ES2224713T3 - Supresion de rechazo de xenotransplantes. - Google Patents

Abstract

Un tejido biológico que comprende células endoteliales que se pueden inducir para generar un compuesto que regula por disminución la expresión de una molécula de adhesión celular por las células, siendo el compuesto bien (a) un polinucleótido complementario en secuencia a parte del gen o mRNA que codifica la molécula de adhesión celular, (b) un polinucleótido que comprende una secuencia de ribozima que se dirige específicamente a un gen o mRNA que codifica la molécula de adhesión celular, o (c) un péptido con afinidad de unión específica para la molécula de adhesión celular.

Description

Supresión de rechazo de xenotransplantes.

La presente invención se refiere a la supresión de rechazo de injertos, particularmente a la supresión de rechazo de xenotransplantes.

El éxito de transplante de órganos alogénicos se ha llegado a establecer bien en las últimas décadas. Sin embargo, el suministro limitado de órganos de donantes significa que muchos pacientes tienen poca o ninguna oportunidad de recibir un órgano transplantado y de esta manera mueren antes de que se encuentre un órgano. Una solución potencial a este problema es el "xenotransplante", o el uso de órganos de donantes de animales no humanos ("xenogénicos").

Los órganos de donantes porcinos son candidatos adecuados particularmente para transplante debido a que los cerdos son anatómicamente y fisiológicamente similares a los seres humanos, son de suministro abundante y están relativamente exentos de patógenos que son capaces de producir infecciones a seres humanos. Además, la tecnología transgénica produce la posibilidad de modificar genéticamente el tejido del donante para invalidar la respuesta de rechazo.

Un problema asociado al xenotransplante es que los órganos xenogénicos se rechazan rápidamente tras la revascularización mediante un proceso humoral llamado rechazo hiperagudo (abreviadamente en inglés HAR). Esto se debe a la presencia de anticuerpos de origen natural en el receptor del transplante, que reconoce y reacciona con antígenos en las células endoteliales (abreviadamente en inglés EC) del xenotransplante. Este reconocimiento desencadena la cascada complementaria que a su vez conduce al rechazo.

En los últimos años, se han propuesto varios planteamientos terapéuticos novedosos para suprimir el HAR y ensayado con éxito (Bach, 1998). Éstos actúan bien mediante supresión de la activación complementaria o evitando los anticuerpos naturales xenorreactivos. El HAR ya no se considera más como un problema insalvable para el transplante de cerdo a ser humano. Sin embargo, es evidente que solo la prevención de HAR en improbable que sea suficiente para evitar el rechazo de órganos xenogénicos.

Incluso si se vence el HAR, el rechazo enérgico del injerto se produce dentro de 2 - 3 días, mucho más rápido que la mayoría de las formas de transplante alogénico, un proceso denominado rechazo tardío al xenotransplante retardado (abreviadamente en inglés DXR). La histología de este tipo de rechazo es diferente del HAR con menos hemorragia aunque con trombosis intravascular significativa. Además, existe deposición de anticuerpos xenorreactivos sobre el endotelio junto con fibrina, agregados de plaquetas e infiltración del tejido perivascular con células inflamatorias (neutrófilos, macrófagos y células NK) (Blakely y col., 1994).

Además de DXR existe el problema del rechazo mediado por linfocitos T. Se ha mostrado (Dorling y col., 1994) que la respuesta de las células T a los xenotransplantes porcinos es al menos equivalente a la respuesta contra el transplante alogénico, pero es probable que sea más agresivo y puede ser difícil controlar con dosis habituales de fármacos inmunosupresores sistémicos.

Las células endoteliales (abreviadamente en inglés EC) se cree que orquestan el reclutamiento de células inflamatorias en el DXR y el posterior rechazo celular en numerosas formas: (i) produciendo mediadores (tales como la interleucina - 8 (abreviadamente IL - 8) y el factor activador de plaquetas (abreviadamente en inglés PAF) que activan la función de leucocitos, incluyendo la adhesión; (ii) mediante la actuación de células que presentan antígenos, que estimulan la respuesta inmune contra el tejido extraño, y (iii) mediante la regulación de la expresión espacial y temporal de las moléculas de adhesión celular para facilitar la transmigración de leucocitos en el interior del órgano transplantado (Bevilacqua), 1993). Las citocinas, liberadas de los leucocitos reclutados, incrementan drásticamente la expresión de las moléculas de adhesión sobre la superficie de las EC y potencian el procedimiento de reclutamiento.

La primera estructura que pone en contacto los leucocitos circulantes cuando la sangre reperfunde un injerto vascularizado es el endotelio. Los leucocitos se deben adherir y cruzar la barrera endotelial para infiltrar el injerto. Los recientes avances en la comprensión de los mecanismos de las interacciones leucocitos - EC han revelado una serie de casos de adhesión y de activación (la cascada de adhesión) que tiene lugar durante la emigración de leucocitos en los tejidos (Springer, 1994). (Véase la figura 1).

La rodadura inicial sobre el endotelio vascular está mediada por interacciones transitorias entre selectinas (por ejemplo, la selectina L sobre los leucocitos, la selectina S sobre las EC activadas y la selectina P sobre tanto las EC activadas como las plaquetas activadas) y estructuras opuestas que llevan carbohidratos sobre la célula opuesta (EC, leucocito o plaqueta) (Tedder y col, 1995). Sin embargo debido a la alta relación conexión/desconexión de estas interacciones selectinas - carbohidratos, esta clase de receptores no pueden soportar la adhesión firme de leucocitos. Mientras la rodadura, los leucocitos se llegan a exponer a señales de activación que dan como resultado un incremento de avidez de las integrinas de superficie de leucocitos. Las quimiocinas se cree que son los candidatos probables para este caso de desencadenamiento: la IL - 8 se ha mostrado que existe anclada a la superficie de las EC mediante proteoglicanos de superficie (Tanaka y col., 1993) que dan como resultado concentraciones locales altas dentro del medio del leucocito rodante. Esta adhesión secundaria mediada por integrinas da como resultado una detección estable del leucocito y sigue la transmigración en los tejidos (Springer, 1994).

Los miembros de la familia de supergenes de las inmunoglobulinas (abreviadamente en inglés IgSF) expresados sobre el endotelio son contra - receptores para las integrinas de los leucocitos. Éstos incluyen la molécula de adhesión celular vascular (abreviadamente en inglés VCAM - 1), moléculas de adhesión intracelular (abreviadamente en inglés ICAM - 1, ICAM - 2), y adresinas vasculares mucosales (MadCAM - 1). Los contra ligandos para la VCAM - 1 son integrinas heterodiméricas \alpha4 con un enlace no covalente bien a la cadena \beta o a \beta7. La integrina \alpha4\beta1 (antígeno - 4 muy tardío [VLA - 4] se expresa constitutivamente sobre la mayoría de los leucocitos mononucleares que incluyen eosinófilos, linfocitos, monocitos, basófilos pero está ausente sobre los neutrófilos. En contraste, la integrina \alpha4\beta1 se encuentran principalmente en un subconjunto de células T con un tropismo para el tracto intestinal y su ligando primario es la adresina vascular mucosal (MadCAM - 1), aunque también se une a VCAM - 1 (18). Los receptores de los leucocitos para las ICAM son las integrinas \beta2' antígeno asociado a la función de los linfocitos' (abreviadamente en inglés LFA - 1) y la integrina \alphaM\beta1 (Mac - 1). Los neutrófilos y las células hematopoyéticas (excepto los eritrocitos) expresan el LFA - 1, mientras que la expresión de Mac - 1 está más restringida a los monocitos, macrófagos y granulocitos.

