones adicionales. Esta solicitud se
pretende que cubra cualquier variación, uso o adaptación de las
invenciones siguiendo, en general, los principios de la invención e
incluyendo tales desviaciones de la presente descripción ya que
están dentro de la práctica conocida o habitual dentro de la
técnica a la que pertenece la invención y ya que puede aplicarse a
las características esenciales citadas anteriormente en la presente
memoria expuestas tal como sigue en el alcance de las
reivindicaciones adjuntas.
Todas las referencias citadas en la presente
memoria, incluyendo artículos o resúmenes de publicaciones
periódicas, solicitudes de patentes de los EE.UU. o extranjeras
publicadas o sin publicar, patentes extranjeras o de los EE.UU.
expedidas, o cualquier otra referencia, están incorporadas
enteramente como referencia en la presente memoria, incluyendo
todos los datos, tablas, figuras y textos presentados en las citadas
referencias. Además, los contenidos completos de las referencias
citadas dentro de las referencias citadas en la presente memoria
también están incorporados completamente como referencia.
La referencia a etapas de métodos conocidos,
etapas de métodos convencionales, métodos conocidos o métodos
convencionales no es en modo alguno una admisión de que cualquier
aspecto, descripción o realización de la presente invención esté
descrito, enseñado o sugerido en la técnica relevante.
Claims (9)
1. Un método para la unión por etapas de restos
de polietilénglicol (PEG) en serie a un polipéptido, que comprende
las etapas de:
hacer reaccionar un polipéptido con un resto de
PEG heterobifuncional u homobifuncional que tiene un peso molecular
en el intervalo de 100 a 5.000 daltons y que tiene la siguiente
fórmula:
W-CH_{2}CH_{2}O(CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}CH_{2}-X,
en la que "W" y "X" son
grupos que reaccionan independientemente con un grupo funcional
amino, sulfhidrilo, carboxilo o hidroxilo para unir el resto de PEG
de bajo peso molecular al polipéptido;
y
hacer reaccionar el resto de PEG de bajo peso
molecular unido al polipéptido con un resto de PEG monofuncional o
bifuncional que tiene un peso molecular en el intervalo de 100
daltons a 200 kilodaltons para unir el resto de PEG monofuncional o
bifuncional a un extremo libre del resto de PEG de bajo peso
molecular y formar un conjugado de
PEG-polipéptido.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que el resto de PEG monofuncional o bifuncional tiene la
siguiente fórmula:
Y-CH_{2}CH_{2}O(CH_{2}CH_{2})_{M}CH_{2}CH_{2}-Z,
en la que "Y" es reactivo a un
grupo terminal en el extremo libre del resto de PEG de bajo peso
molecular unido al polipéptido y "Z" es -OCH_{3} o un grupo
reactivo con "X" para formar un conjugado
bifuncional.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 2,
en el que el resto de PEG monofuncional o bifuncional es
metoxi-PEG, PEG ramificado, PEG hidrolítica o
enzimáticamente degradable, PEG con colgaduras o PEG
dendrimérico.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que "W" y -"X" se seleccionan independientemente
entre el grupo que consiste en disulfuro de ortopiridilo,
maleimidas, vinilsulfonas, yodoacetamidas, hidrazidas, aldehídos,
ésteres de succinimidilo, epóxidos, aminas, tioles, carboxilos,
ésteres activos, carbonatos de benzotriazol, carbonatos de
p-nitrofenol, isocianatos y biotina.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que el resto de PEG de bajo peso molecular y/o el resto de
PEG monofuncional o bifuncional es un copolímero de
polietilenglicol.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 5,
en el que el copolímero de polietilenglicol se selecciona entre el
grupo que consiste en copolímeros de
polietilenglicol/polipropilenglicol y copolímeros de
polietilenglicol/poli(ácido láctico/glicólico).
7. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
comprendiendo además una etapa de purificación del conjugado de
PEG-polipéptido después de la unión por etapas de
dos restos de PEG en serie a un polipéptido.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 7,
en el que dicha etapa de purificación comprende una o más técnicas
de purificación seleccionadas entre el grupo que consiste en
cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por
tamaño, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de
afinidad y cromatografía en fase inversa.
9. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido es
interferón-\beta.
Applications Claiming Priority (2)
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