El endotelio vascular quiescente expresa una disposición de moléculas que no debe ser suficiente para promover unión significativa a los leucocitos y posterior transmigración. Sin embargo está bien establecido que la isquemia de los órganos peritransplantados da como resultado la activación endotelial con un incremento de expresión de las moléculas de adhesión.

La interacción de la VACM - 1 sobre las EC con su ligando, la integrina \alpha4\beta1 del VLA - 4, sobre el leucocito se ha mostrado recientemente que es el mecanismo predominante que desencadena la detención de monocitos rodantes y linfocitos, y posterior difusión (Jones y col., 1994; Alon y col., 1995). La transmigración a través de las conexiones estrechas endoteliales implica a la molécula de adhesión de células endoteliales (abreviadamente en inglés PECAM, CD31), proteína asociada a las integrinas (abreviadamente en inglés IAP, CD47) e integrina \alpha4\beta1 (Muller, 1995; Brown, 1996).

Parece que la interferencia con los procedimientos de reconocimiento mediados mediante estas moléculas de adhesión (en particular ICAM - 1, LFA - 1, VCAM - 1 y CD2) pueden prolongar significativamente la supervivencia del injerto alogrénico. Además en algunos modelos, no solamente bloquearon las moléculas de adhesión induciendo los anticuerpos monoclonales la supervivencia indefinida del injerto, pero también la tolerancia específica del donante (Isobe y col, 1992).

Las EC porcinas tienen la capacidad de mediar tanto la adhesión inicial como la migración y activación de los leucocitos humanos de infiltración. Las interacciones funcionales entre LFA - 1 humanos e ICAM de cerdo, y el VLA - 4 humano y la VCAM de cerdo se han documentado. Además la interacción de los monocitos humanos con endotelio porcino también da como resultado la activación de las EC (Millan y col, 1997). Esto es probablemente para promover la circulación de linfocitos y monocitos humanos en el xenotransplante porcino y desencadenan el rechazo.

Se ha demostrado que los anticuerpos contra las moléculas de adhesión porcinas pueden inhibir el proceso de infiltración (Dorling y col., 1996; Mueller y col., 1995). Para inhibir la interacción de la VCAM - 1 y el VLA - 4, se han administrado los anticuerpos monoclonales contra cualquiera de estas moléculas. Una proteína de fusión de la VCAM - Ig, los antagonistas de péptidos cíclicos que imitan el bucle de unión a la integrina \alpha4 en el dominio 1 de la VCAM - 1, y también se han usado ciertos ciclopeptólidos (revisión en el documento de Foster, 1996).

Podría ser posible dirigir la VCAM - 1 porcina específicamente con los anticuerpos monoclonales, pero se cree que la administración repetida de estos anticuerpos daría como resultado la sensibilización del receptor y un declive en la eficacia del bloqueo. La administración sistémica de los agentes tales como la proteína de fusión VCAM - Ig, los antagonistas de péptidos cíclicos ciclopeptólidos fúngicos de origen natural mencionados anteriormente darían como resultado un bloqueo no solamente de la interacción pVCAM - VLA - 4 en el injerto sino también en otros tejidos del receptor y puede perjudicar la capacidad del receptor para combatir las infecciones.

Así pues existe una gran necesidad de un procedimiento para combatir la fase celular del proceso de rechazo que se produce a partir del xenotransplante, sin comprometer el sistema inmune del receptor del tejido injertado.

Sumario de la invención

Según la presente invención se proporciona un tejido biológico que comprende células endoteliales que se pueden inducir para generar un compuesto que regula por disminución la expresión de una molécula de adhesión celular por las células.

El tejido biológico puede ser cualquier tejido adecuado para transplante a un mamífero, e incluye colecciones de células, y tejidos y órganos individuales. De acuerdo con lo anterior, esta definición incluye, fibroblastos, tejido neural, tejido fetal y corazón, hígado, pulmón, páncreas, islotes de Langherans, piel, intestino delgado, córnea, cartílago, hueso, músculo, o tejidos u órganos renales.

El tejido se puede derivar de cualquier animal no humano que está suficientemente y estrechamente relacionado con el ser humano y permite la conservación de la función que se ha conservado. Tales animales incluyen ovejas, cerdos, ratites (avestruz, emu), capibara y primates. El animal de elección es el cerdo, debido a que sus órganos tienen fisiología y tamaño similar a los órganos humanos. Además, los cerdos se pueden criar en grandes cantidades y están relativamente exentos de patógenos capaces de producir infecciones en seres humanos.

Como se usa en esta memoria descriptiva, el término "expresión" se puede referir a la expresión de un péptido o polipéptido a partir de un gen y/o la expresión de un péptido o proteína sobre la superficie de una célula, según el contexto lo requiera. Por "regulados por disminución" se entiende que el compuesto actúa para disminuir el nivel de expresión de la proteína de adhesión celular. La regulación por disminución puede ser a nivel de transcripción, puede ser afectando la traducción o puede actuar mediante algún otro mecanismo, por ejemplo, efectuando cambios en la estabilidad del mRNA.

La molécula de adhesión celular que se va a regular por disminución puede ser cualquier proteína que se expresa sobre la superficie de una célula endotelial y que es capaz de la interacción con un leucocito o plaqueta, tal como VCAM - 1, ICAM - 1, LFA - 1, CD2, PECAM, CD31, IAP, CD47, integrina \alpha\nu\beta3, MadCAM, PECAM, selectinas (selectina P-, L-, y E-), LFE - 3, CD80/CD86 o trombospondina. La VCAM - 1 es la molécula de adhesión celular de elección debido a la interacción de la VCAM - 1 sobre las EC con su ligando, y la integrina \alpha4\beta1 del VLA - 4 sobre los leucocitos se ha mostrado que es el mecanismo predominante que desencadena la detención de los monocitos rodantes y linfocitos, y su posterior difusión.

Una característica de la presente invención es que el compuesto que previene la expresión de la molécula de adhesión celular se puede generar por inducción. Se ha encontrado que la interrupción dirigida de la molécula de adhesión VCAM - 1 en ratones es casi universalmente fatal para el desarrollo del embrión debido a un fallo de placentación eficaz, que produce fusión corioalantoica ausente o tardía y da como resultado la muerte del embrión a entre 8 y 12 días en el útero (Gurtner y col., 1995).

La estrategia ideal para la inducción es la eliminación genética condicional de la molécula de adhesión celular, que permite la expresión normal durante el desarrollo y en el adulto joven, pero con la capacidad de inhibir la expresión de la molécula de adhesión celular en el órgano donante inmediatamente antes, y/o después del transplante. Los procedimientos adecuados de inducción serán evidentes para los expertos en la técnica, tales como la clonación del compuesto inhibidor por disminución de un elemento de respuesta adecuado, elemento potenciador o elemento promotor. Por ejemplo, varios sistemas conocidos permiten la transcripción de un gen a controlar en las células de mamíferos que usan moléculas pequeñas, incluyendo el sistema Tet - On ™ (Clontech, Reino Unido), el sistema promotor de metaloproteínas (Palmiter y col., 1983), el sistema de expresión de mamíferos inducible por ecdisona (Invitrogen, BV), promotores inducibles por esteroides (Clackson y col., 1997) y promotores inducibles por citocinas (Aranciba y col., 1998; Bachiller y col., 1990). El sistema particular elegido se determinará mediante el grado requerido de supresión.

El compuesto que regula por disminución la expresión de la molécula de adhesión celular puede ser un polinucleótido. Según un segundo aspecto de la invención se proporciona un tejido biológico en el que las células endoteliales del tejido se pueden inducir para generar un polinucleótido que regula por disminución la expresión de una molécula de adhesión celular por las células.

El polinucleótido puede ser complementario en secuencia a parte del gen o mRNA que codifica la molécula de adhesión celular, de manera que se hibrida al gen o al mRNA y así previene su transcripción o traducción. De manera ideal, tal polinucleótido debe ser de al menos 15 nucleótidos de longitud, preferiblemente al menos 50 nucleótidos, más preferiblemente mayor que 100 nucleótidos. Para asegurar que solamente el gen de adhesión celular está dirigido, el polinucleótido debe ser complementario a una porción del gen que es el más divergente de otras secuencias de ácidos nucleicos. El polinucleótido se debe preferiblemente hibridar al gen o al mRNA que codifica la molécula de adhesión celular en condiciones de alta restricción, por ejemplo, 0,1 x SSC, 65ºC, (donde SSC = NaCl 0,15 M, citrato sódico 0,015 M, pH 7,2).

Según este aspecto de la invención, las secuencias de polinucleótidos actuarán para revocar la transcripción de un gen que codifica una molécula de adhesión celular o traducción de un mRNA de adhesión celular mediante la hibridación con la molécula, por lo tanto previniendo que tenga lugar la interacción del ácido nucleico con los factores proteicos relevantes necesarios para la transcripción o traducción.

Como alternativa, las secuencias de polinucleótidos pueden comprender una secuencia de ribozimas que dirige específicamente un gen o mRNA que codifica una molécula de adhesión celular.

Según un tercer aspecto de la invención se proporciona un tejido biológico en el que las células endoteliales del tejido de pueden inducir para generar u péptido o polipéptido que regula por disminución la expresión de una molécula de adhesión celular por las células.

El péptido o polipéptido puede poseer alta afinidad para la molécula de adhesión celular. Preferiblemente, la afinidad del compuestos para la molécula de adhesión celular es mayor que 10^{-8}M, más preferiblemente mayor que 10^{-9}M, incluso más preferiblemente mayor que 10^{-10}M. El compuesto también debe exhibir afinidad de unión específica para la molécula de adhesión celular con el fin de asegurar que la actividad de unión del compuesto no sea responsable de la destrucción inapropiada de otras moléculas en la célula.

Preferiblemente, el compuesto es un anticuerpo o fragmento de anticuerpos, que se puede preparar fácilmente con especificidad y afinidad alta para una diana deseada. Los fragmentos de anticuerpos tales como los fragmentos Fab o fragmentos de cadenas individuales (sFvS) son particularmente adecuadas ya que son moléculas pequeñas con un alta solubilidad y mayor que la capacidad penetrante en un medio intracelular. Los anticuerpos sFv intracelulares se han empleado con éxito in vitro para neutralizar virus (VIH - 1 (Rondon y col., 1997) y flavivirus (Jiang y col., 1995)), y para reducir la expresión de oncoproteínas intracelulares (por ejemplo, erbB - 2 (Beerli y col.,)1994; Graus Porta y col., 1995) y ras (Bioca y col., 1993)) y los receptores de la superficie celular (por ejemplo, IL . 2R (Richardson y col., 1997)). Estas especies de los sFv se generaron a partir de hibridomas de anticuerpos monoclonales para la proteína diana.

El polipéptido puede ser una proteína de fusión que comprende un dominio de unión que muestra afinidad para una molécula de adhesión celular y un dominio efector que dirige una molécula de adhesión celular o que dirige un gen o mRNA que codifica la molécula de adhesión celular. Por ejemplo, el dominio efector se puede distribuir (por medio del dominio de unión) al medio de la molécula de adhesión celular, de manera que la molécula de adhesión celular se dirige a la destrucción. Si es proteináceo, el dominio efector puede comprender una proteasa, una quinasa, una fosfatasa o cualquier otra enzima que sea capaz de inactivar una molécula de adhesión celular. Como alternativa, el dominio efector puede comprender un oligonucleótido o molécula de ribozima que actúa sobre el gen o mRNA que codifica la molécula de adhesión celular.

Según un cuarto aspecto de la invención se proporciona un tejido biológico en el que las células endoteliales del tejido se pueden inducir para generar una proteína de fusión biespecífica que regula por disminución la expresión de una o más moléculas de adhesión celular mediante las células. Tal proteína de fusión puede comprender dominios o péptidos con afinidades para epítopos diferentes de proteínas de adhesión celular. Por ejemplo, una proteína de fusión se puede diseñar con afinidad de unión y especificidad contra dos o más epítopos diferentes sobre una molécula de adhesión celular tal como la VCAM. Esto mejoraría la eficacia de eliminación genética de la molécula de adhesión celular. Además, se pueden dirigir numerosos epítopos sobre diferentes moléculas de adhesión celular, con el fin de derogar simultáneamente su expresión.

Con el fin de que la molécula de adhesión celular no se transporte a la superficie celular para la expresión, la secuencia de aminoácidos del péptido o polipéptido debe incluir una secuencia directora para dirigir la degradación de la molécula de adhesión celular.

La secuencia directora puede comprender cualquier señal que hace circular la proteína intracelular, con tal que la señal esté implicada en la dirección del complejo de enlace a un compartimiento celular para degradación. Los ejemplos de señales de circulación de proteínas intracelulares adecuadas se describen en el documento de Pudsley, 1989 y de Magee y Wileman, 1992.

Preferiblemente, la señal comprende una señal de localización que dirige un péptido naciente al retículo endoplásmico (abreviadamente en inglés ER). Una señal adecuada particularmente es la inclusión de la secuencia de aminoácidos Lys - Asp - Glu - Leu (KDEL) en el extremo C del péptido o polipéptido. Las proteínas que residen en el lumen del retículo endoplásmico (ER), el primer compartimiento para las proteínas unidas a membranas recientemente preparadas o proteínas secretadas, se sabe que poseen esta corta secuencia (Mururo y Pelham, 1987). Si esta secuencia se suprime o se extiende mediante la adición de aminoácidos adicionales, la proteína se secreta desde la célula en lugar de conservarse.

Las regiones de señales alternativas serán evidentes para los expertos en la técnica e incluyen secuencias de dirección liposomales. Las proteínas sede fusión también se pueden construir, comprendiendo un péptido o polipéptido condensado a una proteína viral tal como la nef del VIH - 1, o a señales citoplásmicas para un rápido recambio tales como los que se encuentran en CTLA - 4 (véase Magee y Wileman, (1992) Protein targeting: a practical approach; Oxford University Press).

Según un quinto aspecto de la invención se proporciona un polipéptido que comprende una región de unión capaz de unirse a una molécula de adhesión celular y una región de señalización para la dirección subcelular del polinucleótido. Preferiblemente, el polipéptido comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpos, más preferiblemente un fragmento de anticuerpos de cadena individual (sFv). La región de señalización elegida es una señal de localización para el retículo endoplásmico. Más preferiblemente la región de señalización comprende la secuencia de aminoácidos KDEL en el extremo C del polipéptido.

Según un sexto aspecto de la invención se proporciona un polinucleótido que codifica un péptido o polipéptido según el aspecto quinto de la invención. Preferiblemente, el polinucleótido comprenderá secuencias adecuadas para la regulación de la expresión del péptido o polipéptido. Preferiblemente esta expresión puede controlarse, tal como mediante control específico celular, control inducible, o control temporal. Preferiblemente, la expresión debe ser específica para células musculares lisas vasculares, fibroblastos, miocitos cardíacos, las EC o cualquier combinación de estos tipos de células. Más preferiblemente, la expresión debe ser específica para las EC; la expresión específica de las EC se puede lograr usando promotores específicos de tejidos tales como la selectina E, ICAM, y MadCAM.

Según un séptimo aspecto de la invención, se proporciona un vector que comprende un polinucleótido según el aspecto sexto la invención.

El término "vector" significa un resto que es capaz de transferir un polinucleótido a una célula hospedadora. Preferiblemente el vector es un vector de DNA y, más preferiblemente, es capaz de expresar RNA que codifica una proteína según la invención. Numerosos vectores adecuados se documentan en la técnica; los ejemplos se pueden encontrar en Molecular cloning: a Laboratory Manual: 2ª edición, Sambrook y col., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press o DNA cloning; a practical approach, Volumen II: Expression systems, editado por D. M. Glover (IRL Press, 1995).

Muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de ácidos nucleicos, por ejemplo, en la preparación de construcciones de ácidos nucleicos, mutagénesis, secuenciación, introducción de DNA en las células y expresión génica, y análisis de proteínas, se describen en detalle en Short Protocols in Molecular Biology, edición segunda, Ausubel y col., eds., (John Wiley & Sons, 1992) o Protein Engineering: A practical approach (editado por A. R. Rees y col., IRL Press 1993). Por ejemplo, en las células eucarióticas, los vectores de elección pueden ser a base de virus.

Para cierta realizaciones de la invención, se puede usar un vector de expresión bicistrónico con el fin de permitir la coexpresión estequiométrica de dos genes a partir de un mRNA. En un sistema particular (Jackson y col., 1990), la expresión se dirige desde un promotor de señal y la incorporación del sitio interno de entrada al ribosomas (abreviadamente en inglés IRES) del virus de encefalomiocarditis (abreviadamente en inglés ECMV) permite la unión ribosomal independiente de CAP y la traducción de la segunda fase abierta de lectura. Esto permite la transfección de una construcción que contiene secuencias dirigidas contra dos epítopos diferentes sobre una molécula de adhesión celular para mejorar la eficacia de eliminación genética, o permite la dirección de dos o más moléculas de adhesión celular diferentes usando solamente una construcción.

A la introducción del ácido nucleico puede seguir la producción o permisión de la expresión a partir del ácido nucleico, por ejemplo cultivando las células hospedadoras en condiciones que permiten la expresión del gen.

En una realización, el ácido nucleico de la invención se integra en el genoma (por ejemplo, cromosoma) de la célula hospedadora. La integración se puede promover mediante la inclusión de secuencias que promueven la recombinación con el genoma, de acuerdo con técnicas habituales.

Preferiblemente el vector es adecuado para la producción de un animal transgénico. Los vectores adecuados para la generación de cerdos transgénicos, por ejemplo, como se describe en el documento de Heckl - Östreicher (1995), MaCurry (1996), White (1995), Yannoutsos (1995), y Langford (1996). Los vectores de minigenes adecuados para la generación de ratones transgénicos se describen en el documento de Diamond (1995).

Según un octavo aspecto de la invención, se proporciona un sistema de distribución que comprende una molécula de los aspectos quinto, sexto o séptimo y significa que distribuye dicha molécula a la célula diana.

El sistema de distribución puede viral o no viral. Los sistemas no virales, tales como liposomas, evitan algunas de las dificultades asociadas a los sistemas a base de virus, tales como el gasto de producción escalada, persistencia pobre de expresión, y concierne a la seguridad. Preferiblemente el sistema de distribución es adecuado para uso en terapia génica. Se conocen en la técnica numerosos sistemas de distribución apropiados tales como, por ejemplo, DNA condensado policatiónico unido o no unido a adeno virus destruídos solos (véase Curiel, 1992) y DNA unido a ligandos (véase WU, 1989). También se puede emplear DNA desnudo, opcionalmente usando perlas de látex biodegradable para incrementar la captación. Los liposomas pueden también actuar como vehículos de distribución génica encapsulando ácidos nucleicos que comprenden un gen clonado bajo el control de una diversidad de promotores específicos de tejidos o activos de manera ubicua. También se pueden usar sistemas de distribución mecánica tales como el planteamiento descrito en el documento de Woffendin y col., (1994).

La distribución directa de composiciones de terapia génica generalmente se llevará a cabo, en bien un régimen de dosis múltiples o de dosis individual, mediante la inyección, bien subcutáneamente, por vía intraperitoneal, intravenosa o intramuscular o distribuido al espacio intersticial de un tejido. Otras formas de administración incluyen administración oral y pulmonar, usando supositorios, y aplicaciones transdérmicas, agujas y pistolas génicas o hipopulverizaciones.

Preferiblemente, el sistema de distribución se dirigirá de manera que las moléculas según la presente invención son recogidas por las células adecuadas para transplante, o las células que se han transplantado. Más preferiblemente el sistema de distribución será específico para estas células. Por ejemplo, el sistema de distribución se puede dirigir a un órgano específico, tal como el corazón o el riñón, o a un tipo de células específico, tal como las células endoteliales.

Para lograr esto el sistema de distribución puede, por ejemplo, ser un sistema de distribución mediado por receptores, que se dirige a receptores encontrados en las células diana. Por ejemplo, el sistema de distribución se debe dirigir a los receptores encontrados en las células cardiacas, preferiblemente a receptores encontrados exclusivamente en las células cardiacas, o se puede dirigir a receptores encontrados en las células endoteliales, preferiblemente a receptores encontrados exclusivamente en las células endoteliales tales como la selectina E o la selectina P.

El sistema de distribución es preferiblemente adecuado para la generación de animales transgénicos. Por ejemplo, el sistema de distribución se puede dirigir a un gameto, un cigoto, o una célula tronco embrionaria.

Según un noveno aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento de transfección de una célula con un vector según la invención. La célula para la transfección debe ser un progenitor de la especie que va a ser el donante de órganos, preferiblemente una célula endotelial. La transfección estable de células endoteliales porcinas se describe en el documento de Heckl - Östreicher (1995).

Preferiblemente, la célula es adecuada para la generación de un animal transgénico. Más preferiblemente, la célula es un gameto, un cigoto, o una célula tronco embrionaria. Por ejemplo, la transfección de óvulos de murinos mediante microinyección para generar ratones transgénicos, se describe en el documento de Diamond (1995), y por ejemplo, la microinyección de cigotos porcinos, para generar cerdos transgénicos se describe en el documento de Yannoutsos (1995), Langford (1996), Y White (1995).

Según un décimo aspecto de la invención, se proporciona una célula transfectada según el noveno aspecto.

Según un undécimo aspecto de la invención, se proporciona un tejido biológico que comprende una célula según el décimo aspecto de la invención. El término "tejido biológico" como se usa en esta memoria descriptiva incluye colecciones de células, tejidos y órganos. De acuerdo con lo anterior la definición incluye, por ejemplo, fibroblastos, tejido nervioso, corazón, hígado, o tejidos u órganos de riñón.

Según un duodécimo aspecto de la invención, se proporciona un animal que comprende un tejido celular y/o biológico según la invención. Preferiblemente el animal es adecuado para la producción de órganos para transplante en seres humanos. Preferiblemente el animal es un mamífero, y más preferiblemente es un cerdo transgénico u oveja transgénica.

El animal se debe ser tratar mientras vive de manera que comprenda tejido biológico transgénico (es decir, tratado mediante terapia génica). Preferiblemente, un animal vivo se transfecta con un vector que se distribuye específicamente a las células endoteliales para producir órganos transgénicos adecuados para xenotransplante.

Como alternativa, el animal debe nacer como un animal transgénico. Se conocen en la técnica diversos planteamientos adecuados para generar tales animales transgénicos (por ejemplo, Bradley y Liu, 1996; Clarke. 1996; Wheeler, 1994). Por ejemplo, se conoce bien la manipulación directa del cigoto o embrión temprano, por ejemplo mediante microinyección de DNA, como es la manipulación in vitro de células pluripotentes tales como células madre embrionarias. La infección retroviral de embriones tempranos ha probado ser exitosa en una serie de especies, y se ha descrito la infección adenoviral de los huevos libres de zonas. También se ha descrito la transgénesis y clonación de ovejas mediante transferencia nuclear (por ejemplo, el documento WO 97/07668).

Según un decimotercero aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento de obtención de un tejido biológico adecuado para transplante, que comprende la expresión de uno o más compuestos según la presente invención en el tejido biológico, preferiblemente y exclusivamente en sus células endoteliales. El tejido biológico también se puede obtener bien in vivo o ex vivo. Por ejemplo, un órgano animal se puede estar transfectar in vivo con un vector según la invención, o un órgano se puede transfectar ex vivo antes del transplante o in vivo después del transplante.

Según un decimocuarto aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento de transplante que comprende el transplante de tejido biológico según la invención a partir de un donante animal en un animal receptor. Preferiblemente el procedimiento es para xenotransplante y el tejido donante biológico es xenogénico con respecto al animal receptor.

Ahora la invención se describirá en detalle con referencia específica a fragmentos de anticuerpos de cadena única frente a la molécula de la VCAM - 1. Se apreciará que se puede realizar la modificación de detalles sin salirse el alcance de la invención.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: cascada de adhesión de leucocitos - células endoteliales

Figura 2: citometría de flujo con anticuerpos de fagos que demuestran especificidad para VCAM

Figura 3: toma de impresiones digitales de las enzimas de restricción de los clones de sFv

Figura 4: vector de expresión para sFv

Figura 5: cotransfección de sFv/ER con pEF/GFP/ER

Figura 6a: expresión de VCAM sobre trasfectantes de EC estables con el clon F5 de sFv

Figura 6b: expresión de VCAM sobre trasfectantes de EC estables con el clon E6.2 de sFv

Figura 7a: expresión de VCAM sobre trasfectantes de EC estables con el clon F5 de sFv

Figura 7b: expresión de VCAM sobre trasfectantes de EC estables con el clon E6.2 de sFv

Figura 8: tinción de VCAM sobre células endoteliales no transfectadas y transfectadas

Figura 9: unión de células Jurkat a densidades variables de células endoteliales

Ejemplos Ejemplo 1 Identificación de sFv específico de VCAM a partir de una genoteca de exposición de fagos

Se usó una genoteca de anticuerpos de exposición de fagos para generar un sFv específico para la VCAM - 1.

La genoteca usada contiene > 10^{8} clones generados usando un banco de 50 segmentos de genes VH humanos clonados con una secuencia de nucleótidos aleatorios que codifica longitudes de CDR3 de 4 - 12 residuos (Richardson y col., 1993). Esta genoteca ya se ha usado para aislar anticuerpos de cadena única específicos para una diversidad de antígenos que incluye haptenos, antígenos extraños y propios. Sin embargo la selección ha dependido de la disponibilidad de antígeno purificado o recombinante. Los autores desarrollaron una estrategia de selección novedosa pata superar la carencia de VCAM porcina recombinante.

cDNA para VCAM porcino se utilizó para generar líneas celulares estables que muestran altos niveles de expresión de VCAM porcina de superficie como se determinó mediante citometría de flujo. Las células VCAM positivas se incubaron con CMFDA verde CellTracker™ 3 \muM (diacetato de 5- clorometilfluoresceína, (Molecular Probes, Oregón) durante 1 hora a 37ºC. Una vez que esta sonda permeable a la membrana entra en la célula la hidrólisis con esterasa convierte el CMFDA no fluorescente en 5-clorometilfluoresceína fluorescente que reacciona con tioles o proteínas para formar conjugados fijables de aldehídos. Las células marcadas con esto son viables y fluorescentes durante varias divisiones celulares.

Una suspensión de células negativas de VCAM se incubó con la genoteca de fagos en Marvel al 4%/PBS a 4ºC con agitación suave. Después de 30 minutos, después las células VCAM positivas se añadieron en una relación 1:10 (VCAM positiva:negativa) y se incubaron durante 90 minutos adicionales. La células se sedimentaron mediante centrifugación y se lavaron con PBS tres veces. Las células VCAM positivas fluorescentes (y el fago que se unió a la superficie celular) se separaron después mediante FACS. Los fagos se "rescataron" de la manera habitual (Griffiths y col, 1994), se amplificaron y la genoteca se sometió a tres rondas adicionales de selección. ELISA de fagos "policlonales" confirmó que la genoteca se enriqueció para el fago específico de VCAM. Después los clones individuales se ensayaron mediante citometría de flujo para unión a la línea celular VCAM positiva y los resultados de los clones representativos se muestran en la figura 2.

La secuencia para los clones específicos de VCAM se amplificó a partir de minipreparaciones del vector fagémido mediante PCR y se digirieron durante 18 horas con bien BstN1 o BsaJi según el protocolo del fabricante. El mapeo del polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (abreviadamente en inglés RFLP) de los 15 primeros clones específicos de VCAM mostró que había al menos 5 distintos patrones de digestión sugiriendo al menos 5 secuencias de anticuerpos diferentes. (Figura 3). Dos de éstos se usaron para análisis posterior.

Ejemplo 2 Subclonación de sFv para expresión intracelular dirigida

La estrategia de los autores fue modificar genéticamente el cFv específico de VCAM a conservar dentro del ER, de manera que prevea que la interacción sFv - VACM sea de suficiente afinidad, ambas moléculas se conservarían dentro del ER y se degradarían, por lo tanto se reducirían los niveles de VCAM de la superficie celular. Inicialmente, el sFv se ha expresado usando un promotor constitutivamente activo, el promotor de la subunidad 1\alpha (EF - 1\alpha) del factor de elongación humano.

El sFv se amplificó a partir del vector fagemido mediante PCR (30 ciclos, fijación por calor a temperatura de 55ºC, Mg^{24} 1,5 \muM) usando los cebadores:

(5')CAGTCTATGCGGCCCCATTCA(3'); Y

(5')TCCACAGGCGCGCACTCCCAGCCGGGCATGGCCCAGGT(3').

El fragmento resultante se subclonó en los sitios BssHII/Not1 en pEF/myc/ER (Invitrogen, BV). El sFv se dirigió al ER mediante la incorporación de la secuencia de un péptido señal a partir de una cadena VH de ratón en el extremo 5' del gen sFv; este péptido se escinde tras la translocación en el ER. El sFv se conserva debido a que la secuencia peptídica de KDEL en el extremo c. La construcción se muestra en forma de diagrama en la figura 4.

Ejemplo 3 Efecto de las construcciones de sFv sobre la expresión de VCAM Cotransfección de sFv/ER con pEF/GFP/ER

El análisis funcional de las construcciones se llevó a cabo mediante la transfección en una línea célula A9 endotelial porcina inmortalizada. Éstas se generaron mediante microinyección de DNA de pZipSVU19 en células endoteliales aórticas primarias (Dorling y col, 1996). Las células inmortalizadas coservan las características de las células endoteliales pero diferentes a las EC, demostraron expresión constitutiva de VCAM. El tratamiento con citocinas de las células incrementó la expresión de VCAM marginalmente (incremento de RMFI desde 38,2 a 66,3 en 72 horas).

La trasfección de DNA se llevó a cabo con la formulación de liposomas LipofectMAINE (Life Technologies) usando una modificación del protocolo de los fabricantes. El reactivo de LipofectAMINE es una formulación 3:1 del lípido policatiónico trifluoroacetato de 2,3-dioleiloxi-N-[2(esperminacarboxilamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio (abreviadamente en inglés DOSPA) y el lípido neutro dioleoilfosfatidiletanolamina (abreviadamente en inglés DOPE) en agua.

1 x 10^{5} células se sembraron en cada uno de los pocillos de una placa de 6 pocillos en medio completo (DMEM) y se dejó unir durante una noche a 37ºC, en un incubador con CO_{2} al 5% durante una noche. El día siguiente las células se lavaron dos veces en Opti - MEM® I exento de suero precalentado (Gibco BRL). Se añadieron 2 ml de Opti
- MEM® I exento de suero a cada uno de los pocillos y las células se devolvieron al incubador de CO_{2} a 37ºC durante 2 - 3 horas.

El DNA a transfectar (1 - 2 \mug por transfección) se diluyó hasta un volumen final de 100 \mul por transfección en Opti - MEM® I, exento de suero. A un tubo separado, para cada transfección, se añadieron 5 \mul de LipofectAMINE y 15 \mug de transferrina bobina (Sigma; solución madre preparada hasta 1 \mug/ml en Opti - MEM® I exento de suero) a un volumen final de 100 \mul en Opti - MEM® I exento de suero. El DNA y la mezcla de LipofectAMINE - transferrina se combinaron y se dejaron en reposo a temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir la formación del complejo DNA - liposomas.

Para cada transfección, se añadieron 0,8 ml de Opti - MEM® I exento de suero precalentado al tubo que contenía los complejos. El medio se aspiró de las paredes y se añadió 1 ml de la solución diluida de los complejos a las células. Las células se incubaron a 37ºC en CO_{2} al 5% durante 5 - 6 horas. Después la mezcla de transfección se retiró y se añadieron 2 ml de medio completo (DMEM) que contenía FCS al 10% a cada pocillo.

En los ensayos de transfección transitoria, las células se ensayaron 24 - 72 horas después del comienzo de la transfección. Las células transfectadas se recogieron y se tiñeron con en anticuerpo monoclonal 10.2C7 específico para VCAM porcino (Celltech, Reino Unido) y un segundo reactivo de fase marcado con rojo Texas. Con el fin de identificar las células que habían recogido el DNA de plásmidos, las construcciones de sFv se cotransfectaron con el vector pEF/GFP/ER que contiene un fragmento de 761 pares de bases de paGFP (Crameri y col, 1996) condensado a la señal KDEL de retención de ER en la misma estructura principal del vector como las construcciones sFv.

La figura 5 muestra un histograma típico cuando se determina la población para la expresión de VCAM (fluorescencia roja) y la expresión de GFP (fluorescencia verde). Las células que expresan GFP mostraron una reducción de 77% en la expresión de VCAM (control RMFI 10,9, células GFP positivas 2,4). Esta reducción no se observó en las células transfectadas con el plásmido pEF/GFP/ER solo sugiriendo que la reducción se debía a la expresión del sFv específico de VCAM.

Ejemplo 4 Análisis de transfectantes estables

Para obtener transfectantes estables, IPEC se cotransfectaron con un plásmido que codificaba la resistencia a la higromicina (Kioussis y col., 1987). Después de 48 - 72 horas las células se subcultivaron y se diluyeron 1:10 en medio completo que contenía 150 \mug/ml de higromicina. La expresión de VCAM se analizó mediante citometría de flujo de las células resistentes a la higromicina en los 10 - 14 días.

Las figuras 6 A y B muestran los histogramas típicos de las líneas celulares generadas mediante transfección de las construcciones de dos clones diferentes de sFv, E6.2 y F5. Ambas construcciones de sFv reducen la expresión de VCAM sobre la superficie de las células endoteliales. Los valores de la fluorescencia media correspondientes al nivel de la expresión de VCAM mostrados en estas figuras son:

Población no transfectada de RMFI = 38,2, clon sFv/ER 6.2 = 4,82 y F5 = 10,1.

Las figuras 7 A y B presentan los resultados de un segundo experimento en las células transfectadas permanentemente para determinar la reducción de la expresión de VCAM sobre la superficie de estas células.

Estos datos demuestran que es posible reducir la expresión de VCAM sobre las células endoteliales mediante la expresión en las células de un scFv específico de VCAM dirigida para la retención en las ER.

Ejemplo 5 La transfección de las contrucciones scFv - ER atrapa la VCAM en el interior de la célula

Las técnicas de la tinción con inmunofluorescencia y microscopía confocal se usaron después para demostrar la colocalización de VCAM y scFv dentro de los transfectante de scFv tanto E6.2 como F5.

Las células endoteliales A9 no transfectadas muestran una tinción de membranas difusa para VCAM (véase la figura 8A). Ambos clones transfectados de scFv demostraron un patrón de tinción perinuclear, acentuado cuando se tiñe para la expresión de VCAM, consistente con la retención de VCAM en el interior del retículo endoplásmico (un ejemplo de una célula transfectada se muestra en la figura 8 B). La tinción de la células transfectadas con un anticuerpo anti - myc sin la detección del epítopo c-myc sobre las construcciones de scFv produjeron un patrón de tinción perinuclear fuerte consistente con la retención de ER del scFv (figura 8C). La exposición dual con filtros apropiados confirmó que la VACM y scFv se colocalizaron en ER (panel D):

Ejemplo 6 Reducción de la expresión de VCAM mediante scFv intracelular asociada con la reducción en adherencia de leucocitos humanos

Con el fin de demostrar que la reducción en la expresión de VCAM lograda mediante el scFv intracelular era significativa funcionalmente, se examinó la unión de la línea de leucemia de las células T, Jufkat, tanto para los transfectantes como para la línea precursora endotelial A9.

La línea Jurkat A9 se eligió debido a la alta expresión de VLA - 4 de superficie y se documentó la dependencia de esta integrina para la unión a las células endoteliales (van Kooyk, Y y col,, 1993)

Los gráficos mostrados en la figuras 9A y B demuestran la unión de las células Jurkat a densidades variables de las células endoteliales sembradas en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos. Para ambos transfectantes de scFv, hubo un desplazamiento a la derecha en la curva de unión demostrando una afinidad reducida de las células Jurkat para los trasnfectantes, así como una reducción significativa en la máxima unión de los leucocitos a la monocapa de células endoteliales.

Referencias

Alon, R., P. D. Kassner, M. W. Carr, E. B. Finger, M. E. Hemler, and T. A. Springer. 1995. The integrin VLA-4 supports tethering and rolling in flow on VCAM-1. J-Cell-Biol 128:1243-53 issn: 0021-9525.

Aranciba-Carcamo et al., (1998) 65(1): 62-7.

Bach, F. H. 1998. Xenotransplantation: problems and prospects. Annu Rev Med 49:301-10.

Bachiler et al, (1990) Arch Geschwulstforsch, 60(5): 357-60.

Beerli, R. R., W. Wels, and N. E. Hynes. 1994. Intracellular expression of single chain antibodies reverts ErbB-2 transformation. J-Biol-Chem 269: 23931-6.

Bevilacqua, M. P. 1993. Endothelial-leukocyte adhesion molecules. Annu Rev Immunol 11:767-804.

Biocca, S., P. Pierandrei Amaldi, and A. Cattaneo. 1993. Intracellular expression of anti-p2lras single chain Fv fragments inhibits meiotic maturation of xenopus oocytes. Biochem-Biophys-Res-Commun 197:422-7.

Blakely, M. L., W. J. Van der Werf, M. C. Berndt, A. P. Dalmasso, F. H. Bach, and W. W. Hancock. 1994. Activation of intragraft endothelial and mononuclear cells during discordant xenograft rejection. Transplantation 58: 1059-66 issn: 0041-1337.

Bradley A, Liu P. Target practice in transgenics. Nature Genet. 1996; 14: 121-123.

Brown, E. J., and F. P. Lindberg. 1996. Leucocyte adhesion molecules in host defence against infection. Ann-Med 28:201-8 issn: 0785-3890.

Clackson, T. 1997. Controlling mammalian gene expression with small molecules. Curr. Opin. Chem. Biol. 1:210-8.

Clarke AR. The adenovirus and the egg: a new approach to transgenesis. Nature Biotech. 1996; 14: 942.

Crameri, A., E. A. Whitehom, E. Tate, and W. P. Stemmer. 1996. Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling. Nat-Biotechnol 14:315-9.

Curiel (1992) Hum Gene Ther 3:147-154

Diamond LE, McCurry KR, Oldham ER, Tone M, Waldmann H, Platt JL, Logan JS. Human CD59 expressed in transgenic mouse hearts inhibits the activation of complement. Transplant Immunol. 1995; 3: 305-312.

Dorling, A., and R. I. Lechler. 1994. Prospects for xenografting. Curr-Opin-Immunol 6:765-9 issn: 0952-7915.

Dorling, A., C. Stocker, T. Tsao, D. O. Haskard, and R. 1. Lechler. 1996. In vitro accommodation of immortalized porcine endothelial cells: resistance to complement mediated lysis and down-regulation of VCAM expression induced by low concentrations of polyclonal human IgG antipig antibodies. Transplantation 62:1127-36 issn: 0041-1337.

Foster, C. A. 1996. VCAM-1/alpha 4-integrin adhesion pathway: therapeutic target for allergic inflammatory disorders. J-Allergy-Clin-Immunol 98:S270-7 issn: 0091-6749.

Graus Porta, D., R. R. Beerli, and N. E. Hynes. 1995. Single-chain antibody-mediated intracellular retention of ErbB-2 impairs Neu differentiation factor and epidermal growth factor signaling. Mol-Cell-Biol 15:1182-91.

Griffiths, A. D., S. C. Williams, O. Hartley, 1. M. Tomlinson, P. Waterhouse, W. L. Crosby, R. E. Kontermann, P. T. Jones, N. M. Low, T. J.Allison, and et al. 1994. Isolation of high affinity human antibodies directly from large synthetic repertoires. EMBO-J 13:3245-60.

Gurtner, G. C., V. Davis, H. Li, M. J. McCoy, A. Sharpe, and M. 1. Cybulsky. 1995. Targeted disruption of the murine VCAM1 gene: essential role of VCAM-1 in chorioallantoic fusion and placentation. Genes-Dev 9:1-14 issn: 0890-9369.

Heckl-Ostreicher B, Binder R, Kirschfink M. Functional activity of the membrane-associated complement inhibitor CD59 in a pig-to-human in vitro model for hyperacture xenograft rejection. Clin. Exp. lmmunol. 1995;102:589-595.

Isobe, M., H. Yagita, K. Okumura, and A. Ihara. 1992. Specific acceptance of cardiac allograft after treatment with antibodies to ICAM-1 and LFA-1. Science 255:1125-7 issn: 0036-8075.

Jiang, W., K. Venugopal, and E. A. Gould. 1995. Intracellular interference of tick-bome flavivirus infection by using a single-chain antibody fragment delivered by recombinant Sindbis virus. J-Virol 69:1044-9.

Jones, D. A., L. V. McIntire, C. W. Smith, and L. J. Picker. 1994. A two-step adhesion cascade for T
cell/endothelial cell interactions under flow conditions. J-Clin-lnvest 94:2443-50 issn: 0021-9738.

Kioussis, D., F. Wilson, C. Daniels, C. Leveton, J. Taverne, and J. H. Playfair. 1987. Expression and rescuing of a cloned human tumour necrosis factor gene using an EBV-based shuttle cosmid vector. EMBO-J 6:355-61.

Langford GA, Cozzi E, Yannoutsos N, Lancaster R, Elsome K, Chen P, White DGJ. Production of pigs transgenic for human regulators of complement activation using YAC technology. Transplant Proc. 1996; 28: 862-863.

Magee, A., and T. Wileman, 1992. Protein Targeting: A Practical Approach. In Practical Approach Series. Oxford University Press, Oxford.

McCurry KR, Diamond LE, Kooyman DL, Byme GW, Martin MJ, Logan JS, Platt JL. Human complement regulatory proteins expressed in transgenic swine protect swine xenografts from humoral injury. Transplant Proc. 1996; 28: 758.

Millan, M. T., C. Geczy, K. M. Stuhlmeier, D. J. Goodman, C. Ferran, and F. H. Bach. 1997. Human monocytes activate porcine endothelial cells, resulting in increased E-selectin, interleukin-8, monocyte chemotactic protein-1, and plasminogen activator inhibitor-type-1 expression. Transplantation 63:421-9 issn: 0041-1337 .

Mueller, J. P., M. J. Evans, R. Cofiell, R. P. Rother, L. A. Matis, and E. A. Elliott. 1995. Porcine vascular cell adhesion molecule (VCAM) mediates endothelial cell adhesion to human T cells. Development of blocking antibodies specific for porcine VCAM. Transplantation 60:1299-306 issn: 0041-1337.

Muller, W. A. 1995. The role of PECAM-1 (CD31) in leukocyte emigration: studies in vitro and in vivo. J-Leukoc-Biol 57:523-8 issn: 0741-5400.

Munro, S., and H. R. Pelham. 1987. A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins. Cell 48:899-907 *LHM: This title is held by RPMS library *LHC: Vol. 19 (1980)-.

Palmiter et al., 1983 Science, 222: (4625): 809-814.

Pudsley, A. 1989. Protein Targeting. Academic Press, San Diego, CA.

Richardson, J. H., T. A. Waldmann, J. G. Sodroski, and W. A. Marasco. 1997. Inducible knockout of the interleukin-2 receptor alpha chain: expression of the high-affinity IL-2 receptor is not required for the in vitro growth of HTLV-I-transformed cell Zines. Virology 237:209-16.

Rondon, 1. J., and W. A. Marasco. 1997. Intracellular antibodies (intrabodies) for gene therapy of infectious diseases. Annu Rev Microbiol 51:257-83.

Springer, T. A. 1994. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell 76:301-14 issn: 0092-8674.

Tanaka, Y., D. H. Adams, and S. Shaw. 1993. Proteoglycans on endothelial cells present adhesion-inducing cytokines to leukocytes. Immunol-Today 14:111-5 issn: 0167-4919.

Tedder, T. F., D. A. Steeber, A. Chen, and P. Engel. 1995. The selectins: vascular adhesion molecules. FASEB-J 9: 866-73 issn: 0892-6638.

van Kooyk,Y et al; 1993"Lymphocyte function-associated antigen 1 dominates very late antigen 4 in binding of activated T cells to endothelium". J Exp Med 177: 185-90.

Wheeler MB. Development and validation of swine embryonic stem cells: a review. Reprod Perfil. Dec. 1994; 6:563-568.

White D, Cozzi E, Langford G, Oglesby T, Wang M, Wright L, Wallwork J. The control of hyperacute rejection by genetic engineering of the donor species. Eye 1995; 9:185-189.

Woffendin et al (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(24):11581-11585

Wu (1989) J. Biol. Chem. 264:16985-16987

Yannoutsos N, Langford GA, Cozzi E, Lancaster R, Elsome K, Chen P, White DJG. Production of pigs transgenic for human regulators of complement activation. Transplant Proc. 1995; 27: 324-325.

Claims (18)

1. Un tejido biológico que comprende células endoteliales que se pueden inducir para generar un compuesto que regula por disminución la expresión de una molécula de adhesión celular por las células, siendo el compuesto bien (a) un polinucleótido complementario en secuencia a parte del gen o mRNA que codifica la molécula de adhesión celular, (b) un polinucleótido que comprende una secuencia de ribozima que se dirige específicamente a un gen o mRNA que codifica la molécula de adhesión celular, o (c) un péptido con afinidad de unión específica para la molécula de adhesión celular.

2. Un tejido según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido (c) es una proteína de fusión biespecífica.

3. Un polipéptido que comprende una región de unión capaz de unirse a una molécula de adhesión celular y una región de señalización para la dirección subcelular del polipéptido de manera que no se transporte a la superficie de la célula.

4. Un polipéptido según la reivindicación 3, que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

5. Un polipéptido según la reivindicación 4, que comprende un fragmento Fv de una cadena simple.

6. Un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que la región de señalización para la dirección subcelular del polipéptido comprende una señal de localización para el retículo endoplásmico.

7. Un polipéptido según la reivindicación 6, en el que la región de señalización comprende la secuencia de aminoácidos KDEL en el extremo C del polipéptido.

8. Un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en el que la región de unión tiene afinidad por una cualquiera de las moléculas de adhesión VCAM - 1, ICAM - 1, LFA - 1, CD2, PECAM, CD31, IAP, CD47 o integrina \alpha\nu\beta3.

9. Un polipéptido que codifica un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8.

10. Un vector que comprende un polinucleótido según la reivindicación 9.

11. Una célula que comprende un polinucleótido según la reivindicación 9 o un vector según la reivindicación 10.

12. Tejido biológico que comprende una célula según la reivindicación 11.

13. Un animal no humano que comprende tejido biológico según la reivindicación 12 y/o una célula según la reivindicación 11.

14. Un animal según la reivindicación 13, en el que dicho animal es un cerdo u oveja transgénica.

15. Un procedimiento de obtención de un tejido u órgano adecuado para transplante, que comprende la expresión de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8 en las células endoteliales en dicho tejido u órgano, por lo tanto regulando por disminución la expresión de una molécula de adhesión celular.

16. Tejido biológico según la reivindicación 12, para uso en transplante.

17. El uso de tejido biológico según la reivindicación 12 en la fabricación de un medicamento para transplantar en un animal receptor.

18. El uso de la reivindicación 17, en el que dicho receptor animal es un ser humano